MINISTERUL SANATATII AL REPUBLICI MOLDOVACENTRUL NATIONAL DE SANATATE PUBLICA

Cu titlu de manuscrisC.Z.U: 578.821 .83 (043.2)

EDER VERONICA

STUDIBREA $I BVALUAREA VIRUSURILOR GRIPALE iNPERIOADELB PANDEMICA $I INTERBPIDEMICA

163.04 - MICROBIOLOGIE

Teza de doctor in gtiinfe biologice

Conducitor qtiinfific :

Autor:

ftk l_-z Spinu Constantin- a

l ' tv dr. hab. in medicini, profesor universitar,

Om Emerito Laureat al Premiului Na{ional,Centrul Nafional de Slnitate Publici

Eder Veronica

CHI$INAU,2or5

2

Eder Veronica, 2015

3

CUPRINS

ADNOTARE (n romn, rus i englez).......................................................................... 5

LISTA ABREVIERILOR.................................................................................................... 8

INTRODUCERE................................................................................................................... 9

1. EVOLUIA CAPACITILOR DE DIAGNOSTIC PRIVIND STUDIEREA I

EVALUAREA PARTICULARITILOR ETIOLOGICE ALE INFECIILOR

GRIPALE .

18

1.1 Aspecte etiologice ale infeciilor gripale i caracteristicile morfostructurale ale

virusurilor gripale ...................................................................................................

18

1.2 Caracteristica fenotipic i genotipic a virusurilor gripale........................................ 25

1.3 Diagnosticul de laborator: tehnici clasice i de biologie molecular de ultim

generaie......................................................................................

1.4 Concluzii la capitolul 1...............................................................................................

35

42

2. MATERIALE I METODE DE CERCETARE............................................................ 44

2.1 Liniaritatea cercetrilor i obiectul de studiu ..................................................... 44

2.2 Metodele de cercetare aplicate i volumul investigaiilor.......................................

2.3 Concluzii la capitolul 2...............................................................................................

44

54

3. STUDIEREA I EVALUAREA TULPINILOR DE VIRUSURI GRIPALE

IZOLATE I IDENTIFICATE N PERIOADA PANDEMIC ...............................

55

3.1 Particularitile virusurilor gripale n perioada pre-pandemic...................................

3.2 Rezultatele determinrii caracteristicilor tulpinilor de virusuri gripale n

perioada pandemic...................................................................................................

3.3 Studierea particularitilor tulpinilor de virusuri gripale n perioada

post-pandemic..........................................................................................................

3.4 Concluzii la capitolul 3...............................................................................................

55

62

70

80

4. EVALUAREA PARTICULARITILOR VIRUSURILOR GRIPALE N

PERIOADA INTEREPIDEMIC NTRU OPTIMIZAREA SUPRAVEGHERII

EPIDEMIOLOGICE I VIRUSOLOGICE A GRIPEI ...................................................

83

4.1 Rezultatele evalurii particularitilor virusurilor gripale n sezonul 2011-

2012.............................................................................................................................

83

4.2 Rezultatele evalurii particularitilor virusurilor gripale n sezonul 2012-

2013............................................................................................................................

4.3 Studierea i evaluarea particularitilor virusurilor gripale n sezonul 2013-2014....

88

101

4

4.4 Valorificarea rezultatelor obinute ntru optimizarea supravegherii epidemiologice

i virusologice a gripei................................................................................................

4.5 Concluzii la capitolul 4...............................................................................................

109

114

CONCLUZII GENERALE I RECOMANDRI........................................................... 116

BIBLIOGRAFIE................................................................................................................... 120

ANEXE...................................................................................................................................

ANEXA 1 Acte de implementare ..

ANEXA 2 Acreditarea laboratorului CNSP de ctre OMS ..

ANEXA 3 Chestionarul privind acreditarea de ctre OMS ..

ANEXA 4 Certificate de realizare a Programelor de Control Extern de Calitate .

ANEXA 5 Brevet de invenie ....

ANEXA 6 Diploma Cupa Marele Premiu ..

ANEXA 7 Diploma Medalia de aur ...

ANEXA 8 Diploma de decernare ..

ANEXA 9 Diploma de Excelen i Medalia de aur ......

ANEXA 10 Diploma Gala Premiilor n Sntate ..

140

141

145

146

147

154

156

157

158

159

160

DECLARAIA PRIVIND ASUMAREA RSPUNDERII .............................................. 161

CV-ul AUTORULUI ............................................................................................................ 162

5

ADNOTARE

Eder Veronica: Studierea i evaluarea virusurilor gripale n perioadele pandemic i

interepidemic, teza de doctor n tiine biologice, Chiinu, 2015. Structura tezei: introducere,

4 capitole, concluzii i recomandri, bibliografie (191 surse), 118 pagini de text de baz, 22

tabele, 47 figuri i 10 anexe. Rezultatele sunt publicate n 28 lucrri tiinifice. Cuvinte cheie:

virusuri gripale, HA, NA, grup genetic, sensibilitate la antivirale. Domeniu de studiu: 163.04 -

Microbiologie. Scopul lucrrii: Studierea i evaluarea particularitilor antigenice, fenotipice i

genotipice ale tulpinilor de virusuri gripale izolate i identificate n perioadele pandemic i

interepidemic n Republica Moldova ntru argumentarea msurilor de sntate cu optimizarea

sistemului naional de supraveghere epidemiologic i virusologic a gripei. Obiectivele

studiului: Determinarea i evaluarea tipurilor i subtipurilor de virusuri gripale evideniate n

perioada de studiu; studierea i evaluarea particularitilor antigenice ale tulpinilor de virusuri

gripale n perioadele pandemic i interepidemic; studierea i evaluarea particularitilor

genetice ale tulpinilor de virusuri gripale A i B n baza genelor HA i NA n perioadele

precutate n studiu; analiza caracteristicilor fenotipice cu evaluarea sensibilitii tulpinilor de

virusuri gripale la remediile antivirale de ultim generaie (oseltamivir, zanamivir) n perioadele

evideniate; valorificarea rezultatelor obinute i optimizarea supravegherii epidemiologice i

virusologice a gripei. Noutatea i originalitatea tiinific: n premier au fost obinute

rezultate originale privind particularitile antigenice, genotipice i fenotipice ale virusurilor

gripale circulante n perioadele pandemic i interepidemic. Problema tiinific: Evidenierea

i evaluarea particularitilor antigenice, genotipice i fenotipice ale virusurilor gripale circulante

n Republica Moldova, care au servit ca argumente i suport metodic ntru perfecionarea

continu a sistemului de supraveghere epidemiologic, clinic i virusologic la grip, IACRS i

SARI implementat, racordat la exigenele OMS, ECDC i CDC. Semnificaia teoretic. Acest

studiu a evideniat particularitile virusurilor gripale circulante n Republica Moldova, ceea ce a

permis de a identifica i evalua locul tulpinilor izolate n arborele filogenetic global, circumstane

extrem de importante pentru argumentarea formulei vaccinului gripal. Valoarea aplicativ a

lucrrii. Rezultatele au permis de a evidenia particularitile virusologice evolutive ale

procesului epidemic prin grip n perioadele nominalizate elemente semnificative utilizate n

perfecionarea sistemului naional de supraveghere la grip, IACRS i SARI ajustat la exigenele

OMS, ECDC, CDC. Implementarea rezultatelor tiinifice: Rezultatele obinute au servit la

valorificarea de noi metode standardizate de diagnostic al gripei, optimizarea monitorizrii

infeciilor gripale, IACRS i SARI pentru realizarea n timp real a msurilor adecvate de control

i rspuns n contextul integrrii n reelele de supraveghere regionale (EuroFlu/TESSy) i

globale (FluNet) ale OMS.

6

:

.

, , 2015. : , 4 ,

, (191 ), 118 , 22 ,

47 10 . 28 .

: , , , ,

. : 163.04 - .

: ,

. :

;

;

;

;

. :

,

. :

,

, ,

, ECDC CDC. :

,

. :

,

,

(EuroFlu/TESSy) (FluNet)

.

7

SUMMARY

Eder Veronica: The study and evaluation of influenza viruses in the pandemic and

interepidemic periods, PhD thesis in biological sciences, Chisinau, Republic of Moldova,

2015. Thesis structure: introduction, 4 chapters, conclusions and recommendations, bibliography

(191 sources), 118 pages of basic text, 22 tables, 47 figures, and 10 annexes. The results have

been published in 28 scientific papers. Keywords: influenza viruses, HA, NA, genetic group,

antiviral susceptibility. Field of research: 163.04 - Microbiology. The purpose of study: Study

and evaluation of antigenic, phenotypic and genotypic characteristics of influenza strains isolated

and identified in pandemic and inter-epidemic periods in Moldova. Research objectives: The

determination and evaluation of the types/subtypes of influenza viruses in the period of the

study; study and evaluation of antigenic specificities of influenza viruses strains in pandemic and

interepidemic periods; study and evaluation of genetic peculiarities of A and B influenza

viruses strains based on HA and NA genes in the mentioned periods; sensitivity analysis

evaluating phenotypic characteristics of influenza viruses strains to antiviral remedies of latest

generation (oseltamivir, zanamivir) in the highlighted periods; results achieved and optimize

epidemiological and virological influenza surveillance system. The scientific novelty and

originality: For the first time were obtained the original results on antigenic, genotypic and

phenotypic characteristics of circulating influenza viruses during pandemic and inter-epidemic

periods. Scientific problem: Highlighting and evaluation of features of influenza viruses

circulating in Republic of Moldova served as arguments and methodical support to continuous

improvement of implemented influenza, ARI and SARI epidemiological, clinical and virological

surveillance system, connected to the requirements of WHO, ECDC and CDC. The scientific

and practical value: The results allowed to highlight the virological peculiarities of influenza

epidemic evolution in mentioned periods significant items used in improving the national

influenza, ARI and SARI surveillance adjusted to the WHO, ECDC, CDC requirements.

Obtained results allowed to identify and evaluate the place of isolated strains in the phylogenetic

tree globally extremely important circumstances to argue influenza vaccine formulation. The

implementation of scientific results: The results of this research are used for clinical,

epidemiological and virological influenza, ARI and SARI surveillance system improving

through the implementation of new standardized methods of influenza diagnostics by approving

a series of documents in order to strengthen epidemiological surveillance, systematic monitoring

of influenza, ARI and SARI for achieving in real time the appropriate preventive and control

measures in the context of integration in regional (EuroFlu/TESSy) and global (FluNet)

surveillance networks of the WHO.

