UNIVERSITATEA “ALEXANDRU IOAN CUZA”

FACULTATEA DE BIOLOGIE

Coordonator stiintific,

Prof. Dr. MARIA-MAGDALENA

ZAMFIRACHE

Drd. an 3,

MAGDA COISIN

IASI, 2012

In terapeutica moderna, plantele aromatice au inceput sa aiba un rol tot

mai important dupa ce proprietatile terapeutice ale acestora au fost elucidate sau

confirmate atat experimental, cat si prin observatii clinice.

Plantele medicinale si aromatice reprezinta un domeniu de actualitate,

fiind folosite cu succes in prevenirea si tratarea multor afectiuni, avand in vedere

faptul ca organismul uman dispune de sistemul enzimatic necesar metabolizarii

lor. Multe dintre uleiurile volatile au o capacitate deosebita de difuziune prin

structurile organismului uman. Important este faptul ca aceste uleiuri, in cazul

administrarii lor corecte, nu provoaca dependenta si nu au efecte secundare

nocive, specifice multor medicamente de sinteza.

Proprietatile insecticide si repelente ale unor uleiuri esentiale si ale

componentelor acestora sunt, de asemenea, in atentia cercetatorilor in domeniu,

iar in acest sens s-au obtinut rezultate importante.

1. Dozarea spectrofotometrica a pigmentilor asimilatori din tesuturile

foliare si determinarea gradului de hidratare a acestora.

2. Inregistrarea intensitatii proceselor fiziologice de fotosinteza si

respiratie care au loc in aparatul foliar al taxonilor investigati.

3. Identificarea GC-MS a compusilor chimici din uleiurile volatile

obtinute prin hidrodistilare.

4. Observarea activitatii antimicrobiene a uleiurilor asupra a doua tulpini

de microorganisme test (Staphyllococcus aures si Escherichia coli).

OBIECTIVE

Gen Salvia

Subfam. Nepetoideae

Fam. Lamiaceae

MATERIALUL VEGETAL

Metoda de extracţie a uleiurilor vegetale

hidrodistilare, cu ajutorul unui dispozitiv de tip

Clevenger, in cadrul Laboratorului de Fiziologie

vegetala al Facultatii de Biologie, Univ. “Al. I.

Cuza” din Iasi.

Analiza gc-ms a uleiurilor volatile

prin metoda GC-MS (gaz-cromatografie cuplata

cu spectrometrie de masa). în cadrul Centrului

de Cercetări pentru Studiul Calităţii Produselor

Horticole al Facultăţii de Horticultură –

Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină

Veterinară Bucureşti.

Aparatul utilizat este un

gaz-cromatograf GC-MS Agilant.

Probe pentru testări :

1. Salvia aethiopis L

2. Salvia nemorosa L.

3. Salvia verticillata L.

Microorganisme test

a. Staphyllococcus aureus

b. Escherichia coli

Metoda microplăcilor

Protocol placi:

- m80 μl mediu de cultură (bulion nutritiv)

- 10 μl cultură bacteriană diluată 10-2

sau 10-3

- 100 μl ulei de testat cu diferite concentraţii

- 10 μl resazurină 0,01%

MATERIALE SI METODE UTILIZATE IN CERCETARILE MICROBIOLOGICE

REZULTATELE

C

E

R

C

E

T

A

R

I

L

O

R

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

mg

/g t

es. ve

g

Cantitatea de pigmenti asimilatori foliari la 3 specii de Salvia

Pigm.carot.

Clorof. b

Clorof. a

Clorof. a

mg/g tes. veg.

Clorof. b

mg/g tes. veg.

Pigmenti

carotenoizi

mg/g tes. veg.

Clorof.a / b

S. aethiopis (f. vegetativa) 0.88 0.31 0.0002 2.83

S. aethiopis (inflorire) 0.96 0.28 0.0003 3.42

S. aethiopis (fructificare) 0.55 0.17 0.0001 3.23

S. nemorosa (f. vegetativa) 0.58 0.28 0.0002 2.07

S. nemorosa (inflorire) 1.31 0.51 0.0003 2.56

S. nemorosa (fructificare) 0.81 0.42 0.0002 1.92

S.verticillata (f. vegetativa) 1.25 0.51 0.0004 2.45

S. verticillata (inflorire) 1.38 0.47 0.0004 2.93

S. verticillata (fructificare) 0.87 0.41 0.0002 2.12

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

f. v

eg

eta

tiva

infl

ori

re

fru

cti

fic

are

f. v

eg

eta

tiva

infl

ori

re

fru

cti

fic

are

f. v

eg

eta

tiva

infl

ori

re

fru

cti

fic

are

S.aethiopis S.nemorosa S. verticillata

mg

/g t

esu

t v

eget

al

Variatia raportului clorofila a/b in principalele fenofaze

clorofila a clorofila b cl a/cl b

Determinarea gradului de hidratare a tesuturilor foliare pe durata vegetatiei

S.U. (%) H2O (%)

