Universitatea Tehnica “Gh. Asachi” Iasi. Facultatea de Inginerie Chimica si Protectia Mediului

Determinarea rapidă a cafeinei utilizând microextracţia cu solvent şi cromatografia gazoasă cuplată cu spectrometria de masă

Botezatu Vasilica Madalina Grupa:2502

Specializare:PFC

Introducere

În 1820, la solicitarea lui Goethe, farmacistul german Friedlieb Ferdinand Rungef izolează

cofeină pură din boabele de cafea. În 1821, independent de Runge, farmaciștii francezi Pierre

Joseph Pelletier, Joseph Bienaimé Caventou și Pierre Robiquet reușesc de asemenea să izoleze

cafeina. În anul 1832 Pfaff și Justus von Liebig descoperă formula chimică a cofeinei

(C8H10N4O2) Formula structurală va fi descoperită în 1895 de Hermann Emil Fischer.

Numele de cafeină provine de la cafea, din care a fost izolată pentru prima oară substanța.

După nomenclatura IUPAC, denumirea cafeinei este 1,3,7-Trimethyl-2,6-purindion sau, pe scurt,

1,3,7-Trimethylxanthin . Cafeina face parte din grupul purinelor, ca și teofilina și teobromina.

Structura cafeinei constă dintr-un inel dublu, care la exterior are o serie de substituenți, în centru

fiind nucleul purinic.

Cafeina sau cofeina se găseşte în principal în Coffea arabica şi Camellia thea. Există o serie

de băuturi stimulante care conţin cofeină: Pepsi Cola 25-30mg sau ceaiul negru 50-100 mg.

Cafeina este un stimulant psihomotor cu efect de intensitate moderată, care se menţine până la 8

ore. Dozele de 100-200 mg au ca efect o stare de voiciune, atenuează starea de oboseală, cresc

capacitatea de efort intelectual şi/sau fizic şi ameliorează performanţele psihomotorii .

Dozele de 250-300 mg produc efecte diferite: fie de iritabilitate, nervozitate, tremur, insomnie,

pirozis dacă sunt administrate la consumatorii ocazionali, fie senzaţie de bine, scăderea iritabilităţii,

senzaţie de bine dacă doza este administrată la consumatorii cronici.

Efectul stimulant respirator este minim la doze mici, dar poate deveni relevant prin mărirea reactivităţii

centrilor bulbari la dioxidul de carbon. Cafeina participă şi la relaxarea musculaturii netede bronşice, cu

ameliorarea schimburilor gazoase sub aspect cantitativ.

Cafeina stimulează contracţia inimii, cu consum mărit de oxigen la nivelul miocardului, ceea ce poate fi

considerat ca factor limitativ al performanţei cardiace. La nivelul circulaţiei periferice, determină o

vasodilataţie arteriolară cu scăderea rezistenţei locale. Cafeina este un puternic stimulant al secreţiei

gastrice clorhidropeptice. La nivel renal creşte circulaţia sanguină şi inhibă reabsorbţia tubulară de sare,

ceea ce produce efectul de slab diuretic. Cei ce sufera de ulcer, boli de inima, hipertensiune arteriala si

anemie trebuie sa evite utilizarea cafeinei. Consumul indelungat de cafeina poate sa dea un oarecare

2

grad de dependenta, iar la intreruperea brusca a administrarii apare sindromul de sevraj, manifestat

prin iritabilitate si dureri de cap.

Determinarea rapidă a cafeinei dintr-o singură picătura de băuturi şi produse alimentare, utilizând microextracţia cu solvent şi

cromatografia gazoasă cuplată cu spectrometria de masă

S-a propus o metodă simplă şi rapidă de curăţare a probei şi preconcentrare pentru

determinarea cantitativă a cafeinei într-o picătură din băuturi şi produse alimentare prin

cromatografie gazoasă cuplată cu spectrometria de masă (GC/MS), utilizând microextracţia cu

solvent picătură cu picătură (DDSME).

Condiţiile optime experimentale pentru DDSME au fost: cloroformul ca solvent de extracţie,

timp de extracţie de 5 minute, 0.5µL volumul fazei extrase şi nici un adaos de sare la temperatura

camerei. Această metodă optimizată prezintă o liniaritate bună între 0.05 şi 5.0 µg/mL, cu un

coeficient de corelaţie de 0.980.

