UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE GRIGORE T POPA IAŞI

FACULTATEA DE MEDICINĂ

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

STUDIU PRIVIND REZISTENŢA PRIN METALO-BETA-LACTAMAZE LA TULPINI DE

BACILI GRAM-NEGATIVI IZOLATE IcircN NORD-ESTUL ROMAcircNIEI

Conducător de doctorat Prof Univ Dr Luminiţa Smaranda Iancu

Doctorand Ana Irina Vornicu (Mereuţă)

IAŞI 2013

CUPRINS

PARTEA GENERALĂ 1 Rezistenţa la carbapeneme 1 11 Scurt istoric 1 12 Carbapenemele 2 13 Mecanisme de rezistenţă la carbapeneme 3 2 Metalo-β-lactamazele 3 21 Clasificarea metalo-β-lactamazelor 3 22 Metalo-β-lactamazele cromosomale 6 23 Metalo-β-lactamazele transferabile 7 24 Biochimia metalo-β-lactamazelor 32 25 Metode de detectare a metalo-β-lactamazelor 33 26 Inhibitorii de metalo-β-lactamaze 37 27 Epidemiologia metalo-β-lactamazelor 37 28 Terapia infecţiilor cu bacterii producătoare de metalo-β-lactamaze

39

29 Concluzii 40 PARTEA PERSONALĂ Motivaţia scopul şi obiectivele studiului doctoral 41 3 Material şi metode 42 31 Selecţia tulpinilor bacteriene 42 32 Testarea sensibilităţii la antibiotice 44 33 Metode fenotipice de screening pentru producerea de metalo-β-lactamaze

47

34 Izolarea şi purificarea ADN bacterian 52 35 Detectarea prin PCR a genelor pentru metalo-β-lactamaze

56

36 Determinarea spectrofotometrică a activităţii enzimatice

63

37 Investigarea suportului genetic al genelor pentru metalo-β-lactamaze

65

38 Metode de tipare moleculară 71 39 Analiza statistică 76 4 Rezultate 77

41 Tulpinile bacteriene 77 42 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor studiate 77 43 Performanţa detectării fenotipice a metalo-β-lactamazelor

84

44 Izolarea şi purificarea ADN bacterian 88 45 Genele pentru metalo-β-lactamaze 90 46 Confirmarea producerii de metalo-β-lactamaze 98 47 Suportul genetic al genelor pentru metalo-β-lactamaze

99

48 Relaţiile epidemiologice dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze

103

5 Discuţii 108 51 Sensibilitatea la antibiotice 108 52 Screening-ul fenotipic pentru producerea de metalo-β-lactamaze

113

53 Frecvenţa rezistenţei prin metalo-β-lactamaze 115 54 Caracteristicile integronilor de clasă 1 asociaţi genelor pentru metalo-β-lactamaze

121

55 Diseminarea genelor pentru metalo-β-lactamaze la tulpinile studiate

123

6 Concluzii generale Gradul de originalitate Perspective de cercetare

126

Bibliografie 128

Abrevieri AIM Australian imipenemase AK Amikacină AMA Acid mercaptoacetic ATM Aztreonam bla Gena ce codifică o β-lactamază BLSE β-lactamaze cu spectru extins bp Perechi de baze CAZ Ceftazidim CIP Ciprofloxacin CLSI Clinical Laboratory Standards Institute CMI Concentraţia Minimă Inhibitorie CT Colistin DIM Dutch imipenemase DO Doxiciclină EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ETP Ertapenem EUCAST European Comittee on Antimicrobial Susceptibility

Testing

FEP Cefepim FIM Florence imipenemase GIM German imipenemase GM Gentamicină IMP Imipenemase In Integron IPM Imipenem ISCR Insertion Sequence Common Region kb kilobaze KHM Kyorin Hospital metallo-β-lactamase LEV Levofloxacin MBL Metalo-β-lactamaze MEM Meropenem MLST Multilocus Sequence Typing NDM New Delhi metallo-β-lactamase Omp Proteină din membrana externă (outer membrane

protein) PCR Polymerase Chain Reaction PFGE Pulsed - Field Gel Electrophoresis PLP Proteine de Legare a Penicilinei

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA SAM Ampicilină-sulbactam SIM Seul imipenemase SPM Sao Paulo metallo-β-lactamase ST Sequence Type

SXT Trimetoprim-sulfametoxazol TE Tetraciclină TIC Ticarcilină TMB Tripoli metallo-β-lactamase

Cuvinte cheie metalo-β-lactamaze rezistenţa la carbapeneme Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter

baumannii tipare moleculară

MOTIVAŢIA SCOPUL ŞI OBIECTIVELE STUDIULUI

DOCTORAL

Tema aleasă pentru realizarea tezei de doctorat abordează un subiect de mare actualitate icircntrucacirct emergenţa bacteriilor rezistente şi multirezistente la antibiotice a devenit o problemă de sănătate publică icircngrijorătoare Răspacircndirea β-lactamazelor a distrus utilitatea benzilpenicilinei icircmpotriva stafilococilor a penicilinelor cu spectru larg şi a cefalosporinelor icircmpotriva bacteriilor Gram-negative Noi enzime şi noi moduri de producere a vechilor enzime ameninţă carbapenemele antibiotice de rezervă icircn prezent necesare pentru tratamentul infecţiilor severe noscomiale şi icircn unele ţări a infecţiilor comunitare cu bacili producători de β-lactamaze cu spectru extins şi cefalosporinaze AmpC Rezistenţa la această clasă de antibiotice creşte rapid cu limitarea opţiunilor terapeutice la substanţe vechi mai toxice (polimixine fosfomicină) (Hamouda et al 2011) Subiectul este cu atacirct mai important cu cacirct datele din literatura de specialitate sunt insuficiente pentru zona noastră Pseudomonas aeruginosa şi Acinetobacter baumannii sunt frecvenţi patogeni nosocomiali fiind implicaţi icircntr-o gamă largă de infecţii uneori dificil de controlat Metalo-β-lactamazele hidrolizează majoritatea beta-lactaminelor cunoscute (inclusiv carbapeneme şi inhibitori de β-lactamaze) conferind astfel bacteriei gazdă un profil larg de rezistenţă şi se asociază cu elemente genetice mobile (integroni sau plasmide) care promovează transmiterea lor rapidă Prima MBL transferabilă a fost descoperită icircn Japonia spre sfacircrşitul anilor 80 la tulpini de P aeruginosa multirezistente la antibiotice Icircn ultimii 20 de ani au fost descrise peste 10 tipuri de MBL care au diseminat rapid printre tulpini de Pseudomonas spp Acinetobacter spp şi de Enterobacteriaceae Avacircnd icircn vedere că pe plan european există programe de supraveghere a rezistenţei la antibiotice prin producerea de MBL ne-am propus cunoaşterea realităţii la momentul de faţă

1

icircn ceea ce priveşte profilul de sensibilitate la antibiotice şi determinarea frecvenţei MBL la tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn spitale din Nord-Estul Romacircniei Necesitatea majoră a utilizării unor metode specifice de diagnosticare şi identificare a bacteriilor implicate icircn patologie ne-a motivat să comparăm diferite metode de detectare a MBL cu scopul de a evidenţia eficacitatea rapiditatea şi specificitatea fiecăreia dintre acestea Utilizarea metodelor moleculare a completat evaluarea fenotipică a izolatelor şi a avut o importanţă majoră icircn caracterizarea tulpinilor rezistente care pun probleme de terapie şi de răspacircndire icircn mediul de spital Rezultatele studiului ar putea completa baza de date de la nivel naţional sau european icircn ceea ce priveşte rezistenţa la antibiotice prin producerea de MBL Stabilirea unui protocol de depistare a tulpinilor producătoare de MBL are importanţă majoră atacirct icircn stabilirea ghidurilor terapeutice cacirct şi icircn recunoaşterea promptă a unei izbucniri epidemice de infecţii nosocomiale şi luarea măsurilor de control al infecţiei Realizarea acestui studiu a fost posibilă cu ajutorul grantului intern de cercetare nr 1707830092010 finanţat de UMF ldquoGrigore T Popardquo Iaşi a unei burse de cercetare oferite de Federaţia Europeană a Societăţilor de Microbiologie (FEMS) icircn 2007 şi a grantului CNCSIS ID-25432009 Obiective 1 Investigarea profilului de sensibilitate la antibiotice la tulpini de P aeruginosa izolate icircn spitale universitare din Iaşi 2 Optimizarea unor metode de detectarea a producerii de MBL la tulpini de Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Enterobacteriaceae rezistente la imipenem 3 Identificarea naturii MBL şi investigarea suportului lor genetic 4 Investigarea mecanismelor de răspacircndire a genelor de rezistenţă (expansiune clonală versus transfer orizontal)

2

PARTEA PERSONALĂ Cuprinde capitolele 3 4 şi 5 respectiv Material şi Metode Rezultate şi Discuţii

3 MATERIAL ŞI METODE

31 SELECŢIA TULPINILOR BACTERIENE

Au fost incluse icircn studiu tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn perioada 2004-2012 icircn laboratoarele unor spitale din Iaşi Bacău şi Galaţi Criterii de includere au fost caracter morfo-tinctorial de bacil Gram-negativ şi certitudinea semnificaţiei clinice a izolatului icircn funcţie de produsul patologic Identificarea bacteriilor a fost realizată pe baza caracterelor microscopice de cultură şi biochimice Caracterele biochimice le-am determinat cu ajutorul sistemelor multitest TSI (Triple Sugar Iron) asociat cu MIU (Mobilitate Indol Urează) şi cu Simmons (citrat) şi al celor microtest galeriile API 20E şi API 20NE (bioMerieux Marcy lrsquoEtoile Franţa) 32 TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA ANTIBIOTICE

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor bacteriene incluse icircn studiu a fost testată prin metoda difuzimetrică la următoarele antibiotice (Oxoid Basingstoke Marea Britanie) ampicilină amoxicilină+acid clavulanic ampicilină +sulbactam ceftazidim cefepim piperacilină+tazobactam aztreonam imipenem meropenem ciprofloxacin levofloxacin trimetoprim-sulfametoxazol tetraciclină doxiciclină gentamicină amikacină tobramicină şi colistin icircn funcţie de identitatea bacteriei Prin metoda microdiluţiilor icircn bulion am determinat concentraţia minimă inhibitorie pentru ceftazidim şi imipenem Interpretarea rezultatelor am efectuat-o pe baza normelor CLSI (Clinical Laboratory and Standards Institute) 2004 - 2010 Controlul de calitate a fost asigurat cu tulpinile

3

de referinţă Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 şi Escherichia coli ATCC 25922 Pentru clasificarea tulpinilor icircn multirezistente MDR (multidrug-resistant) extensiv rezistente XDR (extensively

drug-resistant) şi panrezistente PDR (pandrug-resistant) am folosit recomandările recente propuse de un grup de experţi internaţionali (Magiorakos et al 2012) 33 METODE FENOTIPICE DE SCREENING PENTRU PRODUCEREA DE METALO-β-LACTAMAZE

Testarea fenotipică pentru detectarea producerii de MBL a fost efectuată prin cinci metode descrise anterior 331 Metoda dublului disc ceftazidimimipenem ndash acid mercaptoacetic CuCl2 FeCl3 (Arakawa et al 2000) 332 Metoda discului combinat imipenem-EDTA (Yong et al 2002) 333 Testul Hodge modificat (Lee et al 2003) 334 Etest MBL (Walsh et al 2002) 335 Testul microdiluţiilor EPI (EDTA-phenanthroline-

imipenem) (Migliavacca et al 2002) 34 IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN BACTERIAN

Pentru extracţia ADN bacterian am folosit patru metode 341 liza termică a celulelor bacteriene (fierberea) 342 liza chimică a celulelor bacteriene (Wilson 2001) 343 extracţia prin legare pe coloane cu membrană de silica cu ajutorul kit-ului comercial GenElute Bacterial

Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich St Louis MO SUA) 344 Extracţia automată cu aparatul Maxwellreg16 AS2000 (Promega Corp Madison WI SUA)

4

35 DETECTAREA PRIN PCR A GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Pentru detectarea genelor de tip blaVIM şi blaIMP am efectuat un multiplex PCR cu următorii primeri IMP-DIA-FWD (5rsquo-GGAATAGAGTGGCTTAATTCT-3rsquo) IMP-DIA-REV (5rsquo-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3rsquo) VIM-DIA-FWD (5rsquo-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3rsquo) VIM-DIA-REV (5rsquo-AGGTGGGCCATTCAGCCAGA-3rsquo) (Eurogentec Liegravege Belgia) care generează ampliconi de 361 bp pentru blaIMP şi 523 bp pentru blaVIM după o metodă descrisă anterior (Docquier et al 2003) Amplificarea genei de tip blaNDM-1 am realizat-o cu ajutorul primerilor NDM-Fm (5- GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC-3) şi NDM-Rm (5- CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC -3) (Eurogentec Liegravege Belgia) care flanchează un fragment intern al genei de 621 bp şi conform protocolului propus de Nordmann et al (Nordmann et al 2011a) Produşii PCR au fost separaţi prin electroforeză icircn gel de agaroză 2 36 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Am testat acţiunea de hidroliză a unei soluţii de IPM 150 microM de către extractul bacterian al tulpinilor pozitive pentru gene blaVIM şi blaIMP după o metodă descrisă anterior (Gutieacuterrez et al 2007) Ulterior am urmărit inhibiţia activităţii carbapenemazice prin EDTA pentru a confirma prezenţa unei MBL Am calculat activitatea enzimatică specifică (nmolimin mg proteină) 37 INVESTIGAREA SUPORTULUI GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Suportul genetic al blaVIM şi blaIMP l-am investigat cu primeri pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 5rsquoCS şi 3rsquoCS icircn combinaţie cu primerii IMP DIA FWD IMP

5

DIA REV VIM DIA FWD VIM DIA REV conform unei metode descrise anterior (Docquier et al 2003) O parte din ampliconii purificaţi (Wizard PCR Purification Kit Promega

Corp Madison WI SUA) au fost trimişi pentru secvenţiere la Macrogen Inc (Amsterdam Olanda) restul fiind secvenţiaţi icircn Laboratorul de Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie din cadrul Universităţii Al I Cuza Iaşi Identitatea MBL a fost stabilită prin compararea cu baza de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (httpwwwncbinlmnihgov) 38 METODE DE TIPARE MOLECULARĂ

Metodele de tipare utilizate au fost PFGE şi RAPD Tiparea prin RAPD a fost realizată pentru tulpinile de P

aeruginosa cu primerii 272PSE şi 208PSE (Campbell et al 2000) şi cu primerul ERIC2 (Versalovic et al 1991) conform protocoalelor descrise anterior iar pentru tulpinile de A baumannii cu primerul 1254 după metoda lui Akopyanz (Akopyanz et al 1992) Două sau mai multe probe cu acelaşi pattern de benzi (analizate vizual) au fost incluse icircn acelaşi tip RAPD denumit cu litere majuscule sau cifre Probele care au diferit prin una sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite Tipurile RAPD care au diferit prin maxim o bandă majoră sau trei minore au fost considerate posibil icircnrudite Benzile au fost clasificate icircn majore dacă intensitatea lor a fost mai mare sau egală cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate moleculară 200-bp ladder (Promega Corp Madison WI USA) Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mică decacirct cea a fragmentului de 1000- bp 39 ANALIZA STATISTICĂ

Datele au fost centralizate icircn baze de date EXCEL şi SPSS 130 şi prelucrate testele ANOVA şi χ2 Am considerat ca semnificative valorile lui p lt 005

6

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

CUPRINS

PARTEA GENERALĂ 1 Rezistenţa la carbapeneme 1 11 Scurt istoric 1 12 Carbapenemele 2 13 Mecanisme de rezistenţă la carbapeneme 3 2 Metalo-β-lactamazele 3 21 Clasificarea metalo-β-lactamazelor 3 22 Metalo-β-lactamazele cromosomale 6 23 Metalo-β-lactamazele transferabile 7 24 Biochimia metalo-β-lactamazelor 32 25 Metode de detectare a metalo-β-lactamazelor 33 26 Inhibitorii de metalo-β-lactamaze 37 27 Epidemiologia metalo-β-lactamazelor 37 28 Terapia infecţiilor cu bacterii producătoare de metalo-β-lactamaze

39

29 Concluzii 40 PARTEA PERSONALĂ Motivaţia scopul şi obiectivele studiului doctoral 41 3 Material şi metode 42 31 Selecţia tulpinilor bacteriene 42 32 Testarea sensibilităţii la antibiotice 44 33 Metode fenotipice de screening pentru producerea de metalo-β-lactamaze

47

34 Izolarea şi purificarea ADN bacterian 52 35 Detectarea prin PCR a genelor pentru metalo-β-lactamaze

56

36 Determinarea spectrofotometrică a activităţii enzimatice

63

37 Investigarea suportului genetic al genelor pentru metalo-β-lactamaze

65

38 Metode de tipare moleculară 71 39 Analiza statistică 76 4 Rezultate 77

41 Tulpinile bacteriene 77 42 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor studiate 77 43 Performanţa detectării fenotipice a metalo-β-lactamazelor

84

44 Izolarea şi purificarea ADN bacterian 88 45 Genele pentru metalo-β-lactamaze 90 46 Confirmarea producerii de metalo-β-lactamaze 98 47 Suportul genetic al genelor pentru metalo-β-lactamaze

99

48 Relaţiile epidemiologice dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze

103

5 Discuţii 108 51 Sensibilitatea la antibiotice 108 52 Screening-ul fenotipic pentru producerea de metalo-β-lactamaze

113

53 Frecvenţa rezistenţei prin metalo-β-lactamaze 115 54 Caracteristicile integronilor de clasă 1 asociaţi genelor pentru metalo-β-lactamaze

121

55 Diseminarea genelor pentru metalo-β-lactamaze la tulpinile studiate

123

6 Concluzii generale Gradul de originalitate Perspective de cercetare

126

Bibliografie 128

Abrevieri AIM Australian imipenemase AK Amikacină AMA Acid mercaptoacetic ATM Aztreonam bla Gena ce codifică o β-lactamază BLSE β-lactamaze cu spectru extins bp Perechi de baze CAZ Ceftazidim CIP Ciprofloxacin CLSI Clinical Laboratory Standards Institute CMI Concentraţia Minimă Inhibitorie CT Colistin DIM Dutch imipenemase DO Doxiciclină EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ETP Ertapenem EUCAST European Comittee on Antimicrobial Susceptibility

Testing

FEP Cefepim FIM Florence imipenemase GIM German imipenemase GM Gentamicină IMP Imipenemase In Integron IPM Imipenem ISCR Insertion Sequence Common Region kb kilobaze KHM Kyorin Hospital metallo-β-lactamase LEV Levofloxacin MBL Metalo-β-lactamaze MEM Meropenem MLST Multilocus Sequence Typing NDM New Delhi metallo-β-lactamase Omp Proteină din membrana externă (outer membrane

protein) PCR Polymerase Chain Reaction PFGE Pulsed - Field Gel Electrophoresis PLP Proteine de Legare a Penicilinei

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA SAM Ampicilină-sulbactam SIM Seul imipenemase SPM Sao Paulo metallo-β-lactamase ST Sequence Type

SXT Trimetoprim-sulfametoxazol TE Tetraciclină TIC Ticarcilină TMB Tripoli metallo-β-lactamase

