UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

CICLUL 1. LICENTA IN BIOCHIMIE

Biochimie metabolica

Digestia proteinelor exogene

Absorbtia intracelulara a aminoacizilor

Degradarea proteinelor endogene

DEGRADAREA PROTEINELOR EXOGENE

1

La nivelul stomacului

Cardia – in principal celule secretoare de mucus Fundus (corpul) – celule parietale producatoare de acid, celule principale – proiducatoare de pepsinogen Pilor – productie de gastrina (hormon)

Functii

Amestecarea hranei cu acid/pepsina

Mediu acid (pH 1,5-2,0) necesita o bariera constituita dintr-o mucoasa gastrica superficiala, i n t e g r i t a t e a e p i t e l i a l a s i tamponarea cu bicarbonat

Activarea pepsinogenului

pepsinogen

pepsina + INP + 5 peptide inactive

MM 40,4 kDa

32,7 kDa 3 kDa

Se scindeaza 9 legaturi peptidice, modificari conformationale cu forma centrului catalitic activ

pH < 5

autocatalitic

Pepsina – endopeptidaza, pH optim 2-3, catalizeaza intr-o prima etapa hidroliza legaturilor peptidice la care participa prin gr carbonil resturile de Phe, Tyr, Trp

2

3

La o hidroliza mai indelungata exista si situsuri de atac minore

Produsii digestiei peptice: polipeptide peptice

La nivelul intestinului subtire

Isi varsa secretia pancreasul: 1,2 – 1,5 litri/zi, apa, electroliti (ioni bicarbonat), zimogene ale unor enzime proteolitice, amilaza, lipaze, etc (pH usor alcalin 7-8 neutralizeaza aciditatea gastrica

Zimogenele trec din RE in Ap. Golgi unde se acopera cu o membr lipoproteica formand asa numitele granule de zimogen - secretate un duoden ca urmare a unui semnal hormonal sau impul nervos

Intr-o prima etapa are loc activarea tripsinogenului la tripsina activa, care are loc sub actiunea enterokinazei, Ca2+ si autocatalitic

4

NH2 6 7 8 COOH

Lys-Ile-Val-

NH2 Lys COOH + NH2 Ile Val COOH

tripsinogen

tripsina

enterokinaza

Activarea tripsinogenului consta intr-un proces de proteoliza limitata, scindarea unei singure legaturi peptidice, indepartarea unei hexapeptide N-terminale si plierea polipeptidei C-terminale cu formarea conformatiei catalitic active

+ autocatalitic

Tripsina - erndopeptidaza, 24 kDa, actioneaza optim la pH 8,0 hidrolizand legaturile peotidice la care participa prin gr carbonil resturi de Lys si Arg

Substratele tripsinei – produsii peptici

Produsii hidrolizei tripsinei – produsii triptici

Tripsina incepe sa activeze celelalte zimogene:

chimotripsinogen chimotripsine

proelastaza elastaza

procarboxipeptidaze carboxipeptidaze

1 A 13 16 B 146 149 C 245

S-S S-S S-S

S S S S α

1 15 16 245 π S S

1 245 chimotripsinogen

chimotripsine

tripsina

Ser14-Arg15

Thr147-Asn148

5

6

Chimotripsinele – endopeptidaze – care scindeaza preferential legaturi peptidice la care participa prin grupari carbonil resturi: Tyr, Trp, Phe si Met

- familie de enzime (Nu! Izoenzime) formate prin proteoliza limitata, treptata, a zimogenului

- de la π α creste stabilitatea si scade activitatea

Elastaza – endopeptidaza care scindeaza legaturi peptidice la care participa prin grupari carboni resturi de aminoacizi mici: Gly, Ala, Val – denumirea de la substratul natural elastina din miofibrilele aortei

Carboxipeptidazele – exopeptidaze ce catalizeaza hidroliza resturilor de aminoacizi din pozitie carboxil-terminale

…….NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-…..NH-CH-CO-NH-CH-COOH

Ra Rb Rc Rn-1 R

Carboxipeptidaza A actioneaza nespecific; carboxipeptidaza B hidrolizeaza preferential resturi de Arg si Lys

7

Pancreasul este protejat contra activarii timpurii a zimogenelor prin 3 mecanisme:

1)  Sinteza enzimelor proteolitice sub forma de zimogene;

2)  Co-sinteza unor inhibitori naturali ai tripsinei, chimotripsinei, carboxipeptidazelor

3)  Inglobarea precursorilor enzimatice in granulele de zimogen

8

Comparatie intre chimotripsina, tripsina si elastaza

40 % din structura lor primara identica

Structuri 3-D asemanatoare

Diferente mari la nivelul centrului catalitic activ

Evolutie moleculara divergenta Asp

Val Thr

chimotripsina

tripsina COO─-

elastaza

Phe,Tyr,Trp,Met

Arg+,Lys+

Gly

Comparatie chimotripsina, subtilizina

Enzime diferite care au suferit o evolutie moleculara convergenta privind solutia de a creste caracterul nucleofil din centrul catalitic activ al enzimei

