AgO = lant O din LPZ Ag R = miez PZ din LPZ Ag K = capsula Ag H = flagel Ag F = pili 1. Microbiologia. Obiectul de studiu. Disciplinile microbiologice si obiectele de studiu. Etapele istorice de dezvoltare a microbiologiei. Rolul savantilor A. Leeuwenhoek, L. Pasteur, R. Koch, I.Mecinicov in dezvoltarea microbiologiei. Obiectul de studiu: 1. mi/o si activitatea lor vitala (forma, structura, metabolism, crestere si multiplicare) identificare 2. relatiile mi/o cu mediul ambiant si cu organismul-gazda Scopurile studierii mi/o: 1) patogene, oportuniste = prevenire maladii infectioase 2) utile, inofensive = productie AB, medicamente prin ADNrec (streptokinaza, insulina), alimente (unt, brinza) 3) insecticide biologice 4) fabricare plastic biodegradabil ??? 5) decompunere deseuri, metan Disciplini microbiologice: particularitati biologice mi/o bacteriologie virologie protozoologie micologie, etc habitat mi/o microbiologia solului ... marina ... cosmica implicatii in activitatea umana microbiologia medicala ... veterinara ... alimentara, etc Genetica microbiana Ecologia microbiana Microbiologia medicala studiaza: a) relatia mi/o-gazda umana b) capacitatile patogene mi/o c) capacitatile antiinfectioase organism uman d) metode de diagnostic etiologic al bolilor infectioase e) metode de terapie/profilaxie antimicrobiana Etape istorice in dezvoltarea microbiologiei: I. empirica (pina in sec. 15) II. morfologica (sec. 16-18) A. von Leewenhoek: 1673 prima observare si descriere a mi/o III. fiziologica (sec. 19) L. Pasteur: prepararea vaccinurilor contra antraxului, turbarii, holerei; sustine necesitatea sterilizarii instrumentelor, bandajelor R. Koch: introducerea mediilor de cultura solide; izolare agent antrax, tbc; elaborare teorie despre rolul etiologic al mi/o in bolile infectioase (postulatele lui Koch) I. Mecinicov: argumentare rolul florei intestinale (antagonism); descoperire fagocitoza si rolul antimicrobian al inflamatiei 2. Tipurile de laboratoare microbiologice si sarcinile lor. Regimul si regulile de lucru in laboratorul microbiologic. Clasificarea laboratoarelor in functie de exigenta sigurantei antiinfectioase.

1

Notiune de microorganisme. Categoriile taxonomice, tipuri acelulare si celulare. Deosebirile dintre microorganismele procariote si eucariote. Mi/o = organisme microscopice (micro-nano- metri) + alge, protozoare, virusuri, agenti subvirali (prioni), cipuerci microscopice (fungi, micete) Clasificari mi/o: fenotipica (prima tentativa Carl von Linne) genotipica filogenetica (bazata pe studiul fosilelor sau al HLA) Grupe taxonomice: domeniu regn increngatura clasa ordin familie gen specie Taxoni infraspecifici din cadrul speciei, care prezinta anumite diferente: biovar (activitate biochimica/fiziologica) serovar (structura Ag) patovar (grad de patogenitate) lizovar (sensibilitate la bacteriofagi) antibiovar (sensibilitate la AB) Rolul taxonilor infraspecifici: markeri epidemiologici! Clasificare mi/o: forme acelulare (virusuri, viroizi, prioni) forme celulare: bacteria = procariote, eubct 1) G2) G+ 3) micoplasme (lipsite de PC) archaea = procariote, PC fara peptidoglican, habitat in conditii extremale eucarya = eucariote (fungi, protozoare) 4. Metodele microbiologice de diagnostic si esenta lor. Metoda microscopica in diagnosticul bolilor infectioase. Tipurile de microscoape, utilizarea practica, particularitatile si rolul uleiului de emersie. Metode microbiologice de diagnostic: diagnostic direct (detectare agent patogen sau a produselor lui) 1. microscopic (orientativ) prezenta bct, nr, forma, structura 2. bacteriologic izolare culturi pure de bct, identificare si testare la AB 3. biologic (experimental) inoculare produs patologic la animale de laborator, provocare maladie tipica 4. depistare Ag mi/o in lichide biologice 5. identificare AN mi/o prin tehnici de biologie moleculara diagnostic indirect (imunologic) 1. serodiagnostic detectare si titrare Ac specifici in serul bolnavului 2. intradermoreactie introducere alergen microbian epidermal/intradermal; reactie pozitiva = aparitie eritem hipersensibilitate specifica (intilnire repetata cu Ag) 5. Morfologia bacteriilor. Grupurile morfologice de bacterii. De desenat. Caracterele tinctoriale ale bacteriilor. Colorantii de baza utilizati in microbiologie. Metodele de colorare. Aplicarea practica. Bct = mi/o, unicelular, procariot, autonom Grupe morfologice de bct: coci: 1. micro 2. diplo (neisseria=bob de cafea, pneumococi=lanceolati) 3. tetra 4. strepto (lant) + enterococcus, lactococcus 5. stafilo (gramezi) 6. sarcine (pachete 8-16-32 coci) bastonase 1. bacterium capete rotunjite, nu formeaza spori (ex. E. coli) 2. bacillus capete retezate, formeaza spori ce nu depasesc diametrul celulei (ex. B. anthracis); posibilitate formare lanturi = streptobacili 2

3.

3. clostridium capete rotunjite, formeaza spori ce depasesc diametrul celulei (ex. C. perfringens) spiralate/incurbate 1. vibrio (ex. V. cholarae) 2. campylo-/helico- bacter = 2 apire. aspect de pasare in zbor (ex. C. jejuni) 3. spirillum = cel. spiralate rigide 4. spirochaeta = cel. spiralate flexibile, 5-25 spire (ex. Treponema, Leptospira, Borrelia) polimorfe (Actinomyces, Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma) 6. Etapele si tehnica de pregatire a frotiurilor din culturile bacteriene crescute pe medii lichide. Tehnica de pregatire a frotiurilor din biosubstrate: sputa si frotiuri amprente. Metodele de fixare. Pregatirea frotiurilor examen microscopic Etape in pregatirea frotiului: 1) etalare material microbian 2) uscare 3) fixare oamoara bct, mareste afinitatea pt colorant 4) colorare asigura contrast intre mi/o si fundal 5) examinare (microscop optic cu imersie) Caracter tinctorial = capacitatea mi/o de a fixa colorantul 7. Etapele si tehnica de pregatire a frotiurilor din culturile bacteriene crescute pe medii solide. Tehnica de pregatire a frotiurilor din biosubstrate: singe, puroi. Metodele de fixare. 8. Structura celulei bacteriene. Enumerati elementele permanente (obligatorii) si nepermanente (neobligatorii) de structura. Membrana citoplasmatica si citoplasma. Structura, compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Elemente permanente: 1. PC 2. MCt 3. Ct 4. nucleoid 5. ribosomi 6. mezosomi G+ (E, citocromi) Elemente nepermanente: 1. capsula 2. spor 3. flageli 4. fimbrii 5. plasmide 6. incluziuni celulare MCt: mozeic fluid Singer lipsa colesterol, contin sterol-like molecules hopanoizi mai bogata in prot. decit eucariotele fctii multiple (la eucariote indeplinite de organite) PBP catalizare transpeptidare si sinteza PC permeaze transport prot. sist. de secretie receptori E lant respirator Rol MCt: 1. Bariera semipermeabila, selectiva difuziune simpla, facilitata 2. Permeaze transport activ 3. E activitate metabolica 4. Metabolism energetic 3

5. Participa la diviziunea celulara 6. Sinteza PG si fosfolipidelor 7. Chemotaxis (R specifici) Mezozomi: cresc S MCt cresc activitatea metabolica, energetica Ct: Lipsesc organitele Prezenta: ribozomi, nucleoid, inclusiuni, plasmide pH acid Rol Ct: sediul proceselor metabolice 9. Peretele celular bacterian, functiile. Particularitatile de structura ale peretelui celular al bacteriilor gram pozitive. Coloratia Gram. Tehnica si mecanismul de colorare. Importanta practica. Exemple de bacterii gram pozitive. PC = invelis rigid ceinconjoara protoplastul; e constituit din PG. PG = mureina = heteropolimer macromolecular, format din 2 parti: Partea glicanica (PZ) = catene liniare paralele: NAG + NAM Partea peptidica = peptide 4*aa (izoforme D si L) legate de NAM protectie de proteaze G-: tetrapeptidele unite direct (bidimensional) G+: tetrapeptidele unite prin punti interpeptidice 5*Gly (tridimensional) Structuri prezente doar la procariote: 1. ac. diaminopimelic (tetrapeptid, la G+) 2. izoforma D aa 3. NAM Fragmente solubile de mureina (PG) interactiune cu toll-likeR/CD14R de pe macrofage secretie citokine soc septic! Rol PC: 1. Protectie de liza osmotica 2. Forma 3. Factor de patogenitate (soc septic) 4. Protectie contra subst. toxice (AgO, E din spatiul periplasmatic) 5. Tinta de atac a unor substante: Lizozim scindare legaturi din catena glicanica (intre NAG si NAM) AB inhibitie proces de transpeptidare PC G+: Componente: PG (tridimensional) 40-80% ac. teichoici (fixati de NAG), ac. lipoteichoici (fixati de MCt) = polimeri de ribitol, glicerol-fosfat; o sarcina electrica negativa o transfer de ioni o fctie Ag o activare complement pe cale alternativa o stimulare secretie citokine o adeziune intercelulara prot. asociate PC o Streptococcus pyogenes = prot. M o Staphylococcus aureus = prot. A (clumping factor), prot. fixatoare de fibronectina Uniform Grosime 80 nm 10. Peretele celular bacterian, functiile. Particularitatile de structura ale peretelui celular al bacteriilor gram negative. Coloratia Gram. Tehnica si mecanismul de colorare. Importanta practica. Exemple de bacterii gram negative. PC G-: Componente: 4

PG (bidimensional) 1-10% MEx: existenta situsuri de comuniune intre MEx si MCt rol in transport o Prot. majore: porine, receptori (pili, fagi) o Prot. minore: E de captare si transport a subst. LP Braun = uneste Mex si PG stabilizare MEx LPZ (cel mai neobisnuit component) stabilizare MEx o Lipid A localizat in MEx; endotoxina (stimuleaza secretia citokinelor) o Miex PZ transport unele subst.; AgR specificitate de gen o Lant O (OZ) sarcina negativa, impiedica fagocitoza; AgO specificitate de specie N.B. Bct au capacitatea de a modifica structura AgO capacitate de a amagi apararea imuna Neomogen Grosime 12 nm Spatiul periplasmatic: E si prot. fixate de MCt Rol e: hidroliza, sinteza PC, detoxifiere (ex. Beta-lactamaze) Coloratia GRAM 1. Violet de gentiana Ct violeta 2. Spalare cu apa, tratare cu sol. Lugol (iodin) formare complex insolubil violet-iodin fixare colorant in celule 3. Tratare cu alcool 95% o eliminare colorant din bct G- pori mai mari in PG, continut mai mare de lipide (solubile in alcool), pH slab acid o mentinere colorant in bct G+ pori mai mici, continut scazut de lipide alcoolul dehisrateaza peretele si reduce diametrul porilor 4. Recolorare cu fuxina apoasa Rezultat: G-: rosu G+: violet Utilizarea coloratiei Gram: a. Diagnostic b. Sensibilitate la AB Forme particulare, osmotic sensibile: Protoplast = G+, fara PG Sferoplast = G-, MCt+MEx, partial fara PG Forme L = bct lipside de PC, din cauza AB, (i)reversibile Mycoplasma lipsite de PC, osmotic rezistente rezistenta marita MCt; forma pleiomorfa 11. Particularitatile de structura si compozitia chimica a peretelui celular al bacteriilor acidorezistente. Coloratia Ziehl-Neelsen. Componentele, tehnica si mecanismul de colorare. Exemple de bacterii acidorezistente. Coloratia Ziehl-Neelsen: 1. Colorare cu fuxina fenicata + incalzire lama pina la aparitia vaporilor 2. Spalare cu apa, tratare cu sol. ac. sulfuric 5% 3. Spalare cu apa, recolorare cu albastru de metilen Rezultat: Acidorezistente: rosu Acidonerezistente: albastru 12. Aparatul nuclear al bacteriilor. Compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Plasmidele bacteriene, tipurile si functiile lor. Aparatul nuclear = nucleoid, ADN bicatenar circular 1 crs N.B. date recente ca V. cholerae contine > 1 crs ADN: pliat n bucle, stabilizat prin ARN i proteine (diferite de histone). Fiecare bucl hiperspiralizat sub aciunea ADN-girazei i topoizomerazei IV (se ntlnesc doar la bacterii). Pe ADN sunt fixate enzime de sintez (ADN - , ARN polimeraze). 5

