broasca

Experimente pe sistem cardiovascular şi respirator de broască 7

EXPERIMENTE PE SISTEM CARDIOVASCULAR ŞI RESPIRATOR DE BROASCĂ Dr. Metz Júlia, Dr. Orbán-Kis Károly, Dr. Szilágyi Tibor

SCOPUL LUCRĂRII La această lucrare se doreşte investigarea funcţiilor cardiovasculare şi respiratorii la broască. Analiza funcţionării in situ (in vivo) şi in vitro a organelor de broască reprezintă metodă experimentală folosită pentru înţelegerea fiziologiei umane, broasca având sisteme funcţionale foarte similare cu cele umane. Scopurile definite ale lucrării sunt:

– demonstrarea mişcării ciliare la nivelul mucoasei respiratorii – microcirculaţia de la nivelul patului unghial – demonstrarea circulaţie arteriale şi venoase pe limba de broască – înregistrarea activităţii mecanice şi electrice a inimii de broască, demonstrarea efectului termic, a substanţelor inotrope şi cronotrope precum şi a variaţiei concentraţiei ionilor asupra activităţii cordului de broască – demonstrarea pragului de excitaţie şi a perioadelor refractare

Animalele de experienţă sunt manevrate doar de către asistent! Nu atingeţi şi nu daţi mâncare sau de băut animalelor de experienţă!

PRINCIPII TEORETICE Mişcarea ciliară. Toate căile respiratorii, de la cavitatea bucală/nazală şi până la bronhiolele terminale, sunt menţinute umede de către un strat subţire de mucus ce tapetează întreaga suprafaţă. Mucusul captează particulele mici din aerul inspirat, împiedicându-le să mai ajungă în alveole. Mucusul este în continuare reînnoit datorită clearance-lui mucociliar. Întreaga suprafaţă a căilor respiratorii este acoperită de un epiteliu ciliat, aproximativ 200 cili/celulă epitelială. Aceştia se mişcă în continuu cu o frecvenţă de 10-20 bătăi/s, iar direcţia de mişcare a mucusului este spre faringe. Astfel, mucusul din căile respiratorii inferioare se deplasează în sus, iar la nivelul cavităţii nazale în jos.

Figura nr. 1. Schema microcirculaţiei de la nivelul patului unghiei umane. (adaptat după D. P. Allen et al. Acquisition and analysis of nailfold capillary images)

8 Lucrări practice de fiziologie

Această mişcare continuă face ca stratul de mucus să se deplaseze încet, cu o viteză de aproximativ 1 cm/min, spre faringe unde împreună cu particulele capturate este înghiţit sau eliminat. Particularitatea anatomiei de broască este că epiteliul ciliat există şi în 1/3 superioară a esofagului. Microcirculaţia. Din punct de vedere structural microcirculaţia cuprinde mai multe categorii de vase: arteriole, venule, capilare (Figura nr. 1). Acestea pot fi vizualizate la om la nivelul patului unghial în timp ce la broască pe limbă şi membrana interdigitală. Vizualizarea microcirculaţiei la om permite numărarea arcurilor capilare, măsurarea diametrelor vaselor la acest nivel şi determinarea vitezei de circulaţie prin metoda Doppler. Acestă metoda poate fi folosită pentru diagnosticarea unor boli precum boala Raynaud, sclerodermia, etc. Vizualizarea vaselor de la nivelul limbii de broască permite recunoaşterea arteriolelor, în care circulaţia sângelui este în direcţia ramificaţiilor în timp ce în venule direcţia circulaţiei este dinspre vase mici spre vene mai mari. În arteriole viteza sângelui este mai mare şi se observă pulsaţii. Vizualizarea vaselor mari permite şi recunoaşterea circulaţiei laminare: se observă fluxul axial de viteză mai mare şi fluxul parietal de viteză mult mai mică (Figura nr. 2).

