Metoda spectrofotometrică de determinare a beta carotenului

Metoda spectrofotometrică se bazează pe proprietatea substanţelor de a absorbi selectiv radiaţiile

electromagnetice şi este folosită pentru identificare, determinarea purităţii şi dozare.

Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unui fascicul de radiaţii continue prin substanţa

de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbită depinde

de structura şi de numărul moleculelor şi al atomilor substanţei cu care interacţionează fasciculul

de radiaţii.

În funcţie de domeniile spectrale în care are loc absorbţia luminii se deosebesc: metode

spectrofotometrice în ultraviolet (185-400nm), metode spectrofotometrice în vizibil (400-800nm)

şi metode spectrofotometrice în infraroşu (peste 800nm).

Spectrele de absorbţie în ultraviolet şi vizibil (spectre electronice) se datorează tranziţiilor

dintre nivelele energetice ale stărilor electronice ale moleculelor.

Spectrele de absorbţie în infraroşu se datoresc tranziţiilor de rotaţie-vibraţie ale

moleculelor.

Principiul spectrofotometriei se bazează pe determinarea concentraţiei soluţiilor colorate la

trecerea unui fascicul emis de o sursă luminoasă printr-o soluţie omogenă constituită din substanţa

de analizat. Astfel se determină absorbţia radiaţiei luminoase, care este direct proporţională cu

concentraţia substanţei absorbante în conformitate cu legea Lambert-Beer [65] :

A= D= E= lg I0/I = -lg T = ε L C

În care:

A = absorbanţa;

D = densitatea optică;

E = extincţia;

I0 = intensitatea luminii incidente;

I = intensitatea luminii transmise;

T = transmitanţa;

L = grosimea stratului de absorbţie (cm);

C = concentraţia soluţiei absorbante (moli/l);

Ε = absorbtivitatea molară (constantă caracteristică fiecărei substanţe absorbante).

Lungimea de undă a luminii incidente este cea a culorii complementare a soluţiei de analizat.

Legea Lambert- Beer este valabilă în întregul domeniu spectral, pentru orice lungime de undă,

pentru orice mediu omogen în care scăderea intensităţii luminii se datorează numai absorbţiei,

indiferent dacă mediul absorbant este gaz, lichid sau soluţie.

Pentru aceeaşi substanţă absorbantă, într-un anumit domeniu de concentraţie (C< 0,001 moli/l), şi

în aceeaşi cuvă, ε şi L fiind constante se poate scrie:

A = K x C

Unde:

K = constantă de proporţionalitate K = ε x L

Se observă că absorbanţa este funcţie de concentraţie, fiind direct proporţionale.

Prin reprezentarea grafică a absorbanţei în funcţie de concentraţie (folosind diferite concentraţii ale

substanţei etalon), pentru o anumită lungime de undă, la care substanţa de analizat are concentraţie

maximă, se obţine curba de calibrare. Cu ajutorul curbei de calibrare se poate afla concentraţia

probei de analizat prin măsurarea absorbanţei la lungimea de undă respectivă, absorbanţă căreia îi

va corespunde o anumită valoare a concentraţiei de pe curba de calibrare [74].Spectrofotometrul de

absorbţie în ultraviolet şi vizibil se compune din următoarele părţi principale:

sursa de radiaţii;

monocromatorul;

suportul pentru cuve;

detectorul;

amplificatorul;

înregistratorul

Sursa de radiaţii este constituită dintr-un bec cu filament de wolfram pentrudomeniul vizibil şi o

lampă de hidrogen pentru domeniul ultraviolet.

Monocromatorul şi cuvele sunt confecţionate din sticlă, pentru domeniul vizibil, şi din

cuarţ, pentru domeniul ultraviolet.

Dozarea beta-carotenului total se bazează pe măsurarea spectrofotometrică a intensităţii culorii

galbene caracteristice soluţiilor sale, în intervalul lungimilor de undă 300- 540 nm.

Sunt doua metode de dozare:

1. Beta- carotenul se izolează prin extracţie, după saponificarea prealabilă a substanţelor lipidice.

Carotenoizii se separă prin cromatografie pe coloană, iar conţinutul în beta- caroten se stabileşte

prin măsurarea extincţiei soluţiei respective.

2. Extractia carotenoizilor totali in benzen si determinarea concentratiei prin citirea extinctiei

probei si folosirea curbei de etalonare pentru sol de beta caroten in benzen. Se determina de fapt

total carotenoizi exprimati in beta caroten

Metoda 2 Determinarea spectrofotometrică în domeniul VIS a carotenilor totali din uleiul de

cătină(exprimat în β-caroten)

Reactivi:

-Benzen (R)

-β-caroten 0,01g %

Tehnică de lucru:

Se cântăresc 0,15-0,3 g probă de ulei catina se introduce într-un balon cu fund rotund. Peste proba

se introduc 100 ml benzen şi se refluxează pe baia de apă timp de 30-60 min.

