METODE METODE CROMATOGRAFICE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE A DE SEPARARE A AMESTECURILOR AMESTECURILOR

COMPLEXECOMPLEXE

Clasificarea metodelor de Clasificarea metodelor de separareseparare

Metode cromatograficeMetode cromatografice. Cromatografia este o . Cromatografia este o metoda fizico-chimica de separare a componentelor metoda fizico-chimica de separare a componentelor unui amestec si are la baza interactiunea ce se unui amestec si are la baza interactiunea ce se stabileste intre moleculele diferitelor specii din stabileste intre moleculele diferitelor specii din amestec si doua faze din care una fixa si alta amestec si doua faze din care una fixa si alta mobila.mobila.

In functie de tipul de interactiune care are loc intre In functie de tipul de interactiune care are loc intre componentele sistemului :componentele sistemului :

- Cromatografia de adsorbtie Cromatografia de adsorbtie - Cromatografia de repartitieCromatografia de repartitie- Cromatografia de excluziune stericaCromatografia de excluziune sterica- Cromatografia de schimb Cromatografia de schimb - Cromatografia de afinitateCromatografia de afinitate

Metode cromatograficeMetode cromatografice

In functie de modul de realizare In functie de modul de realizare practica:practica:

- Cromatografie pe coloanaCromatografie pe coloana- Cromatografie in strat subtire Cromatografie in strat subtire - Cromatografie pe suport poros.Cromatografie pe suport poros.Pentru toate tipurile de cromatografie, Pentru toate tipurile de cromatografie,

faza mobila este reprezentata de o faza mobila este reprezentata de o solutie a carei compozitie este aleasa solutie a carei compozitie este aleasa potrivit tipului de de cromatografie si a potrivit tipului de de cromatografie si a amestecului ce urmeaza a fi separat.amestecului ce urmeaza a fi separat.

1. CROMATOGRAFIA DE ADSORBTIE1. CROMATOGRAFIA DE ADSORBTIE

Are loc la suprafata ce separa doua faze ale unui Are loc la suprafata ce separa doua faze ale unui sistem heterogen (de exemplu suprafata de sistem heterogen (de exemplu suprafata de separare solid/lichid).separare solid/lichid).

Adsorbtia=fenomenul de retinere pe suprafata Adsorbtia=fenomenul de retinere pe suprafata unui corp numit adsorbant, a substantelor unui corp numit adsorbant, a substantelor gazoase, lichide sau solide dintr-un amestec. gazoase, lichide sau solide dintr-un amestec. Substanta adsorbita se numeste adsorbat.Substanta adsorbita se numeste adsorbat.

Adsorbtia este un fenomen reversibil. Fenomenul Adsorbtia este un fenomen reversibil. Fenomenul invers, adica desprinderea substantei adsorbite, invers, adica desprinderea substantei adsorbite, se numeste desorbtie.se numeste desorbtie.

A nu se confunda cu absorbtia, care este un A nu se confunda cu absorbtia, care este un fenomen de inglobare in masa a unei substante, fenomen de inglobare in masa a unei substante, nu numai la suprafata.nu numai la suprafata.

Cromatografia de adsorbtieCromatografia de adsorbtie Adsorbtia poate fi de natura fizica sau Adsorbtia poate fi de natura fizica sau

chimica.chimica. Adsorbtia fizica=adsorbantul formeaza un Adsorbtia fizica=adsorbantul formeaza un

strat monomolecular la suprafata strat monomolecular la suprafata adsorbantului, moleculele adsorbite fiind adsorbantului, moleculele adsorbite fiind retinute prin interactiuni Van der Waals. Daca retinute prin interactiuni Van der Waals. Daca adsorbantii retin in mod preferential unele adsorbantii retin in mod preferential unele substante, adsorbtia se numeste selectiva.substante, adsorbtia se numeste selectiva.