Cuvinte cheie metalo-β-lactamaze rezistenţa la carbapeneme Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter

baumannii tipare moleculară

MOTIVAŢIA SCOPUL ŞI OBIECTIVELE STUDIULUI

DOCTORAL

Tema aleasă pentru realizarea tezei de doctorat abordează un subiect de mare actualitate icircntrucacirct emergenţa bacteriilor rezistente şi multirezistente la antibiotice a devenit o problemă de sănătate publică icircngrijorătoare Răspacircndirea β-lactamazelor a distrus utilitatea benzilpenicilinei icircmpotriva stafilococilor a penicilinelor cu spectru larg şi a cefalosporinelor icircmpotriva bacteriilor Gram-negative Noi enzime şi noi moduri de producere a vechilor enzime ameninţă carbapenemele antibiotice de rezervă icircn prezent necesare pentru tratamentul infecţiilor severe noscomiale şi icircn unele ţări a infecţiilor comunitare cu bacili producători de β-lactamaze cu spectru extins şi cefalosporinaze AmpC Rezistenţa la această clasă de antibiotice creşte rapid cu limitarea opţiunilor terapeutice la substanţe vechi mai toxice (polimixine fosfomicină) (Hamouda et al 2011) Subiectul este cu atacirct mai important cu cacirct datele din literatura de specialitate sunt insuficiente pentru zona noastră Pseudomonas aeruginosa şi Acinetobacter baumannii sunt frecvenţi patogeni nosocomiali fiind implicaţi icircntr-o gamă largă de infecţii uneori dificil de controlat Metalo-β-lactamazele hidrolizează majoritatea beta-lactaminelor cunoscute (inclusiv carbapeneme şi inhibitori de β-lactamaze) conferind astfel bacteriei gazdă un profil larg de rezistenţă şi se asociază cu elemente genetice mobile (integroni sau plasmide) care promovează transmiterea lor rapidă Prima MBL transferabilă a fost descoperită icircn Japonia spre sfacircrşitul anilor 80 la tulpini de P aeruginosa multirezistente la antibiotice Icircn ultimii 20 de ani au fost descrise peste 10 tipuri de MBL care au diseminat rapid printre tulpini de Pseudomonas spp Acinetobacter spp şi de Enterobacteriaceae Avacircnd icircn vedere că pe plan european există programe de supraveghere a rezistenţei la antibiotice prin producerea de MBL ne-am propus cunoaşterea realităţii la momentul de faţă

1

icircn ceea ce priveşte profilul de sensibilitate la antibiotice şi determinarea frecvenţei MBL la tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn spitale din Nord-Estul Romacircniei Necesitatea majoră a utilizării unor metode specifice de diagnosticare şi identificare a bacteriilor implicate icircn patologie ne-a motivat să comparăm diferite metode de detectare a MBL cu scopul de a evidenţia eficacitatea rapiditatea şi specificitatea fiecăreia dintre acestea Utilizarea metodelor moleculare a completat evaluarea fenotipică a izolatelor şi a avut o importanţă majoră icircn caracterizarea tulpinilor rezistente care pun probleme de terapie şi de răspacircndire icircn mediul de spital Rezultatele studiului ar putea completa baza de date de la nivel naţional sau european icircn ceea ce priveşte rezistenţa la antibiotice prin producerea de MBL Stabilirea unui protocol de depistare a tulpinilor producătoare de MBL are importanţă majoră atacirct icircn stabilirea ghidurilor terapeutice cacirct şi icircn recunoaşterea promptă a unei izbucniri epidemice de infecţii nosocomiale şi luarea măsurilor de control al infecţiei Realizarea acestui studiu a fost posibilă cu ajutorul grantului intern de cercetare nr 1707830092010 finanţat de UMF ldquoGrigore T Popardquo Iaşi a unei burse de cercetare oferite de Federaţia Europeană a Societăţilor de Microbiologie (FEMS) icircn 2007 şi a grantului CNCSIS ID-25432009 Obiective 1 Investigarea profilului de sensibilitate la antibiotice la tulpini de P aeruginosa izolate icircn spitale universitare din Iaşi 2 Optimizarea unor metode de detectarea a producerii de MBL la tulpini de Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Enterobacteriaceae rezistente la imipenem 3 Identificarea naturii MBL şi investigarea suportului lor genetic 4 Investigarea mecanismelor de răspacircndire a genelor de rezistenţă (expansiune clonală versus transfer orizontal)

2

PARTEA PERSONALĂ Cuprinde capitolele 3 4 şi 5 respectiv Material şi Metode Rezultate şi Discuţii

3 MATERIAL ŞI METODE

31 SELECŢIA TULPINILOR BACTERIENE

Au fost incluse icircn studiu tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn perioada 2004-2012 icircn laboratoarele unor spitale din Iaşi Bacău şi Galaţi Criterii de includere au fost caracter morfo-tinctorial de bacil Gram-negativ şi certitudinea semnificaţiei clinice a izolatului icircn funcţie de produsul patologic Identificarea bacteriilor a fost realizată pe baza caracterelor microscopice de cultură şi biochimice Caracterele biochimice le-am determinat cu ajutorul sistemelor multitest TSI (Triple Sugar Iron) asociat cu MIU (Mobilitate Indol Urează) şi cu Simmons (citrat) şi al celor microtest galeriile API 20E şi API 20NE (bioMerieux Marcy lrsquoEtoile Franţa) 32 TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA ANTIBIOTICE

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor bacteriene incluse icircn studiu a fost testată prin metoda difuzimetrică la următoarele antibiotice (Oxoid Basingstoke Marea Britanie) ampicilină amoxicilină+acid clavulanic ampicilină +sulbactam ceftazidim cefepim piperacilină+tazobactam aztreonam imipenem meropenem ciprofloxacin levofloxacin trimetoprim-sulfametoxazol tetraciclină doxiciclină gentamicină amikacină tobramicină şi colistin icircn funcţie de identitatea bacteriei Prin metoda microdiluţiilor icircn bulion am determinat concentraţia minimă inhibitorie pentru ceftazidim şi imipenem Interpretarea rezultatelor am efectuat-o pe baza normelor CLSI (Clinical Laboratory and Standards Institute) 2004 - 2010 Controlul de calitate a fost asigurat cu tulpinile

3

de referinţă Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 şi Escherichia coli ATCC 25922 Pentru clasificarea tulpinilor icircn multirezistente MDR (multidrug-resistant) extensiv rezistente XDR (extensively

drug-resistant) şi panrezistente PDR (pandrug-resistant) am folosit recomandările recente propuse de un grup de experţi internaţionali (Magiorakos et al 2012) 33 METODE FENOTIPICE DE SCREENING PENTRU PRODUCEREA DE METALO-β-LACTAMAZE

Testarea fenotipică pentru detectarea producerii de MBL a fost efectuată prin cinci metode descrise anterior 331 Metoda dublului disc ceftazidimimipenem ndash acid mercaptoacetic CuCl2 FeCl3 (Arakawa et al 2000) 332 Metoda discului combinat imipenem-EDTA (Yong et al 2002) 333 Testul Hodge modificat (Lee et al 2003) 334 Etest MBL (Walsh et al 2002) 335 Testul microdiluţiilor EPI (EDTA-phenanthroline-

imipenem) (Migliavacca et al 2002) 34 IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN BACTERIAN

Pentru extracţia ADN bacterian am folosit patru metode 341 liza termică a celulelor bacteriene (fierberea) 342 liza chimică a celulelor bacteriene (Wilson 2001) 343 extracţia prin legare pe coloane cu membrană de silica cu ajutorul kit-ului comercial GenElute Bacterial

Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich St Louis MO SUA) 344 Extracţia automată cu aparatul Maxwellreg16 AS2000 (Promega Corp Madison WI SUA)

4

35 DETECTAREA PRIN PCR A GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Pentru detectarea genelor de tip blaVIM şi blaIMP am efectuat un multiplex PCR cu următorii primeri IMP-DIA-FWD (5rsquo-GGAATAGAGTGGCTTAATTCT-3rsquo) IMP-DIA-REV (5rsquo-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3rsquo) VIM-DIA-FWD (5rsquo-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3rsquo) VIM-DIA-REV (5rsquo-AGGTGGGCCATTCAGCCAGA-3rsquo) (Eurogentec Liegravege Belgia) care generează ampliconi de 361 bp pentru blaIMP şi 523 bp pentru blaVIM după o metodă descrisă anterior (Docquier et al 2003) Amplificarea genei de tip blaNDM-1 am realizat-o cu ajutorul primerilor NDM-Fm (5- GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC-3) şi NDM-Rm (5- CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC -3) (Eurogentec Liegravege Belgia) care flanchează un fragment intern al genei de 621 bp şi conform protocolului propus de Nordmann et al (Nordmann et al 2011a) Produşii PCR au fost separaţi prin electroforeză icircn gel de agaroză 2 36 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Am testat acţiunea de hidroliză a unei soluţii de IPM 150 microM de către extractul bacterian al tulpinilor pozitive pentru gene blaVIM şi blaIMP după o metodă descrisă anterior (Gutieacuterrez et al 2007) Ulterior am urmărit inhibiţia activităţii carbapenemazice prin EDTA pentru a confirma prezenţa unei MBL Am calculat activitatea enzimatică specifică (nmolimin mg proteină) 37 INVESTIGAREA SUPORTULUI GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Suportul genetic al blaVIM şi blaIMP l-am investigat cu primeri pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 5rsquoCS şi 3rsquoCS icircn combinaţie cu primerii IMP DIA FWD IMP

5

DIA REV VIM DIA FWD VIM DIA REV conform unei metode descrise anterior (Docquier et al 2003) O parte din ampliconii purificaţi (Wizard PCR Purification Kit Promega

Corp Madison WI SUA) au fost trimişi pentru secvenţiere la Macrogen Inc (Amsterdam Olanda) restul fiind secvenţiaţi icircn Laboratorul de Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie din cadrul Universităţii Al I Cuza Iaşi Identitatea MBL a fost stabilită prin compararea cu baza de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (httpwwwncbinlmnihgov) 38 METODE DE TIPARE MOLECULARĂ

Metodele de tipare utilizate au fost PFGE şi RAPD Tiparea prin RAPD a fost realizată pentru tulpinile de P

aeruginosa cu primerii 272PSE şi 208PSE (Campbell et al 2000) şi cu primerul ERIC2 (Versalovic et al 1991) conform protocoalelor descrise anterior iar pentru tulpinile de A baumannii cu primerul 1254 după metoda lui Akopyanz (Akopyanz et al 1992) Două sau mai multe probe cu acelaşi pattern de benzi (analizate vizual) au fost incluse icircn acelaşi tip RAPD denumit cu litere majuscule sau cifre Probele care au diferit prin una sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite Tipurile RAPD care au diferit prin maxim o bandă majoră sau trei minore au fost considerate posibil icircnrudite Benzile au fost clasificate icircn majore dacă intensitatea lor a fost mai mare sau egală cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate moleculară 200-bp ladder (Promega Corp Madison WI USA) Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mică decacirct cea a fragmentului de 1000- bp 39 ANALIZA STATISTICĂ

Datele au fost centralizate icircn baze de date EXCEL şi SPSS 130 şi prelucrate testele ANOVA şi χ2 Am considerat ca semnificative valorile lui p lt 005

6

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

41 Tulpinile bacteriene 77 42 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor studiate 77 43 Performanţa detectării fenotipice a metalo-β-lactamazelor

84

44 Izolarea şi purificarea ADN bacterian 88 45 Genele pentru metalo-β-lactamaze 90 46 Confirmarea producerii de metalo-β-lactamaze 98 47 Suportul genetic al genelor pentru metalo-β-lactamaze

99

48 Relaţiile epidemiologice dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze

103

5 Discuţii 108 51 Sensibilitatea la antibiotice 108 52 Screening-ul fenotipic pentru producerea de metalo-β-lactamaze

113

53 Frecvenţa rezistenţei prin metalo-β-lactamaze 115 54 Caracteristicile integronilor de clasă 1 asociaţi genelor pentru metalo-β-lactamaze

121

55 Diseminarea genelor pentru metalo-β-lactamaze la tulpinile studiate

123

6 Concluzii generale Gradul de originalitate Perspective de cercetare

126

Bibliografie 128

Abrevieri AIM Australian imipenemase AK Amikacină AMA Acid mercaptoacetic ATM Aztreonam bla Gena ce codifică o β-lactamază BLSE β-lactamaze cu spectru extins bp Perechi de baze CAZ Ceftazidim CIP Ciprofloxacin CLSI Clinical Laboratory Standards Institute CMI Concentraţia Minimă Inhibitorie CT Colistin DIM Dutch imipenemase DO Doxiciclină EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ETP Ertapenem EUCAST European Comittee on Antimicrobial Susceptibility

Testing

FEP Cefepim FIM Florence imipenemase GIM German imipenemase GM Gentamicină IMP Imipenemase In Integron IPM Imipenem ISCR Insertion Sequence Common Region kb kilobaze KHM Kyorin Hospital metallo-β-lactamase LEV Levofloxacin MBL Metalo-β-lactamaze MEM Meropenem MLST Multilocus Sequence Typing NDM New Delhi metallo-β-lactamase Omp Proteină din membrana externă (outer membrane

protein) PCR Polymerase Chain Reaction PFGE Pulsed - Field Gel Electrophoresis PLP Proteine de Legare a Penicilinei

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA SAM Ampicilină-sulbactam SIM Seul imipenemase SPM Sao Paulo metallo-β-lactamase ST Sequence Type

SXT Trimetoprim-sulfametoxazol TE Tetraciclină TIC Ticarcilină TMB Tripoli metallo-β-lactamase

Cuvinte cheie metalo-β-lactamaze rezistenţa la carbapeneme Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter

baumannii tipare moleculară

MOTIVAŢIA SCOPUL ŞI OBIECTIVELE STUDIULUI

DOCTORAL

Tema aleasă pentru realizarea tezei de doctorat abordează un subiect de mare actualitate icircntrucacirct emergenţa bacteriilor rezistente şi multirezistente la antibiotice a devenit o problemă de sănătate publică icircngrijorătoare Răspacircndirea β-lactamazelor a distrus utilitatea benzilpenicilinei icircmpotriva stafilococilor a penicilinelor cu spectru larg şi a cefalosporinelor icircmpotriva bacteriilor Gram-negative Noi enzime şi noi moduri de producere a vechilor enzime ameninţă carbapenemele antibiotice de rezervă icircn prezent necesare pentru tratamentul infecţiilor severe noscomiale şi icircn unele ţări a infecţiilor comunitare cu bacili producători de β-lactamaze cu spectru extins şi cefalosporinaze AmpC Rezistenţa la această clasă de antibiotice creşte rapid cu limitarea opţiunilor terapeutice la substanţe vechi mai toxice (polimixine fosfomicină) (Hamouda et al 2011) Subiectul este cu atacirct mai important cu cacirct datele din literatura de specialitate sunt insuficiente pentru zona noastră Pseudomonas aeruginosa şi Acinetobacter baumannii sunt frecvenţi patogeni nosocomiali fiind implicaţi icircntr-o gamă largă de infecţii uneori dificil de controlat Metalo-β-lactamazele hidrolizează majoritatea beta-lactaminelor cunoscute (inclusiv carbapeneme şi inhibitori de β-lactamaze) conferind astfel bacteriei gazdă un profil larg de rezistenţă şi se asociază cu elemente genetice mobile (integroni sau plasmide) care promovează transmiterea lor rapidă Prima MBL transferabilă a fost descoperită icircn Japonia spre sfacircrşitul anilor 80 la tulpini de P aeruginosa multirezistente la antibiotice Icircn ultimii 20 de ani au fost descrise peste 10 tipuri de MBL care au diseminat rapid printre tulpini de Pseudomonas spp Acinetobacter spp şi de Enterobacteriaceae Avacircnd icircn vedere că pe plan european există programe de supraveghere a rezistenţei la antibiotice prin producerea de MBL ne-am propus cunoaşterea realităţii la momentul de faţă

1

icircn ceea ce priveşte profilul de sensibilitate la antibiotice şi determinarea frecvenţei MBL la tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn spitale din Nord-Estul Romacircniei Necesitatea majoră a utilizării unor metode specifice de diagnosticare şi identificare a bacteriilor implicate icircn patologie ne-a motivat să comparăm diferite metode de detectare a MBL cu scopul de a evidenţia eficacitatea rapiditatea şi specificitatea fiecăreia dintre acestea Utilizarea metodelor moleculare a completat evaluarea fenotipică a izolatelor şi a avut o importanţă majoră icircn caracterizarea tulpinilor rezistente care pun probleme de terapie şi de răspacircndire icircn mediul de spital Rezultatele studiului ar putea completa baza de date de la nivel naţional sau european icircn ceea ce priveşte rezistenţa la antibiotice prin producerea de MBL Stabilirea unui protocol de depistare a tulpinilor producătoare de MBL are importanţă majoră atacirct icircn stabilirea ghidurilor terapeutice cacirct şi icircn recunoaşterea promptă a unei izbucniri epidemice de infecţii nosocomiale şi luarea măsurilor de control al infecţiei Realizarea acestui studiu a fost posibilă cu ajutorul grantului intern de cercetare nr 1707830092010 finanţat de UMF ldquoGrigore T Popardquo Iaşi a unei burse de cercetare oferite de Federaţia Europeană a Societăţilor de Microbiologie (FEMS) icircn 2007 şi a grantului CNCSIS ID-25432009 Obiective 1 Investigarea profilului de sensibilitate la antibiotice la tulpini de P aeruginosa izolate icircn spitale universitare din Iaşi 2 Optimizarea unor metode de detectarea a producerii de MBL la tulpini de Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Enterobacteriaceae rezistente la imipenem 3 Identificarea naturii MBL şi investigarea suportului lor genetic 4 Investigarea mecanismelor de răspacircndire a genelor de rezistenţă (expansiune clonală versus transfer orizontal)

2

PARTEA PERSONALĂ Cuprinde capitolele 3 4 şi 5 respectiv Material şi Metode Rezultate şi Discuţii

3 MATERIAL ŞI METODE

31 SELECŢIA TULPINILOR BACTERIENE

Au fost incluse icircn studiu tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn perioada 2004-2012 icircn laboratoarele unor spitale din Iaşi Bacău şi Galaţi Criterii de includere au fost caracter morfo-tinctorial de bacil Gram-negativ şi certitudinea semnificaţiei clinice a izolatului icircn funcţie de produsul patologic Identificarea bacteriilor a fost realizată pe baza caracterelor microscopice de cultură şi biochimice Caracterele biochimice le-am determinat cu ajutorul sistemelor multitest TSI (Triple Sugar Iron) asociat cu MIU (Mobilitate Indol Urează) şi cu Simmons (citrat) şi al celor microtest galeriile API 20E şi API 20NE (bioMerieux Marcy lrsquoEtoile Franţa) 32 TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA ANTIBIOTICE

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor bacteriene incluse icircn studiu a fost testată prin metoda difuzimetrică la următoarele antibiotice (Oxoid Basingstoke Marea Britanie) ampicilină amoxicilină+acid clavulanic ampicilină +sulbactam ceftazidim cefepim piperacilină+tazobactam aztreonam imipenem meropenem ciprofloxacin levofloxacin trimetoprim-sulfametoxazol tetraciclină doxiciclină gentamicină amikacină tobramicină şi colistin icircn funcţie de identitatea bacteriei Prin metoda microdiluţiilor icircn bulion am determinat concentraţia minimă inhibitorie pentru ceftazidim şi imipenem Interpretarea rezultatelor am efectuat-o pe baza normelor CLSI (Clinical Laboratory and Standards Institute) 2004 - 2010 Controlul de calitate a fost asigurat cu tulpinile

3

de referinţă Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 şi Escherichia coli ATCC 25922 Pentru clasificarea tulpinilor icircn multirezistente MDR (multidrug-resistant) extensiv rezistente XDR (extensively

drug-resistant) şi panrezistente PDR (pandrug-resistant) am folosit recomandările recente propuse de un grup de experţi internaţionali (Magiorakos et al 2012) 33 METODE FENOTIPICE DE SCREENING PENTRU PRODUCEREA DE METALO-β-LACTAMAZE

