VIRUSOLOGIE GENERALĂ

• Virusurile - forme acelulare sau subcelulare de viaţă, metabolic inerte şi lipsite de capacitatea de creştere şi multiplicare înafara organismelor vii, fiind parazite obligatoriu intracelular.

CARACTERELE GENERALE ALE VIRUSURILOR

1.- Dimensiunile foarte reduse, 10 - 300 nanometri (nm) le conferă următoarele proprietăţi:

• - nu sunt vizibile la microscopul optic, ci numai la microscopul electronic;

• - traversează fitrele obişnuite, care reţin bacteriile;

• -sedimentează numai prin ultracentrifugare (>10000 turații/minut).

2.- Sunt lipsite de metabolism propriu deoarece nu dispun de enzime metabolice şi prin urmare:

• -nu cresc și nu se divid singure ci sunt replicate de o celulă gazdă (animală, vegetală, fungică, bacterienă);

• - relația cu celulele gazdă este una de parazitism deoarece virusul deviază metabolismul acestora în sensul sintezei de noi particule virale pe baza rezervelor nutritive și energetice ale celulei.

FORMELE DE EXISTENŢĂ A VIRUSURILOR ÎN NATURĂ

1. Virusul complet (virionul) = forma matură a virusului– posedă toate componenetele caracteristice virusului

şi toate atributele speciei din care face parte; – are capacitatea de a rezista un timp limitat înafara

celulei sensibile;– este dotat cu infecţiozitate (posibilitatea de a pătrunde

într-o celulă gazdă receptivă, capabilă să-l reproducă);

– este dotat cu patogenitate (capacitatea de a determina modificări morfologice şi funcţionale echivalente cu starea de boală).

2. Virusul vegetativ = o formă de existenţă intracelulară a virusului, sub formă de elemente structurale dispersate în citoplasma celulei.

• Conform informaţiei genetice conţinute în acidul nucleic viral, celula cu aparatul ei enzimatic sintetizează componentele virale care, în urma ansamblării, formează noi virioni. Eliberaţi din celula parazitată, aceştia vor pătrunde în alte celule receptive, reluând circuitul care asigură conservarea virusului în natură. Î

• În faza de virus vegetativ, dependenţa virusului de celulă este totală, el fiind incapabil de a supravieţui înafara acesteia.

3. Virusul integrat sau provirusul = virus integrat în genomul celulei receptive, unde rămâne în stare ocultă (celula parazitată nu sintetizează material viral) un timp nelimitat, comportându-se ca un fragment de material genetic propriu celulei. • Sub acţiunea unor factori stresanţi pentru

celulăVirusul integrat →virus vegetativ

(genomul viral se desprinde de cromozomul celulei şi începe să codifice sinteza de material viral, trecând în stadiul de virus vegetativ).

• MORFOLOGIA şi STRUCTURA VIRUSURILOR

FORMA şi DIMENSIUNILE • Virusurile se prezintă într-o gamă foarte variată de

forme:În general:

- forma rotunjită (corpusculară) este specifică virusurilor patogene pentru animale (zoovirusuri);- forma alungită, virusurilor patogene pentru plante (fitovirusuri) şi insecte;- forma spermatozoidică, virusurilor patogene pentru bacterii (bacteriofagi).

Dimensiunile virusurilor diferă de la o specie la alta, fiind cuprinse între 10-20 nanometri la virusurile mici (ex. virusul febrei aftoase) şi 300-350 nanometri la virusurile mari (ex. virusurile variolice).

STRUCTURA VIRUSURILOR • Virusurile complete (virionii):

- un singur acid nucleic – ADN sau ARN -,care constituie genomul viral;

- un înveliş proteic numit capsidă; genomul + capsida = nucleocapsida.

• La unele virusuri, nucleocapsida este înconjutată de un înveliş suplimentar numit pericapsidă (anvelopă, peplos), prevăzut cu o serie de emergenţe numite spiculi

Genomul viral

• Genomul viral este reprezenrat de acidul nucleic viral. În funcţie de natura acestuia, virusurile se împart în:

1. ribovirusuri (virusuri cu ARN);2. dezoxiribovirusuri (virusuri cu

ADN). La virusurile fitopatogene (patogene pentru

plante) acidul nucleic este întotdeauna ARN, în timp ce la virusurile zoopatogene şi bacteriofage, poate fi ADN sau ARN.

