7/23/2019 6 - pentelescu - 330-334

1/5330

M tr

Clujul Medical 2012 Vol. 85 - nr. 3

BiofilM Ring TesT o nou MeTodologie deevaluaRe IN VITRO a eficaciTii apeloR deguR

caRola penTelescu1, ada delean1, dan pop1,vioRica TeodoRescu3, lauReniu pascu2

1ctr ot2ctr prtt dtr1,2ftt M dtr, urtt M frm iH, c-n3ctr ot, ftt M dtr, urtt o,ct

Rmt

Biofilmul plcii dentare reprezint factorul etiologic principal al cariei dentare

i bolii parodontale. Prevenia cariei dentare i a afeciunilor parodoniului marginal

vizeaz ndeprtarea biofilmelor orale existente i prevenirea formrii acestora. Apele

de gur sunt mijloace ieftine, uor de utilizat, scopul lor fiind combaterea biofilmelor

i prevenirea apariiei gingivitei. Testarea in vitro a agenilor antiplac trebuie s

precead utilizarea clinic a acestora. Aceasta se realizeaz pe modele experimentale

care imagineaz biofilme create in vitro. Un astfel de model experimental este tehnica

Biofilm Ring Test. Principiul metodei const n adiia unor bile magnetice la soluia

bacterian. Odat cu formarea biofilmelor, bilele magnetice sunt ncorporate n

matricea exopolizaharidic. Dup incubare, biofilmele sunt supuse unui proces de

magnetizare i scanate ntr-un dispozitiv special. Pe baza imaginilor obinute se

calculeaz un Indice de Formare a Biofilmelor (BFI), valorile acestuia indicnd

prezena sau absena biofilmelor. Astfel este posibil depistarea rapid, precis i

reproductibil a biofilmelor.

ct h:biofilme orale, ageni antimicrobieni, Biofilm Ring Test.

BiofilM Ring TesT a new TecHnique of IN VITROevaluaTion of MouTHRinses

abtrtOral biofilms are the etiological factor for dental caries and periodontal disease.

Prevention should focus on the removal of existing oral biofilms and inhibition of

new biofilm formation. Mouthrinses are efficient antiplaque and antigingivits agents.

Mouthrinses are tested in vitro before their clinical use. Biofilm models that mimic in

vivo conditions are used for this purpose. Biofilm Ring Test represents a new device

for in vitro biofilm evaluation. The principle of the method consists of the addition ofmagnetic microbeads to the bacterial solution. During biofilm formation the beads

are incorporated in the exopolisaccharide matrix. After incubation the biofilms are

read with a special scanner prior and after magnetization. Based on the readings a

Biofilm Forming Index (BFI) is calculated. The BFI values are indicating the presence

or absence of biofilms. The Biofim Ring Test technique is a rapid, precise and

reproducible method for biofilm detection.

Kyr:oral biofilms, antimicrobial agents, Biofilm Ring Test.

Articol intrat la redacie n data de: 27.05.2012Primit sub form revizuit n data de: 06.06.2012Acceptat n data de: 11.06.2012Adresa pentru coresponden: carollinchen@yahoo.com

7/23/2019 6 - pentelescu - 330-334

2/5 33

art rtr

Clujul Medical 2012 Vol. 85 - nr. 3

inTRoduceReBiofilmele au fost descrise din secolul 17, cnd

Leeuwenhoek observa prima oar animaculele din placadentar proprie [1]. Dar teoria biofilmului a fost postulatabia n 1978, cnd cercetri ulterioare privind dinamicaformrii i dezvoltrii biofilmelor au dus la dobndireacunotinelor necesare pentru definirea biofilmelor. Astzi

biofilmele sunt definite ca fiind comuniti bacterienesesile ataate ireversibil de un substrat sau ntre ele, nglo-

bate ntr-o matrice extracelular de substane polimerice,pe care celulele bacteriene le-au produs i prezint unfenotip modificat cu privire la rata de cretere i transcripiagenelor [1]. Orice mediu n care sunt prezente bacterii icare prezint un flux lichidian este predispus la apariia