Metode speciale de colorare (Feulgen): HCl.aldehida.react. Shiff.culoare rosie ??? colorare Plasmide: elemente genetice (ADN) extracromozomiale, capabile de replicare autonom. Confer bacteriei caractere suplimentare. Se transmit celulelor-fiice la diviziunea bacteriei. Plasmidele conjugative F se transmit prin conjugare. Episom - plasmida integrat n cromosom integrat Tipuri de plasmide: F factor de fertilitate, conjugative (sinteza pililor F) R rezisten la antibiotice Ent producerea enterotoxinei Hly producerea hemolizinei Col producerea de bacteriocine Utilizarea practic: n tehnologii de ADN-recombinant 13.Sporii bacterieni. Compozitia chimica si functiile biologice. Etapele sporogenezei. Amplasarea sporului in celula. Exemple de specii patogene sporulate, de desenat. Metodele de evidentiere a sporilor. Bacterii sporogene, G+: Bacillus, Clostridium. sporogene, F. vegetativa = activa metabolic Spor: Inactiv metabolic Coninut sczut de ap liber Coninut mare (pn la 10%) n dipicolinat de calciu Rezistent la temperaturi i pH extreme, desicare, radiaii, ageni chimici i fizici n condiii favorabile sporul germineaz, dezvoltndu-se forma vegetativ. Forma sporului (sferic, oval) i poziia n celul (central, subterminal, terminal) sunt caractere utile n identificarea bacteriilor. Pozitia sporului in celula: central subterminal terminal terminal, cu deformarea celulei Structura sporului: exospor tunica externa = straturi proteice rezistenta la subst. chimice (ex. apa oxigenata) tunica interna ??? cortex = PG inlaturare osmotica a apei dehidratare PC sporal protoplast = nucleoid + ribosomi + E de reparare ADN 15% masa uscata spor = dipicolinat de Ca, localizat in protoplast stabilizare ADN ADN asociat la DNA binding proteins protectie contra temperaturii inalte, radiatiilor, desicatiei Stadiile sporogenezei (durata 36-72 ore); stimul carenta alimetara Stadiul I se formeaz filamentul axial, compus din ADN Stadiul II divizarea asimetric a citoplasmei printr-un sept, formarea presporului, care presporului, conine un filament de ADN. MCt nglobeaz presporul. Stadiul III nglobarea complet a presporului, care este limitat de 2 membrane Stadiul IV formarea cortexului de PG ntre cele 2 membrane Stadiile V-VI formarea tunicii proteice la exterior i maturarea sporului. Uneori se formeaz un nveli extern suplimentar - exosporiu Stadiul VII sporul matur este eliberat iar celula-mam se dezintegreaz Germinarea sporului I. activare (reversibil) II. germinatie III. crestere Evidenierea sporilor: colorarea dup AUJESZKY sporilor: 6

14. Capsula bacteriilor. Compozitita chimica si functiile biologice. Metodele pozitive si negative de colorare a capsulei. Exemple de bacterii capsulate, de desenat. Capsula formata din polimeri organici sintetizati in mediul natural de existenta al bct. Se disting: Capsula adevrat (peste 0,2m), vizibil la microscopul optic Capsula 0,2 Microcapsula, detectat la microscopul electronic Microcapsula, Capsula flexibil (slime, glicocalix), o reea lax de fibre polizaharidice, care difuzeaz n mediu. Nu se evideniaz microscopic. Asigur formarea biofilmelor bacteriene ansamblu Asigur structurat de celule bacteriene nglobate ntro matrice de polimeri de origine bacterian, care poate adera la suprafee inerte (ex.: cateter, stimulator cardiac, endoproteze, sonde de intubare, etc) sau esuturi vii. Compoziia chimic: ap i substane organice (polizaharide, mucopolizaharide, peptide) : Bacillus anthracis acid glutamic Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae PZ Streptococcus pyogenes acid hialuronic Funciile capsulei: 1. Impiedic desicarea bacteriei ([apa] marita) 2. Barier de permeabilitate pentru substane toxice (antibiotice, ioni metalici) antibiotice, 3. Barier protectoare faa de factori antiinfecioi (complement, fagocite), bacteriofagi, protozoare 4. Rezerv nutritiv 5. Aderarea bacteriei la substrat esuturi sau suporturi inerte substrat 6. Specificitate Ag de specie sau tip (Ag K) (Ag K) S. pneumonia: patogenitate marita in prezenta capsulei Evidenierea capsulei Coloraia Burri-Hinss coloratie negativ Coloraia Pe lam se amestec suspensia bacterian cu tu de China, se etaleaz, se usuc Frotiul se fixeaz cu alcool Se coloreaz frotiul cu fucsin apoas apoas Rezultatul: capsula apare ca un halou incolor pe fondul negru. Citoplasma bacteriilor se Rezultatul: coloreaz n rou. Coloraia Romanovski Giemsa (capsula se coloreaz n roz) coloraie pozitiv 15. Flagelii. Structura si compozitia chimica. Clasificarea bacteriilor dupa amplasarea si numarul flagelilor. Metodele directe de studiere si evidentiere a flagelilor. Coloratia Loeffler. Pilii bacterieni, tipurile. Flageli = structuri filamentoase proteice. Rol: 1. mobilitate 2. Ag H Tipurile de bacterii dup dispoziia flagelilor monotriche (Pseudomonas) lofotriche = un mnunchi de flageli la o extremitate (Spirillum) amfitriche = cte un flagel sau un mnunchi de flageli la fiecare extremitate peritriche = flageli pe toat suprafaa celulei (Proteus vulgaris) La spirochete flagelii se plaseaz n spaiul periplasmic flageli interni, periplasmatici. Structura flagel 1. filament = helicoidal, alcatuit din flagelina 2. cirlig de articulatie 3. corp bazal G+ inel intern (MCt) inel extern (PG) G7

disc M (Mct) disc S (spatiu periplasmatic) disc P (PG) disc LPZ (MEx) Sinteza flagel = proprietate de autoasamblare Rotire flagel E. coli = 270/s Motilitatea e determinate de chemotaxis. Bct nu allege directia de miscare, cid oar determina daca trebuie sau nu sa continuie miscarea in aceeasi directie. Evidentierea flagelilor: microscopie electronic coloratie Loeffler (mordansarea cu tanin, sruri de aluminiu, fer, apoi colorarea cu fucsin sau albastru de metilen) Pilii comuni (fimbriile) elemente proteice fine, rigide, scurte, pe bct G-. Structura: prot. pilina, fixate de MEx. Numrul fimbriilor per celul: sute. : Rol pili: 1. adeziunea bacteriilor la suprafee inerte, la celule sau alte bacterii 2. Ag F Pili conjugativi structuri capiliforme de natur proteic, prezeni n numr de 1-10 per celul Pili (codificati de plasmide conjugative F). Rol pili conjugativi: 1. transferul de ADN prin conjugare transferul 2. R pentru unii bacteriofagi Evidenierea pililor: microscopia electronic 16.Metodele indirecte de studiere a mobilitatii bacteriilor. Pregatirea preparatelor native. Metodele de examinare. Principiul microscopiei cu fond negru si contrast de faza. Studierea preparatelor native pictur suspendat sau ntre lam i lamel (microscopia cu contrast de faz sau pe fond negru). nsmnarea culturii bacteriene n medii semisolide (se observ turbiditate) . (se observ Creterea culturii n vl pe suprafaa mediului solid. 17.Granulatiile de volutina. Compozitia chimica si functiile biologice. Metodele de evidentiere. Coloratia Loeffler si Neisser. Mecanismul si tehnica de colorare. Exemple de bacterii cu granulatii de volutina. Importanta practica. Tipuri de incluziuni Ct: glicogen sau PHB (poli-beta-hidroxibutirat) vacuole de gaz plutire (ex. cianobacterii) magnetosomi = incluziuni de Fe sub forma de magnetit --. orientare in cimpul magnetic al pamintului granule de volutina (polimetafosfat) = granule metacromatice La tratarea cu unii colorani bazici granulele de volutin se coloreaz n alt culoare, de ex. n rou-violet la colorarea cu albastru de metilen fenomenul metacromaziei. Rol granule de volutina: 1. rezerva energetic 2. sursa de fosfati sinteza AN 3. scadere presiune osmotic Interesul medical: la agentul difteriei, Corynebacterium diphtheriae, granulele de volutin se medical: agentul localizeaz la extremitile celulei, iar la corynebacterii nepatogene sunt repartizate neuniform n citoplasm. Evidenierea: metoda Loeffler, metoda Neisser 18. Morfologia si ultrastructura spirochetelor. Clasificarea. Metodele de studiere. Speciile patogene si diferenierea lor. 19. Morfologia si ultrastructura micoplasmelor si chlamidiilor. Metodele de studiere. Speciile patogene. 8

20. Notiuni de sterilizare, obiect steril si nesteril. Sterilizarea cu vapori fluizi si sub presiune. Obiectele si regimurile sterilizarii. Controlul eficienei sterilizrii. 21. Notiuni de sterilizare, obiect steril si nesteril. Sterilizarea cu aer fierbinte. Obiectele si regimurile sterilizarii. Controlul eficienei sterilizrii. 22.Notiuni de sterilizare, aseptica si antiseptica. Metoda mecanic de sterilizare. Aplicarea practica. Tipurile de filtre. Conservantii. 23.Metabolismul microbian. Particularitile. Enzimele bacteriene. Clasificarea, rolul in fiziologia microbian. Aplicarea practic in microbiologie. Metabolismul bacterian = ansamblu de reacii biochimice care au loc n celula vie, format din cata- si ana- bolism. Particularitile metabolismului bacterian: 1. metabolism unicelular, necompartimentat (toate procesele metabolice intr-o singur celul) 2. foarte flexibil, diverse ci metabolice (adaptare rapida la condiiile mediului) 3. foarte intens (viteza reaciilor este mare) 4. produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct n calitate de precursori pentru reaciile anabolice (amfibolism) 5. prezenta catalizatori proteici specifici enzime Caracter special al E bct: active n limite largi de temperaturi (0-65C) i de pH (2-9) Clasificare E: Constitutive, permanente Inductive, adaptive, se sintetizeaz n prezena substratului (ex.: lactaza) Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n exces a produsului reaciei catalizate Dup locul de aciune (exoenzime, endoenzime) Dup tipul reaciei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligaze) Dup impactul asupra ma/o Enzime metabolice Enzime de patogenitate (hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza) Importana practic a studierii enzimelor 1. Identificarea i clasificarea bacteriilor (enzimele determin activitatea biochimic specific a bacteriilor) 2. Substrat pt unele AB 3. Determinarea mecanismelor patogenezei infeciilor (unele enzime sunt responsabile de producerea leziunilor n esutul gazdei) 4. Aplicarea industrial a enzimelor 24. Nutriia bacteriilor. Tipul nutriiei si mecanismele transportului nutrienilor in celula bacterian. Clasificarea m/o dupa sursele de carbon. Notiune de m/o saprofite si parazite. Nutriia modalitile prin care bacteriile asimileaz din mediu substanele necesare pentru metabolism. Modul (tipul) de nutriie = absorbtiv. Nutritii se obtin prin solvire (sruri minerale, CO2, O2) sau dup o digestie prealabil (proteine, polizaharide, lipide). Digestia: G+ extracelular G- n spaiul periplasmic Transportul transmembranar 1. Difuzie simpl: O2, CO2, AG, nutrieni liposolubili 2. Difuzie facilitat (permeaze): molecule mari 9

