Peptide semnal Atunci când o proteină este sintetizată,

structura sa secundară sau terţiară se construieşte din nou şi pe măsura transducţiei este eliberată în citoplasmă.

Dacă această proteină este destinată pentru a fi în membrane sau organite celulare, partea codantă a ARNm începe printr-o secvenţă de câţiva aminoacizi ca adresă pentru încorporarea acestei proteine în membrane.

Peptidele semnal sunt lanţuri formate din câţiva aminoacizi (15-20) situaţi la extremitatea NH2 terminală a proteinelor traduse, semnalând unde trebuie să fie excretată proteina din celulă.

Aceste peptide orientează destinaţia proteinelor; încorporate în membrană (RE, AG, plasmalemă, lizozomi) intră în mitocondrii sau sunt exocitate în afara celulelor prin aparatul Golgi.

• Fiecare organit prezintă un mecanism de recunoaştere şi încorporare numai a proteinelor necesare şi specifice lui.

• Această recunoaştere se realizează datorită unei secvenţe de aminoacizi pe care o conţine proteina respectivă, secvenţa semnal, şi a unui receptor specific care recunoaşte proteina şi o internalizează.

• După ce proteina a ajuns la destinaţie, secvenţa semnal este eliminată prin digestie proteolitică, iar în cazul receptorului, acesta este eliberat şi reciclat.

• Poliribozomii şi peptidele semnal

• Poliribozomii care se formează pe un mesager conţinând o peptidă semnal, au o evoluţie uşor diferită.

• Transducţia se opreşte cu puţin după sinteza peptidei semnal.

• Se ştie că peptida semnal interacţionează direct cu membrana reticulului endoplasmatic.

• Acest lucru este posibil datorită particulei de recunoaştere a semnalului SRP (Signal Recognition Particle)

• . SRP este constituit din diferite proteine şi un ARN 7S. Imediat ce interacţiunea peptidei semnal cu SRP apare în afara structurii ribozomilor, şi se leagă cu SRP este inhibată elongaţia.

• Traducerea se opreşte până când SRP este recunoscut de un receptor al membranei RE.

• Imediat ce această legătură este stabilită ribozomul este legat de ribozomii din membrana RE lângă un complex proteic.

• Acesta contribuie la formarea unui canal apos de transport al proteinelor cunoscut sub numele de translocon, prin care proteina nou formată trece în lumenul, apoi în cisternele RE.

• Deci canalul se deschide şi elongaţia se reia.

• La faţa internă a membranei RE o endopeptidază specifică sau peptidaza semnal va secţiona peptida semnal şi sinteza se va desfăşura până la terminare.

• SRP se eliberează în citosol şi traducerea este încheiată.

• Proteina va fi în final încorporată într-o membrană sau exportată pentru traversarea AG către exteriorul celulei.

• Adresarea proteinelor către mitocondrii face apel la un alt tip de peptidă de adresare care conduce peptidele prin traversul membranei mitocondriale.

• Produşii primari de traducere conţinând peptide semnal sunt denumiţi preproteine, de exemplu preproinsulina, hormonul preproparotidian, etc.

• Modificări posttransducţionale

• Numeroase modificări chimice se produc după încorporarea aminoacizilor în structura primară a proteinei (transducţia); ele se numesc modificări posttransducţionale.

• Se disting modificări cotransducţionale care se produc atunci când transducţia se desfăşoară şi când peptidele formate sunt încă ataşate la ribozomul care a construit-o în celule, în organite sau în afara celulei.

• Astfel de modificări sunt:• Proteoliza: fragmentarea peptidei semnal; • Glicozilare • Acilare• Hidroxilare, etilare, carboxilare • Dezaminarea citozinei• Fosforilare • Legarea unui cofactor: Metal, Flavine, Hem• Blocajul extremităţilor• Se numeşte proteină matură, forma chimică

definitivă pe care proteina în momentul în care îşi îndeplineşte funcţia în organism.

• Organizarea structurală a proteinelor• Lanţurile polipeptidice ale proteinelor se pliază în

diferite moduri atât în cadrul propriului lanţ cât şi între lanţurile vecine adică intracatenar şi intercatenar.

• Acest mod de pliere este esenţial pentru activitatea biologică a proteinelor şi această organizare complicată este cea care trebuie conservată pe parcursul procedurilor implicate în purificarea proteinelor.

