1.Introducere

L-acid ascorbic (vitamina C), reprezintă un antioxidant de exceptie ce contribuie activ la franarea proceselor degenerative din organism. Facând parte din grupa vitaminelor hidrosolubile (solubile in apa) acidul ascorbic se elimina ȋn cantitati mari din organism.

L-enantiomerul acidului ascorbic se mai numeşte şi vitamina C (numele de "ascorbic" vine de la proprietatea sa de a preveni şi vindeca scorbutul). Primatele (incluzând oamenii) şi câteva alte specii din regnul animal, notabil fiind porcuşorul de guinea, şi-au pierdut proprietatea de a sintetiza vitamina C şi trebuie să şi-o procure din alimente sau din alte surse.[1]

Acidul ascorbic şi sărurile sale de sodiu, potasiu şi calciu sunt des folosiţi ca aditivi alimentari antioxidanţi. Aceşti compuşi sunt solubili în apă şi, deci, nu pot proteja grăsimile de oxidare: pentru acestea, esterii liposolubili ai acidului ascobic cu catenă lungă de acizi graşi (ascorbil palmitat sau ascorbil stearate) pot fi folosiţi drepti antioxidanţi. Numele aditivilor alimentari europeni relevanţi sunt: E300 acid ascorbic, E301 ascorbat de sodiu, E302 ascorbat de calciu, E303 ascorbat de potasiu, E304 esteri ai acidului ascorbic cu acizi graşi ascorbil palmitat,ascorbil stearat.[1]

În 1937 Premiul Nobel pentru chimie a fost acordat la Walter Haworth pentru munca sa în determinarea structurii acidului ascorbic.

Acidul ascorbic este oxidat foarte uşor şi de aceea este folosit ca reducător în soluţiile de developare fotografică (printre alţi compuşi) şi drept conservant.Expunerea la oxigen, lumină, căldură si metal distrug acidul ascorbic, deci trebuie păstrat la întuneric şi răcoare, într-un recipient non-metalic.Forma oxidată a acidului ascorbic se numeşte acid dehidroascorbic.[1]

Acid ascorbic se găseşte în fructe şi legume, cum ar fi citricele (portocalele, lămâile, mandarine, etc), pepeni galbeni, rosii, ardei, broccoli, legumele cu frunze verzi, cum ar fi spanac, cartofi şi napi. Are un rol deosebit de importantă în producţia de vin, bere, lapte, băuturi răcoritoare şi sucuri de fructe. În industria vinului, acid L-ascorbic poate fi adăugat pentru a preveni oxidarea vinului.[2]

2. Utilizarea acidului ascorbic

Antioxidanţii reprezintă un grup de aditivi care se utilizează pentru păstrarea calităţii grăsimilor, împiedicând procesul de degradare a grăsimilor prin autooxidare (râncezire aldehidică). În cazul alimentelor, degradarea grăsimilor, pe lângă faptul că face alimentele improprii consumului (modificând gustul şi mirosul), reduce şi valoarea lor nutritivă. Grăsimile degradate oxidativ au efect dăunător asupra organismului prin acţiune distructivă asupra vitaminelor A, E, C, B2 , B6 din alimente (avitaminoze secundare), prin lezarea mucoasei

gastrice şi intestinale, în care caz se ajunge la scăderea coeficientului de utilizare digestivă a alimentelor şi prin acţiunea peroxizilor şi radicalilor din grăsimile autooxidate asupra membranelor celulare, asupra unor vitamine din organismul uman .Antioxidanţii pot fi clasificaţi în antioxidanţi propriu-zişi şi antioxidanţi secundari. Substanţele care întăresc acţiunea antioxidanţilor se numesc sinergetice. După originea lor antioxidanţii pot fi naturali şi de sinteză.[3]

Acid ascorbic se comporă ca un antioxidant prin disponibilitatea sa de a se oxida în condiţii energetice favoranile. Oxidanţii (numiţi ştiinţific specii de oxigen reactiv) precum redicalul hidroxil (format din peroxid de hidrogen), conţin un orbital monoelectronic şi de aceea sunt foarte reactivi şi dăunători oamenilor şi plantelor la nivel molecular. Acest lucru are loc datorită interacţiei lor cu acizii nucleici, proteinele şi lipidele. Speciile de oxigen reactiv pot 'extrage' un atom hidrogen din ascorbat, care devine astfel monodehidroascorbat, dar imediat câştigă un alt electron pentru a redeveni dehidroascorbat. Speciile de oxigen reactiv sunt reduse in prezenta apei, în timp ce formele de ascorbat oxidat sunt relativ stabile şi nereactive, necauzând nici un rău celulei.[1]

