VALIDAREA METODELOR DE

ANALIZ

1

Validarea unei metode analitice, conformFarmacopeei Statelor Unite ale Americii 28, este procesulprin care se stabilete prin studii de laborator, dac aceametod ndeplinete condiiile pentru aplicaiileanalitice pentru care a fost pus la punct.

Validarea este aadar, o etap important ndeterminarea reproductibilitii i siguranei metodei,deoarece poate confirma dac metoda este potrivitpentru a fi utilizat pentru un anumit sistem.

2

n laboratoarele de analiz, validarea are la bazstandarde, cum ar fi:Bunele practici de producie (Good Manufacturing Practices -GMP)Bunele practici de laborator (Good Laboratory Practices - GLP)Bunele practici clinice (Good Clinical Practices - GCP) etc.

Alte reguli pentru validare sunt stabilite de:Organizaia Internaional a Standardelor (ISO) n seriile 9000i 17025Normele Europene (EN 45001)Farmacopeea Statelor Unite ale Americii (United StatesPharmacopoeia - USP)Agenia Alimentelor i Medicamentului (Food and DrugAdministration - FDA)Agenia pentru Protecia Mediului (Environmental ProtectionAgency - EPA).

3

Este important de precizat c la ora actual nu exist unconsens n ceea ce privete diferitele documente dereglementare internaional (ISO, ICH, Afnor, Sanco, FDA, ANM,Conferina de la Washington) pentru definirea criteriilor caretrebuie testate n faza de validare.

De exemplu criteriul de liniaritate este prezentat diferitde la un document la altul, n cazul n care acesta apare printrecriterii.

Acelai lucru se ntmpl pentru exactitatea mediei carepoate fi confundat cu exactitatea n unele documente.

Ca o parantez, n limba romn confuzia este foarteuoar, datorit faptului c pentru termenii din limba englez ifrancez (trueness/justesse i accuracy/exactitude) exist unsingur cuvnt romnesc - exactitate.

De aceea s-a propus pentru trueness echivalentulexactitatea mediei pentru c se refer la exactitatea dintremedia mai multor msurtori i o valoare convenionaladevrat.

4

Criterii de validare dup Farmacopeea European

Criterii

Determinarea principiului activ sau a produilor

finii

Determinarea impuritilor sau

produilor de degradare

Teste pentru limitele de impuriti

Teste farmaco-tehnice

Fidelitatea(precizia) Da

Da Nu Da

Exactitatea(acurateea)

Nu Nu Da Da

Limita dedetecie

Nu Nu Da Da

Limita decuantificare Nu

Da Nu Da

Specificitatea Da Da Da Da

Intervalul devaliditate

Da Da Da Da

Liniaritatea Da Da Nu Da

RobusteeaDa Da Da Da

5

Criterii de validare dup Comunitatea Economic European (CEE)

METODA CRITERII DE VALIDARE

Identificarea/ detecia specificitatea

Determinarea coninutului de impuriti

specificitatea limita de detecie limita de cuantificare

Determinarea coninutului (concentraiei) sau a activitii substanei active

specificitatea fidelitatea repetabilitatea reproductibilitatea exactitatea liniaritatea intervalul de liniaritate sensibilitatea

6

Normele IUPAC menioneaz c validarea poate fi:

Validare ntr-un singur laborator atunci cnd severific viabilitatea metodei naintea unui studiu ncolaborare (ntre mai multe laboratoare) i asigur faptulc metoda pus la punct este utilizat corect.

Validare complet caracteristicile metodei au fostverificate de multiple laboratoare, n colaborare.

7

SPECIFICITATEA / SELECTIVITATEAn limbajul comun, termenii de specificitate i

selectivitate sunt deseori interschimbabili.O metod este specific dac este adecvat pentru un

singur analit, n timp ce o metod este selectiv dac poate fiutilizat pentru mai muli analii care pot fi ns difereniaisau, cu alte cuvinte, reprezint capacitatea unei metode de acuantifica cu acuratee i specific analitul sau analiii nprezena altor compui.

