1

ACADEMIA ROMÂNĂ Proiect PN-II-ID-PCE-2011-3-0742 INSTITUTUL DE BIOLOGIE BUCUREŞTI Contract nr. 159 / 28.10.2011

Biodiversitate şi distribuţie cronologică a microorganismelor în straturile de gheaţă perenă din gheţarul Scărişoara (România)

RAPORT ŞTIINŢIFIC

Etapa 1 (2012)

Investigarea microbiotei provenind din depozitele perene de gheaţă din Gheţarul Scărişoara reprezintă primul studiu al biodiversităţii microorganismelor procariote şi eucariote din gheţarii peşterilor şi corelarea acesteia cu vârsta şi caracteristicele geo-climatice ale gheţii.

Rezultatele obţinute corespund tuturor obiectivelor şi activităţilor prevăzute în proiect pentru etapa 2012, cuprinzând: (1) Prelevarea probelor de gheaţă de vârste diferite. (2) Studiul fiziologic al comunităţilor microbiene din depozitele de gheaţă. 2.1 Cultivarea microorganismelor din probele de gheaţă în (A) mediu lichid şi (B) mediu solid; 2.2 Caracterizarea microorganismelor prin microscopie de epifluorescenţă; 2.3 Evaluarea capacităţii de fixare autotrofă a carbonului şi a azotului; (3) Studiu filogenetic al comunităţilor microbiene din depozitele de gheaţă; 3.1 Construcţia bibliotecilor genice 16S-rRNA; 3.2 Evaluarea diversităţii bibliotecilor genice prin DGGE şi ARDRA; 3.3 Secvenţierea băncilor de gene 16S-ARNr; (4) Analiza geochimica a sedimentelor de gheaţă în funcţie de vârstă şi încărcătură organică. 1. Prelevarea probelor de gheaţă de vârste diferite

Probele de gheaţă au fost colectate din diferite locaţii din Sala Mare şi Rezervaţia Mică a Gheţarului Scărişoara, în trei sesiuni de prelevare (Martie, Iulie, Septembrie 2012). Prelevarea s-a efectuat în condiţii sterile. Probele au fost colectate din locaţii datate anterior cu izotopi (Perşoiu et al., 2010), corespunzătoare gheţii de diferite vârste: Proba 1-S (1 an, expuse la soare), Proba 1-L (1 an, lumină indirectă) din Sala Mare şi din Rezervaţia Mică, de la întuneric: Proba 1-D (1 an), Proba 450 (450 ani) şi Proba 900-O (900 de ani bogate în sediment organic) sau în absenţa acestuia Proba 900. De asemenea, au fost prelevate probe de apă recentă, expusă la soare, rezultată din acumularea precipitaţiilor în Sala Mare (Proba A-S). Pentru evitarea contaminării probelor, stratul superficial (cca. 20 cm) de gheaţă a fost iniţial îndepărtat, iar suprafaţa rezultată flambată; carotele (0,5 m lungime x 3 cm diametru) au fost extrase cu un dispozitiv manual de foraj sterilizat prin flambare (Fig.1a, 1b). Carotele (0,5 m lungime x 3 cm diametru) au fost transferate în flacoane sterile de 1 L şi conservate la -20°C. Probele de apă au fost recoltate cu ajutorul unor seringi sterile de 60 ml.

2. Studiul fiziologic al comunităţilor microbiene din depozitele de gheaţă 2.1 Cultivarea microorganismelor din probele de gheaţă

(A) Microorganismele din probele de gheaţă de diferite vârste au fost cultivate la 4° şi 15°C, în medii lichide cu compoziţii diferite: mediul Luria Bertani (LB), LB suplimentat cu 10% glucoză (LBG) şi medii minerale suplimentate cu glucoză, peptonă, yeast extract şi/sau cazaminoacizi T1, T2 şi T3 (Bidle et al., 2007). Creşterea bacteriană a fost monitorizată spectrofotometric cu cititorul de placi FluoStar Omega (BGM Labtech) prin determinarea OD600 . Curbele de creştere a probelor 1-S, 1-L, 450, 900 şi 900-O la 4°C (Fig.2) şi 15°C (Fig.3) indică varietatea la nivelul perioadei de lag, a vitezei de creştere şi a nivelului maxim al OD600 atinse pentru fiecare probă, acestea fiind corelate cu vârsta gheţii.