Elutia=indepartarea substantelor fixate pe Elutia=indepartarea substantelor fixate pe mediul absorbant prin dizolvarea lor intr-un mediul absorbant prin dizolvarea lor intr-un solvent adecvat. In general substantele solvent adecvat. In general substantele tensioactive au proprietatea de a disloca tensioactive au proprietatea de a disloca substantele adsorbite pe suprafete.substantele adsorbite pe suprafete.

Cromatografia de adsorbtieCromatografia de adsorbtie In principiu, cromatografia de adsorbtie se In principiu, cromatografia de adsorbtie se

bazeaza pe capacitatea deferita de adsorbtie bazeaza pe capacitatea deferita de adsorbtie a componentelor dintr-un amestec, a componentelor dintr-un amestec, obtinandu-se in final o succesiune de benzi obtinandu-se in final o succesiune de benzi pe coloana (sau suportul) adsorbantului.pe coloana (sau suportul) adsorbantului.

Adsorbtia componentelor amestecului nu se Adsorbtia componentelor amestecului nu se face simultan, ci este rezultatul succesiunii face simultan, ci este rezultatul succesiunii proceselor de adsorbtie si desorbtie, unele proceselor de adsorbtie si desorbtie, unele mai rapide decat altele.mai rapide decat altele.

In general se utilizeaza coloane de adsorbtie In general se utilizeaza coloane de adsorbtie comerciale.comerciale.

Cromatografia de adsorbtieCromatografia de adsorbtie

Separarea se desfasoara in diferite Separarea se desfasoara in diferite etape.etape.

Cromatografia de adsorbtieCromatografia de adsorbtie Pe coloana se toarna intai solutia de cercetat, Pe coloana se toarna intai solutia de cercetat,

apoi se trece prin coloana o cantitae de apoi se trece prin coloana o cantitae de solvent pur, apoi componentele separate se solvent pur, apoi componentele separate se pun in evidente printr-o metoda de colorare pun in evidente printr-o metoda de colorare si apoi sunt izolati.si apoi sunt izolati.

Alegera absorbantilor: pentru molecule care Alegera absorbantilor: pentru molecule care se adsorb slab, se aleg adsorbanti cu se adsorb slab, se aleg adsorbanti cu suprafata specifica mare, de exemplu suprafata specifica mare, de exemplu carbune activ.carbune activ.

Pentru molecule care se adsorb puternic se Pentru molecule care se adsorb puternic se aleg adsorbanti mai putin activi, de exemplu aleg adsorbanti mai putin activi, de exemplu zaharul sau creata.zaharul sau creata.

In practica farmaceutica cei mai utilizati In practica farmaceutica cei mai utilizati absorbanti sunt oxidul de aluminiu si absorbanti sunt oxidul de aluminiu si silicagelul.silicagelul.

Capacitatea de adsorbtie a unui materialCapacitatea de adsorbtie a unui material

Reprezinta cantitatea de substanta adsorbita de un Reprezinta cantitatea de substanta adsorbita de un gram sau de 1 cmgram sau de 1 cm3 de 3 de adsorbant.adsorbant.

Capacitatea de adsorbtie depinde de:Capacitatea de adsorbtie depinde de: - natura adsorbantului- natura adsorbantului- Natura adsorbatuluiNatura adsorbatului- Concentratia sau presiunea partiala a adsorbantului Concentratia sau presiunea partiala a adsorbantului

in amestec.in amestec.- TemperaturaTemperaturaDaca adsorbtia se face din faza lichida, atunci Daca adsorbtia se face din faza lichida, atunci

capacitatea de adsorbtie creste odata cu diferenta capacitatea de adsorbtie creste odata cu diferenta de polaritate dintre adsorbant si solventul in care de polaritate dintre adsorbant si solventul in care este dizolvat adsorbatul.este dizolvat adsorbatul.