102 57 195 chimotripsina

32 64 221 subtilizina

Asp His Ser

ABSORBTIA INTRACELULARA A AMINOACIZILOR

Transpeptidaza MP

NH2-CH-COOH

R

Glutation Cys-Gly

Cys γ-Glu-Cys

γ-glutamil aminoacid

5-oxoprolina

Glu

Gly ATP

ATP ATP 5-oxoprolinaza

Ciclul γ-glutamil la mamifere

Deficienta in 5-oxoprolinaza, acumulare de 5-oxoprolina, indivizi inapoiati mental

9

aminoacid

DIGESTIA INTRACELULARA A PROTEINELOR

Degradarea proteinelor endogene in cadrul turnoverului proteinelor

– permite eliminarea proteinelor mutant sau pliate gresit (Hb normala – 120 zile; Hb mutante – minute)

- Modalitate de reglare a metabolismului (enzime comune – viata lunga; enzime reglatoare – viata scurta)

- Viteza degradarii proteinelor endogene depinde de starea nutritionala, de hormoni

2 cai de degradare a proteinelor

- Mecanismul neselectiv lizozomal (cu catepsine)

- Mecanismul selectiv citosolic, ATP-dependent, in complexe multienzimatice numite proteasomi

10

Degradarea lizozomala

-realizat cu catepsine – endoproteinaze de pH 5 si aminopeptidaze– care protejeaza celula contra scurgerii accidentale a enzimelor lizozomiale, care devin inactive la pH citosolic -experienţe cu derivaţi ai chininei – baze slabe care patrund in lizozomi in stare neincarcata, se protoneaza in lizozomi datorita pH lizozomial (5) unde inhiba functia lizozomilor -aceste studii au demonstrat care din proteinele endogene sunt degradate lizozomial Epuizarea musculara in cazul lipsei de miscare; Regresia uterului la nastere [ de la 2 Kg la 50 g in 9 zile] Diabet Traumatisme Artrita reumatoida Nu este afectata degradarea proteinelor anormale si cu viata scurta

11

Mecanism selectiv citosolic

Ubichitina

Proteina de 76 aminoacizi, 8,5 kDa

Termo-stabila

Pliata intr-o structura globulara

Gasita in toate celulele eucariote, proteina de la om si drojdie difera prin 3 aminoacizi

Implicata in multe proteine celulara

Implicata 2 etape:

Atasarea covalenta a unor multiple molecule de ubichitina la proteina condamnata (Pc)

Degradarea Pc marcate cu ubichitina si degradarea ei in proteasomul 26 S (ubichitina este reciclata)

12

Proteasomul organit “profesional” de degradare a proteinelor

are o activitate proteazica ATP-dependenta

reprezinta circa 1 % din proteinele celulare

prezent sub forma mai multor copii in citosol si nucleu

forma de cilindru gol de 20 S format din mai multe subunitati – unele sunt proteaze active cu centre catalitic active in interiorul cilindrului

Capetele cilindrului sunt asociate cu un complex proteic mare, 19 S cap, de circa 20 polipeptide distincte.

13

14

In celulele eucariote exista 2 tipuri de proteazomi: 20 S si 26 S

Proteazomul 26 S este compus din proteazomul 20 S si doi reglatori de 19 S (cap) cu activitate ATPazica

15

Mai mult de 80 % din proteine se pliaza incorect, scapa actiunii chaperonilor 1/3 din catenele polipeptidice nou sintetizate sunt selectate pentru degradare In cazul unor glicoproteine pliate necorespunzator, ele sufera translocare in citosol – unde sunt indepartate oligozaharidele sub actiunea unei N-glicanaze

16

17

Exista multiple variante de mono- si poli-ubichitinare

E1 – enzima de activare a ubichitinei (Ub) Se formeaza o legatura tiol esterica macroergica int re Gly-COOH terminala din Ub si Cys din situsul activ al E1 (ATP/AMP) E2 – enzima de conjugare a Ub Ub este transferata la Cys din E2 cu formarea unei noi legaturi tiol esterice E3 – Ub ligaza Se formeaza o legatura izopeptidica intre gr COOH terminala a Gly-Ub si o grupare ε-amino dintr-un rest de Lys din proteina condamnata

18

Ub + ATP D Ub–AMP + PPi Ub–AMP + E1-SH D E1-S–Ub + AMP ______________________________ Ub + ATP → E1-S–Ub + AMP +PPi

Poli-ubichitinarea are loc sub actiunea altei enzime E4

Care catalizeaza adaugarea de resturi Ub la resturi Lys dintr-o alta molecula de Ub

19

Dezubichitinarea are loc sub actiunea unei enzime DUB (deubiquinating enzyme). Monomerii Ub pot relua ciclul

20

Ce determina ca o anumita proteina sa fie condamnata acestei degradari, sa fie ubichitinata selectiv ? Ce mecanism recunoaşte si degradeaza proteine anormale, incomplet sintetizate, pliate gresit, etc ?.

N-end rule

Odata Met indepartata, anumite resturi de aminoacizi N-terminale reprezinta semnale de recunoastere pentru calea ubichitinarii: Arg, Lys, His

Se pare ca E3 recunoaste aminoacizi specifici de la capatul N a unei proteine

Regula nu este universala

21