biofilmelor [2]. n acest sens, mediul oral reprezint mediulideal pentru apariia i instalarea biofilmelor, fiind expusfluxului salivar constant i prezentnd numeroase i variatespecii bacteriene. Cele peste 700 de specii bacteriene pre-zente n cavitatea oral [3] se organizeaz la nivelul supra-

feelor dentare sub forma plcii dentare. Aceasta reunetetoate caracteristicile structurale i funcionale ale unui

biofilm [4]. Particularitile biofilmului plcii dentare suntdiversitatea mare de specii bacteriene regsite n acestai comunicarea ntre celule sau de la microcomunitate lamacrocomunicate, proces denumit quorum sensing [2].Scopul acestui proces dinamic desfurat ntre celulele

bacteriene este de a-i semnaliza prezena unele fa dealtele i de a modula expresia genetic ca i rspuns lamodificrile densitii populaionale [2]. Patogenitatea

biofilmului plcii dentare, ca i n cazul altor biofilme,este consecina rezistenei crescute fa de substanele

antimicrobiene, precum i a incapacitii de a fi fagocitatde celulele de aprare ale gazdei [2]. Biofilmele orale suntunanim acceptate ca fiind factorul cauzal al principalelorafeciuni ale cavitii orale i anume caria dentar [5] i

boala parodontal [6]. Un loc important n combatereaacestor afeciuni revine preveniei. OMS atrage ateniaasupra importanei care trebuie acordat preveniei, prin

promovarea unui stil de via ct mai sntos, cu scopulcreterii calitii vieii [7]. De la corelaia demonstratde Loe et al. [8] ntre placa dentar i gingivit, pn n

prezent, cercetri microbiologice, imunologice i modeleexperimentale de laborator au aprofundat i explicatcorelaia dintre placa dentar i cele dou afeciuni majore

ale cavitii orale [9]. Astfel prevenia cariei dentare i aafeciunilor parodoniului marginal vizeaz n principalndeprtarea biofilmelor orale existente i prevenireaformrii acestora.

apele de guR - Mijloc coMpleMen-TaR de igien oRal

ndeprtarea biofilmelor orale de la nivelul supra-feelor dentare se poate realiza profesional n cabinetulde medicin dentar prin detartraj i periaj profesional.Dar principala metod de ndeprtare a plcii dentare

rmne periajul dentar efectuat individual la domiciliu. S-ademonstrat c n timpul periajului dentar nu se realizeazigienizarea corect a spaiilor interdentare [10], fiindnecesar utilizarea unor mijloace adjuvante de igienizarea spaiilor interdentare, cum sunt aa dentar i periueleinterdentare, care permit controlul nivelului de plac dinaceste zone. Studiile au artat c, n medie, n rile VestEuropene un adult practic periajul dentar n medie unminut zilnic [9], timp evident insuficient pentru a asigura ondeprtare corect a biofilmelor orale. Un alt factor limitantal eficacitii periajului dentar este lipsa de motivaiea pacienilor n efectuarea igienizrii orale, precum idificultatea medicilor de a motiva pacienii n scopulmeninerii unei igiene orale ct mai corecte. Timpul necesar

pentru a reui motivarea corect a pacientului, exprimatprin reduceri semnificative ale indicelui de plac este de3.5 ore [10], interval extrem de lung att pentru medic, cti pentru pacient [10]. Pentru a mri eficiena periajuluidentar ntr-un timp mai scurt au aprut periile dentare

electrice. Acestea permit reducerea mai eficient a plciidentare, 45% fa de 30% prin periajul manual, necesit untimp mai scurt de periaj, nu presupun o tehnic complicati sunt active i asupra plcii dentare subgingivale [10].Chiar i n aceste condiii compliana pacienilor fa deacest instrument de igien oral rmne limitat, ntre 24-36% [11], la aceasta adugndu-se i preul de cost relativridicat al acestor dispozitive.