8

LISTA ABREVIERILOR

ADN acid dezoxiribonucleic

Ag antigen

ARI Acute Respiratory Infections

ARN acid ribonucleic

CDC Centers for Disease Control and

Prevention

CNSP Centrul Naional de Sntate Public

CSP Centru de Sntate Public

ECDC European Centre for Disease

Prevention and Control

FITC izotiocianat de fluorescein

GIHSN Global Influenza Hospital

Surveillance Network

GISN Global Influenza Surveillance

Network

GISRS Global Influenza Surveillance and

Response System

HA hemaglutinin

HAU uniti de hemaglutinare

IACRS infecii acute ale cilor respiratorii

superioare

IMSP Instituie Medico - Sanitar Public

IRVA infecii respiratorii virale acute

M, M1, M2 proteine matrice

NA neuraminidaz

NAI inhibitor al neuraminidazei

NEP nuclear export protein

NP nucleoprotein

NS1, NS2 proteine nestructurale

OMS Organizaia Mondial a Sntii

ORF open reading frame

PA proteaza acid

PB1, PB2 proteaze bazice

PBS soluie-tampon fosfat salin

PCR reacie de polimerizare n lan

(Polymerase Chain Reaction)

RHA reacie de hemaglutinare

RHAI reacie de inhibare a hemaglutinrii

rRT-PCR Real Time Revers Transcription

Polimerase Chain Reaction

SARI severe acute respiratory infections

SUA Statele Unite ale Americii

WHO World Health Organization

9

INTRODUCERE

Gripa i IACRS sunt maladii infecioase cu impact global, ce evolueaz n epidemii sau/i

pandemii soldate cu mortalitate crescut.

Virusurile gripale reprezint o problem permanent de sntate public pentru toate

rile, iar eforturile de a preveni mbolnvirile i rspndirea acestora sunt constante, dar i

considerabile.

Larg rspndite n ntreaga lume, virusurile gripale infecteaz nu numai omul, ci i

numeroase specii de animale domestice (cai, porci) i slbatice (nurc, foc, balen etc.) sau

psri (rae, pescrui, curcani, gini etc.) [1-4].

Variaia antigenic i circulaia virusurilor gripale ntre specii sunt cauza izbucnirilor

epidemice care au loc anual, mbolnvirile fiind favorizate de rspunsul imun neadecvat, chiar n

acele segmente de populaie care au fost anterior expuse infeciei gripale [1-4].

Epidemiile de grip se nregistreaz n fiecare an datorit variaiei antigenice minore

(antigenic drift). Acestea sunt mutaii nesemnificative n genele care codific HA i NA. Ele

constau n apariia lent de mutaii punctiforme n HA i NA n rezultatul circulaiei continue a

virusurilor gripale n populaiile parial imunizate. Structurile antigenice existente sufer

modificri de conformaie spaial i/sau modificri n compoziia unor aminoacizi. Protecia

imun fa de contactele anterioare cu virusul gripal se menine, dar este insuficient. Astfel, fa

de subtipurile existente ale virusurilor gripale, la om se reinstaleaz o susceptibilitate la

reinfectri multiple. De regul, astfel de succesiuni se produc n fiecare an [4-7].

De obicei, epidemiile de grip apar n perioada rece a anului: n Emisfera de Nord n

lunile noiembrie martie, n Emisfera de Sud lunile mai august. n regiunile tropice gripa nu

se manifest sezonier, ci se nregistreaz pe tot parcursul anului, fiind dependent, totui, de

schimbrile climei [3-5].

n Republica Moldova cea mai nalt morbiditate prin grip se nregistreaz, de obicei, n

luna februarie, ns au fost cazuri cnd cel mai nalt nivel de morbiditate prin grip s-a nregistrat

n lunile decembrie, ianuarie i martie [2, 3, 6, 8].

Durata epidemiei este de regul 1-2 luni (4-8 sptmni), dup care virusurile dispar. Una

din enigmele principale ale virusului gripal este faptul c n cea mai mare parte a anului ele

lipsesc n circulaia populaiei umane i nu se cunoate unde circul n perioada interepidemic,

cum i unde se produc modificrile antigenice (drift antigen). Se presupune c virusurile ar

circula i s-ar modifica n regiunile ecuatoriale, pe motiv c mbolnvirile prin grip aici se

nregistreaz pe toat perioada anului [1, 3-5].

10

Totodat, pe lng variaia antigenic minor, exist i variaie antigenic major

(antigenic shift), ce se ntlnete doar la virusul gripal de tip A. Mutaiile de tip shift reprezint o

form mult mai brutal de schimbri n virusul gripal A, ceea ce duce la apariia unui nou virus

gripal cu o nou combinaie a proteinelor HA i NA, care anterior nu a existat mult timp sau

niciodat n populaia uman. Dac acest virus apare n populaia uman, unde majoritatea este

lipsit de protecie sau exist o protecie nesemnificativ fa de aceast variant, virusul

obinnd abilitatea de a se transmite de la om la om, atunci aceste circumstane pot conduce la

apariia de pandemii de proporii. Important este faptul, c modificrile n structura antigenic nu

pot fi previzibile. Virusurile cu deosebiri genotipice i fenotipice semnificative fa de cele

antecedente apar la intervale neregulate de timp (10-40 de ani). Aceste modificri sunt

responsabile de apariia marilor pandemii de grip [1, 3-5].

Pe parcursul a ultimii 300 de ani s-au nregistrat 10 pandemii de grip, din care 4 au avut

loc n secolul XX [3-5, 9, 10]. Pandemia spaniol din 1918 a fost una din cea mai sever

dintre pandemiile cunoscute i descrise vreodat. Gripa spaniol a afectat peste 20,0% din

populaia globului avnd o evoluie foarte rapid. Timp de 10 luni gripa s-a rspndit n ntreaga

lume. n aceast perioad au fost afectate peste 400 milioane de persoane. Valuri repetate de

mbolnviri prin grip s-au nregistrat i n anii 1918-1919 i 1919-1920 cu o intensitate mai

mic. Atunci s-au mbolnvit cei care nu au suferit n primul val. Pandemia spaniol a fost

cauzat de un nou virus gripal A(H1N1), genomul cruia coninea poriuni de gene ale

virusurilor gripale aviare i porcine. Cei mai afectai au fost tinerii, btrnii i persoanele

imunocompromise. ntr-un singur an gripa spaniol a fcut mai multe victime dect ciuma

bubonic n patru ani (1347-1351) i dect Primul Rzboi Mondial, numrnd de la 50 la 100

milioane de decese. Cea mai nalt mortalitate s-a nregistrat la persoanele cu vrsta cuprins

ntre 20 i 40 ani, rata mortalitii fiind de 259 ori mai mare dect n cazul unei gripe obinuite.

Referitor la locul i debutul pandemiei sunt dou ipoteze: prima pandemia a debutat n

februarie-martie 1918 n SUA cu transmiterea ulterioar de ctre trupele americane n Europa, a

doua ipotez pandemia a debutat n ianuarie 1918 n China cu rspndirea ulterioar la Apus

[3-5, 9, 10]. Gripa asiatic a avut loc n 1957-1958 i a fost cauzat de virusul gripal

A(H2N2), pandemia fiind de intensitate mai mic dect cea din 1918. Pandemia a nceput n

februarie 1957 n Orientul ndeprtat i s-a rspndit rapid n ntreaga lume nregistrnd 2

miliarde de bolnavi i 1 milion de decese [3-5, 9, 10]. Gripa Hong Kong n 1968-1969 a

aprut gripa de tip Hong Kong cauzat de virusul gripal A(H3N2). Pandemia avnd severitate

medie, a afectat, n special, persoanele cu vrsta de 65 de ani, nregistrndu-se peste 1 milion de

decese [3-5, 9, 10]. Gripa Ruseasc n 1977-1978 a avut loc o pandemie relativ uoar

11

cauzat de virusul gripal A(H1N1) agent etiologic implicat n epidemia din 1950, astfel au avut

de suferit n primul rnd persoanele nscute dup acest an [3, 4, 10].

Apariia virusului gripal A(H5N1) n 1997 n Hong Kong , care a cauzat o epizootie

masiv printre psrile domestice afectnd concomitent 18 persoane cu moartea a 6 dintre ele, a

servit ca un semnal de apariie a unei noi pandemii de grip. Distrugerea la acel moment a cca

1,5 milioane de psri a stopat rspndirea virusului A(H5N1) printre psrile domestice i

populaia uman. Virusul gripal aviar A(H5N1) a reaprut printre psrile domestice n anul

2003 ntr-un ir de ri asiatice: Cambodia, China, Indonezia, Japonia, Laos, Thailanda, Vietnam,

Coreea. n 2004 din nou s-au nregistrat mbolnviri printre oameni. Distrugerea a peste 160

milioane de psri a contribuit la reducerea rspndirii infeciei cu virusul gripal A(H5N1). n

pofida faptului c acest virus a trecut bariera de specie cu afectarea nu numai a psrilor, dar i a

unor specii de mamifere (tigri, cini, pisici), totui transmiterea lui de la om la om a fost

limitat. Persoanele care s-au mbolnvit de grip cauzat de virusul A(H5N1) au avut contact

direct i nemijlocit cu psrile bolnave [3-5, 9, 10].

Cu apariia virusului gripal aviar A(H5N1) n 2003 a persistat pericolul declanrii unei

noi pandemii de grip. Dac la nceputul anului 2004 se credea, c noua pandemie va fi cauzat

de virusul gripal A(H5N1), atunci evenimentele din 2009 au demonstrat, c ngrijorrile

specialitilor n domeniu nu au fost n zdar [3-5, 9, 10].

Noua pandemie de grip, prima din secolul XXI, a debutat n aprilie 2009 n SUA

(California de Sud i Texas), fiind cauzat de virusul gripal de tip nou A(H1N1) numit "triplu

reasortant", deoarece genomul su conine gene ale virusurilor gripale porcine, umane i aviare.

Virusul de tip nou a aprut brusc, fiind detectat concomitent n alte 2 ri: Mexic i Canada.

Procesul epidemic prin infecia cu virusul gripal de tip nou A(H1N1) a evoluat foarte repede,

afectnd ntr-un timp scurt un numr mare de oameni de pe toate continentele. Aceste

evenimente au impus OMS s ridice la 11 iunie 2009 nivelul de alert pandemic de la faza 5 la

faza 6, ceea ce a nsemnat nceputul primei pandemii de grip din secolul XXI. Totodat OMS a

subliniat, c severitatea pandemiei date a fost moderat. Majoritatea persoanelor infectate s-au

recuperat i s-au nsntoit fr a necesita spitalizare sau tratament medical specific, iar numrul

cazurilor cu complicaii i decese a fost similar epidemiilor gripale sezoniere [3-6, 8-12].

n Republica Moldova, gripa i IACRS se nregistreaz n fiecare an, numrul cazurilor

de mbolnviri variind de la an la an i reprezint 2/3 din numrul total de maladii infecioase

nregistrate pe parcursul anului. Apariia n anul 2009 a unui nou subtip de virus gripal A(H1N1)

a cauzat pandemia de grip la nivel global, resimit i n Republica Moldova. Acest fapt a impus

fortificarea sistemului de supraveghere epidemiologic a gripei prin crearea strategiilor de

12

prevenire i control permanent, inclusiv prin sisteme speciale de monitorizare a gripei, IACRS i

SARI [3, 6, 8].

Monitorizarea circulaiei virusurilor gripale umane face parte din sistemul complex de

supraveghere a gripei. Anual, OMS monitorizeaz circulaia i profilul antigenic al virusurilor

gripale n vederea descifrrii n timp real a variantelor cu potenial epidemic i pandemic,

precum i a sensibilitii lor la produsele medicamentoase cu aciune antiviral, n special, a celor

de ultim generaie (oseltamivir, zanamivir) i profilul imunitii antigripale a populaiei cu

scopul preparrii vaccinului antigripal potrivit sezonului curent.

