Capitolul 1 CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR INTE ALE ACIUNII ANTIBIOTICELOR DIN STRUCTURA CELULEI BACTERIENE Cunoaterea structurii interne a celulei bacteriene este rezultatul utilizrii tehnicilor de citochimie i de microscopie electronic. Structura i arhitectura molecular a componentelor celulare a fost demonstrat cu ajutorul tehnicilor de citochimie, care presupun utilizarea unor metode de colorare selectiv, adic a coloranilor cu afinitate pentru o anumit structur celular. Prin arhitectur molecular se nelege modalitatea de aranjare ordonat a subunitilor constitutive ale unei structuri. Structura reper a celulei bacteriene este peretele celular. In raport cu peretele se disting structurile intraparietale (care alctuiesc protoplastul bacterian) i structurile extraparietale (Zarnea, 1983). Structurile intraparietale sunt reprezentate de: spaiul periplasmic, membrana plasmatic, mezosomul, nucleoidul, citoplasma, ribosomii, incluziile, vacuolele, sporul, aparatul fotosintetic, rhapidosomii (rhapidos = baston) incluzii ribonucleoproteice n form de baston, magnetosomii incluzii intracelulare delimitate de membran, cu structur cristalin formate din magnetit (Fe3O4). Magnetosomii confer dipol magnetic permanent celulei, permindu-i s se alinieze pasiv la cmpul geomagnetic. Bacteriile care produc magnetosomi manifest magnetotaxie, adic procesul de orientare i migrare de-a lungul liniilor cmpului magnetic. Structurile extraparietale sunt reprezentate de: glicocalix cu variantele sale structurale (capsula i glicocalixul comportamental), flageli, fimbrii i pili, spini structuri pericelulare groase la baz i ascuite la vrf. Unele structuri (membrana, citoplasma, nucleoidul, ribosomii) sunt eseniale (obligatorii) i se gsesc la toate celulele bacteriene. Altele sunt facultative (spor, aparat fotosintetic, capsul, flageli), fiind prezente numai la anumite grupe de bacterii. 1.1. Peretele celular Peretele celular este o structur rigid de nveli, care delimiteaz celula bacterian. La cele mobile, peretele este strbtut de flageli. Structura parietal lipsete la bacteriile din grupul Mycoplasma, precum i la cele halofile extreme (cele care triesc n medii saline foarte concentrate, unde structura protectoare fa de ocul osmotic nu este necesar). La microscopul optic, peretele celular se evideniaz dup colorare selectiv, cu colorani de mare afinitate fa de componentele sale chimice. La microscopul electronic, peretele se evideniaz fie direct, fie dup utilizarea unor artificii de tehnic, ce constau n inducerea de leziuni mecanice ale structurii parietale cu ajutorul perlelor de sticl sau prin ultrasonicare. Coninutul celular se pierde si peretele rmne ca un sac gol i rigid, care pstreaz forma original a celulei, ceea ce sugereaz rolul esenial al peretelui n determinarea formei bacteriene. Grosimea peretelui este cuprins ntre l5 i 30 nm (uneori pn la 80 nm). n ciuda strii incerte a taxonomiei bacteriene, un criteriu empiric care a avut o valoare practic deosebit pentru clasificarea i identificarea procariotelor este comportamentul la coloraia Gram (C. Gram, 1884) (Beveridge i Davies, 1983). Caracterul Gram pozitiv sau Gram negativ reflect deosebiri structurale majore ale peretelui, cu excepia Archaea, cocilor rezisteni la radiaiile ionizante i a micoplasmelor. Relaia dintre structura peretelui celular i coloraia Gram este urmtoarea: tehnica implic tratamentul succesiv al celulelor cu cristal - violet (un colorant bazic), urmat de tratamentul cu soluie de iod i ulterior, extracia cu un solvent organic polar (alcool sau aceton). n interiorul celulei, cristalul violet i iodul formeaz un complex insolubil. Celulele Gram pozitive, care rezist etapei de decolorare i rein complexul insolubil (cristal violet - iod) sunt colorate n albastru nchis, iar cele care nu rein colorantul sunt Gram negative i pot fi difereniate de cele Gram pozitive prin recolorare cu un colorant de contrast, fiind colorate n rou. Reacia Gram nu se coreleaz direct cu compoziia chimic a peretelui, ci depinde de structura sa fizic, de starea fiziologic a celulei i de integritatea ei structural. Astfel, levurile, care au perete celular gros, dar cu o compoziie chimic diferit de a mureinei, se coloreaz Gram pozitiv. n funcie de particularitile structurale ale peretelui, bacteriile se mpart n 4 categorii: l. Firmacutes (firmus = tare; cutis = nveli) sunt bacteriile Gram pozitive, cu perete celular gros i rigid, la care mureina reprezint pn la 80% din greutatea uscat a acestei structuri i bacteriile acidoalcoolo-rezistente. 2. Gracilicutes (gracilis = subire, fin) sunt bacteriile Gram negative cu perete subire, la care mureina reprezint circa l0% din greutatea uscat a peretelui.

11

3. Mollicutes sau Tenericutes (mollis, tener = moale) cuprinde bacteriile din grupul Mycoplasma, lipsite de perete. Periferia celulei este acoperit de o membran ce conine steroli, cu rol protector fa de liza osmotic. Sunt cele mai mici bacterii cunoscute, cu capacitatea de a crete pe medii inerte. Se dezvolt ca saprobionte n cavitile organismului uman i animal sau sunt patogene pentru om, animale i plante. 4. Mendosicutes (mendosus =o structur cu defecte). Noiunea desemneaz organismele domeniului Archaea, care au perete celular din care lipsete mureina. Marea majoritate a bacteriilor cunoscute aparin grupului Gram pozitive sau Gram negative. Structura molecular a peretelui la bacteriile Gram pozitive La bacteriile Gram pozitive, peretele celular este gros, rezistent i rigid. Componenta esenial este mureina, denumit i peptidoglican, glicopeptid, mucopeptid sau glucozaminopeptid. Mureina formeaz un strat rigid, adiacent membranei plasmatice i sub aspectul compoziiei chimice este unitar la toate eubacteriile (Gram pozitive i Gram negative). Mureina este alctuit dintr-o component peptidic i una glucidic. Componenta glucidic de baz este un dizaharid format din N-acetil-D- glucozamin i acid Nacetilmuramic, legate l-4 (fig. 1). Acidul N-acetilmuramic rezult prin stabilirea unei legaturi dr tip esteric ntre N-acetil-D-glucozamin i acidul lactic. Componenta peptidic este un tetrapeptid, a crui compoziie n aminoacizi este variabil n funcie de specie, dar conine L-ala, acid D-glutamic, acid diaminopimelic (derivat al lizinei) sau lizina i D-ala i se leag de acidul N-acetilmuramic. Acidul N-acetil muramic i Daminoacizii sunt markeri biochimici ai eubacteriilor.

Figura 1. Structura glicanului tetrapeptidic, una dintre unitaile repetitive ale peptidoglicanului structurilor parietale. Aceasta structura chimica se gasete la E. coli, dar bacteriile conin si ali aminoacizi (dupa Brock, 2005).

Rigiditatea peptidoglicanului este conferit de puni peptidice transversale. Cu ct numrul de legturi peptidice este mai mare, cu att crete rigiditatea peretelui celular. La bacteriile Gram negative, punile transversale reunesc gruparea NH2 a acidului diaminopimelic, cu gruparea COOH a D-Ala terminale a altei grupri peptidice. La bacteriile Gram pozitive, legarea transversal a dou peptide nvecinate se face printr-o punte peptidic, care, de exemplu, la Staphylococcus aureus este format din 5 resturi de glicin (fig. 2).

12

Figura 2. Tetrapeptidele conectate la acidul N-acetilmuramic sunt interconectate prin puni formate din cateva resturi de aminoacizi. La S. aureus tetrapeptidele sunt conectate prin puni de pentaglicin (dupa Brock, 1988).

Se formeaz astfel o structur covalent perfect continu n jurul celulei, o molecul mureinic gigant, un adevrat sac mureinic, cu structur tridimensional dinamic (fig. 3) (Ghuysen si Hackenbeck, 1994). La nivelul sacului mureinic sunt localizate enzimele care modeleaz creterea sa: murein-hidrolazele care atac legturile chimice ale mureinei i murein-sintetazele care inser noi uniti de construcie. Peptidoglicanii diferitelor specii difer prin aminoacizii 2 i 3 ai tetrapeptidului i prin frecvena punilor transversale de pentaglicin. Speciile patogene au o frecven superioar a punilor transversale, ceea ce se coreleaz cu o rezisten mai mare a mureinei la aciunea factorilor litici din umorile organismului (lizozimul etc.).

13

Figura 3. Reprezentarea structurii generale a peptidoglicanului (G = N-acetilglucozamina ; M = acid Nacetilmuramic). La resturile de acid N-acetil-muranic sunt conectate tetrapeptidele, iar aceastea sunt reunite prin legaturi peptidice transversale (dupa Brock, 2000).

Importana mureinei, ca o component structural esenial a peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive a reieit din studiul aciunii a doi ageni antibacterieni, lizozimul i penicilina, asupra peretului celular. Lizozimul cliveaz legturile glicozidice l - 4 i hidrolizeaz mureina celulelor aflate n faza staionar (fig. 4), n timp ce penicilina inhib cresterea celulelor bacteriene Gram pozitive aflate n faza de cretere, deoarece inhib treapta final a sintezei mureinei, reacia de transpeptidare, adic formarea legturilor peptidice transversale ntre catenele de glican adiacente.

Figura 4. Imaginea electrono-optic a celulelor de Bacillus subtilis. a. In regiunea central s-a initiat formarea septului de diviziune. b. Un stadiu intermediar al degradarii peretelui sub aciuna lizozimului i retracia protoplastului. c. Protoplastul (original).

La bacteriile Gram pozitive, puntea peptidica transversal reuneste acidul diaminopimelic al unui peptid i D-ala a peptidului adiacent (Ghuysen i Hackenbeck, 1994). Inhibiia reactiei de transpeptidare (de formare a puntilor peptidice transversale) sub aciunea penicilinei duce la formarea unui peptidoglican subire. n celulele care cresc, autolizinele continu s degradeze legaturile chimice ale mureinei, fr a se mai forma alte puni peptidice. Astfel, peretele mureinic se dezagreg progresiv si elibereaza protoplastul, care este o celul neviabil, iar n mediul neprotejat osmotic sufer liz. De aceea, penicilina este activ numai asupra celulelor care cresc. In celulele care nu cresc, autolizinele nu sunt active i peptidoglicanul nu este degradat. Mureina formeaz o matrice n care se gsesc i ali polimeri: polizaharide, acizi teichoici. Acizii teichoici sunt polimeri de l-3-poliglicerol-fosfat sau de poli-ribitol-fosfat, legai fosfo-diesteric.

Poliglicerol fosfat

14

Poliribitol fosfat

Polimerii formeaz axul central al moleculei. Gruprile OH libere ale glicerolului i gruparea OH de la C3 a ribitolului sunt ocupate de D-alanin, D-glucoz sau de N-acetilglucozamin. Bacteriile Gram pozitive au dou categorii de acizi teichoici: acizi lipoteichoici sau membranari, care traverseaz peptidoglicanul i cu o extremitate se leag de glicolipidele din membran, iar cellalt capt este liber la suprafaa celulei i acizi teichoici parietali, ataai de resturile de acid N-acetilmuramic ale mureinei. Acizii teichoici sunt molecule lungi i flexibile, filamentoase, care confer un plus de rigiditate peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive. Pentru bacteriile patogene, acizii teichoici sunt un factor de virulen, deoarece au proprieti chimiotactic negative fa de fagocite. Sunt implicai n transportul ionilor n/i din celul. Pot avea rolul de receptori de fagi. Uneori bacteriile secret cantiti mari de acizi teichoici solubili. Peretele celular la bacteriile Gram negative La bacteriile Gram negative, mureina reprezint numai 2,5 - l0% din greutatea uscat a peretelui. Peretele lor este mai complex, datorit unei structuri caracteristice denumit membrana extern a peretelui celular, o replic structural a membranei plasmatice, care poate fi astfel considerat ca membran intern. La microscopul electronic, peretele celular apare pluristratificat, datorit structurii trilaminare a membranei externe a peretelui (fig. 5).