Testarea fenotipică pentru detectarea producerii de MBL a fost efectuată prin cinci metode descrise anterior 331 Metoda dublului disc ceftazidimimipenem ndash acid mercaptoacetic CuCl2 FeCl3 (Arakawa et al 2000) 332 Metoda discului combinat imipenem-EDTA (Yong et al 2002) 333 Testul Hodge modificat (Lee et al 2003) 334 Etest MBL (Walsh et al 2002) 335 Testul microdiluţiilor EPI (EDTA-phenanthroline-

imipenem) (Migliavacca et al 2002) 34 IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN BACTERIAN

Pentru extracţia ADN bacterian am folosit patru metode 341 liza termică a celulelor bacteriene (fierberea) 342 liza chimică a celulelor bacteriene (Wilson 2001) 343 extracţia prin legare pe coloane cu membrană de silica cu ajutorul kit-ului comercial GenElute Bacterial

Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich St Louis MO SUA) 344 Extracţia automată cu aparatul Maxwellreg16 AS2000 (Promega Corp Madison WI SUA)

4

35 DETECTAREA PRIN PCR A GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Pentru detectarea genelor de tip blaVIM şi blaIMP am efectuat un multiplex PCR cu următorii primeri IMP-DIA-FWD (5rsquo-GGAATAGAGTGGCTTAATTCT-3rsquo) IMP-DIA-REV (5rsquo-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3rsquo) VIM-DIA-FWD (5rsquo-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3rsquo) VIM-DIA-REV (5rsquo-AGGTGGGCCATTCAGCCAGA-3rsquo) (Eurogentec Liegravege Belgia) care generează ampliconi de 361 bp pentru blaIMP şi 523 bp pentru blaVIM după o metodă descrisă anterior (Docquier et al 2003) Amplificarea genei de tip blaNDM-1 am realizat-o cu ajutorul primerilor NDM-Fm (5- GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC-3) şi NDM-Rm (5- CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC -3) (Eurogentec Liegravege Belgia) care flanchează un fragment intern al genei de 621 bp şi conform protocolului propus de Nordmann et al (Nordmann et al 2011a) Produşii PCR au fost separaţi prin electroforeză icircn gel de agaroză 2 36 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Am testat acţiunea de hidroliză a unei soluţii de IPM 150 microM de către extractul bacterian al tulpinilor pozitive pentru gene blaVIM şi blaIMP după o metodă descrisă anterior (Gutieacuterrez et al 2007) Ulterior am urmărit inhibiţia activităţii carbapenemazice prin EDTA pentru a confirma prezenţa unei MBL Am calculat activitatea enzimatică specifică (nmolimin mg proteină) 37 INVESTIGAREA SUPORTULUI GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Suportul genetic al blaVIM şi blaIMP l-am investigat cu primeri pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 5rsquoCS şi 3rsquoCS icircn combinaţie cu primerii IMP DIA FWD IMP

5

DIA REV VIM DIA FWD VIM DIA REV conform unei metode descrise anterior (Docquier et al 2003) O parte din ampliconii purificaţi (Wizard PCR Purification Kit Promega

Corp Madison WI SUA) au fost trimişi pentru secvenţiere la Macrogen Inc (Amsterdam Olanda) restul fiind secvenţiaţi icircn Laboratorul de Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie din cadrul Universităţii Al I Cuza Iaşi Identitatea MBL a fost stabilită prin compararea cu baza de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (httpwwwncbinlmnihgov) 38 METODE DE TIPARE MOLECULARĂ

Metodele de tipare utilizate au fost PFGE şi RAPD Tiparea prin RAPD a fost realizată pentru tulpinile de P

aeruginosa cu primerii 272PSE şi 208PSE (Campbell et al 2000) şi cu primerul ERIC2 (Versalovic et al 1991) conform protocoalelor descrise anterior iar pentru tulpinile de A baumannii cu primerul 1254 după metoda lui Akopyanz (Akopyanz et al 1992) Două sau mai multe probe cu acelaşi pattern de benzi (analizate vizual) au fost incluse icircn acelaşi tip RAPD denumit cu litere majuscule sau cifre Probele care au diferit prin una sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite Tipurile RAPD care au diferit prin maxim o bandă majoră sau trei minore au fost considerate posibil icircnrudite Benzile au fost clasificate icircn majore dacă intensitatea lor a fost mai mare sau egală cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate moleculară 200-bp ladder (Promega Corp Madison WI USA) Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mică decacirct cea a fragmentului de 1000- bp 39 ANALIZA STATISTICĂ

Datele au fost centralizate icircn baze de date EXCEL şi SPSS 130 şi prelucrate testele ANOVA şi χ2 Am considerat ca semnificative valorile lui p lt 005

6

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

Abrevieri AIM Australian imipenemase AK Amikacină AMA Acid mercaptoacetic ATM Aztreonam bla Gena ce codifică o β-lactamază BLSE β-lactamaze cu spectru extins bp Perechi de baze CAZ Ceftazidim CIP Ciprofloxacin CLSI Clinical Laboratory Standards Institute CMI Concentraţia Minimă Inhibitorie CT Colistin DIM Dutch imipenemase DO Doxiciclină EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ETP Ertapenem EUCAST European Comittee on Antimicrobial Susceptibility

Testing

FEP Cefepim FIM Florence imipenemase GIM German imipenemase GM Gentamicină IMP Imipenemase In Integron IPM Imipenem ISCR Insertion Sequence Common Region kb kilobaze KHM Kyorin Hospital metallo-β-lactamase LEV Levofloxacin MBL Metalo-β-lactamaze MEM Meropenem MLST Multilocus Sequence Typing NDM New Delhi metallo-β-lactamase Omp Proteină din membrana externă (outer membrane

protein) PCR Polymerase Chain Reaction PFGE Pulsed - Field Gel Electrophoresis PLP Proteine de Legare a Penicilinei

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA SAM Ampicilină-sulbactam SIM Seul imipenemase SPM Sao Paulo metallo-β-lactamase ST Sequence Type

SXT Trimetoprim-sulfametoxazol TE Tetraciclină TIC Ticarcilină TMB Tripoli metallo-β-lactamase

Cuvinte cheie metalo-β-lactamaze rezistenţa la carbapeneme Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter

baumannii tipare moleculară

MOTIVAŢIA SCOPUL ŞI OBIECTIVELE STUDIULUI

DOCTORAL

Tema aleasă pentru realizarea tezei de doctorat abordează un subiect de mare actualitate icircntrucacirct emergenţa bacteriilor rezistente şi multirezistente la antibiotice a devenit o problemă de sănătate publică icircngrijorătoare Răspacircndirea β-lactamazelor a distrus utilitatea benzilpenicilinei icircmpotriva stafilococilor a penicilinelor cu spectru larg şi a cefalosporinelor icircmpotriva bacteriilor Gram-negative Noi enzime şi noi moduri de producere a vechilor enzime ameninţă carbapenemele antibiotice de rezervă icircn prezent necesare pentru tratamentul infecţiilor severe noscomiale şi icircn unele ţări a infecţiilor comunitare cu bacili producători de β-lactamaze cu spectru extins şi cefalosporinaze AmpC Rezistenţa la această clasă de antibiotice creşte rapid cu limitarea opţiunilor terapeutice la substanţe vechi mai toxice (polimixine fosfomicină) (Hamouda et al 2011) Subiectul este cu atacirct mai important cu cacirct datele din literatura de specialitate sunt insuficiente pentru zona noastră Pseudomonas aeruginosa şi Acinetobacter baumannii sunt frecvenţi patogeni nosocomiali fiind implicaţi icircntr-o gamă largă de infecţii uneori dificil de controlat Metalo-β-lactamazele hidrolizează majoritatea beta-lactaminelor cunoscute (inclusiv carbapeneme şi inhibitori de β-lactamaze) conferind astfel bacteriei gazdă un profil larg de rezistenţă şi se asociază cu elemente genetice mobile (integroni sau plasmide) care promovează transmiterea lor rapidă Prima MBL transferabilă a fost descoperită icircn Japonia spre sfacircrşitul anilor 80 la tulpini de P aeruginosa multirezistente la antibiotice Icircn ultimii 20 de ani au fost descrise peste 10 tipuri de MBL care au diseminat rapid printre tulpini de Pseudomonas spp Acinetobacter spp şi de Enterobacteriaceae Avacircnd icircn vedere că pe plan european există programe de supraveghere a rezistenţei la antibiotice prin producerea de MBL ne-am propus cunoaşterea realităţii la momentul de faţă

1

icircn ceea ce priveşte profilul de sensibilitate la antibiotice şi determinarea frecvenţei MBL la tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn spitale din Nord-Estul Romacircniei Necesitatea majoră a utilizării unor metode specifice de diagnosticare şi identificare a bacteriilor implicate icircn patologie ne-a motivat să comparăm diferite metode de detectare a MBL cu scopul de a evidenţia eficacitatea rapiditatea şi specificitatea fiecăreia dintre acestea Utilizarea metodelor moleculare a completat evaluarea fenotipică a izolatelor şi a avut o importanţă majoră icircn caracterizarea tulpinilor rezistente care pun probleme de terapie şi de răspacircndire icircn mediul de spital Rezultatele studiului ar putea completa baza de date de la nivel naţional sau european icircn ceea ce priveşte rezistenţa la antibiotice prin producerea de MBL Stabilirea unui protocol de depistare a tulpinilor producătoare de MBL are importanţă majoră atacirct icircn stabilirea ghidurilor terapeutice cacirct şi icircn recunoaşterea promptă a unei izbucniri epidemice de infecţii nosocomiale şi luarea măsurilor de control al infecţiei Realizarea acestui studiu a fost posibilă cu ajutorul grantului intern de cercetare nr 1707830092010 finanţat de UMF ldquoGrigore T Popardquo Iaşi a unei burse de cercetare oferite de Federaţia Europeană a Societăţilor de Microbiologie (FEMS) icircn 2007 şi a grantului CNCSIS ID-25432009 Obiective 1 Investigarea profilului de sensibilitate la antibiotice la tulpini de P aeruginosa izolate icircn spitale universitare din Iaşi 2 Optimizarea unor metode de detectarea a producerii de MBL la tulpini de Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Enterobacteriaceae rezistente la imipenem 3 Identificarea naturii MBL şi investigarea suportului lor genetic 4 Investigarea mecanismelor de răspacircndire a genelor de rezistenţă (expansiune clonală versus transfer orizontal)

2

PARTEA PERSONALĂ Cuprinde capitolele 3 4 şi 5 respectiv Material şi Metode Rezultate şi Discuţii

3 MATERIAL ŞI METODE

31 SELECŢIA TULPINILOR BACTERIENE

Au fost incluse icircn studiu tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn perioada 2004-2012 icircn laboratoarele unor spitale din Iaşi Bacău şi Galaţi Criterii de includere au fost caracter morfo-tinctorial de bacil Gram-negativ şi certitudinea semnificaţiei clinice a izolatului icircn funcţie de produsul patologic Identificarea bacteriilor a fost realizată pe baza caracterelor microscopice de cultură şi biochimice Caracterele biochimice le-am determinat cu ajutorul sistemelor multitest TSI (Triple Sugar Iron) asociat cu MIU (Mobilitate Indol Urează) şi cu Simmons (citrat) şi al celor microtest galeriile API 20E şi API 20NE (bioMerieux Marcy lrsquoEtoile Franţa) 32 TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA ANTIBIOTICE

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor bacteriene incluse icircn studiu a fost testată prin metoda difuzimetrică la următoarele antibiotice (Oxoid Basingstoke Marea Britanie) ampicilină amoxicilină+acid clavulanic ampicilină +sulbactam ceftazidim cefepim piperacilină+tazobactam aztreonam imipenem meropenem ciprofloxacin levofloxacin trimetoprim-sulfametoxazol tetraciclină doxiciclină gentamicină amikacină tobramicină şi colistin icircn funcţie de identitatea bacteriei Prin metoda microdiluţiilor icircn bulion am determinat concentraţia minimă inhibitorie pentru ceftazidim şi imipenem Interpretarea rezultatelor am efectuat-o pe baza normelor CLSI (Clinical Laboratory and Standards Institute) 2004 - 2010 Controlul de calitate a fost asigurat cu tulpinile

3

de referinţă Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 şi Escherichia coli ATCC 25922 Pentru clasificarea tulpinilor icircn multirezistente MDR (multidrug-resistant) extensiv rezistente XDR (extensively

drug-resistant) şi panrezistente PDR (pandrug-resistant) am folosit recomandările recente propuse de un grup de experţi internaţionali (Magiorakos et al 2012) 33 METODE FENOTIPICE DE SCREENING PENTRU PRODUCEREA DE METALO-β-LACTAMAZE

Testarea fenotipică pentru detectarea producerii de MBL a fost efectuată prin cinci metode descrise anterior 331 Metoda dublului disc ceftazidimimipenem ndash acid mercaptoacetic CuCl2 FeCl3 (Arakawa et al 2000) 332 Metoda discului combinat imipenem-EDTA (Yong et al 2002) 333 Testul Hodge modificat (Lee et al 2003) 334 Etest MBL (Walsh et al 2002) 335 Testul microdiluţiilor EPI (EDTA-phenanthroline-

imipenem) (Migliavacca et al 2002) 34 IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN BACTERIAN

Pentru extracţia ADN bacterian am folosit patru metode 341 liza termică a celulelor bacteriene (fierberea) 342 liza chimică a celulelor bacteriene (Wilson 2001) 343 extracţia prin legare pe coloane cu membrană de silica cu ajutorul kit-ului comercial GenElute Bacterial

Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich St Louis MO SUA) 344 Extracţia automată cu aparatul Maxwellreg16 AS2000 (Promega Corp Madison WI SUA)

4

35 DETECTAREA PRIN PCR A GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Pentru detectarea genelor de tip blaVIM şi blaIMP am efectuat un multiplex PCR cu următorii primeri IMP-DIA-FWD (5rsquo-GGAATAGAGTGGCTTAATTCT-3rsquo) IMP-DIA-REV (5rsquo-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3rsquo) VIM-DIA-FWD (5rsquo-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3rsquo) VIM-DIA-REV (5rsquo-AGGTGGGCCATTCAGCCAGA-3rsquo) (Eurogentec Liegravege Belgia) care generează ampliconi de 361 bp pentru blaIMP şi 523 bp pentru blaVIM după o metodă descrisă anterior (Docquier et al 2003) Amplificarea genei de tip blaNDM-1 am realizat-o cu ajutorul primerilor NDM-Fm (5- GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC-3) şi NDM-Rm (5- CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC -3) (Eurogentec Liegravege Belgia) care flanchează un fragment intern al genei de 621 bp şi conform protocolului propus de Nordmann et al (Nordmann et al 2011a) Produşii PCR au fost separaţi prin electroforeză icircn gel de agaroză 2 36 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Am testat acţiunea de hidroliză a unei soluţii de IPM 150 microM de către extractul bacterian al tulpinilor pozitive pentru gene blaVIM şi blaIMP după o metodă descrisă anterior (Gutieacuterrez et al 2007) Ulterior am urmărit inhibiţia activităţii carbapenemazice prin EDTA pentru a confirma prezenţa unei MBL Am calculat activitatea enzimatică specifică (nmolimin mg proteină) 37 INVESTIGAREA SUPORTULUI GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Suportul genetic al blaVIM şi blaIMP l-am investigat cu primeri pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 5rsquoCS şi 3rsquoCS icircn combinaţie cu primerii IMP DIA FWD IMP

5

DIA REV VIM DIA FWD VIM DIA REV conform unei metode descrise anterior (Docquier et al 2003) O parte din ampliconii purificaţi (Wizard PCR Purification Kit Promega

Corp Madison WI SUA) au fost trimişi pentru secvenţiere la Macrogen Inc (Amsterdam Olanda) restul fiind secvenţiaţi icircn Laboratorul de Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie din cadrul Universităţii Al I Cuza Iaşi Identitatea MBL a fost stabilită prin compararea cu baza de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (httpwwwncbinlmnihgov) 38 METODE DE TIPARE MOLECULARĂ

Metodele de tipare utilizate au fost PFGE şi RAPD Tiparea prin RAPD a fost realizată pentru tulpinile de P

aeruginosa cu primerii 272PSE şi 208PSE (Campbell et al 2000) şi cu primerul ERIC2 (Versalovic et al 1991) conform protocoalelor descrise anterior iar pentru tulpinile de A baumannii cu primerul 1254 după metoda lui Akopyanz (Akopyanz et al 1992) Două sau mai multe probe cu acelaşi pattern de benzi (analizate vizual) au fost incluse icircn acelaşi tip RAPD denumit cu litere majuscule sau cifre Probele care au diferit prin una sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite Tipurile RAPD care au diferit prin maxim o bandă majoră sau trei minore au fost considerate posibil icircnrudite Benzile au fost clasificate icircn majore dacă intensitatea lor a fost mai mare sau egală cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate moleculară 200-bp ladder (Promega Corp Madison WI USA) Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mică decacirct cea a fragmentului de 1000- bp 39 ANALIZA STATISTICĂ

Datele au fost centralizate icircn baze de date EXCEL şi SPSS 130 şi prelucrate testele ANOVA şi χ2 Am considerat ca semnificative valorile lui p lt 005

6

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA SAM Ampicilină-sulbactam SIM Seul imipenemase SPM Sao Paulo metallo-β-lactamase ST Sequence Type

SXT Trimetoprim-sulfametoxazol TE Tetraciclină TIC Ticarcilină TMB Tripoli metallo-β-lactamase

Cuvinte cheie metalo-β-lactamaze rezistenţa la carbapeneme Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter

baumannii tipare moleculară

MOTIVAŢIA SCOPUL ŞI OBIECTIVELE STUDIULUI

DOCTORAL

Tema aleasă pentru realizarea tezei de doctorat abordează un subiect de mare actualitate icircntrucacirct emergenţa bacteriilor rezistente şi multirezistente la antibiotice a devenit o problemă de sănătate publică icircngrijorătoare Răspacircndirea β-lactamazelor a distrus utilitatea benzilpenicilinei icircmpotriva stafilococilor a penicilinelor cu spectru larg şi a cefalosporinelor icircmpotriva bacteriilor Gram-negative Noi enzime şi noi moduri de producere a vechilor enzime ameninţă carbapenemele antibiotice de rezervă icircn prezent necesare pentru tratamentul infecţiilor severe noscomiale şi icircn unele ţări a infecţiilor comunitare cu bacili producători de β-lactamaze cu spectru extins şi cefalosporinaze AmpC Rezistenţa la această clasă de antibiotice creşte rapid cu limitarea opţiunilor terapeutice la substanţe vechi mai toxice (polimixine fosfomicină) (Hamouda et al 2011) Subiectul este cu atacirct mai important cu cacirct datele din literatura de specialitate sunt insuficiente pentru zona noastră Pseudomonas aeruginosa şi Acinetobacter baumannii sunt frecvenţi patogeni nosocomiali fiind implicaţi icircntr-o gamă largă de infecţii uneori dificil de controlat Metalo-β-lactamazele hidrolizează majoritatea beta-lactaminelor cunoscute (inclusiv carbapeneme şi inhibitori de β-lactamaze) conferind astfel bacteriei gazdă un profil larg de rezistenţă şi se asociază cu elemente genetice mobile (integroni sau plasmide) care promovează transmiterea lor rapidă Prima MBL transferabilă a fost descoperită icircn Japonia spre sfacircrşitul anilor 80 la tulpini de P aeruginosa multirezistente la antibiotice Icircn ultimii 20 de ani au fost descrise peste 10 tipuri de MBL care au diseminat rapid printre tulpini de Pseudomonas spp Acinetobacter spp şi de Enterobacteriaceae Avacircnd icircn vedere că pe plan european există programe de supraveghere a rezistenţei la antibiotice prin producerea de MBL ne-am propus cunoaşterea realităţii la momentul de faţă

