UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII

Biolog FURDUI EMILIA MARIA

CARACTERIZAREA UNOR RASE ŞI HIBRIZI DE

VIERMI DE MǍTASE BOMBYX MORI L. PRIN

TEHNICI MOLECULARE (REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC

Prof. univ. dr. LIVIU ALEXANDRU MǍRGHITAŞ

12011

Cluj-Napoca

CUPRINS

Teză RezumatINTRODUCERE 1 6 PARTEA ÎNTÂI: STUDIU DE LITERATURĂ 2 6 CAPITOLUL I. IMPORTANŢA SERICICULTURII ŞI ISTORICUL CREŞTERII VIERMILOR DE MǍTASE PE PLAN MONDIAL ŞI ÎN ŢARA NOASTRĂ

3

1.1. IMPORTANŢA SERICICULTURII 3 6 1.2. ISTORICUL CREŞTERII VIERMILOR DE MĂTASE 6 1.3. STADIUL ACTUAL AL SERICICULTURII PE PLAN MONDIAL 8 6 1.4. STADIUL ACTUAL AL SERICICULTURII ŞI AL CERCETĂRILOR

SERICICOLE ÎN ROMÂNIA 11 7

1.5. IMPORTANŢA CERCETǍRII ŞTIINŢIFICE A CREŞTERII VIERMILOR DE MĂTASE

14 7

1.6. STUDIUL GENETIC AL VIERMELUI DE MǍTASE BOMBYX MORI 16 1.6.1. Aspectele citogenetice şi moleculare la viermele de mǎtase Bombyx

mori 17

1.6.2. Cariotipul 18 1.6.3. Bazele cromozomale ale sexului 21 1.6.4. Studiul mutaţiilor apărute la viermele de mătase 22 CAPITOLUL II. INCADRAREA TAXONOMICǍ ŞI CICLUL EVOLUTIV AL SPECIEI BOMBYX MORI L.

26 7

2.1. SISTEMATICA ZOOLOGICǍ A VIERMELUI DE MǍTASE 26 7 2.2. CICLUL EVOLUTIV AL VIERMELUI DE MĂTASE 28 8 CAPITOLUL III. METODE DE AMPRENTARE GENETICĂ 30 8 3.1. CLASIFICAREA MARKERILOR GENETICI 30 3.2. COMPARAREA DIFERITELOR TEHNICI DE MARCARE

MOLECULARĂ 32

3.3. EVIDENŢIEREA VARIABILITĂŢII GENETICE CU AJUTORUL MARKERILOR MOLECULARI

34 8

3.3.1.Tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction) - Reacţia în lanţ a polimerazei

34

3.3.2. Generalităti privind tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)-Amplificarea randomizată a ADN – ului polimorfic

36

3.3.3. Generalităţi privind tehnica microsateliţilor: SSR-Simple Sequence Repeats

40

PARTEA A DOUA: CERCETĂRI PROPRII 45 SCOPUL CERCETĂRILOR 46 5 OBIECTIVELE URMĂRITE 47 6 CAPITOLUL IV. ORGANIZAREA CREŞTERILOR EXPERIMENTALE DE VIERMI DE MĂTASE

49 9

4.1. MATERIALUL BIOLOGIC 49 9 4.2. MATERIALE UTILIZATE LA ORGANIZAREA CREŞTERILOR

EXPERIMENTALE 59 9

4.3. METODE UTILIZATE LA ORGANIZAREA SERIILOR DE CREŞTERE 63 9 4.4. ANALIZA DATELOR 68 9

2

CAPITOLUL V- REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND CREŞTERILE EXPERIMENTALE

70 10

5.1. INCUBAŢIA OUĂLOR ŞI ECLOZIUNEA VIERMILOR DE MĂTASE 70 10 5.2. EVOLUŢIA STADIULUI LARVAR 76 10 5.3. INDICII BIOLOGICI AI LARVELOR 81 11 5.4. MASA GLANDELOR SERICIGENE 86 5.5. ÎNGOGOŞAREA 88 5.6. INDICII BIOLOGICI AI GOGOŞILOR CRUDE 90 12 5.6.1. Masa gogoşilor crude 90 5.6.2. Axul longitudinal şi transversal al gogoşilor crude 92 5.7. INDICII TEHNOLOGICI AI GOGOŞII USCATE 94 12 5.7.1. Masa gogoşii uscate 94 5.7.2. Axul longitudinal şi transversal al gogoşilor uscate 96 5.7.3. Lungimea firului de mătase 97 5.8. CONCLUZII PARŢIALE 100 13 CAPITOLUL VI. MATERIALE ŞI METODE UTILIZATE PENTRU REALIZAREA ANALIZEI RAPD

103 13

6.1. MATERIALE UTILIZATE PENTRU EFECTUAREA ANALIZEI RAPD 103 13 6.1.1. Material biologic 103 13 6.1.2. Materiale chimice 103 6.1.3. Aparate electronice şi instrumentar 104 6.2. METODE DE LUCRU 105 13 6.2.1. Protocolul extracţiei de ADN 105 13 6.2.2. Cuantificarea ADN-ului 107 14 6.2.3. Protocolul de amplificare PCR 108 6.2.4. Componenţa reacţiei PCR 110 6.2.5. Amplificarea PCR 112 14 6.2.6. Primerii RAPD utilizaţi în amplificarea ADN-ului 113 6.2.7. Electroforeza în gel de agaroză 114 6.2.8. Migrarea elecroforetică şi pregătirea probelor de ADN 115 14 6.2.9. Preluarea imaginilor 117 14 6.3. ANALIZA DATELOR 117 14 CAPITOLUL VII. REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND POLIMORFISMUL OBŢINUT CU PRIMERII RAPD

123 14

7.1. REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA PROBELOR DE ADN 123 7.1.1. Rezultate privind extracţia ADN-ului la rasele de viermi de mătase 123 7.1.2. Rezultate privind extracţia ADN-ului la hibrizii de viermi de mătase 124 7.2. REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA ŞI ELECTROFOREZA

PRODUŞILOR DE REACŢIE RAPD 126 15

7.2.1. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie RAPD la rasele de viermi de mătase

126

7.2.2. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie RAPD la hibrizii de viermi de mătase

133

7.3. CONCLUZII PARŢIALE 139 18 CAPITOLUL VIII. MATERIALE ŞI METODE UTILIZATE PENTRU REALIZAREA ANALIZEI SSR

141 19

8.1. MATERIALE UTILIZATE PENTRU REALIZAREA ANALIZEI SSR 143 19 8.1.1. Material biologic 143 19 8.1.2. Materiale chimice 143 8.1.3. Aparate electronice şi instrumentar 144

3

8.2. METODE DE LUCRU 144 19 8.2.1. Extracţia ADN 144 19 8.2.2. Componenţa reacţiei PCR 145 8.2.3. Amplificarea PCR 147 19 8.2.4. Electroforeza capilară 149 8.3. ANALIZA DATELOR 151 19 CAPITOLUL IX. REZULTATE PRIVIND POLIMORFISMUL OBŢINUT CU PRIMERII SSR

155 19

9.1. REZULTATE OBŢINUTE CU PRIMERII SSR 155 19 9.1.1. Mărimea alelelor generate de primerii SSR 156 20 9.1.2. Structura alelică 159 9.1.3. Distribuţia alelelor unice şi fixe 160 20 9.2. ECHILIBRUL HARDY-WEINBERG 171 9.2.1. Rezultatele privind Echilibrul Hardy-Weinberg: locusul SAT 951 172 9.2.2. Rezultatele privind Echilibrul Hardy-Weinberg: locusul SAT 1423 174 9.2.3. Rezultatele privind Echilibrul Hardy-Weinberg: locusul TO1CTA07R 176 9.2.4. Rezultatele privind Echilibrul Hardy-Weinberg: locusul SAT 346 177 9.2.5. Rezultatele privind Echilibrul Hardy-Weinberg: locusul CA16G03R 178 9.3. INDICII DIVERSITĂŢII GENETICE 182 9.4. ANALIZA VARIAŢIEI GENETICE ÎN CADRUL RASELOR ŞI