Selectivitatea implic capacitatea de a separa analitul deproduii de degradare, metabolii (n cazul medicamentelor)i ali compui prezeni n prob.

n cazul medicamentelor, USP 28, definetespecificitatea ca fiind capacitatea de a analiza analitul nprezena altor componeni cum ar fi impuriti, produi dedegradare i matricea. 8

IUPAC i AOAC (Asociaia Stiinific DedicatExcelenei n Metode Analitice) utilizeaz termenul deselectivitate mai mult dect cel de specificitate pentrumetodele care sunt complet selective, pe cnd USP, ICH(Conferina Internaional De Armonizare A CerinelorTehnice Pentru nregistrarea Produselor Farmaceuticede Uz Uman) i FDA folosesc termenul specificitate.

9

n tehnicile cromatografice, selectivitatea metodeipoate fi dovedit printr-o bun separare ntre analit ialte componente (cum ar fi excipieni, impuriti,produi de degradare i metaboliii).

Rezoluia de separare a analitului trebuie s fie de1,5-2 ori mai mare dect a celorlalte componente.

Pentru a mpiedica coeluia altor substane,trebuie s fie cercetat puritatea peak-ului analitului.

De exemplu, pentru a determina puritatea peak-ului se apeleaz la spectrul UV-VIS .

10

Spectrul UV-VIS al analitului poate fi nregistrat lamijlocul peak-ului sau pe pantele peak-ului.

11

Pentru punerea la punct a unei metode de analizntr-un laborator de analiz al medicamentului,selectivitatea poate fi cercetat foarte simplu prininjectarea sau spotarea de etaloane sau martori(blank).

Sistemul cromatografic studiat va trebui srealizeze separarea analitului, iar puritatea iidentificarea peak-ului analitului se va realiza princomparare cu peak-ul etalonului.

12

Peak-ul cromatografic poate fi considerat pur dacfactorul de separare calculat la lungimi de und diferite esteconstant.

Compararea semnalelor la diferite lungimi de undpoate fi utilizat pentru demonstrarea puritii peak-urilor.S-a propus utilizarea limii peak-ului msurat la mijloculnlimii, precum i simetria peak-ului.

Chiar dac peak-urile analitului i a etalonului suntidentice, proba poate conine o impuritate cu spectrusimilar analitului.

Cele mai selective metode de analiz aplicate la probebiologice sunt cele combinate: LCUV; LCMS; GCMS; GCFTIR. 13

LINIARITATEALiniaritatea reprezint capacitatea metodei de a

produce rezultate direct sau indirect proporionale cuconcentraia analitului din prob pe un anumit intervalde concentraii.

De obicei, liniaritatea este reprezentat printr-ocurb de regresie liniar a valorii msurate ca o funcie acreterii concentraiei analitului

Pe de alt parte, liniaritatea rezultatelor uneiproceduri de analiz reprezint capacitatea acesteia de aobine rezultate direct proporionale cu concentraiaanalitului din prob.

Criteriul de liniaritate se aplic pentru rezultateleobinute, adic pentru relaia dintre concentraiacalculat experimental pe baza funciei de rspuns i ceaintrodus (calculat teoretic). 14

Liniaritatea funciei de rspuns poate fi evaluatvizual de pe diagrama ce reprezint modificareasemnalului funcie de coninutul sau concentraiaanalitului.

Dac exist o relaie liniar, testul trebuie s fieevaluat prin metode statistice, de exemplu prin calcululdreptei de regresie folosind metoda celor mai miciptrate.

n anumite cazuri, pentru a obine liniaritateantre rspuns i concentraia probei, dateleexperimentale trebuie supuse unei transformrimatematice nainte de analiza lor prin regresie.

15

n urma analizei de regresie se vor calculaparametri cum sunt: coeficientul de corelaie (r),coeficientul de regresie (r2), interceptul cu ordonata,panta i deviaia standard a dreptei de regresie,suma rezidual a ptratelor etc.