În plante, L-ascorbic acid este esenţială pentru activitatea în timpul fotosinteticede detoxifiere a superoxid şi peroxid de hidrogen în cloroplastele, în lipsa catalazei. Asa este, de asemenea, implicat în regenerarea α-tocoferol. Vitamina C joacă un rol major în procesul de fabricare şi de apărare a ţesutului conjunctiv. Reprezinta un ingredient principal al colagenului, o substanţă lipicica, care leagă celulele împreună pentru a forma ţesuturi [4]. Acid ascorbic ajută sistemul imunitar pentru a lupta împotriva cotropitorilor străini şi celulele tumorale. Acid ascorbic susţine, de asemenea, sistemul cardiovascular, prin facilitarea metabolismul grăsimilor şi a ţesuturilor de protectie daune radicalilor liberi, şi asistă sistemului nervos prin transformarea amino-acizi în anumite neurotransmiţători.[5] Pielea, dinţi şi oase de asemenea beneficiaza de acid ascorbic. Aceasta antioxidant contribuie la menţinerea oaselor sanatoase, prevenirea bolilor parodontale si vindecarea ranilor. Serveşte chiar ca o aspirina naturala, prin controlul inflamaţie şi durere.[6] Acidul ascorbic contribuie la o varietate de funcţii biochimice, biosinteza aminoacizi şi aminelor ce reglementa sistemul nervos. El ajută, de asemenea, corpul să absoarbă fier şi in reactia histaminei, componenta inflamatorie a reacţiilor alergice. Condiţia referitoare la deficitul de vitamina C este scorbutul, care este caracterizate de boala a gingiilor, durere la nivelul muşchilor şi articulaţiilor, leziuni ale pielii, oboseală, şi sângerări. Un adult are nevoie de 10 miligrame de vitamina C pe zi pentru a preveni scorbutul. Unele studii au arătat că o doză zilnică de 100 mg sau mai mult este necesara pentru a menţine in organism vitamina C. [7] Persoanele în vârstă sunt cunoscute pentru lipsa de vitamina C, în primul rând pentru că dieta lor este săracita. Într-un sondaj din 1978, persoanele în vârstă au avut doar jumătate din nivelul de acid ascorbic în sânge, la fel ca şi subiecţii mai tineri. Conform studiilor de cercetare, bărbaţi şi femeile peste 65 de ani nevoie de doze zilnice de 150 mg şi 75 - 80 mg, respectiv, pentru a menţine un nivel plasmatic de 1,0 mg / dl.

Ca un antioxidant, acidul ascorbic, rolul principal este de a neutraliza radicalii liberi.Deoarece acidul ascorbic este solubil în apă, se poate lucra atât în interiorul cât şi în afara celulelor pentru a controla daune radicalilor liberi.

Cărnurile sărate (cu adaos de NaN02 şi NaCl) la depozitare în stare congelată se oxidează mai uşor, sarea având rol prooxidant, efect ce poate fi contracarat prin adaos de acid ascorbic. Efectul clorurii de sodiu este mai evident în prezenţa aerului şi în absenţa antioxidanţilor; de aceea, produsele de carne sărate se congelează şi se depozitează după ambalare sub vid, în care caz durata de păstrare este aproximativ aceeaşi la -12oC, -18oC şi la -24°C.

Substanţele cu acţiune oxidantă sunt recomandate la prelucrarea făinurilor de calitate slabă, ȋn scopul creşterii elasticităţii şi rezistenţei glutenului, respectiv pentru îmbunătăţirea însuşirilor reoogice ale aluatului. Acţiunea lor se bazează pe oxidarea grupărilor -SH din aluat. Dintre oxidanţi cel mai folosit este acidul ascorbic care, deşi este un reducător, ȋn aluat în prezenţa oxigenului acţionează ca un oxidant, deoarece este oxidat enzimatic ȋn prezenţa enzimei ascorbat oxidazâ la acid dehidroascorbic care, de fapt, are acţiune oxidantă. Se foloseşte ȋn doze de 10-100 părţi pe milion şi se introduce în maia sau ȋn aluat.[3]

Tratarea berii cu substanţe antioxidante, care are drept scop legarea oxigenului dizolvat ȋn bere şi protejarea altor compuşi susceptibili la oxidare prezenţi ȋn bere. Se utilizează acidul ascorbic în cantitate de 2-8 g/hl, care poate compensa acţiunea oxigenului dintr-o bere care conţine 0,5-1,0 mg 02 bere. Acidul ascorbic se adaugă în berea filtrată înainte de tragere.[3]

Din totalul de peste 80.000 tone produse anual, circa o treime se utilizează în industria farmceutică (multivitamine, tablete, siropuri, comprimate efervescente etc.), restul utilizându-se în special în calitate de conservant în industria alimentară sau în industria cosmetică [8].

