Curs IV. Creterea, multiplicarea i moartea bacteriilor. Cultivarea bacteriilor 1. Creterea bacteriilor 2. Multiplicarea i moartea bacteriilor 3. Cultivarea bacteriilor: a. Terminologie b. Medii de cultura: gazde vii i medii artificiale c. Clasificarea mediilor de cultura artificiale d. Colon ia izolat e. Aspectul culturilor pe medii solide i lichide f. Curba creterii bacteriene g. Masurarea cresterii bacteriene h. Notiuni privind asigurarea calitatii mediilor bacteriene 1. Creterea bacteriilor Creterea bacteriilor este procesul prin care se formeaz noi constitueni celulari, care are ca efect creterea dimensiunii celulare i maturizarea acesteia Sinteza specifica a subunitilor structurale se face pornind de la constitueni simpli, pentru obinerea unor compui noi, care sunt ulterior asamblai, formnd copii fidele ale constituenilor celulari parentali (vezi Metabolismul celulei bacteriene - Curs III). Modul n care decurge acest proces depinde de: Informaia genetic Substane le din mediu (natura, concentratie) Ali factori care influeneaz exprimarea informaiei genetice: pH, temperatur, presiune osmotic etc. Creterea bacterian continua pn ntr-un moment critic, respectiv un anumit raport volum/suprafata, cad crsterea se ntrerupe i apare multiplicarea. 2. Multiplicarea i moartea bacteriilor Majoritatea bacteriilor patogene pentru om se multiplic prin diviziune direct, coordonat de informaia genetic. Fig. 1 - Schema multiplicrii bacteriene prin diviziune directCellwall Cell membrane Elongated nucleoJd Nueleoid divides; cel! wall and membrane bagin to form transverse septum raneveree septum becomes complete

Daughter cells seperate

Scindarea celulei mame n dou celule fiice are loc prin diviziunea materialului genetic, a citoplasmei si componentelor ei, concomitent cu invaginarea membranei i formarea septului transversal

1

Bacilii i unii spirili se divid n plan plan transversal. Unii spirili se divid n plan longitudinal. Cocii se divid n planuri perpendiculare succesive (l,2 sau 3 planuri), iar desprirea incomplet, prin persistena formaiunilor de legtura provenite din nvelisurile celulare, duce la realizarea unui anumit tip de distribuie: lanuri, tetrade, ciorchine de struguri etc. Exist i alte modaliti de multiplicare, mai puin frecvente la bacterii le patogene: nmugurire n cazul bacteriilor fotosintetice, fragmentare n cazul bacteriilor filamentoase, segmentare n cazul Streptomyces etc. ntr-o populaie bacterian se stabilete un echilibru ntre multiplicare i moarte celular, dependent de competiia pentru substrat.Exist un "pool" de celule vii n cursul perioade lor de scdere a substanelor nutritive. 3. Cultivarea bacteriilor a. Terminologie Cultivarea const n totalitatea proceselor complexe care au loc ca urmare a nsmnrii microorganismelor pe medii de cultura Mediile de cultur sunt combinaii de substrate nutritive complexe care pot susine creterea bacterian, asigurnd nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare creterii i multiplicrii microorganismelor Cultura bacterian = totalitatea microorganismelor acumulate prin multiplicarea ntr-un mediu de cultur Creterea bacterian = creterea numrului sau masei de celule bacteriene Diviziunea bacterian = uzual, fisiune binar; nmugurire, sporulare, fragmentare Timp de generaie = timpul necesar pentru o celul sau o populaie bacterian pentru a se dubla Timpul de generaie n faza exponential i n condiii optime de cultivare este determinat genetic. Pentru E. coli i majoritatea bacteriilor timpul de generaie este de 15 - 20 minute. Pentru Mycobacterium tuberculosis acest timp este de 18 - 27 ore.

b. Medii de cultura: gazde vii i medii artificiale n funcie de necesitile nutritive i metabolice ale microorganismelor, utilizm pentru cultivarea acestora gazde vii sau substraturi artificiale. o Gazde vii (animale de laborator, ou embrionate, culturi de celule) indispensabile pentru: Virusuri Rickettsii Chlamydii o Medii (substraturi) artificiale: Majoritatea bacteriilor Fungi Unele protozoare

