Www.referat.ro-studii Privind Biosinteza Unui Complex Multienzimatic Utilizabil CA Aditiv Furajer

8/8/2019 Www.referat.ro-studii Privind Biosinteza Unui Complex Multienzimatic Utilizabil CA Aditiv Furajer

1/58

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I

MEDICIN VETERINAR BUCURETI

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL-VETERINARE

PROIECT DE DIPLOM

ef lucrri dr.chimist LUMINIA IONESCU

CSI dr. chimist : GETA AVRAM

Absolvent :Marinescu

Georgiana

www.re

www.re


2/58

BUCURETI

2010UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I

MEDICIN VETERINAR BUCURETI

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL

VETERINARE

STUDII PRIVIND BIOSINTEZA UNUI COMPLEX

MULTIENZIMATIC UTILIZABIL CA ADITIV

FURAJER

Coordonator tiinific : LUMINIA IONESCUCSI dr. chimist : GETA AVRAM


3/58

Absolvent :Marinescu

Georgiana

BUCURETI

2010


4/58

Cuprins

REZUMAT

..3

INTRODUCERE ................................................................................................................7PARTEA I .........................................................................................................................11STUDII DOCUMENTARE .............................................................................................11Capitolul 1. Enzime hidrolitice de uz furajer i microorganisme productoare ...... .11

-amilaza ........................................................................................................................11Celulazele .......................................................................................................................13

1.3. Hemicelulazele ....................................................................................................14

1.4. Microorganisme productoare de enzime hidrolitice de uz furajer ....................16Capitolul 2. Utilizarea deeurilor i/sau subproduselor agricole n medii debiosintez a enzimelor hidrolitice de uz zootehnic ........................................................20Capitolul 3......................................................................................................................... 24CERCETRI EXPERIMENTALE ............................................................................... 27Capitolul 4. Materiale i metode .....................................................................................27

4.1 Tulpini de lucru ........................................................................................................274.2. Obinerea culturilor de intreinere ...........................................................................27

................................................................................................. 274.3. Cultivarea n laborator i testarea activitii hidrolitice .................................... 284.4. Determinarea activitilor enzimatice .................................................................30

4.5. Testarea produsului enzimatic n hrana animalelor de ferm ............................. 39Capitolul 5. Rezultate i discuii ..................................................................................... 42

5.1. Compoziia mediilor pentru cultura de ntreinere .................................................425.2 Analiza comparativ a biosintezei enzimelor hidrolitice cu tulpini Aspergillus nigeri Trichoderma viride pe diferite medii .........................................................................425.3. Temperatura optim de cultivare ............................................................................455.3 Alegerea pH-ului optim de cultivare ........................................................................475.4. Testarea complexului enzimatic ca aditiv furajer ................................................. 51

CONCLUZII .......................................................54BIBLIOGRAFIE .............................................................................................................56


5/58

REZUMAT

Numeroase nutreuri ieftine sunt limitate ca utilizare n hrana animalelor datorit

disponibilitii reduse a nutrientilor pe care i contin. Astfel, anumite reete pe baz de

cereale, care, de altfel, se folosesc i n ara noastr, conin cantiti importante de

poliglucide neamidonoase PNA (polizaharide fr amidon). Acestea sunt reprezentate n

principal de beta-glucani (n orz i ovz), arabinoxilani (n gru i tre), polimeri pe

baz de rafinoz (n rotul de soia) celuloz i hemiceluloz (rotul de floarea soarelui),

fapt care limiteaza sever folosirea lor n hrana animalelor. PNA din cereale i trele

acestora manifesta o activitate antinutritiv cnd sunt prezeni n cantiti mari n hrana

psrilor i porcilor. Ele nu pot fi degradate de enzimele din tubul digestiv al acestoranimale. Efectele antinutritive ale PNA se concretizeaza n diminuarea digestibilitatii

amidonului, proteinelor i grsimilor, determinnd astfel un efect general de reducerea

ratei de cretere i de valorificare a hranei. PNA mresc vscozitatea coninutului

intestinal i mpiedica difuzia enzimelor endogene i mixarea aceatora n masa

continutului digestiv.

Avnd n vedere structura complex a PNA din materiile prime furajere, este

evident c un singur tip de activitate enzimatic nu poate asigura disponibilizarea tuturor

substanelor nutritive din componentele hranei, fiind necesar combinarea mai multor

produse diferite (de unde necesitatea obinerii unor complexe multienzimatice).

n acest context, in proiectul de fa s-a urmrit selecia unor tulpini fungice cu

capacitate crescut de producere a unui complex de enzime hidrolitice prin utilizarea unor

formule noi de substraturi nutritive, precum i stabilirea condiiilor optime de biosintez a

acestor enzime cu microorganismele selecionate.

In prima parte a lucrrii sunt prezentate studii documentare referitoare la enzime

hidrolitice de uz furajer i microorganisme productoare ale acestora, utilizarea deeurilor

i/sau subproduselor agricole n medii de biosintez a enzimelor hidrolitice de uz

zootehnic, caracteristici ale proceselor de fermentatie cu microorganisme producatoare de

enzime hidrolitice utilizabile ca aditivi furajeri.


6/58

n cadrul cercetrilor experimentale prezentate n proiect s-au testat dou tulpini

de Aspergillus nigeri o tulpin Trichoderma viridae din colecia Centrului de

Biotehnologii Microbiene i respectiv a Facultii de Biologie, Universitatea Bucureti, n

ceea ce privete capacitatea acestora de a produce un complex de enzime hidrolitice

(proteaze, amilaze, celulaze, xilanaze) utilizabil ca aditiv furajer.

Cele trei tulpini de fungi au fost cultivate n sistem submers, pe 4 medii de

cultur preluate din literatura de specialitate; activitatea polienzimatica a mediilor de

fermentaie i a produselor finite (obinute prin filtrarea mediului de fermentaie,

concentrare i adsorbie pe CaCO3 tehnic) s-a evaluat comparativ cu preparatul

KEMZYMEVP DRY (Belgia).

Rezultatele obinute au evideniat capacitatea bioproductiv superioar a tulpinii

Aspergillus nigerCMGB-401 n ceea ce privete complexul enzimatic studiat.n scopul determinrii condiiilor optime de cultivare a tulpinii de Aspergillus

niger CMGB-401 pentru biosinteza enzimelor hidrolitice (amilaze, proteaze, celulaze,

xilanaze), au fost cercetai o serie de parametrii care au o importan semnificativ pentru

acest tip de bioprocese i anume: compoziia mediul de cultur, temperatura, pH-ul

mediului de cultur i gradul de agitare i aerare al culturii.

n ceea ce privete compoziia mediului de cultur, dintre cele cinci medii testate

(patru medii lichide i un mediu semisolid pe baz de tre de gru), cele mai bunerezultate s-au obinut cu mediul lichid M 4, avnd urmtoarea compoziie (g%):

Fin de porumb-2%;Fin de soia-3%;(NH4)2HPO4-0,5%;MgSO4x7H2O-0,05%;CaCl2-0,1%

n cazul diferitelor variante de pH i temperatur folosite, s-a observat c tulpina

de Aspergillus niger CMGB-401 conduce cele mai bune activiti enzimatice, n urma

cultivrii la pH = 5,5 i la temperatura de 280C (activitatea amilolitic 141,6 UDNS/g,activitatea proteolitic 1,95 UP/g, activitatea celulozolitic 2,27 UC1-Cx/g, activitatea

xilanazic 1366,33 U/ml).


7/58

Condiionarea produsului polienzimatic s-a realizat prin concentrarea mediului

integral din finalul fermentaiei, tratarea cu CaCO3 a concentratului i uscarea sub vid a

amestecului rezultat.

Testarea ca aditiv furajer a produsului polienzimatic condiionat a evideniat

faptul c utilizarea acestuia nu a influenat semnificativ greutatea corporal i sporul

mediu zilnic a purceilor n perioada crizei de nrcare, posibil din cauza faptului c

nutreul combinat a fost optimizat n principii nutritivi specifici acestei categorii de

porcine;

Consumul specific la loturile de purcei la care s-a utilizat preparat enzimatic este

cu 1,52% - 4,04% mai mic fa de martor, in funcie de cantitatea de produs introdus n

raia zilnic.

Rezultatele obinute sugereaz eficiena utilizrii preparatelor enzimatice nrecepturi de nutre combinat deficitare n principii nutritive.

INTRODUCERE

Odat cu integrarea n Uniunea European, Romnia s-a aliniat la StandardeleEuropene n ceea ce privete asigurarea calitii nutreurilor cu un impact deosebit asupra

sntii animalelor i n consecin a oamenilor, s-a interzis utilizarea pulberilor de

origine animal n furajarea animalelor i prin urmare s-au cutat alte ci pentru ca

necesarul de protein furajer s fie acoperit. Printre sursele alternative de proteine

furajere se numr:

surse semiconvenionale, cum sunt proteinele seminelor de

oleaginoase (soia) i din concentratele de pete, utilizate curent

astzi n diferite ri;

surse neconvenionale, cum sunt proteinele furnizate de

microorganisme: mucegaiuri, bacterii, drojdii, alge.

De peste 60 de ani domeniul aditivilor furajeri este explorat prin numeroase

cercetri, timp n care au fost elaborate i testate o multitudine de produse experimentale


8/58

i comerciale. De la simple substane de tipul acizilor organici pna la sisteme de aditivi

cu peste 10 substane active ncorporate, aceasta nou clas de compui a devenit una din

principalele ci de sporire i eficientizare a performanelor de valorificare a hranei de

ctre animalele de interes zootehnic.

Numeroase nutreturi ieftine sunt limitate ca utilizare n hrana animalelor datorita

disponibilitatii reduse a nutrientilor pe care i contin.Astfel, anumite reete pe baz de

cereale, care, de altfel, se folosesc i n ara noastr, conin cantiti importante de

poliglucide neamidonoase PNA (polizaharide fr amidon). Acestea sunt reprezentate n

principal de beta-glucani (n orz si ovaz), arabinoxilani (n gru si tarte), polimeri pe

baz de rafinoz (n rotul de soia) celuloz si hemiceluloz (rotul de floarea soarelui),

fapt care limiteaza sever folosirea lor n hrana animalelor. PNA din cereale si tartele

acestora manifesta o activitate antinutritiva cnd sunt prezenti n cantitati mari n hana

pasarilor si porcilor. Ele nu pot fi degradate de enzimele din tubul digestiv al acestor

animale. Efectele antinutritive ale PNA se concretizeaza n diminuarea digestibilitatii

amidonului, proteinelor si grasimilor, determinnd astfel un efect general de reducerea

ratei de crestere si de valorificare a hanei. PNA maresc vscozitatea continutului

intestinal si mpiedica difuzia enzimelor endogene si mixarea aceatora n masa

continutului digestiv. Ca rezultat, digestibilitatea nutreurilor se reduce i apar o serie de

tulburri ca: diaree (simptom asociat frecvent cu prezenta grului n cantiti mari nraii), consum excesiv de ap, dejecii lipicioase sau cu umiditate ridicat (care afecteaz

negativ microclimatul). n acelai timp pentozanii si betaglucanii se pot combina cu

enzime specifice ale tractusului digestiv, reducndu-le activitatea. Astfel eficiena

conversiei hranei este redus i costul/kg spor este ridicat, sporul mediu zilnic fiind redus.

O soluie pentru diminuarea efectului negativ al PNA asupra produciei animaliere

este reprezentat de adiia de enzime n hrana animalelor.