3. Transport activ (proteine de transport specifice = ABCtransportori) 4. Translocaie substratul este modificat (ex.: fosforilat) n timpul transportului membranar; necesit energie. ex. PEP + glucid piruvat + glucid-P 5. transport Fe = secretie siderofori N.B. G-: necesitate traversare prealabila a MEx MEx contine prot. de transport specfice (OmpE, prot. speciale pt vit. B12) Excreia metaboliilor difuzie, proteine de transport, liza bacteriei Necesitile nutritive ale bacteriilor Necesiti elementare, de baz: C, H, O, N n cantiti importante, S, P, Fe, Ca, Mg, K n cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, Mo Necesiti specifice: bct prototrofe = capabile a-i realiza integral sinteza metaboliilor eseniali bct auxotrofe - solicit suplimentar compui organici preformai (factori de cretere), care nu pot fi sintetizai de bacterie (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul de cultur este indispensabil creterii acestor bacterii. Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbon Bacterii autotrofe utilizeaz CO2 ca unic surs de carbon (nepatogene) Bacterii heterotrofe utilizeaz carbonul din compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli, etc) Bacteriile care utilizeaz materia organic moart sunt saprofite (reciclarea materiei organice) Bacteriile parazite (obligate, facultative) triesc pe contul organismelor vii, aducndu-le prejudicii Bacteriile patogene reprezint parazite care afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau moarte. Surse de azot AA sau acizi nucleici Sruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic Surse de substane minerale: S - din AA, sulfuri, sulfai; P - din fosfai; K, Mg, Ca, Na - din sruri minerale; Zn, Cu, Mn, Mo din ap 25. Clasificarea m/o dupa sursele de energie. Mecanismele de obtinere a energiei la bacteriile chemoorganotrofe. Clasificarea m/o dupa tipul de respiratie. Exemple. Clasificarea bacteriilor dup sursa de energie fototrofe utilizeaz energia solar (fotosint) chemotrofe folosesc energia degajat din reaciile chimice de oxido-reducere. Ele necesit un substrat donor de hidrogen (e- i H+) i un substrat acceptor de hidrogen. chemolitotrofe donorul de H = substan anorganic chemoorganotrofe donorul de H = substan organic (glucoza, lipide...) Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe Mecanismele de obinere a energiei la chemoorganotrofe n funcie de acceptorul final de H : Respiraie aerob. Acceptorul final este oxigenul gazos. Implic lanul respirator de transport al electronilor asociat MCt. Produs final H2O sau H2O2 . Respiraie anaerob. Acceptori finali compui anorganici (nitrat, sulfat, S). Transportul de electroni prin lanul respirator. Produse finale nitritul, amoniacul, sulfura (n prezena O H2O2). Fermentaie. Substratul organic este metabolizat fr intervenia unui agent oxidant extern. Const n procese de ox-red care realizeaz numai o oxidare parial a substratului, donorul i acceptorul de H+ fiind substane organice. Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o molecul mai oxidat (ex.: fermentare lactic, 10

fermentare alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc). Fermentaia se poate desfura n prezena O2, dar fr intervenia acestuia. Clasificarea bacteriilor dup sursele de energie i carbon: Bacterii fotoautotrofe (energie solar, CO2) Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., subst.org) Bacterii chemoautotrofe Bacterii chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe) 26. Cresterea si multiplicarea bacteriilor. Fazele multiplicarii culturilor periodice (discontinue) de bacterii. Cultivarea bacteriilor si conditiile (principiile) necesare pentru cultivare. Creterea mrirea coordonat a masei i volumului structurilor bacteriene ca rezultat al proceselor de sintez. Multiplicarea creterea numrului de celule pe o unitate de suprafa sau de volum. Diviziune binar nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme) Autoreproducere (virusuri) Spori (micete) Fragmentare (actinomicete) Ciclul celular procesele care au loc de la formarea celulei pna la urmtoarea diviziune. Faza C replicarea ADN Faza G de laten, segregarea cromozomilor Faza D de diviziune, formarea septului Replicarea ADN depinde de masa critic a celulei, iar separarea cromozomilor i diviziunea intervin n momentul cnd celula atinge o lungime limit. Perioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul (perioada) de generaie (TG). Durata TG depinde de specie i de condiiile de cretere (condiii optime vitez maxim). Creterea bacteriilor n laborator cultivare izolare Rolul izolarii bct: 1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic) 2. Testatea sensibilitii lor fa de AB 3. Obinere produi de biosintez (AB, aa), bioconversie (hormoni steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, etc), producerea vaccinurilor, probioticelor... Pentru cretere bacteriile au nevoie de nutrieni i condiii fizico-chimice adecvate. Condiiile (principiile) de cultivare: 1. Surs nutritiv adecvat 2. Surs de energie 3. Ap 4. Temperatura potrivit 5. pH adecvat 6. Concentraie optim a oxigenului i a CO2 7. Presiune osmotic adecvat Temperatura de cretere Exist temperaturi minime, maxime i optime de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu temperatura optim deosebim: psichrofile t optim 10-20 C. Cresc i la 0 C. mezofile optimum 30-37 C (limite 15-45 C) termofile optimum 50-60 C (pn la 95 C) hipertermofile (cresc la 70110 C) pH neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) pH 6-7,5 acidofile pH 2-6 (Lactobacillus) alcalofile pH >8 (Pseudomonas, Vibrio) Presiunea osmotic 11

halotolerante (osmotolerante) cresc n concentraii reduse de NaCl (mediu izotonic cu mediul intern al gazdei) mi/o patogene halofile prefer concentraii mari de NaCl (1-30%) stafilococi, vibrioni (Vibrio parahaemolyticus)

Oxigenul strict aerobe cresc doar n prezena O2. Obin energia prin respiraie aerob microaerofile necesit concentraii reduse de O2 i 2-10% CO2. Obin energia prin respiraie sau fermentaie. Neisseria, Brucella, Campylobacter strict anaerobe cresc doar n absena O2. Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie anaerob. Absena catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei. Clostridium, Bacteroides anaerobe aerotolerante pot crete n prezena O2, obin energia prin fermentaie, posed peroxidaz Lactobacillus, streptococi facultativ anaerobe cresc n orice condiii, obin energia prin respiraie sau fermentaie 27.Mediile de cultura. Principiile de clasificare. Mediile uzuale. Componenta. Destinatia lor. Manifestarea cresterii bacteriilor in medii lichide si solide. MC = soluii/substrate solide, asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice pt cultivarea bct. Pot fi utilizate pt: 1. cultivarea (izolarea) bacteriilor 2. testarea sensibilitii la AB 3. stocarea sau transportul culturilor bacreiene. Cerinele fa de MC: a. necesitile nutritive i energetice bct b. umiditate optimal c. pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de tampon) d. potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH210) e. izotonic (0,5% NaCl) f. steril i transparent Clasificarea MC: Dup provenien Empirice, naturale. Au la baz produse de origine animal sau vegetal (snge, ser, lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord, creier, ficat, pete, levuri, etc). Compoziia chimic precis nu poate fi controlat. Sintetice includ ingrediente chimice pure, compoziia chimic este cunoscut cu exactitate Semisintetice Dup consisten Lichide (bulion) utilizate pentru obinerea biomasei bacteriene i a produselor lor (AB, E, toxine) Solide conin 10-15% gelatin sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roii, t topire 80-100C, solidificare 42C). Placa de geloz n cutii Petri izolarea culturilor pure; geloza nclinat (n pant) acumularea culturilor pure. Semisolide 0,2 0,5 % agar-agar. Se utilizeaz pentru studierea activitii biochimice sau a mobilitii bacteriilor. Dup compoziia chimic (complexitate) i destinaie Medii uzuale (universale, simple) Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5% NaCl) Bulion peptonat BP (extract apos din carne + 1% pepton+0,5% NaCl) Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar) Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin) Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor nepretenioase la cultivare Sterilizarea prin autoclavare: 120C, 20 min Medii complexe: 12

elective selective: pe mediu solid pe mediu lichid = mediu de imbogatire diferential-diagnostice (DD) izolare cultura pura multitest, pt acumulare cultura pura si identificare preliminara identificare finala speciale de transport Medii elective formate din medii simple cu adaos de componente care permit creterea mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloz-snge streptococi, neisserii; ser coagulat corinebacterii, etc) Medii selective medii solide cu adaos de componente sau cu condiii fizico-chimice particulare care stimuleaz creterea unor specii i inhib creterea altor specii (geloza salin stafilococi, geloza alcalin - vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc) Mediile de mbogire reprezint medii selective lichide, utilizate pentru mbogirea florei patogene i inhibarea florei de asociaie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale) a. Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit) b. Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de briliant) Salmonella c. Bulion cu selenit Shigella, Salmonella d. Ap peptonat alcalin (pH=8) Vibrio cholerae e. Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) pentru anaerobi Medii diferenial-diagnostice (DD) permit diferenierea speciilor bacteriene n baza activitii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere) Sunt construite dup urmtoarea schem: Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate) Medii DD pentru izolarea culturii pure Studierea proprietilor zaharolitice Endo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na) Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen) Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant) Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin) Studierea proprietilor de oxido-reducere Mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella (colonii negre reducerea sulfitului n sulfura de Bi) Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de K) pentru Corynebacterium diphtheriae Studierea proprietilor lipolitice Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac n jurul coloniei Studierea proprietilor hemolitice Geloza-snge (geloza+5-15% snge defibrinat) in cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o zon clar Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S) Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree Indicatorul Andrede fucsin+NaOH Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n galben. n pant se apreciaz lactoza/zaharoza (oxidare), n coloan-glucoza (fermentare). Producerea H2S nnegrirea mediului Medii DD pentru identificarea final irul pestri Hiss (lichid sau semisolid): tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite glucide i indicator. Aprecierea dup modificarea culorii (acid - A) i apariia bulelor de gaz (acid i gaz AG) Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i indicatori Medii speciale pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Lowenstein-Jensen pentru agenii tuberculozei, Sabouraud fungi) 13