3. Metode de extractie

Acidul ascorbic se obţine prin extracţie din diferite materii prime vegetale, prin sinteză chimică, prin biosinteză sau prin procedee combinate de sinteză chimică şi biosinteză. Indiferent de metoda de obţinere, separarea şi purificarea necesită numeroase etape, care implică consumuri ridicate de materiale şi energie. Soluţia finală din care trebuie extras acidul ascorbic conţine numeroase produse secundare, cel mai important dintre acestea fiind acidul 2-cetogluconic. În ciuda faptului că fiecare etapă a procesului decurge cu randamente de 90%, conversia globală a glucozei în acid ascorbic nu depăşeşte 60% [8].

Datorită caracterului labil al acidului ascorbic, procedurile de extracţie sunt proiectate pentru a o stabiliza. Cooke şi Moxon [11] a revizuit literatura de specialitate până la 1981 şi a constatat că 20 sau mai mult soluţiile de extract au fost folosite de către cercetători cu un număr mare de matrici biologice. Soluţiile de extract ar trebui să menţină un mediu acid, să inactiveze oxidază acidului ascorbic, să limiteaze oxigenul şi să precipite amidonul şiproteinele. Alegerea depinde de soluţia de extract si de probă matrice determinandprocedur. Acidul metafosforic inhibă oxidaza acidului L-ascorbic, inhibă cataliza din metal, şi precipita protein. Amidonul este problematic în sensul ca interferează cu titrarea colorimetrica şiteste fluorometrice. Adaosul de etanol sau acetonă pentru a extrage precipitate metafosforic solubilizeaza amidonul. Acest pas este necesar pentru a analiza prin metode spectroscopice multe legume, inclusiv cartofi, legume, porumb. Acetonă este de asemenea util pentru a elimina

metabisulfit şi dioxid de sulf din fructele deshidratate si din sucuri de fructe. Aceşti agenţi de reducere interfereaza cu 2,6-dichloroindophenol (DCIP) in titrare. EDTA este ca un chelator activ în extractia acidului ascorbic. [11]

Toate procedurile de extracţie trebuie să fie completat de lipsa lumini pentu a limita reactile oxidative. Metodelor de reducere a dimensiunii particulelor ar trebui să evite acumularea căldurii. Ori de câte ori este posibil, eşantionul trebuie adugat azot peste eşantionul iniţial.Liofilizare nu este recomandata pentru concentraţia probei sau conservarea, deoarece stabilitatea vitaminei C scade în umiditate matricei poroase.

Stabilitatea acidului ascorbic total (acid L-ascorbic + acid L-dehidroascorbic) în ser poate

fi extinsă pentru perioade lungi de timp, în condiţii corespunzătoare. Adaosul de acid metafosforic (50 g L-1) stabilizează în mod eficient acidul ascorbic in gel atunci când este ţinută la congelat -70C. Institutul Naţional de Standarde şi Tehnologie (NIST) Standardul de referinta Material (SRM) 970, acid ascorbic in ser, este stabilizat cu acid metafosforic 50 g L-1. Margolis Park [12] a arătat că degradarea poate apărea la plasarea de soluţii de acid L-ascorbic în flacoane înainte de analiză. Ei au arătat că în interiorul suprafeţei de sticlă poate conţine materiale, cum ar fi urme de metale care poate degrada rapid de acid L-ascorbic. Ei au evaluat nouă feluri de flacoane de la cinci furnizori şi au constatat variaţii mari în stabilitatea acidului L-ascorbic stocate în flacoane diferite. Eliminarea efectivă a degradării implica înmuierea flacoanelor în 0,5 mol L-1 NaOH timp de 30 minute; clătirea cu apă distilată, apă deionizată; înmuiere în 1 mol L-1 HCl şi din nou, clătire cu apă distilată, deionizată.Rizzolo [13] a arătat că manipularea şi depozitarea fructelor proaspete a fost esenţială pentru stabilitatea acidului L-ascorbic înainte de analiză. Solutia fiind congelare în azot lichid şi depozitarea probelor înainte de extracţie la -80°C.