HIBRIZILOR 196 21

9.5. CONCLUZII PARŢIALE 202 22 CAPITOLUL X. CONCLUZII GENERALE 205 22 ELEMENTE DE ORIGINALITATE 209 23 LISTA LUCRĂRILOR PUBLICATE 211 REFERINŢE BIBLIOGRAFIE 213 24 ANEXA 1 243 ANEXA 2 245 ANEXA 3 246 ANEXA 4 248

4

SCOPUL CERCETĂRILOR În cadrul prezentului studiu, teza de doctorat, scopul cercetării a constat în

aprecierea unor rase şi hibrizi de viermi de mătase Bombyx mori L., din România prin caracterizarea fenotipică (metode recunoscute internaţional) şi moleculară (cu ajutorul markerilor RAPD- Random Amplified Polymorphic DNA şi SSR- Simple Sequence Repeats). Cercetările iniţiate de noi, prin caracterizarea fenotipică şi moleculară a viermilor de mătase, constituie primul studiu de acest gen în domeniu, din România.

OBIECTIVELE URMĂRITE Principalele obiective urmărite privind organizarea creşterilor experimentale de viermi de mătase au fost:

Inventarierea corectǎ a unor rase şi hibrizi de viermi de mătase din stocul genetic local de Bombyx mori L. din România prin controale morfologice asupra raselor din stocul genetic, pe ouă, larve, luându-se în considerare aspectele fenotipice conform standardelor rasei. Indicii studiaţi pentru rasele parentale şi hibrizi sunt: - indicii biologici ai oului:

prolificitatea procentul de ecloziune

- indicii biologici ai larvelor: masa larvelor lungimea larvelor masa glandei sericigene

- indicii biologici ai gogoşii crude: masa gogoşii crude masa incartamentului mătăsos axul longitudinal al gogoşii axul transversal al gogoşii

- indicii tehnologici ai gogoşii uscate şi ai fibrei: masa gogoşii uscate masa deşeului din gogoaşă lungimea firului de mătase

Obiectivele cercetărilor privind caracterizarea moleculară sunt:

Utilizarea tehnicilor moleculare (RAPD şi SSR) în vederea identificǎrii polimorfismului genetic la rasele şi hibrizii luaţi în studiu;

Identificarea primerilor RAPD capabili sǎ determine polimorfismul la nivel molecular;

Stabilirea protocolului de extracţii de ADN; Depistarea gradului de înrudire între populaţiile de viermi de mǎtase

Bombyx mori L. din România.

5

Alegerea primerilor SSR capabili de a diferenţia rasele şi hibrizii analizaţi;

Extracţia ADN-ului din viermii de mătase şi evidenţierea profilului genetic al raselor şi hibrizilor testaţi;

Caracterizarea moleculară şi diversitatea genetică a raselor şi hibrizilor de viermi de mătase luate în studiu cu ajutorul markerilor SSR.

INTRODUCERE Dintre toate speciile de viermi de mătase care ţes gogoşi din fir de mătase, cea

mai mare pondere o deţine viermele de mătase al dudului Bombyx mori L. (circa 90%), urmat de viermele de mătase al ricinului şi stejarului, aria de răspândire a acestor specii fiind legată de zona de răspândire a speciilor vegetale furnizoare de hrană.

Începând cu legenda coconului căzut şi metamorfozat în ceaşca prinţesei chineze Xi Lingshi, acum 5000 de ani (Kurin, 2002), fluturele de mătase Bombyx mori, a fost intim legat de umanitate. Chinezii au păstrat acest secret sute de ani, iar divulgarea acestuia era pedepsită cu moartea.

Stând la baza sericiculturii, fluturele de mătase a reprezentat supravieţuirea economică pentru fermierii şi muncitorii din industria textilă. Mătasea în sine şi comercializarea ei au îmbogăţit activitatea umană prin artă şi cultură, contribuind la crearea unei forme incipiente de globalizare timp de aproximativ 2000 de ani, pe parcursul erei Drumului Mătăsii (Kurin, 2002).

Bombyx mori fiind singura insectă cu adevărat domesticită, este complet dependentă de om atât pentru supravieţuire cât şi pentru reproducere (Hubbell, 2001).

CAPITOLUL I. IMPORTANŢA SERICICULTURII ŞI ISTORICUL CREŞTERII

VIERMILOR DE MǍTASE PE PLAN MONDIAL ŞI ÎN ŢARA NOASTRĂ

1.1. IMPORTANŢA SERICICULTURII Prin creşterea viermilor de mătase, se furnizează industriei prelucrătoare a mătăsii,

materia primă, adică gogoşi de mătase. Mătasea naturală prezintă rezistenţă ridicată, fineţe mare (12-30 microni), luciu intens, tuşeu plăcut şi se încarcă electric mult mai puţin decât fibrele sintetice, astfel că datorită acestor înşuşiri este considerată „fibra de lux a industriei textile” (Bura, 1992).

Patria mătăsii naturale o reprezintă China. Cercetările istorice şi arheologice realizate aici au pus în evidenţă faptul că în jurul orăşelului chinez Schengze, din regiunea Wuxion, provincia Jiangsu, locuitorii acestor meleaguri cultivau duzi, creşteau viermi de mătase şi cunoşteau meşteşugul obţinerii firelor şi al ţesăturilor din mătase naturală, deoarece s-au găsit numeroase obiecte de ceramică neagră atribuite erei neolitice, pe care figurează viermele de mătase.

1.2. STADIUL ACTUAL AL SERICICULTURII PE PLAN MONDIAL La ora actuală, din datele raportate în anul 2009 de ţările membre ale Asociaţiei

Internaţionale de Sericicultură (I.S.C. Website), producţia mondială de gogoşi înregistrată este de 126.995 tone, primul loc în producţia de mătase este deţinut de China

6

(104.000 tone), urmată de India (19690 tone), Brazilia (811 tone), Uzbekistan (750 tone) etc. 1.3. STADIUL ACTUAL AL SERICICULTURII ŞI AL CERCETĂRILOR

La ora actuală, sericicultura trece printr-o criză evidentă, producţia de gogoşi de mătase fiind pe cale de dispariţie. Ca potenţial sericicol, România deţine locul al doilea în Europa după Franţa, iar ca şi producţie în ţara noastră se produc anual mai puţin de 4 tone de gogoşi de mătase (Paşca şi colab., 2008b), figura 1.

Datorită condiţiilor pedoclimatice favorabile cultivării dudului, sericicultura s-a dezvoltat foarte rapid în ţara noastră.

00.5

11.5

22.5

33.5

4

tone

/tons

2001 2002 2003 2004 2005 2006

Anul productiei/Production Year

Figura 1. Producţia de gogoşi între anii 2001-2006

1.4. IMPORTANŢA CERCETǍRII ŞTIINŢIFICE A CREŞTERII VIERMILOR DE MĂTASE

Studiul viermelui de mătase a fost iniţiat in Japonia, sub impulsul dezvoltării sericiculturii şi a industriei mătasii, dar rapid a fost promovat şi ca un model valoros pentru studiile fundamentale. Astǎzi viermele de mǎtase are un rol important în trei domenii: cercetare, sericiculturǎ şi biotehnologii (Goldsmith şi colab., 2005); În cercetarea ştiinţifică, viermii de mătase Bombyx mori au constituit un model privilegiat pentru unele descoperiri în biologie, genetică şi medicină, cum ar fi: analiza reglajului genetic privind biosinteza proteinelor mătasii, dezvoltarea morfogenetică, studiul reglărilor legate de poikiloterme, constituind premiere. Studii şi cercetări au avut loc şi în alte domenii: endocrinologiei, toxicologiei, radiologiei, virusologiei şi biotehnologiilor.

