Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

286
Universitatea de Medicina si Farmacie „Victor Babes” Timisoara Analogii-GnRH in reproducerea umana asistata Tehnici actuale in reproducerea umana asistata – ICSI si crioconservarea Doctorand: Muresan Maria-Cezara Conducator stiintific Academician Prof. Dr. Ioan Munteanu 2005

description

Agonisti GnRh versus Antagonisti GnRh in ART

Transcript of Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

Page 1: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

Universitatea de Medicina si Farmacie „Victor Babes”

Timisoara

Analogii-GnRH in reproducerea umana asistata

Tehnici actuale in reproducerea umana asistata – ICSI si

crioconservarea

Doctorand: Muresan Maria-Cezara

Conducator stiintific

Academician Prof. Dr. Ioan Munteanu

2005

Page 2: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

Universitatea de Medicina si Farmacie „Victor Babes”

Timisoara

Analogii-GnRH in reproducerea umana asistata

Tehnici actuale in reproducerea umana asistata – ICSI si crioconservarea

Dr. Muresan Maria Cezara

Conducator stiintific Academician Prof. Dr. Ioan Munteanu

Page 3: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

II

Cuvant inainte

Sterilitatea / infertilitatea ca patologie ocupa un loc important in cadrul ginecologiei.

Adeseori tratamentul sterilitatii necesita timp si rabdare din partea pacientei, succesul (obtinerea

sarcinii) fiind si el asteptat in timp. Cu tot ajutorul medical acordat, ramane un procent din

cuplurile cu sterilitate care nu vor concepe. Numarul acestor cupluri a fost insa influentat odata

cu introducerea fertilizarii in vitro – o realizare de seama a secolului XX. Problema conceptiei in

exteriorul organismului i-a preocupat pe oamenii de stiinta cu multe decade in urma. La

inceputul secolului XX (1900) este citat biologul Ilya Ivanov cu cercetarile sale despre

inseminarea artificiala la animale. Initial studiile s-au limitat la animale. Cand s-a observat ca

incercarile au dat roade, s-a trecut si la aplicarea acestor proceduri la om. Pionierii in acest

domeniu sunt considerati a fi britanicii P. Steptoe si R.G. Edwards, carora le datoram fertilizarea

in vitro de astazi. Ei sunt cei care au reusit fecundarea in vitro a gametilor feminin si masculin,

cu obtinerea embrionului, implantarea sa intrauterina, si obtinerea unei sarcina ce s-a finalizat cu

nasterea primului “copil in eprubeta” (notiune ce avea sa se incetateneasca mai tarziu). Ei si-au

anuntat succesul printr-un scurt articol intr-o revista de specialitate. Acestui prim success i-au

urmat multe altele si in curand tehnica fertilizarii in vitro s-a extins pe aproape intreg globul.

De-a lungul anilor s-au adus imbunatatiri ale metodei si s-au dezvoltat noi tehnici, mai

performante, care sa permita cresterea ratei sarcinilor la cuplurile cu sterilitate. Fertilizarea in

vitro poate fi considerata, pe drept cuvant, una dintre minunile lumii, reprezentand o cucerire

fantastica a stiintei, totodata, implinind visul multor cercetatori. Astfel, prin fecundarea in vitro

s-au rezolvat problemele multor familii fara copii, carora pana atunci le era imposibil sa

conceapa.

La noi in tara meritul introducerii acestei metode ii apartine Academicianului Prof. Dr.

Ioan Munteanu, cu o veche preocupare in domeniul sterilitatii si care a luptat pentru progresul

medicinei romanesti. Chiar de la prima fertilizare in vitro efectuata la 20.05.1995, in cadrul

Centrului de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din

Clinica Universitara de Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara, s-a si obtinut sarcina. La

6.02.1996 s-a nascut primul roman „din eprubeta”.

Am avut sansa de-a ma numara printre invataceii d-lui Acad. Prof. Dr. Ioan Munteanu,

care mi-a calauzit pasii spre acest capitol al ginecologiei – sterilitatea - si in final tratamentul

Page 4: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

III

sterilitatii – tehnicile de reproducere asistata. Acesta este in parte si motivul pentru care am ales

reproducerea asistata ca tema pentru teza de doctorat.

Doresc pe aceasta cale sa aduc multumirile mele si profunda recunostiinta d-lui Acad.

Prof. Dr. Ioan Munteanu, personalitate marcanta in ginecologia din Romania, conducatorul

stiintific al prezentei teze de doctorat. De asemenea ii sunt recunoscatoare pentru generozitatea

cu care mi-a indrumat cercetarea, pentru materialul bibliografic pe care mi l-a pus la dispozitie,

pentru indicatiile competente pe care mi le-a oferit si care sunt izvorate dintr-o inegalabila

experienta si valoare, cat si pentru sustinerea in definitivarea acestei teze.

Pentru aprofundarea cunostintelor in domeniul reproducerii umane am beneficiat de o

bursa DAAD (Deutscher Akademischer Austauschdienst) in cadrul pregatirii pentru doctorat si

am urmat un stagiu de 6 luni la Clinica Universitara de Ginecologie, Heidelberg, Germania, in

Departamentul de Fertilizare in Vitro. Acest departament are o veche traditie in tratamentul

sterilitatii si in tehnicile reproducerii umane asistate. Am avut la dispozitie material bibliografic,

acces la baza de date si am lucrat efectiv in cadrul acestei sectii. Ii multumesc colectivului

acestui departament, condus de Prof. Dr. Thomas Strowitzki si Prof. Dr. Thomas Rabe, care au

avut intotdeauna un sfat competent pentru cercetarea mea.

Multumirile mele se indreapta si catre dl. Prof. Dr. Virgil Ancar, Spitalul Sf. Pantelimon -

Bucuresti, care a condus cursul si stagiile de pregatire in cadrul supraspecializarii de fertilizare in

vitro, pe care am urmat-o. Cu Domnia sa mi-am sustinut examenul de supraspecializare in anul

2005. Cu ocazia efectuarii acestei supraspecializari am beneficiat si de cunostintele d-lui Prof.

Ancar, o personalitate de seama in domeniul reproducerii umane asistate in Romania.

Nu in ultimul rand doresc sa-i multumesc familiei mele, care m-a sustinut si m-a incurajat

in realizarea - si mai ales in finalizarea tezei si care m-a impulsionat in momentele mai dificile

din conceperea lucrarii.

Page 5: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

IV

Introducere

Lucrarea de fata s-a conturat si a luat nastere in urma sfaturilor competente ale d-lui

Academician Prof. Dr. Ioan Munteanu, renumita personalitate a ginecologiei romanesti,

recunoscuta si peste hotare, initiatorul fertilizarii in vitro in tara noastra. Domnia sa este

conducatorul stiintific al acestei teze.

O serie de date si informatii am avut ocazia sa le obtin de la Departamentul de Fertilizare

in Vitro din cadrul Clinicii Universitare de Ginecologie din Heidelberg, Germania. Acolo am

urmat un stagiu de 6 luni in cadrul unei burse doctorale DAAD.

Subiectul acestei teze abordeaza tratamentul modern al sterilitatii, si anume reproducerea

umana asistata. Este un domeniu unde cercetarile, si mai ales cele legate de capitole intricate, ca

embriologia si diagnosticul genetic preimplantational – asteapta inca multe raspunsuri si noi

descoperiri.

Am ales in partea generala a tezei, pentru inceput, descrierea hormonului hipotalamic

GnRH, precum si motivele si criteriile pentru care acesta este considerat a avea rol central in

reproducerea umana. Am insistat asupra unor aspecte moderne, descrise mai recent, si anume

activitatea generatorului de pulsuri-GnRH. La fel sunt expuse si amanunte legate de receptorii-

GnRH. Din structura hormonului hipotalamic au derivat substante cu mecanism analog –

agonistii- si antagonistii-GnRH (Capitolul 1).

In acest mod am efectuat o trecere spre clasa de substante - a analogilor-GnRH, care sunt

utilizate pe scara larga in reproducerea umana asistata. Rolul lor este de-a produce o supresie a

functiei hipofizare. Protocoalele cu agonisti-GnRH sunt cunoscute si sunt aplicate mai demult,

spre deosebire de protocoalele cu antagonisti-GnRH, care sunt de data mai recenta. Cele 2 tipuri

de analogi inca constituie subiect de dezbatere si controverse referitor la impactul lor asupra ratei

sarcinilor in urma tehnicilor de reproducere asistata. Am descris structura substantelor agoniste si

antagoniste, inclusiv exemple de preparate utilizate in practica clinica. Am subliniat avantajele si

dezavantajele acestor doua clase de substante si am detaliat protocoalele terapeutice. Totodata

am expus si datele statistice din studii de specialitate, din literatura internationala, cu referire la

diversele tipuri de protocoale (Capitolul 3).

In cadrul stimularii ovariene controlate se utilizeaza clomifen citratul, gonadotropinele,

combinarea celor doua sau asocierea gonadotropinelor. Dupa ce am trecut in revista un scurt

Page 6: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

V

istoric al preparatelor gonadotropinice, m-am axat pe descrierea mecanismului cresterii foliculare

sub actiunea gonadotropilor hipofizari, inclusiv teoria celor doua compartimente celulare. Am

considerat necesara amintirea si detalierea mecanismului intim al recrutarii si dezvoltarii

folicolului dominat pentru a justifica semnificatia gonadotropinelor in reproducerea umana

asistata.

Un ultim capitol al partii generale se refera la tehnicile reproducerii umane asistate. Initial

am descris fertilizarea in vitro conventionala, clasica, si mai apoi tehnicile de micromanipulare a

gametilor umani, culminand cu metoda microinjectarii intracitoplasmatice a unui singur

spermatozoid in ovocit – metoda ICSI si care scurtcircuiteaza toate barierele ce stau in calea

patrunderii spermiei in ovocit. In completarea descrierii acestor tehnici, cu amanunte si din

partea de biologie, am adus cateva imagini din microscopie ale ovocitelor, a celulelor in stadiul

de prezigot si a embrionilor. In finalul partii generale am amintit si studii din literatura, care

redau rezultate ale tehnicilor reproducerii umane asistate.

Pentru a se putea aplica metodele reproducerii umane asistate este deci nevoie de a

stimula controlat ovarul (este vorba de o suprastimulare controlata) prin terapie cu gonadotropine

(modern cu preparate sintetizate genetic), motiv pentru care am insistat asupra preparatelor

gonadotropinice, in capitolul 2. Pentru a evita cresterea prematura a LH-ului endogen, fiind

cunoscute efectele sale negative asupra maturarii foliculare si pentru a evita o ovulatie

necontrolata in cadrul schemelor de stimulare ovariana, se doreste inhibarea hipofizei. In acest

scop se administreaza agonistii- sau antagonistii-GnRH. In acest mod am conceput si am

structurat partea initiala a tezei – partea generala.

Partea speciala este o expunere comparativa, in cadrul unui studiu propriu, a

protocoalelor cu agonisti- si antagonisti-GnRH, in ideea de-a desprinde unele observatii

referitoare la influenta lor asupra ratei sarcinilor, obiectivul final al reproducerii umane asistate.

Studiul este unul retrospectiv, intins pe o perioada de 3 ani (1999; 2000 si 2001). In cadrul

acestei analize am luat in calcul o serie de factori, incercand sa gasesc corelatii intre varsta

pacientei, durata si doza stimularii ovariene cu gonadotropine, nivelul estradiolului seric obtinut

in ziua inducerii ovulatiei, cu rasunet asupra raspunsului ovarian. Pentru fiecare an si grup de

paciente din cadrul fiecarui protocol sunt redate procentele tehnicilor reproducerii umane asistate

aplicate si a rezultatelor lor: numarul de ovocite recoltate, numarul de celule fecundate.

Page 7: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

VI

Subcapitolele „Observatii” cuprind detaliat complicatiile de tipul raspunsului redus („low

response”) sau a celui exagerat (sindrom de hiperstimulare) la terapia de stimulare ovariana.

Pentru aceste complicatii am incercat sa gasesc ce factori au influentat raspunsul ovarian

inadecvat – corelatii intre varsta pacientei, durata medie a stimularii ovariene si numarul mediu

de unitati de gonadotropina administrata, nivelul mediu al estradiolului seric obtinut, comparativ

cu valorile medii ale acestor parametri pentru intreg lotul de paciente. De asemenea am precizat

la fiecare acest caz ce tip de protocol s-a aplicat.

Subcapitolele „Concluzii” redau detaliat numarul si evolutia sarcinilor obtinute, inclusiv

tehnica aplicata, tipul protocolului utilizat si gonadotropina administrata.

Fiecare statistica in parte cuprinde un subcapitol ”Discutii” cu remarci comparative

asupra influentei acestor parametri in rata sarcinilor.

Am considerat deosebit de utila expunerea statisticii Centrului de Laparoscopie,

Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul Clincii Universitare de

Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara. Avand in vedere ca acest centru este un centru de

referinta in Romania si a acumulat deja experienta in domeniu, am amintit statistica pe primii 5

ani de activitate.

Un ultim capitol din partea speciala acorda atentie crioconservarii, metoda moderna ce

ofera posibilitatea pastrarii la –196°C a celulelor fecundate si a spermatozoizilor si cu utilizarea

lor ulterioara, dupa decongelare. In acest capitol, dupa o scurta expunere teoretica, am dorit sa

reliefez impactul agonistilor- versus antagonisti-GnRH in obtinerea acestor celule, si anume -

care tip de protocol se insoteste de un procent mai mare de celule fecundate, din care o parte se

crioconserva. Procesul congelarii si al decongelarii, dar si calitatea celulelor fecundate, posibil

influentata (?) de agonisti/antagonisti au impact asupra ratei supravieturii celulare dupa

decongelare.

Prin aceste cercetari, teza de fata isi propune o discutie si unele observatii asupra

avantajelor si dezavantajelor protocoalelor cu agonisti comparativ cu antagonisti-GnRH in cadrul

tehnicilor de reproducere umana asistata, cu impactul lor asupra ratei sarcinilor si incearca prin

aceasta sa contribuie la un progres al tratamentului cuplurilor cu sterilitate, ce intra in programe

de reproducere asistata.

Page 8: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

VII

Abrevieri GnRH: hormon eliberator de gonadotropine

GABA: acid gamaaminobutiric

SNC: sistem nervos central

FSH: hormon foliculostimulant

LH: hormon luteinizant

HCG: coriogonadotropina umana

TSH: hormon tireostimulant

rFSH: preparat recombinat al FSH

HMG: gonadotropina umana obtinuta din urina menopauzala

FSH-HP: preparat inalt purificat al FSH

ß-HCG: fractiunea beta a hormonului coriogonadotropinic uman

E2: estradiol

PCOS: sindromul ovarelor micropolichistice

FIV: fertilizare in vitro

ET: embriotransfer

GIFT: transfer intratubar al gametilor

ZIFT: transfer intratubar al zigotului

ZD: perforarea zonei pellucida

PZD: disectia partiala a zonei pellucida

SUZI: inseminare subzonala

ICSI: injectie intracitoplasmatica a spermatozoidului

MESA: aspirarea microchirurgicala a spermatozoizilor din epididim

TESE: extragerea chirurgicala a spermatozoizilor din testicul

PESA: aspirare percutan a spermatozoizilor epididimali

PN: pronuclei

UI: unitati internationale

ESHRE: Societatea Europeana de Reproducere Umana si Embriologie

Page 9: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

VIII

Cuvant inainte

Introducere

Abrevieri

Cuprins

A. Partea generala pag. 1

GnRH – molecula princeps in reproducere Gonadotropii – terapie de stimulare ovariana Agonisti si antagonisti-GnRH; protocoale in cadrul reproducerii umane asistate Tehnici de reproducere umana asistata. De la fertilizarea in vitro la tehnicile de micromanipulare si ICSI

Capitolul 1- GnRH - rolul si implicatia sa in reproducere pag. 2

Capitolul 1.1

GnRH – molecula princeps in reproducere

Capitolul 1.2

Generatorul de pulsatii GnRH

Capitolul 1.3

Influentele neurotransmitatorilor

Capitolul 1.4

Variatia fiziologica a pulsatiilor GnRH

Capitolul 1.5

Structura GnRH

Capitolul 1.6

Receptorul GnRH

Capitolul 2 – Gonadotropii pag. 13

Capitolul 2.1

Scurt istoric

Capitolul 2.2

Structura si efectele generale ale gonadotropilor hipofizari

Capitolul 2.3

Reglarea secretiei gonadotropilor hipofizari

Page 10: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

IX

Capitolul 2.4

Efectele gonadotropilor hipofizari in reglarea cresterii foliculare

Capitolul 2.5

Gonadotropii utilizati in suprastimularea ovariana controlata

Capitolul 3 – Analogii-GnRH pag. 25

Capitolul 3.1

Agonistii-GnRH

Capitolul 3.2

Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor agonisti-GnRH

Capitolul 3.3

Efectul agonistilor asupra fazei luteale

Capitolul 3.4

Antagonistii-GnRH

Capitolul 3.5

Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor antagonisti-GnRH

Capitolul 4 – Raspunsul pacientelor la stimularea ovariana controlata pag. 36

Capitolul 4.1

Raspuns insuficient al pacientelor la terapia de stimulare

Capitolul 4.2

Raspuns exagerat al pacientelor la terapia de stimulare. Sindromul de hiperstimulare ovariana

Capitolul 4.3

Medicatia hormonala administrata in reproducerea asistata si cancerul

Capitolul 5 - Tehnici de reproducere umana asistata

– fertilizarea in vitro (FIV) pag. 43

Capitolul 5.1

Istoric

Capitolul 5.2

Tehnici de recoltare ovocitara

Capitolul 5.3

Extinderea FIV in lume. FIV in Romania

Capitolul 5.4

Page 11: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

X

Tehnica FIV

Capitolul 5.5

Prelucrarea spermei

Capitolul 5.6

Controlul fecundatiei

Capitolul 5.7

Realizarea embriotransferului

Capitolul 5.8

Rezultatele generale ale FIV

Capitolul 5.9

GIFT (gamete intrafallopian transfer) si ZIFT (zygote intrafallopian transfer)

Capitolul 6 - Tehnici de micromanipulare

in cadrul reproducerii umane asistate pag. 62

Capitolul 6.1

Tehnici de micromanipulare anterioare ICSI

Capitolul 6.2

ICSI (intracytoplasmatic sperm injection)

Capitolul 6.3

Tehnica microinjectarii

Capitolul 6.4

Rezultatele ICSI

B. Partea speciala

Studiu comparativ pe 3 ani al administrarii agonistilor- si antagonistilor-GnRH in

reproducerea umana asistata referitor la rata sarcinilor pag. 78

Capitolul 1 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu agonisti-GnRH in reproducerea

umana asistata pag. 80

Capitolul 1.1

Statistica pe anul 1999 pentru protocoalele cu agonisti-GnRH

a. Material si metoda

Page 12: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

XI

b. Rezultate

c. Observatii

d. Concluzii

e. Discutii

Capitolul 1.2

Statistica pe anul 2000 pentru protocoalele cu agonisti-GnRH

a. Material si metoda

b. Rezultate

c. Observatii

d. Concluzii

e. Discutii

Capitolul 1.3

Statistica pe anul 2001 pentru protocoalele cu agonisti-GnRH

a. Material si metoda

b. Rezultate

c. Observatii

d. Concluzii

e. Discutii

Capitolul 1.4

Statistica pe cei 3 ani pentru protocoalele cu agonisti-GnRH

a. Material si metoda

b. Rezultate

c. Observatii

d. Concluzii

e. Discutii

Capitolul 2 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH in reproducerea

umana asistata pag. 135

Capitolul 2.1

Statistica pe anul 1999 pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH

a. Material si metoda

Page 13: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

XII

b. Rezultate

c. Observatii

d. Concluzii

e. Discutii

Capitolul 2.2

Statistica pe anul 2000 pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH

a. Material si metoda

b. Rezultate

c. Observatii

d. Concluzii

e. Discutii

Capitolul 2.3

Statistica pe anul 2001 pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH

a. Material si metoda

b. Rezultate

c. Observatii

d. Concluzii

e. Discutii

Capitolul 2.4

Statistica pe cei 3 ani pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH

a. Material si metoda

b. Rezultate

c. Observatii

d. Concluzii

e. Discutii

Capitolul 3 – Discutii pag. 190

Page 14: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

XIII

Capitolul 4 – Statistica pe primii 5 ani a Centrului de Laparoscopie, Chirurgie

Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul

Clincii Universitare de Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara pag. 206

Capitolul 5 – Crioconservarea pag. 215

Capitolul 5.1 Crioconservarea si locul acesteia in cadrul reproducerii umane asistate Capitolul 5.2

Efecte fizice in cursul congelarii

Capitolul 5.3

Substantele crioprotectoare

Capitolul 5.4

Crioconservarea celulara

Capitolul 5.5

Rezultatele dupa decongelarea celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu agonisti-

GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata

Capitolul 5.6

Rezultatele dupa decongelare a celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu

antagonisti-GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata

Capitolul 5.7

Discutii crioconservare

Capitolul 5.8

Concluzii crioconservare

Capitolul 6 -- Concluzii generale pag. 246

Bibliografie pag. 253

Page 15: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

1

A. Partea generala

GnRH – molecula princeps in reproducere Gonadotropii – terapie de stimulare ovariana Agonisti- si antagonisti-GnRH; protocoale in cadrul reproducerii umane Tehnici de reproducere umana asistata. De la fertilizarea in vitro la tehnicile de micromanipulare si ICSI

Page 16: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

2

Capitolul 1

GnRH - rolul si implicatia sa in reproducere

Capitolul 1.1

GnRH – molecula princeps in reproducere

In controlul nervos al sistemului reproductiv feminin rolul central il detine GnRH

(gonadotropin releasing hormone, LHRH(F) – luteinizing releasing hormone sau factor) - un

hormon cu secretie pulsatila, produs in neuronii din unele zone ale hipotalamusului (nucleul

arcuat, zona preoptica, zona periventriculara anterioara) [1]; [2].

Secretia hormonala este realizata in nucleii hipotalamici; ulterior, la nivelul terminatiilor

axonilor, hormonii sunt eliberati in sistemul port hipofizar si prin circulatia descrise de Gr.T

Popa si Fielding (1930) ajung la nivelul hipofizei anterioare [3]; [4].

La acest nivel se elibereaza gonadotropii: hormonii FSH (hormon foliculostimulant, folitropina)

si LH (hormon luteinizant) (secretati tot in sistem pulsatil) cu rol in coordonarea ciclului

menstrual. De abia in 1978 s-a demonstrat si s-a recunoscut interventia hormonului GnRH in

reglarea functiei ovariene, rol constatat prin faptul ca administrarea continua a GnRH determina

secretia scazuta a hormonilor FSH si LH. Este meritul cercetarilor a 2 oameni de stiinta – Dr.

Andrew Schally si Dr. Roger Guillemin si a echipelor lor de studiu, care au reusit descrierea

structurii si sinteza GnRH (1971). Activitatea acestora a fost incununata prin decernarea

premiului Nobel in domeniul fiziologiei endocrinologiei reproductive (1977) [5]; [6].

Neuronii secretori ai GnRH isi au originea extracerebral, la nivelul placii olfactive si

migreaza de-a lungul nervului olfactiv spre septul nazal si strabat placa cribriforma, ajungand in

final la nucleul arcuat. Afectarea migrarii neuronale asociaza hipogonadismul hipogonadotrop cu

anosmia (sindrom Kallmann). Migrarea neuronala si pasajul acestora prin placa cribriforma sunt

influentati de o serie de factori reglatori.

S-a constatat ca GnRH este prezent in structurile nervoase embrionare inca din saptamana

9-10 de gestatie, dar de abia din saptamana 14-15 sunt realizate toate conexiunile intre neuronii

hipotalamici si sistemul port hipofizar iar FSH si LH sunt detectati din saptamana a 10-a de

gestatie la nivelul structurilor nervoase si in sange la 12 saptamani de gestatie [7]; [8].

Page 17: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

3

Nivelurile embrionare/ fetale de FSH si LH cresc pana la jumatatea perioadei de gestatie ca apoi

sa scada. GnRH este secretat in tot timpul vietii intrauterine, cu rol in perioada fetala tardiva si in

cea neonatala (rol in dezvoltarea normala a organelor genitale externe).

Secretia pulsatila a GnRH are un rol crucial in mentinerea functiei reproductive.

Modificari ale ritmului pulsatil cauzate, de exemplu, de stress sau de infectii pot afecta functia

endocrina a hipofizei si a gonadelor. Activitatea pulsatorie a hipotalamusului este influentata de

diversi neurotransmitatori de tipul norepinefrinei, a dopaminei, a serotoninei, a acidului gama-

aminobutiric (GABA), de steroizi (estradiol, progesteron, testosteron), de opioide endogene

(beta-endorfina), de neuropeptide (neuropeptidul Y, proencefalina) [9].

Capitolul 1.2

Generatorul de pulsatii GnRH

Neuronii GnRH apartin unei retele hipotalamice, numita generator de pulsatii GnRH,

care induce si coordoneaza secretia episodica a neuropeptidelor. Acest concept de generator de

pulsatii GnRH a fost verificat initial experimental si ulterior dovedit si la om si este general

valabil pentru toate mamiferele [10].

Generatorul de pulsatii GnRH are urmatoarele caracteristici: este localizat in regiunea

arcuata a hipotalamusului mediobazal; reprezinta o proprietate intrinseca a acestei structuri,

capabila de-a functiona fara stimuli neuronali extrahipotalamici sau stimuli hormonali. Pulsatiile

GnRH coincid cu pulsatiile gonadotropinelor. Eliberarea ritmica de GnRH in sistemul port

hipofizar determina o secretie pulsatila de gonadotropine [11].

Recent s-au descris din punct de vedere electrofiziologic componentele acestui generator

de pulsatii GnRH. Acestea sunt cresteri ritmice ale unei activitati electrice la nivelul unor unitati

multiple, care sunt sincrone cu initierea pulsatiilor de LH. Prin analiza unei singure unitati s-a

evidentiat faptul ca aceste descarcari electrice reprezinta o crestere a ratei descarcarilor unitatilor

individuale si nu activarea unor celule dormante [12].

Importanta secretiei pulsatile a fost verificata experimental (pe maimuta). Prin lezarea

hipotalamusului mediobazal si, prin administrarea exogena de GnRH in ritm continuu, se

constata scaderea nivelului gonadotropinelor. Administrarea pulsatila exogena de GnRH a

restabilit nivelul de gonadotropine anterior leziunii hipotalamice. Mentinerea unui ritm constant

Page 18: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

4

de GnRH exogen poate induce totusi cicluri ovulatorii. Se poate aplica acest efect si la femei cu

secretie endogena deficitara, la care se va administra GnRH exogen prin pompa de GnRH pentru

a restabili ovulatia.

Generatorul de pulsatii GnRH are rol determinant in reglarea ciclului reproductiv

feminin. Acest generator de pulsatii GnRH este supus unor variatii importante in cursul fazelor

ciclului menstrual, in special datorita influentei modulatorii a steroizilor gonadali. Factori de

tipul neurotransmitatorilor si neuropeptidelor moduleaza activitatea generatorului de pulsatii

GnRH prin medierea actiunii hormonilor steroizi sau prin medierea efectelor inhibitorii ale

factorilor externi: stress, somn, efort fizic crescut, aport caloric redus (in anorexia nervoasa apare

amenoree hipogonadotropica pe motivul scaderii secretiei GnRH datorate cresterii opioizilor

endogeni, care inhiba activitatea generatorului de pulsatii GnRH). Activitatea generatorului de

pulsatii GnRH este oprita in sarcina si in alaptare. Orice schimbare in frecventa pulsurilor GnRH

va modifica la randul sau fazele unui ciclu menstrual normal. Pulsatii de GnRH de frecventa

inalta au ca efect exprimarea LH α-ARNm si nu a LH β –ARNm sau a FSH β –ARNm. Pe de alta

parte o frecventa joasa a pulsatiilor GnRH induc exprimarea FSH β –ARNm. Secretia fiziologica

a pulsatiilor GnRH se insoteste de eliberarea atat a FSH cat si a LH de la nivelul hipofizei [13].

Page 19: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

5

Fig. 1 - Redarea schematica a controlului prin feed-back a axului hipotalamo-hipofizo-ovarian

NE=norepinefrina, E=epinefrina, DA=dopamina and EOP=opiode endogene (Marshall JC:

Regulation of gonadotropin secretion. In DeGroot LJ (Eds): Endocrinology (ed3). Philadelphia,

Saunders Press, 1995: 1993-2007)

Capitolul 1.3

Influentele neurotransmitatorilor

Neurotransmitatorii care influenteaza constant secretia de GnRH sunt catecolaminele,

opiozii endogeni, dopamina, neuropeptidul Y, galanina (cu rol mai redus) (Fig 1). Opiozii de la

nivelul SNC au in parte rolul de-a transmite si de-a amplifica inhibitia prin feed-back a

steroizilor gonadali asupra secretiei de GnRH, jucand un rol important in eliberarea dinamica a

gonadotropinelor in fazele ciclului menstrual [14]. Activitatea opioizilor endogeni si a

Page 20: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

6

receptorilor acestora este reglata de estradiol si de progesteron; concentratia lor variaza functie

de concentratiile steroizilor, adica la inceputul ciclului menstrual – in faza foliculara incipienta,

cand secretia de estradiol este mica, atunci si concentratia opioizilor va fi scazuta. In faza luteala

creste concentratia opioizilor endogeni. O inhibitie a opioizilor in faza foliculara tardiva sau in

faza luteala (cand nivelurile lor sunt crescute) va produce o defrenare/dezinhibitie a GnRH-ului

si implicit vor creste si nivelurile de gonadotropi [15].

Administrarea intraventricular a norepinefrinei in mod pulsatil stimuleaza secretia de LH.

Tratamentul cu fenoxibenzamina (blocant al receptorilor α-catecolaminergici) inhiba secretia de

GnRH si de gonadotropi, tratamentul cu analogi morfinici scade secretia de gonadotropine si

tratamentul cu antagonisti opioizi (naloxone) creste eliberarea de LH [16].

Administrarea de naloxone in faza foliculara incipienta nu are ca efect modificari in secretia

diurna de GnRH si de LH, dar in cadrul secretiei nocturne va inhiba scaderea nivelului de GnRH,

iar in faza foliculara tardiva va produce o crestere in frecventa si amplitudine a FSH si LH. Se

presupune ca opioizii endogeni au rol si in declansarea ovulatiei prin influentarea peak-ului de

LH preovulator. Activitatea opioizilor scade la mijlocul ciclului menstrual si astfel este defrenata

secretia de FSH si LH [17].

In ceea ce priveste influentele dopaminei asupra modularii activitatii generatorului de

pulsatii GnRH se presupune ca are un efect de inhibare indirecta, mediata prin actiunea

opioizilor si posibil un efect de stimulare directa a secretiei de GnRH.

S-a demonstrat prin studii experimentale ca steroizii sexuali influenteaza atat in sens

stimulator cat si in sens inhibitor secretia de GnRH, efectele fiind in functie de durata si de doza.

Efectele lor sunt mediate de opioizii endogeni (neuromediatori de tipul β endorfinei,

norepinefrinei, dopaminei, neuropeptidului Y). Neuronii din zona preoptica si nucleul arcuat

prezinta o densitate mare de receptori estrogenici, pe de alta parte estrogenul este capabil sa

induca receptori pentru progesteron la nivelul neuronilor in zona mediobazala a hipotalamusului

[18]; [19].

Neuronii secretanti de opioizi prezinta o concentratie mare de receptori pentru steroizii sexuali,

la fel si neuronii dopaminergi exprima receptori pentru estrogen si progesteron [20].

Neuronii GnRH prezinta insa o densitate scazuta a receptorilor pentru steroizii sexuali [21].

Sinapsele intre neuronii GnRH includ GABA si GnRH. Neuronii GABA au rol de

pacemaker, nivelurile crescute si prelungite de GABA la nivel hipotalamic afecteaza negativ

Page 21: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

7

activitatea generatorului de pulsatii GnRH. Aria preoptica (la nivelul hipotalamusului anterior)

contine neuroni GABA [22].

Prezenta sinapselor GnRH intre neuronii secretanti de GnRH explica exprimarea receptorilor-

GnRH la nivel hipotalamic. Injectarea intraventricular de GABA determina oprirea generatorului

de pulsatii GnRH, cu scaderea marcata consecutiv a LH-ului si scaderea exprimarii GnRH si a

receptorului-GnRH in hipotalamus in analogie cu receptorul-GnRH din hipofiza. Functia si

expresia genica a acestor receptori este in stricta dependenta de expunerea episodica la ligand.

Daca oprirea generatorului de pulsatii GnRH este asociata cu reducerea exprimarii genice, atunci

se produce un control autocrin al generatorului de pulsatii GnRH prin receptorii-GnRH

hipotalamici. Generatorul de pulsatii GnRH este reglat la diferite niveluri prin controlul

transcriptiei atat a genei GnRH cat si a genei receptorului-GnRH hipotalamic. Controlul autocrin

al neuronilor GnRH este cheia functionarii generatorului de pulsatii GnRH. Studii in vitro mai

recente au evidentiat ca semnalele ritmice pot proveni chiar din neuronii GnRH. Elucidarea

mecanismului de pacemaker si integrarea celulelor componente reprezinta o provocare pentru

viitor.

Capitolul 1.4

Variatia fiziologica a pulsatiilor GnRH

Ca structura, GnRH este un decapeptid, cu timp de injumatatire scurt, de 2-5 minute.

Secretia pulsatila este diferita in cadrul fazelor ciclului menstrual, atat amplitudinea cit si

frecventa descarcarii pulsatiilor (in faza foliculara amplitudinea este mai mica, dar frecventa mai

crescuta).

Se considera ca fiecare puls de GnRH poate actiona la nivel hipofizar. Intervalul dintre

doua pulsatii este intre 70-90 minute. Frecvente inalte (mai mult de 1 puls/ora) stimuleaza

secretia de LH, pe cand o frecventa mai joasa este raspunzatoare de secretia de FSH.

Secretia de GnRH si de gonadotropine este diferita in functie de varsta, astfel ca imediat

dupa nastere si in primele luni de viata creste secretia de GnRH si gonadotropi (posibil datorita

steroizilor sexuali de tipul estradiolului matern, care induc secretia de GnRH) [8]. Dupa primul

an de viata si pana la pubertate copiii au niveluri scazute de gonadotropi si de hormoni sexuali.

Pulsatiile de GnRH si de LH in perioada prepubertara au o frecventa si amplitudine joasa: 1 puls

Page 22: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

8

la 3-4 ore la fetite si 1 puls/ora la baieti. Odata cu maturarea axului hipotalamo-hipofizo-ovarian

la pubertate se produce dezvoltarea unui model de secretie circadiana a LH-ului. Accentuarea

nocturna a secretiei gonadotropinelor marcheaza instalarea dezvoltarii sexuale. Cresterea

nivelurilor circulante de LH reflecta o crestere in amplitudine si o mai mica crestere in frecventa

a pulsatiilor GnRH in timpul fazelor initiale ale somnului. Pe parcursul maturarii se accentueaza

pulsatiile de LH spre trezire. Se presupune ca dezinhibitia secretiei LH este determinata de un

mecanism dependent de centri superiori din SNC (Fig. 2) [23]; [24].

La pubertate este modificat raspunsul sistemului neuroendocrin sub influenta steroizilor.

Initial, cresterea nocturna a secretiei de GnRH va influenta pozitiv secretia de FSH, care este

inhibata de cresterea secretiei estrogenice. Ulterior, cresterea in continuare a secretiei de GnRH

(in sensul amplitudinii si a frecventei) va influenta pozitiv secretia LH-ului. Estrogenii la randul

lor vor accentua secretia de LH [25].

Fig. 2 - Variatiile plasmatice al LH in decurs de 24 ore la fetite cu profil hormonal normal versus

hyperandrogenemie in pubertatea precoce versus pubertatea intarziata.

In pubertatea precoce cresc pulsatiile LH in somn (prezente, dar anormale in caz de

hiperandrogenemie), ulterior la pubertate pulsatiile se stabilizeaza la fetitele cu profil hormonal

normal.

Page 23: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

9

Fig. 3 - Nivelurile plasmatice ale hormonilor in cadrul ciclului menstrual. Sagetile indica

pulsatiile GnRH, distanta dintre ele reprezinta frecventa pulsatiilor iar lungimea sagetilor –

cantitatea de GnRH secretata. (Marshall JC et al: Gonadotropin-releasing hormone pulses:

Regulators of gonadotropin synthesis and ovulatory cycles. Recent Prog Horm Res 47:155-189,

1991)

In perioada fertila a femeii secretia de GnRH este supusa influentelor steroizilor sexuali

(Fig. 3). In postmenopauza apare o dezinhibare a productiei de GnRH, urmata de o crestere a

nivelurilor de FSH si LH, consecinta a incetarii functiei ovariene (nu mai exista supresia

estrogenilor).

Capitolul 1.5

Structura GnRH

Lantul aminoacidic al GnRH este urmatorul: pGlu-His-Trp-Ser-Tir-Gli-Leu-Arg-Pro-Gli-

NH2. GnRH provine dintr-o molecula precursoare de dimensiuni mari: pre-pro GnRH, care

contine 92 aminoacizi. Prin studii enzimatice s-a constatat ca aminoacidul din pozitia 6 este

implicat in inactivarea hormonului (clivarea enzimatica a legaturii peptidice 6-7 produce peptide

biologic inactive), pe cand aminoacizii din pozitiile 2 si 3 au rol in secretia gonadotropilor.

Pozitiile 1, 6 si 10 sunt implicate in mentinerea structurii spatiale si in legare.

Page 24: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

10

De la sinteza GnRH s-au mai descoperit la om si alte izotipuri (in total 3 izotipuri, cu

diferente de aminoacizi in structura – tipul I, II si III, conform tabelului 1) [26]. Se considera ca

genele pentru GnRH uman tipul I si II se afla pe cromozomul 8 si respectiv 20; gena pentru tipul

III inca nu a fost stabilita. De asemenea inca nu este elucidat daca cele 3 izotipuri de GnRH au

roluri fiziologice diferite si nu este cunoscuta inca distributia receptorilor pentru cele 3 izotipuri.

Izotipul I este GnRH-ul clasic care actioneaza in reglarea secretiei gonadotropilor.

Tabel 1 - Izotipuri GnRH Secventa aminoacizilor

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

GnRH nativ pGlu His Trp Ser Tir Gli Leu Arg Pro Gli-

NH2

GnRH izotip I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

GnRH izotip II 1 2 3 4 His 6 Trp Tyr 9 10

GnRH izotip III 1 2 3 4 5 6 Trp Leu 9 10

Efectul GnRH la nivel hipofizar se manifesta prin legarea hormonului de receptorii

membranari specifici prezenti la nivelul celulelor gonadotrope [27].

Aceste celule reprezinta aproximativ 10% din masa celulara a adenohipofizei. Dupa legarea de

receptori are loc activarea sistemului “second-messenger” (fosfolipaze, calmodulin,

proteinkinaza C, inozitolfosfat, acid arahidonic, leucotriene, AMPc), care vor conduce la

producerea de gonadotropine. O celula este capabila sa secrete atat FSH cat si LH, eliberarea si

secretia gonadotropilor fiind stabilita de GnRH.

Capitolul 1.6

Receptorul GnRH

Membrana celulelor adenohipofizare secretante de gonadotropi are doua locusuri de

legare pentru moleculele de GnRH; receptorii pentru GnRH reprezinta de fapt zona cu afinitate

crescuta, iar partile cu afinitate mica sunt endopeptidaze. Receptorul pentru GnRH este o

glicoproteina ce are in structura sa si acid sialic.

Page 25: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

11

Legarea GnRH de receptorul membranar implica modificarea structurii complexului

hormon-receptor specific si internalizarea totala a acestui complex, care urmeaza a fi degradat

lizozomal, in celula. Eliberarea de gonadotropi implica un proces dependent de Ca2+. Se

considera ca internalizarea complexului are rol in mecanismul de actiune al agonistilor-GnRH si

este mai putin important in secretia gonadotropilor [9].

Receptorii au o distributie uniforma la nivelul celulei. Dupa formarea complexului

GnRH-receptor apare migratia laterala a acestuia de-a lungul membranei celulare. Dupa

internalizarea complexului GnRH-receptor o parte sunt degradati intracelular iar o parte se

reintorc la nivelul membranei. Concentratia receptorilor membranari diminua odata cu inaintarea

in varsta si in cursul lactatiei si creste dupa ovariectomie. Refacerea rapida a receptorilor la

nivelul membranei celulare este o proprietate a GnRH-ului de-a mentine si regla concentratia

receptorilor sai.

Studiile mai recente au constatat ca receptorul pentru GnRH are o parte extramembranara, 7 parti

transmembranare helicoidale si o parte intracelulara care este legata de o proteina G [28].

La marea majoritate a vertebratelor exista mai multe tipuri de receptori. Locusul genic pentru

receptorul tipului I de GnRH este la nivelul cromozomului 4 iar locusul genic pentru tipul II se

afla pe cromozomul 1 [29]; [30]; [31].

La om este clar dovedit doar un tip de receptor GnRH. Legarea hormonului de receptor la nivelul

celulelor gonadotrope implica activarea proteinei G cu eliberarea de “second messenger”,

activarea protein-kinazei si eliberarea ionilor de Ca2+ [32]; [33].

Aceasta cascada are ca efect final secretia de gonadotropi. Secretia pulsatila este situatia

fiziologica in organism, daca insa se administreaza GnRH in mod constant, continuu, aceasta va

fi insotita de o crestere initiala a sintezei si secretiei de gonadotropi (efectul de “flare-up”), ca

apoi sa apara o desensibilizare a hipofizei cu scaderea consecutiva a gonadotropilor.

Se stie in cadrul acestui mecanism ca semnalizarea postreceptor este importanta si ca pierderea

receptorilor (“down-regulation”, supresia) joaca un rol de initiere a fenomenului [34].

Administrarea continua a GnRH are urmatoarele efecte asupra celulei hipofizare:

Scaderea numarului de receptori membranari de la nivelul celulelor gonadotrope;

Blocarea canalelor de calciu, care sunt mediate de acesti receptori;

Incapacitatea celulelor gonadotrope de a transforma gonadotropii din forma

nesecretanta in cea secretanta;

Page 26: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

12

Hipofiza devine refractara la molecula de GnRH.

Odata cu descifrarea structurii hormonale si prin izolarea substantei s-a reusit si sinteza

unor compusi, numiti analogi ai GnRH, care au proprietati, afinitate fata de receptori, stabilitate,

activitate intrinseca diferita de molecula nativa. Astfel, dupa aceste caracteristici si dupa

mecanismul lor de actiune analogii se impart in agonisti si antagonisti ai GnRH. Ei isi gasesc

multiple aplicatii in tratamentul diferitelor afectiuni, ca de exemplu: in endometrioza; in

tratamentul sterilitatii; preoperator in cazul fibroamelor uterine (GnRH inhiba cresterea

leiomioamelor si prin efect negativ asupra proliferarii celulare si prin inducerea apoptozei); mai

recent in tratamentul cancerului mamar si cel al prostatei.

Page 27: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

13

Capitolul 2

Gonadotropii

Capitolul 2.1

Scurt istoric

Adenohipofiza secreta sub actiunea GnRH hormonii gonadotropi – FSH (hormon

foliculostimulant, folitropina) si LH (hormon luteinizant). Zondek (in 1926-1927) a descoperit ca

functia ovariana se afla sub controlul hormonal a gonadotropilor. Ulterior, la mijlocul secolului

XX extractele urinare al gonadotropilor de la animale au fost introduse in tratamentele de

stimulare ovariana, initial experimental apoi si la om, obtinandu-se prima sarcina (1960) [35];

[36].

Cercetari si perfectionari continue au avut ca rezultat inlocuirea gonadotropilor de la

animale (datorita efectelor adverse – anticorpi, boala Creutzfeldt-Jacob) cu gonadotropina umana

menopauzala (obtinuta din urina femeilor aflate in postmenopauza, HMG). Ca si mod de actiune

HMG prin continutul sau in FSH induce cresterea nivelului de FSH in faza foliculara (zilele 3-7)

si permite o recrutare foliculara mai mare. Aceste preparate au efecte adverse datorita unui

continut crescut de proteine, chiar daca ele sunt administrate intramuscular (intoleranta, reactii

alergice). Pe langa acest fapt HMG contine si LH (menotropina: 75 UI FSH si 75 UI LH) si are

contraindicatii relative in cazul pacientelor cu PCOS (risc de aparitie a sindromului de

hiperstimulare ovariana) [124]. In anii ´80 s-au sintetizat preparatele HMG cu o componenta

extrem de redusa a LH-ului (urofolitropina: 0,1 UI LH la 75 UI FSH). Acestea au fost inlocuite

apoi in anii ´90 cu preparate de FSH inalt purificate (FSH-HP; highly purified follitropin), care

au eliminat componentele proteice si fractiunea LH si care se pot administra subcutan [37]. In

prezent se utilizeaza preparate de FSH uman recombinat (rFSH), sintetizat prin inginerie

genetica. Ele se obtin prin introducerea genelor ce codifica subunitatile α si β ale FSH in vectori

de expresie ce sunt transferati in linii celulare ovariene ale hamsterului chinezesc. Aceste noi

substante cu administrare subcutana sau intramusculara au si alte avantaje fata de predecesorii

lor; iar pe langa acestea nu exista nici riscul de infectie si nici de formare de anticorpi anti-

gonadotropina [38]; [39].

Page 28: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

14

Capitolul 2.2

Structura si efectele generale ale gonadotropilor hipofizari

Ca structura, gonadotropii hipofizari sunt heterodimeri formati din 2 subunitati

polipeptidice glicozilate (α si β), lantul α este comun pentru FSH, LH, TSH (hormon

tireostimulant) si HCG (coriogonadotropina umana). Cele 2 lanturi contin legaturi non-covalente

si resturi oligozaharidice. In cadrul fiecarei subunitati exista legaturi disulfidice: 5 in lantul α si 6

in lantul β. Lantul α al FSH contine 92 aminoacizi si lantul β - 118 aminoacizi, care ii confera

proprietati unice si legarea de receptorul specific. Glucidele din componenta FSH sunt fructoza,

galactoza, manoza, glucozamina, galactozamina si acidul sialic, ultima componenta fiind

responsabila pentru timpul de injumatatire a hormonului (3-4 ore). Cu cat cantitatea de acid sialic

este mai mare, cu atat timpul de injumatatire este mai prelungit. Lantul β-FSH contine 2 unitati

carbohidrat acid sialic pe cand lantul β-LH doar una singura [40].