Deviaţia standard relativă (RSD) şi limitele de detecţie (LOD) ale metodei DDSME/GC/MS

au fost de 4.4%, respectiv 4.0 ng/mL. Recuperarea relativă a cafeinei din băuturi şi produse

alimentare a fost de 96.6-101%, ceea ce arată o fiabilitate bună a acestei metode. DDSME

exclude dezavantajele majore ale acestei metode convenţionale de extracţie a cafeinei, cum ar fi

consumul mare de probe şi de solvent organic, precum şi procesul lung de pre-tratare al probei.

Acest studiu dovedeşte că tehnica DDSME/GC/MS poate fi aplicată ca un instrument de

diagnostic simplu, rapid şi fezabil pentru aplicaţii biologice, ale mediului înconjurător sau ale

produselor alimentare, pentru analiza reală a unor cantităţi foarte mici de probă.

1. Introducere

Cafeină (1,3,7-trimetilxantina sau 3,7-dihidro-1,3,7- trimetil-1H-purina-2,6-diona) este un

alcaloid ce apare în mod natural în frunzele de ceai, boabe de cafea şi boabe de cacao sau frunze

şi este utilizată în mod tradiţional pentru efectele sale stimulatoare. Oamenii consumă cafeină în

cafea, ceai, cacao, ciocolată, multe băuturi răcoritoare şi unele medicamente.

Cafeina pură este inodoră şi are un gust amar. Aceasta este unul din aditivii permişi, din

punct de vedere legal, în băuturi, având o limită superioară de tolerabilitate de 0.015% (g/g).

3

Aceasta stimulează sistemul nervos central şi inima, acţionează ca diuretic şi intensifică

activitatea creierului. Cu toate acestea, cantitatea mare de cafeină consumată de fiinţele umane

poate cauza simptome nedorite, cum ar fi tremor, tahicardie, problem gastrointestinal, convulsii

şi chiar moarte. Prin urmare, este important să se monitorizeze cafeina în băuturi şi alimente

pentru menţinerea sănătoasă a organismului.

S-au propus mai multe metode de analiză bazate pe spectrometria UV-vis, HPLC, GC,

spectrometria IR cu transformata Fourier (FTIR), cromatografia de schimb ionic, electroforeza

capilară (CE) pentru determinarea cafeinei din băuturi şi produse alimentare. Dintre aceste

metode, metodele spectrometrice implică etape obositoare, laborioase şi care necesită timp

pentru pre-tratarea a probelor, şi de asemenea, există posibilitatea producerii interferenţelor

(teobromina şi teofilina).

Determinarea cromatografică a analiţilor necesită prepararea probelor prin extracţia lichid-

lichid (LLE) sau prin extracţia în fază solidă (SPE). Aceste metode necesită, de asemenea, timp

şi o cantitate mare de reactivi şi solvenţi. Microextracţia recentă a analiţilor prin microextracţia

în fază solidă (SPME) şi microextracţia în fază lichidă (LPME), incluzând microextracţia într-o

singură picătură (SDME), microextracţia în fază lichidă pe diferite fibre (HP-LPME) şi

microextracţia cu solvent picătură cu picătură (DDSME) au fost aplicate cu succes pentru analiza

probelor farmaceutice şi de mediu. Dintre aceste metode, SPME şi HF-LPME necesită fibre

pentru extracţia analiţilor.

În ceea ce priveşte metoda SDME, doar o singură micro-picătură de solvent este utilizată că

fază acceptoare, care este agăţată în vârful unei microseringi şi imersată în soluţie apoasă pentru

extracţia analiţilor.. Această metodă este foarte simplă, comodă şi are costuri foarte mici în

comparaţie cu SPME şi HF-LPME. SDME foloseşte până la 20mL soluţie apoasă pentru

extracţia analiţilor. în faza organică. Din punct de vedere comercial şi economic, volumul de

probă ar trebui redus la o cantitate mai mică, ceea ce ar putea fi util pentru industria de consum şi

producţie deoarece poate reduce, cu siguranţă, costul probelor. Astfel, DDSME este cea mai

bună tehnică care se potriveşte acestor obiective deoarece doar o picătură (7µL) de probă din

soluţie a fost utilizată pentru extracţia analitului.