Fig. 1. Prelevarea probelor de gheaţă din (a) Rezervaţia Mică, întuneric, şi din (b) Sala Mare, lumină

(b) (a)

2

Timp (zile)

Fig. 2. Curbe de creştere la 4°C ale microorganismelor din probe de gheaţă 1-S, 1-L, 450, 900 şi 900-O pe mediile lichide LB (albastru deschis), LBG (violet), T1 (albastru), T2 (rosu) şi T3 (verde) Fig. 3. Curbe de creştere la 15°C ale microorganismelor din probe de gheaţă 1-S, 1-L, 450, 900 şi 900-O pe mediile lichide LB (albastru deschis), LBG (violet), T1 (albastru), T2 (rosu) şi T3 (verde)

(1-S)

(1-L)

(450)

(900)

(900-O)

(450)

(900)

(900-O)

(1-S)

(1-L)

Timp (zile)

DO

600

DO

600

3

(B) Diversitatea microorganismelor a fost evaluată de asemenea prin cultivarea pe mediu solid în prezenţa a 31 de surse diferite de carbon, utilizând sistemul EcoPlates (Biolog). Plăcile au fost incubate la 10°C iar creşterea bacteriană a fost monitorizată spectrofotometric prin măsurarea OD590 cu cititorul de plăci FluStar Omega (BGM Labtech). Rezultatele obţinute (Tabel 1) indică diversitatea comunităţilor de microorganisme din fiecare probă de gheaţă, corespunzătoare numărului total de medii de cultură utilizate şi similaritata acestora (mediile preferenţial utilizate).

Tabel 1. Cultivare la 10°C în sistem EcoPlates BIOLOG

Proba Diversitate

(numărul de medii de cultură utilizate)

Similaritate (medii de cultură preferenţiale)

1-S 22 A3-4, B3-4, D1-2 1-L 15 D1, D3, E2, F2-3 450 30 A2-4, B2-3-4, C4, D2-3-4, E1-2-4, F2, G1, H3

900-O 2 B2 2.2 Caracterizarea microorganismelor prin microscopie de epifluorescenţă Probele de gheaţă 1-S şi 1-L au fost cultivate la lumină în mediu BG11 la 7oC timp de 2 luni, utilizând microplăci. Microorganismele fototrofe (cianobacterii, alge microscopice) şi heterotrofe rezultate au fost analizate prin microscopie de fluorescenţă (Fig. 4) cu microscopul A1 (Zeiss), în flurescenţă naturală (clorofilă sau pigmenţi), marcate cu SybrGreen (totalitatea celulelor procariote şi eucariote) sau cu homodimer de bromură de etidiu (indicând membrana plasmatică alterată structural şi funcţional, celule moarte). Rezultatele indică prezenţa microorganismelor fototrofe, atât cianobacterii (Fig. 4a) cât şi alge filamentoase (Fig. 4d) , şi dominanta celulelor viabile (Fig. 4b şi 4c).

Fig. 4. Microscopie de fluorescenţă proba 1-S: (a) fluorescenţă naturală; (b) marcare cu homodimer bromură de etidiu; (c, d) marcare cu SybrGreen; (b şi c) reprezintă acelaşi câmp microscopic. 2.3 Evaluarea capacităţii de fixare autotrofă a carbonului şi a azotului

In cazul cultivării în mediul BG11 la 7oC a amestecului de populaţii de microorganisme fototrofe şi heterotrofe din proba 1-S indică un timp de dublare de 10 zile. În absenţa sursei de azot, prin cultivare în mediul BG0, viteza de creştere este extrem de diminuată, proba ne-ajungând în faza staţionară nici dupa 2 luni de zile. Acest rezultat sugerează fie absenţa fixării azotului atmosferic de către fototrofe în aceste condiţii, fie o viteză foarte scăzută a acestui process care nu permite creşterea şi multiplicarea sensibilă a celulelor. 3. Studiu filogenetic al comunităţilor microbiene din depozitele de gheaţă

3.1 Construcţia băncilor de gene 16S-ARNr O bibliotecă genică 16S-ARNr a fost obţinută din proba de gheaţă 900-O în urma cultivării acestora la 15°C în 10 ml mediu lichid LB timp de 7 zile. ADN-ul genomic total a fost extras cu DNAeasy Blood and Tissue kit (Qiagen) în prezenţa mutanolizinei pentru liza pereţilor celulari. Cantitatea şi puritatea ADN-ului a fost determinată spectrofotometric (Nanodrop1000) rezultând concentraţii de 80-350 ng/µl ADN. Genele 16S-ARNr au fost amplificate utilizându-se amorsele universale bacteriene B8F; B152R, urmând procedura touch-down care constă în incubare 2 min la 95oC, urmată de 5 cicluri de 1 min. la 95 oC, 1,50 min. la 62-57oC, şi 2 min. la 72 oC temperatura de anneling reducându-se cu 1oC la fiecare ciclu şi de 25 de cicluri de incubare 1 min. la 95oC, 1,5 min. la 60oC, 2 min./72 oC, cu etapa de extensie finală de 10 min. la 72oC. Produşii de PCR obţinuţi au fost clonaţi în vectorul de clonare pGEM-T Easy (Promega) şi amplificaţi în E. coli XL1Blue. Coloniile rezultate au fost în continuare analizate prin procedeul ARDRA şi parţial secvenţializate. Banca de gene rezultată conţine 182 de clone 16S-ARNr reprezentând bacterii psichrotolerante din proba 900-O cultivate la 15°C în LB.