S. aethiopis (f. vegetativa) 0.88 0.31

S. aethiopis (inflorire) 0.96 0.28

S. aethiopis (fructificare) 0.55 0.17

S. nemorosa (f. vegetativa) 0.28 0.58

S. nemorosa (inflorire) 1.31 0.51

S. nemorosa (fructificare) 0.81 0.42

S.verticillata (f. vegetativa) 1.25 0.51

S. verticillata (inflorire) 1.38 0.47

S. verticillata (fructificare) 0.87 0.41

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

f. v

eget

ati

va

infl

ori

re

fru

ctif

ica

re

f. v

eget

ati

va

infl

ori

re

fru

ctif

ica

re

f. v

eget

ati

va

infl

ori

re

fru

ctif

ica

re

S.aethiopis S. nemorosa S. verticillata

mo

l m -

2 s

-1

mg/g tesut vegetal

mo

l m -

2 s

-1

CO

2

Variatia intensitatii fotosintezei pe parcursul unei perioade de vegetatie la 3 specii de Salvia

Fotosintezaa (mmol m-2s-1) Lumina (mmol m-2s-1)

Procesul de fotosinteza se desfasoara mai intens la o iluminare a surafetei

foliare mai puternica, parametru ce afecteza direct proportional si nivelul

pigmentilor clorofilieni, implicati in proces.

Observam valorile cele mai ridicatecorespunzator perioadei de inflorire –

pentru primele 2 specii si fenofazei vegetative – la S. verticillata.

Biosinteza clorofiliana are loc odata cu maturarea aparatului foliar, sediul

procesului fotoasimilatiei.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

f. v

ege

tati

va

infl

ori

re

fru

ctif

icar

e

f. v

ege

tati

va

infl

ori

re

fru

ctif

icar

e

f. v

ege

tati

va

infl

ori

re

fru

ctif

icar

e

S.aethiopis S. nemorosa S. verticillata

mo

l m -

2 s

-1

mg/g tesut vegetal

mo

l m -

2 s

-1

O2

Variatia intensitatii respiratiei foliare pe parcursul unei perioade de vegetatie la 3 specii de Salvia

Respiratia (mmol m-2s-1) Lumina (mmol m-2s-1) Clorofila (mg/g. tesut vegetal)

Tendinta de cresterea a intensitatii respiratiei foliare spre senescenta

plantelor se observa si in cazul acestor specii investigate, ceea ce inseamna

pierdere de substanta si din punct de vedere calitativ, plantele nu mai

poseda aceleasi calitati , ulei volatil extras din plante in aceasta fenofaza

fiind mai sarac in compusi si in cantitate mult redusa.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

f. v

ege

tati

va

infl

ori

re

fru

ctif

icar

e

f. v

ege

tati

va

infl

ori

re

fru

ctif

icar

e

f. v

ege

tati

va

infl

ori

re

fru

ctif

icar

e

S.aethiopis S. nemorosa S. verticillata

mo

l m -

2 s

-1

mg/g tesut vegetal

mo

l m -

2 s

-1

H2

O

Variatia intensitatii transpiratiei la nivel foliar la cele 3 specii de Salvia

transpiratia (mmol m-2s-1) Lumina (mmol m-2s-1) Clorofila (mg/g. tesut vegetal)

Fotosinteza se desfasoara cu intensitate mai mare in prima parte a ciclului evolutiv al plantelor,

fenofazele de crestere vegetativa si inflorire, cand atinge valorile cele mai mari, pentru a descrie apoi o

panta descendenta pana spre sfarsitul vegetatiei, cand vor predomina procesele catabolice.

Pentru respiratie observam o situatie grafica inversa fotosintezei, cu valorimari, in toate cazurile,

in ultima fenofaza.