Figura 5. Pe imaginile electrono-optice, invelisul celulelor bacteriene Gram negative este multilaminar, caracter conferit de cele doua membrane: membrana externa si membrana citoplasmatica. Structura mezosomala are conexiune directa cu membrana citoplasmatica si pare asociat cu nucleoidul, iar structura sa este trilaminara (original).

Membrana extern a peretelui conine fosfolipide (35% din greutate), proteine (l5%) i lipopolizaharide (50%). Analiza filogeniei organismelor procariote pe baza secvenierii proteinelor a dus la concluzia existenei unor diferene filogenetice majore ntre organismele cu nveli dublu membranar (didermice) i cele cu membran simpl (monodermice) (Costerton i colab., 1974). Mureina este localizat n stratul cel mai intern al peretelui (fig. 6). Dup un tratament adecvat, membrana extern se poate ndeprta i se obine sacul mureinic pur, extrem de fin care pstreaz forma original a celulei i care sugereaz c mureina ar putea fi o reea bidimensional (un monostrat molecular), n timp ce la bacteriile Gram pozitive cantitatea de peptidoglican corespunde la 20 de straturi moleculare sau mai mult.

15

Figura 6. Reprezentarea schematica a componentelor peretelui celular la bacteriile Gram negative (dup Brock, 2005).

Proteinele membranei externe se numesc porine, deoarece regleaz permeabilitatea i constituie canalele membranare de transport celular. Iniial s-au descris trei tipuri de porine trimerice: OmpF, OmpC i PhoE. Analiza prin metoda cristalografiei cu raze X relev c porinele sunt proteine transmembranare a cror configuraie secundar este cea de -pliere. O celul de Escherichia (E.) coli produce circa 105 molecule porine, cu rolul de bariere selective de permeabilitate. n mediul hiperosmotic, numrul porinelor scade. La E. coli, porinele sunt proteine trimere, subunitile delimitnd un por cu diametrul de 1 nm. Lipoproteinele leag ferm membrana extern, de peptidoglicanul profund. Lipopolizaharidele (LPS) sunt inclavate n membrana extern. Ele sunt de fapt endotoxinele bacteriilor Gram negative (Salmonella, Shigella, Escherichia). Se numesc endotoxine, deoarece se elibereaz numai dup pierderea integritii celulei. Datorit poziiei lor externe, LPS se pot extrage din celule, cu fenol 45 - 60%. Din punct de vedere chimic, LPS sunt molecule complexe, fiind alctuite dintr-o regiune polizaharidic extern (polizaharidul O), care determin specificitatea antigenic a celulei bacteriene, o regiune oligozaharidic intermediar (regiunea R) i o regiune intern hidrofob, denumit lipidul A, prin care LPS se ancoreaz n membrana extern, printre moleculele fosfolipidice (fig. 7). Regiunile intermediar i intern ale moleculei LPS au compoziie chimic relativ constant la diferite specii de bacterii Gram negative. Polizaharidul regiunii externe are o structur i o compoziie chimic foarte variabile i constituie antigenul somatic O, cu specificitate antigenic foarte nalt, pe baza cruia numeroasele tulpini ale unei specii aparin unui mare numr de serotipuri.

Figura 7. Reprezentarea schematica a structurii moleculei de lipopolizaharid (LPS) original).

Lipidul A este legat covalent de oligozaharidul regiunii intermediare. La Salmonella, lipidul A este alctuit din dizaharide de D-glucozamin, legate l- 6. Perechile de D-glucozamin sunt interconectate l 4, prin puni pirofosfat. Gruprile OH din poziiile 3, 4 i 6 ale fiecrui dizaharid sunt substituite de acizi grai (lauric, palmitic, miristoximiristic, hidroximiristic).Grupul OH din poziia 3 se leag de componenta polizaharidic (acidul 2-ceto, 3-deoxioctanoic) (KDO). Gruprile NH2 ale glucozaminei sunt substituite de acidul D-3-hidroximiristic (fig. 8). Lipidul A are proprieti endotoxice, evideniate la mutantele R (Rough = rugos) care sintetizeaz LPS incomplet, cruia i lipsete polizaharidul O i unele componente ale oligozaharidului regiunii intermediare R.

16

Figura 8. Structura lipidului A al lipopolizaharidului de Salmonella, cu trizaharidul KDO i cu resturile de acizi grai (dupa Rietschel si colab. , 1977).

In mediile naturale, cele mai multe bacterii sintetizeaz polizaharidul O i formeaz colonii S (Smooth = neted). Cele care nu au polizaharidul O formeaz colonii R. Polizaharidul O nu este factorul determinant al patogenitii, deoarece formele coloniale R ale Bordetella (B.) pertusis, Neisseria (N.) gonorrhoeae sunt patogene (Seifert i colab., 1988; Jawetz i colab., 1989). Permeabilitatea membranei externe. Membrana extern, ca i celelalte membrane biologice, este alctuit din stratul lipidic dublu, puin permeabil pentru moleculele hidrofile. Porinele din membrana extern formeaz canale de difuzie nespecific pentru influxul nutrienilor i pentru eliminarea produselor de catabolism. Porinele s-au gsit la toate bacteriile Gram negative i chiar la un grup de bacterii Gram pozitive: Corynebacterium - Nocardia - Mycobacterium, care produc un perete celular bogat n lipide, asemntor dublului strat. Porinele clasice OmpF i OmpC transport preferenial cationi, iar PhoE, transport anioni. Porinele regleaz permeabilitatea membranei externe n funcie de condiiile mediului: n mediile cu osmolaritate mic (cele naturale), porinele sunt mai permeabile, iar la bacteriile patogene, n organismul gazd, porinele au permeabilitate mai mic. Moleculele de LPS formeaz baza structural a integritii membranei externe. LPS este polianionic datorit sarcinilor negative ale lipidului A i leag cationi. Moleculele adiacente polianionice de LPS sunt aparent legate electrostatic, una de alta, prin cationi bivaleni (Ca2+, Mg2+) i formeaz o structur compact ca un acoperi de igl, pe suprafaa membranei externe. Situsurile LPS care leag cationii sunt eseniale pentru integritatea membranei externe, dar n acelai timp ele reprezint clciul lui Ahile al acestei structuri. Antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexeaz avid cu LPS i dezorganizeaz membrana extern, mrind permeabilitatea pentru agenii cu aciune asupra membranei sau componentelor citoplasmatice. Toi agenii policationici se leag de LPS anionice, cu o afinitate variabil. Bacteriile Gram negative sunt rezistente la detergenii anionici i neutri, dar sunt sensibile la detergenii monocationici. Agenii chelatori ai ionilor de Ca2+ i Mg2+ dezorganizeaz i permeabilizeaz membrana extern. Cel puin la enterobacterii, dublul strat fosfolipidic al membranei externe este asimetric, stratul extern coninnd aproape exclusiv LPS, n timp ce stratul intern conine aproape exclusiv fosfolipide. Structura porinelor trimere s-a analizat prin difracie cu electroni i cristalografie cu raze X. Monomerii porinei traverseaz dublul strat i au configuraie -pliat. Aproape invariabil, secvenele porinelor la captul C-terminal au fenil-alanina. Rareori, restul C-terminal este triptofanul. Peretele celular la Archaea

17

La Archaea, peretele celular prezint diferene structurale majore, comparativ cu ale eubacteriilor. Diferitele specii de Archaea se coloreaz Gram pozitiv sau Gram negativ. Peretele lor nu conine acid muramic sau D-aminoacizi, markeri biochimici ai mureinei (Rogers, 1983). Din punct de vedere chimic, peretele la Archaea este heterogen. La Methanobacterium (productoare de metan), peretele conine o pseudomurein alctuit din uniti repetitive formate din dou zaharuri aminate (N-acetilglucozamin i acidul N-acetiltalosaminuronic, markerul biochimic al domeniului Archaea), legate l-3. Resturile acidului N acetiltalosaminuronic sunt legate prin puni peptidice (ca i la murein), iar aminoacizii sunt numai izomeri L. Legturile l-3 ale pseudomureinei sunt rezistente la aciunea lizozimului. Peretele celular acido-alcoolo-rezistent al micobacteriilor Unele genuri ale micobacteriilor (Mycobacterium (M.) tuberculosis, Corynebacterium (C.) diphteriae, Nocardia (N.) asteroides) conin lipide complexe, care nu se gsesc n structura parietal a altor bacterii. Ele se coloreaz slab dup protocolul coloraiei Gram, dar se coloreaz la cald cu fuxin bazic concentrat i sunt rezistente la decolorare succesiv cu acid sulfuric diluat i alcool etilic 96%. Aceste organisme se numesc acido-alcoolo-rezistente (Rogers, 1983). Rezistena la decolorare se datoreaz compoziiei chimice a peretelui celular. Peptidoglicanul micobacteriilor conine acid diaminopimelic ca acid diaminic major, iar acidul muramic este N-glicozilat (i nu N-acetilat). Un alt compus major parietal al micobacteriilor este polizaharidul cu gr. mol. mare arabinogalactanul de care se leag acizi grai cu caten lung acizii micolici cu 70 - 90 atomi de C. La Corynebacterium i Nocardia, acizii grai au caten mai scurt (40 - 60 de atomi de C). O alt categorie de lipide, cele libere, sunt lipooligozaharide ce conin trehaloz i lipoarabinomanani.

Figura 9. Reprezentarea schematic a componentelor peretelui celular acido-rezistent la grupul Mycobacterium Nocardia. Regiunea extern a nveliului conine unitai lungi de acid micolic legat de arabinogalactan (dupa Holt, 1998).