Enzimele sunt catalizatori biologici de natura proteica care participa la numeroase

reactii chimice ce au loc in sistemele vii i fara de care viata nu ar putea exista. Ele au rol

important in reglarea matabolismului substantelor nutritive, a proceselor de crestere a

tesuturilor la animale si pasari. Desi ele se formeaza si functioneaza ca si catalizatori doar

in celule vii, cele mai multe pot fi separate si-si pot continua activitatea in vitro.


9/58

n ultima perioada, eforturile cercetatorilor din intreaga lume s-au indreptat spre

studierea efectului enzimelor de natura exogena in cresterea disponibilitatii si

digestibilitatii substantelor nutritive si valorii energetice a nutreturilor, imbunatatirea

performantelor productive, reducerea costurilor hranei pe unitatea de produs. Cerintele

noilor enzime furajere sunt: activitati specifice mari in conditiile de lucru impuse,

rezistenta mare la inactivare prin tratament termic, pH scazut si la actiunea enzimelor

proteolitice, costuri scazute de productie, stabilitate marita la pastrare.

Prin ncorporarea enzimelor exogene specifice n nutreul combinat pentru porci

sau psri, se poate realiza creterea performanelor productive i, totodat, protejarea

mediului prin reducerea coninutului excretei n azot i fosfor. Aceste aspecte sunt

susinute de cercetrile de specialitate care demonstreaz, de exemplu, corelaia ntre

progresul genetic la porc i schimbrile n raiile specifice categoriei i vrstei, astfel c,rspunsul animalelor la adiia de enzime nu depinde numai de substrat dar i de

capacitatea fiziologic a animalelor de a utiliza nutrienii.

Avnd n vedere structura complex a PNA din materiile prime furajere, este

evident c un singur tip de activitate enzimatic nu poate asigura disponibilizarea tuturor

substanelor nutritive din componentele hranei, fiind necesar combinarea mai multor

produse diferite (de unde necesitatea obinerii unor preparate enzimatice complexe). De

exemplu, la gru i secar, unde predomin arabinoxilanii este necesar ca n complexulenzimatic utilizat, activitatea esenial s fie orientat spre acest substrat, chiar dac

pentru cele mai multe din dietele pe baz de proteine vegetale este necesar adugarea de

alfagalactozide i pectinaze.

Hemiceluloza este o component a fraciunii polizaharidice care se gsete la un

nivel ridicat n peretele celular al plantei. Acesta este format dintr-un grup de

heteropolizaharide solubile n mediu alcalin, care sunt asociate cu celuloza si intra in

constitutia peretelui celular vegetal, incluznd -D-glucani necelulozici, substane pectice

(poligalacturonani) i mai multe heteropolizaharide cum sunt cele formate n mod

predominant din galactoz (arabinogalactani), manoz (galactogluco- i glucomanani) i

xiloz (arabinoglucurono- i glucuronoxilani). De fapt, heteropolizaharidele cu un grad

de polimerizare redus (100 200 uniti) comparativ cu al glucozei (10000 14 0000),

sunt n general denumite cu termenul de hemiceluloze. Principalii componeni glucidici ai


10/58

heteropolizaharidelor hemicelulozice sunt: D-xiloza, D-manoza, D-glucoza, D-galactoza,

L-arabinoza, acidul D-glucuronic, acidul D-galacturonic i mai puin L-rhamnoza, L-

fucoza i diferite glucide O-metilate. Dintre acetia -glucanii i arabinoxilanii sunt

recunoscui ca factori antinutritivi n cereale.

Adiia enzimelor exogene precum amilaza, celulaza, proteaza, xilanaza, n dietele

furajere, ofer nutriionitilor posibiliti multiple pentru stimularea proceselor digestive

i metabolice la animale, contribuind la ridicarea eficienei biologice i economice a

hranei.

Datele din literatura de specialitate atest faptul c enzimele hidrolitice sus-

menionate se obin fie prin fermentaie n sistem submers, fie pe substraturi solide, cu

microorganisme specifice genuluiAspergillius.

n acest context, in proiectul de fa s-a urmrit selecia unor tulpini fungice cucapacitate crescut de producere a unui complex de enzime hidrolitice prin utilizarea unor

formule noi de substraturi nutritive, pe baza utilizrii reziduurilor agricole ca materii

prime n procesele fermentative precum i stabilirea condiiilor optime de biosintez a

acestor enzime cu microorganismele selecionate.


11/58

PARTEA I

STUDII DOCUMENTARE

Capitolul 1. Enzime hidrolitice de uz furajer imicroorganisme productoare

-amilaza

-amilazele (-1,4-D-glucan-4-glucohidrolaza EC 3.2.1.1.) se ntlnesc n toateorganismele vii (microorganisme, plante, animale) realiznd hidroliza substraturilor

amidonoase pn la oligozaharide. Ele sunt sunt proteine mici, cu mase moleculare

cuprinse ntre 50.000 i 60.000. Situsul catalitic al -amilazelor este format din doi

aminoacizi (Asp i Glu) care se gsesc n zona de legare a substratului [2]. Mecanismul

hidrolizei, asemntor celui ntlnit n cazul lizozimului, ncepe printr-o slbire a legturii

C1-O4 n vederea hidrolizei, urmat de formarea complexului enzim-substrat. Aceast

legtur continu s fie slbit prin aciunea unuia din cei doi aminoacizi, care se

comport ca donor de proton pentru O4. Ruperea legturii glicozidice duce la formarea

unui ion intermediar oxicarbonic (stare de tranziie) care este stabilizat de ncrctura

negativ a celorlali aminoacizi. n final, acest ion reacioneaz cu o molecul de ap i

cele dou oligozaharide formate prsesc situsul catalitic (fig. 1).

pH-ul optim al -amilazelor depinde de originea acestora, situndu-se ntre 4,8 i

6,9. Valori extreme de pH se ntlnesc la -amilaza acid din Bacillus subtilis (pH 3,5)

sau -amilaza bazic din Bacillus licheniformis (pH 9,0). Prezena ionilor de calciu

favorizeaz uneori creterea stabilitii enzimei n condiii extreme de pH.Temperatura optim de activitate variaz i ea n funcie de originea enzimei.

Temperatura medie este de 40-500C, dar poate ajunge pn la 70-800C n cazul -

amilazelor bacteriene din Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus

licheniformis (tabelul 1).


12/58

Figura 1. Mecanismul propus pentru reacia de hidroliz catalizat de -amilaz

Tabelul 1. Proprietile -amilazelor (E.C. 3.2.1.1)

Originea enzimei Masa moleculara pH optim Temperaturaoptima (0C)

Animal

Pancreas de porc 50.000 6,9 37Vegetala

Mal de orz 59.500 4,7 5,4 50 - 55Microbian

Bacillus amyloliquefqciens 49.000 5,9 65B. licheniformis 22.500 5,0 9,0 76

B. stearothermophilus 49.000 5,4 6,1 70B. subtilis 47.000 5,3 6,4 50A. oryzae 52.600 5,5 6,9 40


13/58

Celulazele

Celulazele, enzimele responsabile de hidroliza celulozei, sunt compuse dintr-un

amestec complex de proteine enzimatice, cu diferite specificiti de hidroliz a legturilor

glicozidice. n funcie de activitatea lor enzimatic, ele pot fi mprite n trei clase

majore: endoglucanaze sau endo-1,4--glucanaze (E.C.3.2.1.4), celobiohidrolaze

(E.C.3.2.1.91) i -glucozidaze (E.C.3.2.1.21). Se consider c endoglucanazele, deseori

denumite carboximetilcelulozo (CM)-celulaze iniiaz atacul aleatoriu la multiple situsuri

din interiorul regiunilor amorfe ale fibrei celulozice, deschiznd astfel calea

celobiohidrolazelor. Celobiohidrolazele, deseori denumite exoglucanaze, formeaz

componenta major a sistemului celulazic fungic, reprezentnd aproximativ 40-70% din proteina celulazic total i se caracterizeaz prin faptul c hidrolizeaz celuloza

cristalin. Celobiohidrolazele indeprteaz mono- i dimeri de la captul lanului

celulozic. -glucozidaza hidrolizeaz dimerii i n anumite cazuri, celo-oligozaharide la

glucoz. n general, endoglucanazele i celobiohidrolazele acioneaz n mod sinergic,

dar detaliile mecanismelor lor de aciune nc nu sunt cunoscute. Se pare c

microorganismele au mai multe variante distincte de endo- i exoglucanaze. Ca i

hemicelulazele, celulazele sun proteine formate din mai multe domenii. Definiia curent

i clasificarea adevratelor celulaze este nc incert [3].


14/58

Figura 2. Degradarea enzimatica a celulozei1.3. Hemicelulazele

Hemicelulazele, ca multe alte enzime care hidrolizeaz polizaharide, respectiv

hemiceluloza, din peretele celular al plantelor, sunt proteine alctuite din mai multe

domenii.

Hemiceluloza este un polimer complex, n componena cruia predomin

molecule de glucide cu 5 atomi de carbon, n special xiloz i arabinoz i care mai

conine i hexoze (n special manoz) i civa acizi glucidici (figura 2).

Figura 3. Structura hemicelulozei


15/58

Hemicelulazele conin n general module catalitice i necatalitice structural

distincte. Cele mai importante module necatalitice constau n domenii de legare a

carbohidrailor (CBD) care faciliteaz fixarea acestora, liganzi interdomenii i module

dockerin care mediaz legarea domeniului catalitic al enzimei, prin interacii de coeziune-

dockerin, fie de suprafaa celulei microbiene, fie de complexe enzimatice precum

celulozomul Shallom i Shoham. n funcie de secvena de aminoacizi sau de acizi

nucleici specific modulelor lor catalitice, hemicelulazele sunt fie glicozid-hidrolaze

(GHs), fie carbohidrat esteraze (CEs)[4]. Acestea din urm hidrolizeaz legturile

esterice ale acetatului sau ale esterilor acidului ferulic i, n funcie de omologia secvenei

lor primare, ele au fost grupate n diferite familii.

n funcie de specificitatea de subtract, hemicelulazele se mpart n:- xilanaze: hemicelulaze majore care ataca legturile -1,4-glicozidice din

scheletul xilanului xilooligomeri;

- -xilozidaze: hidrolizeaza xilooligomerii la xiloza;

- xilozidaz-arabinozidaze : GHs bifunctionale, care actioneaza asupra legaturilor

dintre xiloza si arabinoza (Lee i colab., 2003) si au o secventa primara asemanatoare cu

unele dintre -xilozidaze;

- -mananaze: hidrolizeaz hemicelulazele pe baz de manan -1,4-mano-oligomeri mici;

- -manozidaza: hidrolizeaza -1,4-mano-oligomeri la manoz

--L-arabinofuranozidaze si -L-arabinanaze: hidrolizeaz arabinofuranozil-

hemicelulozele; unele au o specificitate larg de substrat, acionnd asupra uneia din

legturile O-5, O-2 si/sau O-3 ale arabinofuranozidelor ca si supra legturilor O-2 i O-3

din xilanii dublu substituii;

- alte xilanaze si -D-glucuronidaze: hidrolizeaz legtura -1,2-glicozidic din

catena lateral a xilanilor, format cu acid 4-O-metil-D-glucuronic

- acetil esteraze: hidrolizeaz substituenii acetil de pe molecula xilozei

- feruloil esteraze: hidrolizeaz legtura esteric dintre substituenii arabinozei si

acidul ferulic. Feruloil esterazele contribuie la ruperea legaturilor dintre hemiceluloza si


16/58

lignin, polizaharidulul devenind accesibil biodegradrii ulterioare de ctre glicozid-

hidrolazele specific[5].