Dificultile de ndeprtare corect a plcii dentaredatorit factorilor mai sus amintii, precum i incidenamare a gingivitei induse de plac n rndul populaiei,reprezint argumentul principal n favoarea introducerii

unor mijloace complementare de igien oral. Mai mult,mucoasa oral este colonizat de un numr mare debacterii, majoritatea speciilor prezente n biofilmul plciidentare fiind regsite i pe suprafeele mucoasei orale[12]. Prin exfolierea continu a mucoasei, bacteriile trec nsaliv, fcnd posibil recolonizarea suprafeelor dentareigienizate, mucoasa servind astfel ca un rezervor permanentde bacterii [13]. Existena acestor nie la nivelul cavitiiorale, care nu sunt igienizate prin periaj, constituie un altargument pentru completarea periajului dentar cu mijloacesuplimentare [13]. Implicaiile bacteriilor orale n apariiaafeciunilor cardiovasculare, a endocarditei bacteriene, a

pneumoniei de aspiraie i asocierea cu nateri premature

[14] reprezint nc un motiv pentru combaterea biofilmelororale. Astfel se impune suplimentarea mijloacelor mecanicede ndeprtare a biofilmelor orale prin introducerea agen-ilor antimicrobieni. Scopul acestora este de a crete eficien-a periajului dentar i de a reduce ncrctura bacterian dela nivelul cavitii orale. Mecanismul lor de aciune constfie n prevenirea formrii biofilmelor, fie n distrugerea

biofilmelor deja formate, fie n mpiedicarea creterii idezvoltrii biofilmelor sau uciderea anumitor sue bacte-riene de la nivelul biofilmelor [15]. Agenii antimicrobieni,n principal substane chimice, sunt ncorporai n ape de

7/23/2019 6 - pentelescu - 330-334

3/5332

M tr

Clujul Medical 2012 Vol. 85 - nr. 3

gur, paste de dini, gume de mestecat i altele.Apele de gur sunt mijloace ieftine ce ofer bene-

ficiul de a fi uor de utilizat, fr a necesita o manualitatedeosebit din partea pacientului. Apele de gur ptrund ntoate zonele cavitii orale, reducnd numrul bacteriiloratt la nivelul suprafeelor dure, ct i la nivelul mucoaseiorale [16]. Scopul lor este de a combate biofilmele orale, dea preveni apariia gingivitei [9] i progresia parodontopatieimarginale cronice [16]. Eficacitatea clinic a apelor degur a fost demonstrat prin numeroase studii efectuate

pe termen scurt, mediu i lung, care au artat c diverselesubstane ncorporate n apele de gur contribuie eficient lareducerea nivelului de plac i a inflamaiei gingivale [17].nainte de a fi testai clinic, agenii antiplac sunt testaiin vitropentru a determina efectul antimicrobian i efectulasupra biofilmelor orale al acestora.

TesTaRea eficaciTii ageniloRanTiplac

O caracterisitic major a bacteriilor care triescn biofilme o constituie rezistena acestora fa de ageniiantimicrobieni. Astfel celulele bacteriene din biofilme secomport diferit fa de agenii antimicrobieni, comparativcu celulele n stare planctonic [1]. Apele de gur, n timpulscurt ct sunt aplicate asupra biofilmelor orale, trebuie s

penetreze matricea extracelular n vederea ptrunderii ngrosimea biofilmelor pentru a fi eficiente asupra bacteriilor[18]. Din aceste considerente rezultatele obinute printestarea efectului antimicrobian asupra celulelor n stare

planctonic vor fi diferite fa de rezultatele obinute printestarea aceluiai produs asupra aceleiai sue bacteriene,

cnd aceasta se gsete n interiorul unui biofilm [18].Pentru a evita aceste neajunsuri i pentru a obine condiiiexperimentale mai apropiate de condiiile din cavitateaoral n timpul cercetrii biofilmelor in vitro, s-au dezvoltatmultiple tehnici experimentale ce urmresc formarea bio-filmelor in vitro. Apariia acestor modele experimentalede formare a biofilmelor in vitroconstituie un pas nainten cercetarea produselor anti-plac, permind testareaagenilor antimicrobieni asupra biofilmelor orale [9].Unele din aceste modele experimentale realizeaz formarea