Funciile peretelui celular Peretele celular este o structur cu rol esenial n arhitectura celular, pentru c determin forma celulei i meninerea ei. Dup pierderea coninutului celular, sacul mureinic pstreaz forma iniial a celulei. Mureina confer celulei elasticitate i plasticitate (capacitatea de a suferi deformri la presiune, fr alterarea structurii celulare), permind mrirea volumului ei prin cretere. Peretele celular constituie o barier suplimentar de permeabilitate, alturi de membrana citoplasmatic. La bacteriile Gram pozitive, peretele are o porozitate de 1,1 nm, permind trecerea moleculelor mai mici de l200 Da (1 Dalton = masa atomului de H, adic l,672649 x l0-24g. l kDa = l 000 Da). La bacteriile Gram pozitive, peretele particip la formarea septului de diviziune, ce separ cele dou celule surori i la procesele de cretere. Creterea volumului celular este rezultatul creterii peretelui. Membrana extern are rolul unei site moleculare i permite difuzia moleculelor mici, dar reine pe cele mari (enzime). Membrana extern este o barier selectiv, fiind impermeabil pentru macromolecule, dar permite difuzia limitat a substanelor hidrofobe, deoarece lama extern nu conine glicerofosfolipide. Suprafaa este acoperit cu LPS, care formeaz o structur quasicristalin. Din aceast cauz, lama extern nu

18

prezint o difuzie lateral marcat a moleculelor, tipic membranelor care conin glicerofosfolipide (Wright i Tipper, 1978). Membrana extern conine proteine cu funcii de transport molecular. Ele au rolul de receptori de vitamine, glucide, aminoacizi, de transferine (leag Fe i l transfer n celul). n membrana extern a bacteriilor patogene se gsesc proteine de virulen, din categoria adezinelor, cu rol de fixare a bacteriei la suprafaa celulelor sensibile. LPS are proprieti chimiotactic negative fa de fagocite, mrind nivelul virulenei bacteriene i confer individualitate biochimic i serologic diferitelor tulpini. LPS sunt antigene i induc sinteza anticorpilor specifici cu rol protector (Seifert i colab, 1988). In concluzie, peretele celular este o structur esenial a celulei bacteriene, ndeplinind funcii multiple, cea mai important fiind protecia fa de liza osmotic n mediile hipotonice. Singurele procariote care nu au o structur parietal sunt micoplasmele. Ele se pot izola din organismul uman, de la animale, plante, insecte, fungi, sol, ape menajere. Sunt saprobionte, trind pe materia organic n mediile naturale (ape menajere, sol) sau comensale la om i animale pe mucoasele bucofaringian i genitourinar, incapabile s se dezvolte n mediul extern ca saprobionte. Unele dintre cele comensale sunt potenial patogene. Faptul c supravieuiesc, dei nu au perete celular, se explic prin aceea c au o membran citoplasmatic rigid (care conine steroli) i pentru c triesc n medii protejate osmotic, aa cum este organismul animal i uman. 1.2. Spaiul periplasmic Spaiul periplasmic este un compartiment celular al bacteriilor Gram negative, delimitat de membrana extern a peretelui celular i de membrana intern (citoplasmatic). Este singurul compartiment al celulei procariote i conine un volum apos semnificativ n care se gsesc proteine i oligozaharide. Proteinele sunt reprezentate de enzime degradative (DN-aza, RN-aza, proteaze, fosfataze, penicilinaza etc.) i proteine de legare specifice pentru diferite molecule, cu rol n transport i chimiotaxie (Costerton i colab., 1974; Wright i Tipper, 1978). Oligozaharidele se gsesc n concentraii variabile i au rolul de a regla presiunea osmotic a celulei. Cnd presiunea osmotic a mediului crete, oligozaharidele trec n citoplasm, iar cnd scade, oligozaharidele revin n spaiul periplasmic. Spaiul periplasmic ndeplinete o funcie esenial ce const n acumularea nutrienilor moleculari din mediu, nainte de a ptrunde n celul. Spaiul periplasmic funcioneaz ca un compartiment adaptativ, a crui funcie de depozit este foarte important, deoarece bacteriile Gram negative triesc, de cele mai multe ori, n mediile oligotrofe (mediile aquatice). n spaiul periplasmic, nutrienii sunt scindai parial sub aciunea enzimelor degradative i de aici sunt preluai de proteinele de transport din membrana intern i transferai n celul. Proteinele periplasmice pot fi eliberate prin conversia celulelor la protoplati, dup tratamentul cu cloroform sau prin oc osmotic (tratamentul celulelor cu EDTA n mediu hipertonic i transferul lor n mediu hipotonic). 1.3. Membrana citoplasmatic Membrana plasmatic nconjoar celula bacterian i este bariera separatoare a citoplasmei de mediul extern. Consecina imediat a lezrii membranei este pierderea componentelor citoplasmatice. Grosimea membranei este de 7 - 10 nm. La microscopul electronic are o structur trilaminar, dup modelul unitar al membranelor celulare (unit membrane), al lui Robertson. Pe baza structurii fine s-a considerat (eronat) c membrana plasmatic este alctuit din dou straturi de proteine, ntre care se gsete unul lipidic. In realitate, membrana este un dublu strat fosfolipidic i glicolipidic, la care se asociaz proteinele membranare. Ansamblul molecular al membranei este asemnat cu un ocean fosfolipidic, n care sunt incluse ca nite iceberguri, proteinele externe (periferice) i integrate, dar spre deosebire de membrana celulei eucariote nu conine steroli. Singer i Nicolson au propus modelul mozaicului fluid de organizare a membranelor biologice, n acord cu care membranele sunt structuri bidimensionale de proteine globulare i lipide, cu distribuie orientat, stabilizate de moleculele de ap. Acestea sunt legate prin puni intermoleculare de H, formnd o structur n reea. Dizolvarea unei molecule n ap are semnificaia stabilirii unei continuiti ntre structurile chimice ale moleculei dizolvate i structura de reea a apei. Pentru a se integra n structura de reea a apei, molecula trebuie s formeze o legtur de H cu apa sau s accepte o legtur a acesteia. Proteinele sunt componentele care confer membranelor multe dintre proprietile funcionale specifice (de exemplu, meninerea i utilizarea gradientului transmembranar de H + pentru sinteza ATP). n raport cu dispunerea lor n structura membranei, proteinele sunt periferice i integrate. Proteinele periferice

19

sunt asociate cu membrana, dar nu au nici o secven inclus n structura ei. Structura lor este analog proteinelor hidrosolubile. Proteinele membranare integrate au cel puin un domeniu al moleculei situat n regiunea hidrofob a stratului lipidic. Secvena de aminoacizi a domeniului inclus n stratul lipidic este hidrofob, are configuraia -helix i cuprinde l9 - 23 aminoacizi. Ele pot fi dislocate din structura membranei numai n prezena detergenilor ce solubilizeaz lipidele. Proteinele integrate difuzeaz liber n planul lateral al matricei lipidice, dar nu trec liber dintr-un strat n altul i de aceea asimetria funcional a membranei se pstreaz pentru perioade lungi. n categoria proteinelor integrate sunt incluse proteinele transmembranare care au o mare parte a masei lor inclus n dublul strat fosfolipidic, dar expun domenii semnificativ diferite pe ambele fee ale membranei, ceea ce confer asimetria funcional a acesteia i proteinele membranare ancorate care au cel putin un domeniu ce penetreaz dublul strat lipidic, dar nu traverseaz complet membrana. Proteinele membranare anocorate sunt legate covalent de lipidele membranare. Domeniile extralipidice ale proteinelor membranare integrate sunt hidrofile, ceea ce confer asimetria structural i funcional a membranei. Aa se explic permeabilitatea superioar a feei interne n raport cu faa extern.

Figura 10. Modelul mozaicului fluid al structurii membranei. Fosfolipidele formeaz un strat dublu, cu componentele hidrofobe orientate spre interior, iar capetele hidrofile constituie suprafaa intern i externa a membranei. In marea lipidic proteinele plutesc ca niste iceberg-uri. Unele se extind n toata grosimea dublului strat lipidic, iar altele sunt ancorate pe faa intern sau extern. Membrana micoplasmelor i eucariotelor conine colesterol.

20

Figura 11. Reprezentarea schematic a moleculei fosfolipidice, componenta structural a membranei. Fosfolipidele sunt molecule polare. Cozile de acizi grai sunt foarte hidrofobe (nu formeaz legturi cu apa) i constituie o barier de permeabilitate fa de moleculele hidrosolubile. Capul moleculei este format din gruparea fosfat, legat de o grupare care conine N i din glicerol si este foarte hidrofil (formeaz legturi cu moleculele de ap) (dupa Lehninger, 1987).

Asimetria structural a proteinelor integrate se evideniaz pe imagini eletrono-optice ale membranei criofracturate. Tehnica criofracturrii presupune nghearea rapid a membranei la temperatura azotului lichid i fracturarea membranei cu un cuit special. Membrana se cliveaz de-a lungul regiunii hidrofobe a acizilor grai i rezult dou jumti, cu un grad accentuat de asimetrie, conferit de proteinele transmembranare (Rogers, 1983). Structura membranei plasmatice este stabilizat prin legturi de H i interaciuni moleculare hidrofobe. Ionii de Mg i Ca realizeaz legturi ionice cu sarcinile negative ale fosfolipidelor i stabilizeaz structura membranei. Lipidele conin acizi grai, predominant cu l4 - l6 atomi de C, saturai sau nesaturai. n raport cu capacitatea lor de a interaciona cu structura apei, lipidele membranelor biologice conin dou categorii de structuri chimice (sunt amfipatice): glicerolul intr n structura de reea a apei, fiind hidrofil, iar restul moleculei (acizii grai) formeaz componenta hidrofob a moleculei. ntr-o soluie apoas, lipidele se agreg i formeaz spontan structuri n dublu strat: acizii grai la interior, n mediul hidrofob, iar moleculele de glicerol rmn expuse n mediul apos. Funciile membranei, dar n special ale lipidelor membranare, s-au studiat folosind ca model, veziculele membranare artificiale sau naturale, ce se formeaz spontan dup spargerea celulelor. S-a demonstrat astfel c procariotele i regleaz fluiditatea membranei, prin modificarea proporiei acizilor grai saturai/nesaturai. Cultivarea la temperaturi sczute mrete proporia acizilor grai nesaturai i sporete gradul de fluiditate a membranei. Prin rcire, faza de cristal lichid a lipidelor membranare trece spre o stare solid de gel, situaie n care grosimea dublului strat crete datorit extensiei catenelor de C ale lipidelor. Dublul strat lipidic este o structur ordonat. Catenele de carbon ale acizilor grai sunt constrnse la o aezare paralel i datorit caracterului hidrofob, nu se deplaseaz uor n afara membranei. Moleculele fosfolipidice sunt foarte mobile i se deplaseaz n plan lateral (bidimensional), n acelai strat, cu o frecven foarte mare, dar micrile flip-flop, dintr-un strat n cellalt (tridimensionale) sunt foarte rare (una la cteva ore). Stratul lipidic este suportul proteinelor i are rolul unei bariere de permeabilitate. Permeabilitatea