Figura 4. Enzime implicate in degradarea hemicelulozei

O clasificare comprehensiv a hemicelulazelor i a altor hidrolaze este disponibil

pe site-ul http:/afmb. cnrs-mrs.fr/CAZY.

1.4. Microorganisme productoare de enzime hidrolitice de uz furajer

O preocupare permanent a cercettorilor din domeniul biotehnologiilor o

constituie ridicarea potenialului productiv al tulpinilor implicate n procesele debiosinteza. Este cunoscut faptul c rentabilitatea bioproceselor depine n mare masur de

potenialul productiv al suelor productoare. Mrirea gradului de eficacitate a

tehnologiilor de biosintez se realizeaz astzi pe scar larg, prin utilizarea tehnicilor de

recombinare genetic.


17/58

n plus, n ultima perioad, ca tulpini productoare de enzime, sunt utilizate tot

mai des mutante, microorganisme modificate genetic, capabile s sintetizeze

biocatalizatorul cu o rat crescut, ntr-un timp mai scurt i pe medii de cultur ct mai

ieftine. Tehnicile utilizate n scopul schimbrii structurii genetice a microorganismelor

constau n mutaii i selecii tehnice recombinare in vitro i tehnici de inginerie genetic.

Datele recente din literatur indic obinerea de enzime hidrolitice n special cu

ajutorul fungilor de Aspergillus niger, studiindu-se posibilitatea mbuntirii procesului

de fermentaie sau selecia de noi tulpini productoare.

Fungii apartinnd genului Aspergillus sunt alturi de cei din genulPenicillium,

cele mai importante microorganisme folosite n biotehnologiile de obinere a enzimelor.

Fungii filamentoi invadeaza substraturile solide, secret enzime degradative conducnd

n cele din urma la descompunerea i transformarea substratului pe care se dezvolt.Din punct de vedere taxonomic, fungii, microorganisme eucariote, pot fi

ncadrate dup clasificarea dat de A.L. Demain i N.A. Solomon (1985) n Biology of

Industrial Microorganisms [6]:

Diviziunea Anastigomycotina

Subdiviziunea Deuteromycotina

Clasa Deuteromycetes

Subclasa Hypomycotidae Ordinul Moniliales

Familia Monialiaceae

Genul Aspergillus

Majoritatea speciilor din genulAspergillus prezint miceliu septat, au un ciclu de

viat sexuat i sunt denumii n mod obinuit fungi imperfeci. Mai pot fi ncadrati i la

fungii perfeci datorita prezenei ciclului de via parasexual. Acest ciclu ambiguu

asemntor cu cel sexual, n special n etapa de recombinare a materialului genetic, cuspecificaia c recombinarea nu are loc n meioza, ci n cursul deviziunii mitotice.

Utilizarea mucegaiurilor pentru producerea de enzime hidrolitice prezint o serie

de avantaje:

avand o structur filamentoas pot fi separate mai usor din mediul de cultur fa

de drojdii i bacterii;


18/58

au un coninut mult mai mic de acizi nucleici dect bacteriile i drojdiile;

pot asimila din substrat oligozaharidele, care nu sunt accesibile drojdiilor.

Multe dintre microorganismele folosite produc aceste enzime extracelular, ceea ce

usureaz foarte mult condiiile de prelucrare industrial pentru obinerea de enzime.

Mucegaiurile pot fi cultivate pe substraturi lichide sau solide bogate n glucide,

cele mai importante genuri fiind: Aspergillus (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae),

Trichoderma (Trichoderma viridae, Trichoderma reesei, Trichoderma koningii),

Fusarium, Penicillium si Rhizopus.

Carbohidrolazele i enzimele celulozolitice derivate dinAspergillus nigerpot fi

utilizate n sigurana ca aditiv n hrana, n conformitate cu urmtoarele condiii:

(a) tulpinaAspergillus nigernu este toxic sau patogenic pentru oameni sau animale;

(b) aditivul nu este folosit n exces, fiind necesare cantiti minime pentru a produce

efectul dorit.

A fost stabilit i standardizat o metod de biosintez a enzimelor celulozolitice

cu o tulpin deAspergillus nigerIBT-90 [7].

n afar de enzimele celulozolitice, fungul mai produce cantiti considerabile de

hemicelulaze, ca i de enzime pectinolitice, 1,3-glucanaze, -amilaze, proteinaze i

ligninperoxidaze. Studiile asupra activitii enzimelor celulozolitice au evideniat 2-endo-

-1,4-glucanaze si anume celobiohidrolaze si -glucanaze. Aceste doua carbohidrolaze aufost izolate i au fost determinate proprietile lor catalitice i moleculare, incluzand

temperatura, pH-ul optim i greutatea molecular. Enzimele celulozolitice derivate din

Aspergillus niger IBT-90 par s atace celuloza ntr-un mod sinergic.

Endo--1,4-xilanaza hidrolizeaz arabinoxilanul, un constituent major al

peretelui celular al cerealelor i de curand aceast enzim este utilizat n mare msura n

procesele biotehnologice.

n industria alimentar xilanazele au fost propuse pentru modificarea celulozei i

hemicelulozei prin hidroliza parial. Hidroliza total a celulozei n glucoz, se poate

finaliza cu cu fermentaia glucozei la etanol, izopropanol sau butanol.

Arabinofuranozidazele sunt enzime care scindeaz substituienii arabinozici din

hemiceluloze (arabinoza la arabinoxilani, arabinani i arabinogalactani). A fost


19/58

secvenializat parial i purificat arabinofuranozidaza din Aspergillus nigercrescut pe

mediul de cultura cu pulpa de sfecla de zahar/trae de gru.

Procentul de umiditate iniial, timpul de cultivare, mrimea inoculului i

concentraia mediului de baz au fost optimizate n vederea produciei de xilanaze de

ctre Aspergillus nigerprin fermentaie n stare solid. S-a demonstrat c timpul de

cultivare i concentraia mediului de baz reprezint factorii cei mai importani care

afecteaz activitatea xilanazic. Mrimea inoculului de 52x105 spori/g, umiditatea de

65%, timpul de cultivare de 5 zile i de 10 ori mai concentrat mediul bazal care conine

50% extract de gru, au reprezentat parametrii optimi pentru producia de xilanaz prin

fermentaie n stare solid. Activitatea i producia de xilanaz dup 5 zile de fermentaie

utiliznd ca surs de carbon paie de orez a fost de 5,071 IU/g respectiv 14,790 IU I -1h-1.

Activitatea xilanazic estimat prin modelul polinomial a fost de 5,484 IU/g de paie deorez [8].

Tulpina deAspergillus niger 44 , cunoscut ca productoare de xilanaz, a fost

studiat de ctre P.V. Gawande si M.Y. Kamat [9] pentru obinerea de xilanaz (E.C.

3.2.1.8) prin fermentaie n stare solid, pe diferite substraturi lignocelulozice. Ca substrat

lignocelulozic utilizat pentru producia de xilanaz cel mai bun a fost trele de gru.

Mediul optim pentruAspergillus nigera fost: tre de gru n proporie 1:5 cu solute

mineral Mandels i Strenberg (continnd 0,1% extract de drojdie) la 35C iconcentraia inoculului fiind de 2x107-2x108 spori/5g substrat. Dup 4 zile de incubare,

activitatea xilanazic a fost de 74,5 IU/ml. Cultura filtrat proaspt a fost utilizat pentru

hidroliza diferitelor deeuri lignocelulozice. n timpul zaharificrii, preparatele xilanazice

au ndeprtat fracia hemicelulozic din toate deeurile lignocelulozice testate,

accentund potenialul comercial al produciei enzimelor xilanazice. Aspergillus sp. a

produs xilanaza cu un nivel scazut al activitii celulozolitice, facilitnd un sistem de

purificare al enzimelor relativ simplu[9].


20/58

Capitolul 2. Utilizarea deeurilor i/sau subproduselor agricolen medii de biosintez a enzimelor hidrolitice de uz

zootehnic

Biomasa lignocelulozic (n special deeurile agricole) este cunoscut ca fiind o

excelent surs de carbon pentru productia enzimelor microbiene. Biomasa

lignocelulozic constituit din reziduuri agricole (paie, coceni de porumb), unele

subproduse ale industriei alimentare (pulpe epuizate de fructe, tiei de sfecla de zahr

epuizai), furajele i lemnele neutilizabile reprezint o rezerv i insuficient valorificat

de glucide fermentescibile. n ultimul deceniu s-au fcut eforturi considerabile n privina

valorificrii superioare a biomasei lignocelulozice(BLC). Celuloza, mpreun cuhemiceluloza i lignina intra n structura pereilor celulelor vegetale. Pentru separarea

celulozei din complexul lignocelulozic se aplic tratamente mecanice i cu vapori de ap.

Substratul pe care se cultiv fungii se obine n urma hidrolizei n mediu acid, bazic sau

enzimatic a deeurilor celulozice [10].

Reziduurile agro-industriale sunt n general considerate ca cele mai bune

substraturi pentru obinerea de enzime prin fermentaie n stare solid. Marele avantaj al

acestor surse naturale de carbon este c sunt disponibile n cantiti industriale i c au unpre sczut.

Cteva substraturi cum ar fi tre de gru, tre de orez, tiulete de porumb, paie

de gru, paie de orez, coaj de orez, pstaie de soia, reziduuri de banan, resturile de

plante medicinale, cocean de porumb,pulp de sfecla de zahr, etc. sunt utilizate ca surse

de carbon n producia de enzime. Dintre acestea, trele de gru sunt cel mai frecvent

utilizate n diferite procese.

S-a constatat c fungul Aspergillus niger 38 poate fi cultivat prin fermentaie n

strat solid pentru obinerea celulazelor folosind ca sursa de carbon deeuri agricole uor

de procurat cum ar fi trele de gru i paiele de gru n diferite proporii. Mediul de

cultur (g/l) a avut urmatoarea compoziie: 10 (NH4)2SO4; 3 KH2PO4; 0,5 MgSO4x 7H2O;

si 0,5 CaCl2xH2O.


21/58

Trele de gru i paiele de gru s-au folosit n proporii diferite (9:1 la 1:9). Cu

o umiditate de 74%, un domeniu al pH-ului de fermentaie cuprins ntre 4.5-5.5 si un

raport paie de gru tre de gru de de 9:1, s-a obinut o activiate endonucleazic de

14.80 UI/ml (uniti internaionale/ml). Raportul o parte paie de gru i nou pri tre

de gru a prezentat cea mai bun activitate.

Alti autori [11] au folosit fungul Trichoderma reesei ZU-0 2pentru obinerea de

celulaz prin fermentatie n stare solid, utiliznd ca substrat reziduuri agricole: tiulete

de porumb, deeuri lignocelulozice din industria xilozei. Mediul de cultur pentru

cresterea microorganismului Trichoderma reesei ZU-02 a avut urmatoarea compoziie

(%): tiulete de porumb 66; tre de gru 30; (NH4)2SO4 2; uree 0.5; KH2PO4 0.5;

MgSO4x7H2O 0.5; CaCl2xH2O 0.45; CoCl2 0.05. Substratul solid a fost reutilizat de cel

puin trei ori n sistembatch i s-a constatat c activitatea celulozolitic cea mai mare afost obinut (158 IFPU/g koji) n a doua fermentaie batch. Enzimele koji produse prin

acest proces au putut fi utilizate direct n hidroliza tiuleilor de porumb. Cnd doza de

celulaz este peste 20 IFPU/g substrat, producia de zahr este peste 84%.