2

Cerinele pe care trebuie s le ndeplineasc mediile artificiale pentru a susine creterea bacterian sunt urmtoarele: S contin factorii de cretere necesari microorganismului a crui cretere trebuie s o sustin S fie sterile S aib pH-ul potrivit scopului pentru care este utilizat (de obicei 7.2) S aib o anumit presiune osmotic S aib umiditatea favorabil cultivrii microorganismelor etc. Utilizrile mediilor de cultur acoper att obiective ale microbiologiei fundamentale, ct i ale celei applicative. Dintre acestea enumerm: Pstrarea microorganismelor n culturi i subculturi Izolare/numrare (alimente, ap, cosmetice, produse farmaceutice) Microbiologie clinic/microorganisme patogene i condiionat patogene: o Izolare o Identificare (interes terapeutic/taxonomie, interes epidemiologic) TSA (Testarea Sensibilitii la Antibiotice) Microbiologia mediului Producie i control al produciei (antibiotice, enzime, toxine, seruri terapeutice, vaccinuri etc.; teste de sterilitate, evaluarea activitii biologice, etc.)

Principalele componente ale mediilor de cultur sunt urmtoarele: Derivai proteici: o Infuzii i extracte - n care se obine coagularea proteinelor prin nclzire o Peptone, obinute prin hidroliz din proteine animale sau vegetale (carne, cazeina, soia, levuri, ficat, mal, gelatin etc.; standardiza bile hidroliza enzimatic (enzime pancreatice sau gastrice; enzime vegetale) : conserv coninutul de aminoacizi i vitamine hidroliza acid (HCl, H2S04): distruge vitaminele i parial aminoacizii

Avnd n vedere c o parte din aceste medii pot fi utilizate pentru cultivarea unor microorganisme n scopul obinerii de produse administrate la om, Decizia EU 97/534/EC a stabilit facptul c materialele brute provenind din rile cu encefalopatie spongiform bovin sunt eliminate. Carbohidraii sunt introdui n mediile de cultur ca substrate fermentabile - glucoza, lactoza, zaharoza, manitolul etc.. Pentru diferenierea bacteriilor n funcie de spectrul de activitatea asupra zaharurilor pe mediile de cultur se utilizeaz indicatorii de pH Ca indicatori de pH se utilizeaz: rou fenol, albastru bromtimol etc., Mai pot fi utilizai indicatori redox, necesari stabilirii capacitii de susinere a creterii bacteriilor anaerobe, indicatori pentru detectarea H2S (sruri de fier) etc. Sruri: sursa de microelemente, tamponare (fosfai), osmolaritate (NaCl) 3

Ageni selectivi: o NaCI: inhib bacterii le Gram negative n mediul hiperclorurat tip Chapman i favorizeaz stafilococii o Bila sau sruri biliare (ex. Taurocolat de Na): inhib bacteriile Gram pozitive i favorizeaz patogenii intestinali o Colorani: crystal violet, verde malahit etc. Ageni de solidificare: cel mai utilizat este agarul. introducerea lui n bacteriologie este legat de numele Dr. Walter Hesse i soiei sale, Angelina Fany Hesse

Lina. Hesse

Walther

Hesse

Povestea soilor Hesse: Fanny Angelina Eilshemius - nscut n 1850 n New York, ca fiic a unui emigrant olandez bogat; n tineree a cltorit n Europa, unde l-a intlnit pe tnarul medic german Walther Hesse, cu care s-a cstorit n 1874. Ca medic de teren, W. Hesse a ajuns n situaia s fie interesat de noua tiint care tocmai lua natere, microbiologia i n 1881 ajunge n laboratorul lui R. Koch, unde a nceput s studieze metabolismul i aspecte de sntate public pentru multe bacterii, asistat de soia sa, Lina, ca devotat tehnician de laborator, desenator, tehnoredactor al lucrrilor sale . :. Problema: ntr-o var fierbinte, Walther incerca s fac numrtori de bacterii din aer pe plci cu GELATIN, CARE SE TOPEA LA CLDUR. Atunci, el a avut ideea s-o intrebe pe Lina: "De ce jeleurile i budincile tale ran solide cand e cald afaa?" .:. Explicaia: Lina utiliza AGAR-AGAR, un polizaharid complex extras din alge marine. Acest ingredient era utilizat de sute de ani ca agent de gelificare in Asia; Lina nvaase asta de la o vecin din New-York, olandez emigrat din insulele Java . :. Din bucatarie in laboratorul de microbiologie - Calitile agar-agarului: (a) netoxic pentru majoritatea microorganismelor. (b) se topete doar la 1000C, dar solidific la aprox. 450C (temperatura la care majoritatea bacteriilor supravieuiesc).