Figura nr. 2. Circulaţia laminară la nivelul arteriolelor (săgeţile din stânga reprezintă viteza straturilor de lichid).

Activitatea electrică şi mecanică a inimii. Potenţialul de acţiune reprezintă răspunsul electric al celulelor miocardice la acţiunea unui stimul a cărei intensitate depăşeşte valoarea prag.

Figura nr. 3. Fenomenul electric şi mecanic (FRA – faza refractară absolută, PA – potenţial de acţiune, MCG - mecanocardiogramă).


Pe timpul potenţialului de acţiune miocardul este în perioadă refractară, în acest timp fibra miocardică nu mai răspunde la stimuli electrici indiferent de intensitatea acestora. Potenţialul de acţiune este urmat de contracţia celulelor miocardice după un scurt interval de timp necesar cuplării electromecanice. Fenomenul mecanic şi electric au durată aproximativ egală (Figura nr. 3). Datorită existenţei perioadelor refractare fenomenele mecanice nu pot fi sumate şi astfel miocardul nu poate fi tetanizat. Succesiunea periodică a fazelor de contracţie şi relaxare este esenţială pentru funcţia de pompă (fază de umplere şi ejecţie). Modularea activităţii inimii.

1. Efectul termic: încălzirea sinusului venos creşte frecvenţa contracţiilor cardiace, iar încălzirea ventriculilor creşte amplitudinea contracţiilor acestora. Răcirea sinusului venos şi a ventriculilor scade frecvenţa respectiv amplitudinea contracţiilor. Atât contracţia cât şi excitabilitatea sunt dependente de activitatea unor sisteme enzimatice respectiv de modificarea conformaţiei unor proteine (canale ionice), influenţate de temperatură. 2. Mediatorii chimici: adrenalina produce creşterea frecvenţei şi amplitudinii contracţiilor prin acţiune asupra receptorilor adrenergici β1. Acetilcolina produce scăderea frecvenţei şi amplitudinii contracţiilor cardiace prin intermediul receptorilor colinergici muscarinici (M2). Prezenţa acestor receptori la nivelul fibrelor miocardice face ca aplicarea mediatorilor sistemului nervos vegetativ pe inima denervată să reproducă efectele stimulării simpatice, respectiv parasimpatice. 3. Concentraţia ionilor din spaţiul extracelular: creşterea concentraţiei Ca2+ extracelular are efecte "sistolizante", ducând la creşterea forţei de contracţie, în timp ce relaxarea diastolică devine din ce în ce mai redusă, până la oprirea inimii în sistolă prin acumularea calciului în spaţiul intracelular (fenomenul de "calcium rigor"). Creşterea concentraţiei K+ extracelular produce prin blocarea neselectivă a porurilor externe a canalelor de Ca2+ şi Na+ scăderea amplitudinii contracţiilor, până când inima se opreşte în diastolă (Figura nr. 4).

Figura nr. 4. Efectul concentraţiei ionilor asupra activităţii mecanice a inimii de broască.

4. Efectul îndepărtării pericardului: deschiderea pericardului permite o mişcare/expansiune mai a accentuată cavităţilor inimii ceea ce duce la creşterea sensibilităţii mecanismului Frank-Starling şi o creştere a volumului bătaie. Îndepărtarea pericardului duce la absenţa efectului vagal şi prin acesta la creşterea frecvenţei cardiace.

METODA DE ÎNREGISTRARE SIMULTANĂ A FENOMENELOR ELECTRICE ŞI MECANICE Pentru înregistrarea simultană a activităţii electrice şi mecanice a inimii de broască (Figura nr. 5) se folosesc trei electrozi metalici. Primul este inserat la baza inimii, al doilea (un cârlig


metalic) este prins la nivelul vârfului inimii, iar ultimul reprezintă electrodul de pământare. Înregistrarea activităţii electrice se realizează prin metodă bipolară şi amplificare diferenţiată. Semnalul electric preluat este amplificat şi apoi digitalizat.