4

3.2 Evaluarea diversităţii băncilor de gene prin DGGE şi ARDRA DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) Diversitatea comunităţilor de microorganisme procariote şi eucariote din probele de gheaţă 1-S, 1-L, 450, 900 şi 900-O a fost analizată utilizând metoda DGGE, atât la nivelul ADN-ului total extras din gheaţă cât şi din culturile bacteriene pe mediile LB, LBG, T2, T3. În primul caz, probele de gheaţă de diferite vârste au fost topite, apa obţinută (aprox. 500 ml) a fost filtrată în condiţii sterile (22 μm, Millipore); filtrele au fost utilizate pentru izolarea ADN-ului genomic cu ajutorul kitului DNAeasy Blood and Tissue kit (Qiagen) în prezenţa mutanolizinei. În cazul culturilor microbiene pe medii diferite, ADN-ul total a fost extras din 5 ml de cultură obţinută dupa 7-20 zile de creştere la 15oC. Genele SSU-rRNA au fost amplificate prin PCR, utilizându-se amorse cu extensii GC (F357GC; R518 – pentru procariote; Euk1A; Euk516 – pentru eucariote) iar fragmentele rezultate au fost analizate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă în gradient denaturant (uree, formamidă) de 30-55% pentru bacterii (16S-ARNr) şi 20-35% pentru eucariote (18S-ARNr).

Fig. 5. Analiza DGGE a genei 16/18S-rARN corespunzătoare probelor de gheaţă şi culturilor celulare (a) amplificare PCR a 16S-rRNA (bacterii) din gheaţă: 1-S (1-2 ), 1-L (3-4), 450 (5-6); 900 (7-8), 900-O (9) (b) amplificare PCR a 18S-rRNA (eucariote) din gheaţă: 1-S (1 ), 1-L (2-3), 450 (4-5); 900 (6-7) (c) amplificare PCR a 16S-rRNA (bacterii) din culturi pe medii LB si LBG: Marker (1,7,12), 1-L/LB (2), 450/LB (3), 900/LB

(4), 900-O/LB (5), 1-S/LBG (6), 1-L/LBG (8), 450/LBG (9), 900/LBG (10), 900-O/LBG (11) (d) amplificare PCR a 16S-rRNA (bacterii) din culturi pe medii T2, T3: Marker (1,7,13), 1-S/T2 (2), 1-L/T2 (3), 450/T2 (4),

900/T2 (5), 900-O/T2 (6), 1-S/T3 (8), 1-L/T3 (9), 450/T3(10), 900/T3(11), 900-O/T3 (12) Profilul DGGE al genelor SSU-rRNA amplificate din ADN-ul total extras din gheaţă şi din culturi pe medii diferite (Fig. 5) indică existenţa unui număr ridicat de specii (nr. de benzi) de origine variată (migrare diferită) în ce priveşte atât microorganismele procariote (a, b, d), cât şi eucariote (c) provenind din gheaţa de vârste diferite. Fragmentele de ADN au fost extrase din gel şi sunt în curs de secvenţiere pentru identificarea compoziţiei speciilor acestor probe. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) Diversitatea moleculară a bibliotecii genice 16S-rRNA obţinute a fost analizată utilizând metoda ARDRA, prin digestia enzimatică cu enzime de restricţie bazată pe diferenţele fragmentelor ADN rezultate corespunzătoare fiecarei clone. Plasmidele izolate din clonele corespunzătoare băncilor de gene 1-D şi 900-O au fost digerate cu HinfI/HaeIII, RsaI şi analizate electroforetic în gel de agaroză 1%. În cazul probei 900-O, analiza ARDRA a clonelor 100-119 şi respectiv 95-99 (Fig. 6) indică profilul digestiilor enzimatice, care au stat la baza unei selecţii prealabile pentru determinarea secvenţelor băncii de gene 16S-ARNr. a. HinfI /HaeIII b. HinfI /HaeIII