Medii de transport transportare/stocare material (prelevat). Menine n via bacteriile, fr a favoriza multiplicarea lor. Mediul cu glicerin 30% Soluie tampon-fosfat Soluie NaCl 3% Mediul Cary-Blair Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) pentru anaerobi, neisserii, etc Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic de material ce conine bacterii (inoculum) se ntroduce ntr-un mediu de cultur (nsmnare, inoculare), care ulterior va fi incubat n termostat (pentru asigurarea temperaturii optime). n timpul incubrii (18-24-48 ore..) bacteriile cresc i se divid, formnd o cultur bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu). M.tuberculosis 3-5 sptmni V.cholerae 6-12 ore Cultur pur format din bacterii de aceeai specie (indispensabil identificrii) Cultur mixt compus din bacterii de specii diferite Tulpin populaie microbian constituit din descendenii unei singure izolri n cultur pur, care va fi studiat ulterior. Clon populaie care rezult din multiplicarea unei singure celule Manifestarea creterii i multiplicrii bacteriilor n mediu lichid Turbiditate uniform Formarea unei pelicule la suprafaa mediului (vibrioni, yersinia - agentul pestei) Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe perei (streptococi, Bacillus anthracis) n mediu solid formarea coloniilor Colonie o aglomerare de bacterii care se dezvolt dintr-o singur celul sau un grup de celule (UFC - unitate formatoare de colonii) pe suprafaa unui mediu solid. Fiecare specie bacterian formeaz colonii specifice (caracter util n identificare). Caracteristica coloniilor a. Dimensiuni colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm) b. Contur (margini) neted, ondulat, zimat, lobat, etc c. Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat, etc d. Form punctiform, circular, filamentoas, neregulat e. Culoare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc f. Densitate opac, transparent, etc g. Consisten cremoas, untoas, uscat, mucoid Tipurile de colonii Colonii S (smouth) rotunde, netede, umede, lucioase Colonii R (rough) margini neregulate, suprafaa uscat, rugoas Caracterele de cultur ale bacteriilor = exigenele nutritive (medii, temperatur, pH, aerare, etc), viteza i manifestarea creterii pe medii lichide i solide Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi n funcie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting: Culturi discontinue Culturi continue Culturi sincrone Culturile discontinue se obin la cultivarea bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul microbiologic Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue

14

I. Faza de lag faza de adaptare la condiiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc n dimensiuni, dar nu se divid. Durata este variabil (2-4 ore); depinde de starea bacteriei, condiiile mediului, etc II. Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu vitez maximal constant, curba evolueaz exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la ageni antimicrobieni (culturi utile pentru testarea sensibilitii la antibiotice). Durata 8-10 ore. III. Faza staionar rata celulelor care se multiplic scade treptat, numrul celulelor vii rmne constant mai multe ore. Cauza consumarea nutrienilor, acumularea metaboliilor toxici. Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare). Sensibilitatea la agenii antimicrobieni scade. Durata 10-12 ore. IV. Faza de declin (letalitate) bacteriile mor progresiv. Cultura continu se realizeaz cnd mediul de cultur este continuu rennoit i mbogit cu oxigen cu evacuarea unei cantiti de cultur. Se realizeaz n chemostate sau turbidostate, cultura aflndu-se permanent n faza exponenial. Se utilizeaz n microbiologia industrial. n intestin culturi continue. Culturi sincrone culturi n care bacteriile se divid n acelai timp. ??? 28.Metoda bacteriologic in diagnosticul bolilor infecioase. Scopul. Prelevate de la pacieni si din mediul ambiant. Principiile de recoltare, ambalare si transportare in laborator. Pregatirea probelor pentru investigatiile de laborator. 29.Examenul bacteriologic. Etapele de izolare a culturilor pure de bacterii aerobe. Volumul de lucru la fiecare etapa. Principiile de identificare a culturii pure. Examenul bacteriologic = inocularea prelevatel pe MC izolare cultura pura identificare, testare sensibilitate la AB, eventual conservare. Etape examen bacteriologic: 1. Faza pre-analitic (responsabilitatea medicului) Prescrierea investigaiei (n funcie de datele examenului clinic i paraclinic). n ordonan se fixeaz identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestrile patologice, locul, data apariiei, alte date: imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc. 2. Prelevarea probelor Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare a agentului patogen) Modul de prelevare (recoltare) : n recipiente sterile Respectnd regulile de autoprotecie La debutul bolii Pn la administrarea antibioticelor 3. Transportarea Imediat sau utiliznd medii de transport, cu respectarea condiiilor speciale dup necesitate n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...) n fia de nsoire s fie indicat identitatea pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data, ora prelevrii, scopul investigaiei) Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni: Secreii rino-faringiene Sput Puroi Exudate Snge LCR Urin Mase fecale Bioptate Material cadaveric 15

Materiale de examinat din mediul extern: Ap Alimente Sol Aer Lavaje Vectori, etc EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURILE AEROBE Prelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) orientare n diagnostic Dup necesitate, probele sunt supuse pregtirii pentru investigaie (diluare, omogenizare, centrifugare, etc) Examinarea microscopic (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Hinss...) prezena mi/o, forma, cantitatea, G+/-. I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE Scopul izolrii - de a obine o cultur pur dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un produs patologic. Tehnici utilizate: o Prin epuizarea inoculului pe suprafaa gelozei din cutia Petri (nsmnare n striuri paralele, nsmnare n cadrane, etalarea consecutiv pe trei cutii). o Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n geloz topit i rcit la 50 C (10-1, 10-2,...), apoi turnate n cutii Petri sau eprubete. Incubare n termostat la 37 C, 18-24 h (n funcie de TG). Metode speciale de izolare n culturi pure: bct sporulate: nclzirea prealabil a prelevatului 80 C 20 min bct acido-rezistente: tratarea prealabil cu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar cu o baz bct din asociaii cu numr minim de mi/o patogene: mbogirea prealabil a florei patogene utiliznd medii de mbogire bct cu virulen nalt i pretenioase la cultivare: inocularea la animalele de laborator sensibile II etap ACUMULAREA CULTURII PURE Examinarea macroscopic a coloniilor crescute (form, culoare, dimensiuni, etc) Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte confirmarea puritii culturii Repicarea coloniilor suspecte pe geloz n pant acumularea culturii pure Termostat, 37 C, 18-24 ore III etap IDENTIFICAREA CULTURII PURE Verificarea puritii culturii (frotiu Gram) Identificarea culturii pure const n evidenierea unor caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include ntr-o familie, gen, specie, variant Se studiaz caracterele: 1. Morfologice 2. Tinctoriale 3. De cultur 4. Biochimice 5. Antigenice (seroidentificarea) 6. De patogenitate 7. Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea) 8. Sensibilitatea la AB IV etap EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA RSPUNSULUI Compararea rezultatelor obinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a gsi asemnri. Exemplu de rspuns: Din proba examinat a fost izolat tulpina de Corynebacterium diphtheriae, biovar gravis, tox+, sensibil la ...., rezistent la ..... STUDIEREA ACTIVITII BIOCHIMICE A BACTERIILOR Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea laptelui, etc) 16

Activitatea proteolitic Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea laptelui, etc) Evidenierea enzimelor specifice (ureaz, decarboxilaze, dezaminaze, etc) prin detectarea produsele finale ale reaciilor: H2S, NH3, indol o Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fer de culoare neagr n mediile multitest Kligler, Olkeniki, etc; plasarea unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu acetat de Pb deasupra BP n care crete cultura studiat (formarea sulfurii de Pb nnegrete hrtia) o Depistarea indolului (produs al metabolizrii triptofanului) benzi de hrtie mbibate cu acid oxalic. n prezena indolului indicatorul vireaz n roz. o Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de turnesol se coloreaz n albastru. o Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2): cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat apariia bulelor de gaz o Depistarea oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei din lanul respirator) Reactiv di (tetra)metil-parafenilen-diamin (benzi sau rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc) Oxidarea reactivului culoare violet-neagr Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas Oxidazo- : Enterobacteriaceae o Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% - formarea unui halou opac n jurul coloniilor o Depistarea lipazei mediu cu Twin 80 1% halou opac n jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai) o Depistarea hemolizinei geloz-snge 5-10% - zon clar n jurul coloniei o Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc Probele sunt incubate la 37 C, 18-24 h Identificarea rapid Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de timp, spaiu, material) Sistemul API o galerie din plastic format din numeroase alveole care conin fiecare un mediu deshidratat diferit (glucide, AA, etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie bacterian testat i incubate. Ulterior la necesitate se adaug reactive pentru detectarea metaboliilor particulari. Lectura conform unui cod de cifre sau computerizat 30.Metodele de creare a condiiilor de anaerobioz pentru cultivarea anaerobilor. Izolarea culturilor pure prin metoda Zeissler. Volumul de lucru la fiecare etapa. Particularitatile de identificare a culturilor pure. EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene) Condiia principal cultivare n absena oxigenului Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100 C, 20 min, rcit, acoperit cu vazelin; nsmnarea n geloz n coloan) Crearea condiiilor de anaerobioz Metoda fizic utilizarea anaerostatului Metoda chimic n exicator se ntroduc substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz); utilizarea gas-pachetelor Metoda biologic Fortner cultivarea concomitent a aerobilor i anaerobilor Recoltarea cu precauie, evitnd contactul cu aerul (n seringi, utiliznd medii speciale) I etap MBOGIREA ANAEROBILOR nsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat nclzirea unui tub la 80 C, 20 min distrugerea florei nesporogene Incubarea la 37 C, 24-48 h (va avea loc nmulirea anaerobilor) II etap - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI Studierea caracterelor de cultur tulburarea mediului, descompunerea bucilor de ficat, etc

17

Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (nsmnarea a 0,1 ml din mediul KT pe 3 cutii cu geloz-snge glucozat consecutiv). Incubarea n anaerostat/exicator/gaspack, 24-48 h Metoda Weinberg diluii succesive a culturii n geloz glucozat lichefiat i aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise ermetic. Incubarea n termostat, 24 h III etap - ACUMULAREA CULTURII PURE Studierea macroscopic a coloniilor Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte Repicarea n mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pure Incubarea n termostat, 24 h IV etap - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI Verificarea puritii culturii pure (frotiu Gram) Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiiilor de anaerobioz) V etap - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA I ELIBERAREA RSPUNSULUI 31. Antagonismul microbian. Tipurile. Mecanismele. Metodele de studiere. Aplicarea practica. Eubioticele. Exemple. BIOTOP spaiu cu condiii de via particulare (conjunctiva, mucoasa intestinal, orofaringe, vagin, tegument, etc), populat i transformat de asociaii de fiine vii. MICROBIOCENOZ (comunitate microbian) asociaii microbiene ce populeaz un biotop. Microorganismele prezente ntr-un biotop particular constituie microflora acestui habitat (m/f cutanat, intestinal, etc). Aceasta joac un rol important n protejarea gazdei fa de o invazie microbian ulterioar, actionnd prin urmtoarele mecanisme: 1. competiia pentru aceiai nutrieni; 2. competiia pentru aceiai R de pe celulele gazdei; 3. producia de bacteriocine; vitamine; 4. producerea de acizi grai volatili sau ali metabolii; 5. stimularea continu a sistemului imun; 6. stimularea producerii unor factori imuni de protecie (anticorpii naturali). ntre microorganismele unui biotop se pot stabili relaii: Indiferente (neutralism) Favorabile (comensalism/satelitism, simbioz/mutualism, sinergism) Defavorabile (parazitism, antagonism) Antagonism o specie inhib sau omoar alt specie prin mecanisme specifice sau nespecifice Mi/o care manifest activitate inhibitoare antagonist (A), mi/o care sufer concurent (C). Antagonism nespecific: Antagonistul este mai activ, utiliznd nutrienii, oxigenul. Antagonistul produce metabolii toxici (acizi, indol, H2S, amoniac, peroxid, etc). Antagonism specific antagonistul produce substane cu aciune specific asupra unui sau mai multor concureni (AB, bacteriocine). Efectul aciunii unui antagonist asupra concurentului poate fi bacteriostatic sau bactericid (uneori bacteriolitic). Utilizarea practic a antagonismului microbian: 1. depistarea mi/o produceni de antibiotice (micete, actinomicete, bacterii) 2. obinerea produselor biologice curative de origine microbian (probiotice, eubiotice/sinbiotice): Lactobacterina, Colibacterina, Bifidumbacterina, Bificol, etc 3. crearea biocenozelor favorabile organismului METODELE DE STUDIU AL ANTAGONISMULUI n mediu solid (metoda traneei) antagonistul se nsmneaz n centrul cutiei, concurenii perpendicular. Termostat 24h. Aprecierea dup dimensiunea zonei de inhibiie a creterii culturii concurentului. n mediu semisolid I strat antagonistul, II strat concurentul. Termostat 24h. Aprecierea zon clar ntre straturi. nsmnarea n mediu lichid (BP) a unui numr egal de A i C. Dup 24 h de incubaie se rensmneaz 0,1 ml pe placa cu geloz. Se compar numrul coloniilor de A i C.