biofilmelor n stare dinamic, cum ar fi Constant DepthFilm Fermenter, dezvoltat de Pratten et al. [19] sau formarea

biofilmelor n dispozitive speciale, cum sunt spre exemplu

camerele Ludin n care soluia bacterian este angajatntr-un flux continuu cu autorul unei pompe peristaltice.Alte modele experimentale se bazeaz pe formarea statica biofilmelor. Dintre aceste metode, cea mai cunoscut estetehnica cristal violet de cercetare a biofilmelor sau modeluldezvoltat de Guggenheim et al., n care biofilmele suntformate pe discuri de hidroxiapatit [20]. O nou tehnicde cercetare a biofilmelor orale in vitro este TehnologiaBiofilm Ring Test, dezvoltat de Biofilm ControlSaintBeauzire, Frana.

TeHnologia BiofilM Ring TesT

Dispozitivul Biofilm Ring Testcuprinde un set deaparate necesare pentru formarea i evaluarea biofilmelor.Kit-ul complet de efectuare a analizei biofilmului printehnologia Biofilm Ring Testcuprinde:

- Un flacon Toner 0.05 sau 0.06, care conine soluiacu bile magnetice;

- Un flacon soluie de contrast;- 12 barete de polistiren a cte 8 godeuri fiecare;- Un dispozitiv de magnetizare care prezint 96

de poziii. n dispozitivul de magnetizare pot fi aezate12 barete a cte 8 godeuri fiecare, deci pot fi magnetizate12 barete odat. Baretele de polistiren sunt aezate ndispozitivul de magnetizare, astfel nct centrului fiecruigodeu s i corespund unui centru de magnetizare;

- Un scanner special Biofilm Reader (SaintBeauzire, France), utilizat pentru lecturarea baretelornainte i dup magnetizare;

- Un calculator dotat cu un software special, n care

vor fi stocate si analizate datele primite de la scanner;- Un software special Biofilm Control Elements

(Saint Beauzire, France), conceput special pentru compa-rarea imaginilor i calcularea Indicelui de Formare aBiofilmului BFI.

pRincipiul MeTodeiPrincipiul metodei Biofilm Ring Testa fost descris

pe larg de Chavant et al. [21]. Se bazeaz pe adiia la soluiabacterian a unor bile magnetice cu diametrul de 5 sau 6microni. Bilele magnetice se gsesc n soluia de Toner,iar proporia de adugare a Tonerului la soluia bacterian

este de 1%. Amestecul soluie bacterian-bile magnetice vafi inoculat n barete de polistiren a cte 8 godeuri fiecare.Soluia bacterian este apoi incubat timpul necesar pentruformarea biofilmelor, specific pentru fiecare bacterie n

parte. Se vor respecta de asemenea condiiile de aerobiozsau anaerobioz necesare dezvoltrii biofilmelor bacte-riene. Odat cu iniierea formrii biofilmelor bacteriilevor sintetiza matricea exopolizaharidic. Bilele magneticeadugate la soluia bacterian vor fi cuprinse n interiorulmatricii exopolizaharidice, fiind reinute astfel ferm ninteriorul biofilmului. Dup perioada de incubare n godeurise va aduga un lichid de contrast care va permite lecturarea

baretelor n scannerul special Biofilm Reader. Dup prima

lectur datele culese de scanner vor fi trimise n calculator,fiind interpretate i stocate de software-ul special BiofilmControl Elements. Baretele vor fi introduse apoi ndispozitivul special de magnetizare i vor fi magnetizatetimp de 1 minut. Bilele care nu au fost reinute n matriceaexopolizaharidic n timpul formrii biofilmului, vor fiatrase spre centrul godeului, formnd un inel de culoareroie. Dup magnetizare se va efectua o a doua lectur careva permite detectarea bilelor magnetice depuse pe bazagodeului (Fig. 1). Datele culese dup aceast a doua lecturvor fi transmise, interpretate i stocate de asemenea n