CAPITOLUL II. INCADRAREA TAXONOMICǍ ŞI CICLUL EVOLUTIV AL SPECIEI BOMBYX MORI L.

2.1. SISTEMATICA ZOOLOGICǍ A VIERMELUI DE MǍTASE Viermele de mătase al dudului (Bombyx mori L.) face parte din:

încrengătura Artropoda; subîncrengătura Mandibulata; clasa Insecta; subclasa Pterigota; ordinul Lepidoptere; seria Lepidoptere nocturne;

7

familia Bombycidae; genul Bombyx specia Bombyx mori

2.2. CICLUL EVOLUTIV AL VIERMELUI DE MĂTASE Viermele de mătase al dudului sau fluturele de mătase (Bombyx mori L.) face parte

din grupa insectelor care se dezvoltă în cadrul unei metamorfoze complete, evoluând prin 4 stadii diferite: ou (sau sămânţa), larvă (viermele de mătase), crisalidă (nimfă sau pupă) şi fluture (adult). După fecundare, timp de trei zile au loc procese de embriogeneză, apoi începe diapauza care durează în funcţie de rasă, de factorii genetici şi de mediu, la rasele de la noi fiind de 9-10 luni, din iulie până în aprilie. După diapauză, ouăle sunt puse în condiţii optime, incubează timp de 10-14 zile, proces care se încheie cu ecloziunea larvelor. Stadiul larvar variază în funcţie de rasă, fiind cuprins între 25 şi 35 de zile, larvele evoluând prin cinci vârste, delimitate de patru perioade de repaus, numite „somnuri”, timp în care are loc schimbarea tegumentului în urma năpârlirilor.

CAPITOLUL III. METODE DE AMPRENTARE GENETICĂ

3.1. EVIDENŢIEREA VARIABILITĂŢII GENETICE CU AJUTORUL MARKERILOR MOLECULARI

Markerii RAPD (Random amplified polymorphic DNA - polimorfisme de ADN amplificate aleator) sunt rezultaţi prin amplificarea PCR a unor segmente necunoscute de ADN genomic cu ajutorul unei amorse decamere aleatoare (Williams şi colab., 1990), a fost utilizatǎ intens în mai multe scopuri, de exemplu: identificarea genelor (Aufauvre şi colab., 1992; Ballinger-Crabtree, 1992), variabilitatea geneticǎ a populaţilor (Lehmann, 1992; Chatterjee şi colab., 2004;), hǎrţi cromozomale şi relaţii filogenetice (Kazan şi colab., 1993). Produşii de amplificare se separă prin electroforeză în gel de agaroză şi se evidenţiază în lumină UV după o colorare prealabilă cu un colorant specific, imaginea obţinută numindu-se fingerprint.

Markerii RAPD se comportă ca markeri dominanţi când sunt urmăriţi în descendenţă. Diversitatea genetică şi relaţiile de înrudire dintre indivizi se evaluează pe baza prezenţei sau absenţei benzilor, rezultând o amprentă genetică specifică.

Avantajele analizei RAPD: relevarea unui număr mare de polimorfisme, costuri scăzute, utilizarea metodelor de vizualizare prin fluorescente în local celor bazate pe radioactivitate; analizarea unui număr mare de probe într-o zi; un implică un grad foarte ridicat de pregătire al personalului din laborator;

Dezavantaje: comportamentul dominant al markerilor RAPD; Microsateliţii (ADN înalt repetitiv) sau SSR (Simple Sequence Repeats) sunt

secvenţe scurte înalt repetate, care conţin de obicei 2 – 5 perechi de baze, repetate în tandem, care flanchează o secvenţă unică de ADN (Field şi colab., 1996). Microsateliţii au devenit foarte utilizaţi în multe aplicaţii precum: cartografierea genomului uman (Dib şi colab., 1996), al câinilor (Ostander şi colab., 1993), al şoarecilor (Dietrich şi colab., 1996) al gǎinilor (Crooijmans şi colab., 1996) al viermilor de mǎtase Bombyx mori (Prasad şi colab., 2005a) dar şi a multor specii de plante (Akkaya şi colab., 1995), în filogenie (Morin şi colab., 1994), a structurii genetice a populaţiilor (Bruford şi colab., 1993), în conservarea geneticǎ (Gotelli şi colab., 1994) şi în criminalisticǎ (Jung, 1989; Jeffreys şi colab., 1991).

8

Polimorfismul apare datorită variaţiei în număr a repetiţiilor în tandem în urma amplificării PCR cu amorse complementare secvenţelor ce flanchează ADN-ul microsatelit (secvenţe conservate în cadrul speciei, uneori şi a genului). Avantajele markerilor SSR sunt date de: polimorfismul ridicat, distribuţia lor uniformă în genom, reproductibilitate mare şi codominanţă. Dintre dezavantaje principalul impediment este reprezentat de costul elaborării primerilor şi de necesitatea cunoaşterii secvenţei de ADN de interes.

CAPITOLUL IV. ORGANIZAREA CREŞTERILOR EXPERIMENTALE DE VIERMI DE MĂTASE

4.1. MATERIALUL BIOLOGIC

În cadrul experimentelor efectuate în anul 2009, materialul biologic a fost constituit din:

-7 rase de viermi de mătase: RG 90; AC/T (Alb de Cislău); AB (Alb de Băneasa); IBV; AC 29/T (Alb Chinezesc); B1 (Băneasa1); S8;

-8 din hibrizii consacraţi: S8 X AC29/T (Ana 1); AC 29/T X S8 (Ana 2); AC x B1 (Cislău 1); B1 X AC (Cislău 2); B1 X SVILA2 (Bulgaria); BB1 X HESA2 (Bulgaria); HESA1 X SVILA 2 (Bulgaria); VRATZA 35 X SVILA 2 (Bulgaria); 4.2. MATERIALE UTILIZATE LA ORGANIZAREA CREŞTERILOR EXPERIMENTALE

Dintre materialele utilizate la organizarea metodei de creştere a viermilor de mătase se face referire la plantaţia de duzi şi frunzele de dud administrate, spaţiul destinat creşterii seriilor experimentale şi materialele de îngogoşare utilizate.

4.3. METODE UTILIZATE LA ORGANIZAREA SERIILOR DE CREŞTERE • incubaţia ouălor viermilor de mătase-metoda ridicării treptate a temperaturii; • Metodologia condiţiilor de creştere şi dezvoltare a larvelor; T: 26-27°C, 25-26 °C,

23-24 °C; H: 80-85%, 75%, 65-70%; • Îngogoşarea: T-22º C, H-65%; • Etufarea gogoşilor; • Devidarea gogoşilor;

4.4. ANALIZA DATELOR

• PAST 2.04; Coeficientul de variabilitate (V%); Având în vedere obiectivele propuse s-au efectuat determinări astfel:

Numărul de indivizi studiaţi a fost diferit în funcţie de însuşirile analizate. Astfel pentru parametrii biologici ai pontelor (prolificitate, număr de ouă eclozionate şi procent de ecloziune) rezultatele exprimă media a 4 ponte diferite, atât la rasele cât şi la hibrizii studiaţi;

Masa şi lungimea larvelor a fost studiată pentru 20 de indivizi, masa glandei sericigene a fost determinată prin cântărirea glandelor extrase de la 20 larve, au fost efectuate determinări a masei gogoşilor crude şi uscate, a incartamentul mătăsos, ale axului longitudinal şi transversal al gogoşilor crude şi uscate asupra unui număr de 20 de gogoşi, masa deşeului şi lungimea firului de mătase au fost determinate pe 10 gogoşi.