Gena pentru subunitatea α-FSH este localizata pe cromozomul 6p21.1-23, exprimata in diferite

celule si gena pentru subunitatea β - pe cromozomul 11p13, exprimata in celulele hipofizei si

aflata sub controlul GnRH, inhibata de actiunea inhibinei [41].

Cunoasterea si mapping-ul epitopurilor functionale pentru actiunea intra- si extracelulara

a hormonului are o importanta aparte in intelegerea functiei atat a hormonului in sine cat si a

receptorului sau. Recent s-a descris structura tridimensionala a FSH legat de regiuni

extracelulare ale receptorului sau (FSHRHB) (Fig.4). Structura complexului hormon-receptor

dovedeste ca amandoua subunitatile sunt implicate in mod diferit in legarea de receptorul

specific, subunitatii α ii revine rolul stereochimic [42].

Page 29: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

15

Fig. 4 - Structura tridimensionala a FSH

Efectele FSH sunt dependente de sex: la femei in perioada reproductiva actioneaza

stimulator asupra cresterii foliculare si asupra secretiei esterogenice, la barbat, in sinergie cu

testosteronul efectele se rasfrang asupra stimularii spermiogenezei.

LH este sintetizat in aceleasi celule adenohipofizare si sub acelasi stimul. Lantul α are 89

aminoacizi si lantul β contine o secventa specifica de 112-115 aminoacizi care ii confera

activitatea hormonala proprie. Ca si in cazul FSH, greutatea moleculara a hormonului este in jur

de 30000-38000 Daltoni si continutul oligozaharidic este intre 16-30%. Se cunoaste doar o

singura gena care codifica lantul β (pe cromozomul 19q13,3) si gena pentru receptorul LH se afla

pe cromozomul 2p21 [43].

Efectele LH la femeie in perioada reproductiva, in faza foliculara, sunt de stimulare a

folicolului in secretia de estrogeni (in sinergie cu FSH). Peak-ul preovulator al LH completeaza

diviziunea ovocitului (meioza I) si in faza luteala LH are rol de stimulare a corpului galben de-a

secreta progesteron. Fiziologic, secretia LH in faza foliculara incipienta este mai scazuta

noaptea, in cursul somnului.

La barbat LH actioneaza asupra celulelor interstitiale testiculare si stimuleaza secretia

testosteronului.

Page 30: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

16

Capitolul 2.3

Reglarea secretiei gonadotropilor hipofizari

Legarea GnRH de receptorii specifici membranari adenohipofizari are ca urmare sinteza,

secretia si depozitarea gonadotropilor. Se sintetizeaza lanturile α si β ale FSH si LH si ulterior

glicozilarea acestor subunitati. Dupa sinteza lor, moleculele FSH si LH sunt stocate in granule si

hormonul va fi eliberat prin exocitoza.

In secretia gonadotropilor sunt implicate urmatoarele mecanisme: leucotrienele au rol in secretia

hormonala si proteinkinaza C are ca efect sinteza si secretia gonadotropilor. Influxul de Ca2+

extracelular si activarea intracelulara a Ca2+ sunt raspunzatoare de eliberarea gonadotropinelor

din depozite.

Reglarea secretiei gonadotropilor se bazeaza pe mecanisme de feed-back. Se descriu 3

arcuri de feed-back, cu efect de stimulare sau de inhibare: arcul lung, scurt si ultrascurt (Fig. 5).

Arcul lung se refera la controlul exercitat de steroizii gonadali atat asupra hipotalamusului cat si

asupra hipofizei. Feed-back-ul pozitiv exercitat de estradiol este exemplificat de peak-ul de LH

preovulator iar controlul negativ consta in reglarea secretiei de FSH prin inhibina. In faza

foliculara estrogenii reduc secretia gonadotropilor, dar influenteaza in mod pozitiv sinteza si

depozitarea gonadotropilor (feed-back negativ). Progesteronul isi exercita controlul in mod

special asupra hipofizei si indirect asupra hipotalamusului, atat prin mecanism de feed-back

pozitiv cat si negativ, dar implica existenta secretiei estrogenice.

Page 31: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

17

Fig. 5 - Reglarea secretiei gonadotropilor

Bucla de reglare scurta consta in controlul gonadotropinelor asupra secretiei lor de catre

hipofiza. Bucla de reglare ultrascurta se refera la controlul sintezei si secretiei de GnRH chiar

prin intermediul acestui hormon.

Gonadotropii prin actiunea lor la nivel ovarian induc formarea unui folicol dominant,

ovulatia si secretia corpului galben. Exista teoria celor 2 compartimente celulare (Fig. 6) care

explica interactiunea intre celulele granuloase si tecale din cadrul folicolului, dar si aceasta teorie

este incompleta.

Page 32: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

18

Fig. 6 – Teoria celor doua compartimente celulare

Capitolul 2.4

Efectele gonadotropilor hipofizari in reglarea cresterii foliculare

FSH isi incepe actiunea in faza finala a unui ciclu menstrual si in faza foliculara

incipienta a urmatorului ciclu menstrual. Celulele granuloasei din folicol poseda receptori pentru

FSH. Acesti receptori isi cresc numarul odata cu cresterea nivelului intraovarian si periferic de

FSH printr-un mecanism de feed-back pozitiv [44]. Mecanismul de actiune al FSH la nivelul

receptorilor celulelor granuloasei implica un mecanism postreceptor mediat AMPc care induce

diferentierea si proliferarea celulelor granuloasei [45]. Factorii locali care intervin in procesul de

proliferare celulara sunt activina, β-TGF (transforming growth factor), factori paracrini.

Cresterea in continuare a FSH va produce proliferarea ceulelor granuloase si, potentat de

estrogeni, va induce receptori pentru LH la nivelul celulelor granuloase. Asa cum am amintit

anterior, cresterea secretiei de estradiol si inhibina exercita un efect de feed-back negativ (arcul

Page 33: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

19

lung) asupra secretiei hipofizare de FSH. Prin acest fenomen se inhiba cresterea si maturarea

altor folicoli in afara celui dominant.

Un eveniment cheie in reglarea ciclului ovarian este peak-ul de gonadotropine de la

mijlocul ciclului. Folicolul dominant secreta in continuare estradiol, care daca ajunge la

concentratia serica de aproximativ 150 pg/ml, mentinuta pentru minim 36 ore, exercita un feed-

back pozitiv: la nivelul hipotalamusului creste secretia de GnRH iar la nivelul adenohipofizei

accentueaza sensibilitatea acesteia fata de GnRH, cu descarcare de FSH si LH. Ca o

particularitate: in cursul peak-ului preovulator secretia de GnRH nu mai este pulsatila.

Actiunea sinergica a FSH si a estradiolului creeaza un mecanism intraovarian autoreglator care

induce multiplicarea rapida a celulelor granuloase si prin urmare cresterea foliculara. Spre

deosebire de celulele granuloase care au receptori atat pentru FSH cat si pentru LH, celulele

interstitiale tecale nu exprima receptori decat pentru LH. Legarea LH de acesti receptori are ca

urmare formarea androgenilor, etapa antemergatoare fiind cea de scindare enzimatica a

colesterolului. Androgenii reprezinta substratul sintezei de estrogeni prin procesul de

aromatizare, proces realizat in celulele granuloase [44]. Androstendiona difuzeaza in lichidul

folicular si ca raspuns la efectul citocromului P450 (indus de FSH in celulele granuloase) are loc

procesul enzimatic de aromatizare cu formarea estronei. Ulterior estrona sub actiunea 17-β-

hidroxilazei este transformata in estradiol. Astfel, LH are o actiune secundara fata de FSH, dar o

actiune modulatoare in raspunsul folicolului la FSH. Pe baza studiilor in vitro efectuate la nivelul

tesutului ovarian s-a putut stabili ca LH stimuleaza activitatea aromatazei si sinteza inhibinei in

celulele granuloase din folicolul dominant si ca inhibina are rol paracrin in cresterea secretiei de

estrogeni de catre folicolul dominant [46]; [47].

Daca insa la nivelul folicolului cantitatea de FSH este insuficienta, atunci exista posibilitatea ca

folicolul sa fie degradat datorita efectului nociv al expunerii la o concentratie mare si neadecvata

de androgeni nearomatizati.

Diferite cercetari in vitro, atat experimentale cat si la om, au putut dovedi ca in celulele

granuloase FSH stimuleaza formarea unui factor care induce la randul sau o crestere a expresiei

citocromului P450c17α-ARNmesager stimulata de LH la nivel tecal si astfel o crestere a sintezei

androgenilor [48].

Page 34: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

20

Alti factori care intervin in proliferarea si diferentierea celulara sunt factorii de crestere insulin-

like (IGF-I si IGF-II) precum si inhibina. Acestia sunt considerati factori paracrini de reglare

[49].

Receptorii pentru LH de la nivelul celulelor granuloase sunt raspunzatori de inducerea

secretiei progesteronului. In cadrul fazei luteale scade numarul receptorilor pentru FSH si LH.

Datele mai sus enuntate sunt exemplificate in figurile de mai jos (Fig. 7; Fig. 8).

Fig. 7 - Nivelurile serice ale gonadotropilor, progesteronului si inhibinei. Mecanismele intracelulare in cadrul fazei foliculare. [9]

Zi ciclu menstrual

Page 35: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

21

Fig. 8 - Selectarea folicolului dominant [9]

Zi ciclu menstrual

Page 36: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

22

Figura 9 exemplifica importanta mediului estrogenic in autoreglarea foliculara, respectiv

importanta mediului androgenic cu rol reglator in dezvoltarea foliculara.

Prin urmare FSH si LH sunt de importanta majora in reglarea cresterii foliculare, ei

intervin in recrutarea si selectarea folicolului dominant, in maturarea acestuia si secretia sa

estrogenica.

Capitolul 2.5

Gonadotropii utilizati in suprastimularea ovariana controlata

In urma celor descrise mai sus se deduce utilitatea gonadotropinei in cadrul terapiei de

stimulare ovariana la pacientele cu sterilitate. Prima sarcina in urma acestui tip de tratament a

fost obtinuta in 1960 de Lunenfeld [50].

Fig. 9 - Mediul androgenic si estrogenic intrafolicular in cadrul fazei foliculare [9]

Folicol preantral Cresterea foliculara

Page 37: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

23

Ulterior preparatele de gonadotropina au fost introduse si in cadrul protocoalelor de

suprastimulare ovariana controlata din cadrul tehnicilor de reproducere asistata. Administrarea

lor in ciclul folicular incepe de timpuriu – din faza foliculara incipienta - in ziua a 3-a, deoarece

selectarea folicolului dominant se realizeaza pana in ziua 5-7. Scopul este de-a matura mai multi

folicoli in ideea de-a creste numarul ovocitelor si implicit rata fertilizarii si a sarcinilor. Totusi

protocoalele de stimulare ovariana se adapteaza functie de raspunsul fiecarei paciente, fiind un

tratament individualizat. S-au imaginat mai multe tipuri de protocoale, unele cu doza mica de

gonadotropina la inceputul stimularii, ca apoi doza sa fie in continuare scazuta (protocolul

Norfolk, “step-down”), iar altele, ca protocolul Bonn (“step-up”) folosesc o doza mai crescuta de

gonadotropina de la inceputul stimularii, ca apoi sa creasca aceasta doza pana anterior ovulatiei.

Amandoua aceste protocoale au avut insa rezultate similare in ceea ce priveste numarul

ovocitelor recoltate la punctia foliculara [51]; [52]; [124].

Sintetizarea rFSH a insemnat un enorm pas inainte in cadrul stimularii ovariene

controlate. Prima sarcina obtinuta in urma stimularii ovariene cu rFSH a fost in 1992 [53].

Aceste preparate s-au impus si actualmente se folosesc pe scara larga in tratamentul de

suprastimulare ovariana controlata din cadrul protocoalelor diverselor proceduri ale reproducerii

umane asistate. Pana in ziua de astazi exista multiple studii care pledeaza in favoarea utilizarii

rFSH, referitor la actiunea sa in cadrul stimularii ovariene comparativ cu HMG, in ceea ce

priveste numarul si calitatea ovocitelor, rata sarcinilor [54].

Se folosesc 2 preparate rFSH: folitropina α (sub forma comerciala Gonal-F, Serono) si

folitropina β (preparatul Puregon, Organon). S-a constata ca in urma administrarii preparatului

folitropin α efectele la locul administrarii sunt mai reduse [55]. Ca mod de actiune al rFSH se

cunoaste ca normalizeaza raportul LH/FSH si optimizeaza steroidogeneza foliculara [124].

Odata cu introducerea pe scara larga a preparatelor sintetizate genetic s-a dorit compararea

eficientei lor fata de substantele utilizate pana atunci (FSH urinar). Rezultatele unui studiu clinic

multicentric, randomizat au fost publicate in 1995 si au dovedit superioritatea rFSH (atat

folitropin α cat si β) fata de FSH-urinar in ceea ce priveste: numarul ovocitelor (mai multe in

cazul rFSH); durata stimularii (mai scurta pentru rFSH) si numarul de unitati FSH administrate

(mai putine pentru rFSH). Numarul embrionilor de calitate inalta a fost mai crescut la loturile

care au primit rFSH. Conditiile de inhibitie hipofizara, tipul de protocol, numarul pacientilor a

Page 38: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

24

fost identic pentru grupele studiate. Nu s-au remarcat insa date semnificativ statistice in ceea ce

priveste rata implantarii si rata sarcinilor la grupele studiate [39].

O alta comparatie s-a efectuat intre preparatul rFSH si FSH inalt purificat. Rezultatele

unui studiu prospectiv randomizat, simplu orb folosind folitropin α versus FSH-HP in aceleasi

conditii de protocol lung (cu acelasi tip de analog-GnRH) au relevat un numar mai mare de

ovocite obtinute prin stimularea ovariana cu rFSH, numar mai mic de zile si doza mai redusa de

FSH in cazul rFSH. De asemenea, ca si in compararea cu FSH urinar, diferenta ratei sarcinilor a

fost nesemnificativa statistic (48% respectiv 47% per embriotransfer). In ceea ce priveste

incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana rezultatele sunt de asemenea comparabile.

Totusi numarul de embrioni crioconservati a fost mai mare (3.2±3.0 versus 1.7±2.5, p<0,0001) in

cazul lotului folosind rFSH fata de FSH urinar inalt purificat [56];[57].

Este cunoscuta degradarea enzimatica a gonadotropilor de catre enzimele digestive, astfel

ca inca nici un preparat sintetizat pana acum nu se poate administra decat parenteral (subcutanat

sau intramuscular).

Totusi, in urma observatiilor efectuate in timp asupra femeilor cu sterilitate la care s-a

efectuat stimularea ovariana cu gonadotropine s-a constatat ca nivelul seric crescut al

estradiolului (insumat prin secretia folicolilor stimulati) induce o crestere prematura a nivelului

de LH (”LH surge”) prin efect de feed-back pozitiv. Acest peak de LH, survenit mai rapid decat

intr-un ciclu normal, actioneaza defavorabil asupra folicolilor, in sensul ca nu toti se afla in

acelasi stadiu de maturare, deci nu toti sunt folicoli preovulatori. Se produce o luteinizare

precoce cu cresterea nivelului progesteronic fata de concentratia sa normala din faza foliculara.

Efectul negativ se repercuta in final asupra ratei sarcinilor [58];[59].

Aceste concluzii au schimbat radical tratamentul de stimulare ovariana din protocoalele utilizate

pentru reproducerea asistata, introducand astfel preparate care sa produca initial o supresie a

hipofizei (pentru a evita cresterea LH-ului endogen) si sa mentina aceasta inhibitie, pentru ca

ulterior sa se initieze stimularea ovariana cu gonadotropi [60].

Page 39: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

25

Capitolul 3

Analogii-GnRH Capitolul 3.1

Agonistii-GnRH

Introducerea terapiei cu analogi-GnRH in stimularea ovariana controlata reprezinta o

etapa moderna in cadrul reproducerii asistate. Din aceasta clasa se contureaza 2 tipuri de

substante: agonistii-GnRH si antagonistii-GnRH.

Sunt agenti terapeutici care au fost sintetizati cu scopul de-a creste efectul GnRH.

Comparativ cu molecula nativa, sunt substante cu o rezistenta mai crescuta fata de degradarea

enzimatica, au o stabilitate mai mare si prezinta si o afinitate mai crescuta fata de receptorii-

GnRH (aproximativ de 100 - 200 de ori). Sintetizarea lor are loc prin modificarea configuratiei

moleculei native in pozitiile 6 sau/si 10 (modificarea la ambele niveluri are efect cumulativ).

Modificari la nivelul aminoacizilor din pozitiile 2 si 3 rezulta in substante cu efect antagonist.

Deletia aminoacidului din pozitia 10 se insoteste de legarea crescuta a substantei [61];[62].

O alta caracteristica este faptul ca timpul de injumatatire este mai lung si sunt substante

mai potente.

Tabelul 2 reda principalii agonisti-GnRH iar tabelul 3 - secventa aminoacizilor in preparatele

agonistilor-GnRH comparativ cu molecula nativa [63].

Tabel 2 - Exemple de agonisti-GnRH, preparate farmaceutice si modul de administrare

leuprolide Enantone Gyn i.m /Depot

buserelin Suprefact s.c/intranazal

nafarelin Synarela intranazal

goserelin Zoladex s.c/Depot

histrelin Supprelin s.c.

triptorelin Decapeptyl, Diphereline i.m/Depot

Page 40: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

26

Tabel 3 - Secventa aminoacizilor in molecula nativa si analogi-GnRH Secventa aminoacizilor

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

GnRH

nativ

pGlu His Trp Ser Tir Gly Leu Arg Pro Gli-NH2

Buserelin 1 2 3 4 5 D-Ser 7 8 9 Etilamida

Goserelin 1 2 3 4 5 D-Ser 7 8 9 AzGli

Leuprorelin 1 2 3 4 5 D-Leu 7 8 9 Etilamida

Triptorelin 1 2 3 4 5 D-Trp 7 8 9 Gli-NH2

Nafarelin 1 2 3 4 5 D-Nal 7 8 9 Gli-NH2

Eficacitatea agonistilor administrati sub forma spray-urilor nazale este de 2-5%

comparativ cu efectul obtinut pe cale subcutanata; toleranta insa este deosebit de crescuta si

efectele secundare sunt minime [62].

S-a constatat ca administrarea continua a agonistilor-GnRH se insoteste de o crestere de

scurta durata a receptorilor membranari, cu eliberarea depozitelor de FSH si LH, dupa care se

produce fenomenul de internalizare a complexului receptor-hormon, cu scaderea ulterioara a

numarului de receptori. Prin internalizare, acest complex este supus degradarii enzimatice

lizozomale. Canalele de calciu, care sunt dependente de acesti receptori, vor fi blocate. Se pierde

capacitatea celulei de-a transforma gonadotropii dintr-o forma nesecretanta intr-una secretanta.

De asemenea se constata ca hipofiza devine refractara la stimularea GnRH nativ. Sinteza de novo

a receptorilor nu poate compensa o pierdere rapida a acestora, pierdere care are loc prin acest

fenomen. Totodata se inhiba si mecanismele postreceptor. Efectul este de scadere al FSH si LH

in celulele gonadotrope (Fig. 10).

Page 41: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

27

Fig. 10 - Efectul legarii GnRH de receptor (molecula nativa si analogii-GnRH)

Valorile FSH si LH din ser scad, consecutiv scade si actiunea acestor hormoni. Nivelul

seric al estradiolului atinge nivelul postmenopauzal. Nu se mai produce cresterea si maturarea

foliculara. Blocarea hipofizei persista pe toata durata administrarii agonistului si este reversibila

odata cu intreruperea tratamentului. Normalizarea functiei hipofizare se reia, in medie, in 6

saptamini.

Efectul de „flare-up” consta intr-un efect de stimulare initială a hipofizei, dupa care se

instaleaza efectul de supresie propriu-zis. Dupa 14-21 de zile de la initierea terapiei se ating

valori ale E2 ca in postmenopauza (<50 pg/ml). Acest efect de “flare-up” declanseaza o crestere

initiala de 5 ori a concentratiei de FSH si de 10 ori a LH dupa un interval de 12 ore de la

administrare si consecutiv se inregistreaza un nivel seric al estradiolului marit, de aproximativ 4

ori [64]. Dupa acest efect initial de “flare-up” nivelul FSH va scadea mai rapid decat cel al LH.

Page 42: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

28

Administrarea continua a agonistilor, asa numita castrare medicamentoasa, are aplicatii in

tratamentul preoperator al fibromului uterin, in tratamentul endometriozei, in cancerul mamar cu

receptori pozitivi pentru estrogeni, in pubertatea precoce, si nu in ultimul rand in cadrul

tehnicilor de reproducere asistata. La barbat terapia cu agonisti isi gaseste aplicatii in cancerul de

prostata.

In administrarea de lunga durata se constata si unele efecte nedorite, cum ar fi bufeurile

(81% din cazuri), cefaleea (30% din cazuri), greata si vertij (21 % din cazuri), scaderea

libidoului, labilitate psihica [65].

Nu este de neglijat deloc pericolul aparitiei osteoporozei. S-a constatat ca la o administrare de 6

luni apare o scadere a masei osoase intre 3,4% si 7,4% [66].

Agonistii-GnRH au fost introdusi in protocoalele de stimulare ovariana controlata din

cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata in scopul prevenirii cresterii premature si

necontrolabile de LH („LH surge”). Cresterea prematura de LH are efecte nedorite asupra

maturarii foliculare, implicit asupra calitatii ovocitelor si embrionilor [67].

Se considera ca anterior introducerii acestei terapii in jur de 15-20% din ciclurile de

stimulare erau abandonate pe motivul cresterii premature de LH, astfel ca prin administrarea unui

agonist GnRH s-a realizat astfel o imbunatatire a ratei sarcinilor [68].

Protocoalele de stimulare ovariana controlata folosesc atat efectul de „flare-up” cat si

supresia hipofizara produsa prin efectul de „down-regulation” al receptorilor-GnRH.

Conform datelor statistice, peste 78,8% din protocoalele in cadrul fertilizarii in vitro asociaza

agonisti-GnRH si stimulare ovariana cu preparate de FSH [69].

Capitolul 3.2

Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor agonisti-GnRH

Diedrich si colab. (1994) au constatat ca introducerea agonistilor a scazut rata ciclurilor

cu raspuns anormal pana la 2 % si permite planificarea momentului declansarii ovulatiei [68].

Anterior introducerii terapiei cu analogi-GnRH (atat agonisti cat si antagonisti), datorita cresterii

premature a secretiei endogene de LH, in jur de 20% din cicluri FIV erau abandonate (stimulare

doar cu gonadotropine) [70].

Page 43: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

29

In cele ce urmeaza sunt redate cele mai des folosite tipuri de protocoale de stimulare

ovariana controlata ce cuprind inschema lor antagonisti-GnRH.

Protocoalele scurt si ultrascurt („short”, „ultrashort”) exploateaza efectul de “flare-up”,

adica nivelul crescut al secretiei gonadotropinice de la inceputul administrarii medicatiei,

folosind acest fenomen in sensul cresterii foliculare.

In cadrul protocolului scurt („short protocol”) - administrarea agonistului este zilnică,

incepand cu ziua 1 a ciclului menstrual, pina la stabilirea declansarii ovulatiei. Stimularea

ovariana cu FSH incepe din ziua 5 a ciclului menstrual.

Protocolul ultrascurt („ultrashort protocol”): agonistul GnRH se administreaza doar in

zilele 2,3 si 4 ale ciclului menstrual. Stimularea cu FSH incepe in ziua 2 a ciclului

menstrual.

Avantajele acestor 2 tipuri de protocoale sunt: durata stimularii este mai redusa si implicit costul

medicatiei utilizate este mai redusa. Dezavantaje: concentratia serica a LH-ului este crescuta in

prima parte a fazei foliculare, cu efect negativ asupra maturarii foliculare [71]. Nu intotdeauna

peak-ul de LH poate fi prevenit.

Prin studii retrospective s-a demonstrat ca numarul de ovocite obtinute prin punctie foliculara,

numarul de embrioni si rata sarcinilor a fost mai bun in cazul utilizarii protocoalelor lungi

(independent de preparatul folosit) [72].

In studii prospective rata difera, dar nu semnificativ.

Protocolul lung („long protocol”) este cel mai frecvent folosit, efectul scontat este cel de

desensibilizare a hipofizei, anterior initierii stimularii ovariene cu FSH. Administrarea

subcutanata/intranazala/intramusculara-depot a agonistului GnRH se incepe din mijlocul

fazei luteale (cel mai frecvent, din ziua 20-22) sau de la inceputul fazei foliculare (ziua 1

a ciclului menstrual). Dupa 14 zile de inceputul tratamentului se considera ca s-a realizat

supresia hipofizei si se efectueaza determinari hormonale (LH < 10 mUI/ml si E2 < 50

pg/ml), se considera necesara o ecografie transvaginala de rutina pentru a depista

eventualele formatiuni ovariene chistice (care temporizeaza administrarea de FSH), ca

apoi sa se inceapa stimularea ovariana cu FSH. Efectul supresiv hipofizar indus de

agonistul-GnRH dureaza pe tot parcursul stimularii ovariene cu FSH (in medie 10-14

zile). Inducerea ovulatiei cu 10.000 UI HCG se produce la dimensiunea foliculilor > 17

mm si niveluri serice de E2: 300-400 pg/ml/folicul.

Page 44: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

30

Avantajul acestui protocol lung este dat prin inceperea administrarii agonistului din faza medio-

luteala si care consta in coinciderea cresterii fiziologice a gonadotropilor din aceasta perioada a

ciclului cu efectul de “flare-up”. Acest tip de protocol ofera o sincronizare a maturarii foliculare

si se permite recrutarea unui numar mai mare de foliculi si implicit de ovocite. Dezavantajul

poate exista in administrarea pe o sarcina incipienta, care nu este sesizata (nu s-au constatat insa

efecte malformative) [73].

Protocolul ultralung („ultralong protocol”) foloseste administrarea agonistului cu 1-3 luni

înainte de momentul începerii stimulării cu FSH.

Capitolul 3.3

Efectul agonistilor asupra fazei luteale

La 8 zile dupa administrarea HCG pentru inducerea ovulatiei se constata o scadere

marcata a concentratiilor serice de estrogeni si progesteron. Secretia endogena de LH ramine in

continuare blocata si se produce astfel o luteoliza precoce. Biopsiile de endometru releva o

incetinire in procesul de transformare secretorie in peste 50% din ciclurile stimulate [74].

Agonistii se leaga de receptorii prezenti la nivel folicular (la nivelul celulelor granuloase) si au

ca efect o scadere a productiei de progesteron. Acest fenomen a fost demonstrat pe baza studiilor

in vitro. Tot prin studii clinice s-a demonstrat impactul negativ al agonistului-GnRH asupra

corpului galben si a functiei luteale. Posibil insa ca mecanismul de actiune sa nu fie direct, avand

in vedere ca dupa oprirea administrarii agonistului acesta este eliminat rapid din organism.

Inhibarea sintezei de gonadotropine persista inca o perioada dupa intreruperea medicatiei (mai

ales in cazul protocoalelor lungi) astfel ca efectul asupra functiei luteale este unul indirect, prin

imposibilitatea eliberarii LH-ului hipofizar. Este deci obligatorie o sustinere a fazei luteale.

Aceasta se face prin administarea progesteronului – direct sau indirect – prin administarea HCG

(fiind cunoscut faptul ca HCG are o structura foarte asemanatoare cu a LH- ului). Uneori se

adopta amandoua modalitatile. Progesteronul se administreaza pe cale orala sau vaginala; s-a

demonstrat faptul ca acestea au o mult mai buna absorbtie decat calea intramusculara.

Dezavantajul administrarii HCG este faptul ca poate produce sau accentua sindromul de

hiperstimulare ovariana, daca acesta este deja existent, situatie in care se prefera administrarea de

progesteron. Concluziile lui Blumenfeld si Nahhas asupra ratei sarcinilor (mai crescute) si

Page 45: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

31

numarului avorturilor (mai scazute) in urma sustinerii fazei luteale cu HCG se bazeaza si pe

faptul ca HCG are rol in implantarea embrionara prin producerea unor factori specifici [75].

Administrarea progesteronului se incepe in ziua punctiei foliculare si se continua pentru

14 zile. Administrarea HCG pentru sustinerea fazei luteale sau asocierea sa cu progesteronul se

decide in functie de situatia clinica si nivelul estradiolului seric. De obicei HCG se administreaza

in zilele 1,4,7 dupa punctia foliculara [76].

Capitolul 3.4

Antagonistii-GnRH

Fac parte din clasa analogilor-GnRH. Acesti compusi iau nastere prin modificarea

moleculei de decapeptid, care se leaga la nivel de receptor membranar hipofizar, fara insa a

determina eliberarea de gonadotropine (ca in cazul agonistilor, prin efectul de „flare-up”). Pana

in momentul de fata s-au sintetizat substante ce au fost incadrate in 3 clase sau generatii de

antagonisti. Substantele care s-au impus in schemele de tratament utilizate astazi sunt cetrorelix

si ganirelix (Tabel 5).

Prima generatie de antagonisti a rezultat prin inlocuirea aminoacizilor din pozitiile 2 si 3

din GnRH nativ (His si Trp), dar aveau efecte supresive doar la doze foarte crescute. Potenta

acestui tip de substanta a fost crescuta prin modificarea aminoacizilor din pozitia 1 si 6 si prin

incorporarea unui D-aminoacid in pozitia 6 (D-Arg), rezultand substante de generatia a 2-a, dar

care au avut efecte alergice (edem, eritem local, induratie), anafilactoide nedorite (edem

generalizat, reactie anafilactica) prin activitate histaminica accentuata. Acest efect secundar a

fost indepartat odata cu sintetizarea produsilor de generatia a 3-a, prin inlocuirea D-Arg din

pozitia 6 cu D-ureiloalkil aminoacid [77].

Tipuri de antagonist-GnRH de generatia a 3-a sunt cetrorelix, iturelix, azaline B, ganirelix,

abarelix si antarelix. In urma administrarii lor se obtine o supresie hipofizara mai marcata pentru

LH (70%) si mai putin pentru FSH (30%) dupa 6 ore de la administrare. Alte modificari aduse

generatiei 3 si substantelor ce sunt inca in studiu sunt la nivelul aminoacizilor din pozitiile

1,2,3,6 si 10 [78]; [79]; [80].

In tabelul 4 sunt redate principalele substante antagoniste-GnRH [63].

Page 46: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

32

Tabel 4 - Principalii antagonisti-GnRH Secventa aminoacizilor

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

GnRH

nativ

pGlu His Trp Ser Tir Gly Leu Arg Pro Gli-

NH2

Cetrorelix D-Nal D-Phe D-Pal 4 5 D-Cit 7 8 9 D-Ala

Nal-Glu D-Nal D-Phe D-Pal 4 Arg D-Glu 7 8 9 D-Ala

Antide D-Nal D-Phe D-Pal 4 NicLis D-

NicLis

7 Lis(iPr) 9 D-Ala

Ganirelix D-Nal D-Phe D-Pal 4 5 D-

hArg

7 hArg 9 D-Ala

Azalina B D-Nal D-Phe D-Phe 4 Phe D-Phe 7 Lis(iPr) 9 D-Ala

Antarelix D-Nal D-Phe D-Pal 4 Phe D-Hcit 7 Lis(iPr) 9 D-Ala

Tabel 5 - Antagonisti-GnRH folositi in practica clinica Antagonist GnRH

(DCI)

Denumire

comerciala

Cale administrare Doza recomandata Doza minima

eficienta

s.c. Doza unica 2 mg Cetrotide Cetrorelix

s.c. Doza multipla 0,25 mg/zi

Orgalutran Ganirelix s.c. Doza multipla 0,25 mg/zi

Efectul este de scadere al gonadotropinelor si implicit a steroizilor sexuali la cateva ore

de la administarea lor. Efectul secundar cel mai important este de eliberare a histaminei, cu

efecte locale si sistemice. Acest fenomen se produce prin existenta receptorilor-GnRH la

suprafata celulelor mastocitare. Un alt efect secundar este cel de precipitare.

Principiul actiunii este diferit de cel al agonistilor. Antagonistul se afla in competitie cu

molecula nativa la nivel de receptori membranari hipofizari. Efectul de antagonizare incepe

imediat, fara stimularea initiala a hipofizei si este dependent de doza. La intreruperea medicatiei,

in decurs de citeva zile se normalizeaza functia hipofizara (comparativ cu agonistii, unde

reluarea functiei hipofizare are loc aproximativ la 6 saptamini).

Antagonistul nu are ca efect epuizarea rezervelor hipofizare a gonadotropilor si nici nu

inhiba sinteza acestora. Pe baza inhibitiei competitive la nivelul situsurilor de legare se poate si

Page 47: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

33

“doza” efectul antigonadotrop al antagonistilor, cu rol in moderarea concentratiei restante de

estradiol. Moderarea concentratiei serice a E2 este importanta in diminuarea efectelor secundare

ale tratamentului cu antagonisti.

Capitolul 3.5

Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor antagonisti-GnRH

Administrarea de scurta durata a antagonistului-GnRH inhiba secretia endogena hipofizara si

previne peak-ul precoce de LH [81]. Spre deosebire de agonisti, nu se produce o desensibilizare

a hipofizei, ci efectul de supresie se realizeaza prin inhibarea competitiva a receptorilor

hipofizari.

Protocolul german – Lübeck - foloseste administrarea zilnica de cetrorelix (doze mici – 0,25

mg/zi), subcutanat, incepand din ziua 5 sau 6 a ciclului menstrual, pana la declansarea ovulatiei.

Stimularea cu FSH se incepe din ziua 2 a ciclului menstrual, cu ajustarea pe parcurs a dozei.

Supresia de LH a fost rapida, s-au atins concentratii serice < 2 mUI/ml si nu s-a semnalat peak-

ul precoce de LH [82]. Declansarea ovulatiei cu 10.000UI HCG s-a efectuat conform criteriilor

ecografice (dimensiunea folicolilor >17 mm) si hormonale (E2: 300-400 pg/ml/folicol).

Sustinerea fazei luteale cu 5000 UI HCG s-a efectuat in ziua 2 si 5 dupa punctia foliculara.

Initial, pentru a stabili doza optima eficienta de cetrorelix, s-au utilizat comparativ pe loturi de

paciente doze de 3 mg, 1 mg si 0,5 mg. S-a constatat ca s-a obtinut o mai buna crestere a

concentratiei de estradiol la grupul ce a folosit 0,5 mg antagonist si rata formarii pronucleilor la

grupul de 0,5 mg cetrorelix a fost de 67,7 % [9]. Actualmente, in protocolul adoptat unanim, se

utilizeaza doza de 0,25mg/zi cetrorelix.

Protocolul francez, descris de grupul lui Olivennes [83] consta intr-o administare unica,

subcutanat de cetrorelix (3 mg), la un nivel seric al E2 de 150-200 pg/ml/ folicul > 14 mm ( in

general in ziua a 9-a). Daca in decurs de 48 h nu se indeplinesc criteriile de declansare a ovulatiei

se mai administreaza o doza de antagonist. Adminstrarea de FSH incepe in ziua a 2-a a ciclului

menstrual. Monitorizarea ecografica si hormonala (E2, LH, progesteron) este zilnica. Declansarea

ovulatiei s-a produs cu 10.000 UI HCG cand au fost indeplinite criteriile ecografice si hormonale

cunoscute. Sustinerea fazei luteale s-a efectuat cu progesteron natural administrat intravaginal.

Page 48: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

34

Sub aceasta medicatie, hipofiza este in continuare sensibila la secretia endogena de GnRH si

ramane reactiva [82].

Dat fiind faptul ca la oprirea medicatiei antagoniste secretia endogena de LH se reia rapid, in

cateva ore, s-a discutat necesitatea sustinerii fazei luteale. Si in aceasta problema exista

suficiente controverse. Se pare ca totusi este influentata intr-o oarecare masura activitatea

corpului galben [84].

Este posibil ca dupa inhibitia hipofizara produsa de antagonistii-GnRH sa se reia ciclul

ovulator printr-o administare pulsatila de GnRH.

Dezavantajul agonistului fata de antagonist este faptul ca prin efectul initial de “flare-up”

produce o crestere de LH, care chiar daca este redusa, induce la randul ei o sinteza crescuta de

androgeni, mediu care este defavorabil dezvoltarii foliculare. Pe de alta parte, luand in

considerare modul de actiune al antagonistului – prin mecanismul de blocare competitiva a

receptorilor-GnRH, se deduce ca efectul sau are o durata de instalare rapida, dar odata oprita

medicatia, se revine rapid la situatia initiala. Efectul antagonistului este dependent de durata si

doza administrata, o doza crescuta de antagonist s-a dovedit a fi defavorabila pentru rata

sarcinilor din ciclurile FIV (Mannaerts, 1998 – studiu multicentric) [85].

In protocoalele utilizand antagonist s-a declansat ovulatia si prin administrarea GnRH, incercand

astfel evitarea sindromului hiperstimularii ovariene, care este favorizat si de HCG.

In figura 11 sunt redate protocoale de stimulare ovariana utilizate in tehnicile de

reproducere asistata, folosind agonisti sau antagonisti-GnRH in vederea supresiei hipofizare.

Page 49: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

35

Fig. 11 - Protocoale de stimulare ovariana cu agonisti/antagonisti-GnRH

Page 50: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

36

Capitolul 4

Raspunsul pacientelor la stimularea ovariana controlata

Capitolul 4.1

Raspuns insuficient al pacientelor la terapia de stimulare

In cadrul protocoalelor de suprastimulare ovariana controlata se poate intalni un raspuns

inadecvat, redus al pacientelor (situatie cunoscuta sub denumirea de „low-responder”). Este

motivul pentru care ciclurile de stimulare se intrerup, se abandoneaza. Acesta situatie apare in 9-

24% din ciclurile de stimulare (Keay, 1997) din cadrul fertilizarii in vitro (FIV) si nu se mai

ajunge la punctia foliculara [86].

Conditiile de definire a situatiei expuse sunt: nivel seric al estradiolului < 500 pg/ml, cu

dezvoltarea a ≤ 3 folicoli dominanti. Determinarea hormonilor bazali a pacientelor care intra in

cadrul protocoalelor de suprastimulare ovariana controlata au relevat o valoare crescuta a FSH

bazal (care la determinari repetate in cursul unui an se mentine ridicata), valori bazale ale

estradiolului de asemenea crescute si LH bazal < 3 mUI/ml. Explicatia este data de scaderea

rezervei ovariene de folicoli, care determina o secretie mai scazuta a inhibinei. In aceste conditii,

conform arcului de reglare ovar-hipofiza, se va secreta o cantitate mai crescuta de FSH, care la

randul ei va detemina cresterea estradiolului bazal. In aceste circumstante poate aparea peak-ul

prematur de LH, luteinizarea precoce a ovocitelor, cu alterarea calitatii lor [87].

Cel mai frecvent rezerva foliculara ovariana scazuta se intalneste odata cu inaintarea in varsta a

femeii, dar se descriu si situatii similare la femeile tinere [88].

S-au incercat multiple variante de adaptare a protocoalelor de stimulare ovariana cu

scopul de-a reduce semnificativ rata de abandon a ciclurilor de stimulare. O varianta este de

scadere a dozei si a timpului de inhibitie hipofizara a agonistului-GnRH, care la randul sau poate

afecta raspunsul ovarian. Astfel ca la protocolul lung cu agonist se opreste doza acestuia la

instalarea menstruatiei, ulterior se administreaza doze mai crescute de gonadotropine [89]. O alta

posibilitate este aplicarea protocoalelor scurt si ultrascurt la „low-responder”, care se bazeaza pe

efectul initial de „flare-up” al agonistului, cu stimularea gonadotropinelor endogene si inducerea

cresterii foliculare. Se administreaza in cadrul protocoalelor scurte (modificate) doze mai

crescute de agonist-GnRH si doze mai mari de gonadotropine [90].

Page 51: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

37

Criteriile de abandonare a ciclurilor de stimulare sunt [91];[92]; [124]:

• Nivel seric al estradiolului < 600 pg/ml, asociat cu numar redus de folicoli ≥ 16 mm (≤

3);

• Cresterea prematura a LH-ului (> 10 mUI/ml) sau nivel seric al progesteronului > 1,5

ng/ml anterior inducerii ovulatiei;

• Sindrom de hiperstimulare ovariana (ovare mari, > 8 cm, cu numar mare (>10) de folicoli

< 16 mm si nivel seric al estradiolului > 3500 pg/ml

• Probleme de organizare

Capitolul 4.2

Raspunsul exagerat al pacientelor la terapia de stimulare. Sindromul de hiperstimulare

ovariana

Am amintit printre criteriile de abandonare a ciclurilor de stimulare si sindromul de

hiperstimulare ovariana - o complicatie de temut si nu rar intalnita in protocoalele din

reproducerea asistata. Este inversul situatiei fata de raspunsul insuficient („low-response”) la

stimularea cu gonadotropine, fiind un raspuns exagerat, insotit de un nivel seric crescut al

estradiolului si cu manifestari clinice variate, in functie de gradul severitatii. Este o complicatie

indusa iatrogen, care se insoteste de extravazarea plasmei in spatiul interstitial si acumularea

lichidului in cavitati, cu formare de edeme, ascita, hidrotorace si hidropericard. Hipovolemia se

insoteste de alterarea perfuziei renale, cu oligurie si in final insuficienta renala acuta.

Hemoconcentratia este cauza complicatiilor tromboembolice ce survin in acest sindrom de

hiperstimulare ovariana. De asemenea apar insuficienta respiratorie si hepatica. De obicei

aparitia sindromului de hiperstimulare se instaleaza la cateva zile dupa punctia foliculara,

frecvent in perioada embriotransferului.

Prevenirea sindromului de hiperstimulare este destul de dificila, deoarece dozele de

gonadotropine folosite pentru a obtine o stimulare ovariana adecvata sunt foarte apropiate de

dozele ce induc aceasta complicatie. In protocoalele pentru FIV/ICSI se incepe cu doze progresiv

crescande de gonadotropine, cu monitorizarea indeaproape a numarului si dimensiunii folicolilor

si a cresterii estradiolului seric. Administrarea HMG si rFSH in doze crescute odata cu initierea

stimularii ovariene are ca efect cresterea unui numar mai mare de folicoli, care se vor dezvolta

Page 52: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

38

progresiv si acumuleaza receptori pentru LH. In final ei vor suferi un proces mai accentuat de

luteinizare. Unii autori considera ca folosirea unui protocol fix de stimulare nu scade aparitia

sindromului de hiperstimulare ovariana [93]. De asemenea introducerea agonistului-GnRH nu

scade riscul sindromului de hiperstimulare ovariana.

Se considera ca pacientele cu sindrom de ovare polichistice (PCOS) si cele cu disfunctie

ovariana, clasificarea OMS II (cu secretie normala de gonadotropi hipofizari) au o predispozitie

si un risc mai mare de dezvoltare a sindromului de hiperstimulare ovariana [94].

Nu exista nici o metoda care sa excluda complet aceasta complicatie. In general este

asociata unor nivele ridicate de estradiol seric in faza preovulatorie, dar se poate intalni si la

nivel scazut de estradiol. Pe de alta parte se descriu si situatii in care paciente cu valori foarte

crescute de estradiol nu dezvolta sindrom de hiperstimulare ovariana [95] .

S-a raportat in cateva situatii izolate aparitia sindromului de hiperstimulare ovariana si in cicluri

spontane [96] (fie la paciente cu PCOS sau la paciente cu profil hormonal normal).

O serie de date din literatura de specialitate apreciaza incidenta sindromului de

hiperstimulare ovariana pentru formele moderate si severe la valori cuprinse intre 3,1% - 6%

respectiv 0,25% - 1,8% [97].

S-au imaginat mai multe clasificari ale acestui sindrom de hiperstimulare ovariana,

fiecare insa este supusa modificarilor.

Clasificarea OMS [98] cuprinde 3 grade de severitate:

• gradul I (forma usoara) se refera la marirea in volum a ovarelor, bilateral (< 6cm),

estradiol seric > 1500 pg/ml, progesteron seric > 30 ng/ml

• gradul II (forma moderata) asociaza marirea in volum bilateral (pana la 12/12 cm) a

ovarelor cu disconfort abdominal, greata, voma, diaree, crestere ponderala, estradiol seric

la niveluri crescute

• gradul III (forma severa) asociaza pe langa ovarele marite in volum (> 12 cm),

simptomele descrise la gradul anterior si estradiolul crescut si prezenta lichidului de

ascita, eventual si hidrotorace/hidropericard; hipovolemie care poate evolua pana la soc

hipovolemic, hemoconcentratie marcata, tulburari electrolitice, tromboembolism.

Page 53: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

39

O varianta de clasificare, mai recenta, este cea a lui Golan si colab. [99].

Forma usoara

Grad 1 – distensie si disconfort abdominal

Grad 2 – se adauga greata, varsaturi ± diaree, dimensiunile ovarelor sunt cuprinse intre 5-12 cm

Forma moderata

Grad 3 – semnele/simptomele formei usoare, la care se adauga prezenta ascitei (descrisa

ecografic)

Forma severa

Grad 4 – semnele/simptomele formei moderate la care se adauga prezenta ascitei si/sau

hidrotoracelui si dispnee

Grad 5 – toate cele enumerate anterior, la care se adauga modificari ale volumului sanguin, ale

vascozitatii sanguine prin hemoconcentratie, tulburari ale coagularii si alterarea perfuziei si

functiei renale.

Complicatiile sindromului de hiperstimulare ovariana

• Complicatiile vasculare sunt cele date de hemoconcentratie, se induce un status de

hipercoagulabilitate si apar fenomene tromboembolice. Se constata cresterea nivelelor

serice ale complexului plasma α2 – antiplasmina, trombina-antitrombina III, scaderea

precalicreinei si a APTT;

• Complicatii hepatice;

• Insuficienta respiratorie;

• Insuficienta renala acuta (prerenala, indusa de hipovolemie);

• Complicatii gastro-intestinale;

• Torsiune anexiala sau ruptura unui chist ovarian.