Cinci tulpini de fungi filamentoi (tulpinile Aspergillus nigerNRRL 3122 i

T00050007-2; Aspergillus oryzae CCT3940; Aspergillus awamori NRRL3112 i

Trichoderma sp.) au fost comparate pentru a vedea capacitatea lor de a produce

endopoligalactouranaze n fermentaie n stare solid. Trele de gru au fost utilizate casuport i ca unic surs de carbon peste care s-au adugat 45 ml soluie de sruri minerale

coninnd (%): KH2PO4 0.2; MgSO4 0.1; (NH4)2SO4 0.4; FeSO4 6,3x10-4; MnSO4 1,0x10-

4 si ZnSO4 6,2x10-4 pentru fiecare 100g tre, pentru a produce mediul bazic de tre de

gru. Activitatea pectolitic a fost atins dup 72 de ore de cretere cele mai bune tulpini

de fungi fiindAspergillus nigerT00050007-2 iAspergillus oryzae CCT3940. Trei tipuri

de pectine comerciale purificate i patru de pectine neprelucrate au fost folosite pentru a

evalua efectul pectinei asupra produciei de endopoligalacturonase de Aspergillus niger

T00050007-2. Maximul activitii pectolitice a fost atins folosind 6 i 10 % pectin

purificat ca inductor. n funcie de originea pectinei comerciale folosit ca inductor,

nivelele maxime endopoligalacturonase au variat de la 223-876 uniti/gram pe mediu

uscat indicand c trebuie s se aib grij cnd se alege acest component al mediului[12].


22/58

Cnd pectinele crude au fost folosite ca inductori la aceeasi concentraie ca

pectina purificat, maximul activitii pectolitice a fost 250-300 uniti/gram. Totui, prin

creterea procentului de pn la 50%, maximul endopoligalacturonazei a fost de 919

uniti/gram, deschiznd astfel posibilitatea scderii costului mediului pentru producerea

de endopoligalacturonaze.

Resturile de gru, grunele uscate i silozul de porumb sunt bioproduse ale

prelucrrii porumbului i grului avnd un coninut sczut de protein i un coninut

ridicat de fibre crude. Aceti doi factori limiteaz utilizarea lor n hrana psrilor i

porcilor, sector care constituie un mare consumator de furaje comerciale[13]. Este absolut

necesar s se sporeasc valoarea nutritiv a acestor bioproduse prin desfacerea

polizaharidelor neamidonoase. Aceast proces este realizabil prin utilizarea enzimelor

microbiene degradative din fungi. Fungii au capacitatea de a produce numeroase enzime.Aspergillus niger,Aspergillus flavus si Penicillium sp. sunt menionate ca fiind cele mai

bune surse de celulaze, amilaze, hemicelulaze, catalaze, pectinaze i xilanaze. Aceste

enzime ajut la degradarea polizaharidelor neamidonoase din substrat pn la glucide

solubile. Aspergillus nigera prezentat cel mai mare procent de reducere al celulozei

datorit creterii sale mai rapide i prin urmare abilitii de a produce mai multe enzime

celulozolitice ntr-o perioad mai scurt. Au fost determinate modificri n protein,

glucide i celuloz a trei bioproduse agro-industriale prin fermentare n stare solid cu Aspergillus niger, Aspergillus flavus i Penicillium sp . Celuloza a fost redus

semnificativ n toate deeurile agro de ctre toi fungii dup 14 zile. Reducerea

procentual cea mai mare a fost realizat de Aspergillus niger n toate deeurile agro:

36,51% pentru deeuri de gru; 35,87% pentru grune uscate i 35,80% pentru siloz de

porumb. Dup 14 zile nivelul zahrului a nceput s scad i nu a mai existat o degradare

semnificativ a celulozei. Protenia total din deeurile agro-industriale a crescut

semnificativ. Dup 14 zile creterea procentual cea mai mare n protein (41%) a fost

obinut din deeuri de gru inoculat cu Aspergillus niger. Rezultatele acestui studiu au

indicat posibilitatea sporirii valorii nutriionale a acestor bioproduse printr-o tehnic

simpl, necostisitoare i uor de adaptat i utilizarea acestora n hrana psrilor i porcilor

[14].


23/58


24/58

Capitolul 3.Caracteristici ale proceselor de fermentatie cu microorganisme

producatoare de enzime hidrolitice utilizabile ca aditivi furajeri

ncepand din anul 1970, au fost iniiate studii privind obinerea de proteaze acide

cu mucegaiuri din genulAspergillus (A. niger, A. oryzae) prin cultivare n sistem submers

sau SSF. Preparatele enzimatice obinute sunt complexe, conin pe lng proteaze i

amilaze (-amilaza i glucoamilaza), celulaze, xilanaze, pectinaze. n cazul culturilor

submerse, comparativ cu procedeul de cultivare n sistem SSF, randamentele de obinere

a preparatului enzimatic sunt mai sczute [10].

Alturi de tulpina microbian i compoztia mediului de cultur, printre factorii

importani care influeneaz procesul de biosintez a enzimelor hidrolitice se numr

aeraia, temperatura i pH-ul mediului de biosintez, precum i gradul de agitare [15].

P.V. Gawande i M.Y. Kamat au studiat influena temperaturii de cultivare asupra

obinerii de xilanaz (E.C. 3.2.1.8) prin fermentaie n stare solid pe diferite substraturi

lignocelulozice, cu 2 tulpini de Aspergillus sp. (A.terreus si A. niger 44), cunoscute ca

productoare de xilanaz. Trele de gru s-au remarcat ca cel mai bun substrat

lignocelulozic utilizat pentru producia de xilanaz. Mediul optim pentru Aspergillus

niger a fost: tre de gru n proporie 1:5 cu soluie mineral Mandels i Strenberg

(coninnd 0,1% extract de drojdie), concentraia inocului fiind de 2x107-2x108 spori /5 g

substrat. Dup terminarea procesului fermentative, s-a constatat c maximul produciei de

xilanaz, pentru ambele tulpini de Aspergillus, a fost atins la temperatura de 35C.

Anterior zaharificrii, preparatele xilanazice au ndeprtat fracia hemicelulozic din toate

deeurile lignocelulozice testate, dovedintu-i astfel potenialul commercial. Aspergillussp. a produs xilanaz cu un nivel sczut al activitii celulozolitice, facilitnd un sistem de

purificare al enzimelor relativ simplu.

Luiza Jecu [16] a constatat c fungul Aspergillus niger 38 poate fi cultivat prin

fermentaie n strat solid, pentru obinerea celulazelor folosind ca surs de carbon deeuri

agricole uor de procurat cum ar fi trele de gru i paiele de gru n diferite proporii.


25/58

Mediul de cultur (g/l) a avut urmatoarea compoziie: 10 (NH4)2SO4;; 3 KH2PO4;; 0,5

MgSO4x7H2O; si 0.5 CaCl2xH2O. Trele de gru i paiele de gru s-au folosit n

proporii diferite (de la 9:1 la 1:9). Cu o umiditate de 74% a substratului coninnd paie

de gru/tre de gru n proporie de 9/1, s-a obinut o activitate endonucleazic de 14.80

UI/ml (uniti internaionale/ml), optim, la un pH de 4.5-5.5. Raportul o parte paie de

gru i nou pri tre de grau a prezentat cea mai bun activitate.

Temperatura mediului n care are loc procesul de biosintez a enzimelor

hidrolitice este un factor extrem de important pentru activitatea microorganismelor.

Variaiile de temperatur au efect asupra randamentului de transformare a substratului n

produsul finit, asupra cerinelor nutritive ale microorganismului i compoziiei biomasei

obinute i, nu n ultimul rnd, asupra vitezei de cretere microbian. Temperatura este un

factor care acioneaz n mod direct asupra microorganismului viu. Temperaturile ridicatepot duna microorganismelor prin denaturarea enzimelor, a proteinelor transportatoare,

sau a altor tipuri de proteine[17].

Valoarea pH-ului este, alturi de temperatur, un parametru important n

procesele de biosintez. Fiecare specie are definit un anumit interval de pH n care poate

crete, precum i un pH optim de dezvoltare. Influena valorii pH-ului asupra dezvoltarii

culturilor microbiene poate fi urmarit n dou direcii principale si anume : asupra

vitezei de cretere a microorganismelor i asupra randamentului de conversie asubstratului la produsul polienzimatic. n general, microorganismele au un domeniu

optim de pH pentru dezvoltare, n care viteza specific de cretere atinge valoarea

maxim. n cazul fungilor, pH-ul optim de dezvoltare este cuprins ntre 4,5-6,5. Fungii

prezint avantajul de a crete convenabil n medii de cultur acide, n care cele mai multe

specii de bacterii nu se dezvolt. Formarea produsului dorit n urma procesului poate s

fie legat de desfaurarea bioprocesului ntr-un domeniu foarte strict de pH. n timpul

dezvoltrii unei culturi microbiene apar deviaii ale pH-ului de la valoarea considerat

optim, care pot avea urmri nedorite asupra procesului de biosintez. Aceste modificri

se pot datora fie consumrii unui nutrient, fie producerii unui acid organic de ctre

microorganism. Pentru corectarea pH-ului la valoarea prescris se folosesc diverse

substane chimice (acizi sau baze)[18].


26/58


27/58


28/58

- KCl- 0,5g

- FeSO4- 0,01g ;

- K2HPO4-1,0g ;

- Agar- 2,0g ;

- Ap distilat-1000ml.

2. Mediul Czapek-Dox- extract de mal (g/l) :

- Extract de mal 20,0 g ;

- Componentele mediului Czapek-Dox.

Dup preparare, mediul s-a repartizat n eprubete i s-a sterilizat la 110C timp

de 30 de minute, pH-ul mediului fiind de 6,4 corectat cu NaOH 40%.

4.2.2. Conservul vegetativ

Dup verificarea sterilitii mediului prin meninerea sa la termostat la 37C, timp

de 48 ore, acesta s-a nsmnat cu o suspensie de spori n ap distilat.

Pentru obinerea inoculului pe mediu solid s-a folosit urmtoarea tehnic de

lucru : peste cultura de ntreinere bine sporulat s-a pipetat 5ml ap distilat steril, se

racleaz foarte bine pentru desprinderea sporilor, obinndu-se o suspensie de spori[19].

Eprubetele cu mediu nsamanat s-au incubat la 28-30C timp de 7 zile. La

sfaritul perioadei de incubare, eprubetele s-au examinat privind gradul de sporulare al

culturii, precum i puritatea acesteia. Tuburile corespunztoare au constituit cultura de

ntreinere. Dup aceast perioad sporii se pot utiliza imediat sau se pot conserva la

frigider la +4C.

4.3. Cultivarea n laborator i testarea activitii hidrolitice

La nivel de laborator, lucrrile s-au axat pe studiul diferitelor medii de cultur

n vederea stabilirii unui mediu optim pentru dezvoltarea microorganismului selecionat

i pentru biosinteza enzimelor hidrolitice precum i pe stabilirea parametrilor de

bioproces optimi.