9

CAPITOLUL V- REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND CREŞTERILE EXPERIMENTALE

5.1. INCUBAŢIA OUĂLOR ŞI ECLOZIUNEA VIERMILOR DE MĂTASE

y = -19.814x + 2438.3R2 = 0.1937

0100200300400500600700

95 96 97 98

Procent de ecloziune (%) Hatching percentage (%)

Num

ar d

e ou

a/ p

onta

N

umbe

r of e

ggs/

hatc

hing

y = 18.129x - 1194.7R2 = 0.3482

500

510

520

530

540

550

560

94 94.5 95 95.5 96

Procent de ecloziune (%) Hatching percentage (%)

Num

ar d

e ou

a/ p

onta

N

umbe

r of

egg

s/ h

atch

ing

Rase Hibrizi

Figura 2. Curba de regresie liniară privind procentul de ecloziune şi numărul de ouă/pontă

Prin corelarea directă a procentului de ecloziune cu numărul de ouă/ pontă, (figura

2) atât pentru rase cât şi pentru hibrizi, s-a observat o legătură mult mai puternică în cazul hibrizilor, apreciată prin coeficientul de regresie liniară (R2 = 0.3482), faţă de (R2 = 0.1937) al raselor.

5.2. EVOLUŢIA STADIULUI LARVAR

În ceea ce priveşte durata stadiului larvar în cazul raselor, (figura 3), este cuprins între 29 de zile la rasa B1 şi 31 de zile la rasele AC29/T, AB şi RG90.

31

30

31

29

31

30 30

28

28.5

29

29.5

30

30.5

31

AC 29/T AC/T AB B1 RG 90 IBV S8

Rase/Races

Evol

utia

stad

iulu

i lar

var

(zile

)Ev

olut

iona

ry st

ages

of

larv

ae(d

ays)

Figura 3. Durata stadiului larvar la rasele luate în studiu

10

28 28

29 29

28 28

29

30

27

27.5

28

28.5

29

29.5

30

B1X

AC

ACX

B1

AC2

9/TX

S8

S8X

AC2

9/T

HES

A1X

SVIL

A2

B1X

SVIL

A2

B1X

HES

A2

VRA

TZA

35X

SVIL

A2

Hibrizi/Hybrids

Evo

lutia

stad

iulu

i lar

var

(zile

)Ev

olut

iona

ry st

ages

of l

arva

e(da

ys)

Figura 4. Durata stadiului larvar la hibrizii luaţi în studiu

Durata stadiului larvar în cazul hibrizilor, (figura 4), este cuprins între 28 de zile la

hibrizii BB1 X AC, AC x B1, HESA1 x SVILA2, B1 x SVILA2 şi 30 de zile la VRATZA35 x SVILA2.

5.3. INDICII BIOLOGICI AI LARVELOR

y = 2.3741x - 12.479R2 = 0.9458

0123456

6 6.5 7 7

Lun

.5

gimea larvelor (cm) Larvae length (cm)

Mas

a la

rvel

or (g

) La

rvae

wei

gth

(g)

y = 0.9643x - 2.5281R2 = 0.2204

4.2

4.4

4.6

4.8

5

5.2

7.2 7.4 7.6 7.8 8

Lungimea larvelor (cm) Larvae length (cm)

Mas

a la

rvelor

(g)

Larv

ae w

eigt

h (g

)

Rase Hibrizi

Figura 5. Curba de regresie liniară privind lungimea şi masa larvelor la rase şi hibrizi În cazul raselor de viermi de mătase prin corelarea directă a lungimii şi masei

larvelor, figura 5, se poate observa o corelaţie pozitivă, apreciată prin coeficientul de regresie liniară (R2=0.9458), ceea ce semnifică faptul că lungimea larvelor se corelează aproape perfect cu masa larvelor. În cazul hibrizilor, prin coeficientul de regresie liniară

11

(R2=0.2204), corelaţia obţinută este una pozitivă dar slabă datorită valorilor prezentate la hibridul B1x Svila2. 5.4. INDICII BIOLOGICI AI GOGOŞILOR CRUDE

Tabelul 1 Mediile şi parametrii dispersiei calculaţi pentru masa gogoşilor crude

Masa gogoşilor crude, conform datelor prezentate în tabelul 1, atinge valori

maxime de 1.94 g la hibridul B1 X SVILA2 şi valori minime de 1.21 g la rasa IBV, având o medie de 1.65 g.

5.5. INDICII TEHNOLOGICI AI GOGOŞII USCATE

În urma determinărilor s-a putut observa că cea mai mare valoare medie de 0.87 g

a fost înregistrată la rasa RG 90, iar cea mai mică medie de 0.59 g la rasa AB şi la hibridul B1X AC, media masei gogoşilor uscate a raselor şi hibrizilor fiind de 0.69 g, valoarea medie minimă a incartamentului a fost înregistrată la rasa IBV 0.17 g, iar valoarea maximă de 0.34g la rasa AC29/T. Coeficienţii de variabilitate obţinuţi pentru masa gogoşii uscate şi masa incartamentului mătăsos sunt în toate cazurile sub 15%, lucru care denotă o mare omogenitate a raselor şi hibrizilor analizaţi.

În ceea ce priveşte lungimea filamentului, valoarea medie maximă de 1256 m s-a înregistrat la hibridul AC29/T X S8, iar cea minimă 1008 m la hibridul B1X HESA2, se constată că rasele sunt cuprinse între hibrizi, având valori maxime de 1210 m la rasa AC/T şi valori minime de 1038 m la rasa IBV.

Rasă/Hibrid N Masa gogoşii (g)

Dev. std.

Err. std. V%

Masa incartament

ului (g)

Dev. std.

Err. std. V%

AC 29/T 1.54 0.24 0.06 15.60 0.35 0.03 0.01 8.57 AC/T 1.49 0.21 0.09 14.09 0.36 0.05 0.01 13.88 AB 1.63 0.16 0.05 9.80 0.33 0.04 0.01 12.12 B1 1.59 0.20 0.06 12.57 0.36 0.03 0.01 8.33 RG90 1.51 0.27 0.08 17.88 0.27 0.04 0.01 14.81 IBV 1.21 0.17 0.03 14.05 0.29 0.05 0.01 17.24 S8 1.76 0.19 0.04 10.81 0.36 0.02 0.00 5.55 BB1X AC 1.77 0.12 0.03 6.78 0.37 0.02 0.01 5.40 ACX B1 1.62 0.16 0.05 9.87 0.33 0.01 0.00 3.03 AC29/TXS8 1.78 0.13 0.04 7.30 0.35 0.01 0.00 2.85 S8XAC29/T 1.80 0.19 0.05 10.55 0.37 0.03 0.01 8.10 HESA1XSVILA2 1.68 0.23 0.07 13.69 0.35 0.03 0.01 8.57 BB1XSVILA2 1.94 0.20 0.06 10.30 0.41 0.03 0.01 7.31 BB1X HESA2 1.70 0.17 0.05 10.00 0.36 0.04 0.01 11.11 VRATZA35XSVILA2

20

1.78 0.13 0.04 7.30 0.36 0.02 0.00 5.55

12

Tabelul 2 Mediile şi parametrii dispersiei calculaţi pentru masa gogoşilor uscate

N Masa

gogoşii (g)

Dev. std.

Err. std. V%

Masa incartamentului Rase/Hibrizi

(g)

Dev. std.

Err. std. V%

AC 29/T 0.83 0.06 0.02 7.228 0.34 0.04 0.02 11.76 AC/T 0.79 0.03 0.01 3.797 0.25 0.01 0.00 4.000 AB 0.59 0.06 0.01 10.16 0.21 0.02 0.00 9.523 B1 0.76 0.04 0.01 5.263 0.19 0.01 0.00 5.263 RG 90 0.87 0.09 0.02 10.34 0.22 0.03 0.00 13.63 IBV 0.62 0.02 0.01 3.225 0.17 0.04 0.01 23.52 S8 0.61 0.04 0.01 6.557 0.25 0.01 0.00 4.000 B1X AC 0.59 0.03 0.01 5.084 0.29 0.01 0.00 3.448 ACX B1 0.65 0.08 0.02 12.30 0.25 0.02 0.01 8.000 AC29/TXS8 0.63 0.04 0.01 6.349 0.26 0.01 0.00 3.846 S8XAC29/T 0.77 0.09 0.02 11.68 0.27 0.01 0.00 3.703 HESA1XSVILA2 0.68 0.08 0.02 11.76 0.19 0.01 0.00 5.263 B1XSVILA2 0.69 0.08 0.04 11.59 0.21 0.04 0.01 19.04 B1X HESA2 0.65 0.05 0.01

7.692 0.27 0.05 0.02 18.51 VRATZA35XSVILA2

20

0.74 0.05 0.02 6.756 0.23 0.02 0.00 8.695

5.6. CONCLUZII PARŢIALE

În privinţa indicelui biologic al masei larvelor, coeficientul de variabilitate prezintă o medie de 8.04%, se poate observa o mare omogenitate a raselor studiate.