Asa cum am mai amintit, declansarea ovulatiei prin administrarea HCG determina inducerea

sindromului de hiperstimulare ovariana. Din acest motiv, in conditii de risc nu se indica HCG

pentru sustinerea luteala. Se poate inlocui HCG ca inductor al ovulatiei cu agonist-GnRH iar

pentru sustinerea luteala se va administra progesteron (intravaginal). Durata si severitatea

sindromului este mai accentuata in cazul instalarii sarcinii.

Page 54: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

40

Fiziopatologia sindromului de hiperstimulare ovariana

In conceptia clasica se considera ca o crestere a permeabilitatii capilare este raspunzatoare de

acumularea lichidului in spatiul interstitial si in cavitati. Exista si o explicatie mai moderna

(Balasch si colab.) care presupune ca tulburarile circulatorii nu se datoreaza hipovolemiei, ci

unei vasodilatatii arteriolare marcate la nivel periferic, urmata de cresterea patului vascular si

hipotensiune arteriala consecutiva. Astfel se va produce in mod compensator o crestere a

frecventei cardiace si a debitului cardiac [100].

La nivel ovarian se remarca cresterea in volum a acestora, cu edem stromal, prezenta zonelor

de necroza, neovascularizatie, chiste foliculare hemoragice si luteinice.

S-au studiat intens mediatorii cresterii permeabilitatii vasculare. Un factor implicat in

acest proces este sistemul renina-angiotensina. Concentratia acestor substante este crescuta in

plasma si in directa corelatie cu severitatea sindromului de hiperstimulare ovariana.

Factorul de crestere endoteliala (VEGF: vascular endothelial growth factor) joaca un rol

important in patogenia hiperstimularii. Este o proteina ce leaga heparina si actioneaza direct

auspra endoteliului cu inducerea angiogenezei. In vivo creste permeabilitatea vasculara si are

implicatii in angiogeneza din cadrul dezvoltarii embrionare. Alte studii au gasit o corelatie intre

VEGF si angiogeneza din cadrul tesuturilor cu reinnoire ciclica (de tipul endometrului) si

activitate crescuta a VEGF in folicolul luteinizat [101]; [102]. VEGF este implicat si in reglarea

angiogenezei ciclice ovariene, creste permeabilitatea vaselor la nivel ovarian si poate fi un factor

in producerea lichidului din chistele ovariene. Este depistat in celulele tecale ale folicolului dar

nu se depisteaza in corpul galben degenerat sau in folicolul atretic. Cresterea rapida a folicolilor

din cursul stimularii si luteinizarea lor necesita angiogeneza marcata. Conform concluziilor

extrase din studii, VEGF este factorul major implicat in producerea permeabilitatii capilare si in

formarea ascitei din sindromul de hiperstimulare ovariana.

Alte cercetari recente si-au indreptat atentia spre interleukine si rolul lor in patogenia sindromul

de hiperstimulare ovariana, dar nu li se atribuie acelasi rol important ca si pentruVEGF [103].

Odata stabilit diagnosticul de sindrom de hiperstimulare ovariana se impune o

monitorizare si supraveghere (clinica si paraclinica) atenta a pacientei. Formele usoare si

moderate nu necesita spitalizare, care insa devine obligatorie in formele severe. Parametrii de

laborator care se urmaresc sunt: determinarea hematocritului si a numarului hematiilor,

Page 55: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

41

creatinina si ureea sanguina, ionograma sanguina si urinara, profil al coagularii, transaminaze,

monitorizarea urinii. Printre alte analize se determina si ß-HCG-ul seric.

Ecografia este utila in urmarirea dimensiunii ovarelor, a prezentei lichidului de ascita, eventual a

prezentei sarcinii.

Tratamentul medical cuprinde restabilirea echilibrului volemic si acido-bazic prin

administrarea de fluide intravenos, electroliti, albumina, plasma-expanderi. Albumina corecteaza

tulburarile hemodinamice, creste presiunea oncotica si nu permite extravazarea lichidului din

patul vascular, este o substanta cu timp de injumatatire lung (10-15 zile). Prevenirea sau tratarea

fenomenelor tromboembolice implica administrarea anticoagulantilor. La pacientele cu oligurie

intra in discutie administrarea dopaminei.

Tratamentul chirurgical se refera la evacuarea lichidului de ascita prin paracenteza sau

prin punctie vaginala ecoghidata. Se imbunatateste starea generala a pacientei, se amelioreaza

simptomele, creste debitul renal si clearence-ul de cretainina. Prezenta hidrotoracelui impune

drenajul pleural. Laparoscopia, sau mai rar laparotomia, se practica doar in cazul torsiunii

ovariene, a rupturii unui chist anexial sau in cazul tratamentului sarcinii extrauterine asociate

sindromului de hiperstimulare ovariana.

Sindromul de hiperstimulare ovariana s-a intalnit in statistica Centrului de Fertilizare in

Vitro si Embriotransfer al Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie “Bega”, Timisoara

doar in 30 cazuri (pe perioada 20.05.1995-31.12.1999), acestea fiind forme usoare si medii. Nu

s-au inregistrat forme severe. La 1 caz cu torsiune de ovar chistic la 12 saptamani gestatie s-a

intervenit si s-a rezolvat pe cale laparoscopica, sarcina a evoluta ulterior normal, pana la termen

[95]; [104]; [105].

Masurile de prevenire ale sindromului de hiperstimulare ovariene cuprind identificarea

factorilor de risc (paciente cu PCOS, tinere, cu estradiol seric crescut, cu sindrom de

hiperstimulare aparut in stimulari anterioare, ecografic se descriu numerosi folicoli de

dimensiuni mici si folicoli ≥ 15 mm). O alta metoda este de retinere fata de administrarea HCG

in scopul inducerii ovulatiei („coasting”) la estradiol seric crescut, cu continuarea agonistului-

GnRH si oprirea medicatiei gonadotrope de stimulare. Monitorizarea concentratiei serice a

estradiolului (scaderea la 3000 pg/ml) reprezinta decizia de administrare a HCG [106].

Inlocuirea HCG cu agonist-GnRH ca inductor al ovulatiei este alta masura de prevenire a

sindromului de hiperstimulare ovariana. Aspirarea foliculara, suportul luteal cu progesteron,

Page 56: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

42

crioconservarea embrionilor si embriotransferul lor in alt ciclu, administrarea profilactica a

albuminei la punctia foliculara sunt alte posibilitati de prevenire a hiperstimularii.

Capitolul 4.3

Medicatia hormonala administrata in reproducerea asistata si cancerul

In urma tratamentului hormonal care se administreaza in cantitati crescute sau cu durata

prelungita in cadrul protocoalelor din reproducerea asistata, respectiv repetarea protocoalelor in

intervale de timp variate s-a ridicat si problema efectelor secundare ale acestei medicatii. Cea

mai de temut complicatie in timp este fireste cancerul. S-au efectuat multiple studii in acest sens

in centre de reproducere asistata si in institutii de cercetare de referinta din intreaga lume si s-a

dovedit ca medicatia utilizata in tratamentul infertilitatii nu este cancerigena. Cu toate aceste

rezultate mai sunt necesare in viitor si alte studii care sa urmareasca in timp efectele terapiei

hormonale in infertilitate [107]; [108]; [109].

Page 57: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

43

Capitolul 5

Tehnici de reproducere umana asistata - fertilizarea in vitro (FIV)

Capitolul 5.1

Istoric

Conform explicatiei din enciclopedie, termenul de fertilizare in vitro reprezinta procedeul

de-a concepe un embrion uman in exteriorul organismului matern. Se refera la cultivarea in

laborator a ovocitelor si spermatozoizilor, cu plasarea ulterior a embrionului/embrionilor

transcervical intrauterin [124]. Tendintele de-a concepe in vitro au existat inca de demult, astfel

ca din punct de vedere istoric se descriu incercarile lui M.C. Chang, care a relizat prima

fertilizare in vitro la mamifer (iepure) in 1959 [110] . In urmatoarea decada aceste incercari s-au

extins si la om.

Secolul 20 este marcat de multiple evenimente, dar unul in mod special a atras atentia lumii

intregi. Cercetarile de durata ale echipei de la Bourn Hall Clinic, Marea Britanie, formata in

principal de ginecologul P. Steptoe si fiziologul R. G. Edwards, au fost incununate de succes la

25 iulie 1978, prin nasterea fetitei Louise Brown („test tube baby”), provenind dintr-un cuplu cu

sterilitate de cauza tubara. Ei au marcat acest eveniment, ce avea insa sa schimbe radical

posibilitatile de reproducere de la acel moment incolo, cu un scurt articol aparut in revista Lancet

[111]; [124]. Stradaniile lor de-a obtine o sarcina in vitro s-au concretizat initial pe modele

experimentale si ulterior la om. In 1971, in urma multor incercari, Edwards si colab. au reusit

cresterea in vitro a ovocitelor fertilizate pana la stadiul de blastocist, lucru imposibil de realizat

pana atunci [112]. In 1976 au obtinut o sarcina tubara (un succes, dar totodata un esec prin

implantarea embrionara ectopica) [113].

Capitolul 5.2

Tehnici de recoltare ovocitara

Ca si metoda, Steptoe si Edwards au obtinut ovocitul dintr-un ciclu menstrual spontan,

prin aspirarea lui laparoscopica (pacienta avand o patologie tubara ireversibila), ulterior acesta a

fost fecundat in vitro si reimplantat prin embriotransfer. Intre timp s-a modificat calea de

Page 58: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

44

recoltare a ovocitelor, fiind introdusa cea prin punctie transvaginala ecoghidata. La introducerea

FIV in SUA (1981) se practica recoltarea ovocitara prin laparoscopie dar, ulterior, in 1983 s-a

efectuat prima aspirare ovocitara transvaginala ecoghidata, aceasta fiind astazi curent folosita

[114].

Avand in vedere dezvoltarea actuala a laparoscopiei se poate practica in continuare acest

tip de recoltare, mai ales daca se doreste in mod special vizualizarea pelvisului (in situatia unei

patologii cunoscute sau presupuse) si in timpul recoltarii ovocitare se poate actiona si terapeutic

(liza aderentelor). Totusi in ziua de astazi ramane rar folosita aceasta metoda, este necesara

experienta si indemanarea operatorului; in unele situatii punctia foliculara poate fi mai

anevoioasa si interventia mai prelungita.

Aparitia ecografiei a permis o noua abordare a diagnosticului si tratamentului organelor

micului bazin. In 1981 Lenz a efectuat prima punctie foliculara sub ghidaj ecografic, metoda sa

fiind o punctie transabdominala transvezicala ecoghidata (transducer abdominal). Aceasta

tehnica are si ea dezavantajele ei (este dureroasa, produce frecvent hematurie, retentie de

cheaguri), fiind mai dificil de abordat ovarele si in cele din urma a fost abandonata [115].

Urmatoarea tehnica de aspirare ovocitara a fost cea prin punctie transvaginala, dar

ghidata ecografic transabdominal (metoda descrisa de Gleicher in 1981). Si aceasta tehnica a fost

inlocuita odata cu aparitia si perfectionarea transducerului vaginal. O alta varianta este aspirarea

ovocitara transuretrala si prin vezica urinara folosind un ghid ecografic transabdominal (este

folosita daca abordul ovarian este dificil, ovare inaccesibile vaginal, daca exista o infectie

vaginala sau daca sonda vaginala este defecta). In 1985 Wikland si colab. au descris pentru

prima data modul de aspirare al ovocitelor prin punctie transvaginala ecoghidata transvaginal,

prin atasarea unui ac de punctie la transducerul vaginal. Este tipul de punctie folosit astazi in

toate centrele de fertilizare in vitro [116].

Avantajele acestui tip de punctie sunt evidente: vizualizarea mai buna a organelor pelvine

(apropierea de sonda a ovarelor), dureri mult mai atenuate (fata de recoltarea transvezicala

ecoghidata), prin buna vizualizare a ovarelor se permite o aspirare adecvata a folicolilor si

obtinerea astfel a mai multor ovocite (inclusiv spalarea repetata a folicolilor pana la evidentierea

ovocitelor), risc mai mic de perforare a unui organ (risc de lezare a unui vas, intestin sau vezica

urinara < 1%), absenta disuriei, a infectiei (prezente in punctia transvezicala). Este de altfel si

varianta de punctie cea mai acceptata de paciente [124].

Page 59: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

45

Anii care au urmat au fost marcati de noi evenimente si progrese, in sensul ca s-a introdus

stimularea ovariana controlata (initial cu clomifen si apoi cu gonadotropine), s-au introdus

ulterior analogii-GnRH in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana. Tratamentul de stimulare

ovariana controlata a permis obtinerea mai multor ovocite mature, care evident au dus la crestera

ratei implantarii/ciclu si la cresterea procentului sarcinilor. Agonistii-GnRH au permis scaderea

procentului de cicluri abandonate pe motivul peak-ului spontan si premature de LH. Astfel incat

la inceputul practicarii FIV rata sarcinilor a fost mult redusa (8%), ca apoi la sfarsitul anilor ´80

cel mai probabil datorita introducerii terapiei cu analogi-GnRH, ea sa creasca in jur de 15%. De

la inceputurile ei FIV a mai suferit si alte modificari, nu numai referitoare la modul de colectare

al ovocitelor sau la modul de stimulare ovariana, ci si paleta de indicatii a fost reconsiderata.

Initial FIV a fost practicata la cupluri cu sterilitate de cauza tubara, s-a extins insa si la paciente

cu endometrioza in diverse stadii, patologie uterina, sindromul ovarelor polichistice (PCOS),

infertilitate idiopatica. In plus, la pacientele cu insuficienta ovariana primara, menopauza precoce

sau ovariectomizate s-a introdus FIV cu ovocite donate. Mai mult, FIV este aplicata si la cupluri

cu factor masculin al sterilitatii sau cu infertilitate de cauza imunologica.

Capitolul 5.3

Extinderea FIV in lume

FIV in Romania

Intre timp aceasta tehnica de reproducere asistata s-a extins pe tot globul. La 4 ani de la

nasterea lui Louise Brown in Marea Britanie, s-a nascut in Germania, la Erlangen, primul baietel

(Oliver) prin FIV iar in 1983 s-a obtinut primul copil “in eprubeta” in SUA. De atunci aceasta

tehnica a cunoscut un enorm avant, numai in Germania s-au practicat pana in anul 2002 peste

60.000 cicluri FIV [117].

In Romania s-a introdus aceasta metoda a reproducerii asistate in anul 1995, cand la

Timisoara, la Clinica Universitara de Obstetrica-Ginecologie “Bega”, echipa condusa de Acad.

Prof. Dr. Ioan Munteanu a realizat prima fertilizare in vitro (20.05.1995) la o pacienta cu

sterilitate tubara, la care s-a obtinut sarcina, urmata de nasterea primului baietel roman conceput

“in eprubeta” (Daniel-Ioan), la 6 februarie 1996 [124]. Astfel ca Romania devenea a 18-a tara in

lume in care se practica FIV [123]. Ulterior acest success a fost urmat de multiple altele [122].

Page 60: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

46

Centrul de fertilizare de la Timisoara - centru de referinta - a fost urmat de infiintarea altora

similare in Bucuresti, Cluj, Constanta [118]; [119]; [120]; [121].

Capitolul 5.4

Tehnica FIV

Tehnica fertilizarii in vitro si a embriotransferului presupune dupa o selectare riguroasa si

incadrare corecta a cuplurilor cu sterilitate in programele de reproducere asistata cateva etape

clare si precise. Fiecare laborator de embriologie detine o aparatura specifica (de exemplu:

incubator, centrifuga, microscop cu lumina inversata, cu contrast de faza, care sa aiba o suprafata

de lucru cu posibilitati de incalzire, camera Makler, instalatie de apa pura, banc de lucru,

consumabile, altele). Laboratorul este curatat si intretinut cu substante speciale, non-

embriotoxice.

Dupa stimularea ovariana prealabila (conform protocoalelor enumerate si folosind

supresia hipofizara cu analogi-GnRH) se induce ovulatia prin administarea a 10.000 IU HCG

intramuscular. Recoltarea ovocitara se va efectua la 34-39 ore (optim la 36 ore) de la

administrarea HCG. Recoltarea ovocitara prin punctie vaginala ecoghidata direct este efectuata

in conditii de asepsie in laboratorul de fertilizare sau in sala de operatie. Se prefera o anestezie

generala i.v. de scurta durata. Anterior punctiei este necesar de verificat pompa de aspiratie si

acul care urmeaza a fi atasat de sonda vaginala printr-un dispozitiv special construit. Pacienta se

afla in decubit dorsal pe masa ginecologica, cu membrele inferioare in abductie. Se introduce un

specul si se efectueaza lavajul din abundenta cu ser fiziologic a vaginului, dupa care se scoate

speculul si se introduce transducerul vaginal (sonda cu frecventa 5-7,5 MHz, preferabil

transducer electronic si nu mecanic, pentru calitatea imaginii) cu acul de punctie atasat.

Operatorul poarta manusi sterile netalcate, masca, boneta. La nivelul transducerului vaginal se

aplica un capison steril cu o cantitate mica de ecogel. Ecograful are la nivelul ecranului o linie de

ghidaj care ajuta la pozitionarea si manevrarea acului (este indicat ca acul sa coincida cu linia de

ghidaj) (ecograf Siemens, Kranzbuehler, Kretz). Inainte de punctionare se reverifica aspectul

ovarelor (prin modificarea pozitiei sondei in cele 2 planuri), daca exista ansa intestinala

interpusa, a se evita confunzia unui folicol cu sectiunea transversala a venei iliace. Punctionarea

foliculara se poate efectua fie cu un sistem de punctie automat sau manual. Acul de punctie in

Page 61: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

47

sistemul automat are dezavantajul ca la fiecare punctionare foliculara perforeaza peretele

vaginal, cu risc mai mare de sangerare. La sistemul manual este intepat peretele vaginal o data

pentru ovarul drept si o data pentru cel stang. Punctionarea se incepe cu folicolii cei mai usor

accesibili, cei mai apropiati de transducer. Se punctioneaza si folicolii mici, care pot contine si ei

ovocite mature (mai rar) (Fig. 12). Daca este necesar se poate efectua lavajul unui folicol cu

aspirarea sa ulterior (in cazul in care nu s-a identificat ovocitul din prima aspirare). Inainte de

extragerea sondei vaginale, la terminarea interventiei se verifica fundul de sac Douglas (poate

contine fina lama de lichid – sangerare in urma procedurii aplicate). Se controleaza punctele de

punctie vaginala si o eventuala sangerare se opreste de obicei prin compresie de scurta durata.

Conform protocolului de la Bourn Hall Clinic se pot administra la sfarsitul interventiei

antibiotice (de exemplu autorii acestui ghid propun acid clavulanic: 1,2 g Augmentin i.v. si

metronidazol: 1 g Flagyl intrarectal) [125].

Fig. 12 - Aspectul ecografic al unui ovar stimulat

Complicatiile unei punctii foliculare transvaginale sunt in parte determinate de

indemanarea si experienta operatorului. Pe de alta parte gradul de accesibilitate (mai dificil sau

nu) al ovarelor sau sindromul aderential pelvin preexistent pot contribui la cresterea incidentei

complicatiilor. Complicatiile se refera in general la sangerare, infectie, punctia unui organ pelvin.

Fiecare centru de fertilizare are statistica sa proprie. Brinsmead si colab. constata un numar mare

de complicatii: 2-7% punctie venoasa, 40% sangerare la nivelul vezicii urinare, 24 % sangerare

vaginala, 14 % perforatie intestinala, 10% dureri pelvine post-punctie, 3% infectii in micul bazin

[126].

Page 62: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

48

La sfarsitul interventiei pacienta este de obicei supravegheata timp de 2 ore (se prefera

repausul in clinostatism) dupa care poate parasi unitatea unde s-au recoltat ovocitele. Este bine

ca pacienta sa mentina legatura cu medicul care a efectuat punctia inca o perioada de

aproximativ 12 ore, timp in care pot aparea alte complicatii acute.

Ovocitele recoltate sunt preluate in laborator de catre embriolog. O persoana cheie in

relizarea tehnicilor de reproducere asistata o reprezinta tocmai embriologul.

Ovocitele umane sunt foarte sensibile la variatiile de temperatura, care pot produce

modificari ireversibile in fusul mitotic, cu afectare cromozomiala. Embrionii obtinuti din FIV si

la care s-au depistat anomalii cromozomiale pot contribui la explicatia procentului de sarcini

biochimice sau avorturi spontane intalnite dupa FIV sau GIFT (transfer intratubar de gameti),

posibil tocmai prin degradarea termica. Astfel incat in timpul manipularii ovocitelor si a

embrionilor este necesara pastrarea unei temperaturi constante [127]. Dupa recoltarea lor prin

aspirare foliculara (in eprubete) se identifica ovocitele la microscop. Complexul cumulus–ovocit

se poate vizualiza prin marimea lui si cu ochiul liber. Continutul folicular se varsa din eprubeta

pe placi Petri si se vizualizeaza la microscop (cu placa termica incalzita la 37 ºC si marire optica

40-125x). Manevra este rapida si efectuata in conditii sterile. Se spala pentru indepartarea

sangelui daca este necesar, cu ajutorul unei pipete. Se transfera imediat in mediul de cultura.

Placile cu godeuri in care se transfera ovocitele sunt placi cu capac (transparent). Pe fiecare se

inscriptioneaza numele pacientei. Fiecare ovocit aflat in mediu este ulterior examinat la

microscop in ceea ce priveste calitatea lui, gradul de maturare (prezenta sau absenta veziculei

germinale, prezenta globulului polar, ovocite degenerate, ovocite luteinizate) (Fig. 14; Fig. 15).

Ovocitul matur este o celula rotunda, cu citoplasma clara, se vizualizeaza primul globulul polar;

cumulus oophorus are o densitate scazuta, de asemenea corona radiata are o densitate celulara

scazuta (Fig.13). In timpul examinarii se mentin stabile temperatura si pH-ul. Ovocitele vor fi

apoi introduse in incubator, unde se pastreaza pana la momentul inseminarii cu sperma

(aproximativ la 3-4 ore de la punctia foliculara).

Page 63: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

49

Fig. 13 - Ovocit de calitate foarte buna

Fig.15 - Ovocit de calitate scazuta

Spatiul de lucru al embriologului trebuie sa fie in imediata vecinatate a incaperii unde se

practica aspirarea ovocitelor, pentru a permite o manevrare rapida a acestor celule.

Pentru fiecare pacienta se intocmeste un formular/fisa tip care cuprinde pe langa datele

personale si cele inscrise de embriolog si cateva elemente de anamneza (cicluri anterioare,

particularitati ale FIV anterioare daca este cazul), date despre proba de sperma.

Actualmente exista numeroase medii de cultura comercializate industrial si numai este

nevoie de prepararea lor in laborator. Placile cu mediul de cultura ovocitar sunt echilibrate in

incubatorul CO2 cu 24 ore anterior punctiei foliculare in ceea ce priveste parametri pH,

temperatura, osmolaritate. Mediul incubatorului contine amestecul de gaze in urmatoarea

proportie 5% CO2, 5% O2, 90% N2 sau aer imbunatatit cu 5% CO2; obligatoriu temperatura

constanta (37ºC), umiditate crescuta si posibilitatea de echilibrare rapida la manevrele de

inchidere-deschidere.

Fig. 14 - Ovocit imatur

Page 64: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

50

Capitolul 5.5

Prelucrarea spermei

A doua etapa dupa identificarea, spalarea si transferul ovocitelor in mediul de cultura este

reprezentata de prelucrarea spermei. Spre deosebire de mediul de cultura ovocitar, mediile de

preparare a spermei nu necesita incubare anterioara. De-a lungul timpului s-au dezvoltat mai

multe metode de prelucrare, de obicei fiecare laborator preferand una din aceste tehnici. Scopul

acestei preparari este de indepartare a lichidului seminal, care contine factori ce impiedica

capacitatia si fertilizarea; se doreste indepartarea detritusurilor si a resturilor celulare si

concentrarea spermatozoizilor cu mobilitate progresiva. Sperma se obtine prin masturbare, se

colecteaza intr-un recipient steril cu aproximativ 2 ore inainte de momentul inseminarii

ovocitelor. Se pot prepara si probe crioconservate si ulterior decongelate. Dupa recoltarea

spermei se lasa la lichefiat 30 minute, dupa care se examineaza la microscop in camera Makler.

Se stabileste daca se intrunesc criteriile OMS ale spermogramei si se urmareste mobilitatea

spermatozoizilor. Ei pot fi cu mobilitate rapid progresiva, mobilitate progresiva incetinita, nu

progreseaza, avand miscari pe loc sau sunt imobili.

Caracteristicile unei spermograme normale (normospermie, normokinezie) conform

criteriilor OMS (1992) [128]:

Volum ≥ 2 ml

pH: 7,2 – 8

Numar total/ejaculat: ≥ 40 x 106

Numar spermatozoizi/ml: ≥ 20 x 106

Mobilitate: ≥ 50 % cu mobilitate progresiva (clasele „a si b”) sau ≥ 25% mobilitate rapida

liniara (categoria „a” pana la 60 min de la colectare)

Morfologie: ≥ 30 % forme normale

In spermograma trebuie sa se regaseasca >50% spermatozoizi vii, numaratoarea

leucocitelor < 1x106 iar testul MAR sa fie negativ (anticorpi antispermatici).

Modificari in unul din parametri enumerati sau asocierea lor produce alterarea capacitatii

de fertilizare. Kruger si colab. au stabilit niste criterii stricte asupra morfologiei spermiei, de

asemenea cu implicatii in rata fertilizarii [129].

Page 65: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

51

In ceea ce priveste morfologia spermiilor s-au gasit multiple corelatii intre aceasta si

fertilitatea [130]. Spermatozoizii sunt clasificati in 5 categorii: normali, cu cap anormal, anomalii

ale gatului/piesei intermediare, anomalii ale cozii, imaturi. Conform clasificarii OMS o

spermograma normala trebuie sa cuprinda > 30% forme normale (anterior valoarea era > 50%).

Alta metoda de evaluare morfologica este reprezentata de criteriile stricte ale lui Thinus

Kruger si colab. - Tygerberg Hospital, Africa de Sud. Acest sistem de clasificare se coreleaza tot

mai mult cu rezultatele FIV in comparatie cu clasificarea OMS. Defectele luate in calcul sunt

aceleasi ca si la incadrarea OMS, dar diferenta rezida in faptul ca aceste criterii foarte stricte

trebuie intrunite ca spermiile sa fie apreciate ca normale. Conform acestor criterii > 14% forme

normale sunt considerate pentru ca o sperma sa fie fertila. Restul se divide in 2 grupe:

5-14% forme normale: modelul “G”: prognostic bun de fertilizare (G: good)

0-4% forme normale: modelul “P”: prognostic prost de fertilizare (P: poor)

In opinia lui Riedel si colab., pentru ca o sperma sa intruneasca proprietatile minime

neceare pentru fecundare in cazul FIV conventional trebuie ca numarul total de spermatozoizi sa

fie minim 5x106, mobilitatea progresiva cel putin 30% si morfologia normala minim 30% [131].

Orice alta modificare in sens negativ a parametrilor unei spermograme altereaza fertilitatea si are

un prognostic de reusita mai redus.

Metodele de prelucrarea a spermei

Tehnica Percoll

urmareste separarea spermiilor cu mobilitatea crescuta (care avand o densitate mai mare

se sedimenteaza la partea inferioara a recipientului) de mediile de prelucrare, pipetate in

concentratii/densitati diferite. Tehnica Percoll foloseste un coloid din particule silicate

invelite in polivinilpirolidona (PVP), considerat actualmente cu potential toxic. A fost

retras de catre producatori, in ideea sigurantei. Etapele metodei au fost descrise de

Braude si Bolton [132].

In eprubeta de centrifuga se pipeteaza mediu Percoll dupa cum urmeaza: la fundul eprubetei 1 ml

mediu Percoll 80%, deasupra un strat de mediu 40% (1 ml) si ultimul strat – cel superficial –

sperma lichefiata. Se prepara astfel 2 eprubete continand mediu cu gradiente diferite si sperma la

suprafata. Sperma este obtinuta si lasata la lichefiat dupa modalitatea descrisa mai sus, respectiv

o proba din sperma se evalueaza anterior prelucrarii ei la camera Makler. Se centrifugheaza la

Page 66: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

52

300 rotatii timp de 20-30 minute, dupa care se arunca supernatantul iar sedimentul de la fundul

eprubetei (pellet) ce contine spermatozoizii, se suspenda in mediul de cultura FIV (mediu

universal, Medicult) – 1,5 ml. Se centrifugheaza din nou la 550 rotatii timp de 10 minute. Se

resuspenda sedimentul in 0,2 ml mediu FIV si se preleveaza 10 µl care se numara in camera

Makler si se apreciaza mobilitatea, restul spermei se foloseste pentru inseminarea ovocitelor.

Este posibil ca aceste gradiente sa protejeze sperma in timpul centrifugarii.

Metoda Percoll a fost in timp inlocuita cu tehnica Sil Select, care foloseste gradiente de

45% si 90% ale unei solutii de particule de siliciu acoperite cu silan si care sunt diluate intr-o

solutie salina tamponata cu mediul Earle. Pasii tehnicii Percoll se regasesc in procedeul Sil

Select.

Metoda swim-up (descrisa de Lopata si colab. in 1976) [133]:

principiul metodei urmareste separarea spermatozoizilor mobili care dupa centrifugare

migreaza din sediment spre mediul proaspat adaugat si de aici vor fi selectionati pentru

inseminare. Etapele acestei tehnici sunt urmatoarele: se amesteca in raport de 1:1 o proba

din ejaculatul lichefiat (la fundul unei eprubete de centrifuga) cu mediu FIV. Sperma se

obtine prin masturbare intr-un recipient steril si prelucrarea ei incepe dupa 30 minute,

timp necesar lichefierii. Dupa amestecarea probei de sperma cu mediul FIV se

centrifugheaza la 550 rotatii timp de 10 minute. In cursul centrifugarii se depune

sedimentul cu spermatozoizi la fundul eprubetei iar supernatantul care contine lichidul

seminal cu componentele lui se arunca. Se resuspenda sedimentul in 3 ml mediu

universal FIV si se centrifugheaza din nou timp de 10 minute la 550 rotatii. Supernatantul

se arunca si se acopera sedimentul cu 1 ml mediu universal FIV dupa care se incubeaza in

incubatorul CO2. In acest timp spermatozoizii mobili vor ascensiona in mediul proaspat

adaugat, suspensia devenind opaca. Se pipeteaza 200 µl de la suprafata eprubetei in alta

mai mica si se masoara 10 µl din suspensie care se evalueaza in camera Makler (numar si

mobilitate). Aceasta tehnica are un prim timp in care mixeaza sperma neprelucrata cu

mediul FIV, situatie care in cursul centrifugarii favorizeaza formarea de radicali oxidanti

(ROS reactive oxygen species) (in cantitate mai crescuta in sperma neselectionata fata de

cea selectionata prin metoda stratificarii). Acesti produsi induc procese de peroxidare a

Page 67: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

53

lipidelor in spermii normale sau anormale si scad capacitatea lor de fecundare. ROS sunt

produsi in mod special de polimorfonucleare (existente in mod normal in componenta

spermei, sunt de 3 feluri: anioni superoxid, peroxizi de hidrogen si radical hidroxil.

Plasma seminala contine antioxidanti care neutralizeaza ROS). Acesta reprezinta un

dezavantaj important al tehnicii swim-up [134]; [135].

Se utilizeaza si alte tehnici derivate din cele descrise mai sus.

Tehnica mini-swim-up urmareste concentrarea spermatozoizilor mobili in cel mai mic

volum de mediu posibil, fiind aplicata in cazul oligoastenosteratozoospermiei. Etapele

procedeului cuprind prepararea spermei dupa metoda swim-up si dupa acoperirea

sedimentului cu 1 ml mediu universal FIV se transfera intr-un tub Eppendorf, de unde se

centrifugheaza la 550 rotatii timp de 2-3 minute. Se indeparteaza cu grija supernatantul si

se resuspenda sedimentul cu 5-10µl mediu universal FIV. Se incubeaza de la cateva

minute pana la cateva ore. Suspensia se utilizeaza la inseminarea ovocitelor in cadrul FIV

clasice sau se foloseste pentru injectarea spermatozoidului in ovocit in cadrul ICSI

(injectia intracitoplasmatica a spermatozoidului).

Filtrarea printr-un filtru de vata de sticla are ca principiu separarea spermiilor moarte sau

anormale (care adera de acest filtru) de cele mobile, care traverseaza filtrul [136].

Adaugarea de pentoxifilina – imbunatateste mobilitatea spermiilor. Deoarece s-a

constatat ca altereaza unele mecanisme intracelulare s-a renuntat la aceasta tehnica de

crestere a calitatii spermei.

Centrifugarea – urmareste separarea celulelor si a componentelor plasmei seminale de

spermii. Se amesteca mediul de prelucrare cu sperma si se centrifugheaza de cateva ori la

300-550 rotatii. Sedimentul obtinut se resuspenda cu mediu si se utilizeaza pentru

inseminarea ovocitelor.

O metoda moderna de evaluare a concentratiei spermei si de stabilire a tipurilor de mobilitate

este CASA (computer-assisted semen analysis), care necesita un echipament costisitor. Nu se

efectueaza insa anterior unei evaluari OMS a spermogramei [179].

Sperma prelucrata dupa una din tehnicile descrise anterior se utilizeaza pentru inseminarea

ovocitara in vitro, procedeu efectuat aproximativ la 3-4 ore (dupa unii autori 4-6 ore) de la

recoltarea ei. Nu s-au remarcat insa procente diferite ale sarcinilor, chiar daca inseminarea s-a

Page 68: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

54

efectuat la un interval mai mare (20 ore) de la aspirarea foliculilor, iar daca dupa 24 ore nu s-au

constatat celulele cu 2 pronuclei se mai poate tenta o inseminare sau o injectie

intracitoplasmatica a spermatozoizilor [137]. Numarul obisnuit de spermatozoizi la o inseminare

este de 100.000 spermatozoizi mobili/ml sau 25.000 per ovocit. Daca dupa prelucrarea spermei

se constata o mobilitate mai scazuta se va creste concentratia lor.

Placile cu capac ce contin in godeurile lor ovocitele suspendate in mediul de cultura se scot

din incubator si se aseaza pe placa microscopului aflata la 37 °C. Se calculeaza

cantitatea/concentratia de spermatozoizi ce urmeaza a fi inseminati si se pipeteaza rapid in

fiecare godeu. Dupa ce s-a finalizat pipetarea se inchide capacul si se verifica sub microscop

cantitatea de spermatozoizi, dupa care se introduc placile din nou in incubator. Daca a fost

necesar de adaugat o concentratie mai mare de spermatozoizi, se vor reimprospata mediile de

cultura mai rapid, deoarece spermatozoizii in concentratie crescuta consuma substantele

nutritive.

Capitolul 5.6

Controlul fecundatiei

Incubarea ovocitelor inseminate are loc inca 16-20 ore, dupa care urmeaza controlul

fecundatiei prin vizualizarea pronucleilor la microscopul cu lumina inversata (40-250 x marire

optica). In acest moment ovocitele sunt inconjurate de corona radiata si de celulele din cumulus.

Pentru o buna vizualizare se indeparteaza celulele granuloase (disectia embrionului), se cauta

numarul de pronuclei. Se evalueaza in continuare din punct de vedere morfologic ovocitele

fecundate (aspectul citoplasmei, fragmentarea), grosimea zonei pellucida. Aspectul normal

intalnit este cel de celula cu contur regulat, cu citoplasma clara, cu 2 pronuclei (2PN), 2 globuli

polari, cu zona pellucida intacta (Fig.16). Se mai pot intalni tot ca situatie normala si aspecte de

citoplasma fin granulara. Zigotul cu numar aberant de PN nu se pastreaza pentru embriotransfer

(Fig.17). Totusi s-a determinat prin analiza FISH ca zigotul cu 1 PN poate avea numar diploid de

cromozomi si daca clivarea lui ulterioara este normala se va putea folosi pentru implantare [138].

Page 69: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

55

Fig.16 - Celula cu 2 PN

In general se selecteaza ovocitele cu 2 PN si se incubeaza inca 24-30 ore, timp in care

embrionul format se divide si ajunge in faza de 4 – 8 celule (Fig. 1; Fig.19). Zigotii care s-au

selectat pentru cultura ulterioara se transfera in alte recipiente ce contin mediu de cultura

preechilibrat. Nu se amesteca cu zigotii cu numar aberant de PN, care se cultiva separat.

Embriologul noteaza toate datele constatate la fiecare zigot in parte. Intarzierea fecundarii poate

fi o cauza de defect morfologic al ovocitului in marea majoritate a cazurilor (37%), mai rar un

defect al spermiei (14,8%) si de obicei embrionii au o evolutie normala [139].

Conform altor observatii, la ovocitele care dupa un numar de 17-27 ore de la inseminare nu au

prezentat aspectul de 2 PN s-a putut remarca a 2-a zi aspectul normal de clivare embrionara,

totusi 30% din zigoti si-au oprit evolutia a 2-a zi si rata de implantare a fost mai scazuta la acesti

embrioni comparativ cu cei proveniti din ovocite normal fecundate (6% comparativ cu 11,1%).

La analiza citogenetica s-au constatat anomalii cromozomiale ale acestor embrioni [140]; [141].

Fig.17 - Multipli PN (aberant)

Page 70: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

56

Fig.18 - Embrion cu 2 celule

Capitolul 5.7

Realizarea embriotransferului (ET)

Cuplul la care urmeaza sa se efectueze embriotransferul (ET) trebuie sa ia decizia impreuna cu

medicul si embriologul asupra numarului de embrioni ce urmeaza a fi transferati si asupra

posibilitatii crioconservarii zigotilor supranumerari. Se crioconserva zigotii cu 2 PN, clar vizibili,

cu zona pellucida intacta si cu contur celular regulat. La 48 ore de la punctia foliculara embrionii

ajung in stadiul de 4 pana la 8 blastomere. Se selecteaza embrionii calitativ inalti si se transfera

maxim 3 (in functie de particularitatile cazului chiar 1 sau 2 embrioni). Embrionii de ziua a 2-a

se afla de fapt in stadiul in care in vivo ei se regasesc in trompa. Clasificarea embrionilor in

functie de numarul blastomerelor, de marimea si forma lor, aspectul citoplamei si simetrie

incearca sa stabileasca embrionii calitativ cei mai buni. Aceste clasificari sunt insa incomplete si

sufera mereu imbunatatiri. O varianta de clasificare este urmatoarea [142]:

Gradul 1 – numar par sau impar de blastomere, regulate, sferice, zona pellucida intacta,

fragmentarea blastomerelor < 10%

Gradul 2 – apare neregularitate a formei si fragmentare ≤ 10%

Gradul 3 - < 50% din blastomere apar fragmentate, restul embrionului trebuie sa corespunda

gradului 2

Fig.19 - Embrion cu 4 blastomere

Page 71: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

57

Gradul 4 - > 50% din blastomere sunt fragmentate

Gradul 5 – zigot cu 2 PN in ziua a 2-a

Gradul 6 – blastomere lizate, embrion fara viabilitate.

Rata implantarii scade semnificativ odata cu cresterea gradului de apreciere calitativa a

embrionilor.

ET se realizeaza ziua 2 sau 3 de la recoltarea ovocitara. Se poate implanta embrionul si in stadiul

de blastocist, in ziua 5-6 de la punctia foliculara, stadiu in care embrionul patrunde in cavitatea

uterina in vivo si care se insoteste de un procent mai mare al implantarii (Fig. 20). Se prefera

embrionii calitativ inalti. Daca in ziua a 2-a se intalnesc doar zigoti cu 2 PN se mai pastreaza in

mediu de cultura inca o zi, pentru a se obtine clivarea scontata.

Fig.20 - Blastocist ziua a 5-a

Pacienta se afla in decubit dorsal pe masa ginecologica, cu membrele inferioare in

abductie. Se aplica un specul si se efectueaza lavajul vaginului cu ser fiziologic dupa care se

tamponeaza cu un tampon steril. Medicul (care poarta manusi sterile netalcate) va cateteriza

canalul cervical cu un cateter special de embriotransfer, patrunzand in cavitatea uterina in

imediata vecinatate a fundului uterin (fara insa a-l atinge). Se extrage mandrenul cateterului si se

asteapta embriologul. Aceasta manevra trebuie sa fie atraumatica.

In acest timp embriologul extrage embrionii din mediul de cultura, dupa ce i-a selectat pe cei mai

aspectuosi (1, 2 sau maxim 3 embrioni). Se aspira embrionii intr-un cateter impreuna cu mediu si

Page 72: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

58

se ataseaza unei seringi, ce contine de asemenea mediu. Volumul care se transfera este de 15-20

µl. Embriologul introduce cu miscari fine cateterul cu embrioni prin teaca cateterului plasat

intrauterin si injecteaza continutul (mediu si embrioni), dupa care este obligatorie verificarea

microscopica, pentru a nu se lasa embrioni pe parcursul cateterului. ET se poate efectua si

ecoghidat. Unele centre folosesc calciu ca marcaj (vizibil la ecoghidaj) pentru a indica pozitia

intrauterina a varfului cateterului. Daca ET a reusit se va extrage cateterul si speculul iar pacienta

ramane in repaus aproximativ 2 ore. Testul de sarcina se efectueaza la 10-12 zile dupa ET (β-

HCG). In aceasta perioada faza luteala este sustinuta cu progestativ: progesteron micronizat

(doza variabila, de obicei 3x200 mg/zi, intravaginal sau oral).

Conform unui studiu efectuat in anul 2004 (studiu dublu-orb, randomizat, controlat

placebo) la care s-au administrat 10 mg piroxicam per os cu 1-2 ore anterior ET, s-a constatat o

rata mai mare de implantare (18,7 versus 8,6%) si o rata mai mare de sarcini (46,7% versus

27,6%) comparativ cu lotul control. Pacientele care au intrat in studiu au avut varsta sub 40 de

ani; cauza tubara, masculina de sterilitate, endometrioza, infertilitate idiopatica. Nu s-a observat

un beneficiu al administrarii piroxicamului in cazul infertilitatii idiopatice sau la paciente peste

40 ani. La aceste paciente s-a efectuat FIV/ET cu embrioni proaspeti (ET la 72 ore dupa

inseminarea ovocitelor) sau cu embrioni decongelati (la 72 ore dupa declansarea ovulatiei).

Efectul se datoreaza posibil cresterii fluxului sanguin uterin, scaderii contractilitatii uterine ce

apare frecvent in cursul ET si care poate fi raspunzatoare de expulzia embrionului [143].

Capitolul 5.8

Rezultatele generale ale FIV

Initial rata de succes in urma FIV/ET a fost de 20-25%, actualmente rata

sarcinilor/embriotransfer depaseste in unele centre 25%. Desigur ca aceste procente sunt

influentate de varsta pacientei, de factorul masculin supraadaugat. In jur de 5% din sarcinile

obtinute sunt sarcini extrauterine, explicate probabil prin ovulatiile multiple si nivelurile

hormonale crescute prin suprastimulare [144].

Rata sarcinilor multiple este ridicata, se situeaza in jur de 30%, fiind crescuta si de ET cu

2 sau 3 embrioni. Rata avorturilor este comparativa cu populatia care concepe natural (in jur de

20 %). Un studiu efectuat intre anii 1994-1999 pe 6045 ET a constatat o rata de 16% avorturi

Page 73: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

59

(cazuri de sarcina incipienta, definita inainte de 6-7 saptamani de gestatie), avand ca factori de

risc fumatul si transferul unor embrioni de calitate redusa [145].

Ceea ce este deosebit de important si s-a constatat in urma supravegherii copiilor nascuti

din sacini provenite FIV/ET este ca acest procedeu nu creste numarul malformatiilor congenitale;

acestea se situeaza la nivelul populatiei care concepe pe cale naturala.

Datele furnizate de grupul Norfolk pentru rata cumulativa a sarcinilor pentru 1-6 cicluri

FIV/ET sunt urmatoarele [146]:

1 ciclu: 13,5%

2 cicluri: 25,3%

3 cicluri: 38,5%

4 cicluri: 47%

5 cicluri: 49,3%

6 cicluri: 57,8%

S-au exclus din start cuplurile cu factor masculin de sterilitate. Rata sarcinilor nu se modifica

radical la cicluri FIV/ET succesive. Pacientele care parcurg intre 3-6 cicluri au o sansa buna de-a

obtine sarcina. Datele sunt similare cu cele obtinute la Hallam Medical Centre (Londra) unde

45 % din femeile < 35 ani au nascut 1 copil in cadrul a 5 cicluri FIV/ET [147].

Capitolul 5.9

GIFT (gamete intrafallopian transfer) si ZIFT (zygote intrafallopian transfer)

De la primele reusite ale FIV pana in ziua de astazi s-au adus multiple perfectionari

metodei, dar au fost dezvoltate si alte procedee, in scopul de-a imbunatati rata sarcinilor. O

metoda de reproducere asistata este reprezentata de GIFT (gamete intrafallopian transfer), adica

transferul intratubar al gametilor. Ofera avantajul ca fecundatia are loc in vivo, embrionii se

formeaza in mediul lor natural si parcurg traseul lor fiziologic spre cavitatea uterina. Se evita

astfel riscul de expulzie al embrionilor, care exista in cazul unui ET. Transferul gametilor are loc

prin doua modalitati, fie se introduc in trompa pe cale laparoscopica prin capatul distal tubar, fie

se introduc transcervical-transuterin sub ghidaj ecografic [148]. Este important de injectat foarte

lent, cu o viteza de 1µl/secunda, iar volumul injectat este de asemenea redus (<50µl).

Page 74: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

60

Tehnica presupune obtinerea spermei cu minim 2 ore inainte de inceperea procedurii.