Acid ascorbic se extrage din celule prin ruperea ţesutului într-un mediupotrivite pentru extracţie. Varza, la fel ca multe ţesuturi de plante superioare, poate fi uşor omogenizate prin măcinarea într-un mojar şi cu un pic de nisip curat (pentru a face procesul mai uşor).

Pentru o măsurare exactă a conţinutului de acid ascorbic, extracţia de acid ascorbic trebuie să fie completă, acid ascorbic poate fi pierdut prin degradare. Multe plante conţin oxidaza acid ascorbic, care catalizează oxidarea acidului ascorbic la acid dehidroascorbic(Figura 1). Atunci când celulele sunt pregtite pentru extractie, componentele din celule, care sunt de obicei separate prin membrane, se amestecă împreună. În aceste cazuri, oxidaza acidului ascorbic poate catalizeaza oxidarea acid ascorbic iniţial prezente în ţesut. [9]

Fig 1 Acidul ascorbic şi oxidare sa in ascorbat şi acid dehidroascorbic

Pentru a evita pierderea de acid ascorbic, se recomandă să se piseze ţesutul de proba în 5% acid metafosforic, care va inactiva oxidaza. Atomi de hidrogen dintre cele două grupe de enol de acid ascorbic poate fi uşor oxidat (Figura1), ceea ce face acid ascorbic un agent puternic de reducere.

Având în vedere utilizarea pe scară largă de acid ascorbic în conservea fructelor, legumelor, alimente de origine animală şi medicamente, pentru a permite determinarea acidului ascorbic multe tehnici analitice sunt disponibile, cum ar fi titrimetrice, spectrophotometrie, derivat spectrophotometric; colorimetrie, cinetica-spectrophotometrice, debitul de injecţie spectrofotometrică, lichid de înaltă performanţă chromatographic (HPLC).

Determinarea acidului ascorbic din usturoi, piper verde si castan a fost interpretat de derivate spectrofotometrie fără a folosi nici o pre-separare sau tehnici de corectare de fond. Metoda se bazează pe măsurarea distanţelor dintre două valori extreme (amplitudinea vârf la vârf) în scopul de al doilea şi al treilea spectrele derivate din extracte.[10]

1.Titrarea cu 2,6-Dichloroindophenol

Titrare cu DCIP a fost introdusa de Tillmans în 1930[14]. DCIP este redus de acid L-ascorbic la o soluţie incoloră de la culoarea albastră. Acid L-ascorbic este oxidat la dehidroascorbicacid şi colorant în exces roz rămâne în soluţie de acid, formând final vizuală a titrării.Absorbanţa la 518 nm, pot fi utilizate alternativ, la determinarea vizuală punctul final.Există o serie de deficienţe importante cu acesta metoda. Cel mai important, este de titrare acid dehidroascorbic nu va fi măsurată cu excepţia cazului în care este redus la acid ascorbic. Titrarea nu va face diferenţa între acid L-ascorbic şi isoascorbic acid. Metoda nu poate fi folosit pentru analiza de vitamina C. DCIP titrare poate fi folosit pentru sucuri proaspete si multivitaminecare nu conţin cantităţi excesive de cupru sau iron. Extracte foarte colorate din fructe şi legume pot masca schimbarea culoari la titrare lui.

Reducerea DCIP nu se limitează la acid L-ascorbic, precum şi orice substanţă prezentă reducerea în eşantion poate reduce colorantul. Astfel de interferenţe pot duce la măsurători în mod eronat de mare, în cazul în care nu sunt recunoscute. Substanţe care pot interfera includ ioni de cupu, de fier, şi ioni de staniu, sulfite, tiosulfat, taninuri, betanin, cisteina, glutation..