Lund n consideraie potenialul epidemic (pandemic) ale anumitor tipuri/subtipuri de

virusuri gripale, inclusiv impactul socio-economic al acestora asupra sntii publice se impune

necesitatea studierii i evalurii virusologice a tulpinilor de virusuri gripale izolate i identificate,

inclusiv i n Republica Moldova.

Scopul lucrrii: Studierea i evaluarea caracteristicilor antigenice, fenotipice i

genotipice ale tulpinilor de virusuri gripale izolate i identificate n perioadele pandemic i

interepidemic n Republica Moldova ntru argumentarea msurilor de sntate cu optimizarea

sistemului naional de supraveghere epidemiologic i virusologic a gripei.

Obiectivele lucrrii:

1. Determinarea i evaluarea tipurilor i subtipurilor de virusuri gripale evideniate n

perioadele de studiu.

2. Studierea i evaluarea particularitilor antigenice ale tulpinilor de virusuri gripale n

perioadele pandemic i interepidemic.

3. Studierea i evaluarea particularitilor genetice ale tulpinilor de virusuri gripale A i B n

baza genelor HA i NA n perioadele precutate n studiu.

4. Analiza caracteristicilor fenotipice cu evaluarea sensibilitii tulpinilor de virusuri gripale la

remediile antivirale de ultim generaie (oseltamivir, zanamivir) n perioadele evideniate.

5. Valorificarea rezultatelor obinute ntru optimizarea supravegherii epidemiologice i

virusologice a gripei.

Noutatea i originalitatea tiinific: n premier pentru Republica Moldova, au fost

obinute rezultate originale privind particularitile antigenice, genotipice i fenotipice ale

virusurilor gripale circulante n perioadele pandemic i interepidemic. Utilizarea, de rnd cu

metodele clasice, a tehnicilor de performan de biologie molecular (rRT-PCR, genotipare,

secveniere) n studierea tulpinilor de virusuri gripale a permis aprecierea i evaluarea poziiei

acestor virusuri n arborii filogenetici globali pentru fiecare gen n parte circumstane extrem

de importante pentru formularea coctailului vaccinal. Analiza i evaluarea susceptibilitii

13

tulpinilor de virusuri gripale circulante a demonstrat sensibilitatea lor la remediile antivirale de

ultim generaie, abordare extrem de important pentru perfecionarea msurilor de control i

rspuns.

Problema tiinific soluionat important const n evidenierea i evaluarea

particularitilor antigenice, genotipice i fenotipice ale virusurilor gripale circulante n

Republica Moldova, care au servit ca argumente i suport metodic ntru perfecionarea continu a

sistemului de supraveghere epidemiologic, clinic i virusologic la grip, IACRS i SARI

implementat, racordat la exigenele OMS, ECDC i CDC.

Semnificaia teoretic: Acest studiu a evideniat particularitile antigenice, genotipice

i fenotipice ale virusurilor gripale circulante n Republica Moldova, ceea ce a permis de a

identifica i evalua locul tulpinilor identificate n arborele filogenetic global, circumstane extrem

de importante pentru argumentarea formulei vaccinului gripal.

Valoarea aplicativ a lucrrii: Rezultatele obinute pe parcursul realizrii acestui studiu

au permis de a evidenia particularitile virusologice de evoluie a procesului epidemic prin

grip n perioadele pandemic i interepidemic elemente semnificative utilizate ulterior n

perfecionarea sistemului naional de supraveghere la grip, IACRS i SARI ajustat la exigenele

OMS, CDC i ECDC. Graie perfecionrii, n corespundere cu strategiile organismelor

internaionale nominalizate, sistemul de supraveghere autohton a fost integrat n reelele de

supraveghere european EuroFlu/TESSy i global FluNet.

Sistemul de supraveghere nominalizat permite de a evalua n timp real particularitile

tulpinilor de virusuri gripale circulante, potenialul lor epidemic/pandemic, sensibilitatea la

antivirale, pronosticul situaiei epidemiologice i volumul de investigaii cu msuri specifice i

nespecifice de profilaxie n situaii de urgen.

Implementarea rezultatelor tiinifice: Rezultatele obinute la realizarea cercetrilor

tiinifice n cadrul acestui studiu au servit la perfecionarea sistemului de supraveghere clinico-

epidemiologic i virusologic la grip, IACRS i SARI prin implementarea de noi metode

standardizate de diagnostic al gripei, recunoaterea de ctre organismele internaionale

nominalizate a subdiviziunii de profil a CNSP ca Centru Naional de Grip i prin aprobarea unui

ir de acte normative, n special, a Planului-cadru intersectorial gradual pentru combaterea

efectelor pandemiei cu virusul gripal nou A(H1N1) n Republica Moldova, aprobat prin

Hotrrea Guvernului nr. 824 din 15.12.2009 i a Ordinului Ministerului Sntii nr. 824 din

31.10.2011 Cu privire la perfectarea sistemului de supraveghere la grip i infeciile acute ale

cilor respiratorii n Republica Moldova n scopul fortificrii supravegherii epidemiologice,

monitorizrii sistematice a circulaiei infeciilor gripale, IACRS i SARI pentru realizarea n

14

timp real a msurilor adecvate de prevenire i control i n contextul integrrii n reelele de

supraveghere regionale (EuroFlu/TESSy) i globale (FluNet) ale Organizaiei Mondiale a

Sntii.

Aprobarea rezultatelor tiinifice: Direciile studiate i rezultatele obinute la realizarea

acestui studiu au fost prezentate i discutate n cadrul forurilor tiinifice naionale i

internaionale: Conferina tiinifico-Practic cu Participare Internaional CMP Chiinu

trecut, prezent i viitor, Chiinu, 23 octombrie 2009; A doua Conferin Naional de

Microbiologie i Epidemiologie, Sinaia, Romnia, 14-16 octombrie 2010; Congresul Naional de

Microbiologie i Conferina Naional de Epidemiologie, Iai, Romnia, 10-12 noiembrie 2011;

International Conference on Emerging Infectious Diseases, Atlanta, Georgia, USA, March 11-

14, 2012; Conferina a VII-a a medicilor-infecioniti din Republica Moldova, Chiinu, 2012;

3rd International Influenza Meeting, Muenster, Germany, September 2nd

4th

, 2012; -

i II

I I, K, , 10 2012; European Scientific

Conference on Applied Infectious Disease Epidemiology (ESCAIDE), Edinburgh, UK, 24-26

October 2012; The second isirv-Antiviral Group Conference in conjunction with NIHE. Severe

Influenza: Burden, Pathogenesis and Management, Hanoi, Viet Nam, 29th 31st October 2012;

23rd

Annual Meeting of the Society for Virology, Kiel, Germany, 6-9 March 2013; Options for

the Control of Influenza, Cape Town, South Africa, 5-10 September 2013; The XIX-th Session

of the Balkan Medical Days and the Second Congress of Emergency Medicine of the Republic of

Moldova, Chisinau, Republic of Moldova, 22-24 September 2013; -

, 90-

, . .. ,

, 2013; Congresul specialitilor din domeniul Sntii Publice i Management Sanitar

din Republica Moldova, Chiinu 25-26 octombrie 2013; A XII-a Ediie a Salonului

Internaional al Cercetrii, Inovrii i Inventicii PRO INVENT 2014, Cluj-Napoca, Romnia,

19-21 martie 2014; Third ISIRV-AVG Conference Influenza and other Respiratory Virus

Infections: Advances in Clinical Management 4th-6th June 2014, Tokyo, Japan; The XVIII-th

International Exhibition of Research, Innovation and Technological Transfer INVENTICA

2014, Iasi, Romania, 2-4 July 2014; 4th International Influenza Meeting, Muenster, Germany,

September 21-23, 2014; Conferina Centrul de Sntate Public din municipiul Chiinu 70 de

ani la Straja Sntii, Chiinu, Republica Moldova, 22 octombrie 2014; A VII-a Conferin

Naional de Microbiologie i Epidemiologie, Bucureti, Romnia, 12-14 Noiembrie 2014;

15

Salonul Internaional de Inventic PRO INVENT, Ediia a XIII-a, Cluj-Napoca, Romnia, 25-27

martie 2015.

Rezultatele cercetrilor au fost discutate i aprobate la edina Centrului Controlul Bolilor

virale al Centrului Naional de Sntate Public (Proces verbal nr. 3 din 16.12.2014), la edina

Consiliului tiinific al CNSP (Proces verbal nr. 1 din 20.01.2015), i la edina Seminarului

tiinific de profil, specialitatea 163.04 Microbiologie, din cadrul Institutului de Microbiologie

i Biotehnologie al AM (Proces verbal nr. 2 din 02.04.2015),

Publicaii la tema tezei: Rezultatele cercetrilor sunt reflectate n 28 lucrri tiinifice (2

din ele fr coautori), inclusiv: 6 articole n reviste tiinifice naionale, 2 articole n reviste

tiinifice internaionale (cotate ISI IF = 4.659 i SCOPUS), 1 tez a comunicrii la nivel

naional, 17 teze ale comunicrilor internaionale, 1 brevet de invenie MD 782 Z publicat n

Buletinul Oficial de Proprietate Industrial (BOPI) nr. 6, 30 iunie 2014.

Volumul i structura tezei: Teza este scris n limba romn, tehnoredactat la

calculator, compartimentat tradiional i include: foaia de titlu, foaia privind dreptul de autor,

rezumate n limbile romn, englez i rus, lista abrevierilor, cuprins, introducere, cuvinte-

cheie, 4 capitole, concluzii i recomandri practice, referine bibliografice, anexe, declaraia

privind asumarea rspunderii, CV-ul autorului. Teza este expus pe 118 pagini de text cules la

calculator n editorul Word, este ilustrat cu 22 tabele, 47 figuri, 10 anexe. Teza este

fundamentat pe 191 referine bibliografice.

Sumarul compartimentelor tezei

n Introducere sunt argumentate actualitatea, importana i necesitatea cercetrii

tiinifice efectuate, este reflectat situaia actual n domeniu, sunt formulate scopul i

obiectivele studiului. Descrierea i expunerea inovaiei tiinifice i a rezultatelor obinute

confirm aspectul tiinific al studiului efectuat i importana lui pentru medicin, n special

pentru sntatea public.

Capitolul 1. EVOLUIA CAPACITILOR DE DIAGNOSTIC PRIVIND

STUDIEREA I EVALUAREA PARTICULARITILOR ETIOLOGICE ALE

INFECIILOR GRIPALE cuprinde o sintez a bazelor teoretice, inclusiv rezultatele

cercetrilor tiinifice privind etiologia, caracteristicile antigenice, fenotipice i genotipice ale

virusurilor gripale efectuate de ctre cercettorii i specialitii din acest domeniu. Sunt expuse

principalele repere existente n domeniul de cercetare la nivel naional, european i mondial.

Sunt descrise studii tiinifice importante, efectuate n ultimul deceniu, privind evaluarea

particularitilor etiologice, inclusiv particularitile antigenice, fenotipice i genotipice ale

virusurilor gripale circulante la nivel de mapamond. Sunt argumentate scopul i obiectivele tezei

16

prin analiza profund a referinelor bibliografice recente ale savanilor contemporani cu renume

internaional. n concluzii sunt nominalizate premisele care au stat la baza iniierii acestui studiu.