Au fost testate mai multe medii de cultura avnd urmtoarele compoziii:


29/58

Mediu 1 (g/100ml) Mediu 2 (g/100ml)

Fin de soia -2% Amidon solubil-2%

Amidon solubil-1% Fin de soia -0,5%

Tre de greu-0,5% CaCl2-0,1%

KH2PO4 -2,5% KH2PO4-0,1%

CaCl2-0,1% MgSO4x7H2O-0,01%MgSO4x7H2O-0,01%

Mediu 3 (g/100ml) Mediu 4 (g/100ml)

Amidon solubil -1% Fin de porumb-2%

Pepton-0,5% Fin de soia -3%Extract drojdie -0,5% (NH4)2HPO4-0,5%

KH2PO4 -0,1% MgSO4x7H2O- 0,05%

MgSO4x7H2O -0,02% CaCl2-0,1%

CaCl2-0,1%

Dup preparare, mediile de cultur sterilizate i rcite la 35C, s-au ns mnat cu

o cultur de inocul sub form de suspensie de spori obinut din cultura de ntreinere.

Raportul de nsamanare este de 0,5 ml suspensie pentru 50 ml mediu. Cultivarea s-a

efectuat 72 ore la baloane agitate(220 rpm) cu 50 ml mediu de cultura/balon. Incubarea

s-a fcut la termostat la 28-30C.

Pentru urmrirea bioprocesului, la intervale de 24 ore s-au determinat urmtorii

parametri:


30/58

- pH-ul mediului de cultura;

- activitatea enzimatic a mediului ;

- dezvoltarea macroscopic si microscopic a tulpinii de la care s-a pornit.

4.4. Determinarea activitilor enzimatice

4.4.1. Determinarea activitii -amilazice (E.C.3.2.1.1)

Pentru dozarea activiii -amilazei produs de fungi s-a aplicat metoda descris

de Hostettler i colaboratorii [20] metod care se bazeaz pe hidroliza enzimatic aamidonului la pH=6,9 si la temperatura de 30C. Hidrolizatul format n special din

maltoz reactioneaz, datorit gruprilor reductoare semiacetalice, cu acidul 3,5-

dinitrosalicilic, cu formare de acid nitroaminosalicilic de culoare roie-portocalie, cu

maximum de adsorbie la 546nm.

Concentraia de acid diaminosalicilic format, msurat colorimetric, este

proporional cu activitatea enzimatic.

Conform acestei metode o unitate amilazic corespunde unui mmol de maltozeliberat de 1g preparat enzimatic ntr-un minut la 30C.

Reactivi necesari :

1. Soluie tampon fosfat 0,2M,Ph=6,9 ;

7,16g Na2HPO4 x 12 H2O + 2,72g KH2PO4 + 0,58g NaCl se dizolv i se aduc la 1 litru

soluie cu ap distilat. Valoarea de pH se verific cu pH-metrul.

2. Soluie amidon 1% in solutie tampon(1) ;

3. Reactiv acid dinitrosalicilic (DNS).

10g acid dinitrosalicilic se dizolv la cald n aproximativ 300ml ap distilat. Se adaug

400ml soluie NaOH 1N i 300g tartrat de sodiu i potasiu. Se aduce la semn ntr-un

balon cotat de 1 litru.

4. Soluie etalon de maltoz ;


31/58

0,2g maltoz monohidrat (0,19g maltoz anhidr) se dizolv n ap tr-un balon cotat de

100ml.

5. Soluie prob de determinat.

Proba se dizolv cu CaCl2, astfel nct s conin 0,5-1,5 uniti DNS.

Mod de lucru

Construirea curbei de etalonare

Din soluia etalon de maltoz(4) se pipeteaz n 6 eprubete dup cum urmeaz :

Tabelul 2. Prepararea diluiilor de maltozNumr eprubet Vol. soluie maltoz

(ml)Vol. ap distilat

(ml)Conc. maltoz

(moli)1 - 2,1 -2 0,4 1,7 2,243 0,8 1,3 4,484 1,2 0,9 6,725 1,6 0,5 8,966 2,0 0,1 11,2

n fiecare eprubet se adaug 2ml DNS, apoi se tine n baie de ap la fierbere 5minute.

Se rcesc i se dilueaz pana la 12 ml cu ap distilat.

Se citete densitatea optic la 546nm dupa 20 de minute.

Datele oinute se trec ntr-un grafic pentru construirea curbei de etalonare. Pe

abcis se trec valorile reprezentnd densitatea optic citit la spectrofotometru

corespunztoare concentraiei de maltoz nscris pe ordonat.

Dozarea activitii enzimaticeParalel cu proba de analizat se face o prob martor pentru a determina

concentraia de maltoz existent n prob, nainte de nceperea reaciei enzimatice.

Modul de lucru este prezentat schematic n tabelul 2.

Tabelul 3. Reprezentarea schematic a modului de lucru pentru dozarea activitii


32/58

-amilazice

Proba de analizat0,5ml soluie tampon(1)

1ml soluie amidon 1%(2)

0,5ml proba-agitare-

Proba martor0,5ml soluie tampon(1)

1ml soluie amidon 1% (2)

2ml DNS(3)agitare0,5ml proba

Incubare 10 minute la 30C2ml DNS -

Incubare 5 minute pe baie de ap.Rcire.

Diluare pn la 12ml cu ap distilatCitirea valorilor absorbanei la spectrofotometru la 546 nm

Calculul rezultatelor

Activitatea enzimatic se calculeaz i se exprim dup formula :

Uniti DNS/ml = mxD/vx10

unde :

- m = moli de maltoz, determinai din curba de etalonare ca fiind diferena dintre

moli de maltoz din prob i moli de maltoz din martor ;

- D = factorul de diluie al probei luate n lucru ;- V = volumul (ml) de soluie prob luat n lucru ;

- 10 = timpul de incubare (minute).

4.4.2. Determinarea activitii celulazice

Principiul metodei

Determinarea activitii celulozolitice se efectueaz dupa metoda descris de

Petterson i Porath[21].

Metoda se bazeaz pe dozarea glucidelor reductoare eliberate de enzim n urma

aciunii asupra substratului respectiv carboximetil celuloza (CMC).

Reactivi i soluii:

1. Soluie tampon Na2HPO4- acid citric 0,1N, pH=6,4 ;


33/58

2. Soluie CMC 1%. 1g carboximetil celuloza se dizolv n 100ml tampon(1) ;

3. Preparat enzimatic cu activitate celulazic ;

4. Reactiv DNS (20g acid 3,5 dinitrosalicilic, 4g fenol proaspat distilat, 1g sulfit de

sodiu, 400g tartrat de sodiu i potasiu). Se dizolv n 1 litru NaOH 2%, soluia se

aduce la 2 litri cu ap distilat.

5. Soltie glucoz 0,1% preaparat proaspt n ap distilat.

Amestecul de reacie, ce const din 2ml soluie de substrat (2), 0,2 ml preparat

enzimatic (3), este incubat 10 minute la temperatura de 50C, dup care reacia

enzimatic este stopat cu 3 ml rectiv DNS. Probele sunt incubate apoi 15 minute pe o

baie de ap la fierbiere, rcite i colorimetrate la 640 nm fa de apa distilat.

Fiecare prob este nsoit de un martor, n care dozm glucidele reductoare

preexistente n amestecul de reacie prin introducerea reactivului DNS nainteapreparatului enzimatic cu activitatea celulozolitic. Martorii sunt i ei colorimetrai la 640

nm fa de apa distilat.


Valorile densitii optice msurate la spectrofotometru pentru probe i martori se

transform cu ajutorul curbei etalon n mg glucoz.

(mg glucoz prob- mg glucoz martor) x5 x1/10 = U/ml/min/50C

Unitatea de activitate Cx este acea cantitate de enzim care n condiiile metodei

elibereaz dintr-o soltie de CM-celuloz o cantitate de glucide reductor, care d cu

reactivul DNS acea densitate optic ca 1mg glucoz.

Construcia curbei de etalonare

Din soluia de glucoz 1,0% (5) se fac o serie de diluii n apa distilat, la care se

adaug reactiv DNS (cte 3 ml DNS/eprubeta cu diluie). Probele sunt incubate 15 minute

pe o baie de ap la fierbere, rcite i colorimetrate fa de apa distilat.Se citesc extinciile probelor la 640 nm i se traseaz un grafic, notnd pe abcis

extincia citit la spectrofotometru, iar pe ordonat mg glucoz.

Tabelul 4. Prepararea diluiilor de glucoz

Vol. soluie 5 (ml) Vol. apa distilat (ml) Cant. Glucoz (mg)


34/58

0,1 2,1 0,10,2 2,0 0,20,3 1,9 0,30,4 1,8 0,40,5 1,7 0,5

0,6 1,6 0,60,7 1,5 0,70,8 1,4 0,80,9 1,3 0,91,0 1,2 1,0

4.4.3. Determinarea activitii proteazice

Activitatea proteolitic se determin dup metoda Anson modificat [22] pe

substrat de cazein.

Principiul metodei

Enzimele proteolitice catalizeaz hidroliza caseinei permind formarea unor

compui solubili n acid tricloracetic. Coninutul n triozina i triptofan , din aceti

compui, este determinat spectrofotometric cu reactivul Folin-Cioclteu.

Reactivi i soluii:

1. Tampon fosfat 0,2 M , pH=7,0 (39,0 ml NaH2PO4 0,2M + 61,0 ml soluieNa2HPO4 0,2M) ;

2. Soluie casein 1%. 1g de casein se dizolv pe un agitator magnetic n cca 30

ml NaOH 1N. Se neutralizeaz cu H3PO4 10%, adugat n picturi sub continu

agitare. Se aduce la pH-ul dorit i se completeaz cu tampon fosfat (pH= 7n

cazul proteazelor neutre).

3. Soluie de L- tirozin 1mM ( se dizolv 181,19 mg de tirozin n 1000ml HCl

soluie 0,2N) ;

4. Soluie HCl 0,01N-0,06N-0,2N ;

5. Soluie NaOH 0,5N ;

6. Soluie acid tricloracetic 5% ;

7. Reactiv Folin-Cioclteu (se dizolv 10 g Na2 WO4 x 2H2O + 2,5g Na2MoO4 x 2

H2O + 15 g Li2SO4 + 10 ml HCl + 5ml H3PO4 conc. i se aduce la 100ml cu apa


35/58

distilat ). nainte de utilizare se dilueaz o parte din aceast soluie cu dou pri

ap distilat .

8. Soluie enzimatic.

Mod de lucru

Amestecul de reacie format din 0,5ml soluie enzimatic (mediu de cultur

separat de biomas) i 1 ml soltie casein 1% n tampon fosfat 0,2 M (pH=7) se

incubeaz la 37 C timp de 10 minute. Reacia enzimatic se stopeaz cu 2 ml acid

tricloracetic 5%. Amestecul de reacie se menine 30 minute la temperatura camerei i

apoi se filtreaz. La 0,5ml filtrat se adaug 0,5 ml HCl 0,2 N, 2ml NaOH 0,5 N i

reactiv Folin Cioclteu diluat 1 :2. Se las 30 minute la temperatura camerei i se

msoar extincia la 578nm fa de martor. La proba martor se lucreaz asemntor , cu

excepia c n amestecul de reacie se introduce acid tricloracetic imediat peste soluia decasein, se las n repaus 30 minute la temperatura camerei i apoi se introduce soluia

enzimatic. n continuare se lucreaz identic ca la proba de determinat.