21

difereniat a celor dou fee ale membranei se explic att prin asimetria proteinelor, ct i prin compoziia chimic diferit a lipidelor n cele dou straturi ale membranei. Cu excepia micoplasmelor i a Archaea (bacteriile metanotrofe), membrana procariotelor se deosebete de cea a eucariotelor prin absena sterolilor. Sterolii sunt molecule plane, rigide, iar acizii grai sunt flexibili. Sterolii confer un grad superior de rigiditate membranei plasmatice. Rigiditatea membranei este necesar celulelor lipsite de perete. La eucariote, rigiditatea ar fi necesar pentru a suporta forele fizice care se exercit asupra membranei. Antibioticele polienice (nistatinul, candicidina) reacioneaz cu sterolii i destabilizeaz membrana. De aceea, ele sunt active fa de celulele eucariote i nu influeneaz celulele procariote. Micoplasmele ncorporeaz sterolul n structura membranei, disponibil n mediul de cretere i sunt sensibile la antibioticele polienice. La unele bacterii, n structura membranei se gsesc molecule asemntoare structural cu colesterolul i pot avea acelai rol de cretere a rigiditii: hopanoidele. Un compus larg distribuit este diploptenul, cu 30 de atomi de C. Mecanismele fiziologice ale permeabilitii membranei Creterea i multiplicarea microorganismelor sunt condiionate de disponibilitatea nutrienilor care trebuie s strbat nveliurile celulare i de eliminarea produselor de catabolism. Caracterul hidrofob al membranei i confer acesteia proprietatea de barier de permeabilitate: trec prin difuzie liber unele molecule hidrofobe mici, molecule lineare i cele solubile n mediul lipidic al membranei (antibioticele cu molecula polar). Apa difuzeaz liber printre fosfolipidele membranei pentru c molecula este mic i lipsit de sarcin. Membrana exclude moleculele mai mari dect glicerolul, dac nu sunt transportate de sisteme membranare sau dac nu se dizolv n lipide. n acelai timp, barierele celulare asigur transportul substanelor nutritive i rein n interiorul celulei substanele necesare, funcionnd ca adevrate pori moleculare, ce controleaz intrarea i ieirea diferitelor molecule. Datorit structurilor de suprafa, celula bacterian nu este niciodat n stare de echilibru cu mediul nconjurtor, n privina concentraiei diferitelor molecule de o parte i de alta a membranei citoplasmatice (Madigan i Martinko, 2005). n funcie de mecanismele fizico-chimice care stau la baza lor, transportul moleculelor (electrolii i neelectrolii) prin membran se face prin dou categorii de procese fiziologice: difuzia pasiv i mecanismele de transfer cu molecul purttor. Difuzia pasiv Difuzia pasiv este cea mai simpl modalitate de ptrundere a moleculelor n celul i se definete prin trecerea liber a substanelor prin membrana plasmatic n ambele sensuri. Procesul difuziei pasive are urmtoarele particulariti: trecerea moleculelor se face fr consum de energie; fora motrice a trecerii este gradientul de concentraie, ceea ce nseamn c transportul substanelor se face din zona cu concentraie mai mare, spre zona cu concentraie mai mic a moleculelor; transferul dureaz pn n momentul n care moleculele substanei care se transfer ajung la aceeai concentraie pe ambele fee ale membranei plasmatice; dac de o parte a membranei se gsesc mai multe tipuri de substane, difuzia pasiv se face individual pentru fiecare tip de molecul n parte, pn la echilibrul osmotic al fiecrei categorii; difuzia pasiv se realizeaz lent i nespecific. Factorul determinant al difuziei pasive este dimensiunea moleculei. Prin difuzia pasiv trec moleculele de ap, O2, CO2 (molecule mai mici de 0,8 nm), precum i moleculele liposolubile (care se dizolv n lipidele membranei celulare, ca de exemplu, tetraciclina). Membrana este permeabil pentru ap i pentru moleculele organice fr sarcin, pn la dimensiunile glicerolului. Fluxul molecular n oricare direcie este proporional cu concentraia moleculei pe faa de intrare, astfel nct rata net de transfer este proporional cu diferena de concentraie ntre cele dou compartimente, dar depinde i de ali factori: sarcina moleculei transportate, gradul ei de potrivire conformaional cu discontinuitile membranare ce formeaz calea de transport. Moleculele mai mari dect glicerolul necesit sisteme specifice de transport. Sisteme de transport cu molecule purttor Moleculele purttor sunt proteine integrate ale membranei plasmatice, care au proprietatea de a lega substanele dizolvate de o parte a membranei i de a le transporta pe cealalt parte, unde le elibereaz. Denumirea lor generic este aceea de sisteme de transport, transportori, purttori sau permeaze. Sunt cel puin trei clase de sisteme de transport membranar : - sisteme formate dintr-o component ce traverseaz membrana;

22

- sisteme formate dintr-o component ce traverseaz membrana i o protein periplasmic de legare; - sisteme formate din proteine multiple ce coopereaz pentru a media transportul. Sistemele de transport cu molecule purttor ndeplinesc mai multe funcii: permit intrarea nutrienilor n celul; regleaz concentraia metaboliilor, cataliznd excreia produselor finale ale cilor metabolice; mediaz eliminarea activ a antibioticelor i a substanelor toxice, favoriznd supravieuirea celulei; regleaz echilibrul ionic, ce trebuie meninut la concentraii ce difer mult de concentraia din mediul extern; particip la secreia proteinelor, polizaharidelor i lipidelor; permit transferul acizilor nucleici prin membran, uurnd schimburile genetice ntre celule; elimin molecule (antibiotice, toxine) care permit celulei s desfoare competiia biologic, conferindu-i un avantaj selectiv pentru supravieuire. Se cunosc trei modaliti de transport prin intermediul moleculelor purttor: difuzia facilitat, translocaia de grup i transportul activ. Sistemele de transfer cu molecule purttor prezint urmtoarele caracteristici: prin intermediul lor se realizeaz o trecere mai rapid a moleculelor de pe o fa pe cealalt a membranei plasmatice; asigur trecerea simultan a mai multor tipuri de molecule, fr s existe fenomene de interferen; transfer n celule diferite molecule, chiar contra gradientului de concentraie i prin aceasta permit acumularea moleculelor n celul la concentraii ce pot depi de l00-l0000 de ori concentraia lor n mediu (cu semnificaie deosebit pentru bacteriile care triesc n apele oligotrofe, srace n substane nutritive). Difuzia facilitat Difuzia facilitat se aseamn ca mecanism, cu difuzia pasiv, deoarece fora de propulsie a transportului este diferena de concentraie a substanei dizolvate, pe cele dou fee ale membranei plasmatice. Procesul nu este cuplat cu consumul de energie metabolic i nu genereaz procese concentrative. Transferul moleculelor se face n sensul gradientului de concentraie, din zona cu concentraie mai mare, spre zona cu concentraie mai mic. In final, concentraia substanei n celul este egal cu concentraia sa n mediu. Nu se produce acumularea (concentrarea) moleculelor pentru c nu se consum energie. Deosebirea fa de difuzia pasiv const n aceea c intervin molecule membranare care uureaz difuzia moleculelor transportate. Moleculele membranare sunt proteine integrate, cu domenii extramembranare, att citoplasmatice ct i la suprafaa extern. Exist dou modaliti de transport facilitat: de tip canal (sau por) i de tip purttor (carrier). In difuzia facilitat de tip canal, substana dizolvat trece de pe o latur pe cealalt a membranei, printr-un canal sau por. Canalele sau porii sunt proteine oligomerice (n special trimere) de membran care au rolul de a transfera diferite molecule (fig. 12). Pereii canalului sunt delimitai de secvene hidrofile, hidrofobe sau amfipatice de aminoacizi, n funcie de proprietile substratului care difuzeaz i favorizeaz trecerea moleculelor, spre deosebire de interiorul hidrofob al stratului lipidic.

Figura 12. Ilustrarea schematica a mecanismului difuziei facilitate de tip canal. Moleculele membranare din categoria porinelor, sunt proteine integrate formate din cateva subunitati. Prin modificari conformationale, porinele realizeaza transportul moleculelor din mediul extracelular, in mediul citoplasmatic, dar numai in sensul gradientului de concentratie (de la concentratie mare, la concentratie mica). Procesul nu necesita consum de energie (dupa Black, 1996).

Moleculele purttor pot fi proteine monomerice sau dimerice, au specificitate stereospecific de substrat i rata de transport este de cteva ori mai mic dect a difuziei de tip canal. Se presupune c molecula purttoare trece prin membran mpreun cu substratul i isi schimb conformaia spaial, ceea ce i permite

23

s se prezinte cu suprafaa activ, alternativ, spre faa extern sau spre faa intern a membranei. Fiecare tip de protein purttor are unul sau mai multe situsuri de legare pentru molecula specific. Mecanismul de transport al difuziei facilitate funcioneaz n celulele adaptate la concentraii mari de glucide n mediu (de exemplu, levuri, eritrocite). La bacterii, care trebuie sa preia substanele nutritive din soluii diluate, nu s-au evideniat astfel de sisteme de transport. Translocaia de grup Particularitatea fundamental a acestei modaliti de transport const n faptul c, pentru a fi transportat prin membrana plasmatic, molecula este modificat chimic. Orice proces de transport n timpul cruia substratul este modificat chimic, se numete translocaie de grup. Moleculele din mediu nu vor aprea n celul n aceeai form chimic, ci sub forma unui produs modificat (Alberts, 1994). Astfel sunt transportate glucidele (glucoza, fructoza, manoza, lactoza, N-acetilglucozamina), bazele purinice i pirimidinice, acizii grai etc. Moleculele sunt fosforilate prin sistemul fosfotransferazei, cu un rest de acid fosforic. Sistemul enzimatic al fosfotransferazei este alctuit dintr-o reea de proteine citoplasmatice i membranare, care se fosforileaz n cascad. Prima protein a reelei (HPr) are localizare citoplasmatic i se fosforileaz din fosfoenol-piruvat, rezultnd HPr-P, cu eliberarea piruvatului. La nivelul membranei, ultima component a catenei de transport, o protein integrat, fosforileaz glucoza prin transferul gruprii fosfat. Glucoza este transferat n celul sub forma esterului glucozo-6-P. La E. coli, sistemul fosfotransferazei este alctuit din 24 de proteine, iar la transportul unui monozaharid particip cel puin 4 componente. Proteinele membranare care se fosforileaz n cascad au rolul de permeaze i formeaz unul dintre sistemele de transport prin membrana citoplasmatic. Permeazele sunt proteine de transport foarte eficiente. Ele mresc viteza de transport de cteva ori n raport cu difuzia facilitat i sunt factorii determinani ai ratei excepionale a metabolismului bacterian. Mutantele bacteriene identificate ca fiind lipsite de permeaze, devin dependente de ptrunderea nutrienilor prin difuzie i necesit o concentraie extern a moleculelor nutritive de l000 de ori mai mare n raport cu tulpina parental. Din categoria permeazelor fac parte: - sistemele de transport pentru glucide, cu specificitate moderat, deoarece pot fi destinate transportului unei anumite molecule de zahr sau unui grup de molecule glucidice. S-au identificat sisteme de transport pentru monozaharide, pentru dizaharide i chiar pentru oligozaharide (de exemplu, sistemul de transport al maltozei poate transporta maltodextrine); - sistemele de transport pentru aminoacizi au afinitate mai nalt pentru substratul specific (comparativ cu cele ce transport glucide), fapt care se coreleaz cu concentraia diferit a celor dou categorii de molecule n mediu i cu rata lor diferit de metabolizare; - sistemele de transport pentru oligopeptide au o specificitate mai mic de legare. La E. coli s-au identificat trei sisteme de transport ale oligopeptidelor: unul care leag nespecific orice dipeptid, unul pentru tripeptide i altul care leag orice peptid mai mic de 6 resturi. Relativa lips de specificitate a permeazelor face posibil ptrunderea unor molecule pentru care membrana nu este permeabil, prin cuplarea lor cu peptidele. Astfel ptrund agenii chimici antibacterieni, care se leag de peptide prin legturi labile i se elibereaz intracelular, dup hidroliza peptidelor. Transportul membranar prin translocaie de grup se realizeaz cu consum de energie. Este o modalitate de a economisi energia, deoarece cea cheltuit prin fosforilare este folosit att pentru realizarea transportului, ct i pentru prima treapt a metabolizrii glucidului. Translocaia de grup realizeaz acumularea moleculei transportate n celul, la o concentraie net superioar celei din mediu. Transportul activ Transportul activ este modalitatea de transfer intracelular al nutrienilor contra gradientului de concentraie, prin care substanele pot fi concentrate de l000 de ori n interiorul celulei, fa de mediul extern. Procesul este totdeauna energizat de o surs primar de energie i se evideniaz prin incubarea celulelor n prezena unui compus marcat radioactiv. Sursa de energie a transportului activ are trei origini: transportorii cuplai leag transportul contra gradientului de concentraie al unei molecule cu transportul n sensul gradientului al alteia; pompele dependente de ATP cupleaz transportul contra gradientului de concentratie cu hidroliza ATP; pompele dependente de lumin cupleaz transportul cu aportul de energie luminoas (de exemplu, bacteriorodopsina de halofilelor).

24

Figura 13. Ilustrarea schematica a mecanismului transportului activ. Ca si in cazul difuziei facilitate, moleculele transportoare sunt proteine membranare integrate, dar spre deosebire de difuzia facilitata, procesul de transport activ are loc contra gradientului de concentratie si de cele mai multe ori, consuma energie stocata in ATP (dupa Black, 1996).