De asemenea, se va reprezenta graficdependena semnalului de concentraia analituluidin prob.

Intervalul de linearitate ce trebuie cercetatdepinde de scopul metodei analitice i se considern general 20% fa de concentraia int, dar poateajunge pn la 150% din concentraia int.

16

Pentru teste de puritate, intervalul n caremetoda trebuie s fie liniar cuprinde limita decuantificare i 30% peste concentraia int.

Testele de stabilitate au un interval de 02% fade concentraia int, iar cele de dizolvare 20% fade concentraia int

Pentru evaluarea liniaritii sunt necesar minim5 valori ale concentraiei pentru cel puin trei seriide soluii de substane standard de diferiteconcentraii (de regul concentraia de interes 20pn la 50% pentru valorile extreme deconcentraie).

Pentru metodele TLC, curba de calibrare trebuieobinut pentru fiecare plac ce va conineetaloanele i probele necunoscute.

17

Metoda statistic cea mai utilizat pentru a gsi ceamai bun corelare ntre curba de calibrare i dateprecum i tipul de curb de calibrare care ofer cea maibun corelare, este regresia liniar sau metoda celor maimici ptrate.

Pentru a compara dou curbe de calibrare estenecesar msurarea celei mai bune corelri a etalonuluila linie, n care scop se utilizeaz parametrii coeficientulde corelaie i eroarea standard a regresiei.

Coeficientul de corelaie, este o msur a asocieriiliniare dintre dou variabile, cu alte cuvinte a gradului ncare reprezentarea bivariat sub forma unei diagrame demprtiere se apropie de o dreapt.

18

Coeficientul de corelaie ia valori intre -1 i +1inclusiv, cu semnificaia de asociere pozitiv /negativ dup semnul coeficientului i de lipsa deasociere pentru rxy = 0.

O valoare de +1 indic o relaie liniar perfectntre semnalul analitic i concentraie cu semnaluln cretere, iar o valoare -1 indic o relaie liniarperfect cu semnalul analitic n scdere.

Coeficientul de corelaie nu indic liniaritateadac nu are o valoare ce depete r = 0,999.

Pentru valori mai mici trebuie calculai i aliparametri, ca de exemplu testul ANOVA pentruregresie.

Cea mai comun metod de calibrare const nprepararea unor soluii standard de concentraiecunoscut, ce acoper domeniul de concentraie ncare se afl proba de analizat.

19

EXACTITATEA MEDIEI(BIAS = EROARE SISTEMATIC)

Exactitatea mediei unei proceduri analiticeexprim ngustimea acordului ntre valoarea medieobinut dintr-o serie de msurtori i o valoare careeste acceptat fie ca valoare convenional adevrat,fie ca valoarea acceptat (de exemplu, standardinternaional, standard al farmacopeei).

20

PRECIZIA Precizia exprim ngustimea acordului (gradul

de dispersie, coeficientul de variaie) dintre o serie demsurtori care provine din mai multe serii aleaceleiai probe omogene (rezultate independente) ncondiii identice de lucru.

Precizia ofer date asupra erorilorntmpltoare i nu are nici o legtur cu valoareaadevrat. Deoarece toate msurtorile conin erorintmpltoare, rezultatul unei singure msurtori nupoate fi acceptat ca valoare adevrat.

Pentru a prezice domeniul n care se gsetevaloarea adevrat este necesar o estimare a acesteierori, acest lucru fcndu-se prin repetareamsurtorii de mai multe ori.

Din acest proces se obin doi parametriimportani i anume valoarea medie i variabilitateamsurtorilor.

21

Cea mai utilizat modalitate de msur a valoriimedii este media aritmetic, calculat utiliznd formula:

(suma valorilor msurtorilor raportat la numrultotal de msurtori).

Deoarece erorile ntmpltoare sunt distribuitenormal, modul comun de msur a variabilitii(preciziei) este deviaia (abaterea) standard ().