Capitolul 2. Materiale i metode include reflectarea detaliat a metodologiei,

metodelor i materialelor de cercetare folosite n cadrul studiului tiinific efectuat. Acesta

include metode descriptive, virusologice, imunologice, de biologie molecular, analitice i

statistice.

n calitate de materiale de studiu au fost folosite 9799 de probe codificate cu material

biologic colectat de la pacienii cu diagnosticul prezumtiv Grip, IRVA i SARI, 127

tulpini de virusuri gripale izolate din probele pozitive la prezena ARN virusurilor gripale

circulante, 78 tulpini cercetate pentru evaluarea particularitilor genotipice ale virusurilor

gripale la nivelul genei HA i 71 tulpini evaluate genetic pentru gena NA.

Capitolul 3. Studierea i evaluarea tulpinilor de virusuri gripale izolate i

identificate n perioada pandemic elucideaz rezultatele unei cercetri moderne, cu aplicarea

n premier pentru Republica Moldova a tehnicilor de biologie molecular n diagnosticarea

gripei. Sunt prezentate rezultatele evidenierii particularitilor antigenice, genotipice i

fenotipice ale virusurilor gripale circulante n perioadele evideniate, caracterizate prin

similaritate antigenic cu tulpinile vaccinale, apartenena la grupurile genetice n baza arborilor

filogenetici globali, sensibilitatea la remediile antivirale de ultim generaie. Rezultatele obinute

au permis de a confirma procesul evolutiv al virusurilor gripale de la o perioad la alta (pre-

pandemic pandemic post-pandemic) prin variaii antigenice majore, manifestat prin

apariia n circulaie a unei tulpini noi de virus gripal A(H1N1)pdm i substituia din circulaie a

virusului gripal sezonier A(H1N1) cu virusul gripal A(H1N1)pdm.

Capitolul 4. Evaluarea particularitilor virusurilor gripale n perioada

interepidemic ntru optimizarea supravegherii epidemiologice i virusologice a gripei

include evidenierea particularitilor care influeneaz n timp evoluia virusurilor gripale, fapt

ce a permis de a extrapola concordana rezultatelor obinute n acest studiu la datele selectate din

literatura internaional, i anume prin confirmarea procesului evolutiv al virusurilor gripale de la

un sezon la altul prin variaii antigenice minore.

Rezultatele studiului au permis valorificarea sistemului de supraveghere clinico-

epidemiologic i virusologic la grip, IACRS i SARI de tip sentinel racordat la exigenele

OMS, ECDC i CDC prin implementarea i valorificarea algoritmului de investigaii ce in de

evaluarea particularitilor antigenice, genotipice i fenotipice ale virusurilor gripale, ceea ce

contribuie la studierea tulpinilor de virusuri gripale n cadrul Reelei Globale de Supraveghere i

17

Rspuns la Grip (GISRS) din cadrul Reelei Globale de Supraveghere la Grip al OMS (WHO

GISN).

Rezultatele lucrrii sunt utilizate n cadrul reelei WHO GISN, fapt ce contribuie la:

aprecierea formulei coctailului vaccinal antigripal pentru fiecare sezon; depistarea ct mai

precoce a noilor substituii de aminoacizi care ar putea influena patogenitatea, tropismul i

capacitatea de transmisie a virusurilor gripale de la o specie la alta; evidenierea factorilor

determinani ai reasortrii virusurilor, n special n apariia de noi virusuri cu potenial pandemic,

inclusiv rezistente la remediile antivirale aflate n uz, pentru evaluarea remediilor antivirale noi

orientate spre ajustarea unui tratament antiviral adecvat.

Rezultatele studiului efectuat n laboratorul Epidemiologia infeciilor respiratorii virale

din cadrul CNSP cu valorificarea lor n practic, au permis de a fortifica sistemele de

supraveghere clinico-epidemiologic i virusologic la grip, IACRS i SARI naional i

sentinel cu realizarea msurilor de control i rspuns. De asemenea, rezultatele expuse au fost

utilizate n procesul de acreditare a laboratorului nominalizat de ctre OMS, care a fost

recunoscut ca Centru Naional de Grip inclus n Reeaua Global de Supraveghere la Grip

(GISN) prin intermediul Sistemului Global de Supraveghere i Rspuns la Grip al OMS (WHO

GISRS).

18

1. EVOLUIA CAPACITILOR DE DIAGNOSTIC PRIVIND STUDIEREA I

EVALUAREA PARTICULARITILOR ETIOLOGICE

ALE INFECIILOR GRIPALE

1.1. Aspecte etiologice ale infeciilor gripale i caracteristicile morfostructurale ale

virusurilor gripale

Infeciile gripale, ce se declaneaz regulat i sezonier prin epidemii i periodic (la diferit

interval de timp: 10-40 ani) prin pandemii, au un impact negativ att asupra sntii publice,

sistemului de sntate, ct i asupra economiei naionale, i astfel, impun eforturi considerabile

de control i rspuns.

Gripa este provocat de virusurile gripale din familia Orthomyxoviridae, genul Influenza

virus, care include virusurile gripale de tip A, B i C cu genom ARN, monocatenar, segmentat,

de sens negativ.

Virusul gripal A pentru prima dat a fost izolat n 1930 de la porci, de ctre virusologul

american Richard Shope, ns primul caz de infectare a omului cu grip porcin a fost atestat cu

trei ani mai nainte [1-3]. De la oameni, virusul a fost izolat n 1933, de un grup de cercettori

englezi Wilson Smith, Cristofer Andrews i Patrick Laidlow. Virusul gripal A este unul din cele

mai cunoscute i mai nfricotoare dintre virusurile gripale, cauznd cele mai serioase epidemii

i pandemii n istoria omenirii cu o rat extrem de nalt de spitalizri i decese [6, 15-18].

Virusul gripal B, a fost descoperit n 1940 de ctre virusologul american Thomas Francis-

Junior. Dup gradul de virulen, contagiozitate i semnificaie epidemic, virusul gripal B,

mereu a cedat n faa virusului gripal A. Acest virus nu cauzeaz pandemii, ns este un agent

patogen al focarelor epidemice moderate, soldate uneori cu spitalizri i cazuri de deces [6, 15-

18].

Virusul gripal C a fost izolat pentru prima dat n 1947 de ctre virusologul american

Richard Taylor. Spre deosebire de virusurile gripale A i B, virusul gripal C cauzeaz infecii

respiratorii uoare, similare rcelilor banale, ns la copiii mici poate evolua destul de grav.

Pentru virusul gripal C este caracteristic o stabilitate major a proprietilor antigenice i

biologice comparativ cu virusurile A i B. De obicei nu cauzeaz epidemii, poate doar s

nsoeasc epidemiile de grip A i B i nu are impact sever asupra sntii publice [6, 15-18].

Genomul virusurilor gripale este de tip ARN monocatenar, de sens negativ, segmentat.

Numrul de segmente difer n funcie de tipul viral: virusurile gripale A i B au genomul

constituit din 8 segmente, iar virusul gripal C din 7 segmente. De asemenea, aranjarea anumitor

fragmente/segmente de ARN n virion pentru fiecare tulpin de virus gripal n parte, poart un

caracter individual [1, 5]. Cercetrile din mijlocul sec. XX au stabilit c ARN virusurilor gripale

19

este segmentat datorit proprietilor lor deosebite: rata nalt de recombinare; participarea la

reactivri multiple i ncruciate; reasortarea care are loc n natur, ceea ce sporete diversitatea

genetic a virusului; precum i inactivarea diverselor funcii ale virusului gripal cu anumii

ageni chimici i raze UV [5, 6, 16, 18].

Din cele 8 fragmente ale ARN viral 7 codific proteinele structurale i doar un singur

fragment (segmentul 8) proteinele nestructurale (NS1 i NS2), funciile crora sunt legate de

reproducerea virusului gripal. n general, genomul virusului gripal codific cel puin 12

(cunoscute n prezent) proteine virale, majoritatea dintre ele sunt necesare pentru replicarea

eficient a virusului n celula-gazd i la structurarea virionilor [5, 6, 18, 19].

Genomul viral mpreun cu proteinele virale: proteaza acid (PA), proteazele bazice (PB1

i PB2) i nucleoproteina (NP) formeaz nucleocapsida. Cea din urm fiind protejat de ctre

nveliul viral, derivat, de facto, din membrana celulei-gazd n timpul exocitozei (figura 1.1).

Fig. 1.1. Structura virusului gripal [19].

nveliul viral este compus predominant din proteinele de suprafa hemaglutinina (HA),

neuraminidaza (NA) i proteinele matri (M: M1 i M2). HA este responsabil de ataarea

particulei virale la receptorii celulei-gazd (acidul sialic) i de ptrunderea virusului n celul, n

special, n procesul contopirii membranei virale cu cea celular. NA nltur acidul sialic de la

HA pentru a-i facilita ptrunderea n celul i participarea n urmtoarele etape de reproducere a

virusului. Totodat, NA conduce la eliberarea particulelor virale de pe suprafaa celulei i

rspndirea virusului n tractusul respirator [5, 6, 19, 20].

Proteinele matri (M: M1 i M2) sunt componente ale stratului lipidic intern al

nveliului viral, fapt ce rezult n interaciunea proteinei M cu HA i NA. Proteina M1 este

mediatorul aranjamentului dintre nucleocapsida helicoidal i nveliul viral, astfel participnd la

structurarea virionului. Pe cnd, proteina M2 (prezent doar n virusurile gripale de tip A)

20

reprezint, de fapt, un canal ionic, care regleaz pH n procesul dezbrcrii virusului n

endosomi i n aparatul Golgi, unde i are loc sinteza HA. n acest caz, crearea unui pH acid este

o condiie absolut necesar n procesul de eliberare a virusului i stabilizare a conformrii HA n

timpul transportului lui intracelular, asigurnd astfel, existena mecanismului de interaciune

cooperativ a structurilor interne cu glicoproteinele externe i canalele ionice ale membranei

lipidice a virusului gripal (figura 1.1) [5, 6, 11, 19-22].

Dat fiind faptul, c principalii determinani antigenici ai virusurilor gripale A i B sunt

HA i NA glicoproteine transmembranare, ele sunt capabile s induc rspunsuri subtip-

specifice i imun, care sunt pe deplin protective n cadrul subtipului i numai parial protective

ntre diferite subtipuri. n baza antigenicitii acestor glicoproteine, virusurile gripale A, la

momentul actual, sunt grupate n 16 subtipuri de HA (H1-H16) i 9 subtipuri de NA (N1-N9).

Anume combinaia dintre diferitele subtipuri de HA cu diferitele subtipuri de NA i se numete

subtip viral: din 144 (16 x 9) subtipuri teoretic posibile, n prezent se cunosc 115, dintre care la

om au fost identificate subtipurile H1, H2, H3 de HA i N1, N2 de NA (i anume virusurile

gripale A(H1N1), A(H2N2), A(H3N2)). Aceste grupri devin considerabile cnd se efectueaz

analiza filogenetic a nucleotidelor i sunt deduse secvenele de aminoacizi ale genelor de HA i

NA respectiv [5, 6, 16-19].