Sperma se obtine si se prepara ca la tehnicile descrise pentru FIV clasic. Se doresc in final

obtinerea a 3-5 milioane spermii mobile/ml, astfel incat in trompa se vor transfera 100.000-

200.000 spermii. Recoltarea ovocitara are loc prin punctie foliculara transvaginala ecoghidata

direct (transvaginal), metoda care a fost expusa la FIV conventionala. Recoltarea ovocitara se

mai poate efectua pe cale laparoscopica, dar foarte rar. In urma aspiratului folicular se identifica

ovocitele, se spala si se selecteaza cele mature (metafaza II). Manipularea ovocitelor se face in

conditii constante de temperatura, pentru a evita degradarea lor datorita variatiilor termice. Pe o

placa Petri calda (37°C) se picura 50-100 µl din suspensia spermei prelucrate si ulterior se

transfera ovocitele. Se spala o seringa si un cateter GIFT cu mediu de cultura si se aspira

amestecul ovocite-sperma (20 µl aer, 30-40 µl ovocite+sperma, 10-20µl aer). In cazul in care

volumul de sperma a fost insuficient, se prefera aspirarea in cateter dupa cum urmeaza: 20 µl aer,

10-15 µl sperma, 10 µl ovocite suspendate in mediu, 10-15 µl sperma, 20 µl aer [142].

Continutul cateterului se transfera imediat in trompa. La sfarsitul procedurii este

obligatorie examinarea cateterului sub microscop, pentru a nu ramane ovocite pe parcursul

acestuia.

Rata sarcinilor obtinute in urma procedeului GIFT, conform datelor provenind din SUA

si Canada pe anul 1991, au fost de 26,5% nasteri/punctie foliculara. In acelasi an (1991) rata

sarcinilor pentru FIV/ET a fost de 15,25%/punctie foliculara (18% pentru femeile de varsta <40

ani). S-a exclus din start factorul masculin. Numarul de sarcini extrauterine a fost comparabil

pentru cele doua tehnici (3% pentru GIFT si 5% pentru FIV/ET) si numarul de sarcini multiple a

fost de asemenea comparabil (aproximativ 30%) [149].

World Collaborative Report on Assisted Reproduction a publicat in 1993 rezultatele a

99.314 de cicluri FIV/ET, dintre care 10% au fost reprezentate de GIFT. Rata sarcinilor clinice in

cazul FIV a fost de 17,9% si o rata de nou nascuti vii de 12,9%. Comparativ cu FIV, in cazul

GIFT procentele au fost mai ridicate: 29,3% rata sarcinilor clinice si 20,8% procentul nou

nascutilor vii. Probabil ca acestea se datoreaza faptului ca procesul de fecundare se realizeaza in

vivo, in conditiile sale naturale, cu parcurgerea unui traseu natural pana la implantare, implicand

inca o serie de factori necunoscuti [150].

O alta posibilitate de transfer intratubar (tot in ideea de-a creste rata implantarii si a

sarcinilor) presupune plasarea zigotului la acest nivel (ZIFT – zygote intrafallopian transfer),

Page 75: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

61

modalitatile de transfer fiind ca la GIFT. Statisticile din anul 1991 arata ca numarul de

sarcini/punctie ZIFT este de 19,7%. Odata cu introducerea ZIFT entuziasmul a fost mare, dar

actualmente se considera ca ZIFT nu este superior FIV/ET.

Conform datelor din unele cercetari clinice rezultatele FIV sunt comparabile cu cele

GIFT/ZIFT [151]; [152].

Alegerea uneia dintre variante depinde si de istoricul pacientei. Daca a fost verificata

fecundarea cu alta ocazie, se poate tenta GIFT. Evident ca daca exista leziune tubara, cele 2

metode - GIFT si ZIFT, nu isi au rostul si se aplica FIV/ET.

S-a mai descris si transferul tubar de embrioni (TET – tubal embryo transfer) care

presupune transferul embrionilor clivati in trompa sau POST (peritoneal oocyte and sperm

transfer) – transferul de ovocite si sperma intraperitoneal, metode care sunt de ordin istoric [153].

Page 76: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

62

Capitolul 6

Tehnici de micromanipulare in cadrul reproducerii umane asistate

Capitolul 6.1

Tehnici de micromanipulare premergatoare ICSI

Esecul fecundarii la procedeul conventional de FIV/ET este o problema majora in cazul

cuplului cu factor masculin preponderent. Rata fertilizarii in aceste cazuri este cu mult mai

scazuta fata de alte etiologii ale sterilitatii (factor tubar, endometrioza, chiar si infertilitatea

idiopatica). In anii ′80 s-au pus la punct metode de microinjectie care au reusit imbunatatirea

procentului fertilitatii si la aceste cupluri cu factor masculin. Scopul este de a indeparta barierele

naturale care se afla in calea spermatozoizilor, spermatozoizi care prezinta anomalii de numar,

mobilitate sau asocierea acestora, posibil si alti factori.

Este vorba de procedeele ZD (zona drilling – perforarea zonei pellucida, Gordon si colab.), PZD

(partial zona dissection – disectia partiala a zonei pellucida) (Cohen si colab.), SUZI (subzonal

insemination – inseminarea subzonala) (Ng si colab.), ICSI (intracytoplasmic sperm injection-

injectarea intracitoplasmatica a unui spermatozoid intr-un ovocit) (Lanzendorf si colab., Palermo

si colab.), care au imbunatatit substantial ratele de fertilizare si au crescut si ratele de implantare

in mod simtitor. Reprezinta un enorm progres al tehnicilor de reproducere asistata.

Zona drilling (ZD) a fost efectuata pentru prima oara pe embrion uman de catre Gordon

si Talansky in anul 1986, reusind digestia enzimatica a zonei pellucida cu o solutie acida Tyrode.

S-a dovedit ulterior ca aceasta substanta inhiba dezvoltarea embrionara si metoda a fost

abandonata [154].

O alta varianta de penetrare a zonei pellucida pentru a usura patrunderea spermiilor este

PZD (partial zona dissection). A fost practicata in 1989 de Cohen si colab.[155]; [156].

Dupa creearea unui orificiu la nivelul zonei (metoda mecanica) s-a incubat ovocitul cu sperma

(100.000 spermatozoizi/ 50 µl). Rata fertilizarii a fost imbunatatita si rata sarcinilor a crescut.

Totusi o deschidere mai mare la nivelul zonei poate face embrionul vulnerabil la alti factori sau

poate favoriza eliminarea unor blastomere prin acest orificiu [157]. PZD se poate aplica unor

Page 77: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

63

cupluri cu factor masculin moderat modificat, nu se poate realiza daca nu exista spermatozoizi

capacitati, cu reactie acrozomiala si mobili; doar acestia pot patrunde liber prin orificiul creeat.

Se intalneste mai frecvent in cazul PZD polispermia, ceea ce reduce implicit numarul de

embrioni pentru ET.

O tehnica mai elaborata, care faciliteaza si mai mult penetrarea spermiilor prin inlaturarea

si mai accentuata a obstacolelor, este SUZI (subzonal insemination). Prima sarcina obtinuta dupa

acest procedeu de microinjectie/micromanipulare a fost in 1988 (Ng si colab.) [158]. Se

injecteaza aproximativ 3-5 spermatozoizi in spatiul perivitelin (se evita injectarea unui numar

foarte mare pentru a nu favoriza polispermia). La fel ca si pentru metoda anterioara (PZD) doar

spermatozoizii capacitati si cu reactie acrozomiala pot penetra in continuare oolema, dar spre

deosebire de PZD, in cazul SUZI se pot injecta spermatozoizi imobili sau cu mobilitate foarte

scazuta. Se aplica cazurilor cu oligozoospermie, astenozoospermie, teratozoospermie sau

combinarea acestora [159].

Capitolul 6.2

ICSI (intracytoplasmic sperm injection)

ICSI (intracytoplasmic sperm injection) implica injectarea directa a unui singur

spermatozoid in interiorul ovocitului. ICSI a fost aplicata ca tehnica inca din anii ’60 pe model

experimental pentru a cerceta succesiunea evenimentelor ce au loc in cadrul fecundarii [160].

Ulterior s-a aplicat pe scara larga in modelele experimentale in studiul fuziunii gametilor, a

formarii celor 2 PN. La om a fost introdusa de diverse grupuri de studiu (Cohen si colab.,

Lanzendorf si colab., Ng si colab., Palermo si colab., Fishel si colab.) intre anii 1988-1992.

Lanzendorf si colab. au efectuat prima ICSI pe ovocit uman in scopul studierii formarii

pronucleului masculin [161], [180].

Prima sarcina obtinuta la om a fost in 1992 de catre Palermo si colab. [162]. Tehnica

ICSI scurtcircuiteaza penetrarea oolemei si fuziunea cu membrana ovocitara si poate injecta

intraovocitar orice spermatozoid. S-a demonstrat ca dupa injectarea capului spermatozoidului se

produce decondensarea si eliminarea materialului genetic cu formarea ulterior a pronucleului

masculin. Astfel ca se poate injecta si spermatozoid imobil sau mort sau cu defecte majore [163].

Page 78: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

64

Injectarea capului spermatozoidului sau numai a nucleului are ca efect decondensarea

nucleului; centriolul proximal (din portiunea intermediara) va forma fusul mitotic si joaca un rol

important in formarea si dezvoltarea embrionului. Prin aceasta se deduce ca atat capul cat si

piesa intermediara a spermatozoidului au rol in dezvoltarea embrionului [164]. Imobilizarea

mecanica a spermatozoidului (anterior efectuarii ICSI) prin compresia si rularea cozii sale induce

in grad variabil alterarea si in unele situatii chiar pierderea acrozomului, modificare ce se

insoteste de o rata mai crescuta a fertilitatii [186].

Prin perfectionarea acestei tehnici de microinjectie s-au adus mari sperante cuplurilor

carora pana atunci le era imposibil sa conceapa. Succesul ICSI depinde de tehnica injectarii,

caracteristicile spermei si ale ovocitelor (maturarea ovocitara). Factorul decisiv este insa

activarea ovocitului si nu reactia acrozomiala [165].

Nu este inca clar stabilit care este factorul de activare ovocitara, se pare ca spermatozoidul joaca

acest rol, posibil prin eliberarea unui factor citoplasmatic [164].

Dintre toate procedeele de micromanipulare care se aplica in caz de factor masculin de

infertilitate, este evident ca ICSI are procentul cel mai crescut de reusita, s-au obtinut cele mai

mari rate de sarcini, fiind actualmente metoda preferata pentru reproducerea asistata.

Indicatiile ICSI

Ejaculat:

- oligozoospermie (< 20 x106)

- astenozoospermie (< 40% spermatozoizi cu mobilitate progresiva, din care minim 10% sunt tip

„a”)

- teratozoospermie (conform criteriilor stricte ale lui Kruger < 14% forme normale)

combinarea celor 3 parametri

- globozoospermie

- anticorpi antispermatici prezenti (testul MAR pozitiv)

- esecul repetat la FIV/ET conventional (absenta fecundarii)

- ejaculare retrograda

Sperma din epididim (absenta congenitala a vaselor deferente, esec la reanastomoza dupa

sterilizarea masculina – vaso-epididimostomie sau vaso-vasostomie, obstructie bilaterala

a ductelor deferente)

Page 79: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

65

Spermatozoizi testiculari (indicatiile spermei epididimale, fibroza epididimala,

azoospermia de diverse cauze, necrozoospermia)

Succese mai mari se obtin la injectarea unui spermatozoid mobil intraovocitar. Daca nu se

depisteaza in proba de sperma decat spermatozoizi imobili, se recurge la teste de viabilitate.

Testul cu eozina exclude spermatozoizii morti. Testul de reactie la mediul hipoosmotic urmareste

identificarea spermatozoizilor vii, care avand membrana intacta si introdusi in mediul salin

hipoosmotic acumuleaza apa in portiunea lor distala. Acestia vor fi selectati pentru ICSI [166].

Unele studii au considerat ca anticorpii antispermatici nu influenteaza negativ sansele ICSI

[167].

In cazul in care in ejaculat nu se gasesc spermatozoizi vii se poate recurge la obtinerea unei

probe testiculare de spermatozoizi.

Obtinerea spermatozoizilor din epididim se face printr-o metoda microchirurgicala – MESA

(microsurgical epididymal aspiration) care presupune extragerea lor prin aspirare, sub anestezie

generala. Mai rar se foloseste PESA (percutaneous epididymal sperm aspiration) care este o

aspirare percutana efectuata in anestezie locala [168]. Daca nici in proba epididimala nu se

gasesc spermatozoizi se apeleaza la biopsia testiculara. Uneori si aceasta poate fi repetata. Se

intalnesc situatii la care nici in cazul biopsiilor testiculare repetate (in cazul azoospermiei) nu se

identifica spermatozoizi. Ca tehnica se practica fie o biopsie testiculara deschisa, excizionala

(TESE – testicular sperm extraction) sau o biopsie prin aspirare pe ac subtire [169]. Prelucrarea

pieselor de biopsie se face fie mecanic, fie enzimatic. Foarte frecvent se crioconserva

spermatozoizii din piesele de biopsie sau din epididim, evitand astfel procedeele

microchirurgicale [170].

Capitolul 6.3

Tehnica microinjectarii

Pentru a efectua procedeul ICSI este necesara o aparatura performanta, care sa permita

injectarea unui spermatozoid intr-un ovocit. Echipamentul pentru ICSI presupune un microscop

cu lumina inversata, cu putere de marire de 200-400 x, cu placa de lucru ce se incalzeste si

mentine temperatura constanta. La acest microscop sunt atasate 2 unitati de manipulatori care

permit miscari in cele 3 planuri, un manipulator electric ce permite miscari mai ample, mai putin

fine si un manipulator hidraulic cu un joystick, care este utilizat la miscarile fine. Micropipetele

Page 80: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

66

de sticla, care sunt dirijate de manipulatoarele descrise, au rolul de-a fixa ovocitul (una dintre

pipete) si de-a aspira si ulterior injecta spermatozoidul (cealalta pipeta) (Fig. 21). Sistemul de

manipulare este conectat de micropipete prin tuburi de teflon, in care se afla ulei mineral. Cele 2

micropipete au lungimea de 10 cm, prezinta cateva diferente intre ele, amandoua sunt insa

angulate, formand intre cele 2 brate un unghi obtuz si cu orizontala un unghi de 30°. Micropipeta

de fixare are orificiul extern al bratului scurt (nivelul la care se fixeaza ovocitul) sectionat

vertical, diametrul extern este de 80-100µ si cel intern de 15-20µ. Micropipeta de aspirare-

injectare are varful bratului scurt retezat oblic (nivel la care se aspira spermatozoidul, se inteapa

oolema si apoi se injecteaza), diametrul interior: 5-6µ si cel extern: 7-8µ. Aceste micropipete se

comercializeaza industrial, exista insa centre/laboratoare care le manufactureaza singure.

Intregul sistem de micromanipulare este plasat pe o masa rezistenta la vibratiile din mediul

extern. Se poate atasa un monitor la sistemul optic si se urmareste procedeul pe ecranul

monitorului. De asemenea exista si posibilitatea efectuarii unor filmari sau a unor imagini statice.

Fig.21 - Cele 2 micropipete de sticla ale sistemului de microinjectie

Ovocitele se recolteaza in aceeasi maniera ca si in FIV conventionala. Se alege procedeul cel

mai potrivit de stimulare ovariana si aspirarea foliculara are loc la 36 ore dupa administrarea

HCG, prin punctie vaginala ecoghidata transvaginal. Eprubetele cu lichidul folicular sunt

preluate de embriolog, se identifica ovocitele, se indeparteaza cumulus oophorus si corona

radiata (mecanic si enzimatic cu hialuronidaza) pentru o mai buna apreciere a maturitatii

celulelor si pentru a permite injectarea acestora. Pentru ICSI se aleg doar ovocitele mature –

Page 81: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

67

metafaza II (si nu ovocite imature sau degenerate ca in Fig. 22). Se vizualizeaza la microscop cu

marire optica 200x, se analizeaza si apectul zonei pellucida, care trebuie sa fie intacta. Ovocitele

cu vezicula germinala prezenta se cultiva in mediu 24 ore si se injecteaza ulterior (in cazul in

care ovocitele in metafaza II sunt putine). S-au obtinut putine sarcini in urma injectarii ovocitelor

imature [171]. Dupa selectarea ovocitelor mature, spalate si denudate, acestea se pastreaza in

incubator in mediul de cultura pana in momentul injectarii.

Fig. 22 - Ovocit degenerat

Spermatozoizii pentru microinjectie se obtin fie din prepararea ejaculatului sau prin procedee

microchirurgicale - spermatozoizi obtinuti de la nivelul epididimului sau testicul. De asemenea

se poate prelucra sperma crioconservata. Prepararea spermei a fost deja expusa.

Tehnica de injectare propriu-zisa consta in plasarea unei placi speciale pe suprafata incalzita

a microscopului (37°C), placa care are 1 godeu central ce contine solutie PVP

(polivinilpirolidona) si 1µl din suspensia de sperma, plasata la periferia picaturii PVP. Rolul

solutiei PVP este de-a incetini miscarea spermiilor, pentru ca acestea sa fie mai usor aspirate si

totodata previne aderarea spermiilor de peretii micropipetei. Godeul central este inconjurat de

alte 8 godeuri ce contin fiecare cate un ovocit plasat in mediul de cultura, acoperit cu ulei

mineral. (Fig. 23) Microinjectia se efectueaza la microscopul cu lumina inversata, la marire

optica de 400x.

Page 82: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

68

Fig. 23 - Placa de microinjectie cu cele 9 godeuri

Se urmaresc 3 etape importante:

- selectarea si aspirarea spermatozoidului (de preferat mobil) in micropipeta

- pozitionarea corecta a ovocitului (prin fixarea lui cu micropipeta de fixare)

- inteparea mebranei ovocitare inainte de injectarea spermatozoidului.

Primul timp este de alegere al spermatozoidului viu, mobil si care dupa imobilizare se aspira in

micropipeta corespunzatoare. In momentul aspiratiei se urmareste lezarea cozii

spermatozoidului, dar intotdeauna la un punct inferior de piesa intermediara (care contine

centriolul proximal). S-a dovedit ca imobilizarea spermiei are rol in activarea ovocitara, care

constituie un punct cheie in mecanismul fecundarii (prin eliberarea unor factori citozolici din

spermie). Aspirarea spermatozoidului in micropipeta are loc intotdeauna intai cu coada, astfel

incat capul spermiei se afla intotdeuna mai aproape de varful micropipetei. Se urmareste

injectare celulei impreuna cu un volum minim de mediu. Se aspira de fiecare data doar un

spermatozoid in pipeta, pipeta ce contine solutie PVP.

Micropipeta de fixare va mentine intr-o pozitie stabila ovocitul, printr-un usor proces de

aspirare. S-a constatat ca pozitionarea corecta este cea cu globulul polar in pozitia „6”, perforarea

oolemei avand loc la ora „3” si micropipeta de fixare imobilizeaza ovocitul la ora „9” (Fig. 24).

Page 83: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

69

In aceasta pozitie nu se lezeaza fusul mitotic in cursul injectarii. Urmatorul pas este de penetrare

a zonei pellucida (relativ usor) si a oolemei (mai dificil) cu varful micropipetei ce contine

spermatozoidul. Penetrarea are loc in planul ecuatorial al ovocitului (Fig. 25). Pentru a facilita

inteparea membranei ovocitare se aspira usor cu micropipeta de aspirare (artificiu de tehnica). O

accelerare a fluxului semnifica penetrarea membranei si patrunderea ooplasmei in micropipeta.

Se opreste suctiunea si se injecteaza incet spermatozoidul in citoplasma ovocitului (Fig. 26),

dupa care se retrage micropipeta de aspiratie. In acelasi mod se procedeaza cu urmatoarele

ovocite. Se injecteaza doar un spermatozoid intr-un singur ovocit (Fig.27). Nu se injecteaza mai

mult de 3-4 ovocite succesiv intr-o etapa.

Fig. 24 - Fixarea ovocitului

Fig. 25 - Inteparea oolemei, spermatozoidul se vizualizeaza in micropipeta

Page 84: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

70

Fig. 26 - Injectarea spermatozoidului

Dupa injectarea tuturor ovocitelor, acestea se spala, se transfera in placi ce contin mediu de

cultura, acoperit cu ulei de parafina si se introduc la incubator (temperatura 37°C, atmosfera de

5% O2, 5% CO2, 90% N2). Controlul fertilizarii are loc la 16-20 ore de la microinjectarea

ovocitelor, prin vizualizarea celulelor cu 2 PN, la fel ca si in cazul FIV clasice (Fig. 28). Si in

cazul ICSI, embriologul noteaza pe o fisa tip datele pacientei, numarul de ovocite injectate,

gradul lor de maturare, aspectul lor, aspectul zonei pellucida, descrierea spermatozoizilor si

provenienta lor, procedeul de prelucrare a spermei, eventual daca s-a folosit sperma

crioconservata. La controlul fecundarii se noteaza aspectul celulelor, numarul PN si al globulilor

polari. Se aleg pentru ET (embriotransfer) doar celulele cu 2 PN. Ovocitele injectate care

prezinta doar 1 PN (aproximativ 3%) posibil ca au rezultat din activare partenogenetica si nu se

transfera. Ovocitele injectate ce au 3 PN (aproximativ 4 %) probabil ca nu au eliminat cel de-al

2-lea globul polar si nici acestea nu se transfera [172].

Fig.27- ICSI, ovocit fixat, cu primul globul polar in pozitia „12” (mai rar)

Page 85: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

71

Fig.28 - Prezigot, sunt vizibili cei 2 PN

Ovocitele cu 2 PN care au fost selectate pentru ET se pastreaza in mediu de cultura in

incubator inca 24 ore. Dupa aceea se examineaza la microscop si se apreciaza numarul si

aspectul blastomerelor, fragmentarea celulara. Se stabileste o clasificare a calitatii embrionilor

dupa dimensiunea si egalitatea blastomerelor si numarul de fragmente anucleate.

Sunt 4 categorii de incadrare a embrionilor:

• Tip A: embrioni calitativ foarte buni, fara fragmente anucleate, blastomerele au aceeasi

marime;

• Tip B: embrioni calitativ buni, blastomere inegale si fragmente anucleate ≤ 20% din

volumul embrionului;

• Tip C: embrioni calitativ mediu, fragmente anucleate 21-50% din volumul embrionului;

• Tip D: embrioni slab calitativ, cu fragmente anucleate ≥ 50% din volumul embrionului.

In urma acestei clasificari se transfera doar embrionii de tip A,B,C. Se prefera transferul a 2

embrioni, in functie de particularitatile cazului si 3 embrioni, dar niciodata peste 3 embrioni.

Datele actuale sustin ca in urma ciclurilor de stimulare ovariana in vederea ICSI este posibil in

90% din cazuri transferul a macar unui embrion si nu exista influente determinate de provenienta

spermatozoizilor [172].

Page 86: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

72

De obicei se transfera embrioni de 48 ore, dar s-au obtinut rate similare de implantare si

in cazul transferurilor cu embrioni de 72 ore (Fig. 29 a si b). Embrionii tip A sau B care sunt in

plus se pot crioconserva.

Fig. 29 a si b - Embrioni (ICSI) cu 8 blastomere (72 ore) (in imaginea b: in planul focusat se

vizualizeaza 6 din cele 8 blastomere)

Modalitatea de ET este similara cu cea din FIV clasica, descrisa deja. Sustinerea fazei

luteale are loc de asemenea cu progesteron (doze variabile, intravaginal sau oral) – cel mai

frecvent sau cu HCG (administrat intramuscular). Efectuarea testului de sarcina prin

determinarea β-HCG are loc la 10-12 zile de la ET.

Capitolul 6.4

Rezultatele ICSI

Odata cu introducerea tehnicii ICSI si cu perfectionarea echipelor de lucru a crescut tot

mai mult numarul practicarii acestui procedeu, astfel ca in 1993 s-au raportat 3.157 cicluri ICSI,

numarul lor a crescut la 12.586 in 1994 si in 1995 a ajuns la 47.654 (Tarlatzis, 1996) [173].

a b

Page 87: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

73

Cel de-al 2-lea raport al ESHRE Task Force despre ICSI cuprinde rezultatele a 13.666

cicluri ICSI efectuate in 1994 de catre 94 centre in 24 tari [174].

Din aceste cicluri ICSI in 94,4% s-au injectat spermatozoizi din ejaculat, in 4,1% din epididim si

in 1,5% spermatozoizii erau de provenienta testiculara. In 12.284 din aceste cicluri s-au obtinut

in medie 8,3 ovocite/ciclu stimulat. Rata de supravietuire a ovocitelor dupa ICSI (dupa injectare)

a fost de aproximativ 90%, nu s-au observat diferente in functie de provenienta spermiilor. Rata

sarcinilor (β-HCG pozitiv)/punctie foliculara a fost intre 28-32,8%, de asemenea nu s-au

semnalat diferente semnificative intre cele 3 grupe de spermii. Din numarul total de sarcini s-au

nascut in 71,2 % din cazuri – 1 copil, in 26,2% din cazuri – gemeni si in 2,4% din cazuri-tripleti.

In dorinta de-a cunoaste cat mai clar siguranta si eficacitatea ICSI, Societatea Europeana

de Reproducere Umana si Embriologie (ESHRE) a stabilit cateva obiective majore in scopul de-a

colecta anual rezultatele clinice. Aceste rezultate insumate pe perioada 1993-1995 (din centrele

unde se efectueaza ICSI) au aratat ca din totalul de 39.675 de cicluri – 36.774 au folosit

spermatozoizi din ejaculat, 1784 spermii din epididim si 1153 cicluri – spermii din testicul. Rata

de fertilizare raportata la originea spermatozoizilor a fost de 61,5% pentru ejaculat, 57,6% pentru

epididim si 51,5% pentru testicul. Rata sarcinilor viabile a fost de 23,9%; 25,7% si respectiv

31,3%. Prin urmare rata fertilizarii si a sarcinii a fost crescuta si nu a depins de provenienta

spermatozoizilor. Nu s-a remarcat un risc mai crescut pentru malformatii majore sau minore si a

fost considerat ca similar fata de FIV/ET sau conceptia naturala. Pe de alta parte, incidenta

aberatiilor legate de cromozomul sexual si a celor autozomale au fost mai crescute la copiii

rezultati din sarcini ICSI fata de populatia neonatala generala. Explicatia rezida in mostenirea

anomaliilor cromozomiale provenite de la mama cat si defecte depistate de-novo la nivelul

cromozomilor sexuali si autozomali [183].

O statistica pe un numar de 2820 cicluri ICSI (Liu si colab., 1995) a aratat urmatoarele

rezultate: s-au injectat 29.415 ovocite in metafaza II, adica o medie de 10,4 ovocite/ciclu.

Numarul de ovocite intacte dupa ICSI a fost de 26.228 (89,2% din ovocitele injectate). Numarul

de ovocite injectate cu succes/ciclu a fost de 9,3. Numarul de ovocite fertilizate a fost 18.364,

adica 70% din ovocitele injectate cu succes, care reprezinta 62,4% din ovocitele in metafaza II,

respectiv 50,4% din ovocitele obtinute/punctie foliculara. Numarul de ovocite ce au prezentat

fertilizare anormala a fost de 2185 (care au prezentat prezigoti cu 1 PN si cu 3 PN). In tabelul 6

Page 88: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

74

sunt redate sumarizat datele fertilizarii si a dezvoltarii embrionare in functie de provenienta

spermei utilizate in cadrul ICSI [175].

Tabel 6 - Statistica pe 2820 cicluri ICSI cu spermii de diferite proveniente

Spermii din ejaculat Spermii din epididim Spermii din testicul

Cicluri ICSI 2572 128 120

Ovocite injectate 26.343 1.628 1.444

% ovocite intacte

dupa microinjectare

89% 90% 89%

Celule cu 2 PN 16.758 844 767

% embrioni transferati 74 67 71

Din tabel reiese ca numarul de embrioni transferati a fost ceva mai mare in cazul ICSI cu

spermatozoizi din ejaculat fata de cei obtinuti din epididim si din testicul.

Tabel 7 - Rata sarcinilor in functie de numarul de embrioni transferati si de provenienta

spermatozoizilor

Ejaculat Epididim Testicul

Numar % Numar % Numar %

Cicluri 2572 - 128 - 120 -

Transfer 2382 93 117 91 108 90

Sarcini/ET

1 embrion 21/204 10 1/7 14 2/14 14

2 embrioni 78/321 24 3/15 20 4/13 32

2 embrioni (electiv)

218/488 45 3/14 21 3/12 25

3 embrioni 253/694 36 17/37 46 10/21 48

3 embrioni (electiv)

254/544 47 17/24 71 11/20 55

>3 embrioni 47/131 36 9/20 45 13/28 46

Sarcini/ET 871/2382 37 50/117 43 43/108 40

Sarcini/ciclu 34 39 36

Page 89: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

75

Daca se analizeaza la acelasi numar de cicluri ICSI rata sarcinilor /numar embrioni

transferati si dependent de provenienta spermatozoizilor se obtin datele sumarizate in tabelul 7.

Din tabel reiese ca din cele 2820 cicluri ICSI initiale s-a efectuat embriotransfer in 2607

(92,6%) cicluri. Rata de transfer a fost comparabila la cele 3 grupuri care au folosit

spermatozoizi de la 3 niveluri diferite. Rata sarcinilor/transfer a fost de asemenea similara pentru

ICSI cu spermatozoizi din ejaculat (37%) fata de spermatozoizi din epididim (43%) si din

testicul (40%). Rata sarcinilor a fost influentata pozitiv daca ET s-a efectuat cu 2 sau 3 embrioni

electivi.

Statisticile expuse si multe alte studii clinice efectuate ulterior confirma rata de fertilizare

si de implantare crescuta, eficienta crescuta a metodei ICSI fata de celelalte tehnici de

reproducere asistata in cazul sterilitatii de cauza masculina.

Alegerea unei metode de reproducere asistata depinde de factorul de infertilitate, de

succes, de costurile procedurii si nu in ultimul rand de riscuri. FIV/ET clasic, conventional are ca

indicatie clara factorul tubar de sterilitate, endometrioza, factorul masculin usor alterat, PCOS,

factorul idiopatic. GIFT si ZIFT nu se aleg in caz de afectiuni ale trompelor. Totodata GIFT si

ZIFT cu transfer per laparoscopic necesita sala de operatie, anestezie si cresc costurile metodei.

Exista si situatii rare in care o patologie a colului uterin poate contraindica transferul

transcervical de embrioni si atunci se prefera GIFT sau ZIFT. ICSI este de departe preferata in

caz de factor masculin cu afectare de diverse grade, in special in afectare severa sau in caz de

esec repetat al FIV/ET [153].

Succesele tehnicilor de reproducere asistata in Germania pe anul 2002 sunt redate

comparativ - FIV/ET si ICSI - in Registrul National de FIV (Deutsches IVF Register - DIR)

conform tabelului 8 [117].

Page 90: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

76

Tabel 8 - Succesele tehnicilor de reproducere umana in Germania (2002)

Numar Procent

Cicluri stimulate 69961 100 %

Punctii foliculare 62306 91,3%

Rata fertilizarii

FIV 21502 89,8%

ICSI 36465 96,7%

Sarcini clinice

FIV 5632 26,2%

ICSI 9696 26,6%

„Baby-take home” rate

FIV 2708 12,6%

ICSI 4855 13,3%

Datorita multor aspecte necunoscute ale ICSI, sarcinile cuplurilor care apelau la acest

procedeu au fost urmarite foarte atent, respectiv evolutia ulterioara a copiilor a fost atent studiata.

S-au efectuat multiple diagnostice prenatale in scopul de-a sesiza aberatiile cromozomiale si mai

ales daca aceasta tehnica de microinjectie favorizeaza ea insasi anomaliile cromozomiale. In

1995 s-au efectuat diagnostice prenatale (prin biopsie de vilozitati coriale sau amniocenteza) la

primele 486 de sarcini obtinute prin ICSI si s-au constatat 6 (1,2%) anomalii cromozomiale,

dintre care 1 trisomie 21 (0,2%) (la o pacienta de 41 ani) si restul de 5 – anomalii ale

cromozomilor sexuali. Observatiile au condus la faptul ca se iregistreaza o foarte usoara crestere

a aberatiilor legate de cromozomii sexuali [176].

Din 877 copii nascuti din sarcini ICSI (1995) la 23 (2,6%) s-au inregistrat malformatii

congenitale majore, insa procentul nu este crescut comparativ cu malformatiile obtinute in

populatia generala [177].

In’t Veld si colab. [181] raporteaza o incidenta crescuta a aberatiilor cromozomiale legate

de cromozomul sexual, depistata intr-un numar redus de teste de diagnostic prenatal, dependente

de varsta materna. Alte rezultate in urma testelor prenatale [180] efectuate pe 1082 sarcini

obtinute prin ICSI (la Centre for Reproductive Medicine of the Brussels Free University

Hospital) au constat ca din cele 690 amniocenteze efectuate - 15 au prezentat anomalii, din 392

Page 91: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

77

biopsii de vilozitati coriale - 13 au fost anormale; 7 cordocenteze - care au fost probe martor

anterioare unor amniocenteze si care au fost normale. Varsta medie a gravidelor carora li s-a

efectuat amniocenteza a fost de 32,7 ani si a celor cu biopsie de vilozitati coriale – 32,1 ani. S-a

constatat un procent de 1,66% (numar de paciente: 18) anomalii cromozomiale. Dintre acestea, 9

(0,83%) au fost legate de cromozomul sexual si alte 9 anomalii (0,83%) au fost autozomale. Este

considerat semnificativ crescut procentul aberatiilor cromozomiale legate de cromozomul sexual.

Incidenta aberatiilor autozomale (trisomii) poate fi corelat cu varsta materna, iar a celor

structurale care este mai mare fata de populatia generala (si in procent mai crescut fata de

literatura: 0,36% versus 0,07%) [182] se poate explica prin patologia factorului masculin, care

este purtator de anomaliile structurale.

Cu toate ca in urma acestor constatari nu exista motive majore de ingrijorare referitor la

procentul malformatiilor congenitale in urma aplicarii ICSI, totusi unul din obiectivele majore

referitor la ICSI stabilite de Societatea Europeana de Reproducere Umana si Embriologie

(ESHRE Task Force) este acela de urmarire in continuare a copiilor proveniti din sarcini ICSI

[178]; [183].

Un studiul multicentric a incercat stabilirea unui profil psihologic al copiilor la varsta de

5 ani si care provin din sarcini ICSI, comparativ cu copiii din sarcini obtinute prin conceptie

naturala. S-au ales cativa parametri ce au fost respectati pentru toti copiii (varsta mamelor, varsta

copiilor, genitorii). Din punct de vedere al dezvoltarii cognitive nu s-au sesizat diferente. In

cadrul unor subteste s-au observat insa diferente semnificative care implica activitatile motorii de

asamblare, de desen, la un numar mare de copii ICSI. Au fost puse pe seama prezentei stress-ului

mai crescut in familiile cu copii ICSI, cu diferente in educatie, ce pot induce unele tulburari

comportamentale la copil. Si aceste aspecte ale evolutiei psihologice la copiii ICSI necesita studii

suplimentare [184]; [185].

Page 92: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

78

B. Partea speciala

Studiu comparativ pe 3 ani al administrarii agonistilor-

GnRH si al antagonistilor-GnRH in reproducerea

umana asistata cu referire la rata sarcinilor

Observatii si discutii

Page 93: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

79

Obiectivele acestor statistici analizate separat pe cei 3 ani (1999- 2000-2001) si ulterior

insumarea datelelor pe perioada totala, urmaresc stabilirea unor parametri clinici sau/si

paraclinici, care pot influenta raspunsul la terapia aplicata, adica tratamentul supresiv hipofizar

realizat prin intermediul agonistilor-GnRH si stimularea ovariana controlata. Studiul acestei teze

incearca sa desprinda unele observatii referitoare la eficienta terapiei agoniste versus antagoniste,

care in final se rasfrange asupra ratei sarcinii, ce constituie scopul final al reproducerii asistate.

Medicatia agonista este utilizata de o perioada mai lunga si s-a „incetatenit” atat pentru

practicieni, cat si pentru paciente. Substantele antagoniste sunt sintetizate de data recenta si

experienta cu administrarea lor fireste ca nu o depaseste pe ce a agonistilor-GnRH. La

introducerea in practica clinica au avut de intampinat unele reticente. Datele din literatura bazate

pe studii clinice dovedesc daca nu superioritatea fata de agonisti, dar totusi unele avantaje ale

antagonistilor-GnRH care trebuie luate in considerare.

Voi analiza pacientele care au apelat la tehnici de reproducere asistata si carora li s-au

administrat agonisti-GnRH sau antagonisti-GnRH in scopul inhibarii secretiei hipofizare

endogene. Efectele agonistilor- si ale antagonistilor-GnRH si rolul lor in cadrul reproducerii

asistate a fost detaliat pe larg in partea generala a tezei.

Page 94: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

80

Capitolul 1 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu agonisti-GnRH in reproducerea umana asistata

Capitolul 1.1

Statistica pe anul 1999 – agonisti-GnRH

a. Material si metoda

In anul 1999 s-au adresat in vederea reproducerii asistate si au fost selectionate un grup de

258 paciente.

Varsta medie a pacientelor a fost de 34,2 ani, cu mediana de 34,5 ani. Pacienta cea mai tanara

din grupul analizat a fost de 21 ani, respectiv varsta cea mai inaintata a fost de 46 ani. Repartitia

pe grupe de varsta este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.1.1). De remarcat ca majoritatea

pacientelor se situeaza in grupul 35-39 ani, urmate de pacientele cu varsta cuprinsa intre 30-34

ani. O alta impartire functie de varsta imparte lotul de paciente in 2 parti egale: varsta < 35 ani:

129 paciente, varsta ≥ 35 ani: 129 paciente.

Tabel 1.1.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor (agonisti-GnRH/ 1999)

Varsta (ani) Numar paciente Procent

< 30 44 17,05 %

30-34 ani 85 32,94 %

35-39 ani 96 37,20 %

≥ 40 ani 33 12,79 %

Pacientele au intrat in protocol de stimulare ovariana controlata, utilizandu-se mai multe

tipuri de gonadotropine. Preparatul cel mai des administrat a fost rFSH, urmat apoi de

combinatia rFSH cu HMG, HMG administrat singur, FSH-HP administrat singur sau asociat cu

rFSH sau HMG, conform tabelului 1.1.2 si figurii 1.1.1 de mai jos.

Page 95: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

81

Tabel 1.1.2 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/ 1999)

Tip gonadotropina Numar paciente Procent

rFSH 200 77,51 %

HMG 20 7,75 %

FSH-HP 1 0,38 %

rFSH + HMG 34 13,17 %

rFSH + FSH-HP 1 0,38 %

rFSH + HMG + FSH-HP 2 7,75 %

0

50

100

150

200

rFSH

HM

G

FSH

-HP

rFSH

+HM

G

rFSH

+FSH

-HP

rFSH

+HM

G+F

SH-H

P

rFSH

HMG

FSH-HP

rFSH+HMG

rFSH+FSH-HP

rFSH+HMG+FSH-HP

Fig. 1.1.1 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/ 1999)

Page 96: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

82

Durata stimularii ovariene controlate a fost in medie de 11,46 zile, cu mediana de 11 zile.

Cea mai scurta perioada de stimulare a fost de 7 zile, respectiv cea mai lunga de 21 de zile.

Deviatia standard: 2,203.

Pentru stimulare s-au folosit o medie de 2784,98 UI FSH (din preparatele enuntate

anterior), cu o mediana de 2400 UI, deviatia standard: 1692,569. Cantitatea maxima administrata

a fost de 14.700 (!!!) UI FSH si cantitatea cea mai redusa de 750 UI FSH. La pacienta la care s-a

administrat aceasta doza enorma a prezentat, in ciuda stimularii masive, un raspuns insuficient

(„low responder”).

Protocolul cel mai des aplicat a fost cel lung („long protocol”) in 239 cazuri (92,63%),

urmat de cel scurt („short protocol”) in 12 cazuri (4,65%) si apoi ultra-lung („ultralong

protocol”) in 7 cazuri (2,71%), conform figurii urmatoare (Fig. 1.1.2).

Protocol lung

Protocol scurt

Protocolultralung

Fig. 1.1.2 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonist-GnRH / 1999

Nivelul E2 seric obtinut in urma stimularii ovariene, masurat anterior inducerii ovulatiei

cu HCG a fost ca valoare medie 1862,16 pg/ml, cu mediana de 1563 pg/ml. Valoarea maxima a

estradiolului seric a fost de 22.580 pg/ml iar cea minima de 135 pg/ml, deviatia standard:

239

12 7

Page 97: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

83

1747,692. Daca se urmareste defalcat valoarea estradiolului seric determinat anterior punctiei se

obtine urmatorul tabel (Tabel 1.1.3). Marea majoritate a pacientelor (53,09%) cu tratament de

stimulare ovariana au prezentat valori serice ale E2 peste valoarea mediana, deci peste 1500

pg/ml.

Tabel 1.1.3 - Valorile defalcate ale E2 seric (agonisti-GnRH/ 1999)

Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent

< 1000 56 21,70%

1000-1499 65 25,19%

1500-1999 49 18,99%

≥ 2000 88 34,10%

Pe langa determinarea serica a estradiolului s-a efectuat si masurarea LH-ului, pentru a

surprinde o crestere (nedorita) a hormonului endogen. Valoarea medie a LH-ului la grupul de

258 de paciente a fost de 2,43 mUI/ml, cu mediana de 2 mUI/ml. Valoarea maxima inregistrata a

fost 38 - si cea mai mica de 0,1 mUI/ml; deviatia standard: 2,698.

Examinarea ecografica a urmarit evolutia folicolilor ca masura a reactivitatii la

tratamentul de stimulare ovarian. Sunt date valorile determinate anterior stabilirii momentului

inducerii ovulatiei (Tabel 1.1.4). Asa cum de fapt este de asteptat in urma stimularii ovariene

controlate, se doreste obtinerea unui numar mai mare de folicoli de 16-18 mm si respectiv > 18

mm, comparativ cu folicolii de dimensiuni mai mici.

Din tabelul expus reiese ca numarul mediu si mediana folicolilor > 18 mm este mai mare

fata de valorile folicolilor de 13-15 mm si 16-18 mm.

Tabel 1.1.4 - Parametri statistici ai folicolilor masurati prin ecografie (agonisti-GnRH/ 1999)

Dimensiune

folicoli

Media Mediana Numarul

minim

Numarul

maxim

Deviatia

standard

13-15 mm 2,61 2 0 10 2,246

16-18 mm 3,26 3 0 22 2,726

> 18 mm 3,67 4 0 11 1,828

Page 98: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

84

La grupul de paciente studiate s-au efectuat punctii foliculare in vederea FIV

conventionale in 135 de cazuri, iar in 115 situatii s-au aspirat ovocitele si s-a procedat la

microinjectia lor, conform metodei ICSI. 8 cicluri nu au fost urmate de punctie foliculara (Fig.

1.1.3).

La 6 microinjectari din cadrul ICSI s-au utilizat spermii de provenienta testiculara, recoltate prin

biopsie (TESE).

FIV conventionala: 135 cazuri (52,32%);

ICSI: 115 cazuri (44,57%);

Cazuri nepunctionate: 8 (3,10%).

FIV

ICSI

Cazurinepunctionate

Fig. 1.1.3 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul grupului cu agonisti-GnRH pe

anul 1999

b. Rezultate

In urma punctiilor foliculare s-a obtinut un numar mediu de 8,26 ovocite, cu mediana de

8 ovocite. Numarul maxim de ovocite aspirate a fost de 29 iar numarul minim: 0 ovocite,

deviatia standard: 5,410 (Tabel 1.1.5).

115 135

8

Page 99: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

85

Tabel 1.1.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu

agonisti-GnRH/1999

Numar mediu

ovocite

Mediana Numar maxim

recoltat

Numar minim

recoltat

Deviatia

standard

8,26 8 29 0 5,410

Controlul fecundarii realizat la 16-20 ore dupa inseminarea/microinjectarea ovocitelor a

aratat urmatoarele observatii: numarul mediu de celule cu 2PN este de 3,89; cu mediana de 3

celule cu 2PN. Numarul maxim de ovocite fecundate s-a inregistrat pentru 23 si numarul minim:

0; deviatia standard: 3,191 (Tabel 1.1.6).

Tabel 1.1.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN/ protocol cu agonisti-GnRH/1999

Numar mediu

celule cu 2PN

Mediana Numar maxim

celule cu 2PN

Numar minim

celule cu 2PN

Deviatia

standard

3,89 3 23 0 3,191

Crioconservarea s-a efectuat la 126 de paciente; dintre acestea in 68 de cazuri (53,96%) a

fost vorba de celule cu 2PN provenite din FIV iar in 58 de cazuri (46,03%) celulele cu 2PN au

provenit din fecundarea ovocitelor microinjectate in cadrul procedurii ICSI (Fig 1.1.4).

Embriotransferul s-a efectuat cu 1; 2 sau 3 embrioni. Au fost 28 de cazuri fara

embriotransfer raportate la cele 258 cicluri initiale. Media embrionilor transferati a fost de 1,85

iar mediana de 2 embrioni.

Page 100: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

86

50

55

60

65

70 Crio-FIV

Crio-ICSI

Fig. 1.1.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI

(agonisti-GnRH/ 1999)

La 56 de paciente s-a inregistrat sarcina (inclusiv sarcina biochimica). Evolutia cazurilor

in parte este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.1.7). Din avorturile spontane s-au descris situatii

cu 1, 2 sau 3 saci amniotici; la sarcinile extrauterine a fost 1 caz cu 2 saci amniotici, respectiv la

sarcinile gemelare si triple au existat cazuri cu oprirea in evolutie pe parcurs a 1 respectiv 2

fat/feti, in final sarcina evoluand spre o nastere monofetala.

Tabel 1.1.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu agonisti-GnRH/1999

Sarcina Sarcina

biochimica

Avort

Sarcina

ectopica

Nastere

monofetala

Nastere

gemelara

Nastere

tripla

Nr. cazuri 6 7 3 34 6 0

Procent 10,71% 12,5% 5,35% 60,71% 10,71% 0

68

58

Page 101: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

87

Complicatiile care s-au inregistrat in cadrul acestui lot de 258 de paciente se grupeaza in:

• lipsa raspunsului la stimularea ovariana controlata („low responder” – cu valori mici ale

E2 seric, dezvoltare minora a folicolilor)

• cresterea prematura a LH-ului endogen (supresie insuficienta prin agonist-GnRH)

• aparitia sindromului de hiperstimulare ovariana.