Capacitatea de adsorbtie a unui Capacitatea de adsorbtie a unui materialmaterial

Exemplu: in cazul adsorbantilor solizi nepolari Exemplu: in cazul adsorbantilor solizi nepolari cum sunt carbunele sau talcul, se vor adsorbi cum sunt carbunele sau talcul, se vor adsorbi mai bine moleculele substantelor tensioactive mai bine moleculele substantelor tensioactive aflate in solutii apoase (polare) si mai slab aflate in solutii apoase (polare) si mai slab cele aflate in lichide nepalare (hidrocarburi, cele aflate in lichide nepalare (hidrocarburi, uleiuri). Invers, adsorbantii polari (silicagelul, uleiuri). Invers, adsorbantii polari (silicagelul, argilele) vor adsorbi mai bine substante argilele) vor adsorbi mai bine substante tensioactive din solutii nepolare.tensioactive din solutii nepolare.

Deci vom alege carbunele activ pentru Deci vom alege carbunele activ pentru adsorbtia din medii apoase si argila sau adsorbtia din medii apoase si argila sau silicagelul pentru adsorbtia din medii silicagelul pentru adsorbtia din medii nepolare. nepolare.

Dependenta de temperaturaDependenta de temperatura

Capacitatea de adsorbtie creste odata cu Capacitatea de adsorbtie creste odata cu scaderea temperaturii.scaderea temperaturii.

Variatia capacitatii de adsorbtie la Variatia capacitatii de adsorbtie la temperatura constanta se repreazinta prin temperatura constanta se repreazinta prin izoterma de adsobtie FREUNDLICH:izoterma de adsobtie FREUNDLICH:

concentratie

Capacit. d

e a

ds.

La un moment dat, adsorbantul nu mai poate fixa molecule, se ajunge la saturatie.

[x/m]

Ecuatia izotermei este x/m = K p1/n sau x/m = K c 1/n

Unde x= masa substantei adsorbite pe m grame de adsorbant, c= concentratia solutiei, K si 1/n sunt constante empirice, depind de temperatura si natura substantei adsorbite, p=presiunea de echilibru a adsorbatului.

2. CROMATOGRAFIA DE REPARTITIE2. CROMATOGRAFIA DE REPARTITIE

In cazul a doua faze nemiscibile intre ele si al unei substante In cazul a doua faze nemiscibile intre ele si al unei substante solubile in ambele faze, aceasta se va repartiza intre ele asa solubile in ambele faze, aceasta se va repartiza intre ele asa incat concentratiile se fla intr-un raport care poate fi incat concentratiile se fla intr-un raport care poate fi determinat experimental.determinat experimental.

Daca o faza care contine o substanta dizolvata este pusa in Daca o faza care contine o substanta dizolvata este pusa in contact cu o alta faza care inca nu contine substanta data, contact cu o alta faza care inca nu contine substanta data, atunci substanta va difuza din prima in a doua faza pana la atunci substanta va difuza din prima in a doua faza pana la stabilirea echilibrului.stabilirea echilibrului.

Conform legii lui Nernst, intre concentratia substantei Conform legii lui Nernst, intre concentratia substantei dizolvata in faza 1 si concentratia aceleasi substante dizolvate dizolvata in faza 1 si concentratia aceleasi substante dizolvate in faza 2, cei doi dizolvanti fiind in echilibru si nemiscibili, se in faza 2, cei doi dizolvanti fiind in echilibru si nemiscibili, se stabileste relatia:stabileste relatia:

cc11/c/c22 = = αα =constant.=constant. αα = coeficient de partitie.= coeficient de partitie.

Cromatografia de repartitieCromatografia de repartitie

Cazul in care una din faze este fixa (f) iar cealalta Cazul in care una din faze este fixa (f) iar cealalta mobila (m): daca amestecul este pus in faza mobila (m): daca amestecul este pus in faza mobila, moleculele amestecului vor fi antrenate in mobila, moleculele amestecului vor fi antrenate in miscare cu viteze diferite, depinzand de miscare cu viteze diferite, depinzand de solubilitatea lor in cele doua faze. Astfel, solubilitatea lor in cele doua faze. Astfel, substantele cu solubilitate mai mare in faza substantele cu solubilitate mai mare in faza mobila, se vor deplasa cu viteza mai mare decat mobila, se vor deplasa cu viteza mai mare decat cele care au solubilitate mai mare in faza fixa.cele care au solubilitate mai mare in faza fixa.