1

icircn ceea ce priveşte profilul de sensibilitate la antibiotice şi determinarea frecvenţei MBL la tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn spitale din Nord-Estul Romacircniei Necesitatea majoră a utilizării unor metode specifice de diagnosticare şi identificare a bacteriilor implicate icircn patologie ne-a motivat să comparăm diferite metode de detectare a MBL cu scopul de a evidenţia eficacitatea rapiditatea şi specificitatea fiecăreia dintre acestea Utilizarea metodelor moleculare a completat evaluarea fenotipică a izolatelor şi a avut o importanţă majoră icircn caracterizarea tulpinilor rezistente care pun probleme de terapie şi de răspacircndire icircn mediul de spital Rezultatele studiului ar putea completa baza de date de la nivel naţional sau european icircn ceea ce priveşte rezistenţa la antibiotice prin producerea de MBL Stabilirea unui protocol de depistare a tulpinilor producătoare de MBL are importanţă majoră atacirct icircn stabilirea ghidurilor terapeutice cacirct şi icircn recunoaşterea promptă a unei izbucniri epidemice de infecţii nosocomiale şi luarea măsurilor de control al infecţiei Realizarea acestui studiu a fost posibilă cu ajutorul grantului intern de cercetare nr 1707830092010 finanţat de UMF ldquoGrigore T Popardquo Iaşi a unei burse de cercetare oferite de Federaţia Europeană a Societăţilor de Microbiologie (FEMS) icircn 2007 şi a grantului CNCSIS ID-25432009 Obiective 1 Investigarea profilului de sensibilitate la antibiotice la tulpini de P aeruginosa izolate icircn spitale universitare din Iaşi 2 Optimizarea unor metode de detectarea a producerii de MBL la tulpini de Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Enterobacteriaceae rezistente la imipenem 3 Identificarea naturii MBL şi investigarea suportului lor genetic 4 Investigarea mecanismelor de răspacircndire a genelor de rezistenţă (expansiune clonală versus transfer orizontal)

2

PARTEA PERSONALĂ Cuprinde capitolele 3 4 şi 5 respectiv Material şi Metode Rezultate şi Discuţii

3 MATERIAL ŞI METODE

31 SELECŢIA TULPINILOR BACTERIENE

Au fost incluse icircn studiu tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn perioada 2004-2012 icircn laboratoarele unor spitale din Iaşi Bacău şi Galaţi Criterii de includere au fost caracter morfo-tinctorial de bacil Gram-negativ şi certitudinea semnificaţiei clinice a izolatului icircn funcţie de produsul patologic Identificarea bacteriilor a fost realizată pe baza caracterelor microscopice de cultură şi biochimice Caracterele biochimice le-am determinat cu ajutorul sistemelor multitest TSI (Triple Sugar Iron) asociat cu MIU (Mobilitate Indol Urează) şi cu Simmons (citrat) şi al celor microtest galeriile API 20E şi API 20NE (bioMerieux Marcy lrsquoEtoile Franţa) 32 TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA ANTIBIOTICE

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor bacteriene incluse icircn studiu a fost testată prin metoda difuzimetrică la următoarele antibiotice (Oxoid Basingstoke Marea Britanie) ampicilină amoxicilină+acid clavulanic ampicilină +sulbactam ceftazidim cefepim piperacilină+tazobactam aztreonam imipenem meropenem ciprofloxacin levofloxacin trimetoprim-sulfametoxazol tetraciclină doxiciclină gentamicină amikacină tobramicină şi colistin icircn funcţie de identitatea bacteriei Prin metoda microdiluţiilor icircn bulion am determinat concentraţia minimă inhibitorie pentru ceftazidim şi imipenem Interpretarea rezultatelor am efectuat-o pe baza normelor CLSI (Clinical Laboratory and Standards Institute) 2004 - 2010 Controlul de calitate a fost asigurat cu tulpinile

3

de referinţă Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 şi Escherichia coli ATCC 25922 Pentru clasificarea tulpinilor icircn multirezistente MDR (multidrug-resistant) extensiv rezistente XDR (extensively

drug-resistant) şi panrezistente PDR (pandrug-resistant) am folosit recomandările recente propuse de un grup de experţi internaţionali (Magiorakos et al 2012) 33 METODE FENOTIPICE DE SCREENING PENTRU PRODUCEREA DE METALO-β-LACTAMAZE

Testarea fenotipică pentru detectarea producerii de MBL a fost efectuată prin cinci metode descrise anterior 331 Metoda dublului disc ceftazidimimipenem ndash acid mercaptoacetic CuCl2 FeCl3 (Arakawa et al 2000) 332 Metoda discului combinat imipenem-EDTA (Yong et al 2002) 333 Testul Hodge modificat (Lee et al 2003) 334 Etest MBL (Walsh et al 2002) 335 Testul microdiluţiilor EPI (EDTA-phenanthroline-

imipenem) (Migliavacca et al 2002) 34 IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN BACTERIAN

Pentru extracţia ADN bacterian am folosit patru metode 341 liza termică a celulelor bacteriene (fierberea) 342 liza chimică a celulelor bacteriene (Wilson 2001) 343 extracţia prin legare pe coloane cu membrană de silica cu ajutorul kit-ului comercial GenElute Bacterial

Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich St Louis MO SUA) 344 Extracţia automată cu aparatul Maxwellreg16 AS2000 (Promega Corp Madison WI SUA)

4

35 DETECTAREA PRIN PCR A GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Pentru detectarea genelor de tip blaVIM şi blaIMP am efectuat un multiplex PCR cu următorii primeri IMP-DIA-FWD (5rsquo-GGAATAGAGTGGCTTAATTCT-3rsquo) IMP-DIA-REV (5rsquo-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3rsquo) VIM-DIA-FWD (5rsquo-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3rsquo) VIM-DIA-REV (5rsquo-AGGTGGGCCATTCAGCCAGA-3rsquo) (Eurogentec Liegravege Belgia) care generează ampliconi de 361 bp pentru blaIMP şi 523 bp pentru blaVIM după o metodă descrisă anterior (Docquier et al 2003) Amplificarea genei de tip blaNDM-1 am realizat-o cu ajutorul primerilor NDM-Fm (5- GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC-3) şi NDM-Rm (5- CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC -3) (Eurogentec Liegravege Belgia) care flanchează un fragment intern al genei de 621 bp şi conform protocolului propus de Nordmann et al (Nordmann et al 2011a) Produşii PCR au fost separaţi prin electroforeză icircn gel de agaroză 2 36 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Am testat acţiunea de hidroliză a unei soluţii de IPM 150 microM de către extractul bacterian al tulpinilor pozitive pentru gene blaVIM şi blaIMP după o metodă descrisă anterior (Gutieacuterrez et al 2007) Ulterior am urmărit inhibiţia activităţii carbapenemazice prin EDTA pentru a confirma prezenţa unei MBL Am calculat activitatea enzimatică specifică (nmolimin mg proteină) 37 INVESTIGAREA SUPORTULUI GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Suportul genetic al blaVIM şi blaIMP l-am investigat cu primeri pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 5rsquoCS şi 3rsquoCS icircn combinaţie cu primerii IMP DIA FWD IMP

5

DIA REV VIM DIA FWD VIM DIA REV conform unei metode descrise anterior (Docquier et al 2003) O parte din ampliconii purificaţi (Wizard PCR Purification Kit Promega

Corp Madison WI SUA) au fost trimişi pentru secvenţiere la Macrogen Inc (Amsterdam Olanda) restul fiind secvenţiaţi icircn Laboratorul de Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie din cadrul Universităţii Al I Cuza Iaşi Identitatea MBL a fost stabilită prin compararea cu baza de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (httpwwwncbinlmnihgov) 38 METODE DE TIPARE MOLECULARĂ

Metodele de tipare utilizate au fost PFGE şi RAPD Tiparea prin RAPD a fost realizată pentru tulpinile de P

aeruginosa cu primerii 272PSE şi 208PSE (Campbell et al 2000) şi cu primerul ERIC2 (Versalovic et al 1991) conform protocoalelor descrise anterior iar pentru tulpinile de A baumannii cu primerul 1254 după metoda lui Akopyanz (Akopyanz et al 1992) Două sau mai multe probe cu acelaşi pattern de benzi (analizate vizual) au fost incluse icircn acelaşi tip RAPD denumit cu litere majuscule sau cifre Probele care au diferit prin una sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite Tipurile RAPD care au diferit prin maxim o bandă majoră sau trei minore au fost considerate posibil icircnrudite Benzile au fost clasificate icircn majore dacă intensitatea lor a fost mai mare sau egală cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate moleculară 200-bp ladder (Promega Corp Madison WI USA) Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mică decacirct cea a fragmentului de 1000- bp 39 ANALIZA STATISTICĂ

Datele au fost centralizate icircn baze de date EXCEL şi SPSS 130 şi prelucrate testele ANOVA şi χ2 Am considerat ca semnificative valorile lui p lt 005

6

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

MOTIVAŢIA SCOPUL ŞI OBIECTIVELE STUDIULUI

DOCTORAL

Tema aleasă pentru realizarea tezei de doctorat abordează un subiect de mare actualitate icircntrucacirct emergenţa bacteriilor rezistente şi multirezistente la antibiotice a devenit o problemă de sănătate publică icircngrijorătoare Răspacircndirea β-lactamazelor a distrus utilitatea benzilpenicilinei icircmpotriva stafilococilor a penicilinelor cu spectru larg şi a cefalosporinelor icircmpotriva bacteriilor Gram-negative Noi enzime şi noi moduri de producere a vechilor enzime ameninţă carbapenemele antibiotice de rezervă icircn prezent necesare pentru tratamentul infecţiilor severe noscomiale şi icircn unele ţări a infecţiilor comunitare cu bacili producători de β-lactamaze cu spectru extins şi cefalosporinaze AmpC Rezistenţa la această clasă de antibiotice creşte rapid cu limitarea opţiunilor terapeutice la substanţe vechi mai toxice (polimixine fosfomicină) (Hamouda et al 2011) Subiectul este cu atacirct mai important cu cacirct datele din literatura de specialitate sunt insuficiente pentru zona noastră Pseudomonas aeruginosa şi Acinetobacter baumannii sunt frecvenţi patogeni nosocomiali fiind implicaţi icircntr-o gamă largă de infecţii uneori dificil de controlat Metalo-β-lactamazele hidrolizează majoritatea beta-lactaminelor cunoscute (inclusiv carbapeneme şi inhibitori de β-lactamaze) conferind astfel bacteriei gazdă un profil larg de rezistenţă şi se asociază cu elemente genetice mobile (integroni sau plasmide) care promovează transmiterea lor rapidă Prima MBL transferabilă a fost descoperită icircn Japonia spre sfacircrşitul anilor 80 la tulpini de P aeruginosa multirezistente la antibiotice Icircn ultimii 20 de ani au fost descrise peste 10 tipuri de MBL care au diseminat rapid printre tulpini de Pseudomonas spp Acinetobacter spp şi de Enterobacteriaceae Avacircnd icircn vedere că pe plan european există programe de supraveghere a rezistenţei la antibiotice prin producerea de MBL ne-am propus cunoaşterea realităţii la momentul de faţă

1

icircn ceea ce priveşte profilul de sensibilitate la antibiotice şi determinarea frecvenţei MBL la tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn spitale din Nord-Estul Romacircniei Necesitatea majoră a utilizării unor metode specifice de diagnosticare şi identificare a bacteriilor implicate icircn patologie ne-a motivat să comparăm diferite metode de detectare a MBL cu scopul de a evidenţia eficacitatea rapiditatea şi specificitatea fiecăreia dintre acestea Utilizarea metodelor moleculare a completat evaluarea fenotipică a izolatelor şi a avut o importanţă majoră icircn caracterizarea tulpinilor rezistente care pun probleme de terapie şi de răspacircndire icircn mediul de spital Rezultatele studiului ar putea completa baza de date de la nivel naţional sau european icircn ceea ce priveşte rezistenţa la antibiotice prin producerea de MBL Stabilirea unui protocol de depistare a tulpinilor producătoare de MBL are importanţă majoră atacirct icircn stabilirea ghidurilor terapeutice cacirct şi icircn recunoaşterea promptă a unei izbucniri epidemice de infecţii nosocomiale şi luarea măsurilor de control al infecţiei Realizarea acestui studiu a fost posibilă cu ajutorul grantului intern de cercetare nr 1707830092010 finanţat de UMF ldquoGrigore T Popardquo Iaşi a unei burse de cercetare oferite de Federaţia Europeană a Societăţilor de Microbiologie (FEMS) icircn 2007 şi a grantului CNCSIS ID-25432009 Obiective 1 Investigarea profilului de sensibilitate la antibiotice la tulpini de P aeruginosa izolate icircn spitale universitare din Iaşi 2 Optimizarea unor metode de detectarea a producerii de MBL la tulpini de Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Enterobacteriaceae rezistente la imipenem 3 Identificarea naturii MBL şi investigarea suportului lor genetic 4 Investigarea mecanismelor de răspacircndire a genelor de rezistenţă (expansiune clonală versus transfer orizontal)

2

PARTEA PERSONALĂ Cuprinde capitolele 3 4 şi 5 respectiv Material şi Metode Rezultate şi Discuţii

3 MATERIAL ŞI METODE

31 SELECŢIA TULPINILOR BACTERIENE

Au fost incluse icircn studiu tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn perioada 2004-2012 icircn laboratoarele unor spitale din Iaşi Bacău şi Galaţi Criterii de includere au fost caracter morfo-tinctorial de bacil Gram-negativ şi certitudinea semnificaţiei clinice a izolatului icircn funcţie de produsul patologic Identificarea bacteriilor a fost realizată pe baza caracterelor microscopice de cultură şi biochimice Caracterele biochimice le-am determinat cu ajutorul sistemelor multitest TSI (Triple Sugar Iron) asociat cu MIU (Mobilitate Indol Urează) şi cu Simmons (citrat) şi al celor microtest galeriile API 20E şi API 20NE (bioMerieux Marcy lrsquoEtoile Franţa) 32 TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA ANTIBIOTICE

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor bacteriene incluse icircn studiu a fost testată prin metoda difuzimetrică la următoarele antibiotice (Oxoid Basingstoke Marea Britanie) ampicilină amoxicilină+acid clavulanic ampicilină +sulbactam ceftazidim cefepim piperacilină+tazobactam aztreonam imipenem meropenem ciprofloxacin levofloxacin trimetoprim-sulfametoxazol tetraciclină doxiciclină gentamicină amikacină tobramicină şi colistin icircn funcţie de identitatea bacteriei Prin metoda microdiluţiilor icircn bulion am determinat concentraţia minimă inhibitorie pentru ceftazidim şi imipenem Interpretarea rezultatelor am efectuat-o pe baza normelor CLSI (Clinical Laboratory and Standards Institute) 2004 - 2010 Controlul de calitate a fost asigurat cu tulpinile

3

de referinţă Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 şi Escherichia coli ATCC 25922 Pentru clasificarea tulpinilor icircn multirezistente MDR (multidrug-resistant) extensiv rezistente XDR (extensively

drug-resistant) şi panrezistente PDR (pandrug-resistant) am folosit recomandările recente propuse de un grup de experţi internaţionali (Magiorakos et al 2012) 33 METODE FENOTIPICE DE SCREENING PENTRU PRODUCEREA DE METALO-β-LACTAMAZE

Testarea fenotipică pentru detectarea producerii de MBL a fost efectuată prin cinci metode descrise anterior 331 Metoda dublului disc ceftazidimimipenem ndash acid mercaptoacetic CuCl2 FeCl3 (Arakawa et al 2000) 332 Metoda discului combinat imipenem-EDTA (Yong et al 2002) 333 Testul Hodge modificat (Lee et al 2003) 334 Etest MBL (Walsh et al 2002) 335 Testul microdiluţiilor EPI (EDTA-phenanthroline-

imipenem) (Migliavacca et al 2002) 34 IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN BACTERIAN

Pentru extracţia ADN bacterian am folosit patru metode 341 liza termică a celulelor bacteriene (fierberea) 342 liza chimică a celulelor bacteriene (Wilson 2001) 343 extracţia prin legare pe coloane cu membrană de silica cu ajutorul kit-ului comercial GenElute Bacterial

Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich St Louis MO SUA) 344 Extracţia automată cu aparatul Maxwellreg16 AS2000 (Promega Corp Madison WI SUA)

4

35 DETECTAREA PRIN PCR A GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Pentru detectarea genelor de tip blaVIM şi blaIMP am efectuat un multiplex PCR cu următorii primeri IMP-DIA-FWD (5rsquo-GGAATAGAGTGGCTTAATTCT-3rsquo) IMP-DIA-REV (5rsquo-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3rsquo) VIM-DIA-FWD (5rsquo-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3rsquo) VIM-DIA-REV (5rsquo-AGGTGGGCCATTCAGCCAGA-3rsquo) (Eurogentec Liegravege Belgia) care generează ampliconi de 361 bp pentru blaIMP şi 523 bp pentru blaVIM după o metodă descrisă anterior (Docquier et al 2003) Amplificarea genei de tip blaNDM-1 am realizat-o cu ajutorul primerilor NDM-Fm (5- GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC-3) şi NDM-Rm (5- CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC -3) (Eurogentec Liegravege Belgia) care flanchează un fragment intern al genei de 621 bp şi conform protocolului propus de Nordmann et al (Nordmann et al 2011a) Produşii PCR au fost separaţi prin electroforeză icircn gel de agaroză 2 36 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Am testat acţiunea de hidroliză a unei soluţii de IPM 150 microM de către extractul bacterian al tulpinilor pozitive pentru gene blaVIM şi blaIMP după o metodă descrisă anterior (Gutieacuterrez et al 2007) Ulterior am urmărit inhibiţia activităţii carbapenemazice prin EDTA pentru a confirma prezenţa unei MBL Am calculat activitatea enzimatică specifică (nmolimin mg proteină) 37 INVESTIGAREA SUPORTULUI GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Suportul genetic al blaVIM şi blaIMP l-am investigat cu primeri pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 5rsquoCS şi 3rsquoCS icircn combinaţie cu primerii IMP DIA FWD IMP

5

DIA REV VIM DIA FWD VIM DIA REV conform unei metode descrise anterior (Docquier et al 2003) O parte din ampliconii purificaţi (Wizard PCR Purification Kit Promega

Corp Madison WI SUA) au fost trimişi pentru secvenţiere la Macrogen Inc (Amsterdam Olanda) restul fiind secvenţiaţi icircn Laboratorul de Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie din cadrul Universităţii Al I Cuza Iaşi Identitatea MBL a fost stabilită prin compararea cu baza de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (httpwwwncbinlmnihgov) 38 METODE DE TIPARE MOLECULARĂ

Metodele de tipare utilizate au fost PFGE şi RAPD Tiparea prin RAPD a fost realizată pentru tulpinile de P

aeruginosa cu primerii 272PSE şi 208PSE (Campbell et al 2000) şi cu primerul ERIC2 (Versalovic et al 1991) conform protocoalelor descrise anterior iar pentru tulpinile de A baumannii cu primerul 1254 după metoda lui Akopyanz (Akopyanz et al 1992) Două sau mai multe probe cu acelaşi pattern de benzi (analizate vizual) au fost incluse icircn acelaşi tip RAPD denumit cu litere majuscule sau cifre Probele care au diferit prin una sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite Tipurile RAPD care au diferit prin maxim o bandă majoră sau trei minore au fost considerate posibil icircnrudite Benzile au fost clasificate icircn majore dacă intensitatea lor a fost mai mare sau egală cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate moleculară 200-bp ladder (Promega Corp Madison WI USA) Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mică decacirct cea a fragmentului de 1000- bp 39 ANALIZA STATISTICĂ

Datele au fost centralizate icircn baze de date EXCEL şi SPSS 130 şi prelucrate testele ANOVA şi χ2 Am considerat ca semnificative valorile lui p lt 005

