AnalizaProbelorBiologice 1 2015
-
Upload
ana-maria-iordan -
Category
Documents
-
view
8 -
download
0
description
Transcript of AnalizaProbelorBiologice 1 2015
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 1/39
ANALIZELE PROBELORBIOLOGICE
- BIOANALIZA -
Prof.dr.ing. Gabriel-Lucian RADU
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 2/39
Capitolul Continuturi
C1. Principiile si aplicatiile bioanalizei
C2. Metode de prelevare a probelor biologice si
prelucrarea in vederea analizei
C3.
Metode si tehnici de separare
C4. Metode spectrometrice de analiză C5. Metode electroanalitice
C6. Metode imunochimice de analiză
C7.
Biosenzori cu aplicatii în bioanaliză C8. Procedee de analiză complexă
C9 Standardizarea procesului de analiză
14 cursuri
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 3/39
TITULARI DISCIPLINA
Prof.dr.ing. Gabriel Lucian RADU
S.l.Dr. Emanuela CRACIUN
Studenţii vor fi evaluaţi în mod continuu, atât în cursul semestrului, cât şi lafinal, alocându-se următoarele ponderi în notarea finală:
Activitate la curs (răspuns la întrebări, implicare în activitatea din cadrul cursului, teme de casă) 10% din nota finală
Performanţa în activităţile aplicative 40% din nota finală Examen 50% din nota finală
•Activităţile evaluate şi ponderea:
10% activitatea pe parcurs, 40% evaluare laborator, 50% examen
b) Cerinţele minimale pentru promovare: Parcurgerea tuturor lucrărilor de laborator;
Obţinerea a 50% din punctajul total; Obţinerea a 50% din examenul final.
c) Calculul notei finale: Calculul notei finale prin rotunjirea punctajului final total.
EVALUARE
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 4/39
Domenii de aplicabilitate
monitorizarea calitatii vietii si mediului
valorificarea deseurilor
industria chimico-farmaceutica
biologie-biotehnologie
medicina
aparare
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 5/39
INSTRUMENTUL BIOANALITIC
ideal
selectiv
specificreproductibil
uti l izare simpla
compact
rapid
ieftin
fiabil
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 6/39
Alegerea
metodei si instrumentului
probainstrument
metoda
*starea de agregare
*omogenitatea
*istoria probei
*securitatea
*sensibilitatea
*mediu (t, p, etc.)
*acceptabilitatea
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 7/39
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 8/39
TEHNICA
METODA
PROCEDEU
PROTOCOL
S P E C I F
I C I T A T E A
• CALITATIVA
•SEMI CANTITATIVA
• CANTITATIVA
INFORMATIA
ANALITICA
• SCREENING
• RUTINA
•RECUNOASTERE
• STANDARD
• REFERINTA
• PRIMARA
I N C R E D
E R E A
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 9/39
Tehnicile de analiză si p rinc ipalele apl icat i i
Tehnica Proprietatea masurata Principalele domenii de
aplicare
Gravimetr ia Greutatea analitului pur sau compus
cu stoichiometrie cunoscuta
Cantitativa pentru componente
majore sau minore
Titr imetr ia Volumul soluţiei reactivului standardreacţionează cu analitul
Cantitativa pentru componente
majore sau minore
Spectrometr ia
atomica si
moleculara
Lungimea de undă şi intensitatearadiaţiilor electromagnetice emisesau absorbite de analit
Calitativa,cantitativa sau
structurala pentru
componentele majore
Spectrometr ia
de masa
Masa analitului sau fragmente din
ea
Calitativa sau structurala pentru
majoritatea majore în jospentru a urmări componentelenivel izotop raporturi
Cromatograf ia
si electrofo reza
Diferite proprietăţi fizico-chimice ale
analiţilor separati
Separarile cantitative si
calitative ale amestecurilor
Analiza termica Schimbări fizice sau chimice înproba atunci când este încălzita sau
răcita
Caracterizarea compusilor
majoritari sau minoritari singuri
sau in amestec
Analiza
electrochimica
Proprietatile electrice ale analitului
in solutie
Calitativa si cantitativa pentru
majoritatea.
Analizaradiochimica
Caracteristicile radiaţiilor ionizantenucleare emise de analit
Calitativa si cantitativa pentrumajoritatea.