Figura nr. 5. Schema aparaturii necesare pentru înregistrare (explicaţii în text).

Înregistrarea activităţii mecanice se efectuează cu ajutorul unui traductor mecano-electric (Figura nr. 6). Pe scurt aceasta funcţionează pe principiul dinamometrului, alungirea resortului elastic este proporţională cu forţa contracţiei. Miezul de ferită al bobinei este conectat la vârful inimii prin intermediul cârligului metalic, astfel contracţiile cordului modifică poziţia miezului şi prin aceasta proporţional inductanţa bobinei.

Figura nr. 6. Schema traductorului mecanoelectric (explicaţii în text). Introducând un cârlig metalic prin vârful inimii aceasta străpunge atât spaţiul extracelular (EC) cât şi cel intracelular (Figura nr. 7). Astfel se înregistrează un potenţial de leziune. Potenţialul înregistrat seamănă calitativ cu ceea ce se obţine prin metoda intracelulară cu microelectrozi dar există un curent extracelular (shunt) care distorsionează semnalul util, deci va trebui micşorat.

Figura nr. 7. Înregistrarea potenţialului de leziune (explicaţii în text).


Aceasta se efectuează prin creşterea rezistenţei spaţiului extracelular; alungirea fibrei miocardice este realizată prin punerea sub tensiune a firului (vezi şi ecuaţiile):

S

LR

R

VI

I – curent, V – diferenţa de potenţial, R – rezistenţa electrică, L – lungimea, S – suprafaţa de secţiune, ρ – rezistenţa specifică a ţesutului

ASPECTE DE ANATOMIE ŞI FIZIOLOGIE DE BROASCĂ Broasca este folosită pentru experimente întocmai pentru că are sisteme funcţionale similare cu cele umane dar cu o sensibilitate a ţesuturilor mai scăzută faţă de hipoxie şi ischemie. Principalele organe şi sisteme ce vor fi identificate în timpul disecţiei sunt prezentate într-un fişier [.pdf] intitulat „Anatomia funcţională de broască” ce poate fi accesat prin situl Disciplinei de Fiziologie (http://www.umftgm.ro/~fizio/edu/lp/data/anatomia_functionala_broasca.pdf). Inima de broască prezintă anumite particularităţi anatomice faţă de inima umană (Figura nr. 8). Inima de broască se compune din patru compartimente: sinus venos, atrii, ventricul, bulb aortic, care se contractă succesiv. În condiţii normale excitaţia se generează la nivelul sinusului venos şi se conduce de la un compartiment la altul; dar fiecare compartiment dispune şi de un pacemaker separat. În condiţii fiziologice, pacemakerul sinusului venos generează frecvenţa cea mai mare, 60 bătăi pe minut, guvernând activitatea electrică a inimii (overdrive suppression). Pacemakerul atrial poate genera un ritm de aprox. 50 bătăi pe minut, cel ventricular un ritm de 25 bătăi pe minut, iar cel din bulbul aortic un ritm de 10 bătăi pe minut. Între fiecare compartiment există o zonă joncţională la nivelul căreia conducerea electrică este încetinită. La aceste nivele impulsul electric întârzie permiţând o umplere mai bună a compartimentului următor şi prin acesta o hemodinamică mai eficientă. La om sinusul venos este înglobat în peretele atrial, există un pacemaker sinoatrial (denumire ce denotă originea filogenetică a acesteia) iar nodul sinoatrial este înconjurat de prima joncţiune (cel dintre SV şi A la broască) ceea ce poate cauza blocurile sinoatriale. LIGATURILE LUI STANNIUS Prin ligaturile lui Stannius se poate studia conducerea intracardiacă a excitaţiei. Înconjurând o zonă joncţională şi strângând aţa, se întrerupe mecanic conducerea impulsurilor electrice de la un compartiment la altul. Prima ligatură a Iui Stannius se face cu un fir de aţă subţire la nivelul limitei de separaţie dintre sinusul venos şi atrii. După prima ligatură a lui Stannius, sinusul venos îşi continuă contracţiile cu frecvenţa iniţială, de aproximativ 60/min, ritm impus de pacemakerul fiziologic, localizat la nivelul sinusului venos (ganglionul Remak, echivalentul nodului sinusal la om), iar atriile şi ventriculul se opresc în diastolă. După câteva minute acestea îşi reiau activitatea, dar cu o frecvenţă mai scăzută, de aproximativ 40/min; ritmul lor fiind determinat de un pacemaker localizat la nivelul atriilor (ganglionul Ludwig, echivalentul nodului atrioventricular la om). A doua ligatură a lui Stannius se face, cu păstrarea primei, la nivelul limitei de separaţie dintre atrii şi ventricul. După a doua ligatură a lui Stannius, sinusul venos se contractă cu frecvenţa iniţială, atriile se contractă cu frecvenţa dobândită în urma primei ligaturi, în timp ce ventriculul, după o pauză de obicei mai lungă (timp în care se pot determina perioadele refractare), îşi reia activitatea cu o frecvenţă mai scăzută, de aproximativ 25/min, şi total asincron faţă de ritmul sinusal (se recreează astfel artificial blocul