6

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

icircn ceea ce priveşte profilul de sensibilitate la antibiotice şi determinarea frecvenţei MBL la tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn spitale din Nord-Estul Romacircniei Necesitatea majoră a utilizării unor metode specifice de diagnosticare şi identificare a bacteriilor implicate icircn patologie ne-a motivat să comparăm diferite metode de detectare a MBL cu scopul de a evidenţia eficacitatea rapiditatea şi specificitatea fiecăreia dintre acestea Utilizarea metodelor moleculare a completat evaluarea fenotipică a izolatelor şi a avut o importanţă majoră icircn caracterizarea tulpinilor rezistente care pun probleme de terapie şi de răspacircndire icircn mediul de spital Rezultatele studiului ar putea completa baza de date de la nivel naţional sau european icircn ceea ce priveşte rezistenţa la antibiotice prin producerea de MBL Stabilirea unui protocol de depistare a tulpinilor producătoare de MBL are importanţă majoră atacirct icircn stabilirea ghidurilor terapeutice cacirct şi icircn recunoaşterea promptă a unei izbucniri epidemice de infecţii nosocomiale şi luarea măsurilor de control al infecţiei Realizarea acestui studiu a fost posibilă cu ajutorul grantului intern de cercetare nr 1707830092010 finanţat de UMF ldquoGrigore T Popardquo Iaşi a unei burse de cercetare oferite de Federaţia Europeană a Societăţilor de Microbiologie (FEMS) icircn 2007 şi a grantului CNCSIS ID-25432009 Obiective 1 Investigarea profilului de sensibilitate la antibiotice la tulpini de P aeruginosa izolate icircn spitale universitare din Iaşi 2 Optimizarea unor metode de detectarea a producerii de MBL la tulpini de Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Enterobacteriaceae rezistente la imipenem 3 Identificarea naturii MBL şi investigarea suportului lor genetic 4 Investigarea mecanismelor de răspacircndire a genelor de rezistenţă (expansiune clonală versus transfer orizontal)

2

PARTEA PERSONALĂ Cuprinde capitolele 3 4 şi 5 respectiv Material şi Metode Rezultate şi Discuţii

3 MATERIAL ŞI METODE

31 SELECŢIA TULPINILOR BACTERIENE

Au fost incluse icircn studiu tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn perioada 2004-2012 icircn laboratoarele unor spitale din Iaşi Bacău şi Galaţi Criterii de includere au fost caracter morfo-tinctorial de bacil Gram-negativ şi certitudinea semnificaţiei clinice a izolatului icircn funcţie de produsul patologic Identificarea bacteriilor a fost realizată pe baza caracterelor microscopice de cultură şi biochimice Caracterele biochimice le-am determinat cu ajutorul sistemelor multitest TSI (Triple Sugar Iron) asociat cu MIU (Mobilitate Indol Urează) şi cu Simmons (citrat) şi al celor microtest galeriile API 20E şi API 20NE (bioMerieux Marcy lrsquoEtoile Franţa) 32 TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA ANTIBIOTICE

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor bacteriene incluse icircn studiu a fost testată prin metoda difuzimetrică la următoarele antibiotice (Oxoid Basingstoke Marea Britanie) ampicilină amoxicilină+acid clavulanic ampicilină +sulbactam ceftazidim cefepim piperacilină+tazobactam aztreonam imipenem meropenem ciprofloxacin levofloxacin trimetoprim-sulfametoxazol tetraciclină doxiciclină gentamicină amikacină tobramicină şi colistin icircn funcţie de identitatea bacteriei Prin metoda microdiluţiilor icircn bulion am determinat concentraţia minimă inhibitorie pentru ceftazidim şi imipenem Interpretarea rezultatelor am efectuat-o pe baza normelor CLSI (Clinical Laboratory and Standards Institute) 2004 - 2010 Controlul de calitate a fost asigurat cu tulpinile

3

de referinţă Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 şi Escherichia coli ATCC 25922 Pentru clasificarea tulpinilor icircn multirezistente MDR (multidrug-resistant) extensiv rezistente XDR (extensively

drug-resistant) şi panrezistente PDR (pandrug-resistant) am folosit recomandările recente propuse de un grup de experţi internaţionali (Magiorakos et al 2012) 33 METODE FENOTIPICE DE SCREENING PENTRU PRODUCEREA DE METALO-β-LACTAMAZE

Testarea fenotipică pentru detectarea producerii de MBL a fost efectuată prin cinci metode descrise anterior 331 Metoda dublului disc ceftazidimimipenem ndash acid mercaptoacetic CuCl2 FeCl3 (Arakawa et al 2000) 332 Metoda discului combinat imipenem-EDTA (Yong et al 2002) 333 Testul Hodge modificat (Lee et al 2003) 334 Etest MBL (Walsh et al 2002) 335 Testul microdiluţiilor EPI (EDTA-phenanthroline-

imipenem) (Migliavacca et al 2002) 34 IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN BACTERIAN

Pentru extracţia ADN bacterian am folosit patru metode 341 liza termică a celulelor bacteriene (fierberea) 342 liza chimică a celulelor bacteriene (Wilson 2001) 343 extracţia prin legare pe coloane cu membrană de silica cu ajutorul kit-ului comercial GenElute Bacterial

Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich St Louis MO SUA) 344 Extracţia automată cu aparatul Maxwellreg16 AS2000 (Promega Corp Madison WI SUA)

4

35 DETECTAREA PRIN PCR A GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Pentru detectarea genelor de tip blaVIM şi blaIMP am efectuat un multiplex PCR cu următorii primeri IMP-DIA-FWD (5rsquo-GGAATAGAGTGGCTTAATTCT-3rsquo) IMP-DIA-REV (5rsquo-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3rsquo) VIM-DIA-FWD (5rsquo-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3rsquo) VIM-DIA-REV (5rsquo-AGGTGGGCCATTCAGCCAGA-3rsquo) (Eurogentec Liegravege Belgia) care generează ampliconi de 361 bp pentru blaIMP şi 523 bp pentru blaVIM după o metodă descrisă anterior (Docquier et al 2003) Amplificarea genei de tip blaNDM-1 am realizat-o cu ajutorul primerilor NDM-Fm (5- GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC-3) şi NDM-Rm (5- CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC -3) (Eurogentec Liegravege Belgia) care flanchează un fragment intern al genei de 621 bp şi conform protocolului propus de Nordmann et al (Nordmann et al 2011a) Produşii PCR au fost separaţi prin electroforeză icircn gel de agaroză 2 36 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Am testat acţiunea de hidroliză a unei soluţii de IPM 150 microM de către extractul bacterian al tulpinilor pozitive pentru gene blaVIM şi blaIMP după o metodă descrisă anterior (Gutieacuterrez et al 2007) Ulterior am urmărit inhibiţia activităţii carbapenemazice prin EDTA pentru a confirma prezenţa unei MBL Am calculat activitatea enzimatică specifică (nmolimin mg proteină) 37 INVESTIGAREA SUPORTULUI GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Suportul genetic al blaVIM şi blaIMP l-am investigat cu primeri pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 5rsquoCS şi 3rsquoCS icircn combinaţie cu primerii IMP DIA FWD IMP

5

DIA REV VIM DIA FWD VIM DIA REV conform unei metode descrise anterior (Docquier et al 2003) O parte din ampliconii purificaţi (Wizard PCR Purification Kit Promega

Corp Madison WI SUA) au fost trimişi pentru secvenţiere la Macrogen Inc (Amsterdam Olanda) restul fiind secvenţiaţi icircn Laboratorul de Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie din cadrul Universităţii Al I Cuza Iaşi Identitatea MBL a fost stabilită prin compararea cu baza de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (httpwwwncbinlmnihgov) 38 METODE DE TIPARE MOLECULARĂ

Metodele de tipare utilizate au fost PFGE şi RAPD Tiparea prin RAPD a fost realizată pentru tulpinile de P

aeruginosa cu primerii 272PSE şi 208PSE (Campbell et al 2000) şi cu primerul ERIC2 (Versalovic et al 1991) conform protocoalelor descrise anterior iar pentru tulpinile de A baumannii cu primerul 1254 după metoda lui Akopyanz (Akopyanz et al 1992) Două sau mai multe probe cu acelaşi pattern de benzi (analizate vizual) au fost incluse icircn acelaşi tip RAPD denumit cu litere majuscule sau cifre Probele care au diferit prin una sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite Tipurile RAPD care au diferit prin maxim o bandă majoră sau trei minore au fost considerate posibil icircnrudite Benzile au fost clasificate icircn majore dacă intensitatea lor a fost mai mare sau egală cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate moleculară 200-bp ladder (Promega Corp Madison WI USA) Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mică decacirct cea a fragmentului de 1000- bp 39 ANALIZA STATISTICĂ

Datele au fost centralizate icircn baze de date EXCEL şi SPSS 130 şi prelucrate testele ANOVA şi χ2 Am considerat ca semnificative valorile lui p lt 005

6

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

PARTEA PERSONALĂ Cuprinde capitolele 3 4 şi 5 respectiv Material şi Metode Rezultate şi Discuţii

3 MATERIAL ŞI METODE

31 SELECŢIA TULPINILOR BACTERIENE

Au fost incluse icircn studiu tulpini de bacili Gram-negativi izolate icircn perioada 2004-2012 icircn laboratoarele unor spitale din Iaşi Bacău şi Galaţi Criterii de includere au fost caracter morfo-tinctorial de bacil Gram-negativ şi certitudinea semnificaţiei clinice a izolatului icircn funcţie de produsul patologic Identificarea bacteriilor a fost realizată pe baza caracterelor microscopice de cultură şi biochimice Caracterele biochimice le-am determinat cu ajutorul sistemelor multitest TSI (Triple Sugar Iron) asociat cu MIU (Mobilitate Indol Urează) şi cu Simmons (citrat) şi al celor microtest galeriile API 20E şi API 20NE (bioMerieux Marcy lrsquoEtoile Franţa) 32 TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA ANTIBIOTICE

Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor bacteriene incluse icircn studiu a fost testată prin metoda difuzimetrică la următoarele antibiotice (Oxoid Basingstoke Marea Britanie) ampicilină amoxicilină+acid clavulanic ampicilină +sulbactam ceftazidim cefepim piperacilină+tazobactam aztreonam imipenem meropenem ciprofloxacin levofloxacin trimetoprim-sulfametoxazol tetraciclină doxiciclină gentamicină amikacină tobramicină şi colistin icircn funcţie de identitatea bacteriei Prin metoda microdiluţiilor icircn bulion am determinat concentraţia minimă inhibitorie pentru ceftazidim şi imipenem Interpretarea rezultatelor am efectuat-o pe baza normelor CLSI (Clinical Laboratory and Standards Institute) 2004 - 2010 Controlul de calitate a fost asigurat cu tulpinile

3

de referinţă Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 şi Escherichia coli ATCC 25922 Pentru clasificarea tulpinilor icircn multirezistente MDR (multidrug-resistant) extensiv rezistente XDR (extensively

drug-resistant) şi panrezistente PDR (pandrug-resistant) am folosit recomandările recente propuse de un grup de experţi internaţionali (Magiorakos et al 2012) 33 METODE FENOTIPICE DE SCREENING PENTRU PRODUCEREA DE METALO-β-LACTAMAZE

Testarea fenotipică pentru detectarea producerii de MBL a fost efectuată prin cinci metode descrise anterior 331 Metoda dublului disc ceftazidimimipenem ndash acid mercaptoacetic CuCl2 FeCl3 (Arakawa et al 2000) 332 Metoda discului combinat imipenem-EDTA (Yong et al 2002) 333 Testul Hodge modificat (Lee et al 2003) 334 Etest MBL (Walsh et al 2002) 335 Testul microdiluţiilor EPI (EDTA-phenanthroline-

imipenem) (Migliavacca et al 2002) 34 IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN BACTERIAN

Pentru extracţia ADN bacterian am folosit patru metode 341 liza termică a celulelor bacteriene (fierberea) 342 liza chimică a celulelor bacteriene (Wilson 2001) 343 extracţia prin legare pe coloane cu membrană de silica cu ajutorul kit-ului comercial GenElute Bacterial

Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich St Louis MO SUA) 344 Extracţia automată cu aparatul Maxwellreg16 AS2000 (Promega Corp Madison WI SUA)

4

35 DETECTAREA PRIN PCR A GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Pentru detectarea genelor de tip blaVIM şi blaIMP am efectuat un multiplex PCR cu următorii primeri IMP-DIA-FWD (5rsquo-GGAATAGAGTGGCTTAATTCT-3rsquo) IMP-DIA-REV (5rsquo-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3rsquo) VIM-DIA-FWD (5rsquo-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3rsquo) VIM-DIA-REV (5rsquo-AGGTGGGCCATTCAGCCAGA-3rsquo) (Eurogentec Liegravege Belgia) care generează ampliconi de 361 bp pentru blaIMP şi 523 bp pentru blaVIM după o metodă descrisă anterior (Docquier et al 2003) Amplificarea genei de tip blaNDM-1 am realizat-o cu ajutorul primerilor NDM-Fm (5- GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC-3) şi NDM-Rm (5- CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC -3) (Eurogentec Liegravege Belgia) care flanchează un fragment intern al genei de 621 bp şi conform protocolului propus de Nordmann et al (Nordmann et al 2011a) Produşii PCR au fost separaţi prin electroforeză icircn gel de agaroză 2 36 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Am testat acţiunea de hidroliză a unei soluţii de IPM 150 microM de către extractul bacterian al tulpinilor pozitive pentru gene blaVIM şi blaIMP după o metodă descrisă anterior (Gutieacuterrez et al 2007) Ulterior am urmărit inhibiţia activităţii carbapenemazice prin EDTA pentru a confirma prezenţa unei MBL Am calculat activitatea enzimatică specifică (nmolimin mg proteină) 37 INVESTIGAREA SUPORTULUI GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Suportul genetic al blaVIM şi blaIMP l-am investigat cu primeri pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 5rsquoCS şi 3rsquoCS icircn combinaţie cu primerii IMP DIA FWD IMP

5

DIA REV VIM DIA FWD VIM DIA REV conform unei metode descrise anterior (Docquier et al 2003) O parte din ampliconii purificaţi (Wizard PCR Purification Kit Promega

Corp Madison WI SUA) au fost trimişi pentru secvenţiere la Macrogen Inc (Amsterdam Olanda) restul fiind secvenţiaţi icircn Laboratorul de Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie din cadrul Universităţii Al I Cuza Iaşi Identitatea MBL a fost stabilită prin compararea cu baza de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (httpwwwncbinlmnihgov) 38 METODE DE TIPARE MOLECULARĂ

Metodele de tipare utilizate au fost PFGE şi RAPD Tiparea prin RAPD a fost realizată pentru tulpinile de P

aeruginosa cu primerii 272PSE şi 208PSE (Campbell et al 2000) şi cu primerul ERIC2 (Versalovic et al 1991) conform protocoalelor descrise anterior iar pentru tulpinile de A baumannii cu primerul 1254 după metoda lui Akopyanz (Akopyanz et al 1992) Două sau mai multe probe cu acelaşi pattern de benzi (analizate vizual) au fost incluse icircn acelaşi tip RAPD denumit cu litere majuscule sau cifre Probele care au diferit prin una sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite Tipurile RAPD care au diferit prin maxim o bandă majoră sau trei minore au fost considerate posibil icircnrudite Benzile au fost clasificate icircn majore dacă intensitatea lor a fost mai mare sau egală cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate moleculară 200-bp ladder (Promega Corp Madison WI USA) Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mică decacirct cea a fragmentului de 1000- bp 39 ANALIZA STATISTICĂ

Datele au fost centralizate icircn baze de date EXCEL şi SPSS 130 şi prelucrate testele ANOVA şi χ2 Am considerat ca semnificative valorile lui p lt 005

6

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

de referinţă Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 şi Escherichia coli ATCC 25922 Pentru clasificarea tulpinilor icircn multirezistente MDR (multidrug-resistant) extensiv rezistente XDR (extensively

drug-resistant) şi panrezistente PDR (pandrug-resistant) am folosit recomandările recente propuse de un grup de experţi internaţionali (Magiorakos et al 2012) 33 METODE FENOTIPICE DE SCREENING PENTRU PRODUCEREA DE METALO-β-LACTAMAZE

Testarea fenotipică pentru detectarea producerii de MBL a fost efectuată prin cinci metode descrise anterior 331 Metoda dublului disc ceftazidimimipenem ndash acid mercaptoacetic CuCl2 FeCl3 (Arakawa et al 2000) 332 Metoda discului combinat imipenem-EDTA (Yong et al 2002) 333 Testul Hodge modificat (Lee et al 2003) 334 Etest MBL (Walsh et al 2002) 335 Testul microdiluţiilor EPI (EDTA-phenanthroline-

imipenem) (Migliavacca et al 2002) 34 IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN BACTERIAN

Pentru extracţia ADN bacterian am folosit patru metode 341 liza termică a celulelor bacteriene (fierberea) 342 liza chimică a celulelor bacteriene (Wilson 2001) 343 extracţia prin legare pe coloane cu membrană de silica cu ajutorul kit-ului comercial GenElute Bacterial

Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich St Louis MO SUA) 344 Extracţia automată cu aparatul Maxwellreg16 AS2000 (Promega Corp Madison WI SUA)

4

35 DETECTAREA PRIN PCR A GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Pentru detectarea genelor de tip blaVIM şi blaIMP am efectuat un multiplex PCR cu următorii primeri IMP-DIA-FWD (5rsquo-GGAATAGAGTGGCTTAATTCT-3rsquo) IMP-DIA-REV (5rsquo-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3rsquo) VIM-DIA-FWD (5rsquo-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3rsquo) VIM-DIA-REV (5rsquo-AGGTGGGCCATTCAGCCAGA-3rsquo) (Eurogentec Liegravege Belgia) care generează ampliconi de 361 bp pentru blaIMP şi 523 bp pentru blaVIM după o metodă descrisă anterior (Docquier et al 2003) Amplificarea genei de tip blaNDM-1 am realizat-o cu ajutorul primerilor NDM-Fm (5- GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC-3) şi NDM-Rm (5- CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC -3) (Eurogentec Liegravege Belgia) care flanchează un fragment intern al genei de 621 bp şi conform protocolului propus de Nordmann et al (Nordmann et al 2011a) Produşii PCR au fost separaţi prin electroforeză icircn gel de agaroză 2 36 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Am testat acţiunea de hidroliză a unei soluţii de IPM 150 microM de către extractul bacterian al tulpinilor pozitive pentru gene blaVIM şi blaIMP după o metodă descrisă anterior (Gutieacuterrez et al 2007) Ulterior am urmărit inhibiţia activităţii carbapenemazice prin EDTA pentru a confirma prezenţa unei MBL Am calculat activitatea enzimatică specifică (nmolimin mg proteină) 37 INVESTIGAREA SUPORTULUI GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Suportul genetic al blaVIM şi blaIMP l-am investigat cu primeri pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 5rsquoCS şi 3rsquoCS icircn combinaţie cu primerii IMP DIA FWD IMP

5

DIA REV VIM DIA FWD VIM DIA REV conform unei metode descrise anterior (Docquier et al 2003) O parte din ampliconii purificaţi (Wizard PCR Purification Kit Promega

Corp Madison WI SUA) au fost trimişi pentru secvenţiere la Macrogen Inc (Amsterdam Olanda) restul fiind secvenţiaţi icircn Laboratorul de Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie din cadrul Universităţii Al I Cuza Iaşi Identitatea MBL a fost stabilită prin compararea cu baza de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (httpwwwncbinlmnihgov) 38 METODE DE TIPARE MOLECULARĂ