Nomenclatura convenional a tulpinilor de virusuri gripale este folosit pentru codarea

lor i necesit conotarea tipului de virus gripal, specia gazdei (omis n cazul originii umane a

virusului), originea geografic, numrul de serie i anul izolrii, i numai pentru virusul gripal A

n paranteze se indic subtipurile de HA i NA ex. A/HongKong/156/97 (H5N1) tulpin de

virus gripal de tip A, izolat de la om, originea geografic Hong Kong, din proba nr. 156, n

anul 1997, cu subtipul H5N1 [5, 6, 15-18].

Variaia antigenic i circulaia virusurilor gripale ntre specii sunt cauza izbucnirilor

epidemice care au loc anual, mbolnvirile fiind favorizate de rspunsul imun neadecvat, chiar n

acele segmente de populaie care au fost anterior expuse infeciei gripale. Variaia antigenic este

particularitatea fundamental a virusurilor gripale A i B, care are loc la nivelul antigenelor de

suprafa HA i NA, reprezentnd astfel, un mecanism evolutiv de adaptare a virusurilor pentru

asigurarea supravieuirii lor ca specie [5, 6, 9, 15-18, 20, 22, 23].

Se cunosc dou mecanisme ale variaiei antigenice: minor (antigenic drift) i major

(antigenic shift). Variaia antigenic minor se ntlnete la toate tipurile de virusuri gripale, ns

totui, se presupune c virusul gripal C nu se supune drift-ului antigenic, deoarece mutaiile n

gena HA nu poart caracter consecvent. Totodat, att variaia antigenic minor drift-ul

antigenic, ct i cea major shift-ul antigenic se ntlnesc la virusul gripal de tip A. Acest fapt

21

poate fi explicat prin numeroasele epidemii, care au loc n fiecare sezon rece, ct i prin

cunoscutele pandemii de grip descrise n baza investigaiilor efectuate de ctre numeroi

cercettori virusologi [5, 6, 9, 15, 18, 24]. Drift-ul antigenic apare n rezultatul mutaiilor

punctiforme n genomul viral, ceea ce conduce, la rndul su, la modificarea proteinelor

determinanilor antigenici pn la pierderea capacitii de recunoatere de ctre sistemul imun al

gazdei. Anume mutaiile, inclusiv nlocuirile, deleiile i inseriile sunt responsabile de apariia

variantelor antigenice noi. Sub aciunea imunitii colective are loc selecia virusurilor, ce se

deosebesc dup caracteristicile antigenelor de suprafa de tulpina patern iniial. Cu toate

acestea, gene aparte ale virusurilor gripale umane acumuleaz mutaii cu o vitez aproximativ

constant, ceea ce permite de a meniona despre timpul molecular al virusului gripal. Variaiile

antigenice (drift) ale virusurilor gripale A i B apar i domin timp de 2-5 ani i numai dup

aceasta sunt nlocuite cu o alt diversitate antigenic [6, 16, 18, 20].

Pn la sfritul anilor 70 ai sec. XX era recunoscut ideea c subtipurile virusului gripal

A se schimb reciproc n mod consecutiv. n aceeai perioad savantul virusolog E. Kilbourn a

atestat faptul, c fiecare serotip al virusurilor gripale A umane imediat l nlocuiete pe

predecesorul su i singur va fi nlocuit de urmtorul. ns, cercetrile i studiile ulterioare ale

agenilor patogeni ai sezoanelor epidemice au demonstrat c lucrurile nu stau aa dup cum se

menionase. Astfel, particularitile etiologice ale gripei contemporane sunt prezentate de

cocirculaia a dou subtipuri de virus gripal A: A(H1N1) i A(H3N2), precum i a virusului

gripal de tip B, avnd, ns, fiecare din ele semnificaie epidemic diferit [15, 18, 25, 26].

n contrast, shift-ul antigenic, denot o schimbare momentan i profund n

determinanii antigenici, cu alte cuvinte, o nlocuire a ambilor sau a unuia din subtipurile de HA

i NA, ntr-un singur ciclu de replicare. Aceasta are loc n celula care este infectat simultan cu

dou sau mai multe virusuri gripale de tip A de diferite subtipuri. Odat ce distribuirea

segmentelor replicate ai genomului viral n interiorul virionului nou format are loc independent

de originea subtipului fiecrui segment, atunci poate s apar un aa virion, capabil deja de

replicare, care va purta informaia genetic a diferitor virusuri parentale (aa-numiii reasortani)

[5, 6, 9, 15-18, 23, 26].

n general, numeroasele teorii despre apariia variantelor pandemice a virusurilor gripale

pot fi divizate n ipotezele antroponozic i zooantroponozic. Se presupune, c una din

modalitile de meninere a virusului gripal A n populaia uman este persistena lui n

organismul uman. Asemenea presupunere a fost bazat pe cercetrile care au stabilit, c dup

ncheierea ciclului pandemic virusul gripal foarte repede disprea din circulaie. Conform

ipotezei date, virusul gripal n organismul uman trecea ntr-o form inactiv, care, ns, peste mai

22

multe luni sau chiar ani, el putea s se reactiveze. Reiese, c prezena infeciei latente i

persistente poate explica mecanismul shift-ului antigenic i includerile repetate n circulaie a

principalelor subtipuri ai virusului gripal de tip A [5, 6, 15, 26].

Urmrind istoria ciclurilor pandemice ale virusului gripal A, a putut fi confirmat ipoteza

persistenei virusurilor gripale prin reapariii repetate la diferit interval de timp, fapt ce nu

exclude posibilitatea persistenei lui n rezervorul animal. Pe de alt parte, exist date veridice, c

virusurile de origine aviar, uman i porcin clasic au un strmo comun i anume virusul

gripal de origine aviar. Unii cercettori presupun, c anume virusul gripal aviar trece bariera de

specie, infectnd la nceput porcii, apoi dup o anumit adaptare, alte mamifere, i ulterior,

nimerete n populaia uman. Acest fapt, a putut fi urmrit n 1918, cnd a aprut pandemia de

grip spaniol, determinat de virusurile gripale ale mamiferelor, HA crora era strns legat

de varianta HA aviare [4-7, 9, 15-18, 20, 22, 23, 25, 27-29].

Modalitatea cu care virusul gripal este capabil s treac periodic bariera de specie poate

explica ipoteza despre prezena n una din genele polimerazice a mutaiei care duce la sporirea

gradului de variabilitate a agentului, la apariia a unui numr considerabil de variante i la

crearea unor condiii mai bune pentru adaptarea n organismul diferitor specii de animale i

psri. ntru confirmarea ipotezei date au fost aduse dovezi, care au demonstrat c HA virusurilor

gripale A(H1N1) izolate de la porcinele bolnave din Europa de Nord a fost nrudit antigenic i

genetic cu HA aviar. Apoi, aceste virusuri porcine noi au putut din nou s treac bariera de

specie i s provoace o epizootie la curcani fr producerea de variaii genetice. Aceti ageni se

caracterizau printr-o instabilitate extrem, variabilitate i vitez de evoluie nalte. Faptul dat ar

putea explica fenomenul istoric de trecere a barierei de specie a virusului gripal aviar, astfel

fcnd posibil apariia unei linii clasice stabile de virus gripal porcin n SUA [5, 18, 24, 30].

Un alt mecanism posibil al shift-ului antigenic, n rezultatul cruia au aprut dou tulpini

pandemice de virusuri gripale este reasortarea genelor virale. n prezent sunt dovezi

convingtoare asupra faptului, c tulpinile pandemice asiatic A(H2N2) (1957) i de Hong

Kong A(H3N2) (1968) au aprut n rezultatul reasortrii virusurilor umane i aviare; genele

HA, NA i a unei proteine din complexul polimerazic avnd origine aviar. Alte gene ale acestor

tulpini pandemice sunt similare cu genele analoage ale virusurilor gripale umane anterioare

A(H1N1) i A(H3N2). Cu toate acestea, porcinele fiind sensibile att fa de virusurile gripale

umane, ct i fa de cele aviare, au putut fi gazde intermediare pentru formarea variantelor shift

(figura 1.2) [5, 18, 21, 24].

23

Fig. 1.2. Mecanismul shift-ului antigenic [6].

Astfel, similaritatea genofondului virusurilor gripale de tip A umane i ale altor specii de

mamifere n biosfer acord o actualitate deosebit fenomenului de participare a virusurilor

gripale animale i aviare n formarea variantelor pandemice. Totodat, trebuie de menionat, c

24

semnificaie epidemic considerabil pentru umanitate, pe parcursul studierii virusurilor gripale

au avut doar 3 subtipuri de virusuri gripale A: A(H1N1), A(H2N2) i A(H3N2) [18, 23].

Aa dar, pandemiile de grip au loc atunci, cnd i face apariia un nou virus gripal, la

care marea majoritate a populaiei umane de pe glob nu are protecie imun sau aceasta este

foarte slab, care are un potenial nalt de infectare a oamenilor provocnd cazuri clinice de boal

i cu o transmisibilitate nalt de la persoan la persoan. Aceste particulariti rezult ntr-un

impact de talie global a infeciei gripale ce afecteaz un procent considerabil de persoane i

cauzeaz o sporire a nivelului de mortalitate [1, 4, 6, 9, 16-18, 20, 23-36].

Practic, ntru confirmarea celor expuse mai sus poate fi adus exemplul ultimei pandemii

din irul istoric care i a avut loc n 2009-2010 prima pandemie a sec. XXI. Aceast pandemie,

de o severitate moderat, a fost provocat de un nou virus gripal reasortant A(H1N1)pdm09.

Analiza genetic a acestui virus pandemic a dezvluit o nou combinaie a genelor virusurilor

umane, porcine i aviare eurasiatice. Virusul conine genele HA, NP i NS ale virusului clasic de

origine porcin, genele PB2 i PA ale virusurilor aviare nord americane, gena PB1 a virusurilor

H3N2 de origine uman i genele NA i M ale virusurilor porcine eurasiatice similare celor

aviare. Nu se exclude probabilitatea, c acest virus provine de la virusurile porcine triplu

reasortante circulante la porcine n perioada anilor 1997-1998 coninnd genele HA, NA i PB1

similare virusurilor umane i genele interne PB2 i PA de origine aviar [4, 7, 15, 16, 20, 23, 30,

37, 38]. Cercetrile, ns, au demonstrat c aceste virusuri sunt srace n determinani moleculari

specifici pentru adaptarea la gazda uman, astfel sugernd un rol nc necunoscut/nedocumentat

a marcherilor moleculari asociat transmisiei umane [7, 11, 20, 28, 30, 38-51]. Aceste virusuri, n

consecin, nu posed marcheri asociai cu virulena nalt sau patogenitatea care au fost

observate la virusul H1N1 din 1918 sau patogenitatea nalt a virusurilor H5N1 [12, 21, 30, 42].

Totodat, analiza filogenetic a demonstrat c secvena de HA a tulpinii de virus gripal

A(H1N1)pdm 09 cel mai mult se aseamn cu cea a tulpinii din 1918 i a fost antigenic distinct

de virusurile H1N1 umane recente, precum i de componenii vaccinurilor. Antigenic, ns,

virusurile A(H1N1)pdm09 sunt omogene i printre tulpinile istorice de virusuri gripale, sunt cele

mai similare cu virusurile gripale porcine A(H1N1) clasice (triplu reasortant) [20, 21, 23, 28, 30,

42, 52].