Metoda include următoarele etape:1. Extracţia: acid L-ascorbic este extras din materiale uscate cu metafosforicacid care conţin acid acetic glacial. Soluţia este stabilizată timp de 7 până la 10 zile in frigider. Extractul, este utilizat pentru a dilua sucuri sau alte probe de lichid. Pentru analiza, extractantul este pregătit prin înlocuirea apei în extractant cu 0,3 N H2SO4. După filtrare sau centrifugare, reziduurilor ar fi extras cel puţin o dată suplimentare prin amestecul în extractant. Extracţie corespunzătoare, inclusiv protecţia de lumina, viteza, duce la recuperări mai mare de 95%, cu formarea minim de acid dehidroascorbic.2. Titrarea: extractele limpezite se titrează cu vopsea standard pregătit de către dizolvarea50 mg DCIP Na sare (Eastman Kodak Nr 3463) în 50 ml de apă care conţin 42 mg deNaHCO3, cu diluare la 200 ml cu apă. Soluţia colorant este filtrat şi stocate la frigider într-un

recipient din sticlă de chihlimbar. Concentraţia DCIP este exprimată în mg echivalent acid L-ascorbic pe 1.0 ml soluţie colorantă. Factorul de echivalenţă este determinat prin adăugarea a 2 ml de acid L-ascorbic standard (1,0 mg mL-1) la 5 ml de extractant, rapid şi titrare cu o soluţie de vopsea la o culoare roz persistă timp de 5 s.Acest lucru ar trebui necesita aproximativ 15 ml de soluţie DCIP. Un martor determinareaeste condus prin titrarea 7 ml de apă de extracţie care conţine egală cu mediavolumul de vopsea necesare pentru a se titrează standard de acid ascorbic. Blanks trebuie să se apropie 0,1 ml soluţie DCIP, care prevede un control imediat asupra reactivde calitate

2. Metoda cu 2,6-diclorofenol-indofenol

Se bazează pe proprietăţile de reducere a acidului ascorbic asupra 2,6-diclorofenol-indofenol într-un mediu acid, atunci când acidul ascorbic este transformat în acid dehidroascorbic şi substanţa oxidat, care este de culoare , se transformă în forma sa redusă, care este de alta culoare. PH-ul acid al mediului de reacţie este asigurată de acid oxalic. Aciditatea mediului de reacţie este o necesitate din cauza mai multe motive, după cum urmează:- Pierderea de acid ascorbic din extracte din cauza oxidari cu aer este împiedicată;- Viteza de reacţie între agentul colorant şi acid ascorbic este crescuta;- Acţiunea reductiv de substanţe străine, găsite în produsul analizat, este redus foarte mult, făcând astfel posibila schimbarea culoari. Ca reactivă şi indicator sare de sodiu a 2,6-diclorofenol-indofenol are o culoare albastru, in mediul acid trece de la albastru la culoarea roz.Conţinutul în acid ascorbic este variabilă de la un extract de la altul, datorită compoziţiei chimice pe de o parte anatomice cercetate de plante şi, de asemenea, ca urmare a solventul folosit.Acest lucru este, de asemenea, confirmate de alte studii în conformitate cu care α-tocoferol au un efect protector faţă de acid ascorbic. Procentul de protecţie este variabilă, în conformitate cu raportul amestecului dintre aceste antioxidanti, cercetările arată că acidul α-tocoferol şi ascorbic, şi amestecuri de acid ascorbic avea un efect semnificativ mai bune decât alte combinaţii. Pentru a verifica declaraţiile de mai sus HPLC (cromatografie lichidă de înaltă performanţă), a fost folosit pentru a determina conţinutul celor trei analizate extracte vegetale.

Coloranţi 2,6 diclorofenol-indofenol (DCIP) este albastru în mediu alcalin, roz în mediu acid, şi poate fi redusă de acid ascorbic la o culoare incoloră formă "leuco" (Figura 2).

Figura 2. Reducerea DCIP la DCIPH2.

3. Detectarea acidului ascorbic prin metoda electochimica

Se bazează pe oxidarea acidului ascorbic(fig. 3). Amperometric şi coulometric sunt măsurătorile la un potenţial electrod constantă. Principala diferenţă între aceste două măsurători este cantitatea de analit oxidat în detector: în amperometric oxidare este limitata; în coulometric, analitul este complet oxidat. Structura unui detector de amperometric este de obicei un ''flux de celule'', întrucât, în coulometric o poros ''celule'' fluxul prin aceasta este utilizată. În coulometrie, o cantitate mai mare a analitului este permisă în contact cu suprafaţa electrodului şisensibilitatea creşte. Lucrul cu detector electrochimic, componente ale fază mobilă trebuie să permită separarea distinctă de acid ascorbic şi să fie conductoaresă efectueze responsabil de analit. Cu toate acestea, faza mobilă nu trebuie să producăprea mare fond de semnal.