• Mult timp s-a considerat că modurile de pliere ale lanţurilor polipeptidice sunt determinate numai la secvenţa aminoacizilor din lanţ.

• Astfel s-a stabilit că proteinele având aceeaşi secvenţă a aminoacizilor pot exista în forme diferite de împachetare şi că astfel de plieri pot fi influenţate de prezenţa altor proteine cunoscute sub numele de molecule supraveghetoare tip scufiţă (chaperones).

• Denaturarea şi renaturarea proteinelor• O proteină care posedă o proprietate biologică

proprie, unică, se numeşte proteină nativă şi ea se deosebeşte de proteina ce şi-a pierdut această proprietate şi pe care o numim de aceea denaturată.

• O proteină denaturată şi-a pierdut structura tridimensională sau în alţi termeni conformaţia sa.

• Denaturarea poate fi reversibilă sau ireversibilă.• Un exemplu de denaturare ireversibilă este cea

termică aplicată la fierberea unui ou albuşul oului (albumina) se coagulează astfel ireversibil.

• Denaturarea reversibilă se poate realiza prin folosirea atentă a unor reactivi ca ureea şi mercaptoetanolul.

• Ureea distruge structura apei şi de aceea limitează interacţiunile hidrofobe ale catenelor laterale R şi a resturilor de aminoacizi, ceea ce duce la deplierea şi la disocierea moleculelor proteice.

• Mercaptoetanolul reduce legăturile S-S. De aceea la îndepărtarea ureei şi a mercatoetanolului, proteina s-ar putea renatura.

• Renaturarea este interpretată ca o dovadă în sprijinul ipotezei că o proteină având o structură primară corectă se va plia în mod spontan conducând la structura unică responsabilă pentru activitatea sa biologică.

• Acest fenomen este denumit autoansamblare a proteinei.

• Astăzi se ştie că renaturarea proteinelor poate fi asistată pe două căi.

• Una implică proteina disulfid izomeraza o enzimă care are rolul de a corecta legăturile S-S greşit formate.

• A doua cale implică structurile tip chaperone.

• Ele se pot defini ca o familie de proteine din clase neânrudite care mediază asamblarea corectă a altor polipeptide dar care nu sunt componente ale structurilor funcţionale asamblate.

• Ciclul celular

• Toate celulele vii urmează fie un un program de diviziune, fie o moarte programată, numită apoptoza.

• La celulele eucariote se pot distinge două faze în timpul diviziunii celulare, interfaza perioadă în care celulele cresc şi mitoza, perioada în care nucleul şi restul celulei se divide.

• Viaţa celulei se derulează între 2 mitoze. La mamifere această perioadă durează mai puţin de 30 de ore; sunt celule a căror viaţă este foarte scurtă sau foarte lungă.

• Pe durata acestor 3 ore, celulele traversează 4 faze:• faza G1 unde genomul fiind diploid, fiecare genă este

reprezentată în 2 exemplare. Cromatina este accesibilă ARN polimerazelor care realizează transcripţia genelor în ARNm care vor fi traduşi.

• Faza S la jumătatea ciclului începe replicarea ADN; ADN –polimeraza va acţiona în jur de 8 ore pentru a recopia în dublură ADN fiecărui cromozom.

• În timpul acestei faze transcripţia este inhibată. • Masa celulară creşte continuu în timp ce conţinutul de

ADN creşte în faza S şi scade brusc după faza S, astfel că ADN din celulele care nu se divid este constant.

• celula intră în faza G2 unde fiecare genă este reprezentată în 4 exemplare.

• Cromatina este din nou accesibilă ARN polimerazei care reâncepe transcripţia;

• survine mitoza care dă naştere la două celule fiice. Fiecare va primi una din copiile identice din ADN fiecărui cromozom şi fiecare genă va fi reprezentată în două exemplare.

• Ciclul celular are trei puncte de decizie: la punctul G1, G2 şi la sfârşitul mitozei

• Proteina Cdk (proteinkinaza dependentă de cicline) a fost identificată ca principalul reglator al trecerii prin aceste trei puncte.

• Complexul Cdk prin intermediul kinazelor fosforilează şi activează numai anumiţi factori de transcripţie pentru cicline.

• Nivelul ciclinelor în G1 creşte şi sunt asociate cu Cdk complex numit şi CdkG1.