Fiecare dintre componentele amestecului va fi Fiecare dintre componentele amestecului va fi caracterizata de marime notata Rcaracterizata de marime notata Rff , numeric egala , numeric egala cu raportul dintre distanta pe care a parcurs-o cu raportul dintre distanta pe care a parcurs-o componenta separata si distanta pe care a componenta separata si distanta pe care a parcurs-o faza mobila in acelasi interval de timp:parcurs-o faza mobila in acelasi interval de timp:

Cromatografia de repartitieCromatografia de repartitie

1

1

ff

m

m

f

Rq

qsau

c

c

Unde qm reprezinta aria sectiunii transversale a fazei mobile iar qf aria fazei fize din sistem.

De obicei daterminarea valorii Rf se face usor prin masurarea directa a distantelor parcurse de substanta separata si de faza mobila in acelasi timp.

Coeficientul RCoeficientul Rf f depinde de:depinde de:

Natura substantelor care trebuie separateNatura substantelor care trebuie separate Structura moleculei, configuratia Structura moleculei, configuratia Prezenta sau absenta unor dipoli electrici Prezenta sau absenta unor dipoli electrici

permanenti sau indusi.permanenti sau indusi. Numarul si distributia legaturilor de Numarul si distributia legaturilor de

hidrogenhidrogen Factori experimentali- tipul suportului solid, Factori experimentali- tipul suportului solid,

tipul fazei apoase, temperatura de lucru, tipul fazei apoase, temperatura de lucru, cantitarea de substanta supusa separarii, cantitarea de substanta supusa separarii, prezenta unor impuritati.prezenta unor impuritati.

Cromatografie pe hartie de Cromatografie pe hartie de filtrufiltru

Separarea cromatografica Separarea cromatografica pe hartie de filtru a pe hartie de filtru a componentelor clorofilei.componentelor clorofilei.

Cromatografia pe hartie de filtruCromatografia pe hartie de filtru Inca din 1944 s-a utilizat cu succes hartia Inca din 1944 s-a utilizat cu succes hartia

de filtru ca suport pentru faza stationara de filtru ca suport pentru faza stationara apoasa. Separarea se face intr-o camera apoasa. Separarea se face intr-o camera umeda (cutie Petri) care contine solutia umeda (cutie Petri) care contine solutia fazei mobile. Aceasta ajunge la faza fixa fazei mobile. Aceasta ajunge la faza fixa printr-un capilar tot din hartie de filtru.printr-un capilar tot din hartie de filtru.

Faza mobila este o solutie NaCl 3%. Hartia Faza mobila este o solutie NaCl 3%. Hartia de filtru se incarca cu amestecul de de filtru se incarca cu amestecul de separat in diferite puncte. Faza mobila va separat in diferite puncte. Faza mobila va patrunde si va inainta prin hartia de filtru patrunde si va inainta prin hartia de filtru contribuind la separarea componentelor. contribuind la separarea componentelor.

Separarea cromatografica a Separarea cromatografica a cernelei negre pe suport de cernelei negre pe suport de acrilamida.acrilamida.

Cromatografia de excluziune strericaCromatografia de excluziune strerica

Faza fixa este reprezentata de un material poros cu pori Faza fixa este reprezentata de un material poros cu pori (canalicule) de diferite diametre.(canalicule) de diferite diametre.

La introducerea amestecului intr-un astfel de mediu, La introducerea amestecului intr-un astfel de mediu, moleculele amesteculei se vor distribui prin agitatie termica in moleculele amesteculei se vor distribui prin agitatie termica in tot volumul pus la dispozitie.tot volumul pus la dispozitie.