18

32.Antibioticele. Notiune. Clasificarea dupa producent, spectrul si efectul de actiune asupra celulei bacteriene. Mecanismele de actiune a antibioticelor. Exemple. ANTIBIOTICE (AB) produse de origine natural (microbian, animal sau vegetal), derivai (AB) semi-sintetici sau produse sintetice care inhib sau omoar selectiv unele mi/o sau/i celule tumorale, fr a exercita ca regul efecte toxice asupra macroorganismului. tumorale, Clasificarea AB Dup efectul asupra celulei Bacteriostatic (tetraciclina, cloramfenicol) cloramfenicol Bactericid (streptomicina, polimixina) Bacteriolitic (peniciline, cefalosporine) Dup spectrul de activitate spectru restrns (ngust) de aciune (AB anti-G+, anti-G-, anti-tuberculoase, antimicotice, anti-tumorale) spectru larg de aciune (G+ i G-) Dup producent (origine) fungic (peniciline, cefalosporine,...) actinomiceta (aminoglicozide, macrolide, cloramfenicol, etc) microbian (bacitracina din Bacillus subtilis, gramicidina din Bacillus brevis, polimixina subtilis, brevis, din Bacillus polimyxa) polimyxa) vegetal fitoncidele (alicina, rafanin, imanin) animal (lizozimul din albu de ou, ecmolina din oase de pete, eritrina din mas eritrocitar, splenocitina din splin) Dup compoziia chimic (beta-lactamice, macrolide, aminoglicozide, fenicoli, polipeptide, compozi poliene, sulfamide, chinolone i fluorochinolone, nitrofurani, etc) Mecanismul de aciune al AB o AB cu aciune asupra sintezei peretelui celular (dereglarea sintezei peptidoglicanului) Beta-lactamice (peniciline, cefalosporine). Deregleaz procesul de sintez a PG, inhibnd transpeptidazele (inta - PFP) Vancomicina, teicoplanina (blocheaz transferul pentapeptidului din MCP spre peretele celular) Bacitracina (blocheaz reciclarea moleculelor de transport transmembranar - bactoprenol) Fosfomicina (blocheaz piruviltransferaza, implicat n sinteza acidului N-acetil muramic) Efectul acestor AB este bactericid/litic, doar celulele metabolic active sunt omorte. Nu afecteaz celulele eucariote (lipsa PG). afecteaz o AB cu aciune asupra MEx i a MCt AB polipeptidice (polimixina, colistina). Se fixeaz pe membrane bacteriene (n special pe lipidul A (ME la bacterii G-), provocnd dezorganizarea lor. Efect bactericid. AB polienice (nistatina, levorina, amfotericina B, etc). Se fixeaz pe sterolii MCP ale micetelor, perturbnd respiraia i dezorganiznd MCP (permeabilitate excesiv i moartea celulei). Aceste AB acioneaz i asupra celulelor n repaos. Relativ toxice, n special nefro. o AB cu aciune asupra ribozomilor 30S (aminoside: streptomicina, kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina; tetracicline) 50S (cloramfenicol, triamfenicol; macrolide: eritromicina, oleandomicina; lincosamide: clindamicina, lincomicina). Se leag pe receptori specifici de pe subunitile 30S sau 50S, perturbnd sinteza proteic (inhibiia transpeptidazei, a translocaiei peptidelor, etc). Rezult inhibiia sintezei proteice sau sinteza proteinelor nefuncionale. Efectul este bacteriostatic (aminosidele bactericid), doar asupra celulelor active metabolic. o AB cu aciune asupra acizilor nucleici Rifampicina inhib ARN-polimeraza ADN-dependent. Rezult stoparea sintezei ARNm Novobiocina , Chinolonele (acidul nalidixic, ciprofloxacina, ofloxacina) blocheaz activitatea Novobiocina topo-izomerazelor, intervenind n conformaia ADN-ului. Efect bactericid. Sulfamidele i trimetoprimul perturb sinteza acidului folic i folailor (cofactori n sinteza AN). Activitate bacteriostatic. Producerea AB 19

Metoda biologic Metoda sintetic Metoda semi-sintetic Etapele metodei biologice: 1. Cultivarea tulpinilor-producente (ex.: Penicillium notatum, Actinomyces griseum, etc) n etc) mediu lichid adecvat 2. Extragerea AB 3. Purificarea i concentrarea AB 4. Controlul toxicitii 5. Determinarea activitii AB Activitatea AB se msoar n uniti de mas (g, mg, g) sau de aciune (UA). 1 UA cantitatea minimal de AB care inhib creterea unei tulpini de referin n condiii standarde. Penicilina 1UA = 0,6 g de substan pur Cerinele fa de AB: 1. Toxicitate selectiv 2. Efect terapeutic cu doze minime 3. Activitate de lung durat 4. Spectru restrns de aciune 5. S fie solubile i absorbite uor 6. S nu provoace efecte secundare 7. S nu se dezvolte rezistena contra AB 8. S fie ieftine 33. Rezistena microbilor la antibiotice, tipurile. Mecanismele rezistenei dobindite si manifestatea ei. Combaterea rezistenei. Cauzele: Factori genetici, proprii bacteriilor Factori ce favorizeaz selecia i difuzarea tulpinilor bacteriene rezistente Tipurile de rezisten: o Natural, ereditar, de specie, prezent la toi membrii unei specii sau gen lipsa intei ex.: micoplasme, micete; imposibilitatea de a atinge inta ex.: Mycobacterium (cerurile, lipidele mpiedic ptrunderea AB n citoplasm); bacteriile nu efectueaz procesul inhibat de AB ex.: acidul folic este preluat din mediu rezisten la sulfamide o Achiziionat, dobndit, afecteaz tulpinile unei specii sensibile. Depinde de aciunea de selecie exercitat de AB utilizate n tratament, urmat de rspndirea ei (ntre bacterii, interuman, transmisie de origine animal). interuman, Diminuarea permeabilitii membranare Modificarea intei moleculare Eliminarea excesiv a AB Inactivarea enzimatic a AB, care poate fi hidrolizat (penicilinaz, cefalosporinaz) sau modificat structural (acetilaze, adenilaze, fosforilaze), etc. Rezistena dobndit se poate manifesta fenotipic (bacteriile n faza de repaos, formele L de bacterii) sau genetic (genotipic) (genotipic) Rezistena genetic poate fi: Cromozomial, determinat de mutaii (10%) Cromozomial, Mecanisme: modificarea intei moleculare, diminuarea permeabilitii membranare Mecanisme: Plasmidic, epidemic, realizat prin transfer de gene prin intermediul plasmidelor R (poate fi Plasmidic, rezisten multipl). Mecanisme: inactivarea enzimatic, modificarea intei, substituia/supraproducia intei, excreie excesiv a AB. Prevenirea rezistenei 1. Supravegherea epidemiologic a tulpinilor rezistente 2. Politic strict de prescriere a AB 20

Respectarea dozelor terapeutice corecte i a timpului de tratament necesar Asocierea AB cu mecanisme de aciune diferite Prescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-lactamaze, utiliznd inhibitori (acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). Ex.: augmentina amoxicilina+acid clavulanic 6. Reciclarea AB 7. Producerea AB noi Efectele negative ale antibioticoterapiei 1. Efect toxic (streptomicina surditate, cloramfenicolul toxic pentru mduva osoas, polipeptidele nefrotoxice, etc) 2. Efect teratogen 3. Aciune sensibilizant (penicilina, etc) 4. Disbacterioz 5. Dereglarea imunogenezei 6. Selecia suelor rezistente Bacteriocinele substane proteice bactericide produse de numeroase specii bacteriene i active asupra altor tulpini ale aceeai specii sau asupra speciilor nrudite. Producerea bacteriocinelor este determinat plasmidic (plasmide Col). Tipuri de bacteriocine: colicine (secretate de Escherichia coli), corinecine (Corynebacterium), coli), vibriocine (Vibrio), piocine (Pseudomonas), etc. Studiul sensibilitii unei tulpini la bacteriocine (bacteriocinotipia) se utilizeaz n scopuri bacteriocinotipia) epidemiologice. Notiuni de tulpini bacteriene sensibile, intermediare si rezistente la antibiotice. Metodele de determinare a sensibilittii microbilor la antibiotice: difuzimetrica (rondelelor), diluiilor succesive. Noiune de concentraie minim de inhibiie (CMI) si concentraie minim bactericid (CMB). Sensibilitatea microbilor la AB n funcie de rezultatele clinice, bacteriile se divizeaz n 3 clase: sensibile la AB (S), rezistente (R) i intermediare (I, moderat sensibile). Tulpinile S efectul terapeutic este obinut cu doze terapeutice uzuale Tulpinile R efectul terapeutic nu poate fi obinut cu doze terapeutice Tulpinile I succesul terapeutic este imprevizibil. Ar fi posibil cu doze mari sau la administarea local a AB. Fiecare tulpin izolat manifest sensibilitate particular. Ea poate fi studiat n laborator pentru determinarea profilului de sensibiliti al acestei tulpini, ceea ce constituie o antibiogram. antibiogram. Testarea sensibilitii bacteriilor la AB o Metoda difuzimetric (rondelelor). Utilizat uzual n infecii banale. Condiii: mediu standard, concentraie standard de mi/o (105/ml), rondele/discuri (comprimate) cu % standarde de AB, condiii standarde. Mediul este inoculat cu suspensia bacterian. Dup uscare n termostat se aplic rondelele 24h, 37C. 37 Lectura diametrul zonei de inhibiie a creterii culturii bacteriene este comparat cu diametrele standarde pentru fiecare AB. Valori sub acest diametru tulpina este R, dac este depit S. o Metoda diluiilor ntr-un ir de tuburi cu 1 ml BP se efectueaz diluia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, etc). Se adaug n fiecare tub (cu excepia celui martor) 0,1 ml de suspensie bacterian 105/ml. Termostat - 24h. Lectura cea mai mic doz de AB care inhib creterea culturii dup 24h de incubare (mediu clar) constituie Concentraia Minim de Inhibiie (CMI) a AB pentru tulpina testat. CMI msoar efectul bacteriostatic. Concentraia Minim Bactericid (CMB) cantitatea minim de AB care omoar 99,9% din inoculum dup 18h de incubare. Determinarea CMB din ultimele tuburi fr cretere se repic 21 34.