Metodele de tipare utilizate au fost PFGE şi RAPD Tiparea prin RAPD a fost realizată pentru tulpinile de P

aeruginosa cu primerii 272PSE şi 208PSE (Campbell et al 2000) şi cu primerul ERIC2 (Versalovic et al 1991) conform protocoalelor descrise anterior iar pentru tulpinile de A baumannii cu primerul 1254 după metoda lui Akopyanz (Akopyanz et al 1992) Două sau mai multe probe cu acelaşi pattern de benzi (analizate vizual) au fost incluse icircn acelaşi tip RAPD denumit cu litere majuscule sau cifre Probele care au diferit prin una sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite Tipurile RAPD care au diferit prin maxim o bandă majoră sau trei minore au fost considerate posibil icircnrudite Benzile au fost clasificate icircn majore dacă intensitatea lor a fost mai mare sau egală cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate moleculară 200-bp ladder (Promega Corp Madison WI USA) Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mică decacirct cea a fragmentului de 1000- bp 39 ANALIZA STATISTICĂ

Datele au fost centralizate icircn baze de date EXCEL şi SPSS 130 şi prelucrate testele ANOVA şi χ2 Am considerat ca semnificative valorile lui p lt 005

6

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

35 DETECTAREA PRIN PCR A GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Pentru detectarea genelor de tip blaVIM şi blaIMP am efectuat un multiplex PCR cu următorii primeri IMP-DIA-FWD (5rsquo-GGAATAGAGTGGCTTAATTCT-3rsquo) IMP-DIA-REV (5rsquo-GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT-3rsquo) VIM-DIA-FWD (5rsquo-CAGATTGCCGATGGTGTTTGG-3rsquo) VIM-DIA-REV (5rsquo-AGGTGGGCCATTCAGCCAGA-3rsquo) (Eurogentec Liegravege Belgia) care generează ampliconi de 361 bp pentru blaIMP şi 523 bp pentru blaVIM după o metodă descrisă anterior (Docquier et al 2003) Amplificarea genei de tip blaNDM-1 am realizat-o cu ajutorul primerilor NDM-Fm (5- GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC-3) şi NDM-Rm (5- CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC -3) (Eurogentec Liegravege Belgia) care flanchează un fragment intern al genei de 621 bp şi conform protocolului propus de Nordmann et al (Nordmann et al 2011a) Produşii PCR au fost separaţi prin electroforeză icircn gel de agaroză 2 36 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Am testat acţiunea de hidroliză a unei soluţii de IPM 150 microM de către extractul bacterian al tulpinilor pozitive pentru gene blaVIM şi blaIMP după o metodă descrisă anterior (Gutieacuterrez et al 2007) Ulterior am urmărit inhibiţia activităţii carbapenemazice prin EDTA pentru a confirma prezenţa unei MBL Am calculat activitatea enzimatică specifică (nmolimin mg proteină) 37 INVESTIGAREA SUPORTULUI GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Suportul genetic al blaVIM şi blaIMP l-am investigat cu primeri pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 5rsquoCS şi 3rsquoCS icircn combinaţie cu primerii IMP DIA FWD IMP

5

DIA REV VIM DIA FWD VIM DIA REV conform unei metode descrise anterior (Docquier et al 2003) O parte din ampliconii purificaţi (Wizard PCR Purification Kit Promega

Corp Madison WI SUA) au fost trimişi pentru secvenţiere la Macrogen Inc (Amsterdam Olanda) restul fiind secvenţiaţi icircn Laboratorul de Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie din cadrul Universităţii Al I Cuza Iaşi Identitatea MBL a fost stabilită prin compararea cu baza de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (httpwwwncbinlmnihgov) 38 METODE DE TIPARE MOLECULARĂ

Metodele de tipare utilizate au fost PFGE şi RAPD Tiparea prin RAPD a fost realizată pentru tulpinile de P

aeruginosa cu primerii 272PSE şi 208PSE (Campbell et al 2000) şi cu primerul ERIC2 (Versalovic et al 1991) conform protocoalelor descrise anterior iar pentru tulpinile de A baumannii cu primerul 1254 după metoda lui Akopyanz (Akopyanz et al 1992) Două sau mai multe probe cu acelaşi pattern de benzi (analizate vizual) au fost incluse icircn acelaşi tip RAPD denumit cu litere majuscule sau cifre Probele care au diferit prin una sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite Tipurile RAPD care au diferit prin maxim o bandă majoră sau trei minore au fost considerate posibil icircnrudite Benzile au fost clasificate icircn majore dacă intensitatea lor a fost mai mare sau egală cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate moleculară 200-bp ladder (Promega Corp Madison WI USA) Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mică decacirct cea a fragmentului de 1000- bp 39 ANALIZA STATISTICĂ

Datele au fost centralizate icircn baze de date EXCEL şi SPSS 130 şi prelucrate testele ANOVA şi χ2 Am considerat ca semnificative valorile lui p lt 005

6

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

DIA REV VIM DIA FWD VIM DIA REV conform unei metode descrise anterior (Docquier et al 2003) O parte din ampliconii purificaţi (Wizard PCR Purification Kit Promega

Corp Madison WI SUA) au fost trimişi pentru secvenţiere la Macrogen Inc (Amsterdam Olanda) restul fiind secvenţiaţi icircn Laboratorul de Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie din cadrul Universităţii Al I Cuza Iaşi Identitatea MBL a fost stabilită prin compararea cu baza de date NCBI cu ajutorul programului BLAST (httpwwwncbinlmnihgov) 38 METODE DE TIPARE MOLECULARĂ

Metodele de tipare utilizate au fost PFGE şi RAPD Tiparea prin RAPD a fost realizată pentru tulpinile de P

aeruginosa cu primerii 272PSE şi 208PSE (Campbell et al 2000) şi cu primerul ERIC2 (Versalovic et al 1991) conform protocoalelor descrise anterior iar pentru tulpinile de A baumannii cu primerul 1254 după metoda lui Akopyanz (Akopyanz et al 1992) Două sau mai multe probe cu acelaşi pattern de benzi (analizate vizual) au fost incluse icircn acelaşi tip RAPD denumit cu litere majuscule sau cifre Probele care au diferit prin una sau mai multe benzi au fost considerate tipuri diferite Tipurile RAPD care au diferit prin maxim o bandă majoră sau trei minore au fost considerate posibil icircnrudite Benzile au fost clasificate icircn majore dacă intensitatea lor a fost mai mare sau egală cea a fragmentului de 1000- bp a marker-ului de greutate moleculară 200-bp ladder (Promega Corp Madison WI USA) Benzile minore au fost cele cu o intensitate mai mică decacirct cea a fragmentului de 1000- bp 39 ANALIZA STATISTICĂ

Datele au fost centralizate icircn baze de date EXCEL şi SPSS 130 şi prelucrate testele ANOVA şi χ2 Am considerat ca semnificative valorile lui p lt 005

6

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

4 REZULTATE

41 TULPINILE BACTERIENE

Lotul de studiu a inclus 2147 bacili Gram-negativi non-duplicat selectaţi aleator dintre tulpinile cu semnificaţie clinică izolate icircn următoarele spitale Spitalul de Boli Infecţioase ldquoSf Paraschevardquo Iaşi Institutul de Boli Cardiovasculare Prof Dr GIM Georgescu Iaşi Spitalul de Copii ldquoSf Mariardquo Iaşi Spitalul Clinic ldquoDr CI Parhonrdquo Iaşi Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţe ldquoSf Spiridonrdquo Iaşi Spitalul Judeţean de Urgenţe Bacău şi Spitalul Judeţean de Urgenţe Galaţi icircn perioada 2004-2012 (tabel 4I)

42 SENSIBILITATEA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR STUDIATE

Prin antibiograma difuzimetrică din totalul de 2147 de tulpini 932 (434) au fost rezistenteintermediare la

7

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

imipenem Dintre acestea 862 tulpini au fost de P

aeruginosa 55 tulpini de A baumannii 6 tulpini de Enterobacter cloacae şi 3 tulpini de K pneumoniae Rezistenţa la imipenem la speciile studiate a fost de 5765 pentru P aeruginosa 478 pentru A baumannii 139 pentru Enterobacter spp şi de 28 pentru K pneumoniae Izolatele sensibile la imipenem au fost excluse din studiu Clasificarea tulpinilor rezistente la imipenem conform definiţiilor propuse icircn 2012 (Magiorakos et al 2012) este ilustrată icircn fig 1

0

20

40

60

80

100

P aeruginosa A baumannii E cloacae K pneumoniae

PDR

XDR

MDR

modR

Fig 1 Distribuţia fenotipurilor de rezistenţă la tulpinile rezistente la

imipenem

Procentul de rezistenţă la IPM la tulpinile de P

aeruginosa a variat de-a lungul perioadei de studiu de la 4827 icircn primii ani (2004-2007) la 618 icircn 2008 la 5759 icircn 2009 la 6466 icircn 2010 şi la 5112 la tulpinile izolate icircn anii 2011-2012 Icircn perioada 2004-2012 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la IMP a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y= 1325 + 133 x) (fig 2) De asemenea curba de regresie privind evoluţia icircn timp a mediilor frecvenţelor relative ale rezistenţei la 12 antibiotice testate a evidenţiat tendinţa de creştere a rezistenţei globale la antibiotice a izolatelor de P aeruginosa de-a lungul celor 8 ani de studiu Valorile CMI la CAZ şi IPM pentru tulpinile de P

aeruginosa din lotul studiat s-au icircncadrat icircntre 1 - ge 128 microgml cu predominanţa izolatelor cu rezistenţă icircnaltă la cele două antibiotice (CMI ge 128 microgml) Tulpinile de P aeruginosa

8

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

studiate s-au remarcat prin valori ridicate ale CMI50 şi CMI90 atacirct pentru IPM (64 microgml respectiv gt128 microgml) cacirct şi pentru CAZ (32 microgml respectiv 128 microgml)

y = 133x + 1325

0

100

200

300

lt 2007 2008 2009 2010 201112

Nr

tu

lpin

i re

zis

ten

te I

MP

Fig 2 Variaţia rezistenţei de imipenem a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa icircntre anii 2004-2012

43 PERFORMANŢA DETECTĂRII FENOTIPICE A METALO-β-LACTAMAZELOR

Un număr de 210 tulpini (P aeruginosa ndash 154 A

baumannii ndash 52 K pneumoniae ndash 3 şi E cloacae - 1) au fost investigate prin toate cele patru teste fenotipice Am reunit rezultatele obţinute icircn tabelul 2

Tabelul 2 Rezultatele testărilor fenotipice pentru producerea de

MBL

9

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

Icircn cadrul acestui lot prezenţa genelor pentru MBL VIM şi IMP a fost confirmată prin PCR la 47 tulpini de P aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi una de K

pneumoniae Comparacircnd rezultatele testelor fenotipice şi ale celor genotipice am calculat sensibilităţile specificităţile şi predicţiile pozitive ale metodelor de screening conform indicaţiilor lui Ilstrup (Ilstrup 1990) (tabelul 3) Nu am luat icircn considerare enterobacteriaceele datorită numărului mic de tulpini Tabelul 3 Compararea a patru metode fenotipice pentru detectarea

MBL la bacili Gram-negativi cu detectarea prin PCR

Se sensibilitatea Sp specificitatea PP predicţia pozitivă ND nedeterminat Testul discului combinat IPM+EDTA a icircnregistrat cea mai mare rată de rezultate fals pozitive 44 pentru P aeruginosa 85 pentru A baumannii deşi a avut o sensibilitate de 100 Icircn cazul enterobacteriaceelor testul discului combinat nu a detectat tulpina de K pneumoniae VIM pozitivă şi a identificat greşit tulpina de E cloacae ca producătoare de MBL Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (70) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Au fost icircnregistrate 14 rezultate fals negative Zece izolate de P

10

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

aeruginosa şi două de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază sau rezultat fals pozitiv La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K

pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Pentru tulpina de E cloacae testul Hodge modificat a fost negativ Deşi toate izolatele producătoare de MBL au fost corect identificate prin Etest MBL au fost icircnregistrate rezultate fals pozitive pentru 3 tulpini de P aeruginosa şi 3 tulpini de A

baumannii Testul EPI a avut o sensibilitate şi o specificitate de 100 comparabilă cu standardul de aur PCR numai pentru P aeruginosa Testul EPI a fost aplicat şi pentru izolatele de A baumannii K pneumoniae şi E cloacae icircnsă acestea nu au crescut icircn prezenţa agenţilor chelatori explicabil prin faptul că metoda este optimizată doar pentru P aeruginosa

45 GENELE PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Lotul investigat prin PCR a inclus 175 tulpini de P

aeruginosa (dintre care 60 sensibile şi 115 rezistente la IPM) 25 tulpini de A baumannii (dintre care 8 sensibile şi 17 rezistente la IPM) 3 tulpini de K pneumoniae şi o tulpină de E cloacae toate rezistente la IPM Prin multiplex PCR a rezultat un amplicon de 523 bp semnalacircnd o genă blaVIM-like la 46 de tulpini de P

aeruginosa 2 tulpini de A baumannii şi o tulpină de K

pneumoniae Un amplicon de 361 bp sugestiv pentru o genă blaIMP-like a fost obţinut la o singură tulpină de P aeruginosa (Pa247IS) (fig 3) Nici o genă blaNDM nu a fost identificată icircn acest studiu Nu am detectat gene pentru MBL la izolatele sensibile la carbapeneme Din 115 tulpini de P aeruginosa rezistenteintermediare la imipenem la 47 (4086) au fost detectate gene pentru MBL Raportat la icircntregul lot de P aeruginosa investigat prin PCR tulpinile producătoare de MBL au reprezentat 268 Două tulpini de A baumannii au fost producătoare de MBL

11

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

adică 117 dintre izolatele rezistente la imipenem şi 8 din lot (fig 4)

Fig 3 Multiplex PCR pentru confirmarea prezenţei genelor de tip

blaVIM şi blaIMP M = marker de greutate moleculară de 100 bp DNA ladder CN= control negativ

0 20 40 60 80 100

P aeruginosa

A baumannii

K pneumoniae

E cloacae

S

R non MBL

MBL

Fig 4 Ponderea rezistenţei la imipenem şi a MBL icircn lotul

studiat Izolatele de P aeruginosa MBL pozitive au provenit cel mai frecvent din urină (446) urmată de puroi (319) spută (106) aspirat traheal (85) hemocultură (212) şi

12

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

lichid cefalorahidian (212) Cele două izolate de A baumannii MBL pozitive au fost izolate din puroi şi din urină iar tulpina de K pneumoniae MBL pozitivă din urină Izolatele MBL negative au provenit cel mai frecvent din puroi (46) urmat de urină (29) spută (101) aspirat traheal (4) hemocultură (31) exsudat faringian (31) lichid cefalorahidian (15) cateter (15) Nu am observat o asociere semnificativă a tulpinilor producătoare de MBL cu un anumit focar de infecţie (p = 012) Tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL au fost rezistente icircn proporţie de 100 la penicilinele şi cefalosporinele anti-Pseudomonas carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide spre deosebire de cele MBL negative la care procentul de rezistenţă a variat (fig 5 6)

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 5 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL pozitive Rezistenţa la ATM s-a icircnregistrat la 1447 tulpini MBL (298) şi la 3468 tulpini nonMBL (50) Ponderea rezistenţei la ATM a tulpinilor nonMBL a fost semnificativ mai crescută (p=0049) evidenţiind un risc relativ de 168 ori mai mare (RR=168 IC95 102-277) comparativ cu tulpinile MBL pentru care acest antibiotic poate avea rol terapeutic (RR=060 IC95 036-098)

13

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

0

20

40

60

80

100

TZP CAZ FEP ATM MEM CIP LEV GM TOB AK CT

Sensibilă

Rezistentă

Fig 6 Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa MBL negative Distribuţia pe ani a tulpinilor producătoare de MBL din lotul nostru a fost neuniformă şi am constat o creştere a numărului lor icircn ultimii ani ai studiului (fig 7)

0

5

10

15

20

25

30

35

2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

non MBL

MBL

Fig 7 Distribuţia pe ani a tulpinilor de Pseudomonas

aeruginosa producătoare de MBL Cele două tulpini de A baumannii producătoare de MBL au fost rezistente la peniciline plus inhibitor de β-lactamază peniciline anti-Pseudomonas plus un inhibitor de β-lactamază cefalosporine cu spectru extins carbapeneme fluorochinolone şi aminoglicozide Una dintre ele a fost

14

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

rezistentă şi la DO şi SXT iar amacircndouă au fost sensibile la TOB şi CT (fig 8) Rezistenţa la antibiotice a celor 15 tulpini de A baumannii rezistente la IPM la care nu am detectat gene pentru MBL a fost următoarea 100 la TZP CAZ SAM MEM SXT CIP 933 la FEP 666 la DO 866 la GM 40 la TOB 733 la AK iar la CT 0 (fig 8)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TZP CAZ FEP SAM MEM CIP SXT DO GM TOB AK CT

MBL nonMBL

Fig 8 Sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor de Acinetobacter

baumannii rezistente la IPM MBL pozitive versus MBL negative

Izolate pozitive pentru gene ce codifică MBL au fost depistate icircn toate spitalele din Iaşi şi icircn cel din Galaţi astfel 2 tulpini la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară a Institutului de Boli Cardiovasculare Iaşi 1 tulpină la Spitalul de Copii 3 tulpini la Clinica de Urologie din Spitalul Dr C I Parhon 14 tulpini la Spitalul Sf Spiridon (5 la secţia ATI 3 la Clinicile de Chirurgie 2 la Dermatologie cacircte una la Clinicile de Diabet Hematologie Oncologie şi Ortopedie) 29 tulpini la Spitalul de Boli Infecţioase şi 1 tulpină la Clinica de Chirurgie a Spitalului Judeţean Galaţi Analiza spectrofotometrică a arătat că toate tulpinile pozitive pentru genele blaVIM şi blaIMP hidrolizează IPM avacircnd o activitate enzimatică specifică cuprinsă icircntre 70-155 nmolminmg proteină ceea ce confirmă producerea de MBL de către aceste tulpini

15

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

47 SUPORTUL GENETIC AL GENELOR PENTRU METALO-β-LACTAMAZE

Prezenţa integronilor de clasă 1 a fost confirmată icircn toate izolatele producătoare de MBL Reacţiile cu primerii pentru regiunile conservate ale integronilor de clasă 1 şi primerii pentru genele blaVIM şi blaIMP au dezvăluit că nu toţi integronii detectaţi adăpostesc genele pentru MBL Tulpina Pa247IS conţine un integron de clasă 1 cu două casete genice blaIMP-13 urmată de aacA4 (fig 9)

Fig 9 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa247IS

Tulpina Pa16GL deţine două cogravepii ale genei blaVIM-2 O

genă blaVIM-2 află icircntr-un un integron de clasă 1 ca a doua casetă genică icircntre genele de rezistenţă la aminoglicozide aacA4 şi aadA2 (fig 10) A doua genă blaVIM-2 a fost identificată icircntr-un fragment dintr-un integron de clasă 1 icircn aval de caseta genică aacA29a (fig 10)

Fig 10 Structura integronilor de clasă 1 din tulpina Pa16GL

Reacţia de amplificare cu primerii 5CS şi 3CS a detectat

icircn 44 tulpini de P aeruginosa doi integroni de clasă 1 unul de aprox 08 kb şi unul de aprox 13 kb Ampliconii de 08 kb nu ar putea găzdui gene de tip blaVIM icircntrucacirct acestea au dimensiuni egale sau mai mari de 800 bp Cel mai probabil aceşti integroni sunt lipsiţi de casete genice Secvenţierea

16

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

ampliconilor de 13 kb cu primerii ATTI şi 3CS a evidenţiat următoarea structură IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 (fig 11)