Moleculele mari vor vor ocupa doar spatiul corespunzator Moleculele mari vor vor ocupa doar spatiul corespunzator porilor cu diametru mai mare, accesul lor fiind exclus prin porilor cu diametru mai mare, accesul lor fiind exclus prin canalele cu diametru mai mic (excluziune sterica).canalele cu diametru mai mic (excluziune sterica).

Moleculele mici din amestec vor putea strabate atat canalele Moleculele mici din amestec vor putea strabate atat canalele cu dimensiuni mari cat si mai mici.cu dimensiuni mari cat si mai mici.

Conform legii lui Poisseuille (vezi vascozitatea lichidelor) viteza Conform legii lui Poisseuille (vezi vascozitatea lichidelor) viteza de deplasare a acestei solutii va fi mai mare in canalele cu de deplasare a acestei solutii va fi mai mare in canalele cu diametru mai mare.diametru mai mare.

Deci se vor deplasa mai repede moleculele mai mari (care Deci se vor deplasa mai repede moleculele mai mari (care umplu spatiul porilor cu diametru mai mare) si mai incet umplu spatiul porilor cu diametru mai mare) si mai incet moleculele mai mici care pot difuza si prin porii cu diametru moleculele mai mici care pot difuza si prin porii cu diametru mai mic. mai mic.

Cromatografia de excluziune Cromatografia de excluziune strericastrerica

In practica se utilizeaza coloane In practica se utilizeaza coloane cromatografice din SEPHADEX -material cromatografice din SEPHADEX -material polimeric cu structura granulara care are polimeric cu structura granulara care are pori cu un diametru ales asa incat exclude pori cu un diametru ales asa incat exclude accesul in interior al macromoleculelor accesul in interior al macromoleculelor globulare cu masa mai mare decat aprox. globulare cu masa mai mare decat aprox. 20.000 Daltoni.20.000 Daltoni.

Se utilizeza pentru separarea diferitelor Se utilizeza pentru separarea diferitelor forme de hemoglobina (oxihemoglobina, forme de hemoglobina (oxihemoglobina, methemoglobina, deoxihemoglobina). Hb methemoglobina, deoxihemoglobina). Hb are M= 60 000 Da.are M= 60 000 Da.

Cromatografia de excluziune stericaCromatografia de excluziune sterica

Formele hemoglobinei sunt interconvertibile:Formele hemoglobinei sunt interconvertibile: Hb care este un tetramer cu 4 ioni FeHb care este un tetramer cu 4 ioni Fe2+2+, in , in

contact cu oxigenul din atmosfera este contact cu oxigenul din atmosfera este aproape complet saturata cu oxigen, fiind in aproape complet saturata cu oxigen, fiind in forma oxiHb, de culoare rosie.forma oxiHb, de culoare rosie.

In solutii lipsite de oxigen, ea se In solutii lipsite de oxigen, ea se deoxigeneaza si trece in forma deoxiHb, isi deoxigeneaza si trece in forma deoxiHb, isi schimba conformatia si culoarea in violet, schimba conformatia si culoarea in violet, contine tot Fecontine tot Fe2+.2+.

Daca fierul este oxidat la FeDaca fierul este oxidat la Fe3+3+, trece in forma , trece in forma MetHb care este inactiva din p.d.v. MetHb care este inactiva din p.d.v. fiziologic , are culoare bruna.fiziologic , are culoare bruna.

Cromatografie lichidă de înaltă Cromatografie lichidă de înaltă performanţă HPLC performanţă HPLC

High Performance Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography metodă de analiză calitativă utilizată în metodă de analiză calitativă utilizată în

biochimiebiochimie şi şi chimiechimie analiticăanalitică pentru pentru separarea, identificarea şi cuantificarea separarea, identificarea şi cuantificarea compuşilor. compuşilor.