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 10/39
TEHNICA
M E T O D A
Procedura
Protocol
Procesul bioanaliticPrelucrarea
datelor
Operatii
preliminare
RezultateProba
bruta
ANALIZA
Masurarea
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 11/39
MODEL
SAMPLING
ANALIZA
PLAN
EVALUARE
Defineste scopul
Selecteaza procesul analitic, numarulanalizelor si centrele de analiza pebaza scopurilor si costurilor
Colecteaza probele, testepreliminare
Efectueaza operatii de ajustareaconditiilor, separarea intereferente,efectueaza masurarile siachizitioneaza datele
Selecteaza dintre date valoarea ceamai buna, estimeaza siguranta
valorii, revizuieste si repeta daca estenecesar
PROCESUL BIOANALITIC
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 12/39
Strategia
bioanalitică
Obținerea probei
Pregătirea probei
Aplicarea metodei de analiză
Obținerea datelor legate de greutatea sau volumul probeipregătite
Prepararea soluțiilor standard ale analitului sau a altorsubstanțe care vor reacționa cu analitul
Standardizarea soluțiilor sau calibrarea echipamentului
Obținerea datelor experimentale
Raportarea rezultatelor
Prelucrarea datelor
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 13/39
Bazele măsurării instrumentale
Soluții standard
Soluții cu probe Traductor
Procesoare
de semnal
Sursă de curent
Dispozitiv
de afișare
Traductor - convertește o proprietate a soluției în semnal electric
Procesoare de semnal - convertește semnalul într -o formăutilizabilă
Dispozitiv de afișare - afișează semnalul într -o formă ce poate fi înțeleasă de analist
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 14/39
Componentele de baza ale unui
instrument
GENERATORSEMNAL
Detector
Tranductor
Procesor
SemnalInregistrator
SURSA DE
CURENT
Semnalanalitic
Semnal
electricmecanicoptic
Semnaliesire
- semnal electric proporțional cu concentrația
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 15/39
Tendintele in domeniul dezvoltarii
instrumentelor bioanalitice
prezent
viitor multinivel
dimensiune
m u l t i d i m
e n s i o n a l
c o m p l e x i t a t e
MULTIFUNCTIONAL
hardware
marimea (u.a.)
i n t e r
f e t e e l e c t r o
n i c e
software
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 16/39
Molaritatea: Numarul de moli dintr-o substantaintr-un dm3de solutie
Un mol: egal cu masa moleculara a
substantei
Masa moleculara:
Da: daltoni
kDa: Kilodaltoni = 1000 Da
Mr: nici o unitate
Masa moleculara relativa
= Masa moleculara a unei substante in
raport cu 1/12 din masa atomica a 12C. 16
Unitatea S.I. pentru exprimarea
concentratiilor
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 17/39
• Conversie mol, mmol si µmol in volume diferite
pentru a da diferite concentratii
• Substantele biologice sunt frecvent prezente inconcentratii relativ scazute. In sistemele “in vitro” volumele solutiilor utilizate frecvent in scopuriexperimentale sunt, de asemenea, mici. Consecintaeste ca solutiile experimentale sunt, de obicei in mmoldm -3, µmol dm-3 si nmol dm-3 decat molar.
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 18/39
Metodele analit ice
în funcţie de
cant i tatea de determ inat
Metoda Limita
aproximat iva
Macro 100 mg
Semi-micro 10 mg
Micro 1 μg
Ultra-micro 0,1 μg Nano 1-50 ng
Analiza in urme 0,1-100 fg
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 19/39
Raportul Semnal / ZgomotSemnal = informatia despre analit care
este de interes pentru chimist
Zgomot = informatia externa care nu
este necesara deoarece degradeaza
acuratetea si precizia analizei si
micsoreaza cantitatea de analit care
poate fi detectat
S/Z = media/deviaţia standard = x/sS/Z = 1/ RSD
unde RSD => deviaţia standard relativă, s/x
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 20/39
Surse de zgomot
în analizele intrumentale
• Zgomot chimic
• rezultă din variabile incontrolabile
careafectează analiza chimică
• Zgomot instrumental
• Tipuri
• Zgomot termic• Zgomot ţintă
• Zgomot slab
• Zgomot de mediu
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 21/39
Modalităţi pentru reducerea zgomotului
Împământare şi protejare
Amplificatori diferiţi Filtrare
Modulare
“Tăierea” semnalului
Blocarea amplificatorilor Metode Software
- S/Z intensitatea la n0.5, unde n este media masurarilor
- Adunarea intensitatii medii a semnalelor
Media semnalelor 1-3, 5-7,etc.
- Filtrare Digitala
- Metode de Corelare
- Adunarea intensitatii medii a semnalelor
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 22/39
Adunarea intensităţii medii a semnalelor
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 23/39
Se observă că scala
verticală este maimică decât numărulscanărilor. Astfel,zgomotul creşte învaloare absolută
odată cu creştereanumărului scanărilor .Totusi, valoarea
relativă a semnalului
analitic creşte.
Efectul medierii semnalelor
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 24/39
Sursele de eroare in bioanaliza
100%
10%
1%
sampling analiza
propriu-zisa
prelucrarea
datelor
coeficient
de variatie
timp40% 30%20%
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 25/39
Erori de masurare: Toate procesele de masurare sunt supuse erorilor
ce afecteaza datele numerice si care decurg dintr-o varietate de cauze.
Erori absolute si relative: O eroare absoluta este diferenta numerica
dintre o valoare masurata si o valoare reala sau o valoare acceptata. Eroarea
relativa este eroarea absoluta impartita la valoarea reala sau acceptata.
Erori determinabile: Sunt cunoscute ca fiind erori sistematice, eleaparand, in general, din surse determinate, identificabile, care duc la
varierea valorilor masurate de la valoarea reala la cea acceptata.