Prin corelarea directă a lungimii şi masei larvelor la rase, se poate observa o corelaţie pozitivă, apreciată prin coeficientul de regresie liniară (R2=0.9458), ceea ce semnifică faptul că lungimea larvelor se corelează aproape perfect cu masa larvelor.

CAPITOLUL VI. MATERIALE ŞI METODE UTILIZATE PENTRU REALIZAREA ANALIZEI RAPD

6.1. MATERIALE UTILIZATE

S-au luat în studiu ca şi material biologic în prima etapă: 6 rase: AB, IBV, B1, RG90, AC29/T, AC/T şi 2 hibrizi: H1 = ♂ AC/T x ♀S8XAc29/T; H2 = ♂ AC/T x ♀ AC29/T;

- iar în etapa a doua 8 din hibrizii consacraţi: S8 x AC 29/T, AC 29/T x S8, AC x B1, BB1 x AC, Hesa1 x Svila2, B1 x Svila2, B1 x Hesa2, Vratza35 x Svila2 şi o rasă S8; 6.2. METODE DE LUCRU 6.2.1. Protocolul extracţiei de ADN

În vederea obţinerii unui ADN de calitate care să poate fi utilizat în tehnica RAPD, în prima etapă s-a izolat ADN genomic din ouă de viermi de mătase provenite de la S.C. Sericarom Băneasa.

13

În a doua etapă s-a efectuat izolarea ADN din ouă (Hesa1 x Svila2, B1 x Svila2, B1 x Hesa2, Vratza35 x Svila2) şi din porţiunea posterioară a glandei sericigene a viermelui de mătase din vârsta a V-a (S8 x AC 29/T, AC 29/T x S8, AC x B1, B1 x AC, S8) larvele de viermi de mătase au fost crescute în modul sericicol familial în cadrul laboratorului de Apicultură-Sericicultură, USAMV Cluj-Napoca, fiind prelevate în vârsta a V-a şi păstrate în condiţii optime la -20° C până la folosirea lor.

După izolarea materialului biologic s-a realizat mărunţirea şi omogenizarea lui prin mojararea cu azot lichid conform cu protocolul descris de Suzuki şi colab., în anul 1972. Extracţia ADN a continuat folosind kitul de extracţie: Wizard Genomic DNA Purification Kit [PROMEGA]-(WGDP)- care este un kit de extracţie ce furnizează ADN de puritate ridicată. 6.2.2. Cuantificarea ADN-ului

Metoda uzuală de apreciere a purităţii ADN-ului este cea spectrofotometrică, în vederea cuantificării ADN-ului extras, s-a folosit Spectofotometrul NanoDrop ND-1000. 6.2.3. Amplificarea PCR

Amplificarea PCR a ADN-ului genomic s-a efectuat cu un număr de 44 primeri RAPD, conform protocolului de amplificare descris de către Williams şi colab., 1990, modificat de Nagaraja şi şi colab., în anul 1995, acest protocol de amplificare a fost optimizat în funcţie de termocycler-ul utilizat în anul 2009 (BioRad, iCycler), temperatura utilizată în actualul experiment fiind cu 1-2º C mai mică, iar în cazul extensiei timpul a fost redus la jumătate. În vederea evidenţierii polimorfismelor între rasele şi hibrizii de viermi de mătase luaţi în studiu, au fost aleşi 44 de primeri RAPD, în concordanţă cu literatura de specialitate. 6.2.4. Migrarea elecroforetică -în gel de agaroză 2%; 6.2.5. Preluarea imaginilor -Vizualizarea produşilor de amplificare prin electroforeză se evidenţiază în lumină UV, se realizează capturarea imaginii gelului de agaroză cu ajutorul sistemului UVP (BioSpectrum AC Imaging System) BioChemi HR Camera (Made in Japan), SYBR Gold 485-655nm filter imaginea obţinută se numeşte fingerprint. 6.3.ANALIZA DATELOR

În prima etapă: analiza bioinformatică a datelor s-a efectuat cu Neighbour Joinning analyse, Coeficientul Nei-Li, Bootstrap 1000.

În etapa a doua: interpretarea rezultatelor s-a efectuat cu programul Free Tree 0.9.1.50, utilizând coeficientul Jaccard pentru distanţele genetice, respectiv metoda UPGMA;

CAPITOLUL VII. REZULTATE ŞI DISCUŢII PRIVIND POLIMORFISMUL OBŢINUT CU PRIMERII RAPD

7.1. MATERIALUL BIOLOGIC S-a prelevat material biologic (ouă de Bombyx mori) şi s-a observat că prin

mojararea cu azot lichid conform (Suzuki, 1972), a rezultat o mai bună mărunţire şi omogenizare a probelor.

14

7.2. REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA ŞI ELECTROFOREZA PRODUŞILOR DE REACŢIE

Fragmentele de ADN au fost amplificate fără probleme şi datorită folosirii în amestecul de reacţie a PVP-ului în procent de 2%. Din cei 44 de primeri RAPD testaţi, au fost utilizaţi mai departe pentru evaluarea diversităţii genetice a tuturor hibrizilor un număr de 35. Reacţiile cu primerii RAPD au generat un total de 876 de fragmente polimorfice, cu o medie de 8,9 fragmente/primer. Aceşti 35 de primeri au fost aleşi în funcţie de numărul de benzi polimorfice date şi repetabilitatea amplificărilor.

Ladder AB IBV B1 RG90 H1 H2 AC29/T AC/T

Figura 6 .Ampliconii obţinuţi cu ajutorul primerului OPF 20

Figura 7. Dendrograma, generată de programul TreeView alcătuită pe baza distribuţiei

genetice dintre unele rase de viermi de mătase, după metoda Neighbour Joinning analyse, utilizând coeficientul Nei-Li/Dice şi programul FreeTree

15

Din dendrogramă se poate observa clasificarea probelor studiate în trei grupuri. Valorile prezentate în dreptul nodurilor dendrogramei reprezintă rezultatul analizei bootstrap asupra arborelui, executată în 1000 de repetiţii. Proba H2 este foarte îndepărtată genetic de grupul format din ceilalţi indivizi analizaţi, clasificare susţinută de o valoare maximă de bootstrap, 100. Este firesc acest lucru datorită faptului că acesta este un hibrid. Probele AB şi H1 au format un grup, iar probele AC29/T, AC/T, B1, IBV şi RG90 au format un alt grup. Valorile de bootstrap sunt înfăţişate pe dendrogramă în drepturile nodurilor, prezentând valori peste 50, excepţie de la acest fapt, fiind valoarea de 22, care susţine clasificarea grupelor formate din probele AB şi H1 şi respectiv, AC29/T, AC/T, B1, IBV şi RG90.

Tabelul 3 Analiza valorilor calculate ale indicilor aferenţi similitudinii genetice

la rasele şi hibrizii analizaţi Rasa/ Hibridul AB IBV B1 RG90 H1 H2 AC29/T AC/T

AB IBV 0,42 B1 0,58 0,62 RG90 0.21 0,43 0,47 H1 0.75 0,50 0,63 0,27 H2 0,65 0,46 0,50 0,25 0,69 AC29/T 0,62 0,48 0,59 0,24 0,69 0,64 AC/T 0,57 0,56 0,57 0,38 0,62 0,59 0,65

H1 = ♂ AC/T x ♀ S8xAC29/T; H2 = ♂ AC/T x ♀ AC29/T.