HPLC foloseşte o coloană încărcată cu HPLC foloseşte o coloană încărcată cu diferite materiale (faza staţionară), o pompă diferite materiale (faza staţionară), o pompă ce împinge faza(ele) mobilă(e) prin coloana şi ce împinge faza(ele) mobilă(e) prin coloana şi un detector care arată timpurile de retenţie un detector care arată timpurile de retenţie ale moleculelor. Timpul de retenţie depinde ale moleculelor. Timpul de retenţie depinde de interacţiunea dintre faza staţionară, de interacţiunea dintre faza staţionară, moleculele de analizat şi solvenţii utilizaţi. moleculele de analizat şi solvenţii utilizaţi.

HPLCHPLC

Fotografie a unui aparat HPLC. De la stânga la dreapta: Pompa de gradient, ce asigură fluxul de solvent, coloana cromatografică, aparat de înregistrare a absorbanţei

Proba de analizat este introdusă în volum mic Proba de analizat este introdusă în volum mic în fluxul fazei mobile. Trecerea analitului prin în fluxul fazei mobile. Trecerea analitului prin coloană este încetinită de prezenţa unor coloană este încetinită de prezenţa unor interacţii de natură chimică sau fizică in faza interacţii de natură chimică sau fizică in faza staţionară, acestea trecând de a lungul staţionară, acestea trecând de a lungul coloanei.coloanei.

Totalul încetinirilor depinde de fiecare analit Totalul încetinirilor depinde de fiecare analit în parte, faza staţionară şi compoziţia fazei în parte, faza staţionară şi compoziţia fazei mobile. Timpul la care un analit specific mobile. Timpul la care un analit specific eluează (iese afară din coloană) este numit eluează (iese afară din coloană) este numit timp de retenţietimp de retenţie; timpul de retenţie in condiţii ; timpul de retenţie in condiţii particulare este considerat o caracteristică particulare este considerat o caracteristică unică de identificare a analitului dat. unică de identificare a analitului dat.

Folosirea unei coloane încărcată cu particule Folosirea unei coloane încărcată cu particule mici (care creează o presiune de împingere mici (care creează o presiune de împingere mai mare) creşte mai mare) creşte vitezaviteza lineară, acordând lineară, acordând compuşilor timpul minim să compuşilor timpul minim să difuzezedifuzeze prin prin coloană, conducând astfel la o îmbunătăţire coloană, conducând astfel la o îmbunătăţire a rezoluţiei a rezoluţiei cromatogrameicromatogramei rezultate. rezultate.

SolvenţiiSolvenţii comuni care se utilizează includ comuni care se utilizează includ orice combinaţie miscibilă cu orice combinaţie miscibilă cu apaapa sau sau lichide organice variate (de obicei metanol lichide organice variate (de obicei metanol sau sau acetonitrilacetonitril). Apa poate conţine soluţii ). Apa poate conţine soluţii tampon sau săruri care ajută la separarea tampon sau săruri care ajută la separarea componenţilor de analizat sau componenţi componenţilor de analizat sau componenţi ca ca acid trifloroaceticacid trifloroacetic care acţionează ca care acţionează ca agent de împerechere ionică. agent de împerechere ionică.

O rafinare mai bună a metodei HPLC a dus la O rafinare mai bună a metodei HPLC a dus la posibilitatea de a varia compoziţia fazei mobile posibilitatea de a varia compoziţia fazei mobile în timpul analizei; aceasta este cunoscută sub în timpul analizei; aceasta este cunoscută sub denumirea denumirea de gradient de eluţiede gradient de eluţie. .

Un gradient normal pentru o fază Un gradient normal pentru o fază cromatografică inversă poate se înceapă cu cromatografică inversă poate se înceapă cu 5% metanol şi să crească până la 50% în 25 5% metanol şi să crească până la 50% în 25 minute; gradientul ales depinde de cât de minute; gradientul ales depinde de cât de hidrofob este analitul. Gradientul separă hidrofob este analitul. Gradientul separă amestecul de analiţi în funcţie de afinitatea amestecul de analiţi în funcţie de afinitatea analitului pentru curentul fazei mobile raportat analitului pentru curentul fazei mobile raportat la faza staţionară la faza staţionară

REZUMAT

EXEMPLEEXEMPLE