atrioventricular gradul III la om). Ritmul ventricular este dat de ganglionul Bidder, localizat la acest nivel.

Figura nr. 8. Compartimentele inimii de broască. Imaginea stânga sus – poziţie anatomică, imaginea dreapta sus, inima cu vârful întors în sus pentru vizualizarea sinusului venos. Schema de jos prezintă succesiunea celor patru cavităţi precum şi poziţia ligaturilor Stannius. SV – sinus venos; A – atriu; V – ventricul; BAo – bulb aortic; Ao – aorta; VCS – vena cavă sup.; VCI – vena cavă inf.

DETERMINAREA PRAGULUI DE EXCITAŢIE ŞI STUDIUL PERIOADELOR REFRACTARE Se ataşează la inimă un stimulator bipolar. Se stimulează inima după aplicarea ligaturii Stannius II (în perioada liberă în care ventriculul încă nu şi-a reluat activitatea). Se începe stimularea cu o intensitate minimă crescând treptat acesta până la apariţia primei contracţii. Astfel se determină pragul de excitaţie. Dacă cordul nu şi-a reluat încă activitatea stimulăm cordul cu două impulsuri succesive folosind cel puţin intensitatea minimă necesară iniţierii potenţialului de acţiune. Apoi se scade treptat intervalul dintre impulsurile succesive până la dispariţia celui de al doilea potenţial de acţiune. Astfel determinăm perioada refractară absolută. În cazul în care ventriculul şi-a reluat activitatea se captează cu ajutorul plăcii A/D potenţialul de acţiune propriu al miocardului (generat de pacemakerul ventricular) acesta fiind folosit de program ca un trigger pentru iniţierea stimulului electric. Stimularea cordului în prima parte a potenţialului de acţiune nu produce nici un răspuns, acesta demonstrând existenţa fazei


refractare absolute. La sfârşitul potenţialului de acţiune, miocardul fiind ieşit din faza refractară, răspunde printr-o contracţie suplimentară numită extrasistolă. Ea este urmată de o pauză mai lungă, numită pauză compensatorie; aceasta se datorează faptului că stimulul normal următor pornit din pacemakerul ventricular, găseşte miocardul în fază refractară în urma extrasistolei.

Folosind ghidul oferit pe următoarele pagini (Realizarea practică) răspundeţi la întrebările din Fişa de lucru.