Aceasta este prima aplicaţie a metodei DDSME/GC/MS utilizată pentru analiza unor probe

reale de băuturi şi produse alimentare, utilizându-se 7µL (o picătură) de probă din soluţie pentru

extracţia cafeinei timp de 5 minute la temperatura camerei şi, ulterior, determinată prin GC/MS.

4

2. Analiza experimentală

2.1. Reactivi şi produse chimice

Apa purificată a fost preparată cu ajutorul sistemului Milli-Q. Toţi solvenţii organici au fost

de grad HPLC. Metanolul a fost achiziţionat de la Mallinckrodt (Phillipsburg, NJ, SUA).

Cloroformul şi diclormetanul au fost obţinute de la Mallinckrodt (Paris, KY, SUA). Toluenul a

fost achiziţionat de la J.T. Baker (NJ, SUA). Octanul a fost achiziţionat de la Sigma–Aldrich

(Steinheim, Germania), iar cafeina de la Aldrich (St. Louis, MO, SUA). Soluţia stoc standard a

fost preparată prin dizolvarea a 10 mg cafeină în 10 mL de metanol şi a fost depozitată în sticle

cu dop la 200C. Soluţiile de lucru standard au fost preparate prin diluarea soluţiei stoc standard în

apă deionizată.

2.2. Colectarea şi prepararea probelor

Şase băuturi (Coca Cola, Spirit, Coca Cola Light, Pepsi, cafea Columbia, Tea Drink) şi şase

produse alimentare (Ceai negru, verde şi ceai Oolong, cafea Nescafe, ciocolată Kaiser’s Milk,

stafide Choco Ball), au fost colectate de pe pieţele locale din Tamusi, Taiwan. Probe de 25 mL

de băuturi au fost colectate în pahare de 100 mL şi păstrate într-o baie cu ultrasunete timp de 10

minute pentru a se degaja gazul prezent în probe. Apoi, după ce a fost filtrat prin hârtie de filtru

Whatman nr 44, filtratul a fost diluat cu apă deionizată în funcţie de cafeina prezentă în probe.

Probe de 0.5 g de ceai negru, verde şi ceai Oolong şi cafea Nescafe au fost cântărite separat

în pahare de 100 mL, şi 45 mL de apă fierbinte a fost adăugată fiecărei probe. Probele au fost

păstrate în apă fierbinte timp de 5 minute, cu o temperatură constantă de 800C. Soluţia a fost

filtrate prin hârtie de filtru Whatman nr 44, iar filtratul a fost diluat în funcţie de concentraţia

cafeinei prezentă în probă.

O probă de 4.0 g ciocolată a fost dizolvată în 45 mL apă fierbinte şi amestecată cu un agitator

mecanic, menţinând temperatura la 800C timp de 30 min. Soluţia a fost filtrată prin hârtie de

filtru, iar diluţia a fost făcută în funcţie de concentraţia de cafeină prezentă.

2.3. Modalităţi de extracţie ale microextracţiei cu solvent picătură cu picătură

5

În Fig. 1 este prezentată o schiţă a aparaturii DDSME pentru extracţia cafeinei dintr-o

picătură de probă din soluţie. O picătură (7µL) de apă pură conţinând 10 µg/mL cafeină a fost

colectată într-o fiolă de 100 µL. Apoi, 1 µL de solvent organic acceptor a fost colectat într-o

microseringă de 10 µL pentru extracţia DDSME şi injectarea în sistemul GC/MS. Înainte de

extracţia cafeinei, microseringa a fost spălată cu solvent de extractive pentru a preveni bulele de

aer care pot duce la erori în ceea ce priveşte reproductibilitatea rezultatelor. Acul a fost introdus

în fiolă cu probă şi imersat în probă de soluţie apoasă.