7/23/2019 6 - pentelescu - 330-334

4/5 33

art rtr

Clujul Medical 2012 Vol. 85 - nr. 3

calculator. Din compararea imaginilor obinute dup primai cea de-a doua lectur pentru fiecare godeu se va calculao valoare denumit Indice de Formare a Biofilmului BFI.Astfel un BFI inferior lui 2 indic formarea complet a

biofilmului, un BFI superior lui 7 arat absena biofilmului,iar valorile intermediare se traduc prin biofilme n curs deformare [21].

f. 1 Ilustreaz imaginea afiat de calculator dup a douascanare a baretei. Godeurile 1,3,4,7,8 arat absena completa biofilmului. Inelul rou la baza godeului apare ca urmare aatraciei bilelor magnetice n aceast arie n timpul magnetizrii.n godeurile 2,5,6 lipsa inelului rou exprim prezena unuibiofilm complet format.

MeTode de ceRceTaRe a BiofilMeloRoRale cu TeHnologia BiofilM Ring TesT

Tehnica Biofilm Ring Test poate fi aplicat nmai multe moduri n vederea cercetrii efectului agenilorantiplac asupra biofilmelor orale.

O prim metod o constituie pretratarea suprafeelorgodeurilor o anumit perioad de timp cu produsul careurmeaz s fie testat. Apoi din godeuri se elimin produsultestat i se aplic soluia bacterian. Baretele se vor incuban condiii corespunztoare perioada de timp necesarformrii biofilmelor. n urmtoarea etap, baretele vor filecturate i se vor interpreta rezultatele n funcie de valorile

BFI obinute. n absena formrii biofilmelor, BFI mai maredect 7, produsul poate fi considerat ca un produs eficientn inhibarea adeziunii bacteriilor pe suprafeele pretratate.

O alt modalitate de testare a aciunii produselorasupra biofilmelor const n formarea iniial a biofilmelor

pe suprafaa godeurilor. n acest sens soluia bacterianva fi inoculat n godeuri i acestea vor fi incubate timpulnecesar respectnd condiiile de cretere a bacteriilor.Ulterior soluia bacterian va fi eliminat prin aspirareatent i n godeuri va fi inoculat produsul de testat i lsatsa acioneze asupra biofilmelor o anumit perioad de timp.Baretele vor fi ulterior lecturate cu scannerul special, iarrezultatele vor fi interpretate n funcie de valorile BFI. Prinaceast metodologie de lucru se poate analiza capacitatea

produsului testat de a detaa biofilmele deja formate de lanivelul suprafeelor unde acestea s-au constituit.

Un alt mecanism de aciune care poate fi testat printehnologia Biofilm Ring Testeste acela al unor substanede a interfera cu formarea biofilmelor. n acest sens soluia

bacterian este mixat cu produsul de testat, iar acestea vorfi inoculate concomitent n godeuri i incubate n condiiioptime. Dup lecturarea baretelor cu scanner-ul special,rezultatele sunt corelate cu valorile BFI. Un studiu a fostefectuat n acest sens cu furanona C30 care s-a dovedit a fi

un potenial inhibitor al formrii biofilmelor deStreptococcus. mutans, prin inhibarea semnalelor de tipquorum sensing trimise de aceste bacterii [22].

Tehnologia Biofilm Ring Test este o tehnic rapidde studiu a dezvoltrii biofilmelor, fiind potrivit i pentrustudiul dinamic al formrii biofilmelor, aa cum arat

Nagant et al. [23].

concluziiAvantajele acestei metode sunt simplitatea de

manipulare, rapiditatea i reproductibilitatea foarte mare[21]. Este o tehnic care nu necesit metode laborioase,care nu implic multiple faze de laborator sau tehnicisofisticate i nici o tehnologie foarte extins de laborator.Face posibil efectuarea unui numr mare de teste simultani permite testarea concomitent a mai multor produseasupra biofilmelor n aceleai condiii experimentale.