Pentru a fi atribuit transportului activ, substana trebuie s se acumuleze n aceeai form chimic (i nu sub forma unui derivat al su). Pentru aminoacizi, dovada transportului activ se obine mai uor, deoarece ntre momentul ptrunderii lor n celul pn la ncorporarea lor n proteine exist un interval de timp suficient pentru evidenierea lor, ns zaharurile sunt metabolizate rapid i de aceea este necesar blocajul metabolic (prin utilizarea mutantelor bacteriene care si-au pierdut capacitatea de a le metaboliza sau prin utilizarea unui analog nemetabolizabil). Transportul activ se realizeaz prin intermediul proteinelor membranare de transport (fig. 13). Existena proteinelor membranare de transport a fost dedus din creterea peak-ului electroforetic al proteinelor marcate n prezena moleculei transportate i din dispariia lor n celulele mutante pentru sistemul respectiv de transport. Prima protein purttor, identificat printre proteinele membranare solubilizate este proteina sistemului lac la E. coli. Este o protein inductibil, iar n celulele bacteriene crescute pe mediu cu lactoz, ea reprezint 4% din totalul proteinelor membranare. Proteinele de transport sunt proteine transmembranare (integrate) i au domenii expuse att spre citoplasm ct i spre mediul extern. Structural, moleculele transportoare formeaz circa 12 helice care se pliaz pentru a forma un canal transportor. Transportul implic o schimbare conformaional a proteinei, dup legarea substratului specific. Uneori transportul activ este foarte specific, adic pentru fiecare tip de molecul transportat exist o anumit molecul purttor, care o preia de pe o fa a membranei i o transfer pe cealalt. Acestea sunt sisteme uniport. Alte sisteme transport simultan, n acelai sens o substan, mpreun cu o alta necesar pentru transport (sisteme simport). O alt categorie realizeaz concomitent transportul a dou tipuri de molecule, n direcii opuse (sisteme antiport) (Alberts, 1994). Transportul activ al multor glucide i aminoacizi n celula bacterian este dependent de gradientul electrochimic de H + prin membrana plasmatic. Substana care este transportat se leag specific cu o protein membranar purttor, dup care molecula transportat este eliberat nemodificat chimic, n interiorul celulei. Specificitatea proteinelor membranare de transport s-a demonstrat prin experimente de mutagenez care au artat c o singur mutaie genic anuleaz capacitatea bacteriei de a transporta glucide specifice prin membran. Substanele transportate activ sunt unele glucide, aminoacizii, acizii organici, ionii anorganici (K+, Mg2+, SO42- , PO43-). Glucoza este luat prin procese active la unele bacterii, iar la altele, prin sistemul fosfotransferazei. Transportul activ necesit consum de energie, deoarece transportorii funcioneaz pe principiul pompelor concentrative. La bacterii, energia necesar activrii pompelor este rezultatul separrii ionilor de H +, de electroni, n grosimea membranei, ceea ce constituie fora proton-motrice. Se creeaz un gradient de concentraie a protonilor ntre exteriorul i interiorul celulei. Protonii sunt expulzati de pompe specifice dependente de ATP si se concentreaz la exteriorul celulei, iar n interior se concentreaz OH -. Potenialul electrochimic are rol esenial pentru transportul activ.

25

La bacteriile Gram negative, transportul moleculelor n celul este rezultatul aciunii a dou mecanisme, ambele consumatoare de energie. Moleculele sunt transportate n spaiul periplasmic prin intermediul porinelor. n spaiul periplasmic, molecula transportat se leag specific cu o protein periplasmic, care faciliteaz transportul n citoplasm, pe calea unei proteine purttoare specifice din membrana celulei, energia necesar transportului fiind furnizat prin hidroliza ATP. Aceast clas de transportori s-a denumit sisteme ABC (ATP- Binding Cassette). Un alt mecanism de transport este reprezentat de sistemul fosfotransferazei. Adeseori, celulele bacteriene posed dou tipuri de sisteme de transport: sisteme constitutive, relativ nespecifice, n condiiile unei relative abundente a nutrienilor i sisteme inductibile, cu specificitate nalt, active n condiii de stress, provocat de deficitul substanelor nutritive sau indus de substane toxice. Sisteme celulare de transport ionic Pentru o molecul fr sarcin, gradientul de concentraie determin transportul pasiv i sensul lui. Dublul strat lipidic este foarte impermeabil pentru moleculele ncrcate electric, mici sau mari. Sarcina i gradul de hidratare le mpiedic s ptrund n dublul strat lipidic. Transportul lor este influenat att de gradientul de concentraie, ct i de diferena de potenial electric a membranei, adic de potenialul membranar. Gradientul de concentraie i gradientul electric, adic gradientul electrochimic, determin fora net de transport pentru fiecare tip de molecul. Diferena de potenial a membranei (negativ pe faa intern) favorizeaz intrarea cationilor, dar se opune accesului anionilor. Membrana citoplasmatic are rol de barier osmotic, prin permeabilitatea foarte selectiv, permind trecerea (ieirea) unor anioni, dar reine cationii eseniali care au acces n i din celul, numai pe calea unor unor sisteme specifice de transport. Ionii de K+, Mg2+, SO42-, PO43- sunt transferai activ n celul, prin intermediul unor molecule purttoare cu specificitate nalt, denumite pompe ionice. Sistemele de transport pentru ionii cu importan nutritriv sunt sisteme de influx, iar cele pentru transportul ionilor toxici sunt sisteme de eflux i reprezint substratul molecular al mecanismelor de rezisten. Aceste pompe au o importan excepional pentru sistemele biologice, deoarece realizeaz i menin pH, gradientele ionice i potenialul de membran. Sistemele de transport pentru Na+, Ca2+, H+ i Cl- sunt sisteme de eflux i au rolul de a menine concentraii intracelulare sczute i de a realiza gradiente ionice transmembranare. Sistemele de eflux pentru cationi consum energie furnizat prin hidroliza ATP. Unii ioni (Cu2+, Zn2+) au rolul de micronutrieni, fiind utili la concentraii mici i sunt concentrai prin sistemele de influx, dar sunt toxici la concentraii mari, fiind eliminai prin sistemele de eflux. Pentru aceti cationi, sistemele de influx i de eflux sunt separate. Sistemele de eflux pentru cationii toxici sunt fie consumatoare de ATP ori sunt cuplate cu un sistem antiport de nglobare a altui cation (H+, Na+, Ca2+). 1.4. Nucleoidul bacterian Spre deosebire de celulele eucariote care au un nucleu cu structur bine definit, delimitat de o membran i coninnd un numr definit de cromosomi, nucleul bacterian reprezint o form primitiv de organizare, lipsit de membran, inclavat direct n citoplasm. Particularitatea structurii nucleare lipsa membranei delimitante este fundamental pentru organizarea celular de tip procariot, cruia i aparin bacteriile. Datorit caracterelor structurale particulare, nucleul bacterian a primit diferite denumiri: nucleoid, material nuclear, nucleoplasm, echivalent nuclear sau chiar nucleu, prin analogie cu nucleul celulei eucariote, lineom sau genofor. Aparatul genetic bacterian este reprezentat de dou tipuri de structuri: nucleoidul, care din punct de vedere structural i funcional corespunde cromosomului, iar cea de a doua categorie de structuri o reprezint plasmidele. Corespunztor celor dou tipuri de structuri, determinanii genetici sunt de dou categorii: gene eseniale (eucromosomale), localizate n structura cromosomului i genele accesorii, cu localizare plasmidial sau n structura elementelor genetice transpozabile i a unor fagi. Cromosomul bacterian, ca structur genetic esenial poart informaia genetic ce asigur desfurarea funciilor eseniale pentru existena celulei, adic setul de determinani minim necesari pentru a codifica arhitectura celulei i pentru a asigura metabolismul energetic i de biosintez, creterea, diviziunea i reglarea diferitelor activiti celulare. Structurile genetice extracromosomale (plasmidele) poart informaia genetic accesorie, de confort, care permite celulei o mai bun adaptare la condiii de mediu noi sau modificate. Genomul E. coli K12 este alctuit din circa 4400 de gene. Pentru creterea n laborator ar fi

26

necesare numai cteva sute. Genomul este rezultatul aciunii forelor selective pentru eficien metabolic i adaptabilitate. Fiind foarte bogat n ARN, citoplasma celulei bacteriene este intens bazofil, fapt ce nu a permis diferenierea materialului nuclear, la fel de bazofil, dup colorarea cu colorani bazici de anilin. De aceea, s-a considerat c nucleul bacterian lipsete sau dimpotriv, c bacteriile ar avea un nucleu imens care ocup ntreaga celul. Datorit bazofiliei citoplasmei, evidenierea materialului nuclear la microscopul optic este posibil dup utilizarea tehnicilor de colorare selectiv, ce constau n ndeprtarea ARN prin hidroliz acid (tehnica Robinow i Feulgen) sau enzimatic (cu ribonucleaz) i utilizarea coloranilor de anilin. Dup hidroliza ARN, materialul nuclear apare sub diferite forme: sferic, ovalar, de halter, de bastona, reprezentnd 5 - l6% din volumul celulei. Dup tratamentul celulelor cu DN-az, zona corespunztoare materialului nuclear apare golit de coninut. Pe micrografiile electrono-optice, materialul nuclear este localizat, n mod obinuit, n partea central a celulei i se distinge de citoplasma nconjurtoare, prin densitatea sa mai mic la fluxul de electroni, n contrast cu celula eucariot, la care nucleul este mai electronodens, comparativ cu citoplasma (fig. 14).

Figura 14. Imaginea electrono-optica a nucleoidului bacterian la Bacillus subtilis, x 100 000 (original).

Celula procariot are un contrast invers al structurilor sale, n raport cu celula eucariot, care se datoreaz att faptului c molecula de ADN nu este asociat cu proteine, ct i densitii foarte mari a citoplasmei bacteriene. Pe seciuni ultrafine, zona materialului nuclear este ocupat de fibrile fine, cu diametrul de 2,5 nm, uneori aranjate n iruri ondulate, paralele, asemntoare cu o jurubi de a i sunt sensibile la hidroliza cu DN-az. Organizarea fizic a cromosomului Materialul nuclear poate fi izolat din celul sub forma unui corpuscul dens i compact. Dup tratatamentul cu RN-az, din corpusculul dens se elibereaz cromosomul circular, format dintr-o singur molecul de ADN, circular, nchis covalent, cu o lungime de l400 m i diametrul de 2,5 nm, corespunztor diametrului moleculei de ADN dublu catenar. Circularitatea este o condiie a existenei sale. Sub aceast form, molecula de ADN este rezistent la aciunea exonucleazelor citoplasmatice, active asupra moleculelor lineare de ADN. Cromosomul bacterian este cea mai mare molecul biologic. Prin lungimea sa (l400 um), molecula de ADN cromosomal depete de circa l000 de ori lungimea celulei bacteriene.Corpusculul dens corespunde strii mpachetate a cromosomului. Dup tratamentul moderat cu RN-az i proteaze, din structura compact se izoleaz ADN (60%), ARNm , ARNt (30%) i ARN-polimeraza (l0%). Raportat la dimensiunile mici ale unei bacterii, molecula de ADN este supus constrngerilor topologice de supraspiralizare (suprarsucire), prin care este mpachetat pentru a forma un corp compact de l500 de ori mai mic. Pentru a ocupa un volum att de mic, molecula de ADN se mpacheteaz dup norme foarte riguroase, astfel nct, n orice moment, din cele 3000-5000 de gene pe care le conine, oricare s fie accesibil sistemelor celulare de transcriere i traducere. Moleculele de ARN au un rol esenial n meninerea strii compacte a ADN. S-au propus mai multe modele de mpachetare a moleculei de ADN. Cel mai acceptat este acela propus de Pettijohn si Hecht (l974) (citat de Zarnea, 1983), n acord cu care, mpachetarea se face printr-un proces de pliere i supraspiralizare (formare de suprahelice) (fig. 14). Se formeaz astfel o structur condensat, meninut prin aciunea asociat a proteinelor din nucleoid. Modelul de mpachetare prin pliere i

27

supraspiralizare ncearc s explice mecanismul molecular al drumului invers, de la structura circular relaxat a macromoleculei de ADN, la arhitectura corpusculului dens existent n celul. Pentru mpachetare se consider c molecula dublu catenar, circular, iniial se pliaz, n 40-60 de domenii egale. Punctele de pliere sunt determinate de molecule de ARN nascente, legate cu una dintre extremiti de ARN-polimeraz. Moleculele de ARNr i ARNt, mpreun cu ARN-polimeraza particip la formarea i meninerea domeniilor de pliere.