Fig 11 Structura integronului de clasă 1 din 44 tulpini de P

aeruginosa

Tulpina de P aeruginosa Pa23IS găzduieşte pe lacircngă fragmentul de 08 kb unul de 25 kb Secvenţa acestui integron de clasă 1 de 25 kb a fost IntI1-attI-aacA7-∆blaVIM-∆cmlA1-qacE∆1 (fig 12) Icircn acest caz tipul de enzimă VIM nu a putut fi precizat deoarece secvenţierea a arătat numai primele 454 bp dintr-o genă blaVIM Icircn aval de acest fragment a urmat o secvenţă de 215 bp similară capătului 3 al genei cmlA1

Fig 12 Structura integronului de clasă 1 din tulpina Pa23IS

Integroni de clasă 1 de 33 kb şi respectiv 15 kb au fost detectaţi la tulpinile de P aeruginosa 281 şi 83 care nu produc MBL (fig13)

Fig 13 Structurile integronilor de clasă 1 din tulpinile Pa281 (sus) şi

Pa83 (jos)

17

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

48 RELAŢIILE EPIDEMIOLOGICE DINTRE IZOLATELE PRODUCĂTOARE DE METALO-β-LACTAMAZE

Analiza RAPD a fost efectuată pentru a determina icircnrudirea genetică a izolatelor care poartă acelaşi determinant de rezistenţă şi modul de transmitere al acestuia Tulpina Pa247IS a fost comparată cu două tulpini (AV65 şi OV160) de P aeruginosa producătoare de IMP-13 izolate icircn Italia Profilul de benzi al Pa247IS a fost identic cu cel al tulpinii AV65 deci izolatul din Iaşi este icircnrudit clonal cu cel responsabil de o izbucnire epidemică icircntr-un spital din sudul Italiei icircn 2003 Cele 46 tulpini P aeruginosa pozitive pentru blaVIM au fost icircmpărţite icircn tipuri 7 RAPD cu ajutorul primerului 272PSE după cum urmează un tip major A (26 tulpini) tipul B (14 tulpini) tipul C (2 tulpini) şi tipurile D E F G fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile A B şi F constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite (fig 14) Tulpinile din tipurile RAPD C D E şi G sunt diferite

Fig 14 Tipurile RAPD cu primer-ul 272PSE M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA)

18

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

Prezenţa aceluiaşi integron de clasă 1 IntI1-attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini din tipuri RAPD diferite sugerează transferul orizontal al materialului genetic Tulpina Pa16GL (tip RAPD G) producătoare de VIM-2 izolată icircn 2003 la Galaţi a fost diferită de tulpinile din Iaşi Prin RAPD cu primerul ERIC2 tulpinile P aeruginosa pozitive pentru blaVIM-2 au fost clasificate icircn tipuri 10 tipuri RAPD notate cu cifre arabe (fig 15)

Fig 15 Tipurile RAPD cu primer ERIC2 M marker de greutate moleculară 200 bp DNA Step Ladder (Promega Corp Madison WI USA) Primerul ERIC2 a discriminat icircn interiorul tipurilor A şi B obţinute cu primerul 272PSE icircncadracircnd cacircteva izolate icircn tipuri separate Totuşi s-a distins icircn continuare un tip major 1 cu 24 tulpini Componenţa celorlalte tipuri a fost următoarea tipurile 2 şi 3 cu cacircte 4 tulpini tipurile 4 şi 10 cu cacircte 2 tulpini şi tipurile 5 6 7 8 9 fiecare cu cacircte o singură tulpină Diferenţa dintre tipurile 1 7 şi 8 constă icircntr-o singură bandă deci tulpinile sunt probabil icircnrudite

Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul 272PSE icircn cele cinci spitale este prezentată icircn fig 16 Tulpinile din tipul A şi B se regăsesc icircn trei spitale ceea ce ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalul de Boli Infecţioase reuneşte trei tipuri RAPD fapt explicat de

19

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

specificul izolatelor de P aeruginosa din această unitate unde sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene Distribuţia tipurilor RAPD obţinute cu primerul ERIC2 icircn cele cinci spitale este ilustrată icircn fig 17

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip A

RAPD tip F

RAPD tip B

RAPD tip C

RAPD tip D

RAPD tip E

Fig 16 Distribuţia tipurilor RAPD-272PSE icircn cele 5 spitale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

BI SS UP Ped CCV

RAPD tip 1

RAPD tip 2

RAPD tip 3

RAPD tip 4

RAPD tip 5

RAPD tip 6

RAPD tip 7

RAPD tip 8

RAPD tip 9

RAPD tip 10

Fig 17 Distribuţia tipurilor RAPD-ERIC2 icircn cele 5 spitale BI= Spitalul de Boli Infecţioase SS = Spitalul Sf Spiridon CCV =

Clinica de Chirurgie Cardiovasculară de la Institutul de Boli Cardiovasculare Iaşi UP = Clinica de Urologie de la Spitalul Dr C

I Parhon Ped = Spitalul de Copii

Nr

tul

pini

N

r t

ulp

ini

20

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn aceleaşi trei spitale ca şi tipul A ceea ce confirmă rezultatele privind amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Pe lacircngă Spitalul de Boli Infecţioase şi Spitalul Sf Spiridon reuneşte mai multe tipuri RAPD-ERIC2

5 DISCUŢII Icircn lotul studiat rezistenţa globală la IPM a tulpinilor de P aeruginosa a fost de 5765 concordant cu raportul sistemului european de supraveghere a rezistenţei la antibiotice EARSS (European Antimicrobial Surveillance

System) din cadrul ECDC (European Center for Disease

Prevention and Control) care situează Romacircnia printre ţările cu rezistenţă peste 50 la carbapeneme alături de Grecia Am remarcat prezenţa unor fluctuaţii anuale ale rezistenţei la IPM nu icircntotdeauna semnificative statistic atacirct icircn studiul nostru cacirct şi icircn raportările pentru alte ţări ale EARSS Rezistenţa la carbapeneme la P aeruginosa este adesea asociată cu rezistenţă şi la alte antibiotice ceea ce limitează opţiunile terapeutice (Livermore 2001) Tulpinile de P aeruginosa rezistente la IPM din lotul investigat au fost rezistente icircn proporţie de peste 90 la TZP cefalosporinele anti-Pseudomonas fluorochinolone şi aminoglicozide Majoritatea au fost sensibile la ATM şi toate si-au păstrat sensibilitatea la CT Rezultate similare au fost raportate icircn Brazilia unde din 512 izolate de P aeruginosa 576 au fost rezistente la IPM toate fiind sensibile la CT iar 308 fiind rezistente la ATM şi 506 la AK (Zavascki et al 2007) Icircn acelaşi studiu s-a raportat un procent de 167 XDR comparabil cu 172 XDR icircn rezultatele noastre Deşi investigarea a 526 tulpini de P aeruginosa izolate icircntr-un spital din Serbia a arătat 31 rezistenţă la IPM mai puţin decacirct procentul identificat de noi proporţia izolatelor XDR a fost de 294 mai mare decacirct 172 icircn studiul nostru

21

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

Similar rezultatelor noastre sensibilitatea la CT a fost tot de 100 icircnsă contrar rezultatelor noastre al doilea cel mai activ antibiotic faţă de P aeruginosa rezistent la IPM după CT a fost LEV urmat de CIP cu procente de sensibilitate mai mari decacirct ATM şi AK (Jovcic et al 2011) Rezistenţa la IPM a tulpinilor de A baumannii investigate de noi a fost de 478 aproape jumătate dintre ele fiind XDR Chiar dacă icircn studiul nostru tulpinile au fost selectate aleator cu predominanţa celor rezistente la imipenem procentul raportat de noi a avut o valoare apropiată de o parte dintre cele observate icircn ultimii anii pentru această bacterie Icircn studiul nostru antibioticele cele mai active asupra tulpinilor de A baumannii rezistente la IPM au fost CT urmat de TOB şi DO Rezultate similare au descris Mammina et al icircntr-un studiu efectuat icircntr-un spital din Palermo pe 61 izolate de A baumannii rezistente la carbapeneme care au fost icircn proporţie de 100 sensibile la CT şi 100 rezistente la cefalosporine la combinaţii β-lactamină-inhibitor de β-lactamază şi la fluorochinolone sensibilitatea la aminoglicozide fiind variabilă cea mai activă TOB cea mai puţin activă GM (Mammina et al 2012) Detectarea precoce a tulpinilor producătoare de MBL este esenţială pentru controlul infecţiei şi pentru prevenirea diseminării acestor microorganisme Faptul că activitatea MBL este inhibată de substanţe chelatoare precum EDTA compuşi tiolici acid dipicolinic a condus la dezvoltarea a diverse metode de screening pentru detectarea microorganismelor care produc MBL Icircn 2002 au fost propuse trei astfel de metode cu rezultate bune la tulpini de Pseudomonas spp şi Acinetobacter spp testul EPI cu EDTA şi orto-fenantrolină (Migliavacca et al 2002) testul discului combinat IPM-IPM+EDTA (Yong et al 2002) şi Etest MBL (Walsh et al 2002) pe care le-am utilizat icircn studiul nostru Am inclus şi testul Hodge modificat cu disc de IPM+ZnSO4 (Lee et al 2003) La testele cu discuri impregnate cu soluţii de CuCl2 şi FeCl3 şi acid mercaptoacetic am renunţat din cauza

22

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

acţiunii antibacteriene demonstrate a rezultatelor ambigui şi a toxicităţii şi mirosului neplăcut al compuşilor tiolici Contrar studiilor anterioare rezultatele noastre au arătat specificitate şi predicţie pozitivă scăzute ale testului discului combinat IPM-EDTA Rezultatele fals pozitive icircnregistrate ar putea fi explicate prin efectul antibacterian al EDTA (Chu et al 2005) prin permeabilizarea peretelui celular (Ratkai et al 2009) inactivarea imipenemului de către zincul chelat (Baxter et al 1997) prezenţa de enzime tip OXA-10 şi sau OXA-14 cu activitate carbapenemazică mai eficientă icircn forma dimerică stabilizată de ionii de Zn2+ şi care sunt parţial inhibate de EDTA (Danel et al 2001) Poate nu icircn ultimul racircnd ar trebui să luăm icircn considerare influenţa unei singure clone icircn interpretarea rezultatelor (a fost demonstrată icircnrudirea clonală a multor tulpini investigate subcap 48) Testul fenotipic EPI a identificat corect tulpinile de P aeruginosa producătoare de MBL fără rezultate fals pozitive sau fals negative icircn acord cu alte raportări (Henrichfreise et al 2005 Sardelic et al 2012) deşi astfel de rezultate au fost semnalate (Migliavacca et al 2002) Testul Hodge modificat a detectat 33 din 47 (702) izolate de P aeruginosa producătoare de MBL Zece izolate de P aeruginosa şi două izolate de A baumannii au dat rezultate pozitive la testul Hodge modificat dar negative la PCR sugeracircnd prezenţa unui alt tip de carbapenemază La testul Hodge modificat toate cele trei tulpini de K pneumoniae au prezentat rezultate pozitive deşi doar una produce MBL Literatura cuprinde semnalări ale diverselor combinaţii de determinanţi de rezistenţă ca alterarea permeabilităţii membranei externe asociată cu cefalosporinază AmpC sau cu β-lactamaze cu spectru extins (CTX-M SHV) la tulpini de K pneumoniae icircnsoţite de o creşterea variabilă a CMI la carbapeneme (Carvalhaes et al 2010) Totodată s-au descris pacircnă la 25 rezultate fals pozitive la testul Hodge modificat mai ales pentru izolate producătoare de CTX-M sau hiperproducătoare de AmpC (Pasteran et al 2010)

23

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

Icircn studiul nostru metoda Etest MBL a avut o sensibilitate de 100 pentru tulpinile de P aeruginosa şi A

baumannii mai mare decacirct icircn raportările lui Walsh et al (94) Yan et al (87) Pitout et al (96) sau Qu et al (857) (Walsh et al 2002 Yan et al 2004 Pitout et al 2005 Qu et al 2009) Icircn ceea ce priveşte specificitatea Etest MBL rezultatele noastre sunt icircn acord cu majoritatea autorilor menţionaţi Icircntr-un lot de 175 tulpini de P aeruginosa proporţia tulpinilor producătoare de MBL a fost de 268 din icircntregul lot şi de 4086 dintre izolatele intermediare şi rezistente la imipenem Icircntr-un lot de 17 tulpini de A baumannii şi 3 tulpini de K pneumoniae rezistente la imipenem doar două respectiv una au fost pozitive pentru producerea de MBL Icircn marea majoritate (98) am detectat MBL tip VIM acestea fiind cel mai frecvent raportate şi la nivel mondial (Dugal Fernandes 2011) O singură tulpină Pa247IS a fost detectată producătoare de IMP-13 Situaţia MBL icircn alte regiuni din Romacircnia pare că respectă pattern-ul epidemiologic observat de Cornaglia (Cornaglia 2011) Icircntre 2007-2008 dintre 84 tulpini de P aeruginosa multirezistente izolate icircn spitale din Bucureşti 5 produceau VIM-2 (Străuţ et al 2010) Icircn perioada 2008-2011 dintr-un total de 531 tulpini de bacili Gram-negativi (enterobacterii şi pseudomonade) izolate din secţii de terapie intensivă din spitale bucureştene 34 au avut rezultate pozitive pentru producerea de MBL prin teste fenotipice iar gena blaVIM a fost identificată la peste 50 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la carbapeneme (Czobor et al 2012) Icircn contrast cu aceste rezultate nicio tulpină de P aeruginosa (din 27 investigate) de la Spitalul de Boli Infecţioase din Cluj Napoca nu a prezentat genele blaVIM sau blaIMP (Crăciunaş et al 2010) Cernat et al au raportat o prevalenţă crescută a MBL IMP-1 şi VIM-2 la tulpini de A baumannii izolate la Institutul de Cardiologie din Bucureşti icircntre anii 2003-2006 (Cernat et al 2007) Un procent mare (83) de tulpini de A baumannii

24

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

producătoare de MBL a fost observat şi la Spitalul Fundeni din Bucureşti dar nu a fost efectuată confirmarea rezultatelor prin PCR (Borcan et al 2012) Un studiu care a inclus 13 tulpini de A baumannii rezistente la carbapeneme izolate icircn spitale din Timişoara Arad şi Reşiţa nu a detectat MBL (Bonin et al 2011) Procente apropiate de cele din studiul nostru privind frecvenţa MBL la tulpini de P aeruginosa au fost raportate icircn Brazilia (Franco et al 2010) Iran (Yousefi et al 2010) şi Taiwan (Lee et al 2008) Metalo-β-lactamaza IMP-13 a fost descrisă prima dată icircn 2005 la tulpini de P aeruginosa din Italia care au fost implicate şi icircn izbucniri de infecţii nosocomiale (Pagani et al 2005) Ocazional a fost detectată şi icircn alte ţări europene Romacircnia (Mereuţă et al 2007) Austria (Duljasz et al 2009) Belgia (Naas et al 2011) Franţa (Fournier et al 2012) şi surprinzător icircn Argentina (Santella et al 2010) Tulpinile italiene producătoare de IMP-13 fac parte din aceeaşi clonă cu care este icircnrudită tulpina Pa247IS izolată la Iaşi Mai mult analiza MLST a arătat că tulpinile izolate icircn Argentina Italia Romacircnia Austria (Santella et al 2010) şi o parte din cele izolate icircn Franţa (Fournier et al 2012) fac parte din acelaşi tip ST621 ceea ce demonstrează un strămoş comun al acestora care a achiziţionat gena blaIMP-13 icircntr-un punct genetic conservat şi apoi a evoluat ca o clonă cu răspacircndire mondială Dată fiind perioada destul de lungă de timp dintre izolarea şi testarea tulpinii Pa247 nu am găsit informaţii care să documenteze o călătorie icircn Italia a pacientului de la care a fost izolată tulpina astfel că nu am putut stabili dacă e un caz de import sau de prezenţa clonei ST621 icircn ţara noastră Faptul că icircn Iaşi icircn 2007 dintre 26 tulpini de bacili Gram-negativi (22 P aeruginosa şi 4 A baumannii) rezistenţi la imipenem izolaţi icircn spitale ieşene doar la o tulpină de P aeruginosa a fost evidenţiată o genă pentru MBL (blaIMP-13) iar icircn prezent dintre 103 tulpini de bacili Gram-negativi (90 P aeruginosa şi 13 A baumannii)

25

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

rezistenţi la imipenem izolaţi din aceleaşi spitale la 47 (45 P aeruginosa şi 2 A baumannii) a fost identificată gena blaVIM sugerează că numărul MBL icircn special al celor VIM-2 creşte Emergenţa MBL VIM la K pneumoniae icircn aceeaşi zonă este un argument icircn plus Investigarea suportului genetic al MBL a identificat cinci tipuri de integroni de clasă 1 care conţin astfel de gene la tulpinile de P aeruginosa Icircn cazul tulpinilor de A baumannii şi de K pneumoniae gena blaVIM nu a fost asociată cu integroni de clasă 1 La 44 tulpini de P aeruginosa am identificat blaVIM-2 icircntr-un integron de clasă 1 cu doar două casete genice icircn regiunea variabilă icircn ordine aacA7 şi blaVIM-2 Integroni similari au fost raportaţi la o tulpină de P aeruginosa izolată icircn Spania (Cabot et al 2012) şi la una din Japonia (Zhao et al 2009) Un integron de clasă 1 conţinacircnd aacA7 and blaVIM-2 a fost semnalat şi icircn Romacircnia la tulpini izolate icircn spitale din Bucureşti (Străuţ et al 2010) dar regiunea aflată icircn aval de gena blaVIM-2 a fost diferită de cea descrisă de noi Integronul caracterizat de Străuţ et al conţinea trei casete genice icircn regiunea variabilă aacA7 blaVIM-2 dhfrB asemănători integronilor detectaţi in Rusia SUA India (Toleman et al 2007) Norvegia (Samuelsen et al 2009) şi Taiwan (Yan et al 2006) iar icircn locul regiunii 3primeCS se afla gena tniC (codifică rezolvaza Tn5090) (Toleman et al 2007) Deşi tulpina Pa23 a prezentat fenotip producător de MBL integronul de clasă 1 detectat a inclus gena blaVIM parţial deletată urmată de un fragment parţial al genei cmlA1 Dat fiind faptul că am obţinut un amplicon de dimensiune corectă la amplificarea cu primerii VIM-DIA suspectăm existenţa genei icircn variantă completă icircn altă parte icircn genom Prezenţa a două cogravepii ale genei blaVIM-2 icircn genomul tulpinii Pa16GL nu este un fenomen singular fiind descris la tulpini de P aeruginosa izolate la Bucureşti (Străuţ et al 2010) Cea de a doua genă blaVIM-2 este situată icircn aval de caseta genică aacA29a similar aranjamentului din integronul

26

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

In59 detectat icircn Franţa cam icircn aceeaşi perioadă (Poirel et al 2001) Spre deosebire de In59 icircn aval de blaVIM-2 nu am identificat regiunea 3CS a unui integron de clasă 1 deci nu cunoaştem suportul genetic al acestor două casete genice (aacA29a-blaVIM-2) Lipsa regiunii 3primeCS este caracteristică integronilor găzduiţi de transposonii Tn5090 considerat progenitorul tipului clasic de integron de clasă 1 icircnainte de adiţia genei de fuziune qacsul şi pierderea genelor de transpoziţie (tniC) (Toleman et al 2007) Integronul de clasă 1 identificat la tulpina PA247IS care adăposteşte gena blaIMP-13 a fost identic cu integronul InPSG descris la tulpini de P aeruginosa izolate icircn Italia (Pagani et al 2005) Austria (Duljasz et al 2009) Argentina (Santella et al 2010) şi Belgia (Naas et al 2011) Integronul InPSG este inserat icircn situsul res al unui transpozon Tn5051-like cu localizare cromosomală (Pagani et al 2005 Santella et al 2010) Icircnrudirea clonală a tulpinii Pa247IS cu izolate din sudul Italiei şi din Belgia indică posibilitatea prezenţei acestui tip de transpozon şi icircn tulpina izolată la Iaşi Aceste rezultate sugerează o origine genetică comună a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care circulă icircn lume Tiparea moleculară clasifică tulpinile dintr-o specie bacteriană pe baza diferenţelor icircntre genomele bacteriene foarte utilă icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale E important de stabilit dacă sunt cauzate de aceeaşi clonă bacteriană (izbucnire monoclonală) icircn care microorganismele sunt transmise de la un pacient la altul Infecţiile nosocomiale cu clone diferite din aceeaşi specie (izbucnire policlonală) se pot datora presiunii selective a antibioticelor utilizate Icircn urma RAPD cu primerul 272 au rezultat şapte tipuri RAPD (A-G) icircn cadrul tulpinilor de P aeruginosa pozitive pentru gena blaVIM Tipurile A-F au fost identificate la izolate din spitalele ieşene iar tipul G la izolatul Pa16GL de la Galaţi Tulpina Pa247IS pozitivă pentru blaIMP-13 a generat un pattern diferit