• Genomul viral conţine între 3 şi 250 de gene şi este componenta esenţială a virusului, deoarece poartă informaţia genetică necesară pentru propria sa replicare și pentru devierea metabolismului celulei gazdă în sensul sintezei celorlalți constituienți ai particulei virale.

• Ribovirusurile constituie un unicat în biologie, în ce priveşte posibilitatea păstrării informaţiei genetice de către ARN.

CAPSIDA (gr. kapsa=cutie) • este formată din mai multe subunităţi de

natură proteică identice, numite capsomere (gr. kapsa+meros=părţi ale cutiei).

• Capsomerele sunt aranjate simetric, numărul lor şi tipul de simetria fiind bine definite pentru fiecare virus în parte.

• Se cunosc 3 tipuri principale de simetrie a capsidei virale.

• 1. Capsida cu simetrie icosaedrică sau cubică dispusă în jurul genomului pliat sub formă de ghem.

• Icosaedrul, prin cele 20 de fețe în formă de triunghiuri echilaterale, 12 vârfuri și 30 de muchii reprezintă forma ideală de dispunere a capsomerelor deoarece asigură minimum de material pentru maximum de volum.

Dispunerea capsomerelor în structura capsidei icosaedrice:

• fețele și laturile sunt formate din hexone (hexamere) (capsomere formate din 6 monomere sau molecule proteice, înconjurate de 6 capsomere identice)

• vârfurile, din pentone sau pentamere (capsomere structurate din 5 molecule proteice) prevăzute cu o prelungire măcicată numită fibra pentonei

• 2. Capsida helicoidală, de forma unui tub cilindric, rezultă din dispunerea capsomerelor în formă de spirală, asemănător unui resort în stare comprimată. Spirala capsomerelor delimitează pe faţa internă a tubului un şanţ în care este aşezat, tot helicoidal, într-un perfect paralelism cu capsida, genomul viral

• 3.Capsida cu simetrie binară sau dublă este caracteristică bacteriofagilor cu cap şi coadă

• Capsida capului este de tip icosaedric, iar capsida cozii este structurată după tipul de simetrie helicoidal

• PERICAPSIDA• La unele virusuri, exterior capsidei se găseşte un înveliş

suplimentar, nimit pericapsidă, anvelopă, sau peplos• Pericapsida derivă din membrana celulei gazdă; în

cursul maturării, virionii ,,înmuguresc" prin membrana celulară pregătită în prealabil prin inserția de glicoproteine virus codificate. Aceste proteine vor proemina sub formă de spiculi pe suprafața anvelopei având, după caz, funcție de liganzi (ex. hemaglutininele), mai rar de enzime (ex. neuraminidaza) sau factori de fuziune a membranelor citoplasmatice. Virusurile lipsite de pericapsidă se numesc virusuri nude.

• Capsida împreună cu pericapsida protejează genomul viral de acţiunea factorilor de mediu şi asigură fixarea

virionului de receptorii celulei gazdă

MULTIPLICAREA VIRUSURILOR ZOOPATOGENE

• Pentru virusuri, termenul de multiplicare nu reflectă întocmai realitatea fenomenelor care au loc în celula gazdă.

• În interiorul acesteia virusurile nu se multiplică ci sunt sintetizate de celulă prin activitatea metabolică a acesteia redirecționată, în urma substituirii informaţiei genetice a celulei cu cea a virusului, către necesitățile replicative ale acestuia.

• Acidul nucleic viral deține informația necesară pentru a dirija propria sa replicare, sinteza proteinelor virale și inhibarea biosintezelor celulare normale

Multiplicarea virusurilor implică următoarele etape succesive:

• adsorbția și penetrarea virionilor în celulă,

• decapsidarea cu eliberarea intracelulară a genomului viral,

• replicarea propriu-zisă,• morfogeneza noilor virioni și • eliberarea acestora din celula gazdă.