Figura 3 Analiză cromatografică cu detecţie coulometrică de probe acid ascorbic.Coloana a fost C18, 75 3.9 mm diametru, dimensiunea particulelor 4 I ¼ m, echipat cu un precolumn C18.Faza mobilă a constat, de 0,1 M fosfat disodic pe bază de hidrogen, 2,5 mm-disodiu EDTA, şi 2,0 mm n-dodecyltrimethylammonium clorură, pH-ul 3.0. Semnalul

detectorului este exprimată în mA. (O probă) apoasă care conţine 35 I ¼ M de acid ascorbic (echivalează cu o tărie injecţie de 17,5 p.mol de acid ascorbic). (B) Proba apoasă se reduce cu DTT. (C) Tipic plasmă eşantion. (D) Plasma proba redusă de DTT. (E) proba cu plasmă, dupăincubare cu 5 I ¼ M CuBr2 (5 min, 25A °C). (F), proba cu plasmă, după incubare cuoxidază acid ascorbic (5 min, 25A ° C). [10]

4. Extracţia acidului ascorbic cu Amberlite LA-2,

Studiile efectuate arată că în acetat de butil separarea decurge prin intermediul unei reacţii interfaciale de ordinul I între acid şi extractant: Procesul este controlat de concentraţia extractantului în faza organică şi de valoarea pH-ului fazei apoase. Un grad de extracţie de 90% se obţine la o concentraţie iniţială a extractantului de 160 g/L şi un pH = 1 în faza apoasă iniţială. Gradul de extracţie poate fi îmbunătăţit cu 6 – 23% prin adăugarea unui modificator de fază (2- octanol), care măreşte polaritatea solventului. Modelarea matematică a procesului de extracţie arată că eficienţa extracţiei este influenţată în proporţie de 91,1% de către concentraţia iniţială a extractantului în faza organică şi de către pH-ul fazei apoase (fig 4), ceilalţi factori (intensitatea amestecării, temperatura, raportul volumic al fazelor etc.) influenţând procesul într-o mai mică măsură [3].

Figura 4. Influenţa pH-ului fazei apoase şi a concentraţiei extractantului la extracţia reactivă a acidului ascorbic cu Amberlite LA-2 în acetat de butil

Bibliografie

[1] http://ro.wikipedia.org/wiki/Acid_ascorbic

[2] Izumi, K. 1992. Reaction of nitrite with ascorbic acid or ascorbic acid-2-derivatives. J. Food. Sci.57:1066.[3] Constantin Banu- Manualul inginerului din industra alimentara. Ed. Tehnica Bucuresti 1998[4] Gaby S.K , Singh V.N., 1991 - "Vitamin C," – Vitamin Intake and Health: A Scientific Review, S.K. Gaby, A. Bendich, V. Singh and L. Machlin (eds.) Marcel Dekker, N.Y. p. 103-1043[5] Schectman G., Byrd J.C., Hoffmann R., 1991 - Ascorbic Acid Requirements for Smokers: Analysis of a Population Survey, American Journal of Clinical Nutrition, 53:1; 1466- 70[6] Valnet J., 2002 – Phytotherapy – Treatment by plants. Gramond, Bucharest[7] Kronhausen E., Kronhausen P., Demopoulos M.D., 1989 - Formula for Life, William Morrow and Co., New York, p. 95[8] Gavrila Lucian., Curs tehnici de separare şi concentrate ȋn biotehnologi.[9] Carol Reiss. Measuring the Amount of Ascorbic Acidin Cabbage [10] Ball, G. F. M., Chemical and biological nature of the water-soluble vitamins, In Water Soluble Vitamin Assays in Human Nutrition, Chapman and Hall, New York, 1994, chap. 2.[11] Cooke, J. R. and Moxon, R. E. D., The detection and measurement of vitamin C, In Vitamin C, Counsell, J. N. and Horning, D. H., eds., Applied Science Publishers, London, 1985, p. 303.

[12] Margolis, S. A., Paule, R. C., and Ziegler, R. G., Ascorbic and dehydroascorbic acids measured in plasma preserved with dithiothreitol or metaphosphoric acid, Clin. Chem., 36, 1750, 1990.[13] Rizzolo, A., Brambilla, A., Valsecchi, S., and Eccher-Zerbini, P., Evaluation of sampling andextraction procedures for the analysis of ascorbic acid from pear fruit tissue, Food Chem., 77, 257,2002.[14] Tillmans, J., The antiscorbutic vitamin, Z. Lebensm. Unters.-Forsch, 60, 34, 1930.