Erori nedeterminabile: Sunt cunoscute si sub numele de erori
aleatorii, ele aparand dintr-o varietate de surse necontrolate si cauzeaza micivariatii aleatorii in masuratorile cantitative cand masurarea este repetata de
un numar de ori.
Erori cumulate: Cand diferite masuratori sunt combinate pentru a
calcula un rezultat analitic global, erorile asociate acestor masurariindividuale contribuie la erori totale sau acumulate.
ERORI IN MASURARILE ANALITICE
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 26/39
Sursele de erori (I)
Erorile de la reactivi
- Reactivii si solvenţii sunt impuri.
- Depozitarea improprie de reactivi.
- Neglijarea datei de expirare a reactivului.
- Evaporarea reactivilor.
- Respectare gradelor si puritaţilor diferite.
S l d i (II)
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 27/39
Sursele de erori (II)Generarea de erori
- Devierea de la procedura de analiza
- Neluarea in seama a limitei de detectie
- Neluarea in seama a spatiului de colectare
- Calcularea erorilor (diluari, amestecuri,
adaugari)
- Folosirea unor proceduri analitice incorecte
Erorile de calibrare- Erorile ale masurarilor volumetrice
- Erorile de cantarire
- Reglarea inexacta a echipamentului
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 28/39
Sursele de erori (III)
Eror i le de la echipament
Echipamentul nu este curat.Intretinerea lui este neglijata.
Influenta temperaturii, electricitatii si influentamagnetica.
Erori în folosirea auto-pipetelor necalibrate,pipetele nu sunt atasate in mod corect sau suntcontaminate.
Erori in folosirea pipetelor de sticla (se pot
deterioara, materiale de calitate mai slaba, elepot fi contaminate anterior).
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 29/39
Sursele de erori (IV)Inr egistrarea semnalelor si descrierea erorilor
- Domeniul incorect de raportare
- Erorile de citire
- Erorile de scriere
- Schimburile de informaţiiCalculul erorilor.
- Erorile aritmetice, erorile de virgula,unitati incorecte
- Erorile circulare- Neluarea in calcul a valorilor volumului
de reactiv adaugat
- Erorile in factorul de diluare
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 30/39
VARIABILITATEA BIOLOGICA
Identificarea naturii variației biologice
Ce se înțelege prin termenul devariației biologică in contextulbioanalizei:
O componentă a diversitățiimăsurarilor bioanalitice determinate
de fiziologia diferita a subiectilor.
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 31/39
Componentele
variaței înmăsurarilebioanalitice
• Variația analitică • Variația biologică la un subiect
• Variația biologică între subiecți
Surse de
VariațieBiologică
• Ritmuri biologice (timpul)
• Homeostazie
• Vârstă • Sex
• Etnie
• Patologie• Stimuli diversi
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 32/39
Cuantificarea variatiei biologice
• Cum se face cuantificarea variatiei biologice?
Trebuie analizate componentele variatiei:
σ²total =σ²analitic + σ²individuală + σ²grup
σ² analitic = Variația medie de teste identice î n termen de
variație analitică
σ² individuală = Media biologică în variația subiecților
σ²grup= Variația valorilor mijlocii între subiecți. Variația in
punctele de setare homeostatica.
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 33/39
Cuantificarea
variației biologice
• Cum se face experimentul?
– Subiecti Câți?
– Colectarea probelor
Număr?Frecvența?
– Analizarea probelor
Diminuarea σ² analitice ?
– Analizarea datelor
Valori extreme? Statistică?
– Aplicarea rezultatelor analizei
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 34/39
Variația biologică și utilizareaintervalelor de referință
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 35/39
Proceduri-Protocoale• Erorile analitice trebuie reduse cât mai mult.
• Analiza ideală: • Un singur tip de reactivi de testare
• Un singur analizor și sistem analitic
• Număr cât mai mic de serii
Condițiile ar trebui sa reducă variabilele pre-analitice.
• Subiecți sănătoși • Moduri normale de viață
• Fără droguri (alcool , tutun )• Flebotomie de la aceeași persoană
• Același moment al zilei la intervale regulate
• Stabilirea unor reguli pentru transportul
probelor, prelucrare și păstrare
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 36/39
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 37/39
CantitateUnități
Grup Medie CVI CVG Indicele deindividuali
tate
µmol/L bărbat (7) 83.9 3.4 6.8 0.54
µmol/L Femeie(8) 71.4 4.9 11.8 0.41
µmol/L* toti (15) 83.9 4.1 14.1 0.29
µmol/L ? ? 5.3 14.2 0.4
µmol/L** N= 20
Barbat 7
Femeie 13
77 4.7 14.4 0.33
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 38/39
Creatinina
µmol/L
Probabilitate
(%)
Creatinina
de start
96 µmol/L
7/17/2019 AnalizaProbelorBiologice 1 2015
http://slidepdf.com/reader/full/analizaprobelorbiologice-1-2015 39/39
• Limite de referintă superioar e :
– Barbat= 106 µmol/L
– Femeie= 80 µmol/L
• Coeficientul de Variabilitate mai marepentru bărbați decât pentru femei