Motivele pentru care nu s-a mai practicat punctia foliculara la cele 8 paciente au fost: in 7

cazuri lipsa raspunsului la stimularea ovariana si in 1caz instalarea sindromului de hiperstimulare

ovariana, cu prezenta in amnadoua ovarele a mai mult de 40 folicoli de ≥ 10 mm. In tabelul de

mai jos sunt redate sumarizat elementele importante care constituie criterii de diagnostic al

statusului de „low responder” (Tabel 1.1.8).

Tabel 1.1.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara) (agonisti-GnRH/1999) Caz Cauza

Varsta

(ani)

Tip

FSH

Durata

stimularii

Nr.

total

UI

Tip

protocol

agonist

E2

(pg/ml)

LH

(UI/l)

Nr. folicoli

- 13-15

- 16-18

- > 18

1 Low

response

25 rec 10 zile 1725 long 797 1 1/ 2/ 3

2 Low

response

25 rec 12 zile 2105 long 464 0,4 2/ 2/ 3

3 Low

response

41 rec+HMG 12 zile 7200 long 213 2,4 0/ 0/ 2

4 Low

response

40 rec+HMG 13 zile 6600 long 400 3,1 0/ 0/ 1

5 Low

response

32 rec 12 zile 2400 long 135 3,1 0/ 1/ 1

6 Low

response

37 rec+HMG 25 zile !! 14.700

!!

short 277 38 !!! 0/ 1/ 1

7 Low

response

25 rec 9 zile 750 long 158 0,1 10/ 4/ 0

8 Sindr.

hiper-

stimulare

25 rec 7 zile 900 long 2264 2,3 5/ 1/ 1

> 40 fol.≥10

mm

Page 102: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

88

c. Observatii

1. De remarcat ca in aceste 7 cazuri varsta medie a pacientelor este de 32,14 ani; deci o

varsta tanara. Este stiut ca marea majoritate a pacientelor cu raspuns scazut la stimulare

se incadreaza in grupe de varsta mai inaintate, care au o rezerva ovariana in mod

fiziologic redusa. Nivelul seric scazut al E2 corespunde cu criteriul clasic de intrerupere a

ciclului de stimulare si la monitorizarea ecografica se constata un numar insuficient al

folicolilor dominanti.

2. Doar 1 caz a prezentat o crestere prematura de LH, la aceasta pacienta a fost nevoie de o

stimulare excesiva - de 25 de zile si cu o doza totala imensa de FSH: 14.700 UI rFSH

asociat cu HMG, cu un E2 seric extrem de redus. Protocolul cu agonist-GnRH a fost unul

scurt, in dorinta de-a exploata efectul initial de „flare-up” al administrarii agonistului si

de-a creste FSH-ul endogen si implicit dezvoltarea foliculara. In ciuda acestei strategii

aplicate rezultatul la stimularea ovariana a fost dezastruos.

3. La o pacienta la care nu s-a mai practicat punctie foliculara a fost vorba de intreruperea

ciclului nu datorita raspunsului redus, ci dimpotriva - datorita reactiei exagerate la

stimularea ovariana, cu o dezvoltare a unui numar de > 40 folicoli ≥ 10 mm la o doza de

numai 900 UI FSH in decurs de doar 7 zile si un E2 seric de 2264 pg/ml.

Incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana in grupul de 258 de paciente a fost de

11 cazuri, adica 4,26 %, un procent deloc de neglijat comparativ cu statisticile din

literatura (conform celor expuse in partea generala). Detaliile referitoare la sindromul de

hiperstimulare ovariana sunt schematizate in tabelul de mai jos (Tabel 1.1.9).

Page 103: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

89

Tabel 1.1.9 - Sindrom de hiperstimulare ovariana (agonisti-GnRH/ 1999) Caz Grad

hiperstim.

E2

(pg/ml)

Punctie

folic.

ET Criocons. Sarcina Avort/

Nastere

1 II 1058 da da - da nastere

2 II 2493 da da - da avort

3 II 3568 da da - da avort

gemel.

4 II 1400 da nu da (tot) - -

5 II 8139 da nu da (tot) - -

6 I 2385 da da - da nastere

7 II 1640 da da - da avort

8 III 2264 nu - - - -

9 II 1635 da da - da nastere

10 I/ II 1388 da da - da nastere

11 II/ III 2342 da da - da nastere

d. Concluzii

1. Sindromul de hiperstimulare ovariana apare in lotul studiat cel mai frecvent de gradul II

(forma moderata), rar in formele extreme: usoara sau severa.

2. Valoarea medie a estradiolului seric inainte de declansarea ovulatiei a fost de 2573,81

pg/ml, cu aproximativ 1000 pg/ml mai ridicat fata de valoarea medie si mediana calculate

pentru intregul lotul de 258 de paciente.

3. Nu este obligatorie asocierea sindromului de hiperstimulare cu valori crescute ale

estradiolului seric. Ca exemplu de exeptie in neconcordanta estradiol seric – aparitia

sindromului de hiperstimulare este cazul unei paciente de 37 ani, cu protocol lung si

stimulare cu rFSH timp de 11 zile, doza totala de 1200 UI, estradiol seric: 22.580 pg/ml,

folicoli: 13-15 mm= 8; 16-18 mm= 7; > 18 mm= 5. La FIV s-au aspirat 24 ovocite, 23 s-

au fecundat, dintre care 20 s-au crioconservat. Embriotransferul s-a efectuat cu 3

embrioni. Nu s-a obtinut nici o sarcina. Nu s-a semnalat sindrom de hiperstimulare

ovariana.

Page 104: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

90

4. In 10 cazuri din 11 (90,90%) de sindrom de hiperstimulare ovariana s-a efectuat aspirarea

foliculara; doar la 1 caz cu un numar de > 40 folicoli ≥ 10 mm s-a abandonat ciclul de

stimulare. Acest caz a si prezentat forma severa de sindrom de hiperstimulare.

5. Din cele 10 cazuri punctionate numai la 2 paciente nu s-a realizat embriotransferul si

toate celulele in stadiul de 2PN au fost crioconservate. S-a considerat ca o masura de

siguranta aceasta evitare a embriotransferului.

6. Toate cazurile la care s-a efectuat embriotransferul au fost insotite de prezenta sarcinii

(evolutia ulterioara fiind de 3 avorturi si 5 nasteri).

Alte incidente:

- in 2 cazuri: nu s-a realizat fecundarea pe motivul absentei spermiilor;

- la 1 caz nu s-a efectuat ET pe motivul prezentei unui polip endometrial;

- la 1 caz nu s-a realizat ET si s-a preferat crioconservarea pe motivul prezentei

unui endometriom.

Din 258 cicluri de stimulare initiate - 8 nu au fost urmate de punctie foliculara, deci s-au

efectuat doar 250 de punctii (96,89% din cicluri punctionate). Din aceste 250 de punctii la 1 caz

nu s-au aspirat ovocite si din acest numar de 250 punctii in 16 cazuri nu s-a realizat fecundarea.

O apreciere a esecurilor din totalul de 258 de cicluri de stimulare initiale este urmatoarea (Tabel

1.1.10):

- 8 cazuri nepunctionate (intreruperi de cicluri: 3,1%);

- 1 caz fara ovocite;

- 16 cazuri fara fecundare;

- 29 cazuri fara embriotransfer realizat.

Tabel 1.1.10 Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ an 1999

Total punctii efectuate Total cazuri cu celule

cu 2PN

Total ET efectuate Total

cicluri

stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent

258 250 96,89% 233 90,31% 229 88,75%

Page 105: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

91

Sarcini/ 1999: 56

• 34 sarcini au rezultat din FIV/ET si 22 sarcini - din ICSI (1 sarcina din crioTESE);

• 51 paciente care au obtinut sarcina (inclusiv biochimica) au fost stimulate cu rFSH, 3

paciente: stimulare ovariana cu HMG, 2 paciente: rFSH asociat cu HMG;

• la 53 de paciente s-a aplicat protocolul lung, la 3 paciente – protocolul ultra-lung.

Rata sarcinilor/ciclu: 21,70 %

Rata sarcinilor/punctie: 22,40%

Rata sarcinilor/embriotransfer: 24,45%

Rata implantarii = nr. saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 28,38%

Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 15,50%

e. Discutii

1. Comparativ cu lotul de 41 de paciente care au urmat tratament de stimulare ovariana

controlata si cu anatgonisti-GnRH in schema de protocol pe perioada anului 1999, lotul

de paciente cu schema cu agonisti-GnRH a fost mult mai numeros, ceea ce semnifica o

complianta mai mare fata de acest tip de medicatie.

2. Procentul majoritar al pacientelor din grupul studiat se afla intre 35-39 ani, urmat

indeaproape de pacientele cu varsta 30-34 ani.

3. In urma parametrilor calculati referitor la durata, tipul si doza totala a unitatilor de

gonadotropina nu se remarca diferente semnificative cu lotul de paciente cu protocol cu

antagonist-GnRH. De asemenea numarul de ovocite recoltate si numarul de celule cu

2PN este comparabil la cele 2 grupe de paciente.

4. Rata sarcinilor calculate in functie de numarul de cicluri de stimulare/ punctii efectuate/

embriotransferuri realizate este net superior la lotul de agonisti versus antagonisti-GnRH.

Page 106: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

92

Capitolul 1.2

Statistica pe anul 2000 – agonisti-GnRH

a. Material si metoda

In anul 2000 s-au adresat in vederea reproducerii asistate si au fost selectionate un grup

de 303 paciente. Varsta medie a pacientelor a fost de 34,46 ani, cu mediana de 35 ani. Pacienta

cu varsta cea mai tanara din grupul analizat a fost de 23 ani, respectiv varsta cea mai inaintata a

fost de 45 ani. Repartitia pe grupe de varsta este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.2.1). De

remarcat ca pacientele intre 35-39 ani sunt grupul cel mai numeros, dar urmate indeaproape de

pacientele cu varsta cuprinsa intre 30-34 ani.

Tabel 1.2.1 - Repartitia pacientelor pe grupe de varsta (agonisti-GnRH/anul 2000)

Varsta (ani) Numar paciente Procent

< 30 56 18,48 %

30-34 ani 93 30,69 %

35-39 ani 103 33,99 %

≥ 40 ani 51 16,83 %

Dintre tipurile de gonadotropine utilizate in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana

controlata se observa ca preponderent a fost administrat rFSH (76,23%) (Tabel 1.2.2, Fig. 1.2.1).

Tabel 1.2.2 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2000)

Tip gonadotropina Numar paciente Procent

rFSH 231 76,23%

HMG 42 13,86 %

FSH-HP 2 0,66 %

rFSH + HMG 28 9,24 %

Page 107: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

93

0

50

100

150

200

250

rFSH

HMG

FSH-HP

rFSH+HMG

Fig.1.2.1 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2000)

Durata stimularii ovariene controlate cu preparatele de gonadotropina enumerate a fost in

medie de 11,24 zile, cu mediana de 11 zile. Cea mai scurta perioada de stimulare a fost de 6 zile,

respectiv cea mai lunga de 24 de zile. Deviatia standard: 2,gonadotropina, cu mediana de 2250

UI, deviatia standard: 1337,421. Cantitatea maxima administrata a fost de 8400 UI

gonadotropina si cantitatea cea mai redusa de 825 UI gonadotropina.

Ca si in statistica anului 1999, cel mai des aplicat a fost protocolul lung („long protocol”)

in 269 cazuri (88,77%), urmat de cel scurt („short protocol”) in 22 cazuri (7,26%) si apoi ultra-

lung („ultralong protocol”) in 12 cazuri (3,96%); situatie rezumata in urmatoarea figura (Fig.

1.2.2).

Page 108: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

94

Protocol lung

Protocol scurt

Protocolultralung

Fig. 1.2.2 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonist-GnRH / anul 2000

Corelarea foliculometriei cu nivelul E2 seric obtinut in urma stimularii ovariene au fost

factorii decisivi pentru alegerea momentului inducerii ovulatiei cu HCG. Valoarea medie a E2

seric a fost de 1877,16 pg/ml, cu mediana de 1529 pg/ml. Valoarea maxima a estradiolului seric

a fost de 27.669 pg/ml iar cea minima de 205 pg/ml, deviatia standard: 1917,754. Daca se

urmareste defalcat valoarea E2 seric determinat anterior punctiei se obtine urmatorul tabel (Tabel

1.2.3). Marea majoritate a pacientelor (33%) cu tratament de stimulare ovariana au prezentat

valori serice ale E2 peste 2000 pg/ml iar 51,81% din paciente au avut concentratia E2 seric peste

valoarea medianei.

Tabel 1.2.3 - Valorile defalcate ale E2 seric (agonist-GnRH/ anul 2000)

Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent

< 1000 71 23,43%

1000-1499 75 24,75%

1500-1999 57 18,81%

≥ 2000 100 33%

269

22 12

Page 109: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

95

Determinarea concentratiei serice a LH-ului isi gaseste utilitatea in depistarea unei

cresteri premature a hormonului endogen, ce semnifica o inhibitie hipofizara insuficienta.

Valoarea media a LH-ului in lotul de paciente a fost de 2,57 UI/l, mediana de 2,1 UI/l. Valoarea

maxima depistata a fost de 21,6 UI/l la o pacienta la care s-a si intrerupt ciclul de stimulare si nu

s-a mai efectuat punctia foliculara. Valoarea minima determinata a fost de 0,1 UI/l si deviatia

standard: 2,073.

In corelatie cu valoarea E2 seric se efectueaza ecografii seriate – foliculometrii care

determina raspunsul ovarian la terapia aplicata. Tabelul urmator (Tabel 1.2.4) sumarizeaza

dimensiunile folicolilor si parametri statistici ai acestora. Scopul stimularii este de-a creste

folicoli dominanti in amandoua ovarele. Se remarca din tabel ca media si mediana folicolilor >

18 mm este mai mare decat a folicolilor de dimensiuni mai mici.

Tabel 1.2.4 Parametri statistici ai folicolilor masurati prin ecografie (agonist GnRH/anul 2000)

Dimensiune

folicoli

Media Mediana Numarul

minim

Numarul

maxim

Deviatia

standard

13-15 mm 2,99 2 0 15 2,431

16-18 mm 3,14 2 0 24 2,626

> 18 mm 3,60 3 0 16 2,059

Tehnicile de reproducere asistata care s-au utilizat in cazul lotului de 303 de paciente ce

au urmat protocol cu agonisti-GnRH pe anul 2000 au fost: FIV conventionala in 209 cazuri si

ICSI in 91 situatii. La pacientele cu ICSI, in 14 cazuri originea spermiilor a fost testiculara, prin

decongelarea probelor recoltate cu alta ocazie (crio-TESE). In 3 situatii s-a abandonat ciclul si nu

s-au punctionat folicolii (Fig. 1.2.3).

• FIV: 209 cazuri (68,97%);

• ICSI: 91 cazuri (30,03%);

• Cazuri nepunctionate: 3 (0,99%).

Page 110: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

96

FIV

ICSI

Cazurinepunctionate

Fig. 1.2.3 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul grupului cu agonisti-GnRH pe

anul 2000

b. Rezultate

In urma punctiilor foliculare s-a obtinut un numar mediu de 8,29 ovocite, cu mediana de

8 ovocite. Numarul maxim de ovocite aspirate a fost de 32 iar numarul minim: 0 ovocite,

deviatia standard: 5,465 (Tabel 1.2.5).

Tabel 1.2.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu

agonisti-GnRH/ anul 2000

Numar mediu

ovocite

Mediana Numar maxim

recoltat

Numar minim

recoltat

Deviatia

standard

8,29 8 32 0 5,465

Controlul fecundarii realizat la 16-20 ore dupa inseminarea/microinjectarea ovocitelor a

relevat urmatoarele: numarul mediu de celule cu 2PN este de 3,56; cu mediana de 3 celule cu

2PN. Numarul maxim de ovocite fecundate a fost 16 si numarul minim: 0; deviatia standard:

3,530 (Tabel 1.2.6).

291

91

3

Page 111: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

97

Tabel 1.2.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (agonisti-GnRH/ anul 2000)

Numar mediu

celule cu 2PN

Mediana Numar maxim

celule cu 2PN

Numar minim

celule cu 2PN

Deviatia

standard

3,56 3 16 0 3,530

Crioconservarea s-a efectuat la 121 de paciente; dintre acestea in 73 de cazuri (60,33%) a

fost vorba de celule cu 2PN provenite din FIV iar in 48 de cazuri (39,66%) celulele cu 2PN au

provenit din fecundarea ovocitelor microinjectate in cadrul procedurii ICSI (Fig 1.2.4).

0

20

40

60

80

Crio-FIV Crio-ICSI

Fig. 1.2.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI

(agonisti-GnRH/ anul 2000).

Embriotransferul s-a efectuat cu 1; 2 sau 3 embrioni. Au fost 66 de cazuri fara

embriotransfer raportate la cele 303 cicluri initiale. Media embrionilor transferati a fost de 1,67

iar mediana de 2 embrioni, deviatia standard: 1,052

73

48

Page 112: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

98

Din cele 303 paciente care au inceput stimularea ovariana in vederea reproducerii

asistate, la 64 de cazuri a survenit sarcina. La o pacienta s-a stabilit ecografic diagnosticul de

sarcina intrauterina concomitent cu sarcina extrauterina, din acest motiv neconcordanta dintre 64

sarcini inregistrate fata de 65 (care reprezinta suma sarcinilor din tabel). Sarcinile intra- si

extrauterina simultana s-au soldat cu avort si respectiv salpingectomie. Evolutia sarcinilor

inregistrate este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.2.7).

Tabel 1.2.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu agonisti-GnRH/ anul 2000

Sarcina Sarcina

biochimica

Avort

Sarcina

ectopica

Nastere

monofetala

Nastere

gemelara

Nastere

tripla

Nr. cazuri 13 13 5 23 11 0

Procent 20,31% 20,31% 7,81% 35,93% 17,18% 0

In cadrul acestor sarcini s-au constatat in cateva situatii malformatii fetale cu ocazia

investigatiilor prenatale si ulterior la examinarea postpartum a nou nascutilor.

• 1 avort a fost efectuat din motiv terapeutic, fiind stabilit diagnosticul de trisomie 21,

pacienta avand varsta de 41 ani!!!

• La o nastere monofetala s-a stabilit ca malformatie keilognatopalatoskizis.

• 2 nasteri gemelare au prezentat de asemenea malformatii.

Inregistrarea anomaliilor depistate ca procent in cadrul acestor sarcini a fost de 6 feti la 64

sarcini: 9,37%. Acest procent ridicat se explica odata prin prezenta trisomiei 21 la o pacienta

cu varsta > 35 de ani, situatie care se intalneste cu frecventa mai crescuta si in conceptiile

naturale. Pe de alta parte, la 2 sarcini gemelare se remarca malformatii – de asemenea este

cunoscut faptul ca riscul malformativ creste la sarcinile multiple fata de cele monofetale.

c. Observatii

Ca si esec intalnit in cadrul stimularii ovariene, asa cu am redat si in celelalte statistici,

mentionez lipsa raspunsului la terapie.

Cele 3 paciente la care nu s-a mai practicat punctie foliculara au avut raspuns ovarian redus

la tratamentul de stimulare si s-au intrunit criteriile de abandonare a ciclului de stimulare, cu

Page 113: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

99

niveluri scazute ale E2 seric si intr-un caz s-a intalnit o crestere prematura a LH-ului endogen. La

pacienta care a prezentat cresterea prematura a LH-ului, la un nou ciclu de stimulare s-a obtinut

raspuns favorabil din punct de vedere al dezvoltarii foliculare, cu un numar de 17 ovocite la

punctie, dar fara a se fecunda ulterior niciunul (Tabel 1.2.8).

Varsta medie a pacientelor a fost de 34 ani, doar pacienta la care nu s-a obtinut nici un

raspuns (fara crestere foliculara) a avut 42 de ani. Toate pacientele au fost stimulate cu rFSH, in

cadrul protocoalelor lungi cu agonisti-GnRH, cu o durata medie de stimulare de 11 zile.

Tabel 1.2.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara) - agonisti-GnRH/ an 2000 Caz Cauza

Varsta

(ani)

Tip

FSH

Durata

stimularii

Nr.

total

UI

Tip

protocol

agonist

E2

(pg/ml)

LH

(UI/l)

Nr.

folicoli

- 13-15

- 16-18

- > 18

1 Low

response

33 rec 13 zile 3300 long 236 0,1 1/ 2/ 3

2 ↑

prematura

LH

27 rec 7 zile 975 long 1127 21,6 1/ 3/ 2

3 No

response

42 rec 11 zile 2475 long 294 1,4 0/ 0/ 0

Pentru alte 3 paciente s-a constatat situatia de „low responder”, dar s-a practicat totusi

punctia foliculara, in ciuda valorilor scazute ale estradiolului seric si ale numarului extrem de

redus al folicolilor. La pacienta cu varsta de 43 de ani s-a intalnit chiar valoarea cea mai scazuta

a estradiolului din intreg lotul de 303 paciente care au urmat tratament de stimulare ovariana cu

protocoale ce cuprindeau in schema agonist-GnRH / anul 2000. Din aceste 3 paciente cu raspuns

scazut la stimulare intr-un caz nu s-au aspirat ovocite si in 2 cazuri la punctia foliculara s-a

recoltat cate 1 ovocit, fara insa a se fecunda (Tabel 1.2.9). La aceste paciente varsta medie a fost

de 36,33 ani, doar 1 pacienta a fost de 43 de ani. Media unitatilor de gonadotropina administrata

a fost 4500 UI, deci a fost necesara o doza mare de stimulare. In 2 situatii s-a asociat rFSH cu

HMG in vederea stimularii ovariene.

Page 114: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

100

Cu toate acestea nivelul E2 seric s-a mentinut in toate cele 3 cazuri < 500 pg/ml si dezvoltarea

folicolilor a fost minima.

La o pacienta s-a virat de la protocolul lung la cel scurt la a doua incercare, in scopul folosirii

efectului de „flare-up” al agonsitului, dar fara efectul dorit. S-a remarcat doar o scadere a duratei

si dozei de stimulare (cazul 1 si 2 din tabel).

Tabel 1.2.9 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – agonisti-GnRH/ an

2000 Caz Cauza

Varsta

(ani)

Tip

FSH

Durata

stimularii

Nr.

total

UI

Tip

protocol

agonist

E2

(pg/ml)

LH

(UI/l)

Nr.

folicoli - 13-15

- 16-18

- > 18

Rezultat

punctie

1 Low

resp.

33 rec+HMG 14 zile 5400 long 415 0,5 0/ 2/ 1 FIV,

Ø

ovocite

2 Low

resp.

33 rec+HMG 8 zile 4800 short 282 3,1 1/ 1/ 1 FIV, 1

ovocit

Ø

fecund.

3 Low

resp.

43 rec 10 zile 3300 long 205 1,6 1/ 1/ 1 FIV, 1

ovocit,

Ø

fecund.

Din cele 2 tabele anterioare, care exemplifica statusul de „low responder” al unor paciente, se

remarca ca factorul varsta nu are in aceste cazuri rol decisiv.

O complicatie a stimularii ovariene controlate este sindromul de hiperstimulare ovariana,

exemplificat in tabelul de mai jos (Tabel 1.2.10). Nu s-au remarcat cazuri de gravitate crescuta in

grupul de 303 paciente analizate.

Page 115: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

101

Tabel 1.2.10 - Sindrom de hiperstimulare ovariana - agonisti-GnRH/ an 2000 Caz Grad

hiperstim.

E2

(pg/ml)

Nr.

folicoli - 13-15

- 16-18

- > 18

Punctie

folic.

ET Criocons. Sarcina Avort/

Nastere

1 II 2856 1/2/5 da da - nu -

2 II 3513 7/7/3 da da - da nastere

gemel.

3 II 1125 3/6/5 da nu - - -

4 I 2925 2/2/4 da da - nu -

5 II 935 1/1/2 da da da avort

6 II 1106 2/1/6 da da - nu -

7 II 5018 1/5/8 da da - nu -

8 II 1100 1/2/4 da da - da avort

9 II 8123 14/24/1 da nu da (tot) - -

10 I 1082 1/1/10 da da - nu -

• Doar 3 situatii au fost insotite de prezenta sarcinii.

• Incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana la totalul de 303 paciente este de 3,3%.

• Media E2 seric la aceste 10 cazuri a fost de 2778,3 pg/ml, cu extremele intre 925 si 8123

pg/ml.

• La pacienta cu valoarea cea mai crescuta a estradiolului seric (8123 pg/ml ) s-a preferat

crioconservarea tuturor celulelor cu 2PN, fara a se mai efectua embriotransferul. Prezenta

unei sarcini ar fi agravat sindromul de hiperstimulare. Tot la aceasta pacienta s-au

dezvoltat foarte multi folicoli de 13-15 si 16-18 mm (14 respectiv 24), factor ce a inclinat

de asemenea spre evitarea embriotransferului.

d. Concluzii

Din numarul de 303 paciente care au inceput ciclul de stimulare ovariana controlata:

• in 3 cazuri nu s-a efectuat punctie foliculara;

• la 4 paciente la aspiratia folicolilor nu s-au recoltat ovocite (punctie negativa);

• in 57 de situatii nu s-a realizat fecundatia;

Page 116: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

102

• la 2 paciente s-au crioconservat toate ovocitele fecundate (toti prezigotii) si nu s-a mai

efectuat embriotransferul;

• in total la 66 de paciente ciclul de stimulare inceput nu s-a finalizat cu embriotransfer

(Tabelul 1.2.11).

Tabel 1.2.11 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ an 2000

Total punctii efectuate Total cazuri cu celule

cu 2PN

Total ET efectuate Total

cicluri

stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent

303 300 99% 246 81,18% 237 78,21%

Sarcini/ 2000: 64

• 43 sarcini au fost obtinute din FIV/ET si 21 de sarcini – din ICSI (3 sarcini din

crioTESE);

• la 47 de paciente stimularea s-a efectuat cu rFSH, la 10 paciente – cu HMG, la 2 paciente

cu FSH-HP, la 5 paciente: asociere rFSH cu HMG;

• din aceste paciente care au obtinut sarcina s-a aplicat protocolul lung la 59 de paciente,

cel scurt la 3 paciente si cel ultra-lung la 2 paciente.

Rata sarcinilor/ciclu: 21,12 %

Rata sarcinilor/punctie: 21,33%

Rata sarcinilor/embriotransfer: 27%

Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. embriotransferuri: 27%

Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 11,22%

e. Discutii

1. Numarul pacientelor care au inceput cicluri de stimulare ovariana controlata si au avut

protocoale cu agonisti-GnRH/ anul 2000 este de 8 ori mai mare comparativ cu ciclurile

cu antagonisti-GnRH din acelasi an.

Page 117: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

103

2. Grupul majoritar al pacientelor care au urmat terapia de stimulare a fost intre 30-39 ani

(64,68%); procente foarte apropiate ale pacientelor de 35-39 ani cu cele de 30-34 ani.

3. Varsta pacientelor care au prezentat „low response” la terapia de stimulare nu a

reprezentat un factor favorizant pentru aceasta situatie nici in cadrul pacientelor cu

protocol cu agonist-GnRH, nici la cele cu antagonist-GnRH.

4. Pentru stimularea ovariana s-a preferat rFSH si a fost utilizat in procent covarsitor

protocolul lung.

5. Din cele 64 de sarcini survenite la lotul de 303 paciente, in 59 de cazuri s-a utilizat

protocolul lung, in 2 cazuri protocolul ultra-lung si in 3 cazuri protocolul scurt. Se

observa ca rata de implantare a fost mai crescuta (19,47%) in cazul aplicarii protocolului

lung.

6. In urma tratamentului de stimulare s-a obtinut un numar mediu de 8,29 ovocite, cu

mediana de 8 ovocite, deviatia standard: 5,465. In cazul protocoalelor cu anatgonisti-

GnRH/ 2000 s-au aspirat un numar mediu de 8,24 ovocite, mediana: 7 ovocite, deviatia

standard: 5,741. Datele sunt comparabile, fara a exista diferente semnificative. Este

cunoscut din datele din literatura ca in cazul protocoalelor cu antagonisti-GnRH se obtin

ceva mai putine ovocite [190].

7. In cazul agonistilor-GnRH/ anul 2000 - rata sarcinilor/ciclu; rata sarcinilor/punctie; rata

sarcinilor/ET; rata implantarii si respectivbaby take home rate sunt cu mult mai mari

comparativ cu ciclurile cu protocoale antagonisti-GnRH/ 2000. Pentru fiecare protocol cu

agonist- respectiv anatagonist-GnRH in parte procentele de punctii efectuate raportate la

numarul de cicluri initiate; rata de fecundare si rata embriotransferurilor sunt

asemanatoare.

Page 118: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

104

Capitolul 1.3

Statistica agonisti-GnRH pe anul 2001

a. Material si metoda

Un grup de 271 de paciente au urmat in anul 2001 tratament de stimulare ovariana

controlata in vederea efectuarii metodelor de reproducere asistata. Aceste paciente au avut in

schema lor de terapie agonisti-GnRH ca medicatie de supresie hipofizara, medicatie administrata

sub diverse protocoale (exemplificate in partea generala a tezei).

Pacientele au avut media de varsta de 34,77 ani, cea mai tanara pacienta cuprinsa in acest

lot a fost de 22 de ani si cea mai varstnica – de 45 de ani; mediana: 35 de ani, deviatia standard:

4,690. Asa ca si la celelalte interpretari ale loturilor de paciente din anii 1999 si 2000, voi

prezenta repartitia (procentul) femeilor incluse in studiu in functie de grupe de varsta (Tabel

1.3.1).

Tabel 1.3.1 - Repartitia pacientelor pe grupe de varsta (agonisti-GnRH/anul 2001)

Varsta (ani) Numar paciente Procent

< 30 43 15,86 %

30-34 ani 81 29,88 %

35-39 ani 99 36,53 %

≥ 40 ani 48 17,71 %

Ca si in celelalte loturi de paciente, grupul majoritar este format de femeile cu varsta intre

35-39 de ani, urmat imediat de cele cu varsta intre 30-34 de ani. Insumate procentele pentru

aceste 2 varste depasesc cu mult numarul pacientelor ce se situeaza la extreme, adica < 30 de ani

si > 40 de ani. Este explicabila incidenta mai crescuta a femeilor > 35 de ani care se adreseaza

centrelor de reproducere asistata, deoarece tendinta femeilor moderne este de-a se implica social

activ, fapt care amana in acest fel momentul (poate chiar si dorinta) conceptiei.

Page 119: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

105

Gonadotropinele care au fost utilizate pentru stimularea ovariana au fost in special

preparatele sintetizate genetic, urmate de gonadotropinele sintetizate din urina menopauzala,

asocierea celor 2 preparate enumerate si in cel mai mic procent - preparatele gonadotropinice

inalt purificate (Tabel 1.3.2) (Fig. 1.3.1). Conform statisticilor prezentate in partea generala s-a

dovedit ca preparatele moderne - cele sintetizate genetic - sunt superioare celorlalte

gonadotropine in ceea ce priveste calitatea si numarul ovocitelor si a embrionilor.

Tabel 1.3.2 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2001)

Tip gonadotropina Numar paciente Procent

rFSH 229 84,50 %

HMG 35 12,91 %

FSH-HP 3 1,10 %

rFSH + HMG 4 1,47 %

050100

150200250

rFSH

HMG

rFSH+HMG

FSH-HP

Fig. 1.3.1 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2001)

229

35 4 3

Page 120: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

106

Durata stimularii ovariene controlate cu preparatele de gonadotropina enumerate a fost in

medie de 11,41 zile; cu mediana de 11 zile. Cea mai scurta perioada de stimulare a fost de 6 zile,

respectiv cea mai lunga de 29 de zile. Deviatia standard: 2,350.

Pentru stimulare s-a folosit o medie de 2556,86 UI gonadotropina, cu mediana de 2250

UI, deviatia standard: 1232,866. Cantitatea maxima care a fost administrata s-a ridicat la

valoarea de 9225 UI gonadotropina, iar cantitatea cea mai mica de unitati a fost de 1050 UI

gonadotropina.

Ca si in statistica anului 1999 si 2000, cel mai des uzitat protocol pentru inhibitia

hipofizara a fost cel lung („long protocol”) in 253 de cazuri (93,35%), urmat de cel scurt („short

protocol”) in 10 cazuri (3,69%) si apoi ultra-lung („ultralong protocol”) in 8 cazuri (2,95%);

situatie redata de urmatoarea figura (Fig. 1.3.2).

Protocol lung

Protocol scurt

Protocol ultralung

Fig. 1.3.2 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonist-GnRH / anul 2001

Determinarea E2 seric corelat cu foliculometria sunt factori determinanti ai stabilirii

momentului inducerii ovulatiei si implicit al zilei de punctie foliculara. Media valorilor E2 seric

pentru lotul de 271 de paciente este 2042,04 pg/ml, cu mediana de 1800 pg/ml si deviatia

253

10 8

Page 121: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

107

standard de 1369,984. Cea mai mica valoare determinata a fost de 34 pg/ml (!!!) si cea mai

crescuta s-a situat la 10.889 pg/ml.

Tabelul 1.3.3 reda procentul pacientelor in functie de anumite paliere valoarea E2 seric, cu scopul

de-a vizualiza pacientele cu concentratii ale hormonului mai mici sau mai mari fata de medie si

mediana.

Tabel 1.3.3 - Valorile defalcate ale E2 seric (agonist-GnRH/ anul 2001)

Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent

< 1000 49 18,08 %

1000-1499 57 21,03 %

1500-1999 50 18,45 %

≥ 2000 115 42,43 %

Pe langa determinarea serica a E2 este necesara si masurarea LH-ului, pentru a urmari

eficienta inhibitiei hipofizare realizata de catre agonistul-GnRH. Cresterile premature de LH

produc o luteinizare precoce a folicolului si au efect negativ asupra calitatii ovocitului. In cazul

de fata, la lotul de paciente, s-a determinat o medie a LH-ului ca fiind la 2,34 mUI/ml, cu

mediana: 2 mUI/ml si deviatia standard: 2,157. Cea mai mare valoare a LH-ului din acest grup

de paciente s-a situat la 28,2 mUI/ml si cea mai mica valoare inregistrata a fost de 0,1 mUI/ml.

Monitorizarea ecografica urmareste practic succesul stimularii ovariene prin cresterea folicolilor,

ca masura a tratamentului aplicat. Tabelul 1.3.4 de mai jos exemplifica parametri statistici ai

folicolilor.

Tabel 1.3.4 - Parametri statistici ai folicolilor masurati prin ecografie (agonist GnRH/anul 2001)

Dimensiune

folicoli

Media Mediana Numarul

minim

Numarul

maxim

Deviatia

standard

13-15 mm 2,74 2 0 10 2,182

16-18 mm 2,89 2 0 13 2,283

> 18 mm 4,16 4 0 16 2,356

Page 122: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

108

Metodele de reproducere asistata care s-au aplicat pentru obtinerea embrionilor au fost

FIV conventionala si ICSI. La 181 de paciente s-a practicat FIV clasica si la 84 de paciente –

ICSI (din acestea - 10 cazuri au folosit spermii pentru microinjectie recoltate prin biopsie

testiculara, proba fiind crioprezervata pana in momentul folosirii ei: crioTESE). La 6 paciente nu

s-a mai efectuat punctia foliculara pe motivul raspunsului redus la terapia de stimulare si s-au

oprit ciclurile de stimulare (Fig. 1.3.3).

• FIV: 181 cazuri (66,78 %);

• ICSI: 84 cazuri (30,99 %);

• Cazuri nepunctionate: 6 (2,21 %).

FIV

ICSI

Cazuri nepunctionate

Fig. 1.3.3 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul grupului cu agonisti-GnRH pe

anul 2001

b. Rezultate

Punctiile foliculare au fost urmate de recoltarea unui numar mediu de 8,76 ovocite, cu

mediana de 8 ovocite. Numarul maxim de ovocite aspirate a fost de 25 iar numarul minim: 0,

deviatia standard: 5,281 (Tabel 1.3.5).

84

181

6

Page 123: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

109

Tabel 1.3.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu

agonisti-GnRH/ anul 2001

Media

ovocitelor

Mediana Numar maxim

recoltat

Numar minim

recoltat

Deviatia

standard

8,76 8 25 0 5,281

In urma controlului fecundarii la intervalul de 16-20 de ore de la inseminarea

conventionala sau microinjectia ovocitelor s-a obtinut un numar mediu al celulelor cu 2PN de

3,71; mediana de 3 celule cu 2PN, deviatia standard: 3,047. Cel mai mare numar de ovocite

fertilizate a fost de 17 iar numarul minim: 0 (Tabel 1.3.6).

Tabel 1.3.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (agonisti-GnRH/ anul 2001)

Media

celulelor cu

2PN

Mediana Numar maxim

celule cu 2PN

Numar minim

celule cu 2PN

Deviatia

standard

3,71 3 17 0 3,047

Crioconservarea a fost posibila la 136 de paciente; dintre acestea in 91 de cazuri

(66,91%) a fost vorba de celule cu 2PN provenite din FIV iar in 45 de cazuri (33,08 %) celulele

cu 2PN au provenit din fecundarea ovocitelor microinjectate in cadrul procedurii ICSI (Fig

1.3.4). Parametrii statistici pentru celulele crioconservate releva urmatoarele: media celulelor

crioconservate a fost de 1,93, cu un maxim de 14 si minim de 0 celule, respectiv mediana de 0,5

celule si deviatia standard: 2,568.

Embriotransferul s-a efectuat cu 1; 2 sau 3 embrioni. Au fost 41 de cazuri fara

embriotransfer raportate la cele 271 cicluri initiale. Media embrionilor transferati a fost de 1,76

iar mediana de 2 embrioni, deviatia standard: 0,925

Page 124: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

110

0

20

40

60

80

100

Crio-FIV Crio-ICSI

Fig. 1.3.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI

(agonisti-GnRH/ anul 2001)

In urma tehnicilor de reproducere asistata s-a inregistrat un numar total de 59 de sarcini.

Dintre acestea, la o pacienta de 40 de ani s-a stabilit diagnosticul de trisomie 18 si s-a efectuat

avort terapeutic (la 18 sapatamani de gestatie). La alta pacienta, de 38 de ani, prin efectuarea

biopsiei de vilozitati coriale, s-a constatat o aberatie cromozomiala a produsului de conceptie,

care a fost urmata de avort terapeutic (la 9 sapatamani de gestatie). Amandoua sarcinile au

provenit din embrioni obtinuti in urma FIV conventionale. In afara de aceste 2 cazuri nu s-au

inregistrat si alte anomalii. Procentul aberatiilor cromozomiale pentru acest grup de paciente este

3,38 %. Trebuie luat in considerare ca acest procent este dat si de faptul ca varsta celor 2 femei a

fost > 35 de ani (risc natural mai crescut pentru aneuploidii).Nu s-au intalnit sarcini triple.

Preponderente au fost sarcinile monofetale. Se remarca in acest lot de paciente ca procentul

91

45

Page 125: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

111

avorturilor, al sarcinilor ectopice si al celor multiple (considerate „esec” al reproducerii asistate)

se inscriu in procentele enuntate de datele din literatura (Tabel 1.3.7).

Tabel 1.3.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu agonisti-GnRH/ anul 2001

Sarcina Sarcina

biochimica

Avort

Sarcina

ectopica

Nastere

monofetala

Nastere

gemelara

Nastere

tripla

Nr. cazuri 8 9 1 34 7 0

Procent 13,55% 15,25% 1,69% 57,62 % 11,86 % 0

c. Observatii

Esecurile terapiei de stimulare ovariana controlata, manifestate prin lipsa de raspuns la

medicatie, au fost inregistrate in numar de 6 pentru grupul de paciente analizate, cazuri care nu

s-au soldat cu punctie foliculara (Tabel 1.3.8).

Pacientele care nu au raspuns favorabil la medicatia de stimulare ovariana au prezentat o

medie de varsta de 34,5 ani, doar 2 dintre ele s-au situat la 38 si 42 de ani. Nici in aceste cazuri

varsta nu are rolul esential in lipsa de raspuns la tratamentul aplicat.

Pentru aceste paciente s-a folosit o medie a unitatilor de gonadotropina (4150 UI) mult peste

media calculata pentru intregul lot de 271 de paciente (2556,86 UI). Media duratei de stimulare a

fost insa asemanatoare: 12 zile fata de 11 zile pentru intregul lot.

Cazurile 5 si 6 reprezinta doua incercari de stimulare la aceeasi pacienta. Prima tentativa

a folosit protocolul lung. Avand in vedere esecul - prin lipsa de raspuns si cresterea prematura de

LH - s-a preferat pentru urmatoarea stimulare inhibitia hipofizara prin protocolul scurt, care in

acelasi timp, prin efectul sau initial de „flare up” sa stimuleze secretia de FSH endogen,

sperandu-se astfel o imbunatatire a situatiei. Nici aceasta a doua modalitate nu a avut succes.

Page 126: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

112

Tabel 1.3.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara) - agonisti-GnRH/ an 2001 Caz Cauza

Varsta

(ani)

Tip

FSH

Durata

stimularii

Nr.

total

UI

Tip

protocol

agonist

E2

(pg/ml)

LH

(UI/l)

Nr.

folicoli

- 13-15

- 16-18

- > 18

1 Low

response

33 rec 14 zile 6300 long 348 1,9 1/ 0/ 1

2 Low

response

42 rec 12 zile 3450 long 121 0,8 0/0/1

3 No

response

38 HMG 10 zile 6000 short 34 !!! 3,9 0/0/0

4 No

response

28 rec+HMG 15 zile 2775 long 892 1,9 0/0/1

5 ↑

prematura

LH; low

response

33 rec 12 zile 2325 long 192 28,2 1/ 0/ 0

6 Low

response

33 rec 9 zile 4050 short 534 5,1 0/ 0/ 2

Reactia pacientelor in sensul hiperstimularii s-a inregistrat in 8 cazuri, descrise in tabelul

1.3.9. Sunt amintiti in tabel numarul de folicoli si dimensiunile lor, precum si concentratiile E2

seric, care conform definitiei gradelor de hiperstimulare, cresc odata cu gravitatea sindromului.

Nu este insa obligatorie aceasta corelare.

• La 6 paciente din cele 8 enumerate nivelul E2 seric s-a situat > 1500 pg/ml. Media

valorilor E2 seric la cele 8 paciente este de 3929,5 pg/ml, cu mult mai ridicata fata de

media valorilor pentru intregul lot de 271 de paciente (2042,04 pg/ml).

• Gravitatea sindromului de hiperstimulare a fost usoara si moderata.

• In toate cele 8 cazuri s-a efectuat embriotransferul.

• Nu a fost cazul de crioconservare a celulelor cu 2PN.

• Se remarca ca 7 din aceste 8 cazuri s-au insotit de prezenta sarcinii. Este cunoscut faptul

ca sarcina poate agrava sindromul de hiperstimulare.

Page 127: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

113

Tabel 1.3.9 - Sindrom de hiperstimulare ovariana (agonisti-GnRH/ 2001) Caz Grad

hiperstim.

E2

(pg/ml)

Nr.

folicoli - 13-15

- 16-18

- > 18

Punctie

folic.

ET Criocons. Sarcina

Avort/

Nastere

1 II 1889 9/4/5 da da - da

nastere

2 II 6696 9/7/6 da da - da

nastere

3 II 2712 5/8/4 da da - da

nastere

4 II 3143 3/2/6 da da - nu

5 II 5608 7/2/5 da da - da

nastere

6 II 1326 1/1/3 da da - da

nastere

7 I/II 8592 8/7/7 da da - da

nastere

8 I 1470 3/2/3 da da - da

avort

d. Concluzii

Din totalul de 271 de paciente care au inceput ciclurile de stimulare in 6 cazuri nu s-a

efectuat punctie foliculara (pe motivul abandonarii ciclurilor).

• La 2 punctii foliculare nu s-au recoltat ovocite.

• In 33 de situatii nu s-a realizat fecundarea.

• In total la 41 de paciente nu s-a efectuat ET (date sumarizate in tabelul 1.3.10).

Page 128: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

114

Tabel 1.3.10 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ an 2001

Total punctii efectuate Total cazuri cu

fecundare realizata

Total ET efectuate Total

cicluri

stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent

271 265 97,78 % 238 87,82 % 230 84,87 %

Sarcini/ 2001: 59

• 41 de sarcini din totalul de 59 s-au obtinut in urma metodei FIV/ET si 18 sarcini – din

aplicarea tehnicii ICSI (1 sarcina din crioTESE)

• la 55 de paciente care au obtinut sarcina s-a administrat rFSH in vederea stimularii

ovariene, la 2 paciente: HMG si la 2 paciente: FSH-HP

• dintre aceste paciente care au obtinut sarcina - protocolul lung a fost aplicat in 58 de

cazuri si la 1 pacienta s-a utilizat protocolul ultra-lung.

Rata sarcinilor/ciclu: 21,77 %

Rata sarcinilor/punctie: 22,26 %

Rata sarcinilor/embriotransfer: 25,65%

Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 26,52 %

Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 15,12 %

e. Discutii

1. Se remarca fata de anul anterior (2000) o scadere a numarului de paciente carora li s-a

administrat protocol cu agonisti-GnRH si o crestere a pacientelor care au apelat la

protocoalele cu antagonisti-GnRH. Acest fapt se datoreaza probabil si prin castigarea in

experienta in terapia cu antagonisti-GnRH, cat si prin interpretarea rezultatelor (a

procentului de sarcini) ca fiind comparabil intre agonisti- si antagonisti-GnRH.

2. Media de varsta a pacientelor din lotul agonisti-GnRH este de 34,77 ani, comparativ cu

33,66 ani la lotul ce a folosit antagonisti-GnRH.