Fig. 6. Analiza ARDRA a clonelor 95-119 din proba 900-O (a-b) Digestie enzimatică HinfI /HaeIII a clonelor 100-118, (c-d) digestie enzimatică RsaI a clonelor 100 –119; (e) digestie enzimatica HinfI, HaeIII, RsaI a clonelor 97-99. 3.3 Secvenţierea băncilor de gene 16S-rRNA Secvenţierea genelor este în curs de execuţie. Banca de gene 16S-ARNr obţinute din proba de gheaţă 900-O cultivată la 15°C în mediu LB a fost partial secvenţializată utilizând Genetic Analyzer ABIPrism 3500 (Applied Biosystem). Secvenţele genice obţinute au fost analizate cu Blast Software al NCBI indicând prezenţa unor specii

c. RsaI_100_112

Mw

100

101

102

103

104

105

Mw

106

107

108

109

110

Mw

111

112

113

114

115

116

117

118

d. RsaI_113_119 e. HaeIII_HinfI_RsaI_97_98_99

5

omoloage (80-98% identitate) cu Pseudomonas (P. mandelii (98%), P. syringae (80%), P. Sp 11, specie psichrotolerantă din soluri alpine (98%), P. brassicacearum (86%)), Antarctic bacterium RO2 (96%), şi bacteriei necultivabile pLW-23 identificată în Washington Lake, lac cu apă dulce (98%). 4. Analiza geochimică a sedimentelor de gheaţă în funcţie de vârstă şi încărcătură organică Probele A-S, 450, 900-O şi 900 au fost analizate pentru următorii indicatori: substanţa organică oxidabilă (SOO)/(consumul chimic de oxigen), nutrienţi (azotaţi) şi salinitate (calciu, sulfaţi, cloruri). Tabel 2. Analiza chimică a probelor de gheaţă

Proba Indicator

U.M.

A-S 450 900-O 900 SOO Consum chimic de oxigen mg O2/l 30,75 740,88 170,52 28,77 Nutrienţi Azotaţi mg NO3

3-/l 0,937 0,382 0,106 0,044 Calciu mg Ca2+/l 50,9 17 16,1 8,9 Sulfaţi mg SO4

2-/l 3,6 3,4 3,7 2,8 Salinitate

Cloruri mg Cl-/l 7,2 5,7 5,0 4,3 Valoarea acestor parametri (Tabel 2.) descreşte odată cu creşterea vârstei gheţii, cu excepţia apei de suprafaţă recentă (A-S) al cărei SOO are valori comparabile cu cele ale gheţii de 900 de ani. Prezenţa substratului organic în proba de 900 de ani (900-O) este asociată cu un conţinut mai ridicat de SOO, azotaţi şi calciu faţă de gheaţa cu aceeaşi vârstă (900).

Referinţe bibliografice 1. Bidle KD, Lee S, Marcant DR, Falkowski PG, 2007, PNAS, 104: 13455-60; 2. Perşoiu A, Pazdur A, 2010, The Cryosphere Discuss, 4: 1909–1929; Articole ISI trimise la publicare (ISI) 1. A. Hillebrand-Voiculescu, C. Itcus, I. Ardelean, A. Rusu, A. Persoiu, T. Brad, E. Popa, B.P. Onac, C. Purcarea. Searching for

cold-adapted microorgansims in 1000-years old underground glacier from Scarisoara Cave. Geografia Fisica Dinamica Quaternaria. Vol. aniversar.

2. A. Persoiu. Monitoring environmental parameters in ice caves: techniques, methods, problems and pitfalls. Geografia Fisica Dinamica Quaternaria. Geografia Fisica Dinamica Quaternaria. Vol. aniversar.

Articole în curs de preparare (reviste ISI) 1. C. Itcus, A. Hillebrand-Voiculescu, A. Persoiu, T. Brad, B.P. Onac, C. Purcarea. Microbial chronodiversity from perennial

ice deposits in Scarisoara Cave. 2. D. Pascu, C. Itcus, T. Brad, A. Hillebrand-Voiculescu, C. Purcarea, I. Ardelean. Phototrophic microorganisms from

Scarisoara Cave glacier. Conferinţe internaţionale: 1. 5th International Workshop on Ice Caves (IWIC-V), Barzio, Italia, 16 - 23 septembrie, 2012. Microbial biodiversity in ice

sediments from Scarisoara Ice Cave (Romania) . A. Hillebrand-Voiculescu, C. Itcus, I. Ardelean, A. Rusu, A. Persoiu, T. Brad, E. Popa, B.P. Onac, C. Purcarea. Poster.

2. A New Approach of the Academic Research in Biology, IBB Annual Conference, Bucuresti, 11-12 decembrie 2012. (1) Microbial Diversity in the Subterranean Ice Deposits of Scărişoara Cave. A. Hillebrand-Voiculescu. Prezentare orala; (2) Cell growth and DGGE analysis of microorganisms from Scarisoara Cave ice sediments. C. Itcus, A. Hillebrand-Voiculescu, D. Pascu, A. Persoiu, T. Brad, C. Purcarea. Poster.