Figura 14. Diferite stri fizice (de impachetare) ale cromosomului bacterian. a. Bucle multiple de ADN dintr-o celul spart prin oc hipotonic, rspndite pe suportul reprezentat de o protein bazic. b. Diagrama ADN supraspiralizat. n stnga sunt reprezentate 7 domenii (numrul real este de circa 50) supraspiralizate, meninute astfel de un set de proteine, care stabilizeaz capetele unui domeniu. Buclele mici ale fiecrui domeniu pot fi spiralizate n jurul unui set de proteine nucleosomale, reducnd tensiunea n dublul helix, creat prin supraspiralizare. n dreapta, dou domenii au fost incizate la nivelul unei catene, permind rotaia helixului i relaxarea supraspiralei (dupa Pettijohn i Snider, 1985).

Prin pliere, diametrul cromosomului scade la circa 30 m. In interiorul fiecrui domeniu de pliere are loc un proces de supraspiralizare. Supraspiralizarea este o stare fizic n care molecula de ADN se pliaz prin rsucire n jurul propriei axe. Intr-o etap ulterioar, domeniile suprahelicale se pliaz din nou unul fa de altul, superior i inferior fa de un plan orizontal. Astfel, rezult masa compact a nucleoidului, aa cum se evideniaz la microscopul optic i se poate izola din celul. Rolul topoizomerazelor n meninerea configuraiei supraspiralizate a moleculei de ADN Spiralizarea ADN are sens pozitiv i negativ. Spiralizarea primar a dublului helix are sens pozitiv (de dreapta), cu 10,4 pb/tur. Anumite secvene de ADN, mai ales cele care conin resturi alternante de G i C, tind s formeze un helix rsucit spre stnga (forma Z) a moleculei de ADN, denumit astfel deoarece axa glucidfosfat are o structur n zig-zag. Spiralizarea secundar (supraspiralizarea) are sens negativ (de stnga), adic se produce prin rsucirea moleculei de ADN n sens opus spiralizrii primare (pozitive) a dublului helix. Molecula de ADN bacterian este, n mod normal, supraspiralizat negativ, cu o spiral negativ la fiecare circa 200 pb. Cromosomul bacterian const dintr-un numr mare de bucle supraspiralizate, aranjate pe o regiune central, rezultnd o structur compact i organizat - nucleoidul. Prin supraspiralizarea negativ, ntre capetele domeniului pliat, se creeaz o tensiune de torsiune, direct proporional cu gradul de spiralizare, care se menine atta timp ct molecula este nchis covalent. Tensiunea este anulat prin incizia unei catene i formarea buclelor de ADN. Catena incizat se rotete liber n jurul axei moleculei, se relaxeaz, ia forma circular deschis, fr superhelice. Formarea unei bucle elimin un tur al suprahelicei i reduce tensiunea general a suprahelicei. Formarea suprahelicei i relaxarea ei este condiionat de activitatea unui set de enzime, denumite ADN-topoizomeraze. Topoizomerazele sunt enzime care schimb configuraia spaial a ADN prin ruperea i reunirea catenelor. Unele topoizomeraze sunt helicaze sau giraze (produc spiralizarea moleculei de ADN), iar altele sunt derulaze (produc despiralizarea prin incizia unei catene i bucla se

28

relaxeaz). O topoizomeraz este o nucleaz reversibil, care se leag covalent la o grupare fosfat a ADN i rupe legtura fosfodiesteric. Deoarece legtura covalent care unete topoizomeraza la o grupare fosfat a ADN reine energia legturii fosfodiesterice pe care o rupe, reacia este reversibil, adic incizia este urmat de legarea celor dou capete. Legarea este rapid i nu necesit un aport suplimentar de energie. Topoizomerazele de tip 1 acioneaz prin recunoaterea unui segment de ADN, parial despiralizat, prin incizia unei catene, ceea ce permite celor dou pri ale helicei de ADN, de o parte i de alta a inciziei, s se roteasc liber una fa de alta, n sensul care reduce tensiunea de supraspiralizare. Aceasta nseamn c replicarea ADN se face numai cu rotaia unei mici pri a helicei, adic a celei situat n aval de bifurcaie. Topoizomeraza I, prin clivarea unei catene, elimin tensiunea de torsiune i formeaz bucle externe distribuite pe toat suprafaa nucleoidului. Buclele sunt secvenele de ADN care conin genele transcrise la un moment dat. Ele sunt invizibile, extinse n citoplasm i n aceast topografie sunt mai uor accesibile ADNpolimerazei i ARN-polimerazei. Pe seciuni subiri, anticorpii marcai cu aur, specifici fa de ADN monocatenar coloreaz numai periferia nucleoidului, iar anticorpii specifici fa de ADN dublu catenar coloreaz partea central (condensat) a nucleoidului. Topoizomerazele de tip II se leag covalent, simultan, de cele dou catene ale dublei helice i produc o rupere bicatenar tranzitorie. Aceste enzime se activeaz la situsurile cromosomale la nivelul crora se ntreptrund dou duble helice. Dup fixarea topoizomerazei la un astfel de situs, are loc clivarea uneia din cele dou helice duble; i trecerea celei de a II-a catene, prin brea creat, urmat de repararea discontinuitii nainte de a se disocia de ADN. ADN-polimeraza de tip II poate astfel s separe cele dou molecule de ADN catenate. ADN-giraza (sau topoizomeraza II) modific configuraia spaial a moleculei de ADN, prin catalizarea suprarsucirii negative ale ADN cromosomal i plasmidial, uurnd mpachetarea cromosomului bacterian n spaiul restrns al celulei. Este o protein heterotetrameric format din dou subuniti A (gyr A) i dou subuniti B (gyr B) (la E. coli proteinele gyr au 97 kDa). Subunitile A i B ale topoizomerazei II sunt codificate de genele gyr A i gyr B. Dup purificarea ADN-girazei de E. coli, structura acestei enzime a fost investigat pentru numeroase alte specii bacteriene, evideniidu-se un grad nalt de omologie ntre subunitaile A, pe de o parte, i a subunitailor B, pe de alt parte. Cu toate acestea, secvena situsurilor catalitice din proteinele gyr A i aceea a situsului de hidroliz a ATP n proteinele gyr B sunt foarte conservate. ADN-giraza purificat introduce rsuciri suprahelicale negative ale moleculei de ADN circular nchis i separ reversibil moleculele circulare catenate. Aceste activiti sunt dependente de energia eliberat prin hidroliza ATP i constau n clivarea ambelor catene ale moleculei de ADN, trecerea altui duplex de ADN (sau alt segment al aceluiai duplex) i reunirea catenelor. Activitatea ADN-girazei este inhibat de quinolone Subunitatea A a fost desemnat ca inta preferenial a aciunii quinolonelor. Subunitatea B este inta altor antibiotice: cumermicina i novobiocina. ADN-giraza este singura enzim care influeneaz gradul de spiralizare al ADN, prin catalizarea suprarsucirilor negative ale ADN cromosomal i plasmidial, fiind esenial pentru meninerea strii suprahelicale a cromosomului bacterian. Inhibiia activitii acestei enzime de ctre fluoroquinolone este asociat cu moartea rapid a celulei bacteriene. Proteina se leag de ADN ca un tetramer, n care cele dou subuniti A i dou subuniti B mpacheteaz ADN prin supraspiralizare negativ. ADN giraza elimin rsucirile suprahelicale pozitive care se acumuleaz naintea bifurcaiei de replicare. Aceste activiti sunt rezultatul secionrii coordonate a ambelor catene ale ADN, trecerea celuilalt segment de ADN prin ni i restabilirea continuitii catenei. Mecanismul de aciune este caracteristic topoizomerazei II. Situsul catalitic al ADN-girazei este situat la tirozina din poziia 122 a subunitaii A. Subunitatea B cuprinde situsul de hidroliz a ATP, hidroliz care furnizeaz energia necesar activitii enzimatice. ADN-giraza este esenial pentru mai multe procese vitale: iniierea i progresia bifurcaiei de replicare, terminarea replicrii, transcrierea unor operoni, repararea ADN, recombinarea i transpoziia. Topoizomeraza IV a fost descris recent, iar funcia sa principal este decatenarea, adic separarea copiilor ADN circular dublu catenar dup replicarea cromosomului bacterian i a plasmidelor. Topoizomeraza IV este omolog structural cu ADN giraza. Este o enzim de separare a catenanilor (a moleculelor surori catenate de ADN), rezultai dintr-un rund de replicare bidirecional i permite segregarea lor n celulele surori. ADN-giraza i topoizomeraza IV acioneaz asupra dublei catene, dar efectele sunt diferite: giraza mpacheteaz ADN prin inducerea supraspiralizrii, iar topoizomeraza IV separ moleculele reunite prin legturi intermoleculare. Topoizomeraza IV este format la fel ca ADN-giraza din dou subuniti denumite Par C i dou subuniti Par E, cu aceeai repartiie funcional ca i a subunitilor ADN-girazei. Proteinele Par C i Par E sunt foarte asemntoare prin structura lor primar cu proteinele Gyr A i Gyr B (40% din secvena aminoacizilor este identic) i sunt codificate de genele parC i parE. Topoizomeraza IV modific ntr-o msur mult mai mic topologia ADN dublu catenar: rolul su este important pentru separarea catenelor