Construirea curbei etalon

Se pipeteaz n 11 eprubete volumele de tirozin, HCl 0,2N, NaOH 0,5N,

menionate n tabelul 4, dup care, n condiii de agitare puternic, se introduce reactivul

Folin-Cioclteu.

Tabelul 5. Obinerea diluiilor de L-tirozina

Eprubetanr.

L-Tyr (ml) L-Tyr (moli)

HCl0,2N(ml)

NaOH0,5N(ml)

F-C(ml)

Extinctia

1 2 3 4 5 6 71 0 0 2,00 4 1,2 0,0433 0,04 0,04 1,96 4 1,2 0,0824 0,08 0,08 1,92 4 1,2 0,1255 0,12 0,12 1,88 4 1,2 0,55

6 0,16 0,16 1,84 4 1,2 0,227 0,20 0,20 1,80 4 1,2 0,298 0,24 0,24 1,76 4 1,2 0,329 0,26 0,26 1,72 4 1,2 0,3410 0,28 0,28 1,68 4 1,2 0,37511 0,32 0,32 1,64 4 1,2 0,45011 0,40 0,40 1,60 4 1,2 0,475


36/58

Se las la temperatura camerei 30 minute,apoi se citete extincia la

spectrafotomertu Spekol la 578 nm , fa de apa distilat. Se construiete un grafic cu

extincia citit la 578 nm pe ordonat i moli L-tyr pe abcis.


Din curba de etalonare se determin moli tirozin corespunztori extinciei

msurate. Valorile citite pe grafic vor fi introduse n urmtoarea formul:

(micromoli Tyr proba- micromoli Tyr martor) x 3,5/10 x 0,5 x 0,5 = micromoli Tyr/ml/min

unde:

3,5- volum total amestec ;

1/10- factorul de transformare pentru un minut de reacie enzimatic ;

0,5- volumul de lichid cu activitate proteolitic luat n lucru ;0,5- volumul de lichid filtrat luat n lucru ;

O unitate de activitate proteazic este definit ca fiind cantitatea de enzim care n

condiiile de reacie indicate elibereaz 1mol tirozin pe minut.

4.4.4. Determinarea activitii xilanazice

Activitatea xilanazic s-a determinat printr-o metod combinat, avnd la bazmetoda clasic a lui Miller ce folosete reactiv DNS [23].

Principiul metodei

Xilanaza catalizeaz hidroliza iar zaharurile reductoare formate (xiloza) sunt

determinate spectrofotometric cu reactiv DNS la 540 nm.

Reactivi i soluii:

1. Tampon acetat de sodiu 0,05M, pH 5,3

2. Soluie xilan (Fluka) 0,6% n tampon acetat

3. Soluie de D-xiloza 0,0025 M n ap distilat

4. Reactiv DNS (se dizolv 10 g acid 3,5 dinitrosalicilic n 300 ml ap distilat, se

adaug 400ml NaOH 1N i 300g tartrat de sodiu i potasiu i se aduce la 1 litru).

5. Soluie enzimatic n tampon acetat.

Mod de lucru


37/58

n eprubetele prevzute cu dop se introduce amestecul de reacie format din 0,5

ml soluie enzimatic i 0,5ml soluie substrat (xilan 0,6% n tampon acetat (pH=5,3), ce

se incubeaz pe baie de ap la 40C, timp de 30 de minute. Reacia enzimatic se

stopeaz cu 1 ml reactiv DNS.

Amestecul de reacie se fierbe 5 minute pe baie de ap, se aduce la 5 ml cu ap

distilat i se msoar extincia la 540 nm fa de apa distilat. La fiecare prob se face i

un martor. La proba martor se lucreaz asemntor, cu excepia c n amestecul de reacie

se introduce reactivul DNS imediat peste soluia de substrat i apoi se introduce soluia

enzimatic. n continuare se lucreaz identic ca la proba de determinat.

Construirea curbei etalon

Se pipeteaz n 11 eprubete volumele de soluie de xiloz menionate n tabelul 5,

dup care se introduc 0,5 ml substrat (soluie xilan) i 1 ml reactiv DNS.


38/58

Tabelul 6. Obinerea diluiilor de D-xiloza

Eprubetanr.

D-Xiloza(ml)

D-Xiloza(nmoli)

Apa (ml) Xilan(ml)

DNS(ml)

Extincia

1 0 0 0,5 0,5 1,0 0,0392 0,05 250 0,45 0,5 1,0 0,0438

3 0,10 500 0,40 0,5 1,0 0,06314 0,15 750 0,35 0,5 1,0 0,10045 0,20 1000 0,30 0,5 1,0 0,12086 0,25 1250 0,25 0,5 1,0 0,14917 0,30 1500 0,20 0,5 1,0 0,18008 0,35 1750 0,15 0,5 1,0 0,22009 0,40 2000 0,10 0,5 1,0 0,235110 0,45 2250 0,05 0,5 1,0 0,284311 0,50 2500 0,00 0,5 1,0 0,3285

Se adaug 3 ml ap distilat i se las la temperatura camerei pentru rcireaeprubetelor, apoi se citete extincia la spectrofotometru JASCO la 540 nm , fa de apa

distilat. Se construiete un grafic cu extincia citit la 540 nm pe ordonat i nmoli D-

xiloza pe abcis, conform diagramei urmtoare :

Figura 5. Curba etalon de xiloz


39/58


Din curba de etalonare se determin nmoli xiloza corespunztori extinciei

msurate.

Valorile citite pe grafic vor fi introduse in urmatoarea formula:

(nmoli xiloza prob nmoli xiloza martor) x 1/30= U/ml/min

unde

1/30- factorul de transformare pentru un minut de reacie enzimatic ;

O unitate de activitate xilanazic este definit ca fiind cantitatea de enzim care n

condiiile de reacie indicate elibereaz 1nmol xiloza/ml/minut la 40C.

4.5. Testarea produsului enzimatic n hrana animalelor de ferm

Testarea produsului enzimatic n hrana animalelor de ferm a implicat stabilirea

dozei optime, evaluarea efectelor tehnico-economice, ntocmirea documentaiei de

realizare a furajului, a schemei i a procedurii de evaluare a conformitii [24].

Figura 6. Tineret porcin din loturile experimentale


40/58

Produsul enzimatic realizat n urma cercetrilor abordate n cadrul proiectului, a

fost verificat n cadrul unui biotest pe tineret porcin, loturile experimentale i observaiile

fiind realizate n condiiile de ferm la IBNA Baloteti. Preparatul enzimatic s-a obinut

din culturi de Aspergillus nigeri reprezint un amestec de enzime cu activitate

amilolitic, proteolitic, celulozolitic i xilanayic (tabelul 7). Doza de includere n

structura reetei de nutre combinat a fost de 2 respectiv 5 kg / tona de nutre combinat.

Tabelul 7. Caracterizarea activitii enzimatice a preparatului enzimatic

Specificaie ActivitateAmilolitic 105,36UDNS/gProteolitic 1,01 UP/g

Celulozolitic 1,35 U/gXilanazica 3,95 U/g

n scopul cuantificrii efectului administrrii preparatului enzimatic n hrana

animalelor s-au format trei loturi omogene i s-au elaborat noi soluii nutriionale.

Testul biologic s-a derulat pe un numr de 54 purcei din rasa Marele Alb conform

schemei experimentale din tabelul 8. Durata experimentului a fost de 18 zile, cu

nregistrarea zilnic a consumului de nutre combinat. Animalele au fost cntrite la

nceputul i sfritul experimentului.

Tabelul 8. Schema experimental

SpecificaieL O T

M E1 E2Numr de animale (cap) 18 18 18

Durata experimentului (zile) 18 18 18Variabila (cantitatea de preparat

enzimatic) Kg / tona de NC* - 2 5

*NC- nutre combinat

A fost utilizat o receptur de nutre combinat unic pentru cele trei loturi,

variabila constituind-o cantitatea de enzima inclus n premixul vitamino-mineral ntr-o

pondere diferit la cele dou loturi experimentale (E1-2 kg /to de NC; E2- 5 kg/ to de


41/58

NC) (tabelul 8). Ca ingrediente cerealiere s-a utilizat grul (acesta fiind caracterizat

printr-un coninut ridicat xilani i arabinoxilani), ponderea de includere fiind de 30% i

porumbul, n vederea unei mai bune echilibrri energetice a reetei.

Tabelul 9. Structura recepturilor de nutre combinat i indicii calitativi ai acestora

pentru purcei

Ingrediente % LOTM E1 E2

Porumb 28,31 28,21 27,81Gru 30,00 30,00 30,00

rot soia 8,00 8,00 8,00Full fat soia 10,00 10,00 10,00

Lapte praf 15,00 15,00 15,00Fin pete 4,00 4,00 4,00

Lizin 0,49 0,49 0,49Metionin 0,20 0,20 0,20

Premix colin 0,10 0,10 0,10Fosfat monocalcic 1,70 1,70 1,70Carbonat de calciu 1,10 1,10 1,10

Sare 0,10 0,10 0,10Premix vitamino-mineral P1

Enzim1,00

-1,000,20

1,000,50

Indici calitativiProtein brut (%) 21,62 21,62 21,62Energie metabolizabil

Kcal

Mj/kg NC

332013,89

332013,89

332013,89

Lizin (%) 1,50 1,50 1,50Metionin + cistin (%) 0,90 0,90 0,90

Calciu (%) 1,10 1,10 1,10Fosfor (%) 0,90 0,90 0,90


42/58

Capitolul 5. Rezultate i discuii

5.1. Compoziia mediilor pentru cultura de ntreinere

n urma testrii celor doua medii menionate n capitolul 4 s-a constatat c mediul

cu extract de mal ofer cele mai bune condiii pentru obinerea culturilor de ntreinere

pentru toate tulpinile testate. Astfel, pe pe suprafata acestui mediu, la temperatura optim

de dezvoltare (28C), dup 7 zile, se formeaz un miceliu bogat, alb pufos i un miceliu

aerian purttor de conidiofori colorai n negru intens. Miceliul este uniform, sporulat pe

toat suprafata. Tulpina de Trichoderma viride nu s-a dezvoltat pe mediul Czapek-Doxsimplu [25].

5.2 Analiza comparativ a biosintezei enzimelor hidrolitice cu tulpiniAspergillus nigeri Trichoderma viride pe diferite medii

Pentru a evalua nivelul de biosintez a enzimelor componente ale complexului

studiat s-a utilizat, ca termen de comparaie, produsul KEMZYMEVP DRY, un

complex multienzimatic destinat a fi utilizat n reetele de hran care conin un nivel

ridicat de cereale i proteine vegetale (rot de soia). Acesta permite obinerea unor

performane deosebite chiar n condiiile excluderii din alimentaie a surselor proteice de

origine animal. Conine surse stabilizate de endo-1,3-beta-glucanaze (E.C 3.2.1.6),

celulaze (E.C 3.2.1.4), alfa-amilaze (E.C 3.2.1.1), bacilolizin (proteaze) (E.C 3.4.24.28),

i endo-1,4-beta-xilanaze (E.C 3.2.1.8). Activitate secundar: lipaza [25]

Tabelul 10. Caracterizarea activitii enzimatice a produsului KEMZYMEVP DRY

KEMZYMEVP DRYActivitatea

celulozolitic(C1-Cx) U/g

Activitateamilolitic

UDNS/g

Activitateproteolitic

U/g

2,50 620 1,12


43/58

Din tabelul 11 se observ c tulpina de Aspergillus niger CBM-1 are activitate

proteolitic i amilolitic, cele mai bune rezultate obtinndu-se pe mediul de cultur M3.