Seringa a fost ţinută în poziţie fixă în scopul de a plasa consecvent vârful acului în 7µL faza

apoasă. Apoi, pistonul seringii a fost lăsat jos pentru a expune 5µL de solvent de extracţie în fază

apoasă. După 5 minute, doar picătura organică a fost luată înapoi în seringă. În cele din urmă,

seringa a fost retrasă din fiolă cu probă şi solventul extras a fost injectat direct în sistemul

GC/MS pentru analiza cafeinei. Toate experimentele au fost realizate la temperatura camerei.

Fig.1. Schţta aparaturii DDSME pentru extracţia cafeinei dintr-o picătură de soluţie

2.4. Analiza GC/MS

Analiza cafeinei a fost realizată într-un sistem GC model Varian 3800, combinat cu un

spectrometru de masă cu sursă internă de captare a ionilor, în conformitate cu modalitatea de

ionizarea electronică. Heliu (99.999%) a fost utilizat ca gaz de transport cu un debit de 1.0

6

ml/min. Separarea prin GC a cafeinei a fost realizată prin utilizarea unei coloane capilare DB-5

obţinută de la Supelco, Bellefonte, PA, USA.

Următorul program de temperatură a fost menţinut în timpul separării cafeinei: 1500C timp

de 1 minut, 2300C cu 200C/min timp de 2 minute, iar timpul total al analizei a fost de 7 minute.

Injectările au fost realizate la 2500C. Dispozitivul de captare, linia de transmisie şi colectorul au

fost setate la 200, 280 şi respectiv 500C. Gama de mase a spectrelor a fost de 50-250 Da.

Monitorizare selectivă a ionilor (SIM) a fost utilizată pentru a efectua toate experimentele

cantitative ale cafeinei. Ionii utilizaţi pentru confirmarea valorilor m/z ale cafeinei au fost 194,

109, 82 şi 52.

3. Rezultate şi discuţii

3.1. Optimizarea metodei DDSME

În acest studiu, metoda DDSME a fost aplicată pentru toate extracţiile cafeinei din faza

apoasă în faza organică. Cel mai bun randament de extracţie al cafeinei a fost realizat prin

optimizarea efectelor selecţiei solventului, timpului de extracţie, volumului expus al fazei

extrase, precum şi adăugarea de sare în faza apoasă. Eficienţa metodei de extracţie a fost

evaluată în funcţie de media peak-urilor a trei injectări succesive (n=3).

3.1.1. Selectarea solventului organic

Proprietăţile chimice ale unor solvenţi organici diferiţi s-au bazat pe polaritatea acestora,

solubilitatea analiţilor. şi caracterul imiscibil cu faza apoasă. De asemenea, aceştia ar trebui să

prezinte un comportament excelent în ceea ce priveşte GC. Solvenţii organici utilizaţi pentru

extracţia cafeinei din faza apoasă au fost cloroformul, diclormetanul, toluenul şi n-octanul,

extracţie timp de 5 minute la temperatura camerei în absenţa adaosului de sare.

Cloroformul s-a dovedit a fi cel mai potrivit solvent pentru extracţia cafeinei din soluţie

apoasă, datorită solubilităţii ridicate ale substanţelor analizate cu acesta. De asemenea,

solubilitatea cafeinei în cloroform este de nouă ori mai mare decât a apei la temperatura camerei.

Astfel, cloroformul a fost ales pentru determinările experimentale ulterioare. Rezultatele

efectului solvenţilor sunt prezentate în tabelul 1.

3.1.2. Timpul de extracţie

Timpul de extracţie este un alt factor care ar putea afecta eficienţa extracţiei analiţilor. din

faza apoasă în faza organică. Ca şi cu LLE şi SPME, nu este necesar pentru LPME să atingă

7

echilibrul, deoarece aceasta nu este o extracţie completă, ci o compartimentare între faza apoasă

şi cea organică. Efectul timpului de extracţie asupra eficienţei extracţiei cafeinei din faza apoasă

a fost studiat prin monitorizarea variaţiei zonei peak-ului, cu timpul de extracţie de 3, 5, 7, 10 şi

15 minute, la temperatura camerei.