Se răceşte şi se filtrează proba apoi se aduce la semn la balon cotat de 100 ml cu benzen.

Se măsoară absorbanţa la spectrofotometru la λ de 460 nm fata de benzen

Concentraţia în β-caroten se determină prin raportarea la curba etalon a β-caroten-ului,

Curba de etalonare se realizeaza astfel:

In trei baloane cotate de 25 ml se pipetează 0,1; 0,2 şi 0,3 ml soluţie de β-caroten (s.r.) 0,01% în

benzen . Se completează volumul baloanelor la semn cu benzen şi se agită puternic. Absorbanţele

obţinute se măsoară la spectrofotometru, la λ=460 nm, în cuva de l cm, faţă de benzen. Conţinutul

în β-caroten din ulei se calculează după formula:

Cx10-3xVf x 100 0,800 x10-3 x 100

β-caroten =--------------------------- x 100% = --------------------------- × 100 = 111,11 mg %sursa 1 mp(mg) 0,072

Cx10-3xVf x 100 0,8733 x10-3 x 100 β-caroten =--------------------------- x 100% = --------------------------- × 100 = 121,29 mg %sursa 2 mp(mg) 0,072

unde:

C=concentraţia probei măsurate la spectrofotometru (µg/ml) cf curbei etalon

Vf= volum sol beta-caroten

mp=masa probei luate în lucru (g) – ulei catina

curba etalon beta caroten λ=460nm

y = 0,2385x + 0,0113

R2 = 0,9993

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

concentratia absorbanta

0,5 0,13671 0,24351,5 0,37222 0,48072,5 0,60683 0,7316

Iti propun sa luam 5 grame de suc (omogenizat in prealabil) facem refluxarea in balon cu benzen, filtram si citim extinctia care trebuie sa se inscrie in intervalul curbei etalon.

Metoda 1

Determinarea beta-carotenului din ulei de cătină Principiul metodeiConstă în extracţia beta-carotenului cu acetonă şi apoi eter de petrol sau n-hexan, separarea lui de alte substanţe colorante pe o coloană cromatografică, apoi spectrofotometrarea la lungimea de undă de 430 nm faţă de eter de petrol sau n-hexan. Pentru produsele care conţin cantităţi mari de grăsimi, se realizează în prealabil saponificarea substanţelor grase cu o soluţie alcalină de hidroxid de potasiu 40% în alcool etilic.Materiale:ulei de cătină;Reactivi şi aparatură:hidroxid de potasiu soluţie alcoolică 40% pentru saponificare;acetonă;eter de petrol;oxid de aluminiu neutru pentru cromatografie;pâlnii de separare;baloane cotate de 50 ml;balon pentru saponificare de 500 ml;plită electrică;coloană cromatografică;spectrofotometru UV-VIS Secomam 750 S;Mod de lucru

S-au cântărit la balanţa analitică masele (g) din uleiul analizat şi s-au supus saponificării cu soluţie de hidroxid de potasiu timp de 30 minute. Soluţiile obţinute s-au răcit, apoi s-au extras carotenii cu 15ml acetonă. Extractele s-au introdus fiecare într-o pâlnie de separare. Peste extracte s-au turnat cu grijă 30 ml eter de petrol pentru extracţia carotenilor, apoi straturile de eter şi acetonă s-au separat. S-au clătit extractele eterice cu câte 15 ml apă şi s-au separat până când au devenit limpezi. Extractele acetonice şi apoase s-au aruncat. Extractele eterice s-au trecut fiecare printr-o coloană cromatografiă umplută cu Al2O3 pentru separarea beta-carotenului de alte substanţe colorante, apoi s-au colectat fiecare într-un balon cotat de 50 ml care s-a adus la semn cu eter de petrol. Curba etalon s-a realizat folosind soluţie etalon de bicromat de potasiu. S-au citit absorbanţele fiecărei soluţii etalon apoi s-a trasat graficul absorbanţă funcţie de concentraţie [35].S-a efectuat citirea absorbanţei extractelor de beta-caroten din ulei de cătină

Calcul:Pentru calculul concentraţiei de beta-caroten s-a folosit formula:

β-caroten = ; mg/100gUnde:A = absorbanţa extractului de beta-caroten la lungimea de undă de 430 nm;F = factorul de pantă care este media factorilor de pantă pentru fiecare concentraţie din scara etalon şi se calculează cu formula:

F = Unde:F1 = A1 / c1; F2 = A2 / c2; F3= a3 / c3; F4 = A4 / c4; F5 = A5 / c5; F6 = A6 / C6;A1, A2, A3, A4, A5, A6 sunt absorbanţele corespunzătoare celor 6 concentraţii (c1-c6) cu care s-a realizat scara etalon;V = volumul la care s-a adus extractul (50 ml);F= 4,77M = masa de ulei luată în lucru (g);După extracţie, spectrofotometrare şi efectuarea calculelor s-au obţinut rezultatele 23,3 mg/100 g