• Cromatina şi ADN• În cursul fazelor ciclului celular, cromozomii evoluează

pentru a pregăti mitoza. • În timpul G1 cromatina este descompactată şi

genele se pot exprima. • Fiecare cromozom nu conţine decât o cromatidă. • În timpul S buclele de replicare se deschid şi

începe replicarea. În timpul fazei G2 cele 2 cromatide rezultate din replicări sunt legate prin centromerii lor.

• Sunt două cromatide pentru un cromozom. În timpul mitozei centromerul se leagă de fusul acromatidic şi pregăteşte separarea.

• Cromatina este compactată la maxim; după mitoză, cromatina este decompactată şi genele se pot exprima în fiecare din celulele fiice.

• Replicare semiconservativă in vivo

• ADN se replică în celulă printr-un proces care asigură ca una din catenele parentale să fie prezentă în moleculele fiice, aşa numita replicare semiconservativă.

• Această sinteză se produce în faza S (în mijlocul ciclului celular) ca urmare a activităţii ADN polimeraza şi .

• Alte ADN polimeraza participă la repararea ADN lizat (ADN polimeraza ) sau a replicării ADN mitocondrial (ADN polimeraza ).

• Replicarea semiconservativă

• Cele 2 lanţuri de ADN parental în curs de replicare servesc fiecare ca model pentru sinteza noului lanţ.

• În acest mod 2 catene în loc să rămânână ansamblate la fiecare sinteză (replicarea conservativă) se separă totdeauna la fiecare ciclu (replicare semiconservativă).

• La prima generaţie o catenă a fiecărui dublu helix provine din celula mamă.

• La a II-a generaţie nu există mai mult de două catene ADN a celulei mame, 4 dublu helixuri.

• Enzimele implicate în replicare• ADN este sintetizat de enzime numite ADNpolimeraze,

fiecare dintre acestea utilizând dezoxinucleozid trifosfaţi ca substraturi; polinucleotidul este sintetizat în direcţia 5'-3'. Matriţa de ADN este utilizată pentru a direcţiona ordinea bazelor azotate în polinucleotidul nou sintetizat care devine complementar cu ADN parental.

• Se cunosc trei tipuri de ADN polimeraze la E. coli.• -ADN polimeraza III , • -ADN polimeraza I• - ADN ligaza• . Fragmentele de ADN sunt legate prin acţiunea

enzimei ADN ligaza. Această enzimă joacă un rol atât în sinteza in vivo a ADN, cât şi în repararea unor rupturi monocatenare ale ADN.

• Rolul ARN în biosinteza ADN• Sinteza oricărei molecule de ADN este iniţiată prin

sinteza unui lanţ scurt de ARN, din nou în direcţia 5'-3', folosind nucleozid trifosfaţi (NTPs) ca substrat, prin intermediul unei enzime numită ARN primaza. Enzima este selectivă privind situsul de iniţiere a sintezei.

• În catena conducătoare numai o amorsă este sintetizată.

• În catena întârziată, sunt implicate multe locuri de iniţiere pe măsură ce catenele de ADN parental se separă. Amorsa ARN este eliminată de ADN polimeraza I şi spaţiile lipsă sunt completate prin acţiunea acestei enzime. Fragmentele sunt unite de ADN ligază.

• Acest mecanism duce la probleme legate de replicarea capetelor cromozomiale, numite telomere. Telomeraza rezolvă această problemă.

• Bucla de replicare la eukariote• Cel puţin 4 ADN polimeraze au fost identificate la

eucariote. Acestea sunt denumite prin litere greceşti α şi β sunt implicate în sinteza ADN nuclear, β în reparare şi γ în replicarea ADN mitocondrial.

• ADN polimerazele încep sinteza în numeroase puncte de iniţiere.

• În urma legării proteinelor specifice, dublul helix se deschide pentru a permite demarajul. Sinteza ADN începe pe amorsa ADN/ARN constituită de ARNprimază şi ADN polimeraza.

• Replicarea se desfăşoară într-o direcţie – în acest sens unul din cele 2 lanţuri de ADN (lanţul sens) este parcurs de enzimă în sensul 3-5 (pe catena antisens), ceea ce permite sinteza unui alt lanţ în direcţia 5-3.

• ADN ligazele asigură apoi legarea între diferitele fragmente ale ADN nou.