3. Durata de stimulare cu gonadotropina este asemanatoare la cele 2 loturi, la fel si

frecventa crescuta a administrarii preparatului rFSH fata de alte gonadotropine. Difera

Page 129: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

115

insa doza de stimulare, care la lotul cu antagonisti-GnRH este in valoare medie mai mica

decat la lotul cu agonisti-GnRN (1975,35 UI versus 2556,86 UI).

4. Procentul de raspuns nefavorabil la tratament, cu intreruperea ciclului este comparabil la

cele 2 loturi, desigur fiecare raportat la numarul total de cicluri initiale.

5. Media ovocitelor si a celulelor cu 2PN este usor mai scazuta in grupul cu agonisti-GnRH

comparativ cu antagonisti-GnRH/ anul 2001.

6. Rata sarcinilor raportata la numarul de cicluri initiate, la numarul de punctii efectuate si

la numarul de embriotransferuri realizate este insa superioara in grupul cu agonisti-GnRH

fata de antagonisti-GnRH:

Rata sarcinilor/ciclu: 21,77% versus 14,08%

Rata sarcinilor/punctie: 22,26 % versus 14,49%

Rata sarcinilor/ET: 25,65% versus 16,12%

Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 26,52 % versus 17,74%

Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 15,12 % versus 9,85%.

Page 130: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

116

Capitolul 1.4

Statistica pe 3 ani (1999-2000-2001) - Agonisti-GnRH

a. Material si metoda

In perioada celor cei 3 ani studiati (1999; 2000; 2001) un total de 832 de paciente s-au

adresat in vederea reproducerii asistate si au urmat protocoale de stimulare ovariana ce

cuprindeau in schema lor agonisti-GnRH (Tabel 1.4.1) (Fig. 1.4.1).

Media de varsta a pacientelor se situeaza la 34,49 ani, cu mediana de 35 de ani si deviatia

standard: 4,727. Varsta minima din acest grup de paciente a fost de 21 ani si varsta maxima de

46 ani.

Tabel 1.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - agonisti-GnRH/ 3 ani

Varsta pacientelor (ani) Numar paciente Procent

< 30 143 17,18 %

30-34 259 31,12 %

35-39 298 35,81 %

≥ 40 132 15,86 %

Se remarca ca in cei 3 ani examinati separat, majoritatea pacientelor se situau in grupele

de varsta 30-34 sau 35-39 ani, iar datele insumate arata ca procentul majoritar al pacientelor ce

au urmat tratament in cadrul tehnicilor de reproducere asistata au avut varsta cuprinsa intre 35-39

ani, urmate indeaproape de pacientele in intervalul de varsta 30-34 de ani. Pacientele tinere < 30

ani si cele cu varsta ≥ 40 ani au de asemenea valori apropiate ca procente, dar sunt cu

aproximativ jumatate mai putine (fiecare luate separat) decat cele din grupele 30-34 si 35-39 de

ani.

Femeile cu varsta >35 ani se adreseaza mai frecvent consultului si terapiei in vederea

reproducerii asistate. Un factor important este acela ca actualmente femeia moderna este

Page 131: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

117

implicata activ in viata sociala si profesionala si pe acest motiv amana momentul conceptiei dupa

varsta de 30 sau chiar 35 de ani.

< 30 ani

30-34 ani

35-39 ani

> 40 ani

Fig. 1.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - agonisti-GnRH/ 3 ani

Pacientelor ce au urmat protocoale cu agonisti-GnRH li s-au administrat mai multe tipuri

de gonadotropine in vederea stimularii ovariene controlate, conform tabelului 1.4.2 si figurii

1.4.2.

Tabel 1.4.2 - Repartitia tipurilor de gonadotropine - agonisti-GnRH/ 3 ani

Tipuri gonadotropine Numar paciente Procent

rFSH 660 79,32%

HMG 97 11,65%

rFSH + HMG 66 7,93%

FSH-HP 6 0,72%

rFSH + FSH-HP 1 0,12%

rFSH + HMG + FSH-HP 2 0,24%

298

259

143

132

Page 132: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

118

Din tabel si figura se observa ca cel mai frecvent s-a utilizat preparatul sintetizat genetic.

In partea generala a tezei am amintit studii care analizeaza comparativ rFSH si HMG si apoi

rFSH si FSH-HP si evidentiaza superioritatea rFSH referitor la calitatea ovocitelor si a

embrionilor. Costul acestei medicatii sintetizata genetic ramane inca ridicat si constituie un

argument suficient de important pentru alegerea si altor tipuri de gonadotropine.

0100200300400500600700

rFSH

HM

G

rFSH

+ H

MG

FSH

-HP

rFSH

+FSH

-HP

rFSH

+HM

G+F

SH-

HP

rFSH

HMG

rFSH + HMG

FSH-HP

rFSH+FSH-HP

rFSH+HMG+FSH-HP

Fig. 1.4.2 - Repartitia tipurilor de gonadotropine din stimularea ovariana - agonisti-GnRH/ 3 ani

Asa cum se intalneste si in literatura de specialitate, protocolul lung a fost si in acesti 3

ani cel mai des aplicat protocol cu agonisti-GnRH la lotul de 832 de paciente. Avantajele si

dezavantajele fiecarui protocol in parte, precum si momentul introducerii medicatiei supresive

hipofizare si durata administrarii agonistului-GnRH au fost prezentate pe larg in partea generala.

Protocolul lung a fost urmat ca frecventa de catre protocolul scurt si pe locul al treilea s-a situat

protocolul ultra-lung (Tabel 1.4.3); (Fig. 1.4.3).

660

97 66

6 1 2

Page 133: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

119

Tabel 1.4.3 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonisti-GnRH/ 3 ani

Tip protocol 1999 2000 2001 TOTAL

Lung 239 269 253 761

Scurt 12 22 10 44

Ultra-lung 7 12 8 27

• Protocol lung: 761 cazuri (91,46%);

• Protocol scurt: 44 cazuri (5,28%);

• Protocol ultra-lung: 27 cazuri (3,24%).

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Protocol lung Protocol scurt Protocol ultra-lung

Fig. 1.4.3 - Incidenta aplicarii celor 3 protocoale cu agonisti-GnRH/ 3 ani

761

44 27

Page 134: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

120

Durata medie a stimularii ovariene a fost comparabila in cei 3 ani studiati (Tabel 1.4.4) si

comparabila cu datele din studii internationale.

Insumate, datele au fost urmatoarele: durata medie a stimularii ovariene: 11,36 zile, valoarea

minima - 6 zile si cea maxima - 29 zile, mediana: 11 zile, deviatia standard: 2,336.

Un procent de 56,37 % din paciente au necesitat o durata a stimularii intre 11-15 zile, fiind

intervalul cel mai apropiat de mediana si media perioadei calculate pentru intregul lot; este

comparabila si cu statistica generala. Valori ceva mai lungi (16-19 zile) si foarte prelungite ale

stimularii (≥ 20 zile) s-au intalnit in procente scazut (Tabel 1.4.5).

Tabel 1.4.4 - Parametri statistici ai duratei de stimulare ovariana - agonisti-GnRH/ 3 ani

An studiat Durata

medie a

stimularii

(zile)

Minim zile

stimulare

Maxim zile

stimulare

Mediana

(zile)

Deviatia

standard

1999 11,46 7 21 11 2,198

2000 11,24 6 24 11 2,438

2001 11,41 6 29 11 2,350

TOTAL ani 11,36 6 29 11 2,336

Tabel 1.4.5 - Variatia pacientelor in functie de numarul de zile de stimulare ovariana - agonisti-

GnRH/ 3 ani

Nr. zile stimulare Nr. paciente Procent

≤ 10 zile 324 38,94 %

11-15 zile 469 56,37 %

16-19 zile 34 4,08 %

≥ 20 zile 5 0,60 %

In ceea ce priveste doza medie calculata pentru unitatile de gonadotropina administrata la

cele 832 de paciente a fost de 2635,19 UI, doza minima a fost de 750 UI si doza maxima la care

s-a ajuns in cursul tratamentului – 14.700 UI (!!!); mediana: 2250 UI gonadotropina si deviatia

Page 135: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

121

standard: 1428,368 (Tabel 1.4.6). Se observa ca doza medie de UI pentru fiecare an in parte cat

si cea calculata pentru intreaga perioada de 3 ani se situeaza in jurul valorii de 2500 UI si usor

mai crescuta peste aceasta valoare. Valorile maxime determinate pentru gonadotropinele

administrate pentru fiecare an in parte este insa foarte diferita, fiind cauzata de raspunsul la

terapia de stimulare al fiecarei paciente in parte si sugereaza statusul de „low responder”.

Tabel 1.4.6 - Parametri statistici ai gonadotropinelor - agonisti-GnRH/ 3 ani

An studiat Doza medie

a stimularii

(UI)

Minim doza

stimulare

(UI)

Maxim

doza

stimulare

(UI)

Mediana

(UI)

Deviatia

standard

1999 2784,98 750 14.700 2400 1692,569

2000 2577,42 825 8400 2250 1337,421

2001 2556,86 1050 9225 2250 1232,866

Total ani 2635,19 750 14.700 2250 1428,368

Ca si determinare hormonala a fost indispensabila si deosebit de importanta masurarea

valorii serice a E2 pe parcursul stimularii, iar rezultatele din tabele se refera la ultima valoare

anterior punctiei foliculare, fiind in ziua administrarii HCG. Acest hormon reflecta practic

functia foliculilor si raspunsul la terapia de stimulare. De o deosebita utilitate este si dozarea

serica al LH-ului, in vederea controlului supresiei hipofizare si a eficientei agonistului-GnRH.

Pe perioada celor 3 ani valoarea medie a E2 seric, masurat anterior inducerii ovulatiei, a

fost pentru intregul lot de paciente de 1926,21 pg/ml, cu o valoare minima obtinuta in ziua

administrarii HCG de 34 pg/ml (!!!) si o valoare maxima de 27.669 pg/ml; mediana: 1602,5

pg/ml, deviatia standard: 1702,215.

Tabelele urmatoare reflecta determinarile E2 seric pe paliere de valori. Ca si constatare:

cele mai multe paciente (36,41 %) au avut valori ale E2 seric > 2000 pg/ml in ziua administrarii

HCG, valori care se apropie de concentratii ce pot produce un sindrom de hiperstimulare

ovariana, (Tabel 1.4.7 si tabel 1.4.8).

Page 136: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

122

Tabel 1.4.7 - Valorile defalcate ale E2 seric (pg/ml) - agonisti-GnRH/ 3 ani

Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent

< 1000 pg/ml 176 21,15 %

1000-1499 pg/ml 197 23,67 %

1500-1999 pg/ml 156 18,75 %

>2000 pg/ml 303 36,41 %

Tabel 1.4.8 - Parametri statistici ai nivelului E2 seric - agonisti-GnRH/ 3 ani

An studiat Nivel mediu

E2 (pg/ml)

Minim nivel

E2 (pg/ml)

Maxim

nivel E2

(pg/ml)

Mediana

(pg/ml)

Deviatia

standard

1999 1862,16 135 22.580 1563 1747,692

2000 1877,16 205 27.669 1529 1917,754

2001 2042,04 34 10.889 1800 1369,984

TOTAL ani 1926,21 34 27.669 1602,5 1702,215

In ceea ce priveste valorile LH se constata urmatorii parametrii statistici (Tabelul 1.4.9).

Tabel 1.4.9 - Parametri statistici pentru LH seric - agonisti-GnRH/ 3 ani

Determinare

LH seric

Valoarea

medie

Valoarea

minima

Valoarea

maxima

Mediana Deviatia

standard

1999 2,43 UI/l 0,1 UI/l 38 UI/l 2 UI/l 2,698

2000 2,57 UI/l 0,1 UI/l 21,6 UI/l 2,1 UI/l 2,073

2001 2,34 UI/l 0,1 UI/l 28,2 UI/l 2 UI/l 2,157

TOTAL ani 2,45 UI/l 0,1 UI/l 38 UI/l 2 UI/l 2,307

Doar in 4 cazuri (0,48%) au fost sesizate valori ale LH-ului > 10 UI/l.

Page 137: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

123

3 paciente au fost stimulate cu rFSH si la o pacienta i s-a administrat asocierea rFSH si HMG.

In 3 situatii supresia hipofizara s-a realizat in cadrul unui protocol lung si la pacienta cu

asocierea de gonadotropine s-a preferat protocolul scurt.

Foliculometria seriata este un parametru important de urmarit alaturi de dozarea E2 seric

si semnifica reactivitatea pacientei la tratamentul administrat prin raspunsul ovarian. Am ales ca

parametru de urmarire marimea foliculara, cu 3 paliere de dimensiuni, pentru evaluarea

raspunsului ovarian. Masurarea ecografica a folicolilor s-a efectuat in paralel cu cea a dozarii E2

seric, valorile din tabel fiind ultimele masurate (anterior inducerii ovulatiei).

La lotul de 832 de paciente in cei 3 ani s-au obtinut urmatoarele valori in cadrul protocoalelor cu

agonisti-GnRH (Tabel 1.4.10):

Tabel 1.4.10 - Parametri statistici pentru foliculometrie - agonisti-GnRH/ 3 ani

Dimensiune

folicoli

(mm)

Numar

mediu

Numar

minim

Numar

maxim

Mediana Deviatia

standard

13-15 mm 2,79 0 15 2 2,298

16-18 mm 3,09 0 24 3 2,554

> 18 mm 3,80 0 16 4 2,107

Tehnicile de reproducere asistata aplicate cel mai des in cei 3 ani luati separat si per

ansamblu au fost fertilizarile conventionale, comparativ cu ICSI. De remarcat ca numarul de

cicluri abandonate a variat intre 0,99 si 3,1% in cei 3 ani analizati si valoarea procentuala

raportata la totalul de paciente a fost de 2,04%, care nu reprezinta o cifra semnificativa. (Tabel

1.4.11); (Fig. 1.4.4).

Page 138: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

124

Tabel 1.4.11 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu agonisti-

GnRH/ 3 ani

FIV ICSI Fara punctie An Nr.

paciente Numar Procent Numar Procent Numar Procent

1999 258 135 52,32% 115 44,57% 8 3,10%

2000 303 209 68,97% 91 30,03% 3 0,99%

2001 271 181 66,78% 84 30,99% 6 2,21%

TOTAL 832 525 63,10% 290 34,85% 17 2,04%

FIV/ET

ICSI

Fara punctie

Fig. 1.4.4 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu agonisti-

GnRH/ 3 ani

525

290

17

Page 139: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

125

b. Rezultate

Punctiile foliculare efectuate pentru FIV sau ICSI au recoltat o medie de 8,43 ovocite,

numarul maxim de ovocite aspirat in cadrul unei punctii fiind de 32 iar numarul minim de 0,

mediana: 8 ovocite, deviatia standard: 5,387.

La controlul fecundarii realizat la 16-20 ore de la inseminarea sau microinjectarea

ovocitelor s-a obtinut o medie de 3,71 celule cu 2PN, numarul maxim a fost de 23 celule cu 2PN

si un numar minim de 0 celule cu 2PN (absenta fecundarii), mediana: 3 celule cu 2PN, deviatia

standard: 3,273. S-au luat in calcul toate ciclurile de stimulare ovariana initiate.

ET s-a efectuat cu 1, 2 sau maxim 3 embrioni (criteriile au fost variate: varsta pacientei,

patologie, aspectul embrionilor, posibilitatea crioconservarii). Numarul mediu de embrioni

pentru transfer a fost de 1,76, mediana: 2 embrioni, deviatia standard: 0,958. Au existat si situatii

in care nu s-au transferat embrioni pe motivul sindromului de hiperstimulare (au fost

crioconservati), fie calulele cu 2PN s-au oprit in evolutie. Cazul cel mai nefericit este cel la care

in urma inseminarii/microinjectarii ovocitelor nu s-a realizat fecundarea. Au fost in total 135

cazuri la care nu s-a realizat embriotransfer. Rata realizarii embriotransferului a fost de 83,77%

pentru cele 832 cazuri.

Din totalul de 832 de cicluri initiale s-a reusit crioconservarea in 383 de cicluri (Tabel

1.4.12). S-a crioconservat o medie de 1,97 celule cu 2PN, numarul maxim fiind de 20, respectiv

numarul minim de 0 celule cu 2 PN; mediana: 0, deviatia standard: 2,860.

Tabel 1.4.12 - Repartitia crioconservarii functie de tehnica de reproducere asistata - agonisti-

GnRH/ 3 ani

Crio-FIV Crio-ICSI An Nr.

paciente

Total crio

Numar Procent Numar Procent

1999 258 126 68 53,96% 58 46,03%

2000 303 121 73 60,33% 48 39,66%

2001 271 136 91 66,91% 45 33,08%

TOTAL 832 383 232 60,57% 151 39,42%

Page 140: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

126

c. Observatii

Complicatiile de tipul raspunsului redus la stimularea ovariana („low responder/no

responder”) intalnite pe parcursul celor 3 ani la cele 832 de paciente s-au soldat cu intreruperea

ciclului de stimulare si neefectuarea punctiei foliculare. Au existat si 3 cazuri la care in ciuda

existentei criteriilor de abandonare a stimularii s-a tentat totusi aspirarea foliculara dar fie a fost

punctia negativa – fara ovocite sau unicul ovocit extras nu s-a fecundat. In tabelul urmator (Tabel

1.4.13) sunt redate toate cazurile de „low responder” (cu sau fara punctie), situatie stabilita in

functie de criteriile ecografice si hormonale. S-au exclus cazurile la care nu s-a efectuat punctia

pe motivul sindromului de hiperstimulare.

Tabel 1.4.13 - Raspunsul redus la terapia de stimulare – agonisti-GnRH/ 3 ani Protocol agonist-

GnRH Tip gonadotropina Low

responder

Varsta

medie

(ani)

Medie UI

gonado-

tropina

Durata

medie

stim.

(zile)

lung scurt ultra-

lung

rFSH HMG rFSH+HMG

18 cicluri 34,22 4425,27 12,27 14 4 0 11 1 6

Raspunsul exagerat la terapia de stimulare, manifestat sub forma sindromului de

hiperstimulare, se intalneste in 29 de cazuri (3,48%) din totalul de 832 cicluri cu agonisti-GnRH/

3 ani.

Formele si gravitatea acestui sindrom au fost de la cea usoara la moderata si severa, cu

preponderenta celei moderate (in 21 de cazuri).

Valoarea E2 seric se coreleaza in majoritatea situatiilor, exista insa si exceptii, la care nu se

intalneste E2 seric crescut. Acest fapt a fost amintit in partea generala; fiind citate si cazuri de

sindrom de hiperstimulare care apare in ciclu spontan (rar).

Valoarea medie a E2 seric determinate pentru aceste paciente a fost de 3018,31 pg/ml, care se

situeaza cu mult peste concentratia medie a E2 seric calculat la lotul total de 832 de paciente

(1926,21 pg/ml).

La 18 paciente s-a inregistrat si prezenta sarcinii.

Page 141: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

127

d. Concluzii

In perioada celor 3 ani analizati s-au obtinut pentru cele 832 de cicluri de stimulare

ovariana controlata cu protocoale cu agonisti-GnRH un numar total de 179 de sarcini (21,51%).

Nu s-au obtinut decat 27 sarcini biochimice (15,08%), 29 sarcini s-au terminat cu avort (spontan

sau terapeutic) (16,2%) iar numarul sarcinilor ectopice s-a ridicat la 9 (5,02%). Sarcinile multiple

au fost de asemenea reduse comparativ cu sarcinile monofetale (13,40% versus 50,83%),

sarcinile multiple fiind reprezentate doar de sarcini gemelare.

Rata avorturilor, a sarcinilor extrauterine si a celor multiple se inscriu procentual in datele din

literatura de specialitate (exemplificat in partea generala) (Tabel 1.4.14).

Tabel 1.4.14 - Numarul de sarcini/ nasteri la pacientele cu agonisti-GnRH/ 3 ani An Nr.

paciente

Nr.

sarcini

Sarcini

biochimice

Avort Sarcina

ectopica

Nastere

monofetala

Nastere

gemelara

Nastere

multipla

1999 258 56 6 7 3 34 6 0

2000 303 64 13 13 5 23 11 0

2001 271 59 8 9 1 34 7 0

TOTAL 832 179

21,51%

27

29

9

91

24

0

Sarcini/ 1999: 56

• 34 sarcini au rezultat din FIV/ET si 22 sarcini - din ICSI (1 sarcina din crioTESE);

• 51 paciente care au obtinut sarcina (inclusiv biochimica) au fost stimulate cu rFSH, 3

paciente: stimulare ovariana cu HMG, 2 paciente: rFSH asociat cu HMG;

• la 53 de paciente s-a aplicat protocolul lung, la 3 paciente – protocolul ultra-lung.

Sarcini/ 2000: 64

• 43 sarcini au fost obtinute din FIV/ET si 21 de sarcini – din ICSI (3 sarcini din

crioTESE);

• la 47 de paciente stimularea s-a efectuat cu rFSH, la 10 paciente – cu HMG, la 2 paciente

cu FSH-HP, la 5 paciente: asociere rFSH cu HMG;

Page 142: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

128

• din aceste paciente care au obtinut sarcina s-a aplicat protocolul lung la 59 de paciente,

cel scurt la 3 paciente si cel ultra-lung la 2 paciente.

Sarcini/ 2001: 59

• 41 de sarcini din totalul de 59 s-au obtinut in urma metodei FIV/ET si 18 sarcini – din

aplicarea tehnicii ICSI (1 sarcina din crioTESE);

• la 55 de paciente care au obtinut sarcina s-a administrat rFSH in vederea stimularii

ovariene, la 2 paciente: HMG si la 2 paciente: FSH-HP;

• dintre aceste paciente care au obtinut sarcina - protocolul lung a fost aplicat in 58 de

cazuri si la 1 pacienta s-a utilizat protocolul ultra-lung.

Conform tabelelor 1.4.15 – 1.4.17 si a figurilor 1.4.5 - 1.4.7 se conclude ca:

• de la introducerea rFSH, acesta a castigat in incredere si si-a dovedit superioritatea

fata de preparatele gonadotropinice anterioare, fiind administrat in studiul actual in

procent de 85,47%;

Tabel 1.4.15 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cadrul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti-GnRH

Nr. sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent

rFSH 51 47 55 153 85,47%

HMG 3 10 2 15 8,37%

FSH-HP 0 2 2 4 2,23%

rFSH+HMG 2 5 0 7 3,91%

Page 143: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

129

0

10

20

30

40

50

60

rFSH HMG FSH-HP rFSH+HMG

1999

2000

2001

Fig. 1.4.5 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti/GnRH

• tipul de protocol care a fost administrat in cazul marii majoritati a pacientelor a fost

cel lung (94,97%). Exista acumulata o experienta suficient de mare in cazul acestui

protocol si literatura de specialitate confirma avantajele acestuia;

Tabel 1.4.16 - Frecventa tipurilor de protocoale cu agonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani

Nr.sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent

Protocol lung 53 59 58 170 94,97%

Protocol scurt 0 3 0 3 1,67%

Protocol ultra-

lung

3 2 1 6 3,35%

Page 144: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

130

0

10

20

30

40

50

60

Protocol lung Protocol scurt Protocolultralung

1999

2000

2001

Fig. 1.4.6 - Frecventa tipurilor de protocoale cu agonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani

• fertilizarile conventionale FIV/ET au fost in fiecare an superioare ca numar tehnicilor de microinjectie ICSI (65,92% versus 34,07%) si aplicate conform indicatiilor fiecarei metode.

Tabel 1.4.17 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti/GnRH

1999 2000 2001 TOTAL

Total

sarcini

56 64 59 179

Procent

FIV/ET

ICSI

34

22

43

21

41

18

118

61

65,92%

34,07%

Page 145: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

131

05

1015202530354045

FIV/ET ICSI

1999

2000

2001

Fig. 1.4.7 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti/GnRH

Din 258 cicluri de stimulare initiate in anul 1999:

• 8 cazuri nepunctionate;

• 1 caz fara ovocit la punctie;

• 16 cazuri fara fecundare;

• in total: 29 cazuri fara ET.

Cele 303 paciente care au inceput ciclul de stimulare ovariana controlata in anul 2000:

• in 3 cazuri nu s-a efectuat punctie foliculara;

• la 4 paciente la aspiratia folicolilor nu s-au recoltat ovocite (punctie negativa);

• in 57 de situatii nu s-a realizat fecundatia;

• la 2 paciente s-au crioconservat toate ovocitele fecundate (toti prezigotii) si nu s-a mai

efectuat ET;

• in total la 66 de paciente ciclul de stimulare inceput nu s-a finalizat cu ET.

Din totalul de 271 de paciente care au inceput ciclurile de stimulare in anul 2001:

Page 146: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

132

• in 6 cazuri nu s-a efectuat punctie foliculara (pe motivul abandonarii ciclurilor);

• la 2 punctii foliculare nu s-au recoltat ovocite;

• in 33 de situatii nu s-a realizat fecundarea;

• in total la 41 de paciente nu s-a efectuat ET.

(Tabel 1.4.18)

Tabel 1.4.18 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ 3 ani

Total punctii

efectuate

Total cazuri cu

fecundare realizata

Total ET efectuate An Total

cicluri

stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent

1999 258 250 96,89% 233 90,31% 229 88,75%

2000 303 300 99% 246 81,18% 237 78,21%

2001 271 265 97,78 % 238 87,82 % 230 84,87 %

TOTAL 832 815 97,95% 717 86,17% 696 83,65%

Datele finale ale ratei sarcinilor sunt exemplificate in tabelul 1.4.19. Toate procentele

defalcate pe ani in parte pentru rata sarcinilor/ciclu se coreleaza cu procentele din statisticile

generale de 20-25% iar baby take home rate pentru cei 3 ani (13,82%) este de asemenea

comparabila cu datele din literatura.

Rata sarcinilor/cicluri stimulate: 21,51%

Rata sarcinilor/punctii efectuate: 21,96 %

Rata sarcinilor/embriotransfer: 25,68%

Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 27,29%

Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 13,82%.

Page 147: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

133

Tabelul 1.4.19 - Rata sarcinilor – protocol agonisti-GnRH/ 3 ani

1999 2000 2001 TOTAL Rata

sarcini/ciclu 21,70% 21,12% 21,77% 21,51%

Rata sarcini/ punctie

22,40% 21,33% 22,26 % 21,96%

Rata sarcini/ET

24,45% 27% 25,65% 25,68%

Rata implantarii

28,38% 27% 26,52 % 27,29%

Baby take home rate

15,50% 11,22% 15,12 % 13,82%

e. Discutii

1. Numarul de paciente care s-a adresat intr-o perioada de 3 ani unui centru de reproducere

umana asistata si au fost incluse in program de stimulare ovariana cu protocol agonisti-

GnRH a fost cu mult superior lotului de paciente cu protocol cu antagonisti-GnRH. O

explicatie este faptul ca agonistii sunt cunoscuti mai demult si experienta acumulata cu

acestia este mai mare. Sinteza substantelor antagoniste si introducerea lor in practica

curenta este de data mai recenta. Este necesara o perioada de timp pentru a fi acceptata

aceasta medicatie atat de medic cat si de pacienta.

2. Se remarca ca media de varsta a pacientelor se situeaza la 34,49 ani, cu mediana de 35 de

ani, extremele sunt de 21 de ani si 46 de ani. Conform tendintei actuale a femeii moderne

de implicare activa in viata profesionala, se deduce de ce perioada alocata conceptiei se

situeaza in jurul acestei varste.

3. Din punctul de vedere al tipului de protocol – cel lung a fost aplicat in procent covarsitor

in cei 3 ani analizati separat si per ansamblu, existand mai bune rezultate cu acest

protocol.

4. Referitor la stimularea ovariana, preparatul care s-a impus este cel sintetizat genetic, cu

efecte mai bune asupra numarului si calitatii ovocitare si embrionare, comparativ cu

celelalte gonadotropine cunoscute.

Page 148: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

134

5. Durata stimularii ovariene este in medie de 11,36 zile, majoritatea pacientelor (56,37%)s-

au incadrat in grupa perioadei cuprinse 11-15 zile.

6. Valoarea medie a E2 seric (dozat in ziua inducerii ovulatiei) a fost 1926,21 pg/ml pentru

intregul lot de 832 de paciente, cu o valoare minima - 34 pg/ml (!!!) si o valoare maxima

de 27.669 pg/ml (dependent de raspunsul individual); mediana: 1602,5 pg/ml.

7. Cresteri premature al LH-ului endogen> 10 UI/l s-au determinat doar in 4 cazuri (0,48%)

LH-ului, ceea ce semnifica o buna complianta a tratamentului. 3 din aceste cazuri au fost

asociere de protocol lung si rFSH, iar intr-o situatie a fost vorba de protocol scurt si

rFSH+HMG.

8. Incidenta tehnicii clasice de FIV/ET a fost cu mult mai crescuta fata de metoda

microinjectiei ICSI, atat in cazul intregului lot de paciente cat si la cele care au obtinut

sarcina. ICSI are indicatii clare, limitate la un grup mai restrans de patologie, in special la

cea masculina si care poate constitui un factor de fertilitate mai scazuta.

9. Numarul mediu de ovocite recoltat prin punctie foliculara a fost de 8,43, care se inscrie in

datele din literatura de specialitate.

10. Ciclurile abandonate pe motivul de raspuns redus la terapie, complicatia de low

responder sau dimpotriva, cea de sindrom de hiperstimulare ovariana nu se afla

procentual la valori care sa depaseasca statisticile generale.

11. Rata sarcinilor/ciclu: 21,51% si baby take home rate se incadreaza de asemenea in

parametri generali.

Page 149: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

135

Capitolul 2 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH in

reproducerea umana asistata

Capitolul 2.1

Statistica protocoalelor cu antagonisti-GnRH - anul 1999

a. Material si metoda

Numarul de paciente la care s-au efectuat tehnici de reproducere asistata utilizand

antagonisti-GnRH in cadrul schemelor de stimulare ovariana au fost 41.

Varsta medie a acestora a fost de 36,21 ani, mediana: 37 ani, cu valorile minime si maxime de 24

si 42 ani. Deviatia standard: 4,210 (Tabel 2.1.1).

Tabel 2.1.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor (antagonist-GnRH/ 1999)

Varsta pacientelor (ani) Numar paciente Procent

< 30 3 7,31 %

30-34 5 12,19 %

35-39 24 58,53 %

≥ 40 9 21,95 %

Se observa din acest tabel ca majoritatea pacientelor s-au incadrat in grupul de varsta 35-

39 de ani. Stimularea ovariana a folosit mai multe tipuri de preparate, cel mai frecvent a fost

administrat rFSH (in 31 cazuri, 75,6%) (Tabel 2.1.2); (Fig. 2.1.1).

Tabel 2.1.2 - Preparate de gonadotropine in stimularea ovariana (antagonist-GnRH/ 1999)

Tipuri gonadotropine Numar paciente Procent

rFSH 31 75,6 %

HMG 4 9,75 %

rFSH+HMG 5 12,19 %

FSH-HP 1 2,43 %

Page 150: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

136

rFSH

HMG

rFSH+HMG

FSH-HP

Fig. 2.1.1 - Repartitia preparatelor gonadotropinice in stimularea ovariana (antagonist-GnRH/

1999)

In total s-au folosit pentru stimularea ovariana o medie de 2176,58 UI gonadotropina, cu

limitele intre 525 UI si 6000 UI; mediana: 1875 UI, deviatia standard: 1118,79.

Durata medie a stimularii a fost de 9,58 de zile, cu limitele intre 6 si 17 zile, mediana: 9

zile, deviatia standard: 2,144.

Dintre tipurile de protocol cu anatgonist-GnRH a fost preferat protocolul german

(Lübeck) in 37 de cazuri, fata de protocolul francez – in 3 cazuri (Fig. 2.1.2).

31

4

5

1

Page 151: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

137

protocolLubeck

Protocolfrancez

Fig. 2.1.2 Tipurile de protocol cu antagonist-GnRH/ an 1999

Valoarea maxima atinsa a estradiolului seric a fost in medie de 1141,39 pg/ml, cu

extremele intre 219-2650 pg/ml, mediana: 1056 pg/ml, deviatia standard: 553,508 (Tabel 2.1.3)

Tabel 2.1.3 - Valori defalcate ale estradiolului seric (pg/ml) (antagonist-GnRH/ 1999)

Nivel E2 (pg/ml) Numar paciente Procent

< 1000 pg/ml 20 cazuri 48,78%

1000-1499 pg/ml 14 cazuri 34,14%

1500-1999 pg/ml 4 cazuri 9,75%

>2000 pg/ml 3cazuri 7,31%

Ca si o observatie: valoarea minima a estradiolului a fost de 219 pg/ml, totusi la aceasta

pacienta s-a efectuat punctie foliculara si s-a obtinut si fecundare. Complicatii de tipul

sindromului de hiperstimulare ovariana nu s-au intalnit la cele mai mari nivele atinse ale

estradiolului seric, ci la un nivel mediu, de 1269 pg/ml.

37

3

Page 152: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

138

Concentratia medie serica a LH-ului a fost de 2,38 mUI/ml, cu extremele de 0,1 si 27,9

mUI/ml, mediana: 1,6 mUI/ml, deviatia standard: 4,301.

Ecografic s-au descris folicoli cu dimensiunile (Tabel 2.1.4):

• Media folicolilor 13-15 mm: 2,4. Mediana: 2 folicoli, deviatia standard: 2,013;

• Media folicolilor 16-18 mm: 2,12. Mediana: 2 folicoli, deviatia standard: 1,791;

• Media folicolilor > 18 mm: 4,12. Mediana: 3 folicoli, deviatia standard: 2,767.

Preponderenti au fost folicolii > 18 mm, asa cum de fapt se si doreste in cadrul unei stimulari

ovariene controlate.

Tabel 2.1.4 - Parametri statistici ai folicolilor (antagonisti-GnRH/anul 1999)

Dimensiune

folicoli

Media Mediana Numarul

minim

Numarul

maxim

Deviatia

standard

13-15 mm 2,4 2 0 7 2,013

16-18 mm 2,12 2 0 6 1,791

> 18 mm 4,12 3 1 17 2,767

Tehnicile de reproducere asistata care s-au efectuat au fost FIV conventionala in 24

cazuri si ICSI in 16 situatii, dintre care la 1 pacienta s-au folosit spermii crioconservate si

decongelate, obtinute din biopsie testiculara (TESE).

Intr-o situatie nu s-a aplicat nici o metoda pe motivul abandonului ciclului („low responder”)

(Fig. 2.1.3).

• FIV: 24 cazuri (58,53%);

• ICSI: 16 cazuri (39,02%);

• Cazuri nepunctionate: 1 (2,43%).

Page 153: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

139

FIVconventionala

ICSI

Caznepunctionat

Fig. 2.1.3 - Tehnici de reproducere asistata aplicate (antagonisti-GnRH/anul 1999)

b. Rezultate

Numarul de ovocite obtinute in medie la aspiratul folicular a fost de 7,56, cu valoarea

minima de 0 (intr-un caz in care s-a efectuat punctie foliculara, cu toate ca se intruneau criterii de

abandon a ciclului) si valoarea maxima de 19 ovocite. Mediana: 6 ovocite, deviatia standard:

4,975 (Tabel 2.1.5).

Tabel 2.1.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu

antagonisti-GnRH/ anul 1999

Numar mediu

ovocite

Mediana Numar maxim

recoltat

Numar minim

recoltat

Deviatia

standard

7,56 6 19 0 4,975

Fecundarea, obtinerea celulelor cu 2 PN, s-a intalnit in 39 de cazuri din totalul de 41

cicluri stimulate (95,12%). Media celulelor fertilizate a fost de 4,19, cu limite intre 1 si 12 celule

cu 2 PN, mediana: 3 celule cu 2 PN, deviatia standard 3,226 (Tabel 2.1.6).

16 24

1

Page 154: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

140

Tabel 2.1.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ anul 1999)

Numar mediu

celule cu 2PN

Mediana Numar maxim

celule cu 2PN

Numar minim

celule cu 2PN

Deviatia

standard

4,19 3 12 1 3,226

Numarul de embrioni care s-au transferat au fost intre 0 si 3, niciodata > 3 embrioni, cu o

medie de 2,07, mediana de 2 embrioni si deviatia standard: 0,905.

Crioconservarea celulelor cu 2 PN s-a putut efectua in 20 de cazuri, dintre care in 14

situatii celulele au provenit din FIV conventionala si in 6 cazuri – de la ICSI. Media celulelor cu

2 PN care s-au crioconservat a fost de 2,12, cu extremele de 1 si 10 (fig. 2.1.4).

02468

101214

Crio-FIV Crio-ICSI

Fig. 2.1.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI

(antagonisti-GnRH/ anul 1999).

14

6

Page 155: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

141

In urma acestor proceduri s-a obtinut un total de 4 sarcini, evolutia acestora fiind

urmatoarea:

• 2 avorturi spontane (la 6 si 8 saptamani de gestatie)

• 2 nasteri - la termen, pe cale naturala, sarcini monofetale, copiii nascuti – cariotip

normal

Nu s-a intalnit nici o sarcina biochimica, extrauterina si nu au fost sarcini multiple (Tabel 2.1.7).

Tabel 2.1.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu antagonisti-GnRH/ anul 1999

Sarcina Sarcina

biochimica

Avort

spontan

Sarcina

ectopica

Nastere

monofetala

Nastere

gemelara

Nastere

tripla

Nr. cazuri 0 2 0 2 0 0

Procent 0 50% 0 50% 0 0

c. Observatii

Esecurile intalnite au fost 2 la numar, reprezentate de o crestere prematura de LH si o

situatie de „low responder”.

• Situatia de „low responder” se descrie la o pacienta de 38 de ani, la care s-a stimulat

ovarian cu rFSH timp de 11 zile, un numar total de UI de 1875, in cadrul protocolului

Lübeck. Estradiolul seric maxim obtinut a fost de 381 pg/ml si valoarea LH a fost de 0,1

mUI/ml. Ecografic s-au masurat 2 folicoli 13-15 mm si 2 folicoli > 18 mm. Avand in

vedere criteriile de abandon ale stimularii la aceasta pacienta nu s-a efectuat punctie

foliculara (Tabel 2.1.8).

• Cresterea prematura de LH s-a intalnit la o pacienta de 41 de ani, la care s-a aplicat

protocolul francez, stimularea fiind cu rFSH timp de 9 zile, total UI FSH: 1575.

Estradiolul seric a fost de 771 pg/ml si LH a crescut la 27,9 mUI/ml. Ecografic s-au

masurat 4 folicoli de 13-15 mm si 2 folicoli > 18 mm. Cu toate ca aspectul ecografic, cel

al nivelurilor hormonale si varsta pacientei au pledat pentru intreruperea stimularii, totusi

s-a efectuat aspirat folicular in cadrul FIV conventionale, dar nu s-a obtinut nici un ovocit

(Tabelul 2.1.9).

Page 156: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

142

Tabel 2.1.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ anul 1999 Caz Cauza

Varsta

(ani)

Tip

FSH

Durata

stimularii

Nr.

total

UI

Tip

protocol

E2

(pg/ml)

LH

(UI/l)

Nr.

folicoli

- 13-15

- 16-18

- > 18

1 Low

response

38 rec 11 zile 1875 Lubeck 381 0,1 2/ 0/ 2

Tabel 2.1.9 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – antagonisti-GnRH/ anul 1999 Caz Cauza

Varsta

(ani)

Tip

FSH

Durata

stimularii

Nr.

total

UI

Tip

protocol

E2

(pg/ml)

LH

(UI/l)

Nr.

folicoli

- 13-15

- 16-18

- > 18

Rezultat

punctie

1 ↑

prematura

LH

41 rec 9 zile 1575 francez 771 27,9 4/ 0/ 2 FIV.

Øovocit

Observatii particulare:

• Valoarea cea mai mica a estradiolului seric din grupul de 41 de paciente a fost de 219

pg/ml (valoare extrem de redusa) la o pacienta de 35 de ani, stimulata ovarian cu 1800 UI

rFSH timp de 8 zile, in cadrul protocolului Lübeck. Valoarea masurata a LH-ului: 3,2

mUI/ml. Folicolii masurati ecografic au fost: 3 folicoli 13-15 mm; 1 folicol 16-18 mm; 2

folicoli > 18 mm. S-a efectuat FIV conventionala si s-au obtinut 6 ovocite, dintre care 2

s-au fecundat. Embriotransferul s-a efectuat cu 2 embrioni, dar nu s-a obtinut nici o

sarcina.

• Toate cele 4 sarcini obtinute au fost in urma punctiei foliculare din cadrul FIV clasice, la

toate pacientele s-a folosit ca si gonadotropina - rFSH si s-a utilizat protocolul Lübeck.

Ca si complicatie in sensul raspunsului exagerat amintesc 1 caz de sindrom de

hiperstimulare ovariana grad I, care a aparut la o pacienta in varsta de 39 ani, la care s-a stimulat

Page 157: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

143

cu rFSH timp de 6 zile, doza totala: 1275 UI, s-a aplicat protocolul Lübeck. Valoarea maxima a

estradiolului seric a fost de 1269 pg/ml, iar LH a fost de 0,2 mUI/ml. Ecografic folicolii au fost

in numar de 17 si toti > 18 mm. S-a practicat FIV clasica si s-au recoltat 19 ovocite, dintre care

11 s-au fecundat. 3 dintre aceste celule s-au cultivat pana a 2-a zi si s-a efectuat embriotransfer

cu 3 embrioni. Restul de 8 celule cu 2 PN s-au crioconservat. Nu s-a obtinut nici o sarcina.

De remarcat: criteriul de intrerupere a stimularii a fost indeplinit prin numarul mare de

folicoli > 18 mm, dar cu o secretie inadecvata de estradiol (mica pentru numarul si dimensiunea

folicolilor, neconcordanta). S-a indus ovulatia cu 10.000 UI HCG si s-a sustinut faza luteala cu

progesteron intravaginal 600 mg/zi.

d. Concluzii

Din cele 41 cicluri stimulate initial la 1 caz nu s-a efectuat punctie foliculara pe motivul

„low responder” (s-au efectuat doar 40 punctii). In 2 cazuri nu s-au obtinut ovocite (1 caz nu a

fost punctionat si intr-un caz nu s-au recoltat ovocite. Prin urmare, din totalul de 41 cicluri

stimulate, doar in 39 de cazuri s-a realizat embriotransferul (Tabel 2.1.10).

Tabel 2.1.10 - Rezultatele ciclurilor cu antagonisti-GnRH/ an 1999

Total punctii efectuate Total ET realizate Numar cicluri

stimulate Numar Procent Numar Procent

41 40 97,56% 39 95,12%

Rata sarcinilor/ciclu: 9,75%

Rata sarcinilor/punctie: 10%

Rata sarcinilor/embriotransfer: 10,25%

Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 10,25%

Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 4,87%

Page 158: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

144

e. Discutii

1. Numarul de paciente din lotul ce au utilizat protocoale de stimulare ovariana cu

antagonisti-GnRH in schema au fost intr-un numar de 6 ori mai redus comparativ cu

pacientele care s-au adresat reproducerii asistate si care au fost incluse in protocoale cu

agonisti-GnRH.

2. Varsta medie a pacientelor se situeaza intre 35-39 ani.

3. Tipul de gonadotropina, durata medie a stimularii si doza medie totala a unitatilor de

gonadotropina sunt similare la lotul agonist versus antagonist-GnRH.

4. Numarul de punctii foliculare raportate la ciclurile initiale de stimulare ovariana si

procentul de ET realizate, raportate tot la ciclurile de stimulare, se ridica la valori similare

cu situatia intalnita la grupul cu agonist-GnRH.

5. Media si mediana ovocitelor rezultate in urma punctiei foliculare sunt mai reduse

comparativ cu grupul de paciente din acelasi an si carora li s-a administrat protocol cu

agonist-GnRH

6. Complicatii de tipul „low response” si sindrom de hiperstimulare ovariana se intalnesc in

procent redus (2,43%).

7. Totalul de sarcini obtinute au fost in urma tratamentului de stimulare cu rFSH in cadrul

protocolului Lübeck. Acest tip de protocol a fost administrat in procent majoritar

comparativ cu protocolul francez.

8. Raportarea sarcinilor la numarul de cicluri de stimulare/ la numarul de punctii efectuate si

la numarul de ET realizate este mult mai scazut in grupul antagonist-GnRH versus

agonist-GnRH.

Page 159: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

145

9. Baby take home rate are valori reduse atat in comparatie cu datele din literatura de

specialitate, cat si fata de rezultatele obtinute la lotul de paciente cu agonist-GnRH.

Page 160: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

146

Capitolul 2.2

Statistica protocoalelor cu antagonisti-GnRH - anul 2000

a. Material si metoda

Un numar de 37 de paciente au efectuat cicluri cu antagonisti-GnRH in anul 2000.

Varsta medie a pacientelor a fost 34,13 ani, cu limitele intre 26-43 ani, mediana: 34 ani,

deviatia standard: 4,001. Pacientele majoritare s-au situat in grupul de varsta 30-39 ani. Doar 3

paciente din grupul de 37 au avut varsta <30 ani. (Tabel 2.2.1)

Tabel 2.2.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor care au efectuat cicluri cu antagonist-

GnRH/ 2000

Varsta pacientelor Numar paciente Procent (%)

<30 ani 3 8,1

30-34 ani 16 43,24

35-39 ani 15 40,54

≥ 40 ani 3 8,1

Pentru stimularea ovariana s-au folosit preponderent preparatele de rFSH (34 paciente), la

2 paciente s-a utilizat HMG iar la 1 pacienta s-au combinat cele 2 preparate (rFSH si HMG) (Fig.

2.2.1).

Durata medie a stimularii cu gonadotropina a fost de 9,83 zile, durata cea mai scurta fiind

de 7 si cea maxima de 31 zile, mediana: 9 zile, deviatia standard: 3,869.

Media uitatilor de gonadotropina folosite pe parcursul stimularii ovariene a fost de

1939,32 UI FSH, cu extremele de 900 si 6225 UI, mediana: 1650 UI, deviatia standard: 912,635.