Tabel 1. Efectul solventului asupra eficienţei extracţiei cafeinei utilizând DDSME/GC/MS

O serie de probe de apă (10 µg/mL de cafeină) au fost preparate, iar variaţia zonei peak-ului

a fost investigată aşa cum se poate vedea în Fig. 2. Eficienţa extracţiei s-a dovedit a fi maximă la

5 minute, iar apoi a scăzut rapid. În DDSME, după timpul de extracţie de 5 minute, a apărut

problema epuizării solventului, ceea ce a cauzat scăderea eficienţei de extracţie a solventului.

Prin urmare, timpul de extracţie de 5 minute a fost utilizat pentru extracţia cafeinei pentru

experimentele ulterioare.

Fig.2. Efectul profilelor timpului asupra eficienţei extracţiei cafeinei obţinută prin DDSME

(nivelul concentraţiei de 10 µg/mL; cloroform ca solvent de extractţe; volumul de expunere

0.5µL al fazei acceptoare; fara adaos de sare la temperatura camerei)

3.1.3. Volumul de expunere al fazei de extracţie

8

Volumul de expunere al solventului organic în faza apoasă este un factor foarte important

care afectează eficienţa extracţiei a DDSME. Astfel, volumul diferit al fazei de extracţie, de la

0.2 la 1.0 µL, a fost expus la faza apoasă. Extracţia prin DDSME a cafeinei din faza apoasă a fost

stabilită la 5 minute-timp de extracţie, în absenţa adaosului de sare, la temperatura camerei.

Fig. 3 prezintă creşterea eficienţei extracţiei cafeinei în cazul în care volumul de expunere al

fazei de extracţie a fost crescut la 1.0 µL. Există posibilitatea miscibilităţii fazei apoase pe

măsura ce volumul de expunere al fazei acceptoare creşte mai mult de 0.5 µL, şi acest lucru a

provocat, de asemenea, o precizie scăzuta (RSD, >±12%) a rezultatelor prezentate în Fig. 3.

Fig.3. Efectul volumului de expunere al fazei acceptoare asupra eficienţei extractţei cafeinei

obţinută prin DDSME (nivelul concentraţiei de 10 µg/mL; cloroform ca solvent de extracţie;

volumul de expunere 0.5µL al fazei acceptoare; fara adaos de sare la temperatura camerei)

O analiză a testării varianţei (ANOVA) a fost efectuată în scopul de a verifica variabilitatea

rezultatelor la volume de expunere diferite. Valoarea varianţei obţinute prin testul ANOVA nu a

fost statistic semnificativ diferită. Cu toate acestea, pentru alte experimente, 0.5 µL-volum de

expunere al fazei de extracţie a fost utilizat în scopul de a menţine o precizie mai bună (RSD,

<±5%) a rezultatelor şi o manipulare mai uşoară a solventului organic din volumul extrem de

mic al probei (7 µL).

3.1.4. Adaosul de sare

Adaosul de sare în soluţia apoasă poate reduce solubilitatea analiţilor. în faza apoasă şi poate

spori migrarea lor spre faza organică în SDME şi LLE. Efectul concentraţiei sării asupra

9

extracţiei cafeinei a fost evaluat prin adăugare de clorură de potasiu (0-30%) în soluţia apoasă

(10µg/mL of cafeină). Fig. 4 arată că zona peak-ului a scăzut ci creşterea concentraţiei KCl în

intervalul studiat. Acest lucru se datorează migraţiei libere a analitului ce a fost interzisă prin

creşterea concentraţiei ionului din sare şi a vâscozităţii fazei apoase. Prin urmare, sarea nu a fost

utilizată pentru experimente ulterioare.

Fig.4. Efectul adaosului de sare asupra eficienţei extracţiei cafeinei obţinută prin DDSME

(nivelul concentraţiei de 10 µg/mL; cloroform ca solvent de extractţe; volumul de expunere

0.5µL al fazei acceptoare; fara adaos de sare la temperatura camerei)

3.2. Factorul de îmbogăţire şi evaluarea metodei

Factorul de îmbogăţire (EF) este definit că raportul dintre concentraţia de analit în faza

acceptoare (Co) şi concentraţia iniţială a analitului (Ci) în soluţie apoasă: EF= Co/Ci.

Condiţiile optime de extracţie au fost utilizate pentru a investiga factorul de îmbogăţire.