Valoarea deviaiei (abaterii) standard se calculeazutiliznd relaia:

n

xx

n

ii

== 1_

n

xxn

ii

=

= 1

2_

22

Dac setul de date este limitat, valoarea medieeste adesea aproximat ca valoare adevrat, fiindnecesar estimarea abaterii standard. n acest caz,valoarea abaterii standard, notat cu SD, se calculeazcu formula:

Odat ce numrul de valori din setul de datecrete, valoarea SD se va apropia de valoarea .

11

2_

==

n

xxSD

n

ii

23

Un alt termen comun utilizat pentru a msuravariabilitatea este coeficientul de variaie (CV) saudeviaia standard relativ (RSD), care se exprim caprocent, conform formulei de mai jos:

sau

Criteriul acceptat pentru valoarea abateriistandard relative (RSD) n studiul preciziei metodeieste RSD 2% (n 6).

Precizia este important n mod particular atuncicnd n analiz este implicat i o etap de pregtire aprobei.

_

x

SDRSD = 100% _ =x

SDRSD

24

Variabilitatea poate afecta exactitatea.Se cunoate faptul c reproductibilitatea unei

analize descrete disproporional cu scdereaconcentraiei.

Incertitudinea n analiza urmelor creteexponenial comparativ cu componenii majori iminori.

De la acest fapt pot aprea abateri n situaiile ncare exist etape de pregtire a probei.

Pe de alt parte, modul de pregtire a probeirmne un proces riguros care influeneazmajoritatea variabilitilor.

25

Precizia caracterizeaz gradul de concordan arezultatelor analitice ntre ele, la aplicarea repetat ametodei de analiz pe aceeai prob omogen saueantion pregtit pentru analiz n condiii identice.

Precizia arat ct de aproape se afl valorilemsurate una fa de alta pentru un numr demsurtori n aceleai condiii.

Normele elaborate de ICH (InternationalConference of Harmonization) definesc precizia cafiind format din 3 componente: repetabilitatea,precizia intermediar i reproductibilitatea.

26

Repetabilitatea: rezultatele independente suntobinute folosind aceeai procedur, pe probeidentice, n acelai laborator, de ctre acelaioperator, utiliznd acelai echipament i ntr-uninterval scurt de timp.

Repetabilitatea analizei (precizia intra prob)se studiaz utiliznd un minim de 9 determinriacoperind domeniul specific de concentraie (deexemplu 3 determinri la 3 valori ale concentraiei),sau un minim de 6 determinri la o valoare de 100%din concentraia soluiei ce urmeaz a fi testate.

27

Precizia intermediar: rezultatele independentesunt obinute folosind aceeai procedur, pe probeidentice, n acelai laborator, de ctre diverioperatori, folosind echipamente diferite i ntr-uninterval de timp dat.

Reproductibilitatea: rezultatele independentesunt obinute folosind aceeai procedur, pe probeidentice, n laboratoare diferite, de ctre diverioperatori i folosind echipamente diferite.

28

ACURATEEA (EXACTITATEA)Normele elaborate definesc acurateea

(exactitatea) ca o caracteristic a apropieriirezultatelor analitice de valoarea adevrat.

Exactitatea este o msur a deviaiei valoriimedii gsit prin analiz, fa de valoarea adevrat.

Acurateea se evalueaz prin aplicarea metodeide analiz studiat, la probe cu concentraiicunoscute.

La efectuarea acestor analize probele seanalizeaz fa de soluii etalon corespunztoare saufa de martori, pentru a se nltura astfel efectulinterferenelor.

29

O alt variant este constituit de compararearezultatelor obinute prin metoda nou cu celeobinute printr-o metod deja cunoscut, despre carese tie c prezint acuratee.

Pentru substane medicamentoase, testul deacuratee se efectueaz frecvent prin adugarea uneicantiti cunoscute din analit, prin cntrire sau prinmsurarea unui volum de soluie (analit dizolvat nsolvent), la soluia placebo, astfel nct s se obinconcentraii cu valori n domeniul de detecie alanalitului.