Bbr1. Donlan M, Costerton WJ. Biofilms: Survival Mechanismsof Clinically Relevant Microorganisms. Clinical MicrobiologyReviews, 2002; 15:1671932. Thomas JC, Lindsay A, Nakaishi BS. Managing the complexityof a dynamic biofilm. JADA, 2006; 137(Suppl 3):10-153. Sokransky S, Haffajee A. Periodontal microbial ecology.Periodontology, 2000 2005; 38:1351874. Marsh PD. Dental Plaque as a Microbial Biofilm. Caries Res,2004; 38:2042115. ten Cate J. Biofilms, a new approach to the microbiology ofdental plaque. Odontology, 2006; 94:1-96. Newman M.G, Takei H, Caranza F. Caranzas ClinicalPeriodontology, Saunders Company, 9thEdition,

7. PetersenPE.WHOglobalpolicy forimprovementof oral healthPetersen PE. WHO global policy for improvement of oral health World Health Assembly 2007. Journ Dent Res 2008;58:115-121

8. Loe H, Theilande E, Jensen B. Experimental gingivitis in man.Journ Period Res ,1967;2: 282-2899. Baehni P, TakeuchiY. Anti-plaque agents in the prevention ofbiofilm-associated oral diseases. Oral Diseases, 2003; 9 (Suppl1): S23S2910. Petersilka G, Ehmke B, Flemmig T. Antimicrobial effects ofmechanical debridement. Periodontology, 2000 2002; 28:56-7111. McCracken G, Janssen J, Heasman L, et al. Assessingadherence with toothbrushing instructions using a data loggertoothbrush. Br Dent J, 2005; 198:29-32;12. Mager DL, Ximenez-Fyvie LA, Haffajee AD, Socransky SS.Distribution of selected bacterial species on intraoral surfaces. JClin of Period, 2003; 30:644654.13. Barnett M. The rationale for the daily use of an antimicrobialmouthrinse. JADA, 2006;137( Suppl 3):16S-21S14. Suzuki N, Yoshida A, Nakano Y. Quantitative Analysis ofMulti-Species Oral Biofilms by TaqMan Real-Time PCR. ClinMed Res, 2005; 3: 17618515. Wilson M. Susuceptibility of oral bacterial biofilms toantimicrobial agents. J. Med Microb, 1996; 44: 79-8716. Lamster I. The Antimicrobial mouthrinses and the managementof periodontal diseases: Introduction to the supplement. JADA,2006; 137(Suppl 3):5S-9S

7/23/2019 6 - pentelescu - 330-334

5/5334

M tr

Clujul Medical 2012 Vol. 85 - nr. 3

17. Gunsolley J. A meta-analysis of six month clinical studiesof anti-plaque and anti-gingivitis agents. JADA, 2006;137:1649-165718. Barnett M. The role of therapeutic antimicrobial mouthrinsesin clinical practice. Control of supragingival plaque and gingivitis.JADA, 2003; 134:699-70419. Pratten J, Wills K, Barnett P, Wilson M. In vitro studies of the

effect of antiseptic-containing mouthwashes on the formation andviability of S sanguis biofilm formation. Journ of Appl Microb,1998; 84:1149-115520. Guggenheim B, Giertsen E, Schupbachl P, Shapiro S.

Validation of an in vtro biofilm modelof supragingival plaque. JDent Res, 2001; 80:363-37021. Chavant P, Gaillard-Martinie B, Talon R, Hbraud M,Bernardi T. A new device for rapid evaluation of biofilm formationpotential by bacteria. J Microbiol Methods, 2007; 68:605-612.22. Wang Y, Wang Q, Hu Y. Effect of furanone C-30 on initialbiofilm formation of Streptococcus mutans. Oral Biomedicine,

2012; 3: 1-423. Nagant C, Tr-Hardy M, Devleeschouwer M, Dehaye JP.Study of the initial phase of biofilm formation using a biofomicapproach. J Microbiol Methods, 2010; 82:243-248