29

de ADN dup terminarea replicrii. Rolul topoizomerazei IV, ca int specific a quinolonelor a fost recent demonstrat la E. coli, S. aureus i N. gonorrhaeae. Ryter i Cohen (l975) consider c nucleoidul evideniat la microscopul electronic ca o structur net ar reprezenta fracia de ADN condensat, genetic inactiv, care din punct de vedere topologic reprezint ADN supraspiralizat. Proporia ntre ADN supraspiralizat i ADN relaxat este meninut prin echilibrul dintre ADNgiraza (topoizomeraza II), enzima care produce supraspiralizarea i topoizomeraza I, enzima care produce relaxarea. Domeniile cromosomului bacterian sunt topografic independente, ceea ce permite rotaia lor liber i relaxarea individual a fiecrei supraspirale, care trece reversibil n starea de bucl, configuraie n care se replic, este transcris sau reparat. ADN bacterian, ca i la eucariote este asociat cu proteine. n celula eucariot, corpii proteici n jurul crora se spiralizeaz dubla caten de ADN se numesc nucleosomi. La bacterii, organizarea molecular a nucleosomilor este puin cunoscut. Se pare c ei conin dou proteine de legare pentru ADN: proteina HU (Helix Unwinding) i proteina I. Ele se gsesc n structura nucleosomului, n proporia de o molecul la l50-200 perechi de baze. 1.5. Ribosomii Ribosomii sunt organite ribonucleoproteice, localizate n citoplasm, care la microscopul electronic au form sferic, cu diametrul de aproximativ 20 nm. Pe baza constantei de sedimentare (S) se disting urmtoarele categorii de ribosomi: a) ribosomi 80 S, n citoplasma celulelor eucariote; b) ribosomi mitocondriali i cloroplastici, ntre 55 S la mamifere i 75 S la plantele superioare; c) ribosomii Archaea, de 70 S, asemntori din punct de vedere funcional cu ribosomii 80 S ai eucariotelor, datorit absenei sensibilitii la streptomicin i cloramfenicol i prin sensiblitatea la toxina difteric; d) ribosomii eubacteriilor, de 70 S. Numrul ribosomilor n celula bacterian este corelat cu activitatea ei fiziologic: este mic n celulele n repaus, dar crete foarte mult n celulele fiziologic active (n medie 20000 ribosomi/celul, cu variaii ntre l5-l00 000). Ribosomii sunt structuri dinamice, calitate ce se reflect n capacitatea lor de a se disocia n dou subuniti, de 30 S i 50 S i de a se reasocia. Disocierea i reasocierea sunt corelate cu variaia concentraiei ionilor de Mg2+: creterea concentraiei ionilor favorizeaz asocierea, iar scderea concentraiei lor produce disocierea. Circa l0% din numrul total de ribosomi sunt asamblai, liberi n citoplasm. Ei sintetizeaz proteinele structurale. Ali l0% se gsesc sub forma subunitilor disociate, iar restul de 80% sunt polisomi. Ribosomii au dou localizri: liberi n citoplasm sau ataai feei interne a membranei citoplasmatice. La nivelul celor ataai se sintetizeaz proteinele de export. Studiul ribosomilor a beneficiat de tehnici din domeniul fizicii (metoda dispersiei neutronilor), care, n asociaie cu tehnicile de chimie au permis nelegerea structurii i funciei ribosomilor. La microscopul electronic, s-a demonstrat c ribosomii au form complex, cea sferic perceput n mod obinuit fiind rezultatul examinrii cu sisteme optice cu putere redus de rezoluie. Subunitatea 50S are o form asemntoare cu aceea a unui fotoliu, iar subunitatea 30S se aseamn cu o halter asimetric, aezat orizontal pe braele i sptarul fotoliului. ntre cele dou subuniti rmne un spaiu prin care trece ARNm. Din punct de vedere biochimic, ribosomii bacterieni conin circa 55 de tipuri de molecule proteice i trei tipuri de molecule de ARNr. Studiile privind structura funcional a ribosomilor s-au fcut cu dou metode foarte sensibile: difracia cu neutroni i imunoelectronomicroscopia. Subunitatea mic 30 S cuprinde 2l tipuri de molecule proteice (S1 - S21), n ordinea descreterii mrimii, cu greutatea molecular ntre 60 000 Da i 8 000 Da i o molecul de ARNr l6S, alctuit din circa l6000 nucleotide. Subunitatea mare, 50S conine 34 tipuri de molecule proteice (Ll - L34, L= Large), cu greutatea molecular cuprins ntre 9 - 28,5 kDa i dou molecule de ARNr, de 23 S i respectiv 5 S. Cele dou tipuri de molecule de ARN provin prin clivarea unui precursor comun, de 30 S. Cele 55 de tipuri de proteine ribosomale se gsesc ntr-un singur exemplar (o singur molecul din fiecare tip). Unele au rol structural, fiind eseniale pentru asamblarea ribosomului, altele au rol funcional, permind legarea ARNm n procesul traducerii i sintezei lanului proteic. La E. coli, n fiecare subunitate ribosomal, raportul ARN-proteine este 2/l, iar la alte bacterii, raportul este 2/3. Moleculele componente au o distribuie fix, riguroas n structura ribosomului. Molecula de ARNr este pliat ntr-o structur tridimensional ce formeaz regiunea central a ribosomului i determin aspectul su. Proteinele care se leag de ARNr 16 S sunt mai profunde i sunt cele mai protejate de aciunea agenilor externi. Proteinele sunt localizate n general la suprafaa ribosomului, n depresiunile pe care le creeaz ARN pliat. Unele proteine conin domenii globulare, localizate la suprafa, ce

30

trimit extensii n regiunea central a ribosomului. Interaciunile fixe ale componentelor condiioneaz procesele de autoasamblare a ribosomilor. Asamblarea ribosomilor. Experimental, componentele ribosomale se disperseaz i se autoasambleaz dup restabilirea condiiilor de mediu, pentru a produce ribosomi activi. S-a reconstituit subunitatea 30 S, dar reasamblarea subunitii 50 S este mai complex deoarece este dependent de temperatur (60o C) i proteinele se denatureaz la aceast temperatur. n studiile experimentale s-au utilizat ribosomi de Bacillus stearothermophilus, ale cror proteine sunt termostabile, rezistente la 60o C. Ulterior s-a reasamblat subunitatea 50 S de la E. coli. Reasamblarea ribosomilor urmeaz o cale specific: anumite proteine se leag de ARN i complexul este recunoscut succesiv de alte proteine, pn ce structura devine complet. Ribosomii reconstituii sunt funcionali (fac sintez proteic). Rolul proteinelor pare a fi de stabilizare a ARN, dar ele permit schimbarea configuraiei ARNr, necesare catalizei sintezei proteinelor. Ribosomii reprezint componenta esenial a sistemului de traducere a informaiei genetice. Ei sunt adevratele fabrici de proteine ale celulei. Ribosomii au rolul de a menine att molecula de ARNm, ct i complexul aminoacil-ARNt, ntr-o orientare corespunztoare pentru a permite att citirea mesajului, ct i formarea legturilor peptidice. Ribosomii se asociaz n polisomi (poliribosomi), adic grupri funcionale formate din 4 - 50 uniti ribosomale. Dimensiunile polisomilor variaz n funcie de lungimea ARNm. Polisomii sintetizeaz concomitent mai multe molecule proteice pe aceeai molecul de ARNm. 1.6. Sporul bacterian Sporul este o forma primitiv de difereniere celular, care const n reorganizarea structural i funcional a celulei vegetative i formarea unui nou tip de celul, cu proprieti noi. Sporii se formeaz la bacteriile cilindrice: totdeauna la bacilii anaerobi din genul Clostridium, facultativ la cei aerobi din genul Bacillus, excepional la coci (Sporosarcina) i la actinomicete. Toate bacteriile sporulate sunt Gram pozitive. Sporularea este condiionat de existena unui perete mureinic gros i de formarea septului de diviziune. Exist circa l0 tipuri de spori, ce se deosebesc prin modul de formare, prin structur i prin rezisten la factorii de mediu. Cel mai caracteristic este endosporul, denumit astfel deoarece se formeaz n interiorul unei celule vegetative. La actinomicete se formeaz cteva tipuri de spori: artrospori (prin segmentare), oidiospori (prin fragmentare), aleuriospori (se formeaz apical sau lateral pe sporofori scuri), zoospori (spori mobili), iar aplanosporii se formeaz prin septarea hifelor i sunt meninui n interiorul unui nveli. La Azotobacter se formeaz chiti. Endosporul sau sporul endogen a fost considerat ca unic tip sporal bacterian, pn la descrierea celorlalte tipuri. Are form sferic sau ovalar. Cei ovalari au dimensiuni cuprinse ntre 0,5 1 m, pentru axul scurt i 1,2 2 m pentru axul lung. Endosporul are o refringen deosebit i pe preparatul proaspt apare strlucitor. Este foarte greu colorabil datorit nveliurilor sporale groase, greu penetrabile pentru colorani (n special cortexul) i datorit coninutului lor chimic particular. Se coloreaz prin tehnici speciale. Poziia sporului n celul poate fi terminal, subterminal sau central. n funcie de dimensiunile fa de diametrul celulei vegetative, sporii sunt deformani (diametrul lor este mai mare dect al celulei) i nedeformani (diametrul lor este mai mic dect al celulei). Intr-o celul bacterian sporulant, sporii sunt unici, cu rare excepii: n sol apar bacterii bisporulate, iar n intestinul unor vertebrate acvatice, bacterii polisporulate. Semnificaia sporilor multipli nu este clar. Se pare c ei apar ca rezultat al perturbrii mecanismului de separare a celulelor dup diviziune. Sporii multipli apar n celulele n care materialul nuclear s-a replicat, dar nu s-a format septul de diviziune. Sporogeneza este declanat n mod obinuit de lipsa unui nutrient esenial n mediu, sursa de azot sau de carbon. Procesul este foarte complex din punct de vedere genetic, biochimic, structural i funcional. Sporularea implic activarea unui numr mare de gene sporale (peste 50) inactive n celula vegetativ, n timp ce sunt represate genele active n celula vegetativ. Sub aspect biochimic, sporularea este nsoit de modificri majore ale componentelor moleculare i structurale. Se sintetizeaz proteazele care mresc turnover-ul proteic, furniznd aminoacizii necesari sintezei proteinelor noi. Din punct de vedere funcional, celula sporal dobndete o rezisten deosebit la factorii fizici i chimici. Din punct de vedere structural, la nivel electrono-optic, sporularea la B. subtilis parcurge 7 stadii, n cursul crora celula sporal se formeaz i se elibereaz. Sporularea este precedat de replicarea materialului nuclear. Ulterior, cei doi cromosomi fuzioneaz, formnd o structur axial alungit unic. Nucleoidul axial diploid segreg n dou structuri cromosomale: una migreaz spre polul sporal i va deveni nucleoidul sporului, iar cealalt rmne n celula vegetativ. Formarea septului sporal este iniiat prin apariia a dou mici protuberane simetrice ale peretelui, spre interiorul celulei. Membrana citoplasmatic mbrac aceste excrescene, se invagineaz i formeaz membrana presporului. Cele dou intruzii ale membranei se nchid ca o diafragm, de la exterior spre interior.

31

Membrana presporului este dubl i delimiteaz componentele celulare ale viitorului spor. Formarea sa este complet la 5 ore dup iniiere. n stadiile ulterioare, din materialul care se depune ntre cele dou membrane ale presporului se definitiveaz morfogeneza cortexului, format din trei lamele: lama intern (profund), care va deveni peretele sporului, iar dup germinare, peretele viitoarei celule; lama intermediar sau cortexul propriu-zis, cu grosime variabila i lama extern. S-au izolat mutante bacteriene care blocheaz sporogeneza n diferite etape. Structura intern a endosporului La diferite grupe de bacterii exist variaii importante ale structurii sporului, n special n privina nveliurilor, care difer prin numrul i grosimea lor. Exist de asemenea variaii cu privire la relaia sporului cu celula vegetativ n care s-a format: sporul rmne inclus n celul sau se elibereaz curnd dup formare, prin liza acesteia. Sporul este alctuit din protoplastul sporal, care conine sporoplasma i materialul nuclear. Protoplastul sporal este acoperit de urmtoarele structuri: - un perete intern subire, originar din membrana intern a presporului. Dup germinare, acesta va forma peretele celulei vegetative; - cortexul sporal, cu grosime variabil, electronodens. Este o structur multilaminar ce se formeaz pe feele adiacente ale celor dou membrane ale presporului; - stratul extern al cortexului, derivat din membrana extern a presporului; - nveliul sporal intern (intina), un strat dens, de natur proteic; - nveliul sporal extern (exina). Uneori, aceste dou nveliuri sunt pluristratificate; - exosporul, un rest al celulei vegetative, uneori adiacent de celelalte nveliuri sporale, prin intermediul filamentelor suspensoare (fig. 15).

Figura 15. Imagine electrono-optica a sectiunii transversale prin sporul in curs de formare la B. megatherium. Componenta structurala electronodensa, delimitanta a protoplastului, este cortexul sporal (x 120000, original).