Stimulatoarele biologice pot genera stimuli cu amplitudine mare, care pot fi periculoase dacă electrozii sunt aşezaţi în aşa fel încât curentul electric poate să treacă prin cord! Stimulatoarele biologice pentru animale de experienţă nu se utilizează niciodată la om! Nu atingeţi aparatura utilizată pentru înregistrare sau stimulare decât în prezenţa şi la dorinţa expresă a asistentului.


REALIZAREA PRACTICĂ A. Examinarea microcirculaţiei umane. Circulaţia sângelui la om se poate vizualiza cu ajutorul microscopului capilar. Microscopul capilar este de fapt un microscop de disecţie, la care obiectul examinării este iluminat de sus. În acest caz se va folosi lumină de culoare verde sau albastră. Se pune o picătură de glicerină pe patul unghial al inelarului. Se aşează degetul pe masa microscopului în aşa fel, încât în câmpul vizual să apară limita dintre unghie şi piele. Se începe de la mărirea minimă a microscopului (ocular 10x, obiectiv 0,63x). Se creşte treptat mărirea microscopului. La o mărire de 40 de ori, se observă ansele capilare (Figura nr. 9).

Figura nr. 9. Microcirculaţia la nivelul patului unghial (explicaţii în text). B. Observarea circulaţiei sanguine pe limba de broască. Se cântăreşte broasca, după care se înfăşoară cu ajutorul unei cârpe. Se injectează intraperitoneal uretan 20% în doză de 1ml/50g. Instituirea narcozei este semnalată de abolirea reflexului de întoarcere (broasca nu se întoarce de pe spate în poziţie normală) şi lipsa reflexului cornean (broasca nu clipeşte la atingerea corneei cu un obiect bont). Broasca se aşează pe o banchetă fixată în poziţie orizontală cu ajutorul unui stativ. Limba trasă afară se fixează cu ace pe un placaj de plută găurit la mijloc. Placajul de plută se aşează pe masa microscopului. (Figura nr. 10).

Figura nr. 10. Observarea circulaţiei sanguine pe limba de broască.


Se examinează circulaţia sângelui cu obiectiv mic (10x). În cazul unei examinări îndelungate, mucoasa se umezeşte periodic cu soluţie Ringer la temperatura camerei.

Soluţia Ringer pentru broască este o soluţie ce conţine clorură de sodiu, clorură de potasiu, bicarbonat de sodiu şi glucoză (principalii ioni din spaţiul extracelular în concentraţii fiziologice, sursă energetică, respectiv soluţie de tampon pentru menţinerea pH) ce este utilizată pentru menţinerea în viaţă a ţesuturilor în timpul experimentelor. Soluţia Ringer pentru broască a fost utilizată pentru prima oară în 1882 de către Sidney Ringer (clinician şi farmacolog britanic, 1836-1910). Variante ale acestei soluţii adaptate la fiziologia diferitelor specii sunt utilizate şi astăzi atât experimental cât şi în practica medicală.

C. Examinarea motilităţii ciliare pe broască. Broasca (deja) anesteziată se fixează din nou într-o cârpă. Se introduce unul din tăişurile foarfecii în cavitatea bucală şi se îndepărtează capul deasupra liniei ochilor (Figura nr. 11).