1. Adsorbţia sau fixarea virionilor pe celulă

• După o serie de ciocniri întâmplătoare ale virusurilor cu celulele animale și după o fază de adsorbție nespecifică reversibilă, urmează faza de adsorbție ireversibilă la nivelul unor receptori celulari specifici.

• Receptorii sunt reprezentați de grupările chimice ale membranei celulare, complementare sub aspect stereo, electrostatic şi geometric cu capsida sau pericapsida virionului.

• Specificitatea de receptor explică tropismul celular, tisular și de organ al unor virusuri.

2. Pătrunderea virionului în celulă• Pătrunderea virusurile

nude se realizează printr-un proces activ de încorporare din partea celulei, numit viropexie. Membrana celulară se invaginează şi se adânceşte progresiv în dreptul virionului până când acesta este înglobat în celulă.

• La virusurile cu anvelopă,are loc fuziunea acesteia cu membrana citoplasmatică și eliberarea nucleocapsidei direct în citoplasmă.

3. Decapsidarea• După pătrunderea în celulă are loc mai întâi

decapsidarea virusurilor sub acţiunea unor enzime produse de celula gazdă sub determinismul genomului viral.

• Din momentul decapsidării până în momentul apariției noilor virioni, virusul se află în stare vegetativă (subunităţi dispersate în citoplasmă) fiind complet dependent de celula gazdă și lipsit de infecțiozitate.

• Acest interval din replicarea virusurilor poartă denumirea de perioadă de eclipsă deoarece virusurile, lipsite de

4. Replicarea propriu-zisă (Sinteza componentelor virale).

• La scurt timp după pătrunderea în celulă, acidul nucleic viral antrenat la locul replicării îşi preia atributele de material genetic autonom, programând şi dirijând sinteza componentelor virale care include:

-replicarea genomului viral, -sinteza ARNm viral și -sintezele proteice.

5. Morfogeneza virionilor progeni (nou formați)

• Morfogeneza, ca regulă generală, are loc pentru virusurile ARN în citoplasmă, iar pentru virusurile ADN, intranuclear, după migrarea materialului viral din citoplasmă în nucleul celulei gazdă.

6. Eliberarea virionilor din celulăVirionii nou formaţi pot fi eliberaţi din celulă prin mai multe

mecanisme.• 1) Înmugurirea sau burjeonarea este modalitatea de

eliberare a virusurilor cu anvelopă.• 2) Liza celulei gazdă sub acţiunea unor enzime

sintetizate de celulă în ultima fază a morfogenezei virionilor. Acest mecanism, caracteristic bacteriofagilor, se mai întâlneşte la virusurile animale nude.

• 3)Eliberarea virionilor consecutiv morţii celulei şi dezintegrării acesteia. Aceste virusuri apar cel mai târziu, iar punerea lor în libertate se caracterizează printr-o frecvenţă moderată.

• 4) Trecerea virionilor direct la celula adiacentă celei în care a avut loc multiplicarea, prin porii membranei celulare.

• RELAŢIA VIRUS – GAZDĂ.

1. TROPISMUL VIRUSURILOR

• Virusurile animale pătrund în organism pe diverse căi: - digestivă (ex. virusul hepatitei A, enterovirusurile), - respiratorie (ex. virusurile gripale);

- transcutanată (ex. virusul rabic); - genitală (virusul Herpes simplex tip 2, virusul verucilor

umane). Unele virusuri rămân cantonate la poarta de intrare, care poate

constitui în același timp și organul țintă (în virozele respiratorii, enteritele virale, virozele genitale) iar altele sunt diseminate în organism:

- prin intermediul sângelui - diseminare hematogenă (viremie);

- pe cale nervoasă - diseminare neurogenă (neuroprobazie) .

• Virionii diseminaţi în organism se localizează:

- în anumite ţesuturi faţă de care prezintă un tropism special (histotropism) sau

- numai în anumite celule (citotropism).

Virusurile manifestă, de asemenea , genotropism sau afinitate pentru o anumită specie biologică.

Genotropismul a permis împărţirea virusurilor în:

- monopatogene (patogene pentru o specie) şi

- polipatogene (patogene pentru două, trei, sau mai multe specii);

- zoovirusuri;- fitovirusuri; - bacteriofagi și micofagi.