Transpiratia la nivel foliar a prezentat valori similare la S. nemorosa si S.verticillata, specii cu

acelasi ecotop, caractere biologice si perioada de recoltare. Pentru S. aethiopis observam o scadere

acuta a acestui proces, corelata cu temperaturile crescute estivale, specia fiind recoltata dintr-o zona

litorala. Ca adaptare la reducerea pierderilor de apa, aceasta specie prezinta si un indumentum foarte

dezvoltat.

Din punct de vedere chimic, uleiurile volatile sunt mixturi naturale complexe

si larg variabile de compusi ce apartin la doua grupuri: terpenoide si compusi

aromatici; predomina, in general, monoterpenele. Compozitia lor chimica ar putea fi

redata prin formula generala (C5H8)n.

Uleiurile voatile pot fi produse in aproape toate organele plantelor: flori,

muguri, tulpini, frunze, seminte si radacini si se acumuleaza in celulele secretoare, in

cavitati, canale si celule epidermice (Hussain et al, 2008).

Datorita proprietatilor lor antibacteriene si antifungice, farmaceutice si

alimentare, uleiurile esentiale sunt privite cu interes ca alternativa la produsele chimice

sintetice, pentru protectia echilibrelor ecologice (Burt, 2004).

ANALIZA GC-MS A ULEIURILOR VOLATILE

Compuşi chimici evidentiati (%) = 12

1. Germacren D - 31. 68

2. β-cariofilen - 24. 8

3. α-copaen - 17. 1

4. β-cubeben - 7. 03

5. α-cariofilen - 5. 55

1. 3.

Compozitia chimica a uleiului volatil de S. aethiopis, fenofaza infloririi

17.1

7.03 24.8

0.42

5.55

31.68

4.14

5.29 0.89

1.11 0.45

0.6

α-copaene β-cubebene β-cariophyllene aromadendreneα-cariophyllene germacrene Dbicyclogermacrene δ-cadinene

Compuşi chimici înregistrați (%) = 24

1. Sabinen - 38. 2

2. β-cariofilen - 19. 03

3. Germacren D - 18. 62

4. Cariofilen oxid - 3. 53

5. Elixen - 2. 98

1. 2.

Compozitia chimica a uleiului volatil de S. nemorosa, fenofaza de inflorire

2.07 0.38

33.93

1.30

1.41

1.25 0.88 2.61

3.88

0.712

0.30

0.3 0.53

19.86

6.37 0.30

11.87

0.81

0.51 4.21

0.48

0.51 5.45

ᾳ-tujon ᾳ-pinen Sabinenᵝ-pinen ᵝ-mircen ᾳ-terpinoden Cimol Limonen ᵞ-terpinen Terpinolen Pulegonă ᾳ-terpinil-acetat ᵝ-burbonen ᵝ-cariofilen ᾳ-cariofilen r-cadinen ᵝ-cubeben Elixenᵝ- cadinen Cariofilen oxid Alloaromadendren oxid(2)

Compuşi chimici înregistrați (%) = 30

1. Camfen - 16. 03

2. β-pinen - 15. 24

3. Sabinen - 14. 54

4. α-cariofilen - 8. 64

1.

2.

0.29

0.16 0.17

0.33

0.16

1.95

1.75

0.17

0.17 0.17

3.63 2.47

0.2

16.03

14.54 0.46 0.3

2.29 1.67

0.36

8.64

15.24

6.91

1.3 1.54

1.77 0.93

0.72 0.79

0.29

14.6

α-Pinen Camfen Sabinen β- Pinen Mircen o-Cimen (Cineol) Limonen trans- β- o- Cimen cis - β- o- Cimen Borneol Borneol acetat Terpinil acetatβ- Burbonen β- Cariofilen α- Cariofilen (z)- β- Farnesen γ- Neurolen Germacren D γ-Elemen γ-Cadinen

Compozitia chimica a uleiului volatil de S. verticillataa, fenofaza de inflorire

Evidentierea efectului antibacterian al uleiurilor volatile prin metoda difuzimetrica

o Zona de inhibare a dezvoltarii bacteriene

S1 – S. verticillata

S2 – S. aethiopis

S3 – S. nemorosa

Ec – Escherichia coli

G – gentamicina

M – martor

Figura 2. Testarea uleiului esenţial obţinut de la S. aethiopis Figura 1. Testarea uleiului obţinut de la S. verticillata

Determinarea M.I.C. prin metoda microdilutiilor succesive (microplacilor)

S1 – S. verticillata

S2 – S. aethiopis

S3 – S. nemorosa

Ec. – Escherichia coli

Stf. – Staphylococcus aureus

DMSO - dimetilsulfoxid

CONCLUZII

În materialul biologic cercetat, gradul de hidratare, conţinutul de substanţă uscată şi cantitatea de pigmenţi asimilatori din frunze variaza în funcţie de momentul de recoltare a plantelor (vârsta plantei), cantitatea de apa scazand invers proportional cu acumularea de materie organica.