Pentru forme farmaceutice cum suntcomprimatele, supozitoarele, cremele etc., acest faptpoate nsemna evaluarea potenialelor interaciuniale substanei active cu excipienii n soluie.

30

Acest test evalueaz specificitatea metodei nprezena excipienilor n condiiile utilizate pentruanaliza acelui compus activ.

Se recomand ca studiile de exactitate pentrusubstane active sau diverse produse s seefectueze la nivele de 80%, 100% i 120% (uninterval de 80 120% sau chiar 75 125% dinconcentraia real).

Aceste soluii se utilizeaz pentru studiile deacuratee numite amestecuri sintetice saupreparate realizate n laborator.

n cazul metodei de analiz prin adaos destandard, concentraia dispersat este n intervalul50 150% din valoarea de interes i se realizeazprin dispersarea concentraiilor cunoscute deanalit n probe biologice (ser, plasm etc.).

31

La fiecare nivel de concentraie studiat seevalueaz probe replicate.

Valoarea deviaiei standard relative (RSD) arezultatelor obinute n urma calculului pe acesteprobe replicate vor furniza variaia analizei sauprecizia metodei.

Valoarea medie reprezentat ca procent indicexactitatea metodei.

Pentru evaluarea acurateii se calculeazregsirea n procente, calcule ce se fac pe bazarezultatelor experimentale obinute.

Intervalul n care se accept rezultatele testuluide regsire este cuprins ntre 98 i 102% sau 95 i105%. 32

Pentru probele biologice, regsirea poate fi 20%din concentraia real.

n cazul determinrii unui analit aflat n urme,criteriile de acceptare sunt cuprinse ntre 80 120%,pentru mai mult de 100 ppb i 60 100%, sub 100 ppb146.

Pentru impuriti, criteriile acceptate sunt 20%,pentru o concentraie a impuritilor 0,5% i de 10% pentru o concentraie de impuriti 0,5% 146.

Pentru a elimina posibilele erori ce pot apare peparcursul determinrilor, se va calcula mediavalorilor obinute.

33

Valorile acceptate n studiul acurateii i preciziei pentru diferite concentraii de analit

Concentraia uniti regsirea precizia analitului(%) medie (RSD %)

34

LIMITA DE DETECIE

Limita de detecie (LD) reprezint cantitateaminim dintr-un anumit component ce se poate punen eviden, fa de o prob martor, cu o anumitlimit de ncredere (n general 1%).

n metodele cromatografice estimarea LD seefectueaz pe baza evalurii raportului semnal/zgomot de fond (linie de baz).

Pentru estimarea limitei de detecie, ngeneral se consider acceptabil un raport semnal /zgomot de 3/1 sau 2/1.

35

Estimarea LD se mai poate face i pe baza deviaieistandard i a pantei dreptei de regresie i se realizeaz utilizndformula:

unde reprezint deviaia standard a dreptei de regresie, iar Preprezint panta dreptei de regresie.

Pentru estimarea deviaiei standard a dreptei de regresie se potutiliza mai multe metode: pe baza deviaiei standard a probelor martor se msoarmagnitudinea semnalului de fond pentru un numr mare de probemartor i se calculeaz deviaia standard a valorilor obinute; pe baza curbei de calibrare trebuie s se construiasc i s sestudieze o curb de calibrare specific folosind probe ce coninanalitul ntr-un domeniu de concentraie apropiat de limita dedetecie.

3LDP

=

36

LIMITA DE CUANTIFICARE (LQ)

Limita de cuantificare (LQ) reprezint cantitateaminim dintr-un anumit component identificat ce se poatecuantifica cu certitudine.

Estimarea LQ pe baza evalurii raportuluisemnal /zgomot se realizeaz prin comparareasemnalelor msurate pentru probe cu o concentraiesczut i cunoscut a analitului i probe martorurmat de stabilirea concentraiei minime la careanalitul poate fi cuantificat cu fidelitate.