Printre virusurile A(H1N1)pdm09 analizate au existat doar cteva substituii de

aminoacizi la nivel de HA, i nici una din ele nu au avut efect antigenic. Deci, variaia antigenic

printre virusurile A(H1N1)pdm09 circulante n populaia uman este la moment mai mic fa de

cea observat n timpul unui sezon gripal tipic [15, 20, 23].

25

Cu toate acestea, s-a atestat c virusul A(H1N1)pdm09 posed o transmisibilitate nalt i

are un avantaj biologic distinct n replicare, transmisie, tropism i patogenez n comparaie cu

ambele virusuri sezoniere reprezentative A(H1N1) i A(H3N2). Similaritatea n manifestrile

epidemiologice ale acestei tulpini de virus gripal a fost observat n populaie att n emisfera

nordic, ct i n cea sudic [15, 21, 30, 42, 48, 53-55].

Astfel, pe msur ce cunoatem mai mult despre virusurile gripale, un efort considerabil

este necesar pentru a rspunde la ntrebrile: care sunt factorii determinani n transmisia

virusului de la o specie la alta; care sunt factorii ce determin reasortarea virusurilor, - factori

critici n apariia unor noi virusuri pandemice. La nivel global, ns, exist posibilitatea de a

urmri evoluia virusurilor gripale, practic n timp real, ceea ce ne poate asigura cu informaii

inestimabile ntru stabilirea factorilor ce determin patogenitatea i/sau transmisibilitatea lor.

1.2. Caracteristica fenotipic i genotipic a virusurilor gripale

Virusurile gripale se caracterizeaz printr-o structur unical a genomului, dar i prin

instabilitate genetic, fapt datorat mutaiilor punctiforme i evenimentelor de reasortare, ceea ce

contribuie la apariia noilor variante sau tulpini de virusuri gripale cu potenial epidemic sau

pandemic. Att epidemiile, ct i pandemiile au un impact economic substanial datorit

costurilor profilaxiei i tratamentului, absenteismului, vizitelor la medic, precum i excesul de

spitalizri. Prin urmare, este necesar o nelegere detaliat a mecanismelor ce determin

patogenitatea i transmisia virusurilor gripale ntre specii, combinat cu disponibilitatea

msurilor efective de prevenie i tratament ntru realizarea msurilor de control i rspuns al

infeciilor gripale [23].

n timp ce persoanele dezvolt imunitate de lung durat la o anumit tulpin de virus

gripal, mutaiile antigenice fa de genomul virusului gripal rezult n proteine ce sunt

recunoscute ntr-o msur mai mic de ctre sistemul imun uman, lsnd persoanele susceptibile

n viitor la infectare. Evoluia fenotipului antigenic apare punctiform cu episoade de nnoire

intercalate de perioade de staz, n timp ce evoluia genetic pare mai continu, ceea ce

sugereaz c un numr relativ mic de modificri genetice sau combinaii de modificri genetice

pot conduce la apariia modificrilor la nivelul fenotipului antigenic. Populaia de virusuri

gripale evolueaz continuu n fenotip antigenic n aa-numitul proces de drift antigenic care se

realizeaz prin intermediul antigenelor de suprafa HA i NA. Aceste dou proteine sunt codate

de segmentele 4 i 6 ale genomului viral (constituit n general din 8 segmente), localizate pe

suprafaa virionului, ele sunt prima int pentru rspunsul imun al gazdei. Celelalte ase

segmente sunt codificate de ctre proteinele: PB2 (segmentul 1), PB1 (segmentul 2), PA

(segmentul 3), NP (segmentul 5), M1 i M2 (segmentul 7), NS1 i NS2/NEP (nuclear export

26

protein) (segmentul 8). O protein-accesoriu, suplimentar, PB1-F2 poate fi codat de segmentul

2 i ea poate conferi proprieti de virulen virusurilor care o expreseaz prin faptul, c ea se

asociaz cu proteinele mitocondriale inducnd procesul de apoptoz n celulele imune. Acest

factor de virulen a fost identificat printre virusurile gripale de tip A, stabilindu-se, totodat,

asocierea lui cu patogenitatea sporit a virusului gripal nalt patogen A(H5N1), precum i a

virusului gripal pandemic din 1918. Proteina fragmentat PB1-F2 cu fragment deschis pentru

citire (PB1-F2 ORF open reading frame) s-a dovedit a fi legat de replicarea viral continu,

inclusiv i de rspunsul proinflamator sporit. Totodat, proteina nestructural NS1 suprim

expresia genelor antivirale n celulele-gazd. Marcherii virulenei precum i factorii ce contribuie

la transmisia ntre specii au fost identificai n proteina PB2, pe cnd determinanii rezistenei

antivirale au fost depistai n proteinele NA i M [56-61].

Din momentul izolrii pentru prima dat n 1930 a virusului gripal A(H1N1) de la

porcine - antigenic foarte asemntor virusului gripal uman reconstruit A(H1N1) din 1918, ele

mprtesc, probabil, un strmo comun i pn la sfritul anilor 90 ai secolului XX acest virus

gripal clasic porcin a circulat n populaia porcinelor i a fost antigenic relativ stabil. n anul

1998, sau mai nainte, acest virus gripal clasic porcin a reasortat cu virusul gripal uman

contemporan A(H3N2) i cu un virus aviar de linie american cu subtip necunoscut, rezultnd n

apariia n populaia porcin nord-american i mai trziu n populaia porcin asiatic a virusului

gripal porcin triplu reasortant H3N2 (rH3N2). Cercetrile au demonstrat c acest virus rH3N2

posed genele HA, NA i PB1 de la virusurile gripale umane, genele PA i PB2 de la virusurile

gripale aviare i genele interne NP, M i NS de la virusurile gripale porcine [36, 42, 56, 58].

Datorit diferenelor intrinsece dintre gazde (ex. receptorii celulari) i ale aprrii selective

(sistemele umoral i celular de aprare nnscute i dobndite), diferite modificri n structura

antigenic a virusurilor gripale sunt provocate mai mult n populaia porcin dect n cea uman.

Drept consecin, drift-ul antigenic al virusurilor gripale urmeaz ci diferite la porcine

comparativ cu populaia uman. Precum drift-ul antigenic n virusurile gripale umane A(H3N2)

este, de obicei, atribuit aprrii imune stabilite n populaia uman ca urmare a infeciilor

precedente cu variantele anterioare de virusuri gripale, tot aa potenialul comun al mutaiilor de

difereniere a cluster-elor pot sugera c modificrile antigenice n virusurile gripale porcine, de

asemenea, sunt urmare ale aprrii imune. Periodic, aceste mutaii ar putea fi selectate n ambele

gazde n baza avantajelor diferite fa de evaziunea imun sau ar putea fi sporadic cuplate cu alte

mutaii cu acelai efect [36, 42, 62-65].

Totodat, virusul gripal A(H1N1) din 1918 a circulat n populaia uman pn la

declanarea n 1957 a pandemiei de grip provocat de virusul gripal A(H2N2) (gripa asiatic).

27

n aceast perioad s-a constatat un drift antigenic substanial al virusului gripal A(H1N1)

departe de virusul din 1918. De la nceputul anilor 1950 virusul gripal A(H1N1) a reaprut n

populaia uman n 1977, iar din 1977 pn n 2009 a fost o evoluie antigenic substanial, fapt

ce a determinat rennoirea de 8 ori a componentului H1 al vaccinului antigripal [36, 42, 56-64].

Staza antigenic relativ a virusului gripal clasic H1N1 n populaia porcin s-a estimat

pn n 1998, n acelai timp, observndu-se drift-ul antigenic substanial al virusului gripal

H1N1 n populaia uman, n cele din urm, acestea au condus la crearea unui decalaj antigenic

esenial ntre virusurile gripale clasice porcine A(H1N1) i virusurile gripale umane A(H1N1).

De asemenea, cercetrile au demonstrat, c din 2005, izolatele virusurilor gripale umane H1N1

de origine porcin au manifestat cel mai nalt grad de similaritate cu virusurile porcine H1

circulante n Asia i SUA i c proteina N1 are legtur cu virusurile porcine circulante n

Europa [41]. Se consider c porcinele joac un rol vital n transmisia ntre specii a virusurilor

gripale prin faptul c ele poart receptori att pentru tulpinile de virus gripal aviar, ct i pentru

tulpinile de virus gripal uman. Aceasta a pus n eviden porcinele drept "vas de amestec" n care

materialul genetic poate fi schimbat cu un potenial de a rezulta ntr-un nou progenitor viral la

care populaia uman este nalt susceptibil i nu posed imunitate. Astfel, populaia porcin a

devenit un rezervor pentru virusurile gripale H1N1 cu potenial de cauzare a unor epidemii

majore sau posibile pandemii n populaia uman [36, 42, 58-64].

Caracteristica unui ir de virusuri gripale A(H1N1)pdm pentru determinarea

proprietilor antigenice, n prima jumtate a anului 2009, a pus n eviden faptul c antigenic

aceste virusuri sunt omogene i printre virusurile istorice, ele sunt antigenic similare cu virusurile

clasice porcine A(H1N1), precum i virusurile triplu reasortate A(H1N1) ale liniei nord-

americane care au circulat n populaia porcin n ultimii 10 ani n SUA, i care ocazional au

infectat populaia uman n aceiai perioad. Analiza antigenic a virusurilor A(H1N1)pdm

izolate n perioada nominalizat a demonstrat prezena doar a cteva substituii ale aminoacizilor

n gena HA, ns niciuna nu s-a dovedit a avea vre-un efect antigenic. Variaia antigenic printre

aceste virusuri s-a constatat a fi, la acel moment, mai mic dect variaia antigenic observat n

populaia uman n timpul unui sezon tipic/epidemic de grip [42].

Cu toate acestea, sezonul epidemic 2008-2009 s-a caracterizat prin circulaia att a

virusurilor sezoniere clasice cunoscute A(H1N1), A(H3N2) i B, ct i a virusurilor

A(H1N1)pdm. Caracteristica antigenic a acestor virusuri gripale a demonstrat c virusurile

gripale A(H1N1) au fost asociate cu tulpina A/Brisbane/59/2007-like; virusurile A(H3N2) au

fost similare tulpinii A/Brisbane/10/2007-like, ambele tulpini fiind componente ale vaccinului

antigripal recomandat de OMS pentru sezonul epidemic 2008-2009. Virusurile gripale de tip B

28

circulante n sezonul respectiv s-au divizat n dou linii distincte reprezentate de tulpinile

B/Yamagata/16/88 i B/Victoria/02/87. Virusurile gripale de tip B care au corespuns liniei

B/Yamagata au fost analoage tulpinii B/Florida/04/2006, de asemenea, component al vaccinului

antigripal din sezonul nominalizat. ns, paralel cu virusurile enumerate, au fost izolate i tulpini

de virusuri gripale de tip B care aparineau liniei B/Victoria, care la acel moment nu au fost

componente ale vaccinului antigripal recomandat pentru sezonul epidemic 2008-2009. n acest

context, este necesar de interpretat cu precauie rezultatele caracterizrii antigenice, deoarece

aceste rezultate s-au bazat, de facto, pe reacia de hemaglutinoinhibare (RHAI) folosind un panel

de seruri de referin existente n acea perioad, i care puteau s nu corespund proteciei clinice

mpotriva virusurilor circulante asigurate de vaccinul antigripal [66-68].