Page 161: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

147

0

5

10

15

20

25

30

35

rFSH

HMG

HMG+rFSH

Fig. 2.2.1 - Preparate folosite pentru stimularea ovariana (antagonist-GnRH/ 2000)

Tipurile de protocol cu antagonist-GnRH au fost:

• Protocolul francez (doza unica): 6 cazuri (16%)

• Protocolul Lűbeck: 31 cazuri (84%) (Fig. 2.2.2)

Protocolfrancez

ProtocolLubeck

Fig. 2.2.2 - Tipurile de protocol cu antagonist-GnRH/ anul 2000

31

6

34

2 1

Page 162: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

148

Nivelul seric obtinut pentru E2 (valoarea medie) in ziua administrarii HCG a fost de

1237,13 pg/ml, cu valoarea minima de 101 si maxima de 5494 pg/ml (Tabel 2.2.2), mediana

1105 pg/ml, deviatia standard: 1012,796.

Se observa ca in 48,64 % din cazuri cresterea estradiolului seric pe parcursul stimularii

(determinata inaintea administrarii HCG) a fost < 1000 pg/ml. In aceste cazuri se inscriu si cele

la care s-au abandonat ciclurile de stimulare pe motivul cresterii monofoliculare sau a scaderii

concentratiei de estradiol.

Tabel 2.2.2 - Nivelul defalcat al estradiolului seric – antagonisti-GnRH/ an 2000

Nivel seric estradiol

(pg/ml)

Nr. cazuri %

< 1000 18 48,64

1000-1500 9 24,32

1500-2000 4 10,81

>2000 6 16,21

S-a controlat pe parcursul stimularii si nivelul LH-ului endogen (mUI/ml), a carui valoare

medie a fost de 2,056; cu minima de 0,1 si maxima de 19,6 mUI/ml, mediana 0,9 mUI/ml,

deviatia standard: 3,305.

Doar 1 caz a prezentat o crestere prematura de LH (> 10 mUI/ml), constituind un criteriu de

abandon al ciclului si nu s-a efectuat punctie foliculara.

Masurarea ecografica a folicolilor a aratat urmatoarele valori (Tabel 2.2.3):

• Folicoli 13-15 mm - (media): 2,67 (valori extreme: 0-10);

• Folicoli 16-18 mm - (media): 2,35 (valori extreme: 0-10);

• Folicoli > 18 mm - (media): 3,51 (valori extreme: 0-12);

Page 163: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

149

Tabel 2.2.3 – Parmateri statistici pentru folicoli – protocol cu antagonist-GnRH/ an 2000

Dimensiune

folicoli

Media Mediana Valoarea

minima

Valoarea

maxima

Deviatia

standard

13-15 mm 2,67 2 0 10 2,224

16-18 mm 2,35 2 0 10 1,917

> 18 mm 3,51 3 0 12 2,168

Din totalul de cicluri cu antagonist-GnRH/ anul 2000, la 21 cazuri s-a efectuat FIV/ET si

la 13 cazuri - ICSI. (Fig. 2.2.3) Majoritatea ciclurilor au fost de fertilizare conventionala. 3

cicluri din 37 totale au fost abandonate si nu s-a mai practicat punctie foliculara.

• FIV 21 cazuri (56,75%);

• ICSI: 13 cazuri (35,13%);

• Cazuri nepunctionate: 3 (8,1%).

FIV/ ET ICSI Cazuri nepunctionate

Fig. 2.2.3 - Proportia FIV/ET si ICSI la cele 34 cicluri antagonisti GnRH/ anul 2000 cu punctie

efectuata (din totalul de 37 cicluri stimulate)

2113

3

Page 164: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

150

b. Rezultate

La punctia foliculara s-au obtinut in medie 8,24 ovocite comparabil cu datele din

literatura), cu valoarea minima de 0 si maxima de 24 ovocite, mediana: 7 ovocite, deviatia

standard: 5,741 (Tabel 2.2.4).

Tabel 2.2.4 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu

antagonisti-GnRH/ anul 2000

Numar mediu

ovocite

Mediana Numar maxim

recoltat

Numar minim

recoltat

Deviatia

standard

8,24 7 24 0 5,741

Fecundarea (celulele cu 2 PN) a fost controlata la 16-20 ore de la inseminarea sau

microinjectarea ovocitelor si s-a constatat o medie de 4,05 celule cu 2 PN, cu extremele intre 0 si

13 celule cu 2 PN, mediana: 3 celule cu 2 PN, deviatia standard: 3,390 (Tabel 2.2.5).

Tabel 2.2.5 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ anul 2000)

Numar mediu

celule cu 2PN

Mediana Numar maxim

celule cu 2PN

Numar minim

celule cu 2PN

Deviatia

standard

4,05 3 13 0 3,390

Celulele crioconservate (in stadiul de 2 PN) au fost in medie 2,05, cu limitele intre 1 si 10

celule.

Crioconservarea s-a efectuat in total la 17 cazuri, dintre care la 6 s-au obtinut celulele cu 2 PN

din cicluri ICSI si la 11 cazuri celulele crioconservate au provenit din cicluri FIV/ET. (Fig.

2.2.4).

Page 165: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

151

Crio-FIV/ET

Crio-ICSI

Fig. 2.2.4 - Raportul celulelor cu 2 PN crioconservate ca provenienta din cicluri FIV/ET si ICSI

Media embrionilor transferati a fost de 2, cu limitele intre 0 (unde nu s-a obtinut

fertilizare) si 3, mediana: 2 embrioni, deviatia standard: 1. Nu s-a transferat un numar mai mare

de 3 embrioni (nici chiar la varsta extrema din grupul studiat).

In urma tehnicilor de reproducere umana asistata la grupul de 37 paciente care au efectuat

protocol de stimulare ovariana ce cuprindea in schema lor antagonist-GnRH s-a obtinut un

numar de 3 sarcini:

• 1 sarcina a fost biochimica (cresterea β-HCG si scaderea lui pe parcurs, fara a se

vizualiza sac gestational ecografic);

• 2 sarcini au fost terminate prin nasteri. Amandoua sarcinile au fost multiple: una

tripla, terminata prin operatie cezariana la 33 S.G; cei 3 nou nascuti au prezentat

stenoza intestinala, parintii au fost depistati cu deficit de 21-OH hidroxilaza si

mama a dezvoltat diabet gestational. A 2-a sarcina multipla a fost gemelara,

terminata prin operatie cezariana la 37 SG (Tabel 2.2.6).

Toate cele 3 sarcini au provenit din embrioni de la cicluri FIV, in care s-a folosit pentru

stimularea ovariana rFSH si protocol Lübeck cu antagonisti-GnRH.

6

11

Page 166: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

152

Tabel 2.2.6 – Evolutia sarcinilor obtinute in urma tehnicilor de reproducere asistata – protocol

anatagonist-GnRH/ an 2000

Sarcina Sarcina

biochimica

Avort

spontan

Sarcina

ectopica

Nastere

monofetala

Nastere

gemelara

Nastere

tripla

Nr. cazuri 1 0 0 0 1 1

Procent 33,33% 0 0 0 33,33% 33,33%

c. Observatii

Esecurile in aceste 37 de cazuri au fost reprezentate de:

• 1 crestere monofoliculara;

• 2 valori scazute ale E2 seric pe parcursul stimularii;

• 2 cazuri cu absenta fecundarii.

Varsta pacientelor la care s-au inregistrat aceste esecuri a fost de:

26 ani: E2 seric scazut;

29 ani: E2 seric scazut;

32 ani: crestere monofoliculara;

34 ani: absenta fecundarii;

36 ani: absenta fecundarii.

Se poate remarca ca in acest grup de paciente varsta acestora nu poate constitui un factor

implicat in raspunsul slab („low responder”) la stimularea ovariana controlata.

Din totalul celor 37 cicluri nu s-a efectuat punctie foliculara in 3 cazuri, cu abandonarea

ciclurilor, si anume (Tabel 2.2.7):

• 1 caz a prezentat o crestere monofoliculara (1 folicol > 18 mm), la o pacienta de 32 ani,

cu E2 seric: 442 pg/ml, cu nivel seric al LH-ului: 19,6 mUI/ml, protocol francez (doza

unica) si un total de 1500 UI rFSH pe parcursul a 8 zile de stimulare;

• Al 2-lea caz - cu concentratia serica a E2 de 204 pg/ml, (1 folicol =15 mm), concentratia

LH endogen= 4,2 mUI/ml, la care s-a efectuat protocolul Lübeck, cu un total de 6225 UI

Page 167: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

153

rFSH pe o durata de 31 de zile de stimulare. Varsta pacientei a fost de 29 ani. De

remarcat durata enorma de stimulare, cu o cantitate foarte mare de FSH administrat si

cresterea foliculara si hormonala insuficienta. Pacienta a avut un raspuns foarte prost la

acest tip de protocol, care nu a fost determinat de factorul varsta.

• Al 3-lea caz: nivelul seric al E2 redus, de 101 pg/ml, (ecografic: 10 folicoli intre 13 - 15

mm), concentratia LH endogen= 3,1 mUI/ml. Protocolul cu antagonist Gn-RH a fost cel

german-Lübeck si stimularea ovariana s-a efectuat cu rFSH 900 UI in total, pe o durata

de 10 zile. Varsta pacientei a fost de 26 de ani. Nici in acest caz varsta pacientei nu a

reprezentat un motiv pentru „low responder”.

Tabel 2.2.7 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ an 2000 Caz Cauza

Varsta

(ani)

Tip

FSH

Durata

stimularii

Nr.

total

UI

Tip

protocol

E2

(pg/ml)

LH

(UI/l)

Nr.

folicoli

- 13-15

- 16-18

- > 18

1 Low

response

si ↑ LH

32 rec 8 zile 1500 francez 442 19,6 !! 0/ 0/1

2 Low

response

29 rec 31 zile !! 6225 Lubeck 204 4,2 1/ 0/ 0

3 Low

response

26 rec 10 zile 900 Lubeck 101 3,1 10/ 0/ 0

Celelalte 2 cazuri de esec au fost reprezentate de absenta fecundarii:

• 1 caz – pacienta de 34 de ani, la care s-a practicat protocolul Lübeck, cu 2700 UI

rFSH, timp de 9 zile, nivelul E2 seric: 912 pg/ml si al LH-ului: 2,1 mUI/ml. S-au

obtinut prin punctie foliculara 2 ovocite si s-au inseminat conventional (FIV).

• Al 2-lea caz: pacienta de 36 de ani, protocol Lübeck; 1500 UI rFSH pe o durata de 9

zile, E2 seric: 2022 pg/ml si LH: 3 mUI/ml. La punctia foliculara s-au obtinut 8

ovocite care au fost inseminate conventional (FIV).

Page 168: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

154

Tabel 2.2.8 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – antagonisti-GnRH/

an 2000 Caz Cauza

Varsta

(ani)

Tip

FSH

Durata

stimularii

Nr.

total

UI

Tip

protocol

E2

(pg/ml)

LH

(UI/l)

Rezultat

punctie

1 Low

response

34 rec 9 zile 2700 Lubeck 912 2,1 FIV, 2

ovocite,

Ø

fecund.

2 Low

response

36 rec 9 zile 1500 Lubeck 2022 3 FIV, 8

ovocite,

Ø

fecund.

Ca si o observatie la cele 2 cazuri de absenta a fecundarii se remarca similitudini : ale

varstei pacientei, a tipurilor de protocoale stimulate si a tipurilor de gonadotropina utilizata, cat

si durata stimularii ovariene. In al 2 –lea caz nivelul E2 seric a fost mult crescut fata de primul,

cu un numar evident mai mare de folicoli punctionati, fapt ce reiese si intr-un numar mai mare de

ovocite obtinute. Amandoua cazurile au fost FIV clasica. Varsta pacientelor (in jur de 35 ani) nu

a constituit un motiv de abandon a ciclului de stimulare, in aceste cazuri s-au obtinut folicoli si s-

au aspirat ovocite.

Din punct de vedere al tipurilor de protocoale folosite se observa ca in cazul celui francez

s-a obtinut o crestere monofoliculara cu abandonarea stimularii ovariene si o crestere a LH-ului

endogen. Doza de antagonist-GnRH (3 mg) a fost administrata in ziua a 7-a a ciclului menstrual.

Protocolul Lübeck s-a utilizat in celelalte 4 situatii de esec: 2 cazuri cu absenta fecundarii si 2

cazuri de nivel scazut al estradiolului seric.

Complicatiile inregistrate in cele 37 cazuri de stimulare ovariana folosind un protocol cu

antagonisti-GnRH au fost reduse, limitandu-se la 1 caz (2,7%) de hiperstimulare ovariana stadiul

II/III, la o pacienta de 33 de ani. S-a folosit in acest caz protocolul francez, s-a stimulat cu un

total de 1800 UI rFSH timp de 8 zile, estradiol seric: 1191 pg/ml. S-au punctionat 1 folicol 13-15

mm, 10 folicoli 16-18 mm si 3 folicoli > 18 mm. Ovocitele (11 obtinute) au fost supuse tehnicii

Page 169: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

155

de microinjectie ICSI si in urma fecundarii s-au obtinut 5 celule cu 2 PN, dintre acestea 3 s-au

crioconservat si 2 s-au incubat pana a 2-a zi pentru embriotransfer. In acest caz nu s-a obtinut

sarcina.

De remarcat in acest caz numarul mare de folicoli cu dimensiunea de 16-18 mm, fara insa

a avea un nivel crescut de estradiol seric in momentul declansarii ovulatiei. Fenomenul de

hiperstimulare s-a dezvoltat pe parcurs.

d. Concluzii

Din cele 37 de cicluri stimulate initial, la 3 cicluri nu s-a efectuat punctie foliculara (s-au

efectuat doar 34 punctii). In 2 cazuri nu s-a obtinut fecundare (s-au efectuat doar 32

embriotransferuri) (Tabel 2.2.9).

Tabel 2.2.9 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu antagonisti-GnRH/ an 2000

Total punctii efectuate Total cazuri cu

fecundare realizata

Total ET efectuate Total

cicluri

stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent

37 34 91,89% 32 86,48% 32 86,48%

Rata sarcinilor/ciclu: 8,1%

Rata sarcinilor/punctie: 8,82%

Rata sarcinilor/embriotransfer: 9,37%

Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 15,62%

Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 5,4%

e. Discutii

1. Majoritatea pacientelor care efectueaza cicluri de stimulare in cadrul tehnicilor de

reproducere asistata se incadreaza in grupele de varsta 30-34 si 35-39 de ani, cu mici

diferente de la un an la altul si comparabile intre loturile de paciente care urmeaza

protocoale cu agonisti-GnRH fata de cele cu antagonisti-GnRH.

Page 170: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

156

2. Durata medie a stimularii cu gonadotropina a fost de 9,83 zile pentru lotul cu antagonist-

GnRH / an 2000 fata de lotul cu agonist-GnRH/ an 2000, la care a fost ceva mai lunga, de

11,24 zile.

3. Media uitatilor de gonadotropina folosite pe parcursul stimularii ovariene la lotul cu

protocol cu antagonist-GnRH a fost de 1939,32 UI fata de lotul cu agonist-GnRH la care

a fost mai ridicata, de 2577,42 UI.

4. Procedeele de reproducere asistata utilizate au fost in amandoua loturile in procent mai

crescut FIV conventionale. De remarcat ca procentul cazurilor nepunctionate, a ciclurilor

abandonate, a fost mai mare in grupul cu antagonisti-GnRH fata de cel cu agonisti-GnRH

( 8,1% fata de 0,99%).

5. Numarul mediu al ovocitelor recoltate prin aspirare foliculara (8,24 versus 8,29) si al

celulelor fecundate (4,05 versus 3,56) este fara diferente semnificative la grupul

antagonist- fata de agonist-GnRH.

6. Incidenta sindromuluii de hiperstimulare ovariana este ceva mai redusa (2,7%) in lotul cu

antagonist-GnRH fata de agonist-GnRH (3,3%).

7. Rata sarcinilor obtinute in urma aplicarii portocolului cu antagonist-GnRH se situeaza la

valori mai mici fata de protocolul cu agonist-GnRH.

• Rata sarcinilor/ciclu: 8,1% versus 21,12 %

• Rata sarcinilor/punctie: 8,82% versus 21,33%

• Rata sarcinilor/ET: 9,37% versus 27%

• Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 15,62% versus 27%

• Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 5,4% versus 11,22%

Page 171: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

157

Capitolul 2.3

Statistica protocoalelor cu antagonisti-GnRH - anul 2001

a. Material si metoda

In anul 2001 un numar de 71 paciente au efectuat cicluri de stimulare ovariana care

cuprind in schema antagonisti-GnRH.

Varsta medie a pacientelor a fost de 33,66 ani, cu valoarea minima de 27 ani si cea

maxima de 42 ani; mediana: 34 ani; deviatia standard: 4,159. Din totalul de 71 de paciente

grupul majoritar a fost reprezentat de femeile cu varsta intre 30 - 39 ani (Tabel 2.3.1).

Tabel 2.3.1 - Repartitia pacientelor pe grupe de varsta (antagonisti-GnRH/anul 2001)

Varsta (ani) Numar paciente Procent

< 30 15 1,4 %

30-34 27 38,02 %

35-39 23 32,39 %

≥ 40 6 8,45 %

Pentru stimularea ovariana s-a apelat la mai multe tipuri de gonadotropine: rFSH in 64

cazuri; HMG in 6 cazuri; rFSH+HMG - 1 caz, asa cum este ilustrat in urmatorul tabel si in figura

de mai jos (Tabel 2.3.2), (Fig. 2.3.1). Se remarca, ca si in toate grupurile de paciente analizate

pana acum, ca rFSH a fost administrat cel mai frecvent.

Tabel 2.3.2 - Tipurile de gonadotropine utilizate in stimularea ovariana (antagonisti-GnRH/anul

2001)

Tipuri gonadotropine Numar paciente Procent

rFSH 64 90,14 %

HMG 6 8,45 %

rFSH+HMG 1 1,4 %

Page 172: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

158

FSH rec

HMG

FSH rec+HMG

Fig. 2.3.1 Repartitia frecventei tipurilor de gonadotropine utilizate in stimularea ovariana

(antagonisti-GnRH/anul 2001)

Durata stimularii ovariene a fost in medie de 10,23 zile, durata minima fiind de 7 zile si

cea maxima de 17 zile; mediana: 10 zile, deviatia standard: 2,174.

Pentru stimulare s-au administrat o medie de 1975,35 UI gonadotropina, doza minima a

fost de 450 UI si doza maxima - de 7425UI; mediana: 1800 UI, deviatia standard: 963,118.

Dintre cele 2 tipuri de protocoale cu antagonisti-GnRH, cel german – Lübeck (doze

multiple) a fost aplicat in toate cele 71 de cazuri si cel francez (doza unica) in nici un caz.

Prin stimularea ovariana s-a atins o medie a E2 seric (determinat in ziua inducerii

ovulatiei) de 1834,30 pg/ml, cea mai mica valoare a estradiolului masurata a fost de 142 pg/ml

iar cea maxima de 8704 pg/ml; mediana: 1610 pg/ml, deviatia standard: 1247,689. In tabelul

2.3.3 sunt redate defalcat valoarile E2 seric.

64

6 1

Page 173: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

159

Tabel 2.3.3 - Valorile defalcate ale estradiolului seric (pg/ml) (antagonisti-GnRH/anul 2001)

Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent

< 1000 pg/ml 17 cazuri 23,94%

1000-1499 pg/ml 13 cazuri 18,30%

1500-1999 pg/ml 15 cazuri 21,12%

>2000 pg/ml 26 cazuri 36,61%

Determinarea concentratiei serice a LH-ului a relevat o medie de 2,12 mUI/ml, cu o

valoare minima obtinuta de 0,1 mUI/ml si una maxima de 18,7 mUI/ml; mediana 1,3 mUI/ml,

deviatia standard: 2,987.

Masuratoarea ecografica a folicolilor a demonstrat urmatoarele (Tabel 2.3.4):

• Folicoli 13-15 mm - (media): 3,09 (valori extreme: 0-10)

• Folicoli 16-18 mm - (media): 2,84 (valori extreme: 0-12)

• Folicoli > 18 mm - (media): 4,05 (valori extreme: 1-11)

Tabel 2.3.4 - Parametri statistici ai folicolilor (antagonisti-GnRH/anul 2001)

Dimensiune

folicoli

Media Mediana Numarul

minim

Numarul

maxim

Deviatia

standard

13-15 mm 3,09 2 0 10 2,778

16-18 mm 2,84 2 0 12 2,364

> 18 mm 4,05 4 1 11 2,260

In anul 2001, pentru cele 71 paciente care au urmat protocoale cu antagonisti-GnRH, s-au

efectuat un total de 26 FIV conventionale si un numar de 43 ICSI (din care in 2 cazuri s-au

folosit spermii din biopsii testiculare decongelate (crioTESE) (Fig. 2.3.2). In 2 situatii, la care era

planificata FIV, nu s-a mai practicat punctie foliculara, cu abandonarea stimularii ovariene pe

motivul raspunsului insuficient la terapie.

FIV: 26 cazuri (36,61%);

Page 174: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

160

ICSI: 43 cazuri (60,56%);

Cazuri nepunctionate: 2 (2,81%)

FIV ICSI Cazuri nepunctionate

Fig. 2.3.2 - Repartitia tehnicilor de reproducere asistata din cadrul protocoalelor cu antagonisti-

GnRH/2001

b. Rezultate

In urma punctiei foliculare s-au recoltat ovocite, cu o valoare medie de 9,028 ovocite,

mediana: 7 ovocite, numarul minim aspirat a fost de 0 ovocite si numarul maxim de 31 ovocite;

deviatia standard: 6,940 (Tabel 2.3.5).

Tabel 2.3.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu

antagonisti-GnRH/ anul 2001

Numar mediu

ovocite

Mediana Numar maxim

recoltat

Numar minim

recoltat

Deviatia

standard

9,02 7 31 0 6,940

26

43

2

Page 175: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

161

La controlul fecundarii s-a obtinut o medie de 4,07 celule cu 2 PN, mediana: 3 celule cu 2

PN; deviatia standard: 3,473. Au fost situatii unde nu s-a realizat fecundarea; numarul maxim al

ovocitelor fecundate a fost de 14 (Tabel 2.3.6).

Tabel 2.3.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ anul 2001)

Numar mediu

celule cu 2PN

Mediana Numar maxim

celule cu 2PN

Numar minim

celule cu 2PN

Deviatia

standard

4,07 3 14 0 3,473

In 5 cazuri nu s-a realizat fecundarea ovocitelor, dintre acestea - 4 au provenit din punctie

foliculara efectuata in cadrul FIV si 1 caz a fost prin aspirat folicular pentru ICSI. La 2 paciente

nu s-au recoltat ovocite, fiind vorba de 2 cazuri de FIV clasica.

In 35 cazuri s-a efectuat crioconservarea celulelor cu 2 PN, din acest total, 23 (65,71%)

au reprezentat crioconservari ale celulelor fecundate provenite din ICSI si in 12 cazuri (34,28%)

- celule provenite din FIV clasica (mediana: 1, deviatia standard: 0,503) (Fig. 2.3.3).

Crio-FIV

Crio-ICSI

23

12

Page 176: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

162

Fig. 2.3.3 - Crioconservarea celulelor cu 2 PN ca provenienta din diferitele tehnici de

reproducere asistata (antagonisti-GnRH/ 2001)

Numarul maxim posibil de celule cu 2 PN care s-au crioconservat a fost de 12, numarul

minim fiind de 2, media celulelor crioconservate: 2,29; mediana: 0, deviatia standard: 3,173

(Tabel 2.3.7).

Tabel 2.3.7 Parametri statistici ai celulelor crioconservate (antagonisti-GnRH/ 2001)

Media Mediana Numar

minim

Numar

maxim

Deviatia

standard

Nr celule cu 2

PN

crioconservate 2,29 0 0 12 3,172

Numarul embrionilor care s-au transferat a variat intre 0 si maxim 3 embrioni, mediana:

2, deviatia standard: 0,883.

In urma acestor proceduri s-a obtinut un numar total de 10 sarcini (14,08%), dintre care:

• 1 sarcina biochimica

• 2 avorturi spontane (la 7 si 14 saptamani de gestatie)

• 7 nasteri. Din aceste sarcini 2 au fost gemelare din start. La 1 caz unul dintre feti s-a oprit

in evolutie la 15 saptamani de gestatie, celalalt fat a evoluat pana la 36 saptamani de

gestatie, dupa care a fost extras prin operatie cezariana (greutate: 2295 g, IA-8/9), deci

pana la final a evoluat ca o sarcina monofetala.

• Nu s-au intalnit sarcini extrauterine si nici sarcini triple (Tabel 2.3.8).

Tabel 2.3.8 - Evolutia sarcinilor in urma protocoalelor cu antagonisti-GnRH / 2001

Sarcina Sarcina

biochimica

Avorturi

spontane

Sarcini

extrauterine

Nasteri

monofetale

Nasteri

gemelare

Nasteri

cu

tripleti

Nr.

cazuri

1 2 0 6 1 0

Procent 10% 20% 0 60% 10% 0

Page 177: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

163

c. Observatii

Esecuri de tipul ciclurilor abandonate s-au intalnit in 2 situatii de “low responder”, in care

nu s-a mai practicat punctia foliculara.

• La un caz s-a masurat nivel scazut de E2 seric. Este vorba de o pacienta in varsta de 29 de

ani, cu stimulare ovariana cu rFSH in cadrul unui protocol Lübeck in vederea efectuarii

punctiei foliculare pentru FIV. S-au folosit un total de 2175 UI FSH pe o durata de

stimulare de 11 zile. S-au dezvoltat doar 3 folicoli de dimensiune > 18 mm, cu estradiol

de 142 pg/ml, valoarea LH: 0,1 mUI/ml.

• Cel de-al doilea caz s-a inregistrat la o pacienta de 32 de ani, de asemenea cu terapie de

stimulare ovariana cu rFSH in cadrul protocolului Lübeck, in vederea FIV. Durata

stimularii a fost de 8 zile, s-au administrat un total de 3600 UI, estradiolul determinat

anterior punctiei a fost de 161 pg/ml si valoarea LH: 1,7 mUI/ml. Ecografic s-au

dezvoltat 1 folicol de 13-15 mm, 1 folicol de 16-18 mm si 1 folicol > 18 mm. Si in acest

caz s-a renuntat la efectuarea punctiei.

In cele 2 cazuri pacientele au prezentat statusul de “low responder”, cu dezvoltare foliculara

inadecvata si o crestere insuficienta de E2. Au fost intrunite criteriile de intrerupere a stimularii

ovariene si nu s-a mai practicat punctie foliculara. In cel de-al 2-lea caz se remarca o cantitate

mai crescuta de gonadotropina administrata pacientei, cu raspuns foarte slab in urma acestei

stimulari.

Tabel 2.3.9 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ an 2001 Caz Cauza

Varsta

(ani)

Tip

FSH

Durata

stimularii

Nr.

total

UI

Tip

protocol

E2

(pg/ml)

LH

(UI/l)

Nr.

folicoli

- 13-15

- 16-18

- > 18

1 Low

response

29 rec 11 zile 2175 Lubeck 142 0,1 0/ 0/ 3

2 Low

response

32 rec 8 zile 3600 Lubeck 161 1,7 1/ 1/ 1

Page 178: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

164

Esecul fecundarii – efectuarea aspiratului folicular cu recoltarea ovocitelor dar absenta

fecundarii acestora (absenta celulelor cu 2 PN) s-a inregistrat la 5 paciente. Sunt exemplificate in

cele ce urmeaza detaliat aceste situatii (Tabel 2.3.10).

Tabel 2.3 10 - Absenta fecundarii in grupul de paciente cu protocol cu antagonisti-GnRH/an

2001 Caz Varsta

(ani)

Tip

gonado

tropina

Proto-

col

Zile

de

Stim.

Total

UI

E2

pg/ml

LH

UI/l

Fol.

13-

15

mm

Fol.

16-

18

mm

Fol.

>

18

mm

IVF ICSI Nr.

ovoc.

1 35 rFSH+

HMG

Lubeck 13 7425 1536 2 3 3 3 DA - 2

2 27 rFSH Lubeck 9 2025 1143 1,2 2 1 4 DA - 6

3 27 rFSH Lubeck 12 1125 8704 14,8 10 12 2 DA - 23

4 34 rFSH Lubeck 9 2025 1620 1,1 2 5 1 - DA 8

5 39 rFSH Lubeck 10 2850 810 0,6 1 2 4 DA - 4

Ca si remarca generala asupra acestor paciente se observa varsta lor cu o variatie larga,

intre 27 si 39 ani.

Remarci particulare asupra acestor cazuri:

La pacienta cu varsta de 35 ani (cazul 1) s-au asociat gonadotropine pentru stimulare

ovariana (rFSH si HMG), fiind vorba si de durata cea mai lunga a stimularii – 13 zile. Tot

in acest caz s-a inregistrat si un numar foarte mare de unitati de gonadotropina folosite

(7425 UI), cu o dezvoltare relativ modesta a folicolilor si o crestere moderata a

estradiolului seric. Numarul de ovocite recoltate a fost redus: 2. Avand in vedere acest

esec al fecundarii, la pacienta in cauza s-a repetat cu ocazia altei incercari stimularea, dar

cu rFSH (numar mult mai scazut de unitati administrate fata de prima tentativa: 3600

versus 7425UI), cu o crestere mai accentuata a folicolilor > 18 mm (4 ca numar) si s-a

efectuat de aceasta data ICSI. Din cele 3 ovocite recoltate s-a fecundat doar 1 (toate cele

3 ovocite au fost mature, metafaza II). Raspunsul a fost de asemenea slab referitor la

dezvoltarea foliculara, dar s-a probat totusi fecundarea, fara obtinerea unei sarcini.

Cazul 2 - pacienta de 27 ani – a mai prezentat o stimulare anterioara, similara ca tip de

gonadotropina si antagonist-GnRH, dar cu durata mai lunga de stimulare (14 zile fata de

Page 179: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

165

9 zile). In incercarea anterioara s-a realizat o dezvoltare foliculara asemanatoare si s-a

obtinut un numar de 2 ovocite cu fecundarea doar a uneia. Raspunsul la stimulare a fost si

in acea prima incercare foarte modest.

La pacienta de 27 ani (cazul 3), la care s-a inregistrat nivelul seric cel mai crescut al E2:

8704 pg/ml, s-a determinat si o concentratie mare a LH-ului: 14,8 mUI/ml. Dezvoltarea

foliculara a fost exagerata referitor la numarul folicolilor moderati (10 folicoli de 13-15

mm), folicolii de 16-18 mm au fost in numar de 12 si s-au descris doar 2 folicoli > 18

mm. Numarul de ovocite recoltate a fost foarte mare (23 ovocite). Ca si o observatie

aparte: nu s-a semnalat sindrom de hiperstimulare ovariana la aceasta pacienta, desi erau

indeplinite conditiile hormonale. Ca si o posibila explicatie a esecului fecundarii trebuie

luata in considerare cresterea prematura aLH-ului, care a produs o luteinizare a

folicolilor, cu alterarea calitatii ovocitare. De mentionat pentru aceasta pacienta s-a

efectuat ulterior, o alta stimulare (tot protocol Lübeck cu antagonisti-GnRH), dar cu

microinjectarea ovocitelor (ICSI) si s-a realizat fecundarea, dar fara a se obtine in

respectiva procedura si sarcina.

Cazul 4 (pacienta de 34 ani) a mai efectuat o procedura ICSI anterioara (tot protocol cu

antagonisti-GnRH), in urma caruia s-au microinjectat 3 ovocite mature si s-a obtinut

fecundarea pentru 2 celule, fara a se obtine sarcina.

La cazul 5, pacienta de 39 ani, s-a demonstrat prezenta fecundarii la o fertilizare

conventionala anterioara, in conditii de stimulare asemanatoare referitor la durata (12

versus 10 zile) si cantitatea de rFSH administrat (2550 versus 2850 UI), tot protocol cu

antagonisti-GnRH. Dezvoltarea foliculara si cresterea estradiolului seric a fost relativ

aceeasi (1038 versus 810 pg/ml). S-au recoltat 6 ovocite, dintre care 2 s-au fecundat, nu

s-a obtinut sarcina.

O alta observatie se refera la cazul unei paciente din grupul de 71 stimulari, la care s-a

inregistrat cel mai crescut nivel de LH seric (18,4 mUI/ml). La aceasta pacienta s-a efectuat

stimulare ovariana cu rFSH (total: 450 UI) in vederea unei inseminarii intrauterine. Tinand cont

de raspunsul pacientei la terapie (estradiol seric maxim: 1172 pg/ml, 1 folicol: 16-18 mm, 3

folicoli > 18 mm) si cu acordul acesteia s-a administrat antagonist-GnRH (protocol Lübeck: 2

doze de 0,25 mg/zi, incepand cu ziua 11 de ciclu menstrual) si s-a virat la FIV clasica. S-au

Page 180: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

166

recoltat 4 ovocite, care s-au fecundat toate. Nu s-a efectuat embriotransfer in urma punctiei, ci

cele 4 celulele cu 2PN s-au crioconservat in acel stadiu.

Ca si complicatii se citeaza 3 cazuri de sindrom de hiperstimulare ovariana: 2 cazuri de grad

II si un caz de grad III. Doar la cel de grad III s-a inregistrat si sarcina, care a evoluat pana la

termen (Tabel 2.3.11).

• 1 caz cu severitate de grad II s-a inregistrat la o pacienta de 35 ani, care s-a stimulat

ovarian cu rFSH, durata de 13 zile, numar total de 2100 UI FSH, in cadrul protocolului

Lübeck, valoarea maxima a E2 seric in urma stimularii: 1429 pg/ml, valoarea LH: 0,3

mUI/ml, Ecografic se descriu 1 folicol de 13-15 mm, 4 folicoli de 16-18 mm si 4 folicoli

> 18 mm. In urma punctiei foliculare s-au obtinut 4 ovocite, care au fost microinjectate

conform procedeului ICSI. Controlul fecundarii a aratat doar o celula cu 2 PN. ET s-a

realizat cu 1 embrion. Nu s-a obtinut sarcina.

• Cel de-al 2-lea caz: pacienta de 29 ani, stimulare ovariana cu rFSH timp de 8 zile,

valoarea totala a gonadotropinei: 1050UI, protocol Lübeck , valoarea maxima a

estradiolului seric: 2993 pg/ml si LH: 2 mUI/ml. Masurarea ecografica anterior

declansarii ovulatiei a relevat 10 folicoli cu dimensiuni de 13-15 mm, 4 folicoli de 16-18

mm si 2 folicoli > 18 mm. Aspiratul folicular a obtinut 17 ovocite (12 in metafaza II si 5

cu vezicula germinala), dintre care prin tehnica ICSI s-au fecundat doar 8. ET s-a efectuat

cu 2 embrioni si 6 celule in stadiul de 2 PN au fost crioconservate. S-a obtinut o sarcina

monofetala, care a evoluat pana la termen. Sindromul de hiperstimulare ovariana a fost ca

si gravitate corespunzatoare gradului III.

• Al 3-lea caz: sindrom de hiperstimulare ovariana grad II la o pacienta de 32 ani, cu

stimulare ovariana in cadrul protocolului Lübeck efectuata cu rFSH, timp de 11 zile, doza

totala de 1525 UI. S-au masurat ecografic 8 folicoli de 13-15 mm, 8 folicoli de 16-18 mm

si 7 folicoli > 18 mm. Aici s-a procedat la efectul de “coasting”, si anume s-a oprit

stimularea cu rFSH si s-a continuat administrarea antagonistului-GnRH (inceput in ziua a

8-a de stimulare si 8 doze administrate in total) pana la scaderea E2 seric si de abia in

acest moment s-a administrat HCG pentru inducerea ovulatiei. E2 seric masurat anterior

inducerii ovulatiei a fost de 2872 pg/ml si valoarea LH: 0,8 mUI/ml. Punctia foliculara

pentru IVF conventionala a extras 31 ovocite, dintre care doar 9 s-au fecundat. Toate cele

Page 181: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

167

9 celule in stadiul de 2 PN s-au crioconservat. La aceasta pacienta nu s-a efectuat ET in

urma punctiei, s-a considerat prea riscant si s-a amanat ET pentru un ciclu spontan.

Tabel 2.3.11 - Sindrom de hiperstimulare ovariana - antagonisti-GnRH/ an 2001 Caz Grad

hiperstim.

E2

(pg/ml)

Nr.

folicoli - 13-15

/ 16-18

/ > 18

Punctie

folic.

ET Criocons. Sarcina Avort/

Nastere

1 II 1429 1/4/4 da da - nu -

2 III 2993 10/4/2 da da - da nastere

monofet.

3 II 2872 8/8/7 da nu da (tot) - -

d. Concluzii

Din totalul de 10 sarcini obtinute - 5 (50%) au fost in urma procedeului clasic de FIV/ET

si celelalte 5 sarcini s-au inregistrat in urma procedeului de microinjectie ICSI.

La toate pacientele s-a utilizat protocolul Lübeck. Gonadotropina folosita a fost rFSH in 9

cazuri din cele 10 (procent majoritar de 90%) si intr-un caz s-a administrat HMG.

Evolutia sarcinilor dupa FIV/ET:

• 1 sarcina biochimica

• 1 avort spontan

• 1 nastere (sarcina gemelara cu 1 fat oprit in evolutie si 1 fat nascut)

• 1 nastere (sarcina gemelara)

• 1 nastere (sarcina monofetala).

Evolutia sarcinilor dupa ICSI:

• 1 avort spontan

• 4 nasteri (sarcini monofetale).

Page 182: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

168

La cele 71 de cazuri s-au intrerupt ciclurile de stimulare in 2 situatii de „low responder”

si nu s-a efectuat punctie foliculara (punctie doar in 69 cazuri).

La 5 paciente s-a inregistrat esec al fecundarii.

La 1 caz de sindrom de hiperstimulare ovariana s-a preferat crioconservarea celulele cu 2

PN.

La o pacienta, pe motivul unei stimularii mai marcate in vederea unei inseminari

intrauterine, s-a virat la FIV si ovocitele recoltate si ulterior fecundate s-au crioconservat in

stadiul de 2 PN, urmand de asemenea un embriotransfer intr-un ciclu spontan.

In concluzie, din cele 71 cicluri stimulate initial in 9 cazuri nu s-a efectuat embriotransfer

(Tabel 2.3.12).

Tabel 2.3.12 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu antagonisti-GnRH/ an 2001

Total punctii efectuate Total cazuri cu

fecundare realizata

Total ET efectuate Total

cicluri

stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent

71 69 97,18% 64 90,14% 62 87,32%

Rata sarcinilor/ciclu: 14,08%

Rata sarcinilor/punctie: 14,49%

Rata sarcinilor/embriotransfer: 16,12%

Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 17,74%

Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 9,85%.

e. Discutii

1. Grupul de paciente cu varsta intre 30-34 ani a fost cel mai bine reprezentat in cadrul

lotului de 71 paciente care au inceput cicluri de stimulare cu protocol cu antagonisti-

GnRH si ca procent imediat urmator au fost pacientele ce s-au situat intre 35-39 de ani.

2. Gonadotropina rFSH a fost administrata in procent majoritar ca terapie de stimulare

ovariana.

Page 183: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

169

3. S-a utilizat in exclusivitate protocolul Lübeck.

4. In cadrul acestui lot de paciente s-a folosit mai des tehnica microinjectiei ovocitelor –

ICSI fata de FIV conventionala, posibil si prin dezvoltarea in timp a acestei metode si a

indemanarii si experientei echipei de embriologi.

5. Rata sarcinilor raportata la numarul de cicluri; la numarul de punctii si la numarul de

embriotransferuri efectuate, respectiv baby take home rate se ridica la procente mai mari

fata de loturile de paciente cu protocol cu antagonist-GnRH din anii 1999 si 2000, si

comparabile cu datele din literatura.

Page 184: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

170

Capitolul 2.4

Statistica pe 3 ani (1999-2000-2001) – protocoale cu antagonisti-GnRH

a. Material si metoda

In cei 3 ani studiati (1999; 2000; 2001) un total de 149 paciente au urmat protocoale de

stimulare ovariana ce cuprindeau in schema lor antagonisti-GnRH (Tabel 2.4.1); (Fig. 2.4.1).

Tabel 2.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - antagonisti-GnRH/ 3 ani

Varsta pacientelor (ani) Numar paciente Procent

< 30 21 14,09%

30-34 48 32,21%

35-39 62 41,61%

≥ 40 18 12,08%

< 30 ani

30-34 ani

35-39 ani

> 40 ani

Fig. 2.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - antagonisti-GnRH/ 3 ani

62

48

21 18

Page 185: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

171

Varsta minima a acestui grup de paciente a fost de 24 ani si varsta maxima de 43 ani.

Media varstei totalului de paciente este de 34,48 de ani si mediana de 35 de ani, deviatia

standard: 4,246.

Se remarca ca daca in datele examinate pe cei 3 ani separat majoritatea pacientelor se

situau in grupele de varsta 30-34 sau 35-39 ani, datele insumate arata ca procentul majoritar al

pacientelor ce au urmat tratament in cadrul tehnicilor de reproducere asistata au avut varsta 35-

39 ani, cu un procent foarte apropiat al pacientelor tinere < 30 ani de al celor ≥ 40.

In general se adreseaza consultului si terapiei in vederea reproducerii asistate femei care

au deja un istoric obstetrical sau ginecologic, cu esec in conceptie, care au epuizat alte variante

de tratament pana in acel moment si care prin natura situatiei ajung la o varsta > 35 ani. Cu toate

acestea, tendinta generala a femeilor (observata pe plan mondial) este de-a concepe natural dupa

varsta de 30, chiar si 35 de ani.

In cazul acestor paciente ce au urmat protocoale cu antagonisti-GnRH s-au folosit mai

multe tipuri de gonadotropine pentru stimularea ovariana controlata, conform tabelului 2.4.2 si

figurii 2.4.2.

Tabel 2.4.2 Repartitia tipurilor de gonadotropine din stimularea ovariana - antagonisti-GnRH/ 3

ani

Tipuri gonadotropine Numar paciente Procent

rFSH 129 86,57%

HMG 12 8,05%

rFSH+HMG 7 4,69%

FSH-HP 1 0,67%

Din tabel se remarca de departe procentul mare pe care l-a castigat rFSH in competitia

pentru stimularea ovariana fata de celelalte preparate existente. Avantajele si rezultatele

medicatiei au fost descrise la partea generala a acestei lucrari. Totusi si in ziua de astazi costul

acestei medicatii sintetizata genetic ramane ridicat, mai ales in situatia in care pacienta isi asigura

terapia. Sunt tari in care programele de sanatate finanteaza cateva incercari in cadrul tehnicilor

Page 186: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

172

de reproducere asistata. Se pot astfel prefera (in unele situatii particulare) si alte tipuri de

gonadotropine pe seama costurilor mai reduse.

0

20

40

60

80100

120

140

rFSHHMGrFSH +HMG

FSH-HP

rFSH

HMG

rFSH + HMG

FSH-HP

Fig. 2.4.2 Repartitia tipurilor de gonadotropine din stimularea ovariana - antagonisti-GnRH/ 3

ani

Cele 2 tipuri de protocoalele de stimulare ovariana care cuprind in schema lor

antagonisti-GnRH au fost detaliate din punct de vedere al dozelor si modului de administrare in

partea generala a tezei. S-a constatat ca la pacientele studiate pe durata a celor 3 ani s-a aplicat

majoritar protocolul Lübeck, care foloseste o doza zilnica de 0,25 mg antagonist-GnRH, cu

repetare pana in momentul declansarii ovulatiei.

Protocolul francez s-a administrat in 9 cazuri (6,04%), iar protocolul Lübeck la 140 paciente

(93,95%) (Fig. 2.4 3).

Page 187: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

173

0

50

100

150

Protocol Lubeck Protocol francez

Fig. 2.4.3 - Incidenta aplicarii celor 2 protocoale cu antagonisti-GnRH/ 3 ani

Durata medie a stimularii ovariene a fost comparabila in cei 3 ani studiati (Tabel 2.4.3) si

comparabila cu datele din studii internationale.

Tabel 2.4.3 - Parametri statistici ai duratei de stimulare ovariana - antagonisti-GnRH/ 3 ani

An studiat Durata

medie a

stimularii

(zile)

Minim zile

stimulare

Maxim zile

stimulare

Mediana

(zile)

Deviatia

standard

1999 9,58 6 17 9 2,144

2000 9,83 7 31 9 3,869

2001 10,23 7 17 10 2,174

TOTAL ani 9,95 6 31 9 2,683

Insumate, datele au redat urmatoarele: durata medie a stimularii ovariene a fost de 9,95 zile,

valoarea minima de 6 zile si cea maxima de 31 zile, mediana: 9 zile, deviatia standard: 2,683. Un

140

9

Page 188: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

174

procent de 69,79% din paciente au necesitat o durata a stimularii ≤ 10 zile, comparabila si cu

statistica generala. Valori foarte prelungite ale stimularii (≥ 15 zile) s-au intalnit in cazuri de

raspuns redus la stimulare si aceasta doar intr-un procent scazut (Tabel 2.4.4).

Tabel 2.4.4 - Variatia pacientelor in functie de numarul de zile de stimulare ovariana -

antagonisti-GnRH/ 3 ani

Nr. zile stimulare Nr. paciente Procent

≤ 10 zile 104 69,79 %

11-15 zile 40 26,84 %

16-19 zile 4 2,68 %

≥ 20 zile 1 0,67 %

Doza medie a unitatilor de gonadotropina administrata la cele 149 de paciente a fost de

2021,779 UI, doza minima a fost de 450 UI si doza maxima la care s-a ajuns in cursul

tratamentului – 7425 UI; mediana: 1800 UI gonadotropina si deviatia standard: 994,482 (Tabel

2.4.5).

Tabel 2.4.5 - Parametri statistici a gonadotropinelor in stimularea ovariana - antagonisti-GnRH/ 3

ani

An studiat Doza medie

a stimularii

(UI)

Minim doza

stimulare

Maxim

doza

stimulare

Mediana

(UI)

Deviatia

standard

1999 2176,58 525 UI 6000 UI 1875 1118,79

2000 1939,32 900 UI 6225 UI 1650 912,635

2001 1975,35 450 UI 7425 UI 1800 963,118

Total ani 2021,779 450 UI 7425 UI 1800 994,482

Determinarile hormonale au vizat masurarea valorii serice a estradiolului anterior

punctiei foliculare, care reflecta secretia foliculilor, precum si nivelul seric al LH-ului, pentru a

depista o eventuala crestere prematura a acestui hormon (efect nedorit de altfel).