3. 4. 5.

0,1 ml de mediu pe placa cu geloz. Dup 24h se compar numrul celulelor ce au supravieuit cu nr iniial de bacterii (105/ml). Corelaia dintre studii in vitro i rezultate in vivo n studii in vitro parametrii (densitatea suspensiei bacteriene, concentraia AB, etc) nu se modific n timp. In vivo, la pacieni, concentraia AB variaz n timp i n funcie de esut. vivo, Pentru a stabili dac tulpina izolat este sensibil sau rezistent la un AB se cere cunoaterea Concentraiei Terapeutice (CT) (cantitatea de AB prezent n focarul infecios n cursul CT) tratamentului cu doze terapeutice) a fiecrui AB testat. Tulpini Sensibile CMI/CT 1, ex.: 8/2, efect terapeutic imposibil CMI/CT> Tulpini Intermediare CMI/CT=1, efect terapeutic imprevizibil. Pot fi utilizate doze maxime de AB sau administrarea lor local Testarea CMI / CMB este indicat n tratamentul infeciilor grave : meningite, septicemii, endocardite, infecii cronice sau la persoane cu imunosupresie. Monitorizatea (supravegherea) tratamentului cu AB. Verificarea eficacitii antibioterapiei. antibioterapiei. 1. Determinarea concentraiilor umorale sau tisulare ale AB Indicaii: Utilizarea unui AB toxic n caz cnd bolnavul sufer de deficiene metabolice sau excretoare (renale, hepatice) Se compar concentraiile obinute cu CMI a antibioticului testat (sau cu CT). 2. Studiul activitii inhibitorii a lichidelor biologice (NEI) Indicaii: infecii grave care nu rspund rapid la tratament. Efectuarea: la diluii duble (1/2, ...) ale lichidului examinat (ser, LCR, urin) se adaug suspensia bacterian (din tulpina izolat de la bolnav). Lectura: dup 24h de incubaie la 37 C se apreciaz diluia maxim cu efect bacteriostatic/cid. NEI 1:8 reflect eficiena antibioticoterapiei 35.Bacteriofagul. Natura. Caracterele morfobiologice. Profagul. Lizogenia. Aplicarea practica a bacteriofagului. Bacteriofagi = virusuri ce infecteaz bacteriile. Parazii intracelulari obligatorii ai bct. acteriof agi virusuri infecteaz ile. Paraz ii intracelulari obligatorii bct. Toate bacteriile pot fi infectate de ctre bacteriofagi. bacteriile po infectate c bacteriof agi In majoritatea cazurilor, un fag anume infecteaz doar celulele unui singur gen, unei anumite cazurilor, infecteaz celulele unui singur nei specii sau a unei tulpini - specificitatea fagului prezena R pt acest fag la suprafaa bctspecii unei specificitate agului prez ena cest sup faa bctgazd . . Structura bacteriofagului Structura Structura fagilor corespunde regulilor generale ce se refer la structura virusurilor. tructura regulilor refer structura virusurilor. 1. Acid nucleic (ADN sau ARN, mai frecvent dublucatenar). nucleic ARN, dublu atenar). 2. Inveli proteic = capsid protecie a materialului genetic. Poseda R la suprafa Inveli proteic protec materia genetic infecia gazdei. Capsida este constituit din subuniti proteice, capsomere, aranjate gazdei. este constituit sub uniti proteice, capsomere, aranjate simetric ntr-o ordine distinct, conferind forma fagului. distinct fagului. 3. Unii fagi pot conine i enzime (ex.: lizozim, neuraminidaza). agi enzi neuraminidaza). Exist 3 forme morfologice principale de fagi: ologic agi Fag icosaedric: form sferic, 20 fee triungiulare, 30 muchii i 12 vrfuri (simetrie cubic a icosaedric eric e triu ngi ulare, v capsidei). Fag cilindric: bastonae proteice formate din capsomere, asamblate ntr-o structur cilindric: bastona proteic formate capsomere, asa mblate ntr-o tubular (simetrie helicoidal a capsidei). Fag complex: constituit din cap icosaedric ataat la o coad helicoidal. Coada este complex: constituit din icosaedric ataat . este format din doua tuburi concentrice, un tub intern rigid - canalul axial, care este inconjurat doua tuburi concentric canalul axial, este de teaca cozii, un manon contractil. Gulerul cozii (colul) se afl la jonciunea capului cu cozii, man afl jonc coada. La partea distal a cozii se afl o plac hexagonal, placa bazal, la fiecare apex La partea afl plac placa baz al, fiind ancorate cte un croet i o fibr. Ele reprezent sistemul de fixare a fagului pe i fibr. reprez stemul fixare agului bacteria receptoare i contribuie la injecia materialului genetic n celul. bacteria receptoare i contribui materia genetic n Nu toi fagii au o astfel de morfologie. Unii au coad lunga i non-contractila, alii - coada to morf nga i non- contractila al scurt, sau far coad . Exist i fagi filamentoi. . agi filamento Interaciunea dintre bacteriofag i celula-gazd 22

Bacteriofagii exist n stare de virioni extracelulari, iar la infectarea unei bacterii ei pot duce la Bacteriofagii virioni extracelulari iar infectarea unei bacterii doua tipuri de infecii: ti de Infecie litic fagii viruleni. La finele ciclului de multiplicare bacteria infectat este li tic agii viruleni finele ci clului multiplicare bacteria infectat lizat elibernd fagii nou-formati. libernd agii nou-formati. Infectie nelitica sau lizogen fagii temperai (moderai). Ei infecteaz bacteriile nfectie lizogen agii tempera (modera i). infecteaz ile fr a le distruge. istrug INFECTIA LITIC (ciclul biologic al fagului virulent) INFECTIA LI TIC clul biologic agului Adsorbia. ciocnire intmpltoare fagul se fixeaz prin intermediul plcii bazale (la inceput Adsorb ia. int mpl agul fixeaz intermediul plcii baz (la prin fibrele sale, apoi prin croete) de un R specific de pe PC bacterian (uneori flageli sau pili). fibrele sale, apoi cro ete) de specific bacteria pili). Penetrarea. fixare ireversibil a fagului pe PC aciune E (ex. lizozim) perforare PC Penetrarea. ireversibil fagului (ex. lizozi contracie manon apropiere cap de placa bazal canalul axial penetreaz MCt ADN man apropiere placa baz canalul penetreaz fagic este injectat in bacterie. agic este injectat Expresia genomului viral (biosinteza componentelor fagice, maturizarea). penetrare Expresia genomului maturizarea). penetrare ADN viral n bacterie (fag vegetativ) timp de aproximativ 12 minute virionul nu este n vegetativ) virionul depistat n bacteria infectat = faza de eclips. Ea coincide cu sinteza enzimelor virale care vor bacteria infectat de eclips. coincide si nteza enzi melor asigura ulterior: ulterior: replicarea ADN fagic; replicarea agic sinteza proteinelor fagice; nteza proteinelor agice; asamblarea acestor elemente. mblar elemente Asamblarea fagilor. sinteza compui capsida i AN n cantiti suficiente asamblarea Asa mblar agilor. compu cantiti spontan a particulelor noi de fagi, prin incorporarea acidului nucleic n capsid . spontan nucleic n . Eliberarea. Majoritatea fagilor, dup maturizare, sunt eliberai n urma lizei peretelui bacterian Eliberarea. fagi zare, su libera n lize pe bacteria cu enzime ale bacteriofagului Timpul dintre infectie i eliberare (ciclul de reproducere) este de 20-60 minute la 37C, fagii Timpul dintre infectie i liberare este de agii sunt eliberai n valuri de 50-1000 fagi per celul. libera n val agi pe INFECTIA NON LITIC SAU LIZOGEN : FAGII TEMPERAI INFECTIA LI TIC LIZOGEN AGII TEMPERA Fagii temperai (moderai) atunci cand infecteaz o bacterie pot: agii tempera infecteaz po 1. sau induce un ciclu complet de multiplicare, ce duce la liza bacteriei, ci clu multiplicare, bacteriei 2. sau, mai frecvent, dup injectarea ADN-ului, s integreze acest ADN n cromozomul DN-ului, integreze acest n cromoz omul bacterian prin recombinare specific, formnd un profag (lizogenizare) bacteria specific, formnd prof 3. sau sa ramn n Ct sub form de plasmid. ram sub plasmid. In ultimele dou cazuri bacteria nu moare i, multiplicndu-se, replic genomul viral dou bacteria nu moar multiplic ndu-se, replic concomitent cu propriul su genom: bacteria (cultura) este numit lizogen. Ea posed i propriul s bacteria este izogen. transmite descendenilor capacitatea de a produce fagi n absena infeciei. transmi descende nilor produc fag absena ei. Proprietile culturilor lizogene Proprietile lizogene Inducia ciclului litic. Profagul pstreaz virulena potenial. Meninerea strii de lizogenie Induc litic. p streaz virulen poten ial Men st lizogenie implic sinteza unui represor proteic, codificat de fag. Dispariia lui duce la inducia ciclului litic. implic ciclului li tic. Inducia se poate declana spontan la un numar limitat de celule sau poate fi provocat la oat declan poat provocat majoritatea celulelor, de ex., la aciunea unor mutageni, ca razele ultraviolete sau mitomicina majoritatea celulelor, ex. ac mutageni, ca razele ultraviolete mitomi cina C. Sistemul SOS activat prot. RecA scindeaza represorul proteic al fagului expresia ciclului stemul activat represo proteic agului expresia ci clului litic. Pentru aceasta profagul trebuie sa fie excizat - operaie invers integrrii. Excizia este tic aceasta prof agul excizat rii. xciz este efectuat de ctre proteina xis, codificat de fag. Urmeaz replicarea genomului, sinteza efectuat proteina xis, codificat Urmeaz genomului, componentelor fagului i fagii asamblai sunt eliberai prin liza celulei (profagul - gen potenial ent ului i agii asa mbla su a prin liza celulei (pr compon ag liber letal !). ! n timpul replicrii fagului moderat fragmente de ADN bacterian pot fi ntroduse din eroare n particulele virale. Aceti fagi pot n continuare ntroduce n cromosomul altor bacterii ADN continuare bacterian capturat = proces de transfer genetic = transducie. Natura genelor bacteriene transferate poate fi diferit: gene din apropierea locului de inserie a fagului (transducie specific) sau fragmente de ADN bacterian ntroduse din ntmplare n capsida fagului (transducie generalizat) Imunitate contra suprainfectiei. Bacteriile lizogene sunt imune la fagul virulent omolog munitate contra suprainfectiei. Bacteriile lizogene su agul profagului gzduit. Acest fag se adsoarbe, injecteaza ADNul, dar fr a se replica sau provoca g zduit. Ace se soa injecteaza DNul, liza. liza. Conversie fagic (modificarea fenotipului celulei cauzat de genele profagului). 23