Vaccinarea antigripal anual presupune asigurarea unei protecii maxime mpotriva

acelor tulpini de virusuri gripale care coincid cu virusurile vaccinale, ns o protecie limitat

sau, n general, lipsa ei poate fi observat atunci, cnd tulpinile de virus gripal vaccinal i cele

circulante sunt aa de diferite, nct s fie din linii diferite aa cum a putut fi observat cu liniile

de virus gripal de tip B (linia B/Yamagata i linia B/Victoria - una fiind component al vaccinului

nu poate asigura protecie mpotriva celeilalte). Aadar, caracteristica antigenic a tulpinilor de

virusuri gripale A(H1N1)pdm a demonstrat c aceste virusuri au fost i sunt antigenic i genetic

diferite de tulpinile A(H1N1), fapt ce a sugerat lipsa proteciei n urma vaccinrii cu vaccinul

trivalent recomandat pentru sezonul epidemic 2008-2009 fa de virusul gripal nou

A(H1N1)pdm [66].

Apariia recent a virusului pandemic (H1N1) 2009, cunoscut anterior ca virus gripal de

tip A de origine porcin, a condus la infectarea pn la mijlocul anului 2009 peste 296 mii de

persoane pe ntreg globul pmntesc cauznd n perioada menionat cca 3486 cazuri de deces.

Analiza mutaiilor de adaptare a virusului gripal de tip nou A(H1N1) 2009 a devenit o prioritate

pentru cercettori care au putut evalua probabilitatea c virusurile de la alte specii non-umane se

vor adapta la populaia uman. Virusul gripal pandemic const din mai multe gene virale

reasortate de diferit origine. Dou gene polimerazice din cele 8 ale ARN genomic segmentat, i

anume PB2 i PA, au fost de origine aviar aparinnd liniei nord americane i au fost introduse

n populaia porcin aproximativ n anul 1998. Alt gen polimerazic, PB1, de asemenea, a

evoluat recent din virusul gripal uman sezonier A(H3N2) practic n acelai an. n particular,

aceast gen PB1 a virusului A(H3N2), este cunoscut c, ar fi provenit de la virusul gripal aviar

care a intrat n populaia uman n anul 1968. Totui, genele proteice HA, NP i NS ale virusului

gripal pandemic (H1N1) 2009 se trag direct de la virusul gripal A clasic porcin al liniei nord

americane care poate fi urmrit pornind de la virusul gripal din anul 1918. Alte dou gene NA i

29

M, avnd originea de la virusul gripal porcin eurasiatic, au fost introduse de la psri

aproximativ n anul 1979. Cu toate c a fost determinat originea segmentelor genelor virusului

gripal pandemic (H1N1) 2009, nu este clar mecanismul de transformare a semnelor

aminoacizilor gazd-specifice, deoarece genele virusului gripal de tip nou au evoluat dup

introducerea lor n circulaie n populaia porcin civa ani n urm [30, 31]. Totodat, interesant

este faptul, c n populaia porcin au fost observate aceleai substituii care au avut loc la nivelul

genelor HA1 (substituia S203T) i NA (substituiile V106I i N248D) ale virusurilor gripale

A(H1N1)pdm circulante n populaia uman. Sistemul imun de aprare al gazdei este considerat

a fi principala for motrice selectiv a substituiilor de aminoacizi, care pot conduce la apariia

drift-ului antigenic, iar HA este inta principal a anticorpilor neutralizani. Diversitatea genetic

a HA este mult mai nalt fa de gena NA att n populaia porcin, ct i n populaia uman.

Genele HA i NA ale izolatelor virusurilor gripale A(H1N1)pdm din pri distincte ale lumii sunt

legate unele de altele cu o distan relativ mic i au o singur origine comun, cum era de

ateptat pentru un focar pandemic. Remarcarea faptului c majoritatea izolatelor derivate din

populaiile uman i porcin par s fi provenit din izolatele derivate din populaia uman, i este,

de asemenea, n concordan cu o frecven mai mare de transmisie de la om la om i de la om la

porcine n comparaie cu transmisia zoonotic de la porcine la om. ntr-adevr, rapoarte cu

privire la izbucnirea gripei sugereaz c virusul a evoluat n tcere la porcine pn la

introducerea sa n populaia uman, dup care s-a rspndit rapid printre oameni i frecvent s-a

retransmis de la oameni la porci. S-a demonstrat c virusul gripal A(H1N1)pdm a evoluat i s-a

transferat (shift antigenic) de la o clad prototip iniial amestecat la clada prototip 7

predominant. Selecia i evoluia ulterioar a cladei 7 a rezultat n apariia n circulaie a

variantelor cu mutaiile genetice D222G/N sau E. Mutaia D222G n proteina genei HA ce

conduce la lrgirea specificitii receptorilor s-a demonstrat a corela cu debutul clinic al bolii i

frecvent detectat n cazurile severe/fatale ale gripei pandemice la oameni [32-34]. De asemenea,

s-a atestat c substituia D222N este mai frecvent n cazurile fatale ale bolii la oameni, pe cnd

aceleai substituii observate n izolatele virusurilor gripale A(H1N1)pdm de la porcine nu

provoac semne clinice severe de boal [58-64, 69-73].

Caracteristica genotipic a virusurilor gripale A(H1N1)pdm a atestat c n cadrul fiecrui

segment de gene exist o congruen nalt printre virusurile gripale pandemice secveniate pan

la mijlocul anului 2009, fapt ce a sugerat c introducerea cross-specific n populaia uman a

fost un singur eveniment sau mai multe evenimente ale virusurilor genetic similare. Analiza

genoamelor virusurilor A(H1N1)pdm din Mexic i SUA, la acel moment, a evideniat 5 variante

genomice mici: secvena consensus; mutaia T373I n gena NP pereche cu mutaia M582L n

30

gena PA; substituiile aminoacizilor V106I i N247D n gena NA pereche cu substituia V100I n

gena NP; substituiile aminoacizilor S206T n gena HA1 grupndu-se cu ambele substituii

V106I i N247D din gena NA, substituiile V100I din gena NP i cu substituia I123V din gena

NS1; substituiile aminoacizilor S91P, V323I mpreun cu substituia S224P din gena PA [42-

44]. Includerea izolatelor din Mexic sau alte state vecine printre aceste 5 variante genomice

reflect probabilitatea c aceste variante genomice timpurii au reprezentat introducerea iniial

independent n SUA din Mexic. Datorit intervalului scurt de timp de la detecia pentru prima

dat a virusului gripal A(H1N1)pdm, nu era clar ce efect, dac era n general, au putut avea

aceste variaii genomice asupra caracteristicilor virale, precum transmisibilitate sau patogeneza.

Analiza de secveniere, ns, nu a identificat caracteristici moleculare deosebite anterior, n

cercetri ai altor virusuri gripale de tip A, presupuse c ar conferi transmisibilitate sporit sau

virulen [38, 42, 45-46]. Cunoscutul receptor al locusului de legare a proteinei hemaglutinina

H1 s-a dovedit a fi tipic multor altor virusuri gripale clasice porcine H1N1 izolate n SUA n

perioada nominalizat. Totui, au fost atestate unele mutaii detectate n gena HA a virusurilor

gripale A(H1N1) 2009 ce se deosebeau de secvena consensus a virusurilor clasice porcine,

niciuna ns, nu a fost identificat n locusul funcional semnificativ al receptorului de legare

cunoscut. Dup cum a fost de ateptat, multe din virusurile A(H1N1) 2009 conineau substituii

de aminoacizi la locusul antigenic presupus n comparaie cu gena HA a virusurilor gripale H1

sezoniere [38-42, 58, 61].

Analiza de secveniere, de asemenea, a pus n eviden prezena substituiilor de

aminoacizi n gena HA a virusurilor gripale A(H1N1)pdm n poziiile S220T, D239G/N/S,

Y247H, E252K, M247V, Q310H i E391K. S-a observat o predominan a mutaiei D239G n

unele ri n cazurile soldate cu deces, similar cu substituia D222G, dar care, probabil a fost n

concordan cu vrsta pacienilor, factorii de risc, manifestarea i progresarea bolii [73, 77, 78].

Un interes aparte prezint particularitile specifice, individuale ale structurii locusului de

legare a HA virusului gripal A(H1N1)pdm, i anume, mutaiile D94N, N125D i V250A.

Substituiile perechi n poziiile 94 i 250 (D94N i V250A) sunt similare n baza structurii

situsului de legare cu acizii sialici cu tipul receptorului caracteristic pentru esuturile umane. Cu

toate acestea, substituia V30A, identificat n structura virusului gripal A(H1N1)pdm, poate

compensa aciunea substituiei N125D, fapt care poate fi urmrit la prezena concomitent a

substituiilor D94N i V250A, cnd schimbul Valinei n poziia 250 cu Alanina influeneaz

semnificativ manifestarea substituiei D94N. n special, este stabilit, c substituiile 30A i 125N

sporesc afinitatea HA fa de receptorii sialici de tip uman. Mai mult ca att, combinaia 94D,

125N i 250V este caracteristic pentru izolatele de virus A(H1N1) din 1918, iar combinaia

31

94N, 125D i 250A conduce la creterea afinitii HA ctre receptorii virusurilor gripale aviare.

Pentru virusul gripal A(H1N1)pdm este caracteristic combinaia 94D, 125N i 250V care

completamente corespunde cu reziduurile aminoacidice n poziiile respective ale virusului gripal

care a cauzat pandemia spaniol din 1918. Este necesar de subliniat, c combinaia de

substituii E190D, Q226L i G228S n hemaglutininele H1, H2 i H3 conduce la trecerea

ambigu a HA de pe receptorii de tip aviar spre receptorii celulelor umane, fapt ce se realizeaz

parial [50, 73, 77, 78].

Secvenierea unor tulpini de virusuri gripale A(H3N2) a atestat c n toate secvenele

genei M1 a fost detectat substituia K174R, la nivel de gena HA a fost caracteristic substituia

K29R, iar pentru gena NA au fost caracteristice dou substituii sinonimice 351 A>G (n codonul

T117) i 408 G>A (n codonul Q136). Acestea, posibil, au indicat la faptul c tulpinile de

virusuri gripale A(H3N2) din sezonul 2008-2009 au prezentat o continuitate evoluionist a

tulpinilor de virusuri gripale A(H3N2) din sezonul 2007-2008 [74-76]. Este necesar de

menionat, c n secvenele genelor NA ale virusurilor gripale A(H3N2) din sezonul 2008-2009 a

fost detectat substituia D147N n locusul de glicozilare. Se cunoate, ns, c glicozilarea n

locusul 130 N1 (ce corespunde locusului146 n N2) a tulpinii A/Wisconsin/33 (H1N1)

deregleaz interaciunea dintre NA i plasminogenul, ceea ce conduce la diminuarea patogenitii

virusului [73, 74-76].