Cea mai mare similitudine genetică (0,75), a fost înregistrată între indivizii AB şi H1, iar cea mai mică similitudine genetică (0,21) a fost înregistrată între indivizii AB şi RG90. Distanţa genetică medie între indivizii studiaţi a fost de 0,48.

În etapa a doua 21 de primeri din totalul de 35 de primeri utilizaţi au generat 921 de benzi polimorfice care au putut intra în analiza matematic-statistică de interpretare a relaţiilor de filogenie Total Lab 120, UVP soft.

Se poate observa datorită dendrogramei gruparea probelor luate în studiu în trei grupe, prima conţinând hibridul Hesa 1 x Svila 2 care este îndepărtat faţă de grupurile formate de ceilalţi indivizi, observaţie susţinută de o valoare foarte mare de bootstrap egală cu 100. Apariţia benzilor non-parentale la proba care conţine hibridul Hesa 1 x Svila 2, generate prin metoda s-a încercat a fi explicată prin mai multe ipoteze: formarea moleculelor de heteroduplex între alele, mutaţii sau recombinări la nivelul locusurilor de ataşare a amorsei sau în interiorul fragmantelor de amplificat, sau competiţia pentru locusurile de ataşarea Nicese şi colab., 1998.

Al doilea grup este format din 2 subgrupuri, în primul subgroup este clasificată proba care conţine rasa S8, iar în cel de-al doilea subgroup este împărţit în două grupe care include în prima probele Ac29/T x S8 şi S8 x Ac /T care au o similitudine genetică indicată de bootstrap cu valoarea 51, iar în a doua probele AC x B1 şi B1x Ac au o valoare de boostrap de 70.

16

Al treilea grup este format din 2 subgrupuri: primul doar din proba B1x Hesa 2, iar al doilea din B1 x Svila 2 şi Vratza 35 x Svila 2.

Analiza RAPD reliefează faptul că următoarele probe luate în studiu sunt aproape identice din punct de vedere molecular: AC x B1 şi B1 xAC- având o valoare ce 70 in dreptul nodului, B1 x Svila şi Vratza 35 x Svila2- sunt foarte aproape identice din punct de vedere molecular având o valoare de bootstrap de 90. Analiza datelor prelucrate folosind, Coeficientul Jaccard, cu ajutorul programului Free Tree şi Bootstrap 1000 este evidenţiată în tabelul 4, datele sunt prelucrate folosind metoda UPGMA, Coeficientul Jaccard, Bootstrap 1000.

Outgroup

HESA1xSVILA2

S8

AC29/TxS8

S8xAC29/T 51

ACxB1

B1xAC 70

40

29

B1xHESA2

B1xSVILA2

VRATZA35 XSVILA2

90

28

56

100

100

Figura 8. Dendrograma, generată de programul TreeVie, alcătuită pe baza distribuţiei genetice dintre unii hibrizi şi o rasă de viermi de mătase prin metoda UPGMA, utilizând

coeficientul Jaccard cu ajutorul programului FreeTree

Media distanţelor genetice între hibrizii şi rasa luată în studiu este 0,53; cea mai

17

mică distanţă genetică este 0,302; între S8 şi B1 x Svila, iar cea mai mare distanţă genetică, 0,753; este între S8 x AC 29/T şi B1X AC;

Tabelul 4 Analiza valorilor calculate ale indicilor aferenţi similitudinii genetice

la probele analizate

Race/

Hybrid

Vratza35x Svila2

BB1x Svila2

Hesa1x Svila2

S8xAC2

9/T BB1x

Hesa2ACxB1 S8

AC29/TxS8

BB1xAC

Vratza35 x Svila2

BB1 X Svila2 0.557

Hesa1 X Svila2 0.689 0.481

S8XAC29/T 0.639 0.479 0.553

BB1X Hesa2 0.444 0.438 0.532 0.527

ACXBB1 0.582 0.365 0.352 0.503 0.436

S8 0.609 0.302 0.494 0.434 0.440 0.376

AC29/TXS8 0.393 0.538 0.591 0.599 0.452 0.516 0.523

B 0.753B1 X AC 0.590 0.664 0.672 0.652 0.687 0.708 0.495

7.3. CONCLUZII PARŢIALE • În prima etapă: s-au efectuat extracţii de ADN din ouă de Bombyx mori şi s-a

observat că prin mojararea cu azot lichid rezultă o mai bună mărunţire şi omogenizare a probelor;

• Din cei 44 de primeri utilizaţi la rase 34 au generat benzi polimorfice; • Distanţa genetică medie între indivizii studiaţi a fost de 0,48; • Se evidenţiază faptul că există diferenţe majore de nivel genetic între rasele

studiate, ceea ce denotă ca aceste rase de Bombyx mori sunt populaţii locale cu un profil genetic bine conturat, în care fluxul genic intrapopulaţional a condus la diferenţierea unui ansamblu stabil de gene coadaptate.

• În etapa a doua, s-au efectuat extracţii de ADN din ouă şi glande sericigene din larve de viermi de mătase de vârsta a cincea, s-a observat că puritatea cea mai mare s-a obţinut la probele care conţineau glande sericigene;

• Din cei 35 de primeri utilizaţi 21 au generat benzi polimorfice • Distanţa genetică medie între probele analizate s-a dovedit a fi relativ mare 0.53 şi

poate fi datorată apartenenţei hibrizilor la două rase diferite, cât şi originii îndepărtate a acestor rase.

18

CAPITOLUL VIII. MATERIALE ŞI METODE UTILIZATE PENTRU REALIZAREA ANALIZEI SSR

8.1. MATERIALE UTILIZATE 8.1.1. Material biologic

Materialul biologic a fost reprezentat de: 7 rase crescute în anul 2009: AB, IBV, B1, RG 90, Ac 29/T, Ac/T , S8; 3 rase crescute în anul 2011 AB, B1, AC/T şi 8 hibrizi: S8 x Ac 29/T, Ac 29/T x S8, Ac x B1, B1 x Ac, Hesa1 x Svila 2, B1 x Svila 2, B1 x Hesa 2, Vratza 35 x Svila 2; Pentru o analiză cât mai completă s-au luat câte 10 indivizi din fiecare rasă şi hibrid. 8.2. METODE DE LUCRU 8.2.1. Extracţia ADN

S-au preluat de la -20 ºC câte 10 viermi de mătase din fiecare rasă şi hibrid luat în experiment, izolarea ADN-ului a fost efectuată din porţiunea mijlocie a glandei sericigene a fiecărui vierme de mătase. Extracţia a fost efectuată cu Chelex 5%. 8.2.2. Cuantificarea ADN-ului-la terminarea incubaţiei s-a citit cantitatea şi puritatea ADN-ului cu ajutorul unui Spectrofotometru UV-VIS NanoDrop ND-2000; 8.2.3. Amplificarea PCR

Amplificarea PCR s-a realizeat prin repetarea a 35 de cicluri într-un termocycler (BioRad C 1000); Au fost testaţi nouă primeri SSR nemarcaţi fluorescent, secvenţele lor fiind preluate din literatura de specialitate, iar din aceştia s-au ales cinci primeri (SAT 951, SAT 1423, TO1CTA07R, SAT 346, CA16G03R) la care secvenţele forward au fost marcate. De asemenea, pentru reducerea costurilor de rulare a electroforezei capilare, primerii au fost marcaţi cu fluorocromi diferiţi (D2, Cy5, Cy5.5), putându-se realiza astfel un multiplex. Protocolul GenomeLab Fragment Analysis Protocol a fost adaptat astfel că s-au pregătit produşii rezultaţi din amplificarea PCR pentru introducerea lor în echipamentul Beckman.