De asemenea s-a constatat ca maximum de activitate amilolitic i proteolitic s-a obinut

la 48 ore : 12,3 UDNS/ml, 1,44 UP/ml, activitatea celulozolitic fiind considerat

satisfctoare, aceast tulpin a fost luat n considerare n experimentele ulterioare fr a

fi considerat cea mai bun.

Mediul de cultur final de fermentaie s-a prelucrat integral prin absorbie pe

carbonat de calciu tehnic, s-a uscat n curent de aer timp de 2 ore la 40C i s-au obinut

10g produs, care s-a caracterizat din punct de vedere al activitii enzimatice.

Produsul enzimatic solid obinut cu tulpina deAspergillus niger CBM-1prezint

urmtoarele activiti enzimatice:Din tabelul 12, se observ c tulpina Aspergillus niger CMGB-401 aflat n

colecia Facultii de Biologie, Universitatea Bucureti este productoare de enzime

amilolitice i celulozolitice, rezultate bune oinndu-se la 48 de ore pe mediul de cultur

M4 (activitatea celulozolitic A.E.= 1,18 UC1-Cx/ml) i la 72 de ore (activitatea amilolitic

A.E.= 40 UDNS/ml).

Din tabelul 13 se observ c tulpina Trichoderma viridae prezint cea mai bun

activitate amilolitic (cuprins ntre 30-46 UDNS/ml), dar activitatea celulozolitic este deaproximativ de 10 ori mai mic. ntruct se urmrete obinerea unui produs cu activitate

amilolitic i celulozolitic s-a ajuns la concluzia ca cea mai potrivit tulpin pentru

scopurile noastre este tulpina deAspergillus niger CMGB-401 pe mediul de cultur M4.

n tabelul 14 sunt redate valorile activitii xilanazice pe probe obinute prin

cultivarea timp de 72 de ore a tulpinilor de Aspergillus nigeri Trichoderma viridae pe

dou variante de mediu: M1 (Aspergillus niger CBM-1 i Trichoderma viridae CMGB-

401 uscate pe pat de carbonat de calciu) i M4 (Aspergillus niger CMGB-401-cultura

final lichid).

Tabelul nr.11 Variaia activitii enzimatice hidrolitice pe parcursul biosintezeienzimelor cu tulpina deAspergillus niger CBM-1

As

per

Me 24 ore 48 ore 72 ore


44/58

gillusnigerCBM-1

diul pH A.E

celulozolitic(C1-Cx)U/ml

A.Eamilolitic

UDNS/ml

A.Eproteolitic

UP/ml

pH A.Ecelulozolitic

(C1-Cx)U/ml

A.Eamilolitic

UDNS/ml

A.Eproteolitic

UP/ml

pH A.Ecelulozolitic

(C1-Cx)U/ml

A.Eamilolitic

UDNS/ml

A.Eproteoliti

UP/ml

1 6,4 0,01 6 0,20 6,0 0,07 7,2 0,50 6,0 0,02 8,1 0,19

2 5,0 0,03 7 0,26 6,0 0,40 8,4 0,32 5,5 0,18 9,3 0,14

3 5,5 0,02 11 0,95 5,5 0,80 12,3 1,44 5,5 0,10 6,4 0,16

4 5,8 0,01 5 0,11 5,5 0,20 5,8 0,21 5,0 0,07 6,9 0,84

Tabelul nr. 12 Variaia activitii enzimatice hidrolitice pe parcursul biosintezeienzimelor cu tulpina deAspergillus niger CMGB-401

AspergillusnigerCMGB-40

1

Mediul 24 ore 48 ore 72 ore

pH A.Ecelulozolitic

(C1-Cx)U/ml

A.Eamilolitic

UDNS/ml

A.Eproteolitic

UP/ml

pH A.Ecelulozoliti

c(C1-Cx)U/ml

A.Eamilolitic

UDNS/ml

A.Eproteolitic

UP/ml

pH A.Ecelulozolitic

(C1-Cx)U/ml

A.Eamilolitic

UDNS/ml

A.Eproteoli

UP/m

1 6,4 0,01 2 0,93 6,0 0,02 13,6 1,2 5,5 0,04 16 0,67

2 6,0 0,10 3,6 0,09 6,0 0,14 28 0,22 5,7 0,02 26 0,11

3 5,5 0,30 3,4 0,5 5,5 0,52 16 0,74 5,5 0,15 36 0,12

4 6,4 0,90 1,4 0,1 5,5 1,18 13 1,4 5,0 0,1 40 0,30

Tabelul nr.13 Variaia activitii enzimatice hidrolitice pe parcursul biosintezeienzimelor cu tuplina de Trichoderma viride CMGB-405

TrichodermavirideCMGB-405

Mediul 24 ore 48 ore 72 ore

pH A.Ecelulozolitic

(C1-Cx)U/ml

A.Eamilolitic

UDNS/ml

A.Eproteolitic

UP/ml

pH A.Ecelulozolitic

(C1-Cx)U/ml

A.Eamilolitic

UDNS/ml

A.Eproteolitic

UP/ml

pH A.Ecelulozolitic

(C1-Cx)U/ml

A.Eamilolitic

UDNS/ml

A.Eproteoli

UP/m

1 6,0 0,187 8 0,28 6,0 0,2 40,4 0,28 5,7 0,15 31,6 0,08

2 6,0 0,095 9,5 0,49 6,0 0,2 46,4 0,49 5,5 0,12 25,7 0,25

3 6,0 0,0375 3,2 0,44 5,5 0,15 18,8 0,39 5,5 0,057 13,0 0,12

4 6,0 0,025 4,5 0,14 5,5 0,75 34,5 0,44 5,5 0,15 9,8 0,17


45/58

Tabelul nr. 14 Determinarea activitii xilanazice

Nr.crt.

Proba Cantitate(g)

mltampon

diluia Extincia 540nm

Activitatexilanazica(U/g)

PH Timp(ore)

V

1 KEMZYMEVP DRY 0,0485 5 X 10 0,5061/0,0512 106 390

2 Aspergillus niger CBM-1 0,2168 5 0,0957/0,0590 280 6,0 72

3 Trichoderma viride

CMGB-405

0,1259 3 0,1445/0,0714 580 5,7 72

4 Aspergillus niger

CMGB-401

1 ml 1 X 4 0,1275/0,0635 85 330 U/ml 5,5 72

5.3. Temperatura optim de cultivare

Temperatura optim de cultivare a tulpinii de Aspergillus niger CMGB-401 pe

mediul de cultur (M4-fin de soia) s-a urmrit determinnd activitatea enzimatic la

diferite temperaturi (28C, 32C, 37C).

Rezultatele obinute sunt prezentate n tabelul 15.

Tabel 15. Variaia activitilor enzimatice n funcie de temperatura de cultivare pe mediul

de cultur M4 dupa 48 ore i dupa condiionare

Temp. Activitatea

amilolitic

Activitatea

Proteolitic

Activitatea celulozolitic (C1-Cx)

28C 124.08 (U/ml) 2.27 (U/ml) 2.82 (U/ml)32C 104.88 (U/ml) 2.03 (U/ml) 1.69 (U/ml)37C 82.8 (U/ml) 1.43 (U/ml) 1.84 (U/ml)

PRODUS CONDIIONAT-prin adsorbie pe CaCO3.28C 122.4 (U/g) 2.31 (U/g) 2.71 (U/g)32C 99.6 (U/g) 1.98 (U/g) 1.64 (U/g)37C 84.72 (U/g) 1.29 (U/g) 1.37 (U/g)

Din tabelul 15 i figura 7 se observ c dei cultura are activiti enzimatice i la

37C (activitatea amilolitic 82.8 UDNS/g, activitatea proteolitic 1.43 UP/g, activitatea

celulozolitic 1.84 UC1-Cx/g), totui cele mai bune rezultate s-au obinut prin cultivarea

tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 la temperatura de 28C (activitatea amilolitic

124.08 UDNS/g, activitatea proteolitic 2.27 UP/g, activitatea celulozolitic 2.82 UC1-Cx/g).


46/58

Din tabelul 16 se observ, de asemenea, c i activitatea xilanazic este optim la 22

-280C, iar la 370C activitatea scade de cca 4 ori.

Tabelul 16. Variaia activitii xilanazice n funcie de temperatura de cultivare a mediului

de cultur (M4-fin de soia) dupa 48 de ore

TemperaturaCantitateprob (ml)

Sol.tampon(ml)

DiluiaExtincia(540 nm)

Activitatexilanazic(U/ml)

220C 2 2 X 5 0,4749/0,0941 1269,33280C 2 2 X 5 0,4749/0,0941 1269,33370C 2 2 X 5 0,1978/0,0941 345,66

Concluzia este c varianta optim de cultivare a tulpiniiAspergillus niger CMGB-

401 este cea realizat la temperatura de 28C.

124,08

2,272,82

104,88

2,03 1,69

82,8

1,431,84

0

20

40

60

80

100

120

140Activitatea

enzimatic (U/ml)

28C 32C 37CTemperatura

Activitateaamilolitic(UDNS/ml)

Activitatea proteolitic(U/g)

Activitateacelulozolitic(UDNS/g)

Figura 7. Efectul temperaturii de cultivare a tulpinii Aspergillus niger CMGB-401 pe

mediul de cultura (M4-faina de soia) asupra activitatii enzimatice, dupa 48 ore


47/58

5.3 Alegerea pH-ului optim de cultivare

Experimentele s-au realizat n pahare Erlenmayer cu capacitatea de 250 ml i 500

ml care conin 100 ml mediu cu fin de soia respectiv, 250 ml mediu cu tre de gru.

Culturile au fost agitate cu ajutorul unui agitator rotativ la 220 rpm timp de 48 de ore.

pH-ul mediului de cultur sarja 2 (M4-mediu de cultura cu fin de soia) a variat astfel:

Varianta 1: pH mediului de cultur=5.5;

Varianta 2: pH mediului de cultur =6.5;

Varianta 3: pH mediului de cultur =7.0

Tabelul 17. Variaia activitilor enzimatice n funcie de pH-ul mediului de cultur

(M4) dup 48 ore de fermentaie i dup condionare

pH Activitatea amilolitic Activitatea proteolitic Activitatea celulozolitic(C1-Cx)

5.5 141.6 (U/ml) 1.95 (U/ml) 2.91 (U/ml)6.5 108 (U/ml) 1.29 (U/ml) 2.15 (U/ml)7.5 76.8 (U/ml) 1.15 (U/ml) 1.66 (U/ml)

PRODUS CONDIIONAT-prin adsorbie pe CaCO3.

5.5 105.36 (U/g) 1.08 (U/g) 1.35 (U/g)6.5 96 (U/g) 1.01 (U/g) 1.28 (U/g)7.5 77.4 (U/g) 0.7 (U/g) 1.31 (U/g)

Dup 48 ore, s-a constatat c pH-ul mediului de cultur n cazul primei variante a

rmas constant 5-5,5, pe cnd pentru celelalte variante (2 i 3) pH-ul mediilor de cultur a

scazut de la 6.5-7.5 la 5-5.5. Ulterior, mediile de cultur au fost condiionate integral,


48/58

nainte de sporulare, prin adsorbie pe CaCO3. .