La unele categorii de spori se gsesc structuri suplimentare denumite apendice sporale. Semnificaia lor funcionala nu este cert, dar ar putea fi implicate n dispersarea sporilor n natur sau ar facilita absorbia substanelor nutritive n perioada premergatoare germinrii sporului. Particularitile biochimice ale sporului Schimbarea specificitii ARN-polimerazei este foarte important pentru controlul sporulrii la B. subtilis. Cnd ncepe sporularea, multe gene active n celula vegetativ sunt represate i sunt activate genele specifice. Fiecare stadiu al sporulrii este marcat de schimbarea expresiei unor gene, mediat de factorul sigma, care schimb specificitatea legrii ARN-polimerazei de promotor. Protoplastul sporal conine toate categoriile de molecule necesare relurii creterii: materialul nuclear i cantiti mici ale fiecrui component al aparatului de sintez proteic (ribosomi, ARNt, enzime). Lipsesc componentele celulare instabile (ARNm i nucleozid-trifosfaii), dar exist precursorii lor mai stabili (nucleozid mono- i difosfai). Aminoacizii i enzimele lor de biosintez sunt virtual absente, dar la germinare, ambele tipuri vor fi generate prin hidroliza proteinelor de depozit, solubile, cu molecul mic. Puine enzime sporale deriv din enzimele celulei

32

vegetative prin clivare. Majoritatea enzimelor sporale sunt noi. Sinteza lor este codificat de gene activate n timpul sporulrii. Toate enzimele sporale sunt termorezistente, fapt explicabil prin dimensiunile lor mici, fiind reprezentate numai de situsul activ al moleculei respective. Lipsesc enzimele fundamentale ale metabolismului celular, ca i sistemele transportoare de electroni. La cele mai multe bacterii, ionii de Ca2+ lipsesc. In stadiile timpurii ale sporulrii apar sistemele de transport activ pentru Ca. Ionii de Ca sunt legai cu o cantitate echivalent de acid dipicolinic (se formeaz din acidul diaminopimelic un precursor al peptidoglicanului) i formeaz dipicolinatul, care poate constitui circa l5% din greutatea uscat a sporului. S-a considerat c sporul este rezultatul unui proces de deshidratare profund. Cercetrile ulterioare au evideniat c deosebirile dintre spor i celula vegetativ nu sunt de ordin cantitativ, ci de ordin calitativ i se datoreaz strii apei (Gould, 1969). In celula vegetativ, apa liber reprezint 70% din cantitatea total, iar n spor oscileaz ntre 3 - l0%, restul de 90 - 97% fiind apa legat. Din aceast cauz, sporul este lipsit de metabolism, sau are un metabolism de intensitate foarte mic, nedecelabil. Celula sporal este vie, dar procesele vieii sunt latente. Fenomenul se numete criptobioz (via ascuns). Consecina particularitilor de compoziie chimic, la care se adaug nveliurile groase multiple i pluristratificate, este rezistena deosebit a sporului la caldur, la aciunea substanelor chimice (antiseptice, dezinfectante) i a radiaiilor. Rezistena termic este conferit de dipicolinatul de Ca. Mutaiile care reduc cantitatea de dipicolinat scade rezistena sporului la agentul termic. Rezistena termic a sporului impune o metodologie costisitoare de sterilizare, la temperaturi foarte ridicate. Uneori, sporii rezist la temperatura de l80 0C, de la cteva minute, la cteva ore. De aceea s-a renunat la metoda sterilizrii obiectelor prin fierbere, deoarece tratamentul omoar numai formele vegetative, iar sporii rmn viabili. Germinarea este procesul de conversie a sporului n celul vegetativ i decurge n trei stadii: - activarea sporului prin deshidratare, asociat cu mrirea volumului; - germinarea, adic modificarea localizat prin gelificare a nveliurilor sporale; - emergena celulei vegetative din nveliuri, delimitat de un perete derivat din peretele sporal intern. Intr-un mediu nutritiv optim, germinarea este rapid: de la iniiere pn la diviziunea celular, procesul dureaz 90 de minute. In medii favorabile, majoritatea sporilor germineaz, dar o proporie mic rmn n stare dormant. Pentru iniierea germinrii, sporii necesit un factor suplimentar: factorul termic, un compus cu grupri SH, pH acid. Dup circa o or de la nceputul activrii ncepe sinteza ADN. 1.7. Glicocalixul Glicocalixul este reprezentat de totalitatea structurilor polizaharidice extraparietale: capsula, cu diferite grade de dezvoltare i glicocalixul comportamental. Capsula este o structur accesorie, cu o consisten gelatinoas, vscoas, care acoper complet celula bacterian. n funcie de gradul de dezvoltare la diferite specii bacteriene se disting urmtoarele structuri capsulare: - microcapsula, reprezrentat de o pelicul fin de material polizaharidic, n jurul peretelui celular (pn la 0,2 m grosime). La microscopul optic se evideniaz numai prin metoda imunofluorescenei, dar este vizibil la microscopul electronic; - macrocapsula, o structur omogen, aderent de celul, mai groas de 0,2 m, vizibil la microscopul optic prin tehnici speciale de colorare negativ, dac este o capsul suficient de compact i rigid, pentru a exclude tuul de India i nigrozina. Dac are o structur lax i flexibil, coloranii o penetreaz. Aderena macrocapsulei de celul este ferm i prin centrifugare se depune concomitent cu celulele; - stratul mucos este o structur capsular cu o grosime neuniform i distribuie dezordonat n jurul celulei. Consistena este mai fluid, prin centrifugare, celulele se desprind i se depun, iar materialul polizaharidic ramne n suspensie; - zoogleea, o mas de material polizaharidic, n care sunt cuprinse un numar mare de celule bacteriene. Materialul capsular se gsete la bacteriile Gram pozitive i Gram negative (fig. 16) din sol, ape (dulci i srate), rumen, la bacteriile patogene ce produc infecii ale vezicii urinare i pulmonare.

33

Figura 16. Macrocapsula la bacili Gram negativi (imagine la microscopul optic, x 1000, original).

Natura chimic a materialului capsular Materialul capsular este de natur polizaharidic. De cele mai multe ori, n alctuirea sa se gsesc Dglucoza, D-fructoza, D-galactoza. Mai rare sunt manoza, fucoza, pentozele. Unele polizaharide extracelulare se aseamn cu acizii teichoici deoarece conin glicerol-fosfat sau ribitol-fosfat. Materialul capsular poate fi un homopolizaharid sau un heteropolizaharid. Cele mai cunoscute homopolizaharide sunt dextranii si levanii. Dextranii formeaz o clas mare de polizaharide, alctuii din uniti de D-glucopiranozil, legate l-6, cu puni de ramificare n pozitiile 2, 3 sau 4. Lungimea lanului este cuprins ntre 40 - 500 resturi de glucoz. Dextranii sunt produi de Peptococcus (Leuconostoc) mesenteroides, din sucroz. Sinteza lor este abundent n melasa de la fabricile de zahr, unde o cantitate semnificativ de zahr este convertit la dextran, aducnd prejudicii economice importante. In stare purificat, dextranul se folosete n practica transfuziilor, ca nlocuitor al plasmei, fiind solubil n ap. Sephadexul este un dextran folosit n tehnicile cromatografice bazate pe principiul sitei moleculare i cromatografia de schimb ionic. Levanii sunt poli-D-fructani (fructozizi), sintetizai de unele bacterii patogene pentru plante (Pseudomonas, Xanthomonas), de Streptococcus (Str.) salivarius, de Bacillus. Au greuti moleculare de l000 kDa sau mai mult (Black, 1996). Heteropolizaharidele sunt alctuite dintr-un numr variat de uniti diferite: glucoz, fructoz, galactoz, manoz, acid galacturonic, derivai aminai i acetilai ai acestora. Structura biochimic a heteropolizaharidelor este foarte diferit nu numai n funcie de compoziia chimic global, ci i de secvena diferiilor monomeri n catena polizaharidic (de exemplu, pentru xantan, structura repetitiv este un pentazaharid). Diversitatea monomerilor glucidici confer heteropolizaharidelor o anumit heterogenitate a structurii chimice i n consecin, o anumit specificitate antigenic. De exemplu, la Str. pneumoniae exist peste 80 de tipuri chimice diferite de material capsular, care corespund nu numai unor diferene de compoziie chimic, ct i de secven a monomerilor. Varianta antigenic a polizaharidului capsular imprim specificitatea anticorpilor n reaciile de aprare fa de bacteriile patogene. Capsula este o structur inert, accesorie ce nu face parte integrant din celula bacterian. Cel mai adesea nu ndeplinete o funcie esenial pentru celul. Bacteriile patogene capsulate sunt virulente, deoarece capsula este un material chimiotactic negativ pentru fagocite. Pe mediul solidificat, ele produc colonii netede (S, Smooth). Mutantele lor necapsulate care produc colonii rugoase (R, Rough) sunt mult mai puin virulente. Materialul capsular este higroscopic (reine apa) i astfel protejeaz celula de efectul duntor al uscciunii. Materialul capsular ar putea avea rolul de depozit al unor nutrieni din mediu. Glicocalixul comportamental La anumite bacterii structurile superficiale sunt acoperite de un glicocalix adevrat, constituit dintr-o reea de filamente polizaharidice i glicoproteice, legate de lipopolizaharidele membranei externe la bacteriile Gram negative sau de mureina bacteriilor Gram pozitive. Filamentele formeaz o structur pericelular dezordonat, ca o psl, prin intermediul creia celula se ancoreaz fie pe alte celule, fie pe suporturi inerte. Glicocalixul se gseste numai la bacteriile care triesc n mediile naturale, avnd un caracter adaptativ, adic exist numai n condiiile n care prezena ei confer celulei un avantaj selectiv. Dup cultivare n medii

34

artificiale (bulion, geloza), glicocalixul dispare i din aceast cauz s-a evidentiat trziu. Deoarece nu persist la celulele cultivate n mediile artificiale, s-a propus denumirea de glicocalix comportamental. Glicocalixul a fost studiat la celulele bacteriene din placa dentar. Placa dentar este un depozit de culoare alb-glbuie, vizibil cu o lup, ce se formeaz pe suprafaa smalului dentar, iniiat de Streptococcus mutans. Celulele sale sintetizeaz un polizaharid glucanic, prin intermediul cruia ader foarte strns de suprafaa smalului, formnd iniial o microcolonie, iar ulterior, o colonie. Celulele ader ntre ele, dar i de smalul dentar, prin glicocalix. Dup impregnare cu sruri i glicoproteine salivare se creeaz un micromediu anaerob, n care bacteriile elimin produsele de catabolism. Micromediul coloniei se acidific i se creeaz condiiile favorabile degradrii smalului. Astfel se initiaz formarea cariei. n mediile naturale, celulele bacteriene lipsite de structura capsular se ancoreaz de suport prin intermediul glicocalixului. Legarea celulelor de suport este prima etap a procesului de colonizare. Astfel se iniiaz formarea coloniei bacteriene, glicocalixul fiind structura care mediaz asocierile bacteriene polispecifice. Astfel s-a demonstrat c n rumen, asocierile coloniale conin celule ce aparin unor specii diferite (colonii polibacteriene). Intre ele se stabilesc relaii metabolice sinergice, prin care bacteriile realizeaz activiti metabolice, pe care speciile separate nu le pot desfura. De exemplu, n rumen se produce CH4: unele bacterii produc H2, altele CO2, iar bacteriile metanogene reduc CO2, utiliznd H2 ca surs reductoare. Majoritatea microorganismelor din mediile acvatice nu se gsesc ca organisme libere plutitoare, ci triesc ataate de suprafee, inclusiv la suprafaa apei, unde formeaz un biofilm. Asociaiile naturale de bacterii, n matricea unui biofilm funcioneaz ca un consoriu cooperant. Biofilmele reprezint sisteme biologice cu un nivel nalt de organizare, n care comunitile de bacterii sunt coordonate funcional. Capacitatea lor de a persista n ntreaga biosfer se datoreaz versatilitii lor metabolice i plasticitii fenotipice. Un element esenial al adaptabilitii este capacitatea lor de a-i alege poziia ntr-o ni n care se propag. Cel mai comun mecanism de poziionare este mobilitatea flagelar i diferitele modaliti de translocaie pe suprafe