Factorul de îmbogăţire al cafeinei pentru extracţia la temperatura camerei a fost 16. Un grafic de

calibrare liniară a fost obţinut în intervalul de concentraţie al cafeinei de 0.05-5.0 µg/mL pentru

soluţii standard. Valoarea coeficientului de corelaţie a fost de 0.980, ceea ce indică o bună

corelaţie cu zona peak-ului în funcţie de concentraţia de cafeină. În plus, răspunsul liniar al peak-

urilor SIM obţinute cu soluţiile stoc reale a fost comparat cu DDSME în Fig. 5.

Limită de detecţie (LOD) a metodei DDSME a fost calculată ca fiind de trei ori deviaţia

standard (3σ). Limită de detecţie obţinută în apa deionizată a fost de 4.0 ng/mL.

Reproductibilitatea metodei a fost evaluată prin efectuarea a şase analize repetate (n=6) ale

10

soluţiei standard de 10 µg/mL cafeină. Deviaţia relativă standard (RSD) a metodei a fost de

4.4%.

11

Fig.5. Peak-urile SIM obţinute cu metoda DDSME (e-h) în comparaţie cu o soluţie stoc reală

de cafeină (a-d)

3.3. Metoda DDSME pentru determinarea cafeinei într-o picătură din băuturi şi

produse alimentare

Metoda DDSME a fost aplicată cu succes pentru determinarea cafeinei din diferite băuturi şi

produse alimentare. O cantitate de 7µL (o picătură) din probe diluate de băuturi, ceai, cafea şi

ciocolată au fost luate într-o fiolă pentru extracţia cafeinei prin DDSME şi apoi analizate prin

GC/MS. Valoarea cantitativă a cafeinei din băuturi şi produse alimentare a fost calculată pe baza

curbei de calibrare. Rezultatele obţinute pentru băuturi şi produse alimentare de soi diferit sunt

rezumate în tabelele 2 şi 3.

Concentraţia de cafeină din băuturi şi alimente a variat de la 74.8 la 389.6 µg/mL şi 0.15-

30.51 mg/g cu RSD de 3.0-7.3 şi 2.3-7.5%. Pentru a verifica corectitudinea metodei, cantităţi

cunoscute de cafeină au fost adăugate probelor cu băuturi şi alimente în scopul de a evalua

recuperarea relativă (table 4). Recuperarea relativă a cafeinei în băuturi şi alimente a fost găsită a

fi între 96.6-101% cu o precizie (RSD) de 3.9-6.3%.

Tabel 2. Determinarea cafeinei într-o picătură de băuturi prin metoda DDSME/GC/MS

Tabel 3. Determinarea cafeinei într-o picătură de soluţie de produs alimentar prin metoda

DDSME/GC/MS

12

Tabel 4. Rezultatele recuperării relative într-o picătură de băuturi şi alimente

3.4. Efectul matricei

Cele mai bune valori ale recuperării (96.6-101%) obţinute în probe de băuturi şi produse

alimentare demonstrează că matricea nu a avut nici un efect asupra analizei cafeinei prin metoda

DDSME. Factorul de îmbogăţire a fost calculat în probă de băutură (alcool) ca fiind similar cu

apa deionizată. Factorul de îmbogăţire găsit în băutură (alcool) a fost de 14 în condiţii optime de

desfăşurare a DDSME. Acest rezultat a relevant faptul că matricea probei de băutură analizată nu

a avut nici un efect asupra extracţiei cafeinei.

4. Concluzii

Pentru prima dată metoda DDSME/GC/MS este aplicată cu succes pentru determinarea

cafeinei într-o picătură de băuturi şi alimente diferite. Această metodologie este simplă, rapidă,

senzitivă, şi necesită volume mici de probă (7µL) pentru separarea şi preconcentrarea cafeinei.

De asemenea, este o tehnică low-cost datorită utilizării unor cantităţii mici de solvent şi reactivi

pentru extracţia cafeinei pe parcursul experimentelor.

13

S-a dovedit că DDSME/GC/MS este un instrument de diagnostic simplu, eficient şi rapid

pentru analiză cantitativă a unor cantităţi în urme de droguri în probe biologice de dimensiuni

ultra-mici, cum ar fi urina şi sângele.

Bibliografie:

14