141.6

1.952.91

108

1.292.15

76.8

1.151.66

0

20

40

60

80

100120

140

160Activitatea

enzimatic (U/ml)

5.5 6.5 7.5pH

Activitateaamilolitic(UDNS/mlActivitatea proteolitic(U/g)

Activitateacelulozolitic(UDNS/g)

Figura 8. Variatia activitatii enzimatice a complexului enzimatic obtinut cu tulpina

Aspergillus nigerCMGB-401 in functie de pH-ul mediului de cultura (M4 faina de soia),

dupa 48 ore

Din datele prezentate n tabelul 17 i figura 8 s-a poate observa c tulpina de

Aspergillus niger CMGB-401 prezint cele mai bune activiti enzimatice la pH-ul

mediului de cultur de 5.5. n urma procesului de condiionare prin adsorbie pe CaCO3 s-

a observat o scdere a activitilor enzimatice aa cum rezult din figura 9.


49/58

141.6

105.36108

96

76.877.4

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Activitate

enzimatic

5.5 6.5 7.5pH

dup 48 de ore

dup condiionare

Figura 9. Variaia activittii amilolitice dup 48 de ore i dup condiionare pe carbonat de

calciu

Tabelul 18. Variaia activitii xilanazice n funcie de pH-ul mediului de cultur dup 48

ore i dup condiionare

PH Prob (ml sau g) Soluietampon(ml)

diluia Extincia 540 nm Activitatexilanazic(U/ml)

5.5 2 2 X5 0,5040/0,0941 1366,336.5 2 2 X5 0,5963/0,0941 16747.5 2 2 X5 0,5757/0,0941 1595,36

PRODUS CONDIIONAT-prin adsorbie pe CaCO3.5.5 0,0759 2 0,5181/0,0696 3,95 U/mg6.5 0,0742 2 0,3635/0,0624 2,67 U/mg

n ceea ce privete activitatea xilanazic a culturii de Aspergillus nigerdup 48 de

ore, funcie de pH, se observ c aceasta este optim la un pH 6,5-7, iar pentru produsul

condiionat activitatea xilanazic este mai ridicat la pH = 5,5, dar scderea nu este

dramatic la valoarea de pH = 6,5, ceea ce permite a se considera pH-ul 5,5 ca optim,


50/58


51/58

Tabelul 19. Variaia activitilor enzimatice n funcie de pH-ul mediului semisolid (cu

tre de gru) dup 48 ore i dup condiionare

PH Activitateaamilolitic

Activitateaproteolitic

Activitateacelulozolitic

(C1-Cx)

Activitatexilanazic

(U/mg)5.5 75.12 (U/ml) 1.98 (U/ml) 1.45 (U/ml)6.5 66.96 (U/ml) 1.55(U/ml) 1.05 (U/ml)

7.5 52.32 (U/ml) 1.29 (U/ml) 1.27 (U/ml)PRODUS CONDIIONAT-prin adsorbie pe CaCO3.

5.5 76.32 (U/g) 1.22 (U/g) 0.98 (U/g) 8,74

6.5 58.88 (U/g) 1.4 (U/g) 0.81 (U/g)7.5 50.88 (U/g) 1.48 (U/g) 1.22 (U/g)

Examinand comparativ rezultatele prezentate n tabelele 17 -19 care redau variaia

activitilor enzimatice n funcie de pH pe mediul M4 (stabilit n prima faz ca fiind

mediul optim de dezvoltare) i un mediu semisolid cu tre de gru ca surs de carbon

(activitatea amilolitic 75.12 UDNS/g, activitatea proteolitic 1.98 UP/g, activitatea

celulozolitic 1.45 UC1-Cx/g), s-a constatat c biosinteza enzimelor hidrolitice (amilaza,

proteaza, celulaza) ca i a xilanazei este favorizat n mediul lichid (M4-fin de soia) la

pH=5.5. Mediul lichid este mai avantajos din punct de vedere economic ceea ce l

recomand pentru folosirea n condiii de micropilot i pilot.

5.4. Testarea complexului enzimatic ca aditiv furajer

Greutatea medie iniial a animalelor supuse testrii a fost de 8 kg. Dup 18 zile

de la nceputul experimentului s-a efectuat cntrirea individual final iar rezultatele

obinute au fost prelucrate statistic (tabelul 18, figura 8). Performanele au fost

mbuntite n cazul loturilor la care a fost inclus enzima n structura reetei de nutre

combinat dar nu s-au semnalat diferene semnificative n ceea ce privete greutatea

corporal i sporul mediu zilnic (P>0.05). O posibil explicaie a mbuntirii

performanelor la purcei prin adugarea de enzim ar fi efectul asupra unor factori ca:

timpul de tranzit intestinal al hranei, produciile endogene, schimbrile n polizaharurile

fr amidon, degradarea sau schimbarea fibrei[26].


52/58

Tabelul 20. Performane bioproductive

SpecificaieL O T

M E1 E2Greutate corporala iniiala (kg) 8,75 8,71 8,96Greutate corporala final (kg)* 12,75 a 1,94 12,83 a 1,90 13,23 a 2,86

Spor mediu zilnic (kg) 0,222a 0,09 0,229a 0,08 0,237a 0,12Consum mediu zilnic de NC (kg) 0,439 0,446 0,450

Consum specific -kg NC /Kg spor- % fa de martor

1,98100,00

1,9598,48

1,9095,96

*aceeai liter diferene nesemnificative ntre loturi (P>0.05)

8.7

5

12

.75

8.7

1

1

2.

83

8.

96 1

3.

23

0

2

4

6

8

10

12

14

G. initiala G. finala

M E1 E2

Figura 10. Dinamica greutii corporale

n ceea ce privete sporul mediu zilnic (tabelul 20, figura 11), se constat de

asemenea, o uoar mbuntire n cazul loturilor experimentale (0,237 kg la lotul E1,

respectiv, 0,229 kg la lotul E2, fa de 0,222 kg la lotul martor), fr ca diferenele s fie

semnificative. Se apreciaz c enzima amelioreaz efectul antinutritiv i eficientizeaz

producia [26].


53/58

0.2

22

0.

229

0.2

37

0.21

0.22

0.23

0.24

sm z

M

E1

E2

Figura 11. Sporul mediu zilnic

Consumul mediu zilnic de nutre combinat a fost asemntor la cele trei loturi

(tabelul 20, figura 12). S-a constatat o reducere a consumului specific n cazul loturilor

cu adaos de preparat enzimatic (1,95 kg NC/kg spor la lotul E1 respectiv, 1,90 kg NC/kg

spor n cazul lotului E2 comparativ cu 1,98 kg NC/kg spor la lotul M).

0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

1.8

2.1

M

E1

E2

M 0.439 1.98

E1 0.446 1.95

E2 0.450 1.90

c.m.z NC Consum specific

Figura 12 . Consumul mediu zilnic (kg) i consumul specific (kg NC/Kg spor)


54/58

CONCLUZII

n cadrul cercetrilor experimentale prezentate n proiectul de fa s-au testat

dou tulpini deAspergillus nigeri o tulpin Trichoderma viridae din colecia Centrului

de Biotehnologii Microbiene i respectiv a Facultii de Biologie, Universitatea

Bucureti, n ceea ce privete capacitatea acestora de a produce un complex de enzime

hidrolitice (proteaze, amilaze, celulaze, xilanaze) utilizabil ca aditiv furajer.

Cele trei tulpini de fungi au fost cultivate n sistem submers, pe 4 medii de

cultur preluate din literatura de specialitate; activitatea polienzimatica a mediilor de

fermentaie i a produselor finite (obinute prin filtrarea mediului de fermentaie,

concentrare i adsorbie pe CaCO3 tehnic) s-a evaluat comparativ cu preparatul

KEMZYMEVP DRY (Belgia).

Rezultatele obinute au evideniat capacitatea bioproductiv superioar a tulpinii

Aspergillus nigerCMGB-401 n ceea ce privete complexul enzimatic studiat.

n scopul determinrii condiiilor optime de cultivare a tulpinii de Aspergillus

niger CMGB-401 pentru biosinteza enzimelor hidrolitice (amilaze, proteaze, celulaze,

xilanaze), au fost cercetai o serie de parametrii care au o importan semnificativ pentruacest tip de bioprocese i anume: compoziia mediul de cultur, temperatura, pH-ul

mediului de cultur i gradul de agitare i aerare al culturii.

n ceea ce privete compoziia mediului de cultur, dintre cele cinci medii testate

(patru medii lichide i un mediu semisolid pe baz de tre de gru), cele mai bune

rezultate s-au obinut cu mediul lichid M 4, avnd urmtoarea compoziie (g%):

Fin de porumb-2%;

Fin de soia-3%;

(NH4)2HPO4-0,5%;

MgSO4x7H2O-0,05%;

CaCl2-0,1%

n cazul diferitelor variante de pH i temperatur folosite, s-a observat c tulpina

de Aspergillus niger CMGB-401 conduce cele mai bune activiti enzimatice, n urma


55/58

cultivrii la pH = 5,5 i la temperatura de 280C (activitatea amilolitic 141,6 UDNS/g,

activitatea proteolitic 1,95 UP/g, activitatea celulozolitic 2,27 UC1-Cx/g, activitatea

xilanazic 1366,33 U/ml).

Condiionarea produsului polienzimatic s-a realizat prin concentrarea mediului

integral din finalul fermentaiei, tratarea cu CaCO3 a concentratului i uscarea sub vid a

amestecului rezultat.

Testarea ca aditiv furajer a produsului polienzimatic condiionat a evideniat

faptul c utilizarea acestuia nu a influenat semnificativ greutatea corporal i sporul

mediu zilnic a purceilor n perioada crizei de nrcare, posibil din cauza faptului c

nutreul combinat a fost optimizat n principii nutritivi specifici acestei categorii de

porcine;

Consumul specific la loturile de purcei la care s-a utilizat preparat enzimatic estecu 1,52% - 4,04% mai mic fa de martor, in funcie de cantitatea de produs introdus n

raia zilnic.

Rezultatele obinute sugereaz eficiena utilizrii preparatelor enzimatice n

recepturi de nutre combinat deficitare n principii nutritivi.


56/58

BIBLIOGRAFIE

1. David Cowan,International Journal for Food Chemistry,pag. 32-38, 1992.

2. Sun Y., Cheng J.,Biores. Technol. 83: 1-11, 2002.

3. Rosgaard I., Pederson S., Cherry J.R., Harris P., Meyer AS.,Biotechnol Prog.,

22(2):493-498, 2006.

4. Puls J., Schuseil J.,Hemicellulose and Hemicellulases, MP Coughlan and GP

Hazlewood (Eds), Portland Press, 1993.

5. Betts W.B., Dart R.K., Ball A.S., Pedlar S.L.,Biodegradation: Natural and Synthetic6. A.L. Demain, N.A. Solomon,Biology of Industrial Microorganisms,1985.

7. Bielecki Stainslaw, Rita Pyc, Institute of Technical Biochemistry, Technical

University of Eoodz, Poland, pag. 153-157.

8. Z. Park, S. Kang, J. Lee, S. Hong, S. Kim , Applied Microbiology and Biotechnology,

Www.referat.ro-studii Privind Biosinteza Unui Complex Multienzimatic Utilizabil CA Aditiv Furajer

Documents

Transcript of Www.referat.ro-studii Privind Biosinteza Unui Complex Multienzimatic Utilizabil CA Aditiv Furajer