Bacteriile infectate cu un fag pot prezenta unele caractere absente la celulele neinfectate. acteriile infectate po prez enta celulele ne infectate. Conversie fagic cauzat de: onversie agic cauzat 1. expresia unor gene ale fagului de ctre celule expresia agului c 2. inactivarea unor gene cromozomale la integrarea profagului. inactivarea cromoz omale integrarea pro agului. De ex., tulpinile de Corynebacterium diphtheriae care provoac difteria sunt lizogenizate de un ex. provoac teria su lizogenizate anumit tip de fagi care codeaza i exprim o toxin puternic; toxina eritrogen a ti agi codeaza i Streptococcus pyogenes, etc pyogenes, Cultura i titrarea bacteriofagilor. Efectul fagilor viruleni asupra culturilor ultura i titrarea bacteriofagilor. fec agilor viruleni sup culturilor bacteriene Bacteriofagii sunt cultivai n laborator n mediu de cultur lichid sau solid n prezena bacteriilor cultiva cultur omologe. omologe. Cultivarea n mediu lichid: mediu Bacteriile sensibile i fagii se ntroduc ntr-un bulion nutritiv (nr fagi < nr bct). Amestecul este (nr bct). incubat pentru a permite bacteriilor s se multiplice i de a fi infectate de ctre fagi numrul s c num fagilor crete mai rapid dect cel al bacteriilor pn la un punct critic cnd numrul fagilor cre dec p c num prezeni este suficient pentru a infecta toate bacteriile culturii. Toate celulele bacteriene sunt prezen lizate n acelai timp, ce duce la dispariia complet a turbiditii culturii (clarificarea mediului). acela dispari complet turbiditii Cultivarea fagilor n mediu solid: Amestecul bacterii-fagi poate fi adugat la geloza topit i Amestecul ad rcit la 45 C i apoi turnat n cutia Petri. Bacteriile cresc, se multiplic, formnd o pelicul cresc, fin, iar fagii continu s infecteze provocnd liza confluent a culturii bacteriene. Aceste continu s provoc confluent colonii de fagi se manifest sub forma unor pete sterile (plaje). Numrul plajelor indic numrul fagilor infecioi n prelevat (fiecare colonie se formeaz pe contul multiplicrii unui virion fagic). Bacteriofagii pot fi intlnii n diferite prelevate umane sau din mediul extern. Fagii indic Bacteriofagii prezena bacteriilor sensibile. IZOLAREA BACTERIOFAGILOR Prelevate: ap, sol, materii fecale, puroi, etc Izolarea direct filtrarea prelevatelor prin filtre bacteriene, ultracentrifugare. Izolare prin metoda de mbogire fr nsmnare materialul de examinat se inoculeaz ntr-un mediu nutritiv lichid (pentru multiplicare bacteriile omologe fagului cutat). Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii. In filtrat s-au acumulat fagii care 37 s-au inmulit pe contul bacteriilor omologe din prelevat. Izolare prin metoda de mbogire cu nsmnare inocularea prelevatului ntr-o suspensie bacterian omolog fagului cutat. Cultura bacterian asigur mbogirea fagilor. Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii. 37 INDICAREA BACTERIOFAGILOR Metoda OTTO. Pe placa de geloz din cutia Petri se nsmneaz n gazon suspensia de OTTO. bacterii omologe fagului. n continuare se aplic o pictur de filtrat care conine fag (cutia poate fi nclinat ca pictura s se preling). Cutia se incubeaz la 37 C timp de 24 ore. Aprecierea: dac n filtrat se aflau fagi omologi culturii bacteriene, n locul aplicrii filtratului se Aprecierea: observ o zon de liz (colonie negativ de fag). Metoda FURT. Filtratul ce conine fagi se amestec cu geloz topit i se toarn n cutia Petri. FURT. Suprafaa cutiei se mparte n 4 sectoare. n fiecare sector se nsmneaz n striuri culturi cunoscute de diferite bacterii. Incubare la 37C 24 ore. 37 Aprecierea: lipsa creterii bacteriilor ntr-un sector indic prezena fagului omolog. Aprecierea: Metoda FISHER Similar cu metoda Furt, doar c suprafaa cutiei se mparte n 10 cadrane, astfel pot fi nsmnate 10 culturi bacteriene i pot fi indicai concomitent mai muli fagi. TITRAREA BACTERIOFAGILOR Este utilizat pentru determinarea numrului de fagi viruleni n prelevat sau cultur. Metodele de titrare a bacteriofagului Titrarea bacteriofagului n mediu lichid (metoda Appelman) Titrarea bacteriofagului n mediu solid (metoda Gratia) 24

APPELMAN la diluii logaritmice a culturii de fag (10-1.....10-10) n bulion peptonat se adaug suspensie bacterian omolog fagului examinat. Dup 24 ore de incubare la 37 C se apreciaz titrul fagului: diluia maxim a fagului care nc mai provoac liza bacteriilor (mediu clar). fagului: dilu GRATIA. Dup diluia logaritmic a fagului i adugarea culturii bacteriene, coninutul fiecrui tub se amestec cu geloz topit i amestecul se toarn n cutii Petri. Dup 24 ore de incubare la 37C se numr plajele formate (coloniile negative de fagi). Numrul plajelor corespunde cu 37 nr de fagi viruleni din materialul de examinat. APLICAREA PRACTIC A FAGILOR n domeniul terapeutic Tratamentul i profilaxia maladiilor infecioase n domeniul diagnostic Fago-identificarea identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt, etc) Lizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenierea unor tulpini din cadrul aceleeai specii (subdivizarea speciei n lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de Staphylococcus aureus, Salmonella Typhi, .a. Lizotipul reprezint un marker epidemiologic. Fagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni, fagii temperai se utilizeaz n ingineria genetic (ei pot asigura transferul de material genetic prin transducie). 36. Virusurile. Natura. Particularitile biologice. Principiile de clasificare. Forma si dimensiunile virusurilor. Metodele de studiu. Virusuri = gene vagabonde = particule infectioase autonome, caracterizate prin : 1. structura speciala : proteine + AN 2. lipsa sist. metabolice 3. myxovirusuri : AN + capsida = nucleocapsida reovirusuri : ARN dublu catenar Particularitile virusurilor Reprezint structuri acelulare cu potenial infecios Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind parazii obligai intracelulari Nu cresc pe medii artificiale, numai pe celule vii Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de AN (ADN sau ARN) Nu cresc i nu se divid, ci se reproduc n celule vii Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm) Rezisten natural la antibiotice Rol capsida : 1. adsorbtie (exceptie virusuri cu supercapsida) 2. antigenitate virala specifica ??? Virusurile cu supercapsida realizeaza absorbtia prin intermediul ei utilizarea detergentilor pt inlaturararea supercapsidei inlaturare virulenta. CLASIFICAREA VIRUSURILOR Dup tipul AN (cu genom ARN/ADN) Dup dimensiuni (mici 20-50 nm, medii 50-150 nm, mari peste 150 nm) Dup tipul de simetrie a capsidei (helicoidal, cubic, mixt) Dup gazd (om, animal, insect, bacterie) Dup sensibilitatea n mediul extern, etc Virusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae Virusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Retroviridae Virusuri ARN- : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Filoviridae Virusuri ARNd.c. : Reoviridae Virion unitate structural infecioas a virusului Viroid ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante 25

Prion protein termostabil infecioas, cauzeaz la om boala Kuru, Creutzfeldt-Jacob, sindromul Gerstmann-Straussler, scrapie la oi COMPOZIIA CHIMIC I STRUCTURA VIRIONULUI Virusurile simple AN i nveli proteic capsida (nucleocapsid) Virusurile complexe nucleocapsid i un nveli extern, lipoglicoproteic (supercapsid, peplos) AN ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, linear, circular sau fragmentat. ARN monocatenar : ARN+ (caten cu sens, ARNm) sau ARN- (caten fr sens) Funcia AN asigurarea replicrii i expresia genomului pentru sinteza proteic Capsida format din uniti proteice, capsomere, aranjate simetric. Simetrie helicoidal capsomerele se fixeaz pe catena de AN, form de bastona Simetrie cubic (icosaedric) capsomerele se aranjeaz n jurul AN, formnd un icosaedru (poliedru regulat cu 20 fee triungiulare i 12 vrfuri), eikos=20 Simetrie mixt (bacteriofagii, poxvirusurile) Funcia protecia AN, rol antigenic, adeziune Supercapsida structur glucido-lipido-proteic, derivat din membrana celulei gazd (lipidele din membrana celular, glicoproteinele proprii) Funcie protecie, antigene de suprafa, adeziune Unele virusuri conin enzime polimeraze, transcriptaze, etc. Aciunea factorilor fizici, chimici Virusurile sunt foarte sensibile la cldur, desicare, UV. Detergenii i solvenii inactiveaz virusurile cu supercapsid. Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80 C REPRODUCEREA VIRUSURILOR I ADSORBIA virusului la celula-gazd prin intermediul receptorilor specifici (tropism) II PENETRAREA virusului n celul Pinocitoz (viropexis) Fuziunea membranelor Translocare Injectarea AN n citoplasm III DECAPSIDAREA (enzime celulare) IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor i replicarea AN) Are loc n citoplasm (virusuri cu ARN) sau nucleul celulei (virusuri cu ADN) Biosinteza virusurilor ADN ADNdc transcrierea ARNm translaia (precoce, tardiv), replicarea sinteza proteic Biosinteza virusurilor ARN ARN+ translaie, replicare sinteza proteic ARNtranscriere ARNm translaie, replicare sinteza proteic Retrovirusuri (ARN+) transcriere ADNADNdc transcriere ARNm replicare, translaie, sinteza pr. (sau integrare n cromosom) V. MORFOGENEZA (asamblarea) virionilor Proteinele capsidale particip la formarea nucleocapsidei (nucleu,citoplasm), glicoproteinele sunt inserate n MCP, substituind proteinele celulare. Contribuie la apariia incluziunilor sau a corpusculilor elementari. VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, nmugurire, exocitoz) Interferena viral fenomen n care, consecutiv infeciei unei celule cu 2 virusuri, multiplicarea unuia este inhibat (virus interferat / virus interferent) 37. Virusurile simple si complexe. Structura virionului. Etapele de interactiune a virionului cu celula gazda. RELAII VIRUS-CELULA GAZD Infecie viral productiv, citocid Virusul este infecios iar celula permisiv. La nivelul ma/o corespunde infeciilor acute, aparente sau inaparente (grip, rujeol) Infecii virale persistente Celulele infectate supravieuiesc cu producerea permanent sau intermitent a virusului. 26

Infecii abortive cu virioni defectivi infecia nu se exprim, are loc transformarea celulelor prin proteine virale. Ele devin int pentru efectorii imunitii (macrofage, T-limfocite) n cursul unor infecii cronice (PESS post-rujeolic) Infecii integrate (virusuri ADN sau copii ADN ale Retrovirusurilor) Transformarea malign a celulei gazd Manifestarea infeciei dup o perioad de incubaie ndelungat cu expresia integral a genomului viral (HIV-SIDA) infecii lente Reactivri ocazionale, repetate ale infeciei cu exprimarea integral a informaiei genetice virale (infecia herpetic) infecii latente Infecii cronice perioade de remisie i acutizare, virusul este prezent permanent, chiar n absena simptomelor (hepatita viral B) TERAPIA ANTIVIRAL Dificulti: Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fr afectarea celulei!) Apariia mutantelor rezistente Activitate asupra virusului n faz de multiplicare Costul avansat al tratamentului Primele preparate antivirale anticanceroase. Preparatele antivirale contemporane: Nu manifest activitate virucid, doar inhib reproducerea viral Sunt dirijate contra etapelor reproducerii virale Adeziunea virusului la celul Mecanismul blocarea receptorilor celulari (HIV-oligopeptidul T, care reproduce gp120; CD4 solubili) Dificulti: afinitate redus, degradare rapid Fuziunea, penetrarea Reprezint peptide sintetice (pentafuzida-T20, T1249) blocheaz fuziunea virusului HIV cu membrana celular (dificultate injecii s/c zilnice) Decapsidarea Amantadina, rimantadina inhib decapsidarea virusului gripal A Utilizare limitat dezvoltarea rezistenei Replicarea Mecanismul blocheaz activitatea enzimelor virale de reproducere (transcriptaze, polimeraze, replicaze) Avantaj nu influeneaz componentele celulei-gazd Analogi nucleozidici Se disting de nucleozidele naturale prin modificarea componentului glucidic sau a bazei purinice sau pirimidinice. Blocheaz elongarea catenei de ADN n curs de formare. Antiherpetice (aciclovir, ganciclovir, penciclovir, idoxuridin) Anti-HIV (zidovudin, didanozin, zalcitabin, stavudin, lamivudin, etc) Anti-HBV (entecavir, LdT, LdC faz de cercetare) Analogi nucleotidici Cidofovir-CMV, HSV adefovir- HIV, HBV, HSV, CMV tenofovir HIV, HBV Analog al pirofosfatului Foscarnet HSV, CMV (HIV, HBV -?) Inhibitori nenucleozidici ai RT HIV (nevirapin, delavirin, efavirenz) Blocarea activitii polimerazelor virale se realizeaz prin: Competiie cu substratul natural al enzimei ngrmdirea steric a centrului activ al enzimei Incorporarea n catena de ADN n curs de sintez Blocarea procesului de elongare a catenei de ADN prin incapacitatea de a fixa un alt nucleozid pe analogul su artificial Asamblarea, eliberarea 27