În funcţie de histotropism, virusurile se grupează în :

• - virusuri epiteliotrope (dermatotrope), care au afinitate pentru piele şi mucoase (ex. virusurile variolice , virusul febrei aftoase, virusurile herpetice);

• - virusuri neurotrope, cu afinitate pentru ţesutul nervos (ex. virusul rabic, virusul poliomielitei);

• - virusuri organotrope (viscerotrope), care, la rândul lor, pot fi clasificate în:

- pneumotrope (ex. virusurile gripale, virusul jigodiei);- enterotrope (ex. virusul diareei virale – bolii mucoaselor);- hepatotrope (virusurile hepatitelor);

• - virusuri pantrope, cu afinitate pentru toate țesuturile şi organele bogate în celule mezenchimale (ex. virusurile pestelor la diferite specii animale).

• Citotropismul reprezintă afinitatea virusurilor pentru anumite celule din cadrul aceluiaşi ţesut. Virusul rabic, de exemplu se multiplică de preferinţă în neuronii piramidali din cornul lui Amon, iar virusul poliomielitei, în neuronii motori din coarnele anterioare ale măduvei spinării.

2. TIPURI DE INFECŢIE VIRALĂ • Virusurile pătrunse în organism determină din

partea gazdei reacții de răspuns numite infecții virale sau viroze:

– 1. Infecţiile virale acute (manifeste clinic);– 2. Infecţiile virale persistente, inaparente clinic:

- lente (perioadă lungă de incubație) ;- cronice (după un episod acut, pentru

o lungă perioadă de timp simptomele lipsesc sau sunt slab exprimate ;

- latente (genomul viral se inseră în genomul anumitor celule unde rămâne în stare ocultă o perioadă nelimitată).

- 3. Infecțiile transformante - determinate de virusurile oncogene → la pierderea controlului reglator asupra multiplicării celulare şi implicit apariţia de tumori benigne sau maligne.

• CULTIVAREA VIRUSURILOR ÎN LABORATOR

• Cultivarea pe culturi celulare• Cultivarea pe ouă embrionate

• Cultivarea pe animale de experiență

1. Cultivarea virusurilor pe culturi celulare

• Culturile celulare se obțin din:- țesuturi sau organe proaspăt

prelevate (culturile primare);- țesuturi embrionare; - tumori canceroase (liniile celulare

permanente; ex:HeLa obținută dintr-un carcinom de col uterin ).

Plăci Coli cu medii pentru culturi celulare Monostrat de celule neinfectat

După o perioadă de incubație, necesară replicării virusului, culturile celulare sunt examinate pentru detectarea prezenței acestuia pe baza efectelor produse asupra celulelor parazitate:

• Efectul citopatic :devierea de la forma normală, celule gigante cu numeroși nuclei(sinciții), vacuolizarea citoplasmei

• Transformarea neoplazică (transformarea celulelor normale în celule canceroase)

• Efectul incluziogen (acumulări de virioni sau componente virale) de dimensiuni variabile, numite incluzii virale ).

Efect citopatic (sinciții) produs de virusul Measles (v. rujeolei umane) în filmul liniei celulare

permanente HeLa

Incluzii Babeş-Negri (granulele de culoare roz) în citoplasma neuronilor piramidali

din cornul lui Ammon

2. Cultivarea virusurilor pe embrioni de găină

• Înainte de inoculare ouăle incubate se verifică la ovoscop, în cameră obscură, pentru a le elimina pe cele neembrionate sau cu embrioni morți.

• Suspensia virală preparată din prelevatele patologice se inoculează ținând cont de vârsta optimă a embrionului (6-15 zile) și de calea optimă de inoculare pentru diverse virusuri:

- pe membrana corioalantoidiană (virusurile herpetice, poxvirusurile);

- în cavitatea amniotică sau alantoidiană; (ortomyxo- și paramyxovirusurile);

- în sacul vitelin;- intavenos sau intracerebral

Structura oului embrionat

3. Cultivarea virusurilor pe animale de laborator

• La ora actuală, cultivarea virusurilor pe animalele de laborator este o metodă la care se apelează numai în cazul unor virusuri care nu se pot izola în alte sisteme celulare.