Marea majoritate din tulpinile gripale A(H3N2) cercetate n perioada nominalizat au

purtat n secvena domenului cu terminaia C a proteinei M1 substituia K174R, care sporete

tendina sectorului dat al lanului proteic spre formarea -spiralei. Proteina M2 s-a dovedit a

conine substituia S31N care este caracteristic rezistenei la remantadin. Cea mai important

consecin a substituiilor de aminoacizi ce rezult n descreterea afinitii pentru receptori este

efectul lor asupra eficienei infeciei i transmisiei [73, 79]. A fost remarcat faptul, c n sezonul

2009-2010 virusurile gripale A(H3N2) practic nu au participat n procesul epidemic, iar n

sezonul 2010-2011 aceste virusuri nu au avut semnificaie epidemic [73, 79, 80].

Comparaia hrilor genetice i antigenice ale virusului gripal A(H3N2) a atestat c

impactul antigenic a modificrilor genetice variaz n dependen de natura substituiilor de

aminoacizi, poziionarea lor structural i interaciunea epistatic cu alte situsuri [75].

Sezoanele epidemice 2008-2009, 2009-2010 i 2010-2011 s-au caracterizat prin reapariia

n circulaie a virusurilor gripale de tip B apartenente liniei B/Victoria n care au avut loc

schimbri semnificative ai proprietilor antigenice izolatele au fost similare unei tulpini etalon

noi, i anume B/Brisbane/60/2008. Analiza genetic a tulpinilor de virusuri gripale de tip B,

izolate n perioada anilor 2009-2011, a demonstrat c aceste tulpini au aparinut liniei B/Victoria,

32

n special cladei 111-ii, sau tulpinii similare B/Brisbane/60/2008 cu substituii caracteristice de

aminoacizi (V146I, N165K) n gena HA, afectnd regiunile antigenice (buclele 150 i 160).

Indiferent de faptul c timp de dou sezoane epidemice (2009-2010 i 2010-2011) n lume a

circulat i a dominat virusul gripal pandemic A/H1N1/pdm09, virusurile gripale de tip B nu au

fost eliminate din circulaie, ns rata lor n sezonul 2009-2010 a fost foarte joas, iar n sezonul

2010-2011 moderat [81-83].

n acest context, spre deosebire de sezonul 2008-2009, n sezonul epidemic 2009-2010 s-

a intensificat circulaia tulpinilor de virusuri gripale de tip B apartenente liniei B/Victoria, iar

circulaia virusurilor gripale B/Yamagata a diminuat. Astfel, componenta ce ine de tulpina

virusului gripal B din vaccinul antigripal pentru sezonul nominalizat s-a schimbat, tulpina

B/Florida/04/2006-like linia B/Yamagata a fost nlocuit cu tulpina B/Brisbane/60/2008-like

linia B/Victoria [66, 67, 81-84].

Comparaia filogenetic a tulpinilor de virusuri gripale de tip B linia B/Victoria a

demonstrat c substituiile de aminoacizi N75K, N165K, i S172P n regiunea de codificare HA1

a genei HA definesc clada genetic B/Brisbane/60/2008. Toate virusurile gripale de tip B

apartenente liniei B/Victoria circulante n sezonul 2010-2011 au fcut parte din clada

menionat. De asemenea, s-a atestat c majoritatea acestor virusuri au purtat substituia de

aminoacizi I146V n gena HA comparativ cu virusul vaccinal B/Brisbane/60/2008 i multe

virusuri au purtat i substituia L58P, ns nici-una din ele nu s-a dovedit a avea efect antigenic

[84].

Arborele filogenetic construit n baza regiunii de codificare HA1 a genei HA a tulpinilor

de virusuri gripale de tip B apartenente liniei B/Yamagata, care a reaprut n circulaie n sezonul

2012-2013, a pus n evidena prezena substituiilor de aminoacizi S150I, N165Y, G229D care

definesc grupul genetic B/Bangladesh/3333/2007. ns o parte din virusuri (grupul de virusuri

din Suedia, Finlanda i Estonia) s-au plasat n grupul genetic distinct reprezentat de tulpina

B/Brisbane/3/2007 virus prototip al acestui grup. Gena HA a tulpinii de virus gripal

B/Athens/9784/2011, ce a prezentat un model distinct n reacia HAI, s-a plasat n grupul genetic

B/Bangladesh/3333/2007 codificnd, ns, substituiile V29A, L172Q i M251V comparativ cu

virusurile de referin [84].

Este cunoscut faptul c reasortarea rearanjarea segmentelor genelor virale n celulele-

gazd infectate cu dou sau mai multe virusuri gripale reprezint un mecanism important n

evoluia virusurilor gripale. Infeciile mixte cu multiple tipuri/subtipuri de virusuri gripale pot

conduce la apariia de reasortri. Un aspect substanial al reasortrii este generarea unor noi

tulpini de virusuri gripale cu potenial pandemic, unde virusurile gripale umane obin un subtip

33

nou de HA i/sau NA de la virusurile gripale aviare i/sau porcine. Reasortarea, de asemenea,

faciliteaz apariia de fenotipuri mai virulente prin permiterea virusurilor de a cpta segmente

cu marcheri pentru virulen. Prin reasortare virusurile gripale au obinut gene cu mutaii ce in

de rezistena la remediile antivirale i aceste virusuri rezistente se pot replica tot aa de eficient

ca i cele sensibile i, de asemenea, pot avea o capacitate de transmisie nalt [85].

Vaccinurile curente contra gripei sezoniere sunt destinate pentru asigurarea proteciei

specifice n dependen de tulpin contra dou subtipuri ai virusului gripal de tip A circulante

(H1N1 i H3N2) i contra unui virus gripal de tip B. inta principal a acestor vaccinuri este HA

care deine rolul de mediere a ptrunderii n celula-gazd. Astfel, anticorpii neutralizani indui

de vaccin blocheaz ptrunderea virusului n celul sau prin prevenirea atarii virusului de

receptorii ce conin acid sialic de pe suprafaa celulei-gazd sau prin interferena cu fuziunea

viral mediat de HA [85].

Substituiile de aminoacizi S31N, V27A, A30V, G34E i L26F reprezint mutaiile ce

induc rezistena la adamantane (amantadina i remantadina) n virusurile gripale [73, 85, 86].

inta adamatanelor este proteina M2 a virusurilor gripale, care funcioneaz drept canal ionic

activat de acizi i este necesar pentru eliberarea nucleoproteinei dup fuziunea cu membrana

endosomal. Adamatanele inhib replicarea viral prin prevenirea deschiderii canalului ionic

M2, interfernd astfel cu dezbrcarea virusului n timpul endocitozei [87-90]. Cea mai

frecvent substituie ce caracterizeaz rezistena fa de adamatane este substituia S31N, care

predomin n 98-100% din tulpinile transmisibile rezistente la amantadin H1N1, H5N1 i

H3N2 izolate de la oameni, psri i porcine n ultimii zece ani, pe cnd mutaiile V27A i L26F

sunt mai puin frecvente [87-89]. Fiecare mutaie rezult sau n legarea redus a remediului

antiviral de ligandul M2 sau n extensia canalului ionic M2 i ambele permit canalului s-i

exercite funcia n prezena antiviralelor [87-89, 91-93]. Cercetarea mutaiilor punctiforme la

nivelul reziduurilor cptuelii porilor canalului M2 a estimat numrul mic de variante naturale

[87, 90, 91]. Astfel, numeroi mutani n captul N-terminal apos al porului rein abilitatea de a

conduce selectiv protonii asupra altor ioni, dei dependena de magnitudine i pH ai

conductibilitii lor variaz. Totui, doar cteva mutaii V27A, S31N i L26F au proprieti

similare cu canalul ionic M2 la cele mai distale locusuri [87-89, 91-93].

Rezistena la amantadin a evoluat rapid in vivo din momentul administrrii ei pacienilor

cu infecie gripal. Baza genetic a rezistenei fa de amantadin este asociat cu substituiile de

aminoacizi, dup cum s-a menionat, n regiunea transmembranar a genei M2. Cercettorii au

atestat o inciden nalt de izolate de virus gripal A(H3N2) rezistente la amantadin, care n

gena M2 posed mutaia Ser-31-Asn i o schimbare dubl n gena HA la reziduurile din poziiile

34

193 i 225 (clada liniei N). Totui, puin se cunoate despre faptul, dac modificrile la nivelul

genei HA au fost sinergice cu modificrile care au avut loc n gena M2 ca rspuns la presiunea

selectiv a medicamentului sau au avut loc separat i s-au asociat randomizat cu mutaiile de

mbuntire a afinitii [87-89, 91-93].

O alt clas de remedii antivirale este reprezentat de inhibitorii neuraminidazei (NAI):

oseltamivir (Tamiflu) i zanamivir (Relenza) [94]. inta NAI este proteina NA a virusurilor

gripale care este responsabil de clivajul reziduurilor acidului sialic al celulelor-gazd permind,

prin aceasta, eliberarea virionilor aflai n maturizare. NA, de asemenea, are importan n

stabilirea infeciilor respiratorii la nivelul cilor respiratorii superioare, deoarece clivarea

acidului sialic pe suprafaa mucoasei expune celulele epiteliale la aciunea virusului. NAI previn

eliberarea virionilor din celulele infectate i, astfel, reduce att infeciile cilor respiratorii

superioare, ct i durata simptoamelor [87, 95, 96]. La nivelul genei NA au fost observate

substituiile de aminoacizi H274Y, E119V, N294S i R292K, substituii care s-a dovedit a

conferi virusurilor gripale rezisten la NAI. Mutaia H274Y s-a estimat ca cea mai frecvent i

pare a fi exclusiv limitat la gena N1 att n virusurile gripale sezoniere, ct i n cele pandemice

n populaia uman i pot avea loc spontan fr presiunea aparent a antiviralelor sau reasortare

[87, 95-100]. Totui, un numr foarte mic de mutaii N294S au fost detectate n virusurile

A(H1N1)pdm, mai general, ns, toate cele patru mutaii s-a stabilit c exist n gena N1. n plus

la aceasta, dei virusurile gripale A(H3N2) sunt dominate de substituiile E119V i R292K,

substituia H274Y nu a fost niciodat identificat n gena N2 [87, 97]. S-a stabilit c o nou

substituie I223R cauzeaz o rezisten modest la NAI, ns, n combinaie cu substituia H274Y

rezistena la oseltamivir crete semnificativ, pe cnd rezistena la zanamivir rmne la nivel

sczut. O alt combinaie a dou mutaii n gena NA, Q313R i I427T, de asemenea cauzeaz

rezisten la ambele remedii NAI: oseltamivir i zanamivir [101, 102-104].

Evoluia rezistenei la oseltamivir n virusurile gripale A(H1N1) pandemice se poate

datora mutaiilor punctiforme n orice regiune a genelor NA sau evenimentului de reasortare.

Rezistena la oseltamivir n tulpinile de virusuri gripale A(H1N1) pandemice pot aprea in

diverse forme: o evoluie sporadic la un pacient infectat drept rspuns la tratament; evoluia

rezistenei la oseltamivir la un pacient infectat i transmisia tulpinii date contacilor; meninerea

genotipului ce confer rezisten la oseltamivir ntr-o linie viral datorit presiunii de selecie

i/sau evenimentului de reasortare dintre tulpinile A(H1N1) sezoniere rezistente la oseltamivir i

tulpinile A(H1N1) pandemice. Acest eveniment poate oferi un se