8.3. ANALIZA DATELOR Analiza cromatogramelor a fost realizată cu ajutorul programului CEQTM

Fragments Analysis distribuit de Beckman Coulter. Programul GenAlEx 6.41, testul Chi-pătrat pentru evidenţierea echilibrului genetic HW; testul AMOVA (analiza moleculară a coeficientului de varianţă), coeficientul RST şi coeficientul Nei, programul StatSoft Inc., Statistica data analysis software sistem, version 10.

CAPITOLUL IX. REZULTATE PRIVIND POLIMORFISMUL OBŢINUT CU

PRIMERII SSR 9.1. REZULTATE OBŢINUTE CU PRIMERII SSR

Rezultatele obţinute privind puritatea ADN-ului, în urma extracţiei cu Chelex 5 %, evidenţiază avantajul utilizării lui ca metoda de extracţie, pe care o putem considera rapidă, putând fi uşor de depozitat la 4 ºC.

19

Această metodă de extracţie a fost pusă la punct în prezenta teză de doctorat şi reprezintă o premieră ca metodă de extracţie şi purificare a ADN-lui la viermii de mătase din România. 9.1.1. Mărimea alelelor generate de primerii SSR

Tabelul 5 Alelele obţinute cu primerii SSR la viermii de mătase

Primer SAT 951 SAT 1423 TO1CTA07R SAT 346 CA16G03R

Nr.de alele 6 8 6 4 7

Alele 97 159 244 131 224 99 161 246 135 226 105 165 248 139 236 111 167 264 141 238 113 169 266 244 117 171 282 246

173 248 177

Numărul de alele identificate de fiecare primer este cuprins între patru la primerul SAT 346 şi opt la primerul SAT 1423.

În ceea ce priveşte rasa S8, şi hibridul S8 X AC29/T aceasta se află în echilbru genetic Hardy-Weinberg pentru toţi cei cinci loci analizaţi, fiind singurele aflate în echilibru genetic pentru toţi loci utilizaţi. Media numărului de indivizi analizaţi este de 7.40±0.30, numărul mediu de alele pe locus este de 2.40±0.11, numărul efectiv de alele pe locus este de 1.83±0.08.

Heterozigoţia observată (Ho), are valori mai mici decât heterozigoţia aşteptată, per total locusuri prezintă o valoare de 0.290±0.031 faţă de He care are o valoare de 0.374±0.026, ceea ce semnifică că 29% din 180 de indivizii analizaţi sunt heterozigoţi.

Conform mediei indicelui de fixare pentru rasele şi hibrizi analizaţi în prezentul studiu, a rezultat că aceştia prezintă un exces de homozigoţi.

9.2. DISTRIBUŢIA ALELELOR

Figura 9. Distribuţia alelelor

20

9.3. ANALIZA VARIAŢIEI GENETICE ÎN CADRUL RASELOR ŞI HIBRIZILOR

Intre indivizi/ Among Indiv 77%

Intre populatii/Among Pops 23%

Figura 10. Coeficientul de varianţă moleculară între probele analizate

În figura 10, se poate constata că coeficientul de varianţă moleculară are valori de

23% între cele 18 populaţii analizate (însumând cele 18 rase şi hibrizi analizaţi), ca rezultat al originii diferite al raselor şi hibrizilor. Între indivizi, coeficientul de varianţă moleculară a înregistrat valori de 77%.

Valorile obţinute atât între populaţii cât şi între indivizii sunt considerate valori mari care evidenţiază faptul că rasele şi hibrizii analizaţi ca populaţie, dar şi indivizii ce compun populaţia (indivizi ce aparţin raselor şi hibrizilor de viermi de mătase) sunt diferiţi genetic.

Figura 11. Histograma distribuţiei distanţei genetice la indivizii analizaţi În figura 11. sunt mai bine evidenţiate distanţele genetice a celor 153 de probe analizate, distanţa medie înregistrată pentru a acestea fiind de 0.51.

21

Distanţele genetice foarte mari identificate la rasa IBV, confirmă faptul că rasa IBV este singura dintre rasele luate în analiză care are origini foarte diferite de celelate rase, deoarece este o rasă la origine polivoltină, însă de-a lungul timpului prin selecţie şi aclimatizare a devenit monovoltină, acest lucru nefiind considerat un impediment deoarece de-a lungul anilor s-a demonstrat că această rasă este una stabilă şi omogenă, lucru dovedit şi de analizele SSR. 9.4. CONCLUZII PARŢIALE

1. S-au utilizat cinci primeri marcaţi pe care i-am adnotat (SAT 951, SAT 1423, TO1CTA07R, SAT 346, CA16G03R), fiecare primer a fost utilizat individual pentru amplificarea probelor, iar în momentul introducerii lor în Beckman, a fost dezvoltat un sistem de amplificare multiplex pentru a reduce costurile de rulare a electroforezei capilare.

2. Coeficientul de varianţă a identificat valori distins semnificative între rasele şi hibrizii analizaţi (23%) şi (77%) între îndivizii analizaţi.

CAPITOLUL X. CONCLUZII GENERALE 1. Acest studiu reprezintă primul de acest gen din România, importanţa lui

fiind dată de necesitatea caracterizării moleculare a raselor şi a hibrizilor de viermi de mătase din specia Bombyx mori L., care fac parte din fondul genetic sericicol autohton al României.

2. În prezentul studiu s-au utilizat două tehnici moleculare, mai precis doi

markeri moleculari pentru analizele propuse: markeri RAPD- folosiţi în analizele de screening şi markeri SSR-utilizaţi pentru caracterizarea moleculară a raselor şi hibrizilor de viermi de mătase Bombyx mori, din România.

3. În urma creşterilor experimentale efectuate s-a putut realiza o clasificare a

raselor şi hibrizilor în funcţie de fiecare parametru studiat astfel: • prolificitatea: rasa AC/T; hibridul B1 X Hesa2; • procentul de ecloziune: rasa IBV; hibridul Hesa1 x Svila2; • lungimea larvelor: rasa AC29/T; hibridul B1X AC; • masa larvelor: rasa AC/T; hibridul B1 X Hesa2; • masa glandelor sericigene: rasa B1; hibridul B1 X Svila 2; • masa gogoşii crude şi a incartamentului: hibridul B1 X Svila 2; • masa gogoşii uscate- rasa RG90; • masa incartamentului: rasa AC29/T; • lungimea firului de mătase: hibridul: AC29/T X S8.

4. Se evidenţiază faptul că există diferenţe majore de nivel genetic între rasele

şi hibrizii analizaţi, ceea ce denotă că aceştia sunt populaţii locale cu un

22

profil genetic bine conturat, în care fluxul genic intrapopulaţional a condus la diferenţierea unui ansamblu stabil de gene coadaptate.

5. În ceea ce priveşte rasa S8, şi hibridul S8 X AC29/T aceştia se află în

echilibru genetic Hardy-Weinberg pentru toţi cei cinci loci analizaţi.

6. Heterozigoţia observată (Ho), are valori mai mici decât heterozigoţia aşteptată, pe total locusuri prezintă o valoare de 0.290±0.031 faţă de He care are o valoare de 0.374±0.026, ceea ce semnifică că 29% din 180 de indivizii analizaţi sunt heterozigoţi.

7. Conform mediei indicelui de fixare pentru rasele şi hibrizi analizaţi în

prezentul studiu, a rezultat că aceştia prezintă un exces de homozigoţi.

ELEMENTE DE ORIGINALITATE

1. Gradul de noutate al tezei constă în faptul că rasele şi hibrizii de viermi de mătase Bombyx mori au fost caracterizate complet, atât fenotipic prin metode standardizate cât şi molecular printr-o analiză primară RAPD şi o analiză mai complexă cea a microsateliţilor.

2. Protocolul de extracţie ADN cu Chelex 5% şi proteinază K utilizat,

reprezintă o premieră în ceea ce priveşte utilizarea lui la viermii de mătase din România.

3. Datorită locusurilor evidenţiate prin studiul de polimorfism s-au putut

identifica rasele şi hibrizii predispuşi la o depresie de consangvinizare în următorii ani, acestea prezentând încă de pe acum un exces de homozigoţi.