Pentru estimarea limitei de cuantificare, ngeneral se consider acceptabil un raport semnal /zgomot de 10/1.

37

Valoarea estimat trebuie s fie validat prin analizeindependente a unui numr adecvat de probe la care secunoate faptul c sunt preparate astfel nct sa coninconcentraii aproape de limita de cuantificare.

n general, limita de cuantificare (LQ) se calculeazprin multiplicarea cu 3 a limitei de detecie (LD):

LQ = 3 x LD

38

ROBUSTEEA I STABILITATEA METODEI

Robusteea unei metode analitice se definete prinmsurarea capacitii metodei de a rmne neafectat de variaiimici, deliberate, ale unor parametri. De aceea, parametrul ofer oindicaie a reabilitrii metodei pe parcursul utilizrii.

Dac msurtorile sunt susceptibile de variaii n ceea ceprivete condiiile analitice, aceste condiii trebuie s fie controlatesau trebuie luate anumite msuri de precauie.

O consecin a robusteei este aceea c se stabilesc o serie deparametri de sistem pentru a ne asigura c validitatea procedeuluianalitic se menine ori de cte ori se utilizeaz.

Stabilitatea unei metode analitice reprezint gradul dereproductibilitate a rezultatelor obinute pe aceeai prob, ncondiii diferite, cum sunt: laboratoare diferite, analiti diferii,aparatur diferit, diferite loturi de reactivi, zile diferite de lucruetc. 39

n studiul robusteii metodelor cromatografice pestrat subire trebuie studiat influena pe care omanifest urmtorii factori:

temperatura; umiditatea; metoda de aplicare a spoturilor; forma i mrimea spoturilor; compoziia fazei mobile; pH-ul; tipul de strat subire utilizat; volumul de prob aplicat; forma bacului; condiiile de uscare a placilor.

40

Pentru metodele HPLC trebuie studiat influenaurmtorilor factori asupra robusteii metodei:

viteza de curgere a fazei mobile; temperatura n coloan; tipul de coloan cromatografic; volumul injectat; compoziia faze mobile; pH; lungimea de und de detecie.

41

Pentru studii pe lichide biologice, trebuie cercetatstabilitatea analitului n mediul biologic.

Trebuie cercetat o eventual degradare n perioadadintre recoltarea probei i analiz.

Instabilitatea analitului poate fi provocat de diverifactori, precum: interaciuni cu recipientul, aerul,descompunerea termic, evaporarea componenilor volatili saufotoliz.

Pentru a limita degradarea pot fi efectuate uneleprelucrri ale probei precum rcirea sau chiar congelareaprobei, pstrarea n loc ferit de lumin, adugarea unor agenistabilizani, ajustarea pH-ului, derivatizarea, utilizareainhibitorilor enzimatici.

42

Validarea metodelor analitice trebuie efectuat dectre toate laboratoarele de analiz i urmrete testareaparametrilor principali ai validrii pentru a asiguraacurateea, precizia, specificitatea, reproductibilitatea irobusteea metodei pentru intervalul de concentraie ncare poate fi studiat analitul.

43

VALIDAREA METODELOR DE ANALIZSlide Number 2Slide Number 3Slide Number 4Slide Number 5Slide Number 6Slide Number 7Slide Number 8Slide Number 9Slide Number 10Slide Number 11Slide Number 12Slide Number 13Slide Number 14Slide Number 15Slide Number 16Slide Number 17Slide Number 18Slide Number 19Slide Number 20Slide Number 21Slide Number 22Slide Number 23Slide Number 24Slide Number 25Slide Number 26Slide Number 27Slide Number 28Slide Number 29Slide Number 30Slide Number 31Slide Number 32Slide Number 33Slide Number 34Slide Number 35Slide Number 36Slide Number 37Slide Number 38Slide Number 39Slide Number 40Slide Number 41Slide Number 42Slide Number 43