4

(c) netoxic pentru alte forme de viat. (d) stabil la temperatura de sterilizare (e) inert fiziologic, deoarece foarte putine bacterii poseda enzime care-l pot digera. Lina si Walther au discutat posibilitatea utilizarii in laborator a agarului, idee care s-a dovedit excelenta: Factori de imbogtire: snge, Factor X, V sau XV (hemofili), Hb, albumin, ou, ser, soluii chimic definite etc. Substrate enzimatice analoge unor substrate metabolice - utilizate pentru diferenierea rapid a unor bacterii (medii cromogene)

c. Clasificarea mediilor artificiale Dupa starea fizic: lichide, semisolide, solide Dup compoziia chimic: complexe; chimic definite Dupa o o o o utilizare: De transport De izolare De imbogire, De identificare - pentru testarea unor caracteristici enzimatice (unitest, multitest), Caracterele mediilor de uz general

Conin ingrediente care convin majorittii microorganismelor Nu conin ingredientele necesare creterii microorganismelor prototrofe (fastidioase, pretenioase) Nu ncurajeaz selectarea unor anumite bacterii Medii speciale

Mediul electiv - ingredientele convin cel mai bine unei anumite bacterii (ex. Mediul Loeffler cu ser de bou pentru bacilul difteric) Mediul selectiv - inhib dezvoltarea altor bacterii dect a celor a cror izolare se urmrete (ex. mediu cu telurit de K pentru difteric, medii cu bil pentru anumii bacili Gram negativi) Mediul de mbogire - favorizeaz nmulirea bacteriilor patogene i inhib dezvoltarea florei de asociaie); functioneaz concomitent ca mediu electiv i mediu selectiv: ex. Mediul hiperclorurat pentru stafilococ) Mediul diferenial: conine un anumit substrat care poate fi sau nu metabolizat (ex. Mc Conkey pentru enterobacterii)

5

Fig. 2 - E. coli (lactoz pozitiv) si Salmon elia (lactoz negativ) pe mediul selectiv i diferenial Mc Conkey

Medii i procedee de cultivare pentru anaerobi i microaerofili Mediu lichid cu thioglicolat - conine un substrat nutritiv, thioglicolat (pentru fixarea 02), agar pentru realizarea unei consistene semisolide, care s scad indicele de difuzie a 02 i un indicaor redox (resazurina sau albastrul de metilen) Cultivarea n exicator cu lumnare - se face pentru realizarea microaerofiliei, pentru satisfacerea necesitii unor bacterii de a beneficia de un coninut de 02 mai mic dect cel atmosferic i de un coninut crescut de C02 (capnofilie) Jar, Gas-Pack: pentru anaerobi si facultativ anaerobi

Fig. 3 - Aspectul creterii pe medii lichide cu ageni de oxidoreducere, n funcie de comportamentul bacteriei fa de oxigen

Obligateaerobc

Obligateaneercbc

Micro Facultativ.aercphile anaerobe

6

d. Colonia izolat Se obine pe medii solide Reprezint totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene (UFC = Unitate Formatoare de Colonii) Reprezint o clon bacterian sau o tulpin bacterian Se obine prin tehnica dispersiei cu ansa sau cu bagheta n L pe medii solide

e. Aspectul culturilor pe medii solide si lichide Pe medii solide: Colonia S (Smooth) are suprafata neteda, bombata, neteda, adesea lucioasa, margini circulare bine trasate Colon ia R (Rough) = plata, suprafata cu rugozitati, margini crenelate; nu pastreaza capsula si de obicei nu pastreaza virulenta (exceptie: B. anthracis, Mycobacterium tuberculosis) Colon ia M (Mucoid) = mare, stralucitoare, mucoasa, uneori fenomen de curgere; la speciile cu capsula bine reprezentata (ex. Klebsiella pneumoniae, Str. pneumoniae) Fig. 4. Colonii S, M, hemolitice pe medii solide; cretere S, R pe medii lichide

7

Pe medii lichide: Varianta S (Smooth) = tulbur omogen mediul Varianta R (Rough) = tulburare mai putin omogen; pot lsa mediul limpede i las flocoane care se depun sau formeaz vI la suprafaa mediului (ex. B. difteric) o Obs.: Bacteriile si fungii facultativ anaerobi se dezvolt n toat masa de lichid, tulburndu-l; bacteriile strict aerobe se dezvolt preponderent la suprafaa mediului f. Curba creterii bacteriene

Fig. 5. Curba creterii bacteriene

1,0

, - - - - - - - - - - - - ~- - - - - i'urbidiii - - - - Viablecount (optical ensity) d .

0]5 0.50

fig Q)"O