• Pe lângă problema protecției animalelor, experimentarea pe animale de laborator (șoareci albi, șobolani, hamsteri, iepuri etc.) prezintă o serie de inconveniente de ordin practic:

- specificitatea de gazdă a unor virusuri;- reactivarea unor infecții virale latente ale

animalelor în cursul experimentului - inconvenient poate fi evitat prin utilizarea animalelor germ free.

• ACŢIUNEA UNOR AGENŢI FIZICI şi CHIMICI ASUPRA VIRUSURILOR

Cunoaşterea comportamentului virusurilor faţă de factorii fizici şi chimici are implicaţii practice atât pentru identificarea unui virus, cât şi pentru măsurile de

profilaxie nespecifică a bolilor virale.

Temperatura• În general, virusurile sunt sensibile la căldură, unele

inactivându-se în mediul extern la temperatura de 20-22ºC, în decurs de câteva ore. Inactivarea virusurilor are loc în majoritatea cazurilor la 56ºC în 30 minute, iar la 100ºC în câteva secunde. Reacţia febrilă a organismului în cursul infecţiei trebuie privită ca un mijloc de apărare antivirală.

• Temperaturile scăzute au proprietăţi conservante, metoda folosită pentru păstrarea virusurilor în colecţii, luni sau chiar ani de zile, fiind congelarea la – 40 până la – 196ºC .

Variaţiile de pH

• Limitele de pH în care virusurile îşi menţin viabilitatea se situează între 5-9, cu unele excepţii cum ar fi enterovirusurile care îşi păstrează infecţiozitatea şi la pH 2,2

Energia radiantă

• Radiaţiile cele mai active faţă de virusuri sunt ultravioletele în doze mari.

• Efectul acestora este însă diminuat proporţional cu protecţia pe care o exercită asupra virusurilor materia organică în care sunt incluse (secreţii, excreţii, cadavre).

Substanţele chimice

• Diversele substanţe dezinfectante şi antiseptice ca formolul, soda caustică, sublimatul de mercur, soluţiile de iod, soluţiile sărurilor de argint, etc., distrug virusurile, viteza de acţiune fiind în funcţie de durata de contact şi de concentraţia soluţiei.

• Hidroxidul de sodiu (soda caustică) exercită un puternic efect virulicid mai ales în soluţie ferbinte.

• Formaldehida este activă dar acţiunea ei antivirală este mai lentă. Ea se utilizează însă în mod curent la prepararea vaccinurilor inactivate (omorâte), deoarece nu modifică structura antigenică a virusurilor.

• Eterul şi cloroformul au o acţiune electivă, în sensul că sunt inactivante pentru unele virusuri şi inofensive pentru altele, astfel încât sensibilitatea la cele două substanţe reprezintă pentru virusuri, un criteriu taxonomic.

• Glicerina în soluţie salină 50% constituie un bun conservant pentru majoritatea virusurilor, asigurându-le infecţiozitatea luni şi chiar ani de zile.

• Antibioticele şi chimioterapicele de uz curent în terapia antibacteriană și antimicotică (penicilina, streptomicina, tetraciclinele, sulfamidele, cefalosporinele etc., respectiv, stamicina, nistatinul, nizoralul ș.a.), sunt inactive faţă de virusuri.

Agenții antivirali folosiți în terapia virozelor

• Interferonii (IFN) - proteine sintetizate în cursul infecției virale de unele celule ale organismul gazdă (leucocite, limfocitele T). Eliberați din primele celule parazitate de virus, interferonii recunosc receptori specifici pe suprafața celulelor învecinate, de care se fixează, protejându-le.

• Interferonii au un spectru larg de acțiune, în sensul că inhibă replicarea a numeroase alte virusuri , nu numai a virusului care a indus sinteza lor, dar au o strânsă specificitate de specie (ex., protecția omului este realizată numai de IFN uman).

• Deși la ora actuală interferonii sunt produși în cantități mari prin inginerie genetică (gena umană care codifică sinteza IFN α este clonată în celule bacteriene), din cauza efectelor secundare și a prețului prohibitiv, ei sunt utilizați doar în terapia unor viroze umane cronice, agresive cum sunt hepatitele virale B și C.