Figura nr. 11. Metoda de decapitarea a broaştei anesteziate. Broasca se aşează pe planşeta de lemn. În continuare se lucrează cu capul îndepărtat al broaştei. Pe mucoasa palatului se pune o mică picătură de soluţie Ringer ce conţine particule de cărbune suspendat în ser fiziologic. După câteva minute se poate observa cu ochiul liber cum particulele de cărbune se deplasează spre esofag. D. Examinarea motilităţii ciliare pe broască la microscop optic. Din mucoasa palatului se efectuează raclaj cu un bisturiu, se întinde pe o lamă degresată şi se umezeşte cu o picătură de soluţie Ringer la temperatura camerei. Se examinează la microscop cu obiectiv de 10x şi se observă mişcarea uniformă a cililor. E. Disecţia broaştei şi identificarea organelor interne. Examinarea inimii. Se continuă cu disecţia broaştei. Se fixează broasca în decubit dorsal pe o planşetă de lemn şi cu o pensă chirurgicală se prinde pielea la nivelul abdomenului ridicând-o şi efectuând o incizie în formă de "V". Se prelungeşte incizia până la nivelul claviculelor, care se secţionează, şi cu o secţiune transversală se îndepărtează plastronul astfel pregătit. Se observă şi se identifică organele. Cavitatea toracică şi cea abdominală nu sunt despărţite, broasca neavând diafragm. Se vede inima în sacul pericardic, arterele şi venele mari precum şi plămânii. Dacă plămânul mai conţine aer se observă structura acinară a plămânului. Se identifică organele abdominale. Se numără frecvenţa ventriculară a inimii în poziţie anatomică. Cu o pensă fină se prinde pericardul (vizualizat ca o membrană fină albă mulată pe cord) şi se secţionează având grijă să nu se lezeze inima. Se numără frecvenţa ventriculară după deschiderea sacului pericardic. Inima se observă în poziţie anatomică şi întors în sens cranial, cu vârful ridicat sus cu ajutorul unei pense fine, după secţionarea ligamentului posterior al inimii. Se identifică


cavităţile inimii şi se examinează contracţia succesivă a cavităţilor. În continuare se examinează efectul termic aplicând soluţie Ringer rece şi apoi caldă direct pe inimă. După aplicarea diferitelor soluţii se măsoară frecvenţa ventriculară. În continuare se îndepărtează inima prin excizare cu foarfecă la nivelul vaselor mari de la baza inimii şi se aşează într-un vas Petri în soluţie Ringer, notând frecvenţa ventriculară. Apoi se adaugă adrenalină în vasul Petri şi se observă schimbarea frecvenţei ventriculare. Dacă după îndepărtarea inimii acesta s-a oprit, se aplică stimulare mecanică cu un ac bont. F. Examinarea motilităţii ciliare pe esofagul de broască. După îndepărtarea inimii se identifică esofagul, stomacul şi intestinele, observând motilitatea intestinală. Se identifică ficatul cu vezica biliară şi splina. Ridicând intestinele, se văd rinichii cu glandele suprarenale, vezica urinară şi organele genitale. Se prepară esofagul broaştei, din partea superioară se taie o bucată de cca. 0,5 cm, care se trage pe o pipetă de sticlă gradată şi se fixează în poziţie orizontală. După câteva minute se observă deplasarea bucăţii de esofag ca urmare a mişcării cililor. G. Înregistrarea activităţii mecanice şi electrice ale inimii de broască. Broasca anesteziată, decapitată, despinalizată se aşează pe spate, se prepară (prin metoda deja descrisă) şi se îndepărtează plastronul sternal, vizualizând inima. Se deschide pericardul. Se aşează electrozii, cârligul metalic fiind inserat la nivelul vârfului inimii. Inima se ridică punând sub tensiune firul traductorului mecano-electric. Se înregistrează simultan activitatea electrică şi mecanică a cordului în condiţii bazale cu ajutorul calculatorului. Continuând înregistrarea se aplică mai întâi soluţie Ringer încălzită la 40°C şi soluţie Ringer de la gheaţă, iar apoi diverşi mediatori chimici (adrenalină, acetilcolină) şi electroliţi (Ca2+ şi K+) observând efectele. Se aplică apoi ligaturile lui Stannius şi se observă efectul acestora asupra activităţii cordului. Se ataşează electrodul stimulatorului la inimă şi se determină mai întâi intensitatea minimă de curent necesară atingerii potenţialului prag (şi iniţierii potenţialului de acţiune) iar apoi se determină perioada refractară. În cazul în care ventriculul îşi reia activitatea spontană se demonstrează extrasistola şi pauza compensatorie.

broasca

Documents

Transcript of broasca