27

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

Primerul ERIC 2 a avut o putere discriminatorie mai mare identificacircnd 10 tipuri RAPD (1-10) printre izolatele din spitalele ieşene Faptul că mai mult de jumătate dintre tulpini sunt icircnrudite clonal arată că mecansimul major de diseminare a genelor pentru MBL icircn regiunea noastră icircl reprezintă expansiunea clonală Identificarea aceluiaşi integron IntI1-

attI-aacA7-blaVIM-2-qacE∆1 la tulpini de P aeruginosa din diverse tipuri RAPD de la diverşi pacienţi spitalizaţi icircn ani diferiţi sugerează persistenţa integronului icircn comunitatea bacteriană locală şi transferul orizontal al integronului icircnsuşi nu doar a casetei genice blaVIM-2 Deşi integronii nu sunt mobili per se mai mulţi integroni de clasă 1 au fost descrişi icircn transpozoni care icirci mobilizează (Fluit et al 1999) Este posibil ca acest integron de clasă 1 caracterizat de noi să facă parte tot dintr-un transpozon Icircn Spitalul de Boli Infecţioase tipul RAPD 1 a fost prezent din 2008 pacircnă icircn 2012 Icircn 2010 apar şi tipurile 9 10 iar icircn 2012 tipurile 2 şi 4 La Spitalul Sf Spiridon tipul RAPD 1 a fost prezent din 2010 pacircnă icircn 2012 icircn 2011 s-au adăugat tipurile 2 şi 5 iar icircn 2012 tipurile 6 şi 3 Tulpinile izolate din Clinica de urologie a Spitalului Dr CI Parhon deşi sunt icircncadrate icircn tipurile 7 şi 8 sunt posibil icircnrudite cu tulpinile din tipul 1 evidenţiate icircn celelalte spitale O tulpină de P aeruginosa izolată icircn noiembrie 2012 la Spitalul de Pediatrie a fost icircnrudită clonal cu o tulpină izolată icircn luna august a aceluiaşi an la Spitalul de Boli Infecţioase Tulpina de P aeruginosa izolată de la Clinica de Chirurgie Cardiovasculară icircn septembrie 2009 a fost icircncadrată icircn tipul 1 circulant la acea vreme icircn Spitalul de Boli Infecţioase Un punct slab al acestui studiu este lipsa datelor despre istoricul pacienţilor de la care au fost izolate tulpinile care să arate spitalizările multiple sau transferul interintraspitalicesc explicacircnd astfel prezenţa aceluiaşi tip RAPD icircn diferite spitale

28

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

Tulpinile din tipul 1 sunt prezente icircn secţii diferite din trei spitale din Iaşi şi au persistat de-a lungul anilor ceea ce sugerează succesul unei clone icircn acapararea unei nişe ecologice şi ilustrează amploarea infecţiei de spital icircncrucişate Spitalele de Boli Infecţioase şi Sf Spiridon reunesc mai multe tipuri RAPD diferite fapt explicat de specificul acestor unităţi Pe de o parte Spitalul Sf Spiridon reuneşte pacienţi din regiunea de Nord-Est a Romacircniei iar icircn Spitalul de Boli Infecţioase sunt internaţi sau transferaţi pacienţi cu diferite complicaţii infecţioase din clinicile medicale şi chirurgicale ieşene 6 CONCLUZII GENERALE

1 Prezentul studiu este prima descriere a VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa şi a unei gene de tip VIM la K pneumoniae din Romacircnia Gene de tip VIM au fost detectate şi la A baumannii

2 Tulpina de P aeruginosa blaIMP-13 pozitivă izolată icircn Romacircnia este icircnrudită clonal şi conţine un integron identic cu o tulpină de P aeruginosa producătoare de IMP-13 care a determinat o izbucnire de infecţie nosocomială icircn sudul Italiei

3 Chiar dacă rezistenţa globală la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa din lotul studiat nu a variat semnificativ statistic icircn perioada 2004-2011 aceasta a icircnregistrat o tendinţă crescătoare (y = 00379x - 75533)

4 Procentul de rezistenţă icircnregistrat la imipenem (5765) trage un semnal de alarmă asupra utilizării corecte restrictive a acestor antibiotice icircn terapia infecţiilor produse de bacili Gram-negativi (Enterobacteriaceae P aeruginosa Acinetobacter spp) Icircn perioada 2004-2011 rezistenţa tulpinilor de P aeruginosa la imipenem a avut tendinţă crescătoare

29

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

5 Supravegherea icircn condiţii standardizate a sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor de P aeruginosa este utilă pentru cunoaşterea spectrului de sensibilitate actual al bacteriilor la antibiotice cu implicaţii directe icircn actualizarea ghidurilor de terapie şi limitarea răspacircndirii tulpinilor multirezistente

6 Prezenţa metalo-β-lactamazelor (285 dintre tulpinile de P aeruginosa rezistente la imipenem) limitează opţiunile terapeutice icircn multe cazuri la colistin şi impune măsuri pentru prevenirea infecţiei nosocomiale şi a transferului orizontal al acestor bacterii

7 Studiul nostru nu a evidenţiat nicio tulpină panrezistentă 8 Tiparea moleculară prin RAPD a demonstrat icircnrudirea

clonală a mai mult de jumătate dintre izolatele producătoare de metalo-β-lactamaze provenite din secţii şi spitale diferite ceea ce reclamă adoptarea unor măsuri riguroase de stopare a infecţiilor icircncrucişate şi de control a infecţiei nosocomiale

9 Testele de screening pentru tulpinile cu fenotip de rezistenţă sugestiv pentru producerea de metalo-β-lactamaze ar trebui să includă testul discului combinat IPM+EDTA urmat de testul Hodge modificat cu adaos de sulfat de zinc Confirmarea rezultatelor se realizează prin tehnici de biologie moleculară

10 Lipsa unor noi antibiotice active faţă de bacteriile Gram-negative face din controlul infecţiei cea mai importantă măsură icircmpotriva tulpinilor multirezistente

30

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

GRADUL DE ORIGINALITATE

Originalitatea studiului de faţă constă icircn investigarea pentru prima dată a prezenţei metalo-β-lactamazelor la bacili Gram-negativi izolaţi icircn spitale din regiunea Moldovei fiind şi printre primele studii de acest fel din ţară Acest studiu a semnalat pentru prima oară icircn ţara noastră enzimele VIM-2 şi IMP-13 la tulpini de P aeruginosa cu caracterizarea integronilor care adăpostesc genele lor codante De asemenea am detectat gena blaVIM la tulpini de K

pneumoniae Este un studiu care s-a desfăşurat pe mai mulţi ani şi a permis observarea creşterii rezistenţei la antibiotice inclusiv la carbapeneme a tulpinilor de P aeruginosa cu emergenţa MBL

Icircn baza tipării moleculare a tulpinilor de P aeruginosa producătoare de MBL teza a scos icircn evidenţă expansiunea clonală ca principal mecanism de transfer al genelor pentru MBL Prin compararea tulpinii producătoare de IMP-13 cu tulpini izolate icircn spitale din Italia şi Argentina a fost demonstrată prezenţa unei clone cu diseminare internaţională icircntr-un spital din Iaşi

De asemenea originalitatea studiului constă şi icircn elaborarea unui algoritm de depistare a tulpinilor producătoare de MBL icircn laboratoarele de microbiologie PERSPECTIVE DE CERCETARE

Detectarea şi caracterizarea altor mecanisme de rezistenţă la imipenem (alte clase de carbapenemaze deficit de porine pompe de eflux hiperactivitatea cefalosporinazei cromosomale AmpC) Continuarea studiului rezistenţei la carbapeneme a

tulpinilor de Enterobacteriaceae şi Acinetobacter spp Introducerea sistematică a metodelor moleculare de tipare

icircn ancheta epidemiologică a infecţiilor nosocomiale

31

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

Bibliografie selectivă Akopyanz N Bukanov NO Westblom TU DNA

diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori

detected by PCR-based RAPD fingerprinting Nucleic Acids

Res 1992 20 5137-5142 Arakawa Y Shibata N Shibayama K et al Convenient

test for screening metallo-β-lactamase-producing gram-negative bacteria by using thiol compounds J Clin Microbiol

2000 38(1) 40-43 Bonin RA Poirel L Licker M Nordmann P Genetic

diversity of carbapenem hydrolysing β-lactamases in Acinetobacter baumannii from Romanian hospitals Clin

Microbiol Infect 2011 17(10) 1524-1527 Cabot G Ocampo-Sosa AA Angeles-Dominguez M et

al genetic markers of widespread extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa high-risk clones Antimicrob Agents

Chemother 2012 56(12) 6349-6357 Campbell M Mahenthiralingam E Speert DP

Evaluation of random amplified plymorphic DNA typing of Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2000 38(12) 4614-4615

Carvalhaes C Picao R Nicoletti AG Gales A Cloverleaf test (modified Hodge test) for detecting carbapenemase production in Klebsiella pneumoniae be aware of false positive results J Antimicrob Chemother 2010 65 249-251

Cernat R C Balotescu Lazar V et al Genetic characterisation of highly prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii strains in a Romanian hospital Clin Microbiol

Infect 2007 13(s1) O436 Chu YW Cheung T Ngan J Kam KM EDTA

susceptibility leading to false detection of metallo-beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa by Etest and an imipenem-EDTA disk method Int J Antimicrob Agents 2005 26(4) 340-343

32

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

Clinical and Laboratory Standards Institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 22th informational supplement 2012 CLSI M100-S22 Wayne PA

Cornaglia G Giamarellou H Rossolini GM Metallo-β-lactamases a last frontier for β-lactams Lancet Infect Dis 2011 11(5) 381-393

Crăciunaş C Butiuc-Keul A Flonta M et al Application of molecular techniques to the study of Pseudomonas

aeruginosa clinical isolate in Cluj Napoca Romania Analele

Universităţii din Oradea-Fascicula Biologie 2010 XVII(2) 243-247

Czobor I Chifiriuc MC Măruţescu LG et al Phenotypic and genetic screening of beta-lactamases mediated resistance amongst clinical isolates of Gram-negative bacilli from Romanian hospitals Roum Arch Microbiol Immunol 2012 71(3) 131-132

Docquier JD Riccio ML Mugnaioli C et al IMP-12 a new plasmid-encoded metallo-β-lactamase from a Pseudomonas putida clinical isolate Antimicrob Agents

Chemother 2003 47(5) 1522-1528 Dugal S Fernandes A Carbapenem hydrolysing metallo-

β-lactamases a review Int J Curr Pharm Res 2011 3(3) 9-16 Duljasz W Gniadkowski M Sitter S et al First

organisms with acquired metallo-β-lactamases (IMP-13 IMP-22 and VIM-2) reported in Austria Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(5) 2221-2222 Fluit AC Schmitz FJ Class 1 integrons gene cassettes

mobility and epidemiology Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999 18(11) 761-770

Fournier D Jeannot K Robert-Nicoud M et alSpread of the blaIMP-13 gene in French Pseudomonas aeruginosa through sequence types ST621 ST308 and ST111 Int J Antimicrob

Agents 201240(6) 571-573 Franco M Caiaffa-Filho HH Burattini MN Rossi F

Metallo-beta-lactamases among imipenem-resistant

33

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital Clinics 2010 65(9) 825-829

Gutieacuterrez O Juan C Cercenado et al Molecular epidemiology and mechanisms of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals Antimicrob Agents Chemother 2007 51(12) 4329-4335

Hamouda A Findlay J Amyes SGB Carbapenems do they have a future J Med Microbiol 2011 60(3) 1229-1230

Henrichfreise B Wiegand I Sherwood KJ Wiedemann B Detection of VIM-2 metallo-β-lactamase in Pseudomonas

aeruginosa from Germany Antimicrob Agents Chemother 2005 49(4) 1668-1669

Jovcic B Vasiljevcic Z Djukic S et al Emergence of VIM-2 metallo - beta - lactamase ndash producing Pseudomonas

aeruginosa isolates in a paediatric hospital in Serbia J Med

Microbiol 2011 60(6) 868-869 Lee K Lim Y Yong D et al Evaluation of the Hodge

test and the imipenem-EDTA double-disk synergy test for differentiating metallo-β-lactamase-producing isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J Clin Microbiol 2003 41(10) 4623-4629

Lee MF Peng CF Hsu HJ Chen YH Molecular characterisation of the metallo-β- lactamase genes in imipenem-resistant Gram-negative bacteria from a university hospital in southern Taiwan Int J Antimicrob Agents 2008 32(6) 475-480

Livermore DM Of Pseudomonas porins pumps and carbapenems J Antimicrob Chemother 2001 47(3) 247-250

Magiorakos AP Srinivasan A Carey RB et al Multidrug-resistant extensively drug- resistant and pandrug-resistant an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance Clin Microbiol Infect 2012 18(3) 268-281

Mammina C Palma DM Bonura C et al Epidemiology and clonality of carbapenem-resistant Acinetobacter

34

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

baumannii from an intensive care unit in Palermo Italy BMC

Research Notes 2012 5 365-373 Mereuţă AI Docquier J Rossolini G Buiuc D Detection

of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romaniamdashresearch fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49

Migliavacca R Docquier JD Mugnaioli C et al Simple microdilution test for detection of metallo-β-lactamase production in Pseudomonas aeruginosa J Clin Microbiol 2002 40(11) 4388-4390

Naas T Bogaerts P Kostyanev T et al Silent spread of IMP-13-producing Pseudomonas aeruginosa belonging to sequence type 621 in Belgium J Antimicrob Chemother 2011 66(9) 2178-2179

Nordmann P Poirel L Carreumlr A et al How to detect NDM-1 producers J Clin Microbiol 2011 49(2) 718-721

Pagani L Colinon C Migliavacca R et al Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant Pseudomonas

aeruginosa producing IMP-13 metallo-β-lactamase J Clin

Microbiol 2005 43(8) 3824-3828 Pasteran F Mendez T Rapoport M Corso A Controlling

the false positive results of the Hodge and Masuda assays for class A carbapenemase detection in species of Enterobacteriaceae J Clin Microbiol 2010 48(4) 1323-1332

Poirel L Lambert T Tuumlrkogluuml S et al Characterization of class 1 integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the blaVIM-2-carbapenem-hydrolyzing β-lactamase gene and of two novel aminoglycoside resistance gene cassettes Antimicrob Agents Chemother 2001 45(2) 546-552

Qu TT Zhang JL Wang J et al Evaluation of phenotypic tests for detection of metallo-β-lactamase- producing Pseudomonas aeruginosa strains in China J Clin Microbiol 2009 47(4)1136-1142

Ratkai C Quinteira S Grosso F et al Controlling for false positives interpreting MBL Etest and MBL combined

35

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

disc test for the detection of metallo-β-lactamases J

Antimicrob Chemother 2009 64(3) 657-658 Samuelsen Oslash Buaroslash L Toleman MA et al The first

metallo-β-lactamase identified in Norway is associated with a TniC-like transposon in a Pseudomonas aeruginosa isolate of sequence type 233 imported from Ghana Antimicrob Agents

Chemother 2009 53(1) 331-332 Sardelic S Bedenic B Colinon-Dupuich C et al

Infrequent finding of metallo-β-lactamase VIM-2 in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains from Croatia Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5) 2746-2749

Străuţ M Dinu S Creţoiu S et al Molecular characterization of genetic structures surrounding blaVIM-2 gene identified in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Romania Clin Microbiol Infect 201016(S2)197

Toleman MA Vinodh H Sekar U et al blaVIM-2-harboring integrons isolated in India Russia and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3prime conserved sequence Antimicrob Agents

Chemother 2007 51(7) 2636-2638 Van Belkum A Tassios PT Dijskhoorn L et al

Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology Clin Microbiol Infect Dis 2007 13(Suppl 3) 1-46

Versalovic J Koeuth T Lupski JR Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes Nucl Acids Res 1991 19(24) 6823-6831

Walsh TR Bolmstroumlm A Qwaumlrnstroumlm A Gales A Evaluation of a new Etest for detecting metallo-β-lactamases in routine clinical testing J Clin Microbiol 2002 40(8) 2755-2759

Wilson K Preparation of genomic DNA from bacteria Curr Protoc Mol Biol 2001 00241ndash245

Yong D Lee K Yum JH et al Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo-β-lactamase-producing

36

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

clinical isolates of Pseudomonas spp and Acinetobacter spp J

Clin Microbiol 2002 40(10) 3798-3801 Yousefi S Farajnia S Nahaei MR et al detection of

metallo- β-lactamase-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in northwest of Iran Diagn

Microbiol Infect Dis 2010 68(3) 322-325 Zavascki AP Barth AL Gonccedilalves ALS et al The

influence of metallo-β-lactamase production on mortality in nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections J Antimicrob

Chemother 2006 58(2) 387-392 Zhao WH Chen G Ito R Hu ZQ Relevance of

resistance levels to carbapenems and integron-borne blaIMP-1 blaIMP-7 blaIMP-10 and blaVIM-2 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa J Med Microbiol 2009 58(8) 1080-1085

Teza cuprinde 67 de figuri 34 de tabele şi 481 titluri bibliografice

37

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38

ANEXĂ Lista de articole din tematica tezei de doctorat

Articole icircn reviste cotate ISI 1 Mereuţă AI Bădescu AC Dorneanu OS Iancu LS

Tuchiluş CG Spread of VIM-2-metallo-β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii clinical isolates from Iasi Romania Rev Romacircnă Med Lab

2013 21 (4) in press Factor de impact 0097

2 Santella G Pollini S Docquier JD Mereuţă AI Gutkind G Rossolini GM Radice M Intercontinental dissemination of IMP-13-producing Pseudomonas

aeruginosa belonging in sequence type 621 J Clin

Microbiol 2010 48(11) 4342-4343 Factor de impact 4068 Articole icircn reviste B+ 3 Mereuţă AI Tuchiluş CG Bădescu AC Iancu LS

Rezistenţa prin metalo-beta-lactamaze la izolate clinice de Pseudomonas aeruginosa rezistente la carbapeneme Rev

Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(4) 1208-1213

4 Mereuţă AI Enache E Dumitraşcu A Vremeră T Coman G Emergenţa rezistenţei la carbapeneme la tulpini Klebsiella pneumoniae izolate din infecţii ale tractusului urinar Rev Med Chir Soc Med Nat Iaşi 2011 115(2) 531-535

5 Mereuţă AI Docquier JD Rossolini GM Buiuc D Detection of metallo-beta-lactamases in gram-negative bacilli isolated in hospitals from Romania--research fellowship report Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol 2007 52(1-2) 45-49 Citat de 3 ori

6 Mereuţă AI Poiată A Tuchiluş CG Dorneanu O Nistor S Copăcianu B Metode de screening al bacililor gram-negativi producători de metalo-β-lactamaze Rev Med Chir

Soc Med Nat Iaşi 2005 109(2) 387-391

38