• Sinteza celeilalte catene (lanţul întârziat) este mult mai complexă deoarece enzima parcurge acest lanţ de la 5-3.

• Primaza şi ADN polimeraza sintetizează o amorsă de 30 nucletoide înainte de zona de replicare şi ADN polimeraza construieşte secvenţe mici de fragmente de ADN în sensul 5-3 (în jur de 200 nucleotide- fragmentele Okazaki).

• Ribonucleazele distrug amorsele ARN (fragmentele Okazaki sunt unite între ele prin ADN ligaze).

• Furca de replicare

• Replicarea începe prin separarea celor două catene ale ADN prin helicaze. Fiecare din cele două lanţuri sunt stabilizate prin SSB (single strand baund).

• Pe catena directă, urcând de la 3 la 5, o ADN polimeraza şi ARN primaza sintetizează un lanţ complementar adăugând dezoxiribonucleotide trifosfat la extremitatea 3OH liberă. Un nou dublu helix se formează între lanţul matriţă directă şi noua catenă sintetizată.

• Pe lanţul întârziat o polimerază, ADN polimeraza şi ARNprimaza progresează de la 53’.

• Pentru a putea sintetiza un lanţ complementar, trebuie ca ARNprimaza şi ADN polimerazei , să fabrice amorse destul de apropiate la câteva sute de nucleotide distanţa pe lanţul matriţă.

• Începând de la 3OH a unei amorse ADN polimeraza sintetizează un fragment Okazaki până când întâlneşte extremitatea 5 trifosfat a amorsei precedente.

• Topoizomeraza I şi helicaza

• -topoizomeraza este capabilă să modifice rularea hidrolizând o catenă de ADN şi reconstituind-o după ce a fost derăsucită local.

Înapoia polimerazelor şi topoizomerazelor, are loc reconstituirea dublului helix (împachetarea).

Topoizomeraza şi helicaza

• Primaza. Demararea acţiunii sale are loc la extremitatea 3OH terminală a lanţului ADN Ultima ribonucleotidă a amorsei, legată de catena ADN care serveşte ca model, va constitui punctul de iniţiere a activităţii ADN polimeraza .

• Amorsa este creată pornind de la o polimerază ARN paticulară (fără legătură cu cele de transcripţie), care poate începe prin a sintetiza 10 nucleotide a unui ARN hibrid, folosind un ADN model. Prima nucleotidă a acestei amorse se păstrează, cei 3 fosfaţi se prind la capătul celei de-a10-a dezoxiribonucleotide a ADN polimeraza şi începe condensarea a 20 dezoxiribonucleotide.

• Amorsa va fi construită deci dintr-o catenă mixtă ARN – ADN, din circa 30 nucleotide.

• ADN ligazele

• ADN ligazele sunt enzime care sunt capabile de reconstituirea legăturilor fosfodiester între 3OH şi fosfatul 5 a două nucleotide vecine dintr-un lanţ de ADN.

• Ele intervin în replicare pentru a lega ansamblul lanţului ADN sau fragmentelor Okazaki sintetizate de ADN polimeraze.

• Intervin de asemenea în numeroase procese de repararea a ADN genomic.

AND ligaza

• Telomerazele

• Sinteza lanţului întârziat a ADN, nu se poate face dacă ADN polimeraza atinge extremitatea 3 a catenei matrice. Dacă n-ar avea mecanisme particulare, la fiecare replicare ADN cromozomial ar fi scurtat.

• Telomerul sau secvenţa de ADN a extremităţilor cromozomilor, este o secvenţă 5TTAGGG-3 repetat de sute de ori înainte de 3OH final.

• Teleomeraza este o ADN polimerază care poate continua sinteza unui ADN monocatenar. Această enzimă conţine un ARN a cărei extremitate 5 terminală este 5 CUAAGCCUAAC 3’.

• Această extremitate serveşte ca model pentru enzimă în vederea sintezei câtorva unităţi de repetiţie TTAGGG.

• După această sinteză enzima glisează în lungul lanţului ADN şi reâncep noi unităţi. Extremitatea 3 a catenei matriţă astfel alungită poate servi pentru ataşarea unei amorse noi;

• extremitatea 3OH a acestei amorse serveşte deci ca punct de pornire pentru ADN polimeraza δ pentru sinteza acestui lanţ.