RECOMANDĂRI ŞI PERSPECTIVE

1. Se recomandă continuarea cercetărilor în ceea ce priveşte studierea

polimorfismului în special a analizei SSR la toate rasele şi hibrizii din fondul genetic autohton pentru a creşte valoarea informaţiilor despre acestea şi pentru a identifica rase genitoare de hibrizi heterozigoţi.

2. În vederea unei mai bune conservării a raselor şi hibrizilor de viermi de mătase

care fac parte din fondul genetic sericicol autohton al României, este necesară stabilirea cât mai exactă a variabilităţii genetice a acestora, aceasta este bine să fie determinată pe două niveluri: fenotipic şi genotipic.

23

REFERINŢE BIBLIOGRAFICE

1. Akkaya, M. S., Shoemaker, R. C., Specht, J.E., Bhagwat, A. A., and P. B., Cregan, 1995, Integration of simple sequence repeats DNA markers into a soybean linkage map. Crop. Sci. 35, 1439-1445.

2. Aufauvre-Brown, A., J. Cohen, and D.W. Holden, 1992, Use of Randomly Amplified Polymorphic DNA Markers to Distinguish Isolates of Aspergillus fumigatus, J. Clin. Microbiol., 30, 299l -2993.

3. Ballinger-Crabtree, M. E., W. C. V. Black, and B. R. Miller (1992). Use of Genetic Polymorphisms Detected by the Random Amplified Polymorphic DNA Polymerase DNA Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR) for Differentiation and ldentification of Aedes Aegpti Subspecies and Population, Amer. J. Trop. Med & Hyg., 47, 893-901.

4. Bruford, M.W. and R.K. Wyne, 1993, Microsatellites and their application to population genetic studies. Curr. Opin. Genet. Dev. 3, 939-943.

5. Bura, M., 1992, Curs de tehnologia producţiei sericicole. Universitatea de Ştiinţe Agricole a Banatului Timişoara.

6. Chatterjee, S.N. and T. Tanushree, 2004, Molecular Profiling of Silkworm Biodiversity in India: An Overview. Russian Journal of Genetics, Vol. 40, No. 12, 2004, pp. 1339-1347. From Genetika, Vol. 40, No. 12, 1618-1627.

7. Crooijman, R.P.M.A., P.A.M. Vanoers, J.A. Strijk, J.J. Vanderpoel, M.A. M., Groenen, 1996, Preliminary linkage map of the chicken (Gallus domesticus) genome based on microsatellite markers- 77 new markers mapped. Poult. Sci. 75: 746-754.

8. Dib, C., Sabine Fauré, Cécile Fizames, Delphine Samson, Nathalie Drouot, A. Vignal, P. Millasseau, Sophie Marc, J. Kazan, E. Seboun, M. Lathrop, G. Gyapay, J. Morissette and J. Weissenbach, 1996, A comprehensive genetic map of the humain genome based on 5264 microsatellites, Nature 380:152-154.

9. Dietrich, W.F., J. Miller, R. Steen, M.A. Merchant, D. Damronboles, Z. Husain, R. Dredge, M.J. Daly, K.A. Ingalls, T.J. O’Connor, C.A. Evans, M. M., DeAngelis, D.M. Levinson, L. Kruglyak, N. Goodman, N.G. Copeland, N.A. Jenkins, T.L. Hawkins, L.Stein, D.C. Page, and E.S. Lander, 1996, A comprehensive genetic map of the mouse genome, Nature, 380:149-152.

10. Field, D., and C. Willis, 1996, Long polymorphic microsatellites in simple microorganisms. Proc. R. Soc. Lond. Ser. B. Biol. Sci. 263:209, 215.

11. Goldsmith, M.R., T. Shimada and A. Hiroaki, 2005, The genetics and genomics of the silkworm, Bombyx mori, Annual Review of Entomology, Proquest Agricultura Journals,71.

12. Gotelli, D., C. Sillero-Zubiri, G.D. Applebaum, M.S. Roy, D.J. Girman, J. Garcia-Moreno, E.A. Ostrander, and R.K. Wayne, 1994, Molecular genetics of the most endangered canid: The Ethiopian wolf Canis simensis., Mol. Ecol. 3, 301-312.

13. Hubbell, S., 2001, Shrinking the Cat: Genetic Engineering Before We Knew about Genes. Boston: Houghton Mifflin, 175.

24

14. Jeffreys, A.J., A.J. Allen, E. Hagelberg, and A. Sonnberg, 1991, Identification of the skeletal remains of Josef Mengele by DNA analysis. Nature, 352, 427-429.

15. Jung, D.S., I.J. Rhe, S.M. Lee, 1989, Classification and selection of the breeding materials in the silkworm, Bombyx mori, by multivariate analysis. Classification of the silkworm genetic stoks by principal component analysis and cuuster analysis. Miryang National Junin. Coll. Of Agriculture and Sericiculture, Miryana, Korean Journal Of Sericicultural Science (Korea Republic), 31:2, 102-112.

16. Kazan, K., J. M. Manners, and D.F. Cameron, 1993, Genetic Relationships and Variation in the Stylosanthes guianensis complex assessed by Random Amplified Polymorphic DNA, Genome, 36, 43-49.

17. Kurin, R., 2002, The Silk Road: Conecting Cultures, Creating Trust” Talk Story, Fall, Smith-sonian Center for Folklife and Cultural Heritage 21, 1-11.

18. Lehmann, P.F., D. Lin, and B.A. Lasker, 1992, Genotypic Identification of Characterization of Species and Strains within the Genus Candida by Using Random Amplified Polymorphic DNA, J. Clin. Microbiol., 30, 3249-3254.

19. Morin, P.A., J.J. Moore, R. Chakraborty, L. Jin, J. Goodall, and D.S. Woodruff, 1994, Kin selection, social structure, gene, flow and evolution of chimpanzees, Science, 265, 1193-1201.

20. Nagaraja, G.M. and J. Nagaraju, 1995, Genome fingerprinting of the silkworm, Bombyx mori, using randim arbitrary primers, Electrophoresis, 16, 1633-1638.

21. Nicese, F.P., J.I. Hormaza, and G.H. Mcgranahan, 1998, Molecular characterization and genetic relatedness among walnut (Juglans regia L.) genotypes based on RAPD markers, Euphytica 101, 199–206.

22. Ostander, E.A., J.F. Sprague, and J.Jr. Rine, 1993, Identification and characterization of dinucleotide repeat (CA)n markers for genetic mapping in dog, Genomics 16, 207-213.

23. Paşca, I., L.Al. Mărghitaş, D. Dezmirean, Laura Laslo, Georgeta Diniţă, O. Maghear, Dana Pusta, R. Morar, A. Cîmpean, R. Oroian, Claudia Bagita, 2008b, Technological features of parental breeds dry cocoon and hybrid combinations on mulberry silkworm (Bombyx mori L.) – SERISTECH, The Proceedings of the First Internatiolnal Conference „Sericulture – From Tradition to Modern Biotechnology”, U.S.A.M.V. Cluj-Napoca, Editura AcademicPres, 17 – 18 aprilie, ISBN 978-973-744-109-6, 119 – 132.

24. Prasad, D.M., M. Muthulakshmi, M. Madhu, Sunil Archak, K. Mita and J. Nagaraju, 2005a, Survey and Analysis of Microsatellites in the Silkworm, Bombyx mori: Frequency, Distribution, Mutations, Marker Potential and Their Conservation in Heterologous Species, Genetics 169, 197–214.

25. Suzuki, Y., L. Gage, and D.D. Brown, 1972, The genes for silk fibroin in Bombyx mori, J., Mol. Biol., 70, 637–649.

26. Williams, J.G. K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski, and S.V. Tingey, 1990, DNA Polymorphism Amplified by Arbitrary Primers Are Useful Genetic Markers, Nucl. Acids Res.,18, 653l -6535.

25