Pigmentii clorofilieni au trasat o curba ascendenta pana la inflorire, si progresiv descendenta pana spre sfarsitul vegetatiei; biodegradarea clorofilelor poate fi corelata si cu scaderea intensitatii luminii.

Inregistrarea procesele fiziologice a aratat corelatia stransa dintre intensitatea acestora, cantitatea de clorofila si radiatia luminoasa ce cade pe suprafata frunzelor(Qleaf).

Pigmentii carotenoizi au fost gasiti in cantitati comparabile cu datele din literatura de specialitate.

Uleiul volatil produs de taxonii investigati este bogat în monoterpene si sesquiterpene. Cele trei specii de Salvia analizate prezinta in uleiul volatil unii compusi compusi comuni, dar exista si o anumita variabilitate interspecifica. De asemenea, s-au inregistrat variatii cantitative, dar si calitative, ale diferitilor compusi din uleiul volatil de la o fenofaza la alta.

Au predominat in compozitia uleiurilor urmatorii compusi: pentru S. aethiopis - ……, pentru S. nemorosa - …., iar pentru S. verticillata - … . Pentru ultimile doua specii, l-a care s-a analizat uleiul volatil in toate cele trei fenofaze, se poate observa ca cel mai mare numar de compusi in compozitia uleiului revine fenofazei de inflorire; deci, recoltate la acest moment, plantele prezinta un ulei cu activitate biologica optima.

S-a evidentiat efectul antibacterian mai pronuntat al uleiurilor volatile de la aceste specii, asupra bacteriilor Gram pozitive – Staphylococcus aureus – , decat asupra celor Gram negative – Escherichia coli – , fapt ce confirma datele din literatura de specialitate.

In determinarea concentratiei minime inhibitorii (MIC) a uleiurilor volatile, mai eficienta a fost cea a microdilutiilor succesive.

In ceea ce priveste metoda difuzimetrica, aceasta a furnizat informatii mai vagi, unul dintre impedimente fiind efectul de volatilizare al uleiurilor atunci cand sunt diluate intr-un mediu apos

• BIBLIOGRAFIE

JALSENJAK V., PELJNAJK S., KUSTRAK D., 1987 – Microcapsules of sage oil,

essential oils content and antimicrobial activity. Pharmazie, 42: 419–420

KAMATOU, G. P. P., A. M. VILJOEN, A. B. GONO-BWALYA, R. L. VAN ZYL,

S. F. VAN VUUREN, A. C. U. LOURENS, K. H. C. BASER, B. DEMIRCI, K. L. LINDSEY, J.

VAN STADEN AND P. STEENKAMP. 2005. The in vitro pharmacological activities and a

chemical investigation of three South African Salvia species. Journal of Ethnopharmacology. 102:

382–390

KAMATOU G. P. P., VILJOEN A. M., VAN ZYL R. L., VAN VUUREN S. F.,

FIGUEIREDO A. C., G. BARROSO J., PEDRO L. G. TILNEY P. M., 2006 – Chemical

composition, leaf trichome types and biological activities of essential oils of four related Salvia

species indigenous to South Africa. Journal of Essential Oil Research. 18: 72–79

KAMATOU G. P. P., ZYL R. L. V., VUUREN S. F. V., FIGUEIREDO A. C., MARINO M., BERSANI C., COMI G., 2001 - Impedance measurements to study the

antimicrobial activity of essential oils from Lamiacea and Compositae. International Journal of

Food Microbiology, 67: 187– 195

MASANGO P., 2004 – Cleaner production of essential oil by steam distillation.

Journal of Cleaner Production, 13: 833-839

Mass spectral library. 2001. NIST/EPA/NIH: USA, http://www.nist.gov/srd/nlstla.htm

MASSADA Y., 1976 – Analysis of Essential Oils by Gas Chromatography and Mass

Spectrometry. Wiley: New York

!