Inhibitori ai proteazei HIV (sanquinavir, ritonavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, nelfinavir, etc) toxicitate, rezisten Inhibitori ai neuraminidazei virusurilor gripale (zanamivir, oseltamivir). Activ contra gripei A i B (efect preventiv, curativ, rezisten rar) INTERFERONII (IFN) IFN ansamblu de proteine capabile s confere celulelor o stare de rezisten la o infecie viral. IFN tip 1 (clasic, antiviral): IFN-alfa (leucocitar) IFN-beta (fibroblastic) Inductori: virusuri, LPS, ARN bicatenar IFN-gama, tip 2, imun, produs de LT activate, NK. Manifest activitate imunomodulatoare IFN acioneaz asupra ciclului de replicare viral prin intermediul celulei: interaciunea IFNalfa cu receptorul su induce sau stimuleaz expresia unor gene celulare, rezultnd o activitate antiviral (blocarea translaiei ARNm viral, degradarea ARNm viral). Este posibil i blocarea asamblrii i nmuguririi virusului (HIV) IFN mresc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar IFN-gama i a celor de clasa II IFN mresc activitatea intrinsec i extrinsec a macrofagelor i manifest activitate antiproliferativ IFN-gama activeaz celulele NK Utilizarea terapeutic a IFNhepatite B i C cronice, infecii herpetice, sarcomul Kaposi, limfome, leucemii Alte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la etapa de testare in vitro. TERAPIA CELULAR (CMV, EBV) Fondat pe administrarea CTL (limfocite Tc) autologe. Prelevarea sngelui de la bolnav Izolarea CTL specifice Clonarea i proliferarea CTL in vitro Reinjectarea la pacient VIITOR: fototerapia, imunizarea intracelular (introducerea unei gene ce codific un anticorp antiviral) 38.Culturile celulare. Tipurile. Izolarea virusurilor pe culturi de celule. Metodele de indicare si identificare a virusului izolat. CULTIVAREA VIRUSURILOR Virusurile sunt cultivate pentru: Stabilirea diagnosticului etiologic Testarea infeciozitii virusurilor Testarea preparatelor antivirale Producerea vaccinurilor SISTEME DE CULTIVARE Culturi de celule Ou embrionat de gin Animale de laborator Animalele de laborator se utilizeaz limitat (receptivitate selectiv, preexistena infeciilor, cost avansat). Se recurge numai cnd nu exist alte posibiliti (VHB, HIV, Coxsackie, etc). Constituie modele de cercetare sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate curent oriceii albi nou-nscui, dar pot fi utilizai obolani, cobai, maimue, etc. Regulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din infeciile bacteriene. Oul embrionat de gin (5-13 zile) reprezint un mediu de celule nedifereniate, cu multiplicare activ, steril i lipsit de mijloace de aprare antiinfecioas. Se utilizeaz n prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal) Iniial se verific viabilitatea embrionului la ovoscop n camera obscur. Prelevatul se inoculeaz steril cu seringa n cavitatea amniotic sau alantoidean, sau pe membrana chorioalantoidean (utiliznd metoda deschis sau nchis). 28

Orificiul se parafineaz i se incubeaz la 35-37 C timp de 48-72 ore Culturile de celule (1949 - Enders, Weller, Robbins). Celulele provenite din esuturi adulte sau embrionare, normale sau tumorale, plasate ntr-un mediu adecvat (nutrieni, pH, t) rmn viabile i se multiplic. Pentru cultivarea virusurilor se utilizeaz culturile n monostrat celular. Tipurile de culturi de celule: Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt obinute din esuturi adulte sau embrionare de origine animal sau uman. Suport 4-6 pasaje (subcultivri) Culturi diploide. Obinute din esut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaii Linii continui de celule. Obinute din esut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat. HeLa carcinom de col uterin KB tumoare a rinofaringelui Hep-2 tumoare canceroas a laringelui Obinera culturilor de celule primar tripsinizate: Prelevarea esutului (ex.: rinichi de maimu) Fragmentarea i splarea cu sol fiziologic Dezagregarea tisular cu enzime proteolitice Separarea celulelor prin centrifugare Dozarea suspensiei 105 106 celule/ml ntroducerea celulelor n mediu nutritiv i repartizarea n recipiente sterile Incubarea pn la formarea monostratului celular (inhibiie de contact) Monostratul poate fi infectat cu virus sau servete drept surs de celule pentru o nou cultivare (pasaj) Mediile de cultur pentru culturi de celule conin AA, Vit, factori de cretere, sruri minerale (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbumin, etc), rou fenol pentru monitorizarea pH (vireaz n galben n mediu acid) Mediile de cretere sunt mbogite cu ser sangvin (uman, animal) pentru cultivarea CC Mediile de ntreinere se utilizeaz pentru meninerea monostratului n procesul reproducerii virale. Nu conin ser. CC reprezint sistemul virus-gazd predilect n virologia clinic i cercetare. Inocularea CC Se aleg tuburi cu monostrat bine format Se nltur mediul de cretere, se spal cu sol. Hanks Se inoculeaz 0,1 0,2 ml de prelevat Peste 30-60 min n tuburi se toarn cte 1 ml mediu de ntreinere Se ntroduc n termostat la t adecvat 3-4 zile 39.Izolarea virusurilor in ou embrionar de gaina. Metodele de infectare. Indicarea si identificarea virusului izolat. 40.Metoda virusologica in diagnosticul virozelor. Materiale de examinat (prelevate) de la bolnav. Regulile de recoltare, ambalare si conditiile de transportare in laborator. Pregatirea pobelor pentru examinare in metoda virusologica. Etapele si esenta lor. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL VIROZELOR Indicaii: Boli cu msuri terapeutice sau profilactice speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc) Elucidarea etiologiei virale a unor izbucniri epidemice (meningite, gastro-enterite, pneumonii, etc) Supravegherea epidemiologic Prelevate: LCR, snge, exsudate, secreii nazale, rino-faringiene, mase fecale, urin, vezicule i ulceraii cutaneo-mucoase, bioptate, etc. 29

Eficacitatea diagnosticului este condiionat de: Alegerea corect a prelevatelor, calitatea lor i transportarea n laborator Examinarea precoce (la debutul bolii) Transportarea rapid a probelor sau utilizarea mediului de transport Respectarea regulilor de autoprotecie i de protecie a anturajului la recoltare, transportare i examinarea probelor METODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELOR METODE DIRECTE Examenul virusoscopic (evidenierea direct a virionului sau a componentelor lui n prelevate) Examenul virusologic (izolarea i identificarea virusului) Detectarea Ag virale n prelevat Identificarea genomului viral (hibridizarea AN, amplificarea genic PCR) METODE INDIRECTE Serodiagnosticul (creterea de cel puin 4 ori a titrului Ac n dinamic) EXAMENUL VIRUSOSCOPIC Microscopia optic depistarea n prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii Guarnieri n variol, Babe-Negri n rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Se prepar frotiuri sau frotiuri-amprente colorate Romanovschi-Giemsa sau cu fluorocrom Microscopia electronic Imunoelectronomicroscopia mai sensibil, mai specific. Se examineaz complexele imune virus Ac Imunofluorescena (direct i indirect) utilizat n diagnosticul rapid al virozelor EXAMENUL VIRUSOLOGIC Prelucrarea prealabil a prelevatelor: Omogenizarea (dup necesitate) nlturarea elementelor celulare, inclusiv bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare) Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea creterii bacteriilor i fungilor contaminani (penicilin - 500 UA/ml, streptomicin 500 UA/ml, nistatin - 20 UA/ml) Etapele diagnosticului virusologic Izolarea virusului Evidenierea (indicarea) reproducerii virale Identificarea virusului Izolarea virusului se realizeaz prin inocularea cu material de examinat a animalelor de laborator, embrionilor de gin sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de cultivare se efectueaz n funcie de particularitile biologice ale agentului etiologic probabil i posibilitile laboratorului. INDICAREA VIRUSULUI n culturi de celule ECP modificri degenerative i distrugere celular, rezultat al multiplicrii virale (rotunjire sau retracie celular, citoliz, apariia vacuolelor sau granulelor n citoplasm, picnoza nucleului, fuziunea membranelor, etc). ECP poate fi studiat la microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu hematoxilin-eozin, Giemsa, fluorocrom. Incluziuni virale Reprezint acumulri paracristaline de virioni sau de componente virale n aria de replicare i asamblare a virusurilor (citoplasm, nucleu). Coloraia Giemsa, hem-eozin, fluorocrom. Localizarea, forma i afinitatea tinctorial (bazofile, acidofile) sunt particulariti diagnostice pentru unele viroze. Interferena Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determin fenomenul de interferen. Pentru detectarea V.rubeolei se infecteaz CC cu virus citopatogen. Lipsa multiplicrii acestui virus confirm prezena V.rubeolei. Hemadsorbia (RHAd) pentru virusuri cu HA Unele virusuri posed n componena capsidei, n special supercapsidei, glicoproteine care pot adera la suprafaa hematiilor HA. n timpul eliberrii din celul prin nmugurire a acestor virusuri, HA lor se afl deja nserate n MCP la nivelul mugurelui. Dac la aceasta etap n recipientul cu monostrat celular se 30

adaug suspensie de hematii i se menine 15-20 min la t caracteristic fiecrui virus, la microscop pot fi urmrite hematiile fixate la suprafaa celulelor infectate (RHAd). Hemaglutinarea (RHA) Pentru virusurile cu HA acumulate n mediul de ntreinere. n acest caz mediul de ntreinere aglutineaz eritrocitele unor specii de mamifere sau psri. Formarea plajelor Reprezint focare de celule alterate n monostratul celular acoperit cu agar. Numrarea plajelor permite cuantificarea virusului infectant. Proba culorii Metabolismul celular neafectat virajul culorii mediului din rou n galben (pH acid) Metabolismul celular inhibat culoarea mediului nu se modific

Indicarea virusului n oul embrionat de gin Oule se rcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricie maxim, apoi aseptic se taie coaja, se recolteaz lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA i embrionul se ntroduc n cutii Petri sterile. Se observ: Moartea embrionului Apariia modificrilor (hemoragii, pustule) pe MCA Acumularea de HA n lichide Indicarea virusului pe animale de laborator Boala manifest a animalului, deces Urmrirea virusului n organele-int: He