Page 189: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

175

Pe perioada celor 3 ani valoarea medie a estradiolului seric, masurat anterior inducerii

ovulatiei a fost de 1495,34 pg/ml, cu o valoare minima obtinuta in acest moment de 101 pg/ml si

o valoare maxima de 8704 pg/ml; mediana: 1259 pg/ml, deviatia standard: 1084,019.

Tabelele urmatoare reflecta determinarile estradiolului seric defalcat, cu o preponderenta

a valorilor < 1000 pg/ml in cursul stimularii. Dar nici valorile > 2000 pg/ml, care se apropie de

concentratii ce pot induce posibil un sindrom de hiperstimulare ovariana, nu au fost intr-un

procent neglijabil (23,48%) (Tabel 2.4.6 si Tabel 2.4.7).

Tabel 2.4.6 - Valorile defalcate ale E2 seric (pg/ml) pe cei 3 ani - antagonisti-GnRH

Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent

< 1000 pg/ml 55 cazuri 36,91%

1000-1499 pg/ml 36 cazuri 24,16%

1500-1999 pg/ml 23 cazuri 15,43%

>2000 pg/ml 35 cazuri 23,48%

Tabel 2.4.7 - Parametri statistici ai nivelului E2- antagonisti-GnRH/ 3 ani

An studiat Nivel mediu

E2 (pg/ml)

Minim nivel

E2 (pg/ml)

Maxim

nivel E2

(pg/ml)

Mediana

(pg/ml)

Deviatia

standard

1999 1141,39 219 2650 1056 553,508

2000 1237,13 101 5494 1105 1012,796

2001 1834,30 142 8704 1610 1247,689

TOTAL ani 1495,34 101 8704 1259 1084,019

In ceea ce priveste valorile LH se constata urmatorii parametrii statistici (Tabelul 2.4.8).

Doar in 4 cazuri au fost sesizate valori ale LH-ului > 10 UI/l. Toate aceste paciente au

fost stimulate cu rFSH.

In 2 dintre aceste cazuri cu crestere prematura a LH-ului s-a considerat ca este mai

practic sa se intrerupa stimularea si s-a abandonat ciclul. La aceste 2 paciente s-a aplicat

protocolul francez si stimulare ovariana cu rFSH.

Page 190: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

176

Celelalte 2 cazuri au fost punctionate in cadrul FIV conventionale, cu protocol Lübeck si

stimulare cu rFSH; in amandoua situatiile s-au recoltat ovocite (1 pacienta cu LH= 18,7 UI/l a

prezentat fecundare, dar fara sarcina; la a 2-a pacienta, cu LH= 14,8 UI/l nu s-a realizat

fecundarea ovocitelor, posibil datorita luteinizarii si a aspectului lor de ovocite postmature.

Tabel 2.4.8 - Parametri statistici pentru LH seric - antagonisti-GnRH/ 3 ani

Determinare

LH seric

Valoarea

medie

Valoarea

minima

Valoarea

maxima

Mediana Deviatia

standard

1999 2,38 UI/l 0,1 UI/l 27,9 UI/l 1,6 UI/l 4,301

2000 2,05 UI/l 0,1 UI/l 19,6 UI/l 0,9 UI/l 3,305

2001 2,12 UI/l 0,1 UI/l 18,7 UI/l 1,3 UI/l 2,987

TOTAL ani 2,18 UI/l 0,1 UI/l 27,9 UI/l 1,2 UI/l 3,449

Ca si o concluzie partiala in urma schemelor de tratament cu antagonisti-GnRH se

observa ca protocolul Lübeck a fost mult mai des aplicat (93,95%) in cele 149 cazuri analizate.

Din cele 4 paciente cu crestere prematura a LH-ului (> 10 UI/l), 2 au apartinut grupului la

care s-a produs supresia hipofizara cu doza unica de antagonist, adica in cadrul protocolului

francez. La aceste 2 paciente s-a renuntat la a se mai practica punctia foliculara. Celelalte 2

paciente cu valori ale LH-ului > 10 UI/l au apartinut protocolului Lübeck, s-a efectuat

punctie, cu fecundare intr-un caz si fara fecundare in al doilea.

Posibil ca efectul antagonistului-GnRH in cadrul unui protocol cu doza unica de

administrare sa nu realizeze in toate situatiile o inhibitie suficienta a hormonilor endogeni.

Foliculometria alaturi de dozarea parametrilor hormonali reflecta raspunsul ovarian

adecvat sau inadecvat (in sensul raspunsului insuficient sau exagerat) la terapia de stimulare

administrata. Din acest motiv a fost ales ca parametru de urmarire si dimensiunea foliculara, cu 3

paliere de dimensiuni, pentru evaluarea raspunsului ovarian. Masurarea ecografica a folicolilor a

aratat pentru cei 3 ani urmatoarele valori obtinute in cadrul protocoalelor cu antagonisti-GnRH

(Tabel 2.4.9):

Page 191: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

177

Tabel 2.4.9 - Parametri statistici pentru foliculometrie - antagonisti-GnRH/ 3 ani

Dimensiune

folicoli

(mm)

Numar

mediu

Numar

minim

Numar

maxim

Mediana Deviatia

standard

13-15 mm 2,81 0 10 2 2,456

16-18 mm 2,52 0 12 2 2,123

> 18 mm 3,93 0 17 3 2,385

La grupul de 149 paciente care au apelat la tehnici de reproducere asistata si la care s-au

introdus protocoalele de stimulare ovariana cu schema de antagonisti-GnRH s-au efectuat un

total de 71 FIV conventionale, 72 microinjectari ICSI si in 6 situatii nu s-a mai practicat punctie

foliculara (abandon cicluri). Analizat pe cei 3 ani separat se observa ca numarul de paciente a

crscut simtitor in anul 2001 fata de cei 2 ani anteriori, In anul 2001, atat in valoare absoluta cat si

procentual, procedeul ICSI a fost mult mai des aplicat (60,56%). Per global insa practicarea FIV

clasice comparativ cu ICSI nu a aratat diferente semnificativ statistic (47,65% versus 48,32%)

(Tabel 2.4.10); (Fig. 2.4.4).

Numarul de cicluri abandonate per total se situeaza la valoarea de 6 (4,02%), cu o

crestere usoara a valorii pentru anul 2000, unde s-a si inregistrat cel mai mic numar de paciente

carora li s-a administrat protocol cu antagonist-GnRH.

O posibila explicatie pentru practicarea din ce in ce mai frecvent a procedeului ICSI este

utilitatea aplicarii lui in cazuri de esec intalnit in cadrul FIV clasice (absenta pronucleilor), motiv

pentru care trebuie verificat procesul de fecundare si in mod special in cazurile cu sterilitate

masculina. Inainte de punerea la punct a metodei ICSI, lipsa fecundarii in cadrul FIV

conventionale ramanea deseori fara o explicatie clara.

Page 192: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

178

Tabel 2.4.10 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu antagonisti-

GnRH/ 3 ani

FIV ICSI Fara punctie An Nr.

paciente Numar Procent Numar Procent Numar Procent

1999 41 24 58,53% 16 39,02% 1 2,43%

2000 37 21 56,75% 13 35,13% 3 8,10%

2001 71 26 36,61% 43 60,56% 2 2,81%

TOTAL 149 71 47,65% 72 48,32% 6 4,02%

FIV/ET

ICSI

Fara punctie

Fig. 2.4.4 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu antagonisti-

GnRH/ 3ani

71 72

6

Page 193: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

179

b. Rezultate

In urma punctionarii foliculare pentru FIV sau ICSI s-au obtinut o medie de 8,42 ovocite,

numarul maxim de ovocite aspirat la o punctie fiind de 31 iar numarul minim de 0, mediana: 7

ovocite, deviatia standard: 6,154 (Tabel 2.4.11).

Tabel 2.4.11 - Parametri statistici pentru ovocite (antagonisti-GnRH/ 3 ani)

Media Mediana Numar

minim

Numar

maxim

Deviatia

standard

Nr. ovocite

8,42 7 0 31 6,154

La controlul fecundarii realizat la 16-20 ore de la inseminarea sau microinjectarea

ovocitelor s-au obtinut o medie de 4,1 celule cu 2PN, un numar maxim de 14 celule cu 2PN si un

numar minim de 0 celule cu 2PN (absenta fecundarii), mediana: 3 celule cu 2PN, deviatia

standard: 3,364. S-au luat in calcul toate ciclurile de stimulare ovariana initiate (Tabel 2.4.12).

Tabel 2.4.12 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ 3 ani)

Media Mediana Numar

minim

Numar

maxim

Deviatia

standard

Nr celule cu 2

PN

crioconservate 4,1 3 0 14 3,364

Embriotransferul s-a efectuat cu 1, 2 sau maxim 3 embrioni, numarul mediu de embrioni

pentru transfer a fost de 1,89, mediana: 2 embrioni, deviatia standard: 0,923.

Au existat si situatii in care nu s-au transferat embrioni pe motivul sindromului de

hiperstimulare (au fost crioconservati) sau in urma culturii celulelor cu 2PN a 2-a zi embrionii s-

au oprit in evolutie sau, cazul cel mai nefericit, la care in urma inseminarii/microinjectarii

ovocitelor nu s-a realizat fecundarea.

Au fost in total 17 cazuri la care nu s-a realizat embriotransfer. Rata realizarii

embriotransferului a fost de 88,59% pentru cele 149 cazuri.

Page 194: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

180

Din totalul de 149 cicluri initiate s-a reusit crioconservarea in 72 cicluri (Tabel 2.4.13).

S-a crioconservat o medie de 4,5 celule cu 2PN, numarul maxim fiind de 12, respectiv numarul

minim de 1 celula cu 2 PN; mediana: 4, deviatia standard: 2,823. In acest calcul au fost stabiliti

parametrii statistici doar pentru cele 72 de cicluri cu crioconservari efectuate.

Tabel 2.4.13- Repartitia crioconservarii functie de tehnica de reproducere asistata - antagonisti-

GnRH/ 3ani

Crio-FIV Crio-ICSI An Nr.

paciente

Total crio

Numar Procent Numar Procent

1999 41 20 14 70% 6 30%

2000 37 17 11 64,7% 6 35,29%

2001 71 35 12 34,28% 23 65,71%

TOTAL 149 72 37 51,38% 35 48,61%

c. Observatii

Numarul de paciente care au prezentat un raspuns insuficient la stimularea ovariana

controlata si la care nu s-a mai practicat punctie foliculara sunt in numar de 6 (4,02%).

Din tabelul 2.4.14 se constata ca varsta medie a pacientelor este de 31 de ani, mai mica

decat varsta medie a totalului de 149 de paciente (34,48 ani), deci in acest caz varsta nu are rol

important in suspicionarea raspunsului redus la terapia de stimulare ovariana.

In toate situatiile s-a utilizat rFSH ca si tip de gonadotropina si in 5 din 6 cazuri (83,33%)

s-a aplicat protocolul Lübeck.

Valoarea medie a UI de gonadotropina este 2712,5.

Durata stimularii ovariene a fost in medie de 13,16 zile, prelungita fata de 9,95 zile, care

reprezinta media duratei de stimulare pentru intregul grup de paciente.

Numarul maxim de zile atins a fost de 31, situatie cand s-a administrat si doza cea mai

mare de rFSH dintre aceste 6 paciente (si anume 6225 UI). Valorile E2 seric s-au situat sub < 500

pg/ml (media valorilor: 238,5 pg/ml).

Page 195: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

181

Doar la o singura pacienta s-a inregistrat cresterea prematura a LH-ului endogen, fiind

vorba de in acest caz de aplicarea protocolului francez.

Exista o corelatie clara pentru aceste cazuri a statusului de „low responder” cu durata medie a

perioadei de stimulare ovariana si cu nivelul scazut al E2 seric. Factorul varsta nu este implicat in

aceste cazuri.

Tabel 2.4.14- Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ 3 ani Caz Cauza

Varsta

(ani)

Tip

FSH

Durata

stimularii

Nr.

total

UI

Tip

protocol

E2

(pg/ml)

LH

(UI/l)

Nr.

folicoli

- 13-15

- 16-18

- > 18

1 Low

response

38 rec 11 zile 1875 Lübeck 381 0,1 2/ 0/ 2

2 Low

response

si ↑ LH

32 rec 8 zile 1500 francez 442 19,6 !! 0/ 0/1

3 Low

response

29 rec 31 zile !! 6225 Lübeck 204 4,2 1/ 0/ 0

4 Low

response

26 rec 10 zile 900 Lübeck 101 3,1 10/ 0/ 0

5 Low

response

29 rec 11 zile 2175 Lübeck 142 0,1 0/ 0/ 3

6 Low

response

32 rec 8 zile 3600 Lübeck 161 1,7 1/ 1/ 1

Au existat si situatii de raspuns ovarian inadecvat, dar in care totusi s-a efectuat punctia

foliculara. In aceste 3 cazuri exemplificate in tabelul 2.4.15 este vorba de paciente la care in

urma punctiei s-au recoltat un numar de 0; 2 si respectiv 8 ovocite, dar nici una din FIV nu s-a

insotit de fecundare.

Varsta medie a acestor 3 paciente este de 37 de ani, toate au fost stimulate cu rFSH si

doar intr-un caz s-a aplicat protocolul francez, acesta fiind insotit si de cresterea LH-ului

endogen (27,9 UI/l).

Numarul de UI de gonadotropina a variat intre 1500 si 2700.

Page 196: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

182

Durata stimularii a fost in toate cele 3 cazuri de 9 zile si comparabila cu durata medie de

stimulare (9,95 de zile) a lotului total de paciente.

Concentratia medie a E2 seric pentru aceste 3 paciente se situeaza sub valoarea medie a

lotului total de 149 de paciente (1235 pg/ml comparativ cu 1495,34 pg/ml).

Se remarca din nou asocierea protocolului francez cu cresterea prematura a LH-ului

endogen, existand astfel posibilitatea ca o doza unica de antagonist sa fie insuficienta in

realizarea supresiei hipofizare.

Tabel 2.4.15 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – antagonisti-GnRH/ 3 ani Caz Cauza

Varsta

(ani)

Tip

FSH

Durata

stimularii

Nr.

total

UI

Tip

protocol

E2

(pg/ml)

LH

(UI/l)

Rezultat

punctie

1 ↑

prematura

LH

41 rec 9 zile 1575 francez 771 27,9 FIV.

Øovocit

2 Low

response

34 rec 9 zile 2700 Lubeck 912 2,1 FIV, 2

ovocite,

Ø

fecund.

3 Low

response

36 rec 9 zile 1500 Lubeck 2022 3 FIV, 8

ovocite,

Ø

fecund.

Sindromul de hiperstimulare s-a inregistrat la 5 cazuri din totalul de 149 de paciente si

reprezinta un procent de 3,35%. S-au constatat toate tipurile de gravitate ale acestui sindrom.

Valoarea medie a E2 seric pentru cele 5 paciente este de 1950,8 pg/ml si este mai mare decat

valoarea medie a lotului total de 149 de paciente (1495,34 pg/ml) (factor pozitiv de corelare al

aparitiei sindromului de hiperstimulare).

Se remarca conform definitiei criteriilor de abandonare a ciclurilor de stimulare prezenta mai

multor folicoli mici sau a unui numar mare de folicoli dominanti.

Doar 1 caz s-a insotit de prezenta sarcinii.

Page 197: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

183

La o singura pacienta s-au crioconservat toate celulele fecundate si nu s-a efectuat ET, aceasta

fiind considerata o masura de siguranta (Tabel 2.4.16).

Tabel 2.4.16 - Sindrom de hiperstimulare ovariana - antagonisti-GnRH/ 3 ani Caz Grad

hiperstim.

E2

(pg/ml)

Nr.

folicoli 13-15

/ 16-18

/ > 18

Punctie

folic.

ET Criocons.

integral

Sarcina Avort/

Nastere

1 I 1269 0/0/17 da da - nu -

2 II/III 1191 1/10/3 da da - nu -

3 II 1429 1/4/4 da da - nu -

4 III 2993 10/4/2 da da - da nastere

monofet.

5 II 2872 8/8/7 da nu da (tot) - -

d. Concluzii

Numarul total de sarcini in perioada celor 3 ani analizati pentru cele 149 cicluri de

stimulare ovariana controlata cu protocoale cu antagonisti-GnRH a fost de 17. Nu s-au obtinut

decat 2 sarcini biochimice, 4 avorturi spontane si nici o sarcina ectopica. Sarcinile multiple au

fost de asemenea reduse comparativ cu sarcinile monofetale (17,64% versus 47,05%), date care

nu depasesc cele inregistrate in statisticile mondiale (exemplificat in partea generala) (Tabel

2.4.17).

Tabel 2.4.17 - Numarul de sarcini si evolutia lor la pacientele cu antagonisti-GnRH/ 3 ani An Nr.

paciente

Nr.

sarcini

Sarcina

biochimica

Avort

spontan

Sarcina

ectopica

Nastere

monofetala

Nastere

gemelara

Nastere

tripla

1999 41 4 0 2 0 2 0 0

2000 37 3 1 0 0 0 1 1

2001 71 10 1 2 0 6 1 0

TOTAL 149 17 2

11,76%

4

23,52%

0 8

47,05%

2

11,76%

1

5,88%

Page 198: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

184

O particularitate care s-a intalnit in grupul de paciente a fost cea referitoare la o sarcina

initial gemelara, a carei evolutie a fost ulterior monofetala: unul dintre feti s-a oprit in evolutie la

15 saptamani de gestatie iar celalalt si-a continuat evolutia pana in momentul extractiei sale prin

operatie cezariana (la 36 saptamani de gestatie).

Sarcini/1999

Cele 4 sarcini au provenit din FIV conventionale, unde s-a utilizat rFSH pentru stimularea

ovariana si s-a aplicat procedeul Lübeck.

Sarcini/ 2000

Toate cele 3 sarcini au provenit din embrioni de la cicluri FIV, in care s-a folosit pentru

stimularea ovariana rFSH si protocol Lübeck

Sarcini/ 2001

Din totalul de 10 sarcini, 5 sarcini au provenit din embrioni FIV si 5 sarcini din embrioni ICSI.

In 9 cazuri s-a utilizat rFSH si protocol Lübeck, doar in 1 caz s-a administrat HMG in vederea

stimularii ovariene si s-a aplicat tot protocolul Lübeck (1 sarcina obtinuta in urma tehnicii ICSI).

Insumand sarcinile pe cei 3 ani se pot conclude urmatoarele:

• pentru stimularea ovariana s-au folosit in 16 cazuri rFSH (94,11%) si in 1 caz HMG

(5,88%) (Tabel 2.4.18); (Fig. 2.4.5)

Tabel – 2.4.18 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cadrul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ antagonisti-GnRH

Nr. sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent

rFSH 4 3 9 16 94,11%

HMG 0 0 1 1 5,88%

Page 199: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

185

0123456789

rFSH HMG

1999

2000

2001

Fig. 2.4.5 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cadrul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/

antagonisti-GnRH

• din 17 sarcini inregistrate in urma schemelor cu antagonisti-GnRH, acestea au fost in

exclusivitate obtinute dupa inhibitia hipofizara conform protocolului Lübeck (Tabel

2.4.19); (Fig. 2.4.6);

Tabel 2.4.19 - Frecventa tipurilor de protocoale cu antagonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani

Nr.sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent

Protocol

Lübeck

4 3 10 17 100%

Protocol

francez

0 0 0 0 0

Page 200: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

186

0123456789

10

Protocol Lubeck Protocol francez

1999

2000

2001

Fig. 2.4.6 - Frecventa tipurilor de protocoale cu antagonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in

cei 3 ani

• in 12 cazuri din total (70,58%) embrionii au provenit in urma fecundarii ovocitelor

punctionate in cadrul FIV conventionale. In 5 cazuri (29,41%) s-au obtinut sarcini

dupa embriotransferul in urma fecundarii ovocitelor microinjectate conform metodei

ICSI (Tabel 2.4.20); (Fig. 2.4.7).

Tabel 2.4.20 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/

antagonisti/GnRH

1999 2000 2001 TOTAL

Total

sarcini

4 3 10 17

Procent

FIV/ET

ICSI

4

0

3

0

5

5

12

5

70,58%

20,51%

Page 201: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

187

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

FIV/ET ICSI

1999

2000

2001

Fig. 2.4.7 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/

antagonisti/GnRH

S-au inceput 149 de cicluri de stimulare in cei 3 ani descrisi, dintre care punctii foliculare

s-au efectuat doar in 143 situatii si embriotransferuri in 133 cazuri (Tabel 2.4.21).

Numarul mai mic de punctii foliculare se explica pe baza abandonarii ciclurilor (situatie detaliata

la fiecare an in parte) iar numarul mai mic al embriotransferurilor este dat de esecul fecundarii

dupa inseminarea/microinjectarea ovocitelor, respectiv absenta embrionilor. Au fost si cazuri

particulare in care s-au crioconservat celulele cu 2PN, urmand a fi decongelate si transferate cu

ocazia unui ciclu spontan (in situatia sindromului de hiperstimulare ovariana) (in acest mod nu s-

a mai ajuns la embriotransfer in urma ciclului inceput).

Page 202: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

188

Tabel 2.4.21 - Rezultatele ciclurilor cu antagonisti-GnRH/ 3 ani

Total punctii efectuate

Total cazuri cu fecundare realizata

Total ET efectuate Total cicluri

stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent

1999 41 40 97,56% 39 95,12% 39 95,12%

2000 37 34 91,89% 32 86,48% 32 86,48%

2001 71 69 97,18% 64 90,14% 62 87,32%

3 ani 149 143 95,97% 135 90,60% 133 89,26%

Comparativ pentru cei 3 ani se remarca o scadere a ratei embriotransferului in anul 2000 fata de

ceilalti ani, in acest an s-a inregistrat si cel mic mare numar de paciente cu antagonisti-GnRH.

Rata punctiilor efectuate in anul 2000 este de asemenea cea mai mica procentual comparativ cu

celilalti doi ani.

Rata sarcinilor/cicluri stimulate: 11,40%

Rata sarcinilor/punctii efectuate: 11,88 %

Rata sarcinilor/embriotransfer: 12,78%

Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 15,03%

Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 7,38%

(Tabel 2.4.2).

Tabelul 2.4.22 - Rata sarcinilor – protocol antagonisti-GnRH/ 3 ani

1999 2000 2001 TOTAL Rata

sarcini/ciclu 9,75% 8,1% 14,08% 11,40%

Rata sarcini/ punctie

10% 8,82% 14,49% 11,88%

Rata sarcini/ET

10,25% 9,37% 16,12% 12,78%

Rata implantarii

10,25% 15,62% 17,74% 15,03%

Baby take home rate

4,87%

5,4% 9,85%. 7,38%

Page 203: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

189

e. Discutii

1. Se observa ca in anii 1999 si 2000 numarul de paciente care au inceput cicluri de

stimulare si au beneficiat de protocoale cu antagonisti-GnRH au fost apropiate (41 si 37),

dar numarul pacientelor a crescut pentru anul 2001 la 71 de cazuri. Explicatia rezida in

faptul ca a crescut complianta pacientelor la un tratament relativ recent introdus, s-au

sedimentat informatiile despre antagonisti. Acelasi lucru este valabil si pentru clinicieni,

care au castigat si ei in experienta si in incredere in aplicarea unui protocol diferit.

2. Tehnicile de reproducere asistata care au fost aplicate in aceasta perioada de 3 ani au fost

comparabile ca incidenta: 47,65% FIV si 48,32% ICSI, dar numarul de sarcini obtinute in

urma FIV este mai mare (70,58%) fata de cele rezultate din ICSI (29,41%).

3. Cu toate ca numarul mediu de ovocite recoltate si media celulelor fecundate este

comparabil cu datele din literatura, totusi rata sarcinilor se situeaza la procente scazute.

Page 204: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

190

Capitolul 3 - Discutii

In introducerea partii speciale am expus obiectivele prezentului studiu. Este o analiza

comparativa a doua substante provenite din structura hormonului hipofizar GnRH, si anume

agonistii si antagonistii-GnRH. Odata cu introducerea tehnicilor de reproducere umana asistata s-

au pus la punct si tratamentele de stimulare ovariana. S-a constatat ca pentru evitarea cresterii

premature a LH-ului endogen, care compromite ovocitele prin luteinizare precoce si influenteaza

in sens negativ calitatea acestora si prin aceasta rata fertilitatii, este necesar de introdus un

protocol care sa inhibe secretia hipofizara de gonadotropi. In acest mod s-au dezvoltat

protocoalele cu agonisti-GnRH. Aceste protocoale sunt deja folosite uzual, exista experienta in

aplicarea lor si se obtin rezultate bune cu ele. Evolutia cercetarilor a introdus mai recent

medicatia antagonista, care prin protocoalele sale a adus avantajul reducerii duratei de stimulare,

cu administrarea unei doze mai scazute de gonadotropine comparativ cu protocoalele deja

existente, ce folosesc agonisti. Astfel se obtine si o reducere a costurilor suportate de pacienta. Se

ridica insa intrebarea daca efectul lor asupra ratei sarcinii este similar; de crestere, sau

dimpotriva, de scadere a ratei, fata de protocoalele devenite clasice pana in momentul

introducerii antagonistilor.

Aceasta analiza isi propune o comparare a celor doua medicatii, in final fiind analizata

rata sarcinilor/ ciclu; rata sarcinilor/ punctie, rata sarcinilor/ ET; rata implantarii si take home

baby rate. Am luat in considerare mai multi parametri pentru a gasi impactul si influenta lor in

raspunsul pacientei la terapie. Acesti factori, separat sau asociat, pot juca un rol in raspunsul

ovarian, in numarul de ovocite recoltate si calitatea lor, au efecte asupra procesului fecundarii si

implantarii embrionului.

Studiul se intinde pe durata a 3 ani (1999, 2000 si 2001), este retrospectiv si analizeaza

comparativ loturile de paciente care s-au adresat Departamentului de Reproducere Asistata (din

cadrul Clinicii Universitare de Ginecologie, Heidelberg) si care au intrat in protocoale de

stimulare ovariana pentru FIV sau ICSI. S-au luat in calcul mai multi parametri: varsta, durata

tratamentului, doza de stimulare si medicatia gonadotropinica administrata, tipurile de protocoale

aplicate. Monitorizarea foliculara si cea hormonala (estradiol si LH seric) sunt considerati

markeri ai raspunsului ovarian la stimulare, respectiv LH-ul reda statusul inhibat corect al

Page 205: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

191

hipofizei. Rezultatele sunt reprezentate de numarul de ovocite recoltate, numarul de celulele

fecundate si, in special, sarcinile obtinute (cu detaliile specifice). Obtinerea sarcinilor este de

altfel scopul reproducerii umane asistate, iar rata sa constituie obiectivul prezentei analize: si

anume aprecierea influentei celor doua clase de analogi-GnRH asupra fertilitatii.

Datele obtinute au fost prelucrate cu ajutorul regresiei logice.

Modelul pentru aceasta este cel binomial, unde „p” reprezinta probabilitatea succesului.

p/(1-p) descrie relatia probabilitatilor intre succes si esec. Este redata urmatoarea corelatie

lineara:

xp

p βα +=

−1

log

unde α reprezinta termenul general, iar prima parte a relatiei este logit din “p”.

Evaluarea s-a efectuat cu ajutorul procedeului SAS GENMOD (Generalized Models). Acest

procedeu permite evaluarea datelor prin regresia logica si in acelasi timp se iau in considerare

valorile pentru aceeasi pacienta care sunt interdependente.

Pacientele care s-au adresat in vederea reproducerii asistate si au urmat tratament ce a

inclus protocoalele cu agonisti-GnRH sunt in numar de 832, de aproximativ 6 ori mai

numeroase, comparativ cu cele ce au inclus protocoale cu antagonisti-GnRH - in numar de 149.

Aceasta diferenta se explica si prin increderea castigata in timp de agonsiti fata de antagonisti,

prin experienta acumulata cu terapia cu agonisti si poate existenta unei rezerve fata de

antagonisti, introdusi mai recent in practica clinica, si implicit o experienta de utilizare mai mica.

Un prim factor care este luat in discutie se refera la varsta pacientelor. Este deja obisnuit

pentru centrele de reproducere asistata ca pacientele incluse in terapie sa se situeze in jurul

varstei de 35 de ani sau chiar peste aceasta varsta. Se motiveaza aceasta incidenta crescuta a

varstei ≥ 35 de ani, prin faptul ca in perioada contemporana femeia moderna este angrenata mai

mult in viata sociala/profesionala, interesul reproductiv (implinirea familiala) trecand pe loc

secund. Astfel ca momentul conceptiei este de multe ori amanat, dupa implinirea carierei.

Factorul varsta este important, deoarece este implicat in raspunsul ovarian: femeile cu varsta >

35 de ani pot prezenta o frecventa mai crescuta a abandonarii ciclului de stimulare.

Page 206: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

192

Se remarca din tabelul 3.1 ca varsta medie si mediana sunt ceva mai crescute in cazul

protocoalelor cu antagonisti, de asemenea procentul pacientelor cu varsta cuprinsa intre 35-39 de

ani il depaseste pe cel din protocoalele cu agonisti. Este posibil ca aceasta crestere sa fie

explicata si prin faptul ca o serie de paciente ce au apelat in trecut la protocoalele cu agonisti sa

incerce o noua stimulare cu medicatia mai recenta, in speranta obtinerii sarcinii cu un tratament

mai modern. Extremele varstelor sunt comparabile (21 versus 24 de ani respectiv 46 versus 43 de

ani).

Tabel 3.1 - Comparatie a parametrului varsta pentru protocoalele cu agonisti/antagonisti

Varsta medie (ani) Mediana (ani) Procent cazuri cu

varsta 35-39 ani

Agonisti-GnRH 34,49 35 35,81%

Antagonisti-GnRH 36,21 37 41,61%

Standard Wald 95% Chi-

Parameter DF Estimate Error Confidence Limits Square Pr > ChiSq

Varsta 1 -0.0780 0.0201 -0.1173 -0.0387 15.10 0.0001

Standard 95% Confidence Parameter Estimate Error Limits Z Pr > |Z|

Varsta -0.0780 0.0184 -0.1141 -0.0419 -4.24 <.0001

Distributia pacientelor in functie de varsta in cele doua loturi analizate este

comparabila, conform analizei statistice.

Referitor la stimularea gonadotropinica, sunt de departe preferate preparatele sintetizate

genetic, si anume rFSH. Acest fapt este constata in studiul actual pentru amandoua protocoalele -

agonist/antagonist, dar este valabil si pentru celelalte centre mondiale unde se practica

reproducerea umana asistata. FSH recombinat are prioritate fata de celelalte preparate deoarece

are activitate pur FSH, evita reactiile alergice; are insa dezavantajul unui cost mai ridicat. A doua

optiune in stimularea ovariana ramane HMG (Tabel 3.2). Din punctul de vedere al stimularii

Page 207: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

193

ovariene, amandoua substantele – agonist si antagonist - au utilizat acelasi tip de gonadotropine,

cu influente pozitive asupra numarului si calitatii ovocitelor, asa cum dovedesc datele din

literatura.

Tabel 3.2 - Comparatie a tipurilor de gonadotropina din stimulare - protocoale cu

agonisti/antagonisti

rFSH HMG

Agonisti-GnRH 79,32% 11,69%

Antagonisti-GnRH 86,57% 8,05%

Parameter DF Estimate Error Confidence Limits Square Pr >ChiSq

recFSH 1 -0.7336 0.4270 -1.5706 0.1034 2.95 0.0858

HMG 1 -1.2141 0.4620 -2.1197 -0.3085 6.90 0.0086

FSH-HP 1 0.0159 0.7380 -1.4305 1.4624 0.00 0.9828

Standard 95% Confidence Parameter Estimate Error Limits Z Pr > |Z|

recFSH -0.7337 0.4385 -1.5931 0.1258 -1.67 0.0943 HMG -1.2140 0.4190 -2.0352 -0.3927 -2.90 0.0038 FSH-HP 0.0156 0.6810 -1.3192 1.3503 0.02 0.9818

In urma analizei statistice, protocoalele cu analogi-GnRH au folosit pentru stimularea

ovariana aceleasi gonadotropine cu diferente nesemnificative statistic (rFSH, HMG), cu

exceptia FSH-HP.

Durata medie a stimularii ovariene a fost pentru pacientele cu protocoale cu agonisti mai

lunga fata de cazurile cu antagonisti, acelasi lucru este valabil si pentru mediana (Tabel 3.3).

Valorile extreme ale perioadei de stimulare sunt comparabile (minim 6 zile si maxim 29 zile

agonist versus 21 zile antagonist).

Pacientele utilizand protocoale cu agonisti au prezentat un procent de 38,94% pentru

durata ≤ 10 zile si 56,37% pentru o perioada intre 11-15 zile. Antagonistii-GnRH au avut un

procent de 69,79% din paciente cu durata a stimularii ≤ 10 zile si 26,84% din cazuri cu stimulare

intre 11-15 zile.

Page 208: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

194

Din studiu reiese ca durata stimularii este mai scurta in cazurile cu antagonisti comparativ

cu agonisti, ceea ce este consemnat si in datele din literatura. Procentele pacientelor care au

necesitat o perioada de stimulare prelungita (> 15 zile, fiind inclusa aici si perioada > 20 de zile)

sunt comparabile: agonisti 4,68% iar anatagonisti 3,35%.

Tabel 3.3 – Comparatie a duratei stimularii ovariane – protocoale agonisti/antagonisti

Durata medie a

stimularii (zile)

Mediana (zile)

Agonisti-GnRH 11,36 11

Antagonisti-GnRH 9,95 9

Doza medie a gonadotropinei utilizata in stimulare este alt factor luat in discutie. Este

cunoscut faptul ca in cadrul protocolului cu antagonisti este o durata mai redusa de stimulare

care poate atrage dupa sine si un necesar mai scazut al unitatilor de FSH. Din cadrul

protocoalelor cu agonisti, cel lung are de obicei necesarul cel mai crescut de unitati de FSH.

In analiza actuala se observa o diferenta de 600 UI intre valorile medii ale dozelor de

FSH din cadrul stimularii ovariene. Se observa in tabelul 3.4 ca in cazul protocoalelor cu agonisti

este necesara o doza medie de gonadotropi mai crescuta. De altfel si valorile extreme ale dozelor,

in speta cele maxime atinse in stimulare, sunt mult mai mari pentru agonisti (14.700 UI) fata de

antagonisti (7425 UI).

Tabel 3.4 – Comparatie a dozei medii de unitati FSH – protocoale agonisti/antagonisti

Doza medie (UI) Mediana (UI)

Agonisti-GnRH 2635,19 2250

Antagonisti-GnRH 2021,77 1800

Chiar daca au existat diferente intre durata totala a stimularii si cantitatea totala de

gonadotropina administrata, acesti parametri nu au influentat semnificativ statistic succesul

protocoalelor (nasterea).

Page 209: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

195

Tipurile de protocoale din cadrul fiecarei medicatii supresive hipofizare au si ele

importanta lor, demonstrata in practica de-a lungul anilor prin rezultatele obtinute. Avantajele

pentru fiecare tip de protocol le-am expus in partea generala.

Agonistii au utilizat cel mai frecvent protocolul lung (91,46%) si in cazul antagonistilor

s-a folosit protocolul Lübeck (cu doze multiple) in 93,95% din cazuri.

In anul 2001(ultimul an studiat) protocolul Lübeck s-a administrat in exclusivitate. In cercetarea

actuala protocolul francez nu a produs o inhibitie corespunzatoare a hipofizei, astfel incat din 9

cicluri cu protocol francez, in 2 cazuri s-a inregistrat cresterea prematura a LH-ului (22,22%). La

140 de cazuri cu protocol Lübeck s-au remarcat tot 2 situatii de crestere prematura a LH-ului

(1,42%). Este evidenta diferenta intre cele doua procente ale protocoalelor cu antagonisti si

dovedeste, cel putin pentru analiza actuala, faptul ca supresia hipofizara („down-

regulation) a fost inadecvata in cazul administrarii unice a antagonistului (protocol

francez) si in aceste situatii s-a intrerupt ciclul de stimulare.

Raspunsul ovarian la stimulare este in mod fidel caracterizat de corelarea a doi parametri,

si anume dezvoltarea folicolilor ovarieni si secretia de estradiol a acestora, cuantificate prin

numarul si dimensiunea ecografica a folicolilor si ,respectiv, concentratia estradiolului seric.

Acesta este motivul pentru care am inclus in analiza comparativa acesti factori si valorile lor sunt

redate astfel: pentru dezvoltarea folicolilor - numarul/dimensiunea lor in ziua in care se

stabileste momentul administrarii HCG (ocazie cu care se si opreste stimularea); iar pentru

estradiol concentratia serica a acestuia in ziua administrarii HCG.

Pacientele care au fost incluse in protocoalele cu agonisti au inregistrat o valoare medie a

E2 seric in ziua inducerii ovulatiei cu aproximativ 500 pg/ml mai mult decat valoarea aceluiasi

hormon la pacientele ce au folosit antagonisti (Tabel 3.5). Valorile maxime ale E2 seric la care s-

a ajuns au fost de 27.669 pg/ml pentru o pacienta din lotul cu agonisti fata de 8704 pg/ml –

valoarea maxima atinsa la o pacienta cu antagonisti-GnRH.

Valorile mai crescute ale E2 seric in cazul agonistilor sunt in corelatie si cu durata mai

prelungita a stimularii ovariene si cu doza medie mai crescuta de administrare a

gonadotropinelor.

Page 210: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

196

Tabel 3.5 – Valoarea medie a E2 seric comparativ pentru agonisti/antagonisti

Valoare medie

(pg/ml)

Mediana (pg/ml)

Agonisti-GnRH 1926,21 1602,5

Antagonisti-GnRH 1495,34 1529

Din datele publicate in literatura actuala se considera ca nu exista o corelatie

semnificativa intre valoarea E2 seric si rata obtineri sarcinilor in cadrul FIV la protocoalele unde

inhibitia hipofizara este realizata cu agonisti-GnRH. Sunt studii retrospective care sugereaza

acest fapt. Totusi, pentru practica clinica, sunt utile studii prospective care sa aduca noi

informatii, atat in cadrul protocoalelor cu agonisti, cat si pentru antagonisti [187].

Incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana in cadrul lotului cu agonisti a fost de

3,48% iar pentru pacientele cu antagonisti - 3,35% . Valorile mai crescute ale E2 seric din grupul

agonistilor nu se coreleaza intotdeauna cu incidenta aparitiei sindromului de hiperstimulare. Este

si concluzia care se desprinde din analiza pacientelor cu sindrom de hiperstimulare, detaliata in

cadrul fiecarui an si tip de protocol. Acestea sunt probate si de statisticile din literatura, care nu

au gasit o corelatie clara intre concentratia E2 seric si aparitia hiperstimularii, cu toate ca in

majoritatea cazurilor acest sindrom se insoteste de valori crescute ale hormonului amintit [189].

Exista insa un consens asupra faptului ca E2 seric crescut poate reprezenta un marker important

in depistarea multor paciente cu risc de hiperstimulare ovariana.

Dozarile hormonale cuprind pe langa E2 seric si determinarea concentratiei LH seric. Este

deosebit de utila aceasta masuratoare a hormonului endogen, tocmai in eventualitatea

surprinderii unei cresteri premature a acestuia. Aceasta crestere precoce reprezina un criteriu de

abandonare a ciclului si semnifica un esec al stimularii ovariene.

Pacientele cu protocoale cu agonisti au prezentat 4 situatii (0,48%) ale valorii LH > 10

UI/l, dintre care 3 cazuri au avut asociere de rFSH si protocol lung; respectiv 1 caz de asociere

rFSH+HMG si protocol scurt.

Pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH s-au inregistrat tot 4 cazuri de crestere prematura a

LH-ului (2,68%). Cele 2 paciente cu asociere rFSH si protocol francez au intrerupt stimularea, pe

Page 211: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

197

cand la celelalte 2 cazuri de rFSH si protocol Lübeck s-a efectuat punctia foliculara, dar fara

obtinerea unei sarcini.

Se considera in cazul protocoalelor cu antagonisti ca realizarea unei supresii hipofizare marcate

in ziua a 8-a de stimulare se insoteste de o rata mai mare a obtinerii sarcinii si de evolutivitate a

acesteia. La pacientele cu LH< 0,5 UI/l in ziua a 8-a de stimulare a fost inregistrata cea mai mare

rata de implantare si apoi de sarcina in evolutie [188].

In analiza prezenta valoarea medie a LH-ului pentru agonisti a fost de 2,45 UI/l si

mediana 2 UI/l, iar pentru antagonisti – de 2,18 UI/l, mediana: 2,2 UI/l.

Foliculometria seriata a fost permanent corelata cu dozarea E2 seric. Amandoua protocoalele

dovedesc prin valorile medii ale folicolilor, exemplificate pe paliere de dimensiuni, o

predominanta a folicolilor > 18 mm, ceea ce reprezinta si scopul stimularii ovariene controlate –

de-a obtine folicoli dominanti si nu folicoli multi si de dimensiuni reduse (Tabel 3.6).

Tabel 3.6 – Numarul folicolilor comparativ agonisti/antagonisti

Agonisti-GnRH Antagonisti-GnRH Dimensiune

folicoli (mm) Numar mediu Mediana Numar mediu Mediana

13-15 2,79 2 2,81 2

16-18 3,09 3 2,52 2

> 18 3,80 4 3,93 3

Rata sarcinilor este influentata si de tehnica reproducerii asistate, in sensul ca pentru

fiecare metoda exista indicatii clare de aplicare, respectiv fiecare tehnica are o rata specifica de

succes.

Numarul pacientelor cu cicluri cu antagonisti a crescut din anul 2000 la anul 2001, la fel

si procentul celor la care s-a efectuat ICSI.

Se remarca din tabelul 3.7 ca numarul ciclurilor intrerupte, care nu s-au soldat cu punctie

foliculara, este usor mai crescut in cazul ciclurilor cu antagonisti. Se poate corela aceasta

informatie si cu faptul ca tot in cazurile antagonstilor procentul cresterii premature a LH-ului este

mai ridicat fata de agonisti. Comparativ insa cu numarul de punctii efectuate in cadrul fiecarui tip

de protocol, cazurile care au ramas nepunctionate sunt in procent foarte reduse.

Page 212: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

198

Tabel 3.7 - Frecventa tehnicilor de reproducere umana asistata – comparativ agonisti/antagonisti

FIV ICSI Fara punctie

Agonisti-GnRH 525 (63,10%) 290 (34,85%) 17 (2,04%)

Antagonisti-GnRH 71 (47,65%) 72 (48,32%) 6(4,02%)

Se observa ca frecventa ICSI in protocoalele cu agonist fata de antagonist se situeaza la

valorile 34,85% versus 48,32%. Diferenta rezida si din indicatiile pentru care s-a efectuat ICSI :

severitatea cazului, tipul sterilitatii, rezultatele de la punctii anterioare (daca s-au efectuat).

Prin diferenta restul cazurilor au beneficiat de FIV, in cazul agonistilor in proportie de 63,10%

fata de antagonisti – 47,65%.

Punctiile s-au insotit de o valoare medie a ovocitelor comparabila intre cele doua tipuri de

protocoale, respectiv asemanatoare cu datele din literatura (Tabel 3.8).

O concluzie foarte importanta care se desprinde din aceste date este ca protocolul cu

antagonisti nu influenteaza in sens negativ numarul si calitatea ovocitelor obtinute per

punctie foliculara.

Tabel 3.8 – Comparatie intre numarul ovocitelor recoltate / punctie foliculara –

agonisti/antagonisti

Numar mediu al

ovocitelor recoltate

Mediana ovocitelor

recoltate

Agonisti-GnRH 8,43 8

Antagonisti-GnRH 8,42 7

Fecundarea, apreciata prin prezenta celulelor cu 2PN, arata aceleasi rezultate comparativ

pentru pacietele care au urmat protocoale cu agonisti-antagonisti, ca si in cazul ovocitelor.

Tabel 3.9 - Comparatie intre numarul celulelor fecundate / punctie – agonisti/antagonisti

Numar mediu al

celulelor cu 2PN

Mediana celulelor cu

2PN

Agonisti-GnRH 3,71 3

Antagonisti-GnRH 4,10 3

Page 213: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

199

Diferenta, de altfel minora, intre aceste valori medii poate fi explicata prin faptul ca in

cazul antagonistilor s-a utilizat in procent mai crescut procedeul ICSI (48,32%) fata de

protocoalele cu agonisti (34,85%) iar in cazul ICSI se scurtcircuiteaza toate barierele intre

spermatozoid si mediul intern al ovocitului.

Rezultatele expuse demonstreaza ca substantele antagoniste nu au efect negativ asupra

fecundarii, in sensul in care acesta depinde in mare masura, pe langa alti factori, si de

calitatea ovocitelor.

Deci agonistii si antagonistii-GnRH au rezultate similare in ceea ce priveste numarul

si calitatea ovocitelor si numarul celulelor fecundate.

Am considerat sa compar si valorile medii ale embrionilor transferati, pentru ca se poate

deduce de aici calitatea embrionilor (daca s-a produs clivajul la prezigoti si daca acestia si-au

continuat evolutia pana la stadiul de embrion). Intotdeauna s-au transferat intre 1 si 3 embrioni.

Tabel 3.10 - Comparatie intre numarul embrionilor transferati – agonisti/antagonisti

Numar mediu al

embrionilor

transferati

Mediana

embrionilor

transferati

Cazuri fara

embriotransfer

Agonisti-GnRH 1,76 2 135

16,23%

Antagonisti-GnRH 1,89 2 16

10,73%

Standard Wald 95% Chi- Parameter DF Estimate Error Confidence Limits Square Pr > ChiSq

ET 1 0.7522 0.1276 0.5020 1.0023 34.74 <.0001

Standard 95% Confidence Parameter Estimate Error Limits Z Pr > |Z| ET 0.7517 0.1052 0.5455 0.9578 7.15 <.0001

Page 214: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

200

Sarcinile care s-au inregistrat la cele 832 de paciente care au efectuat cicluri de stimulare si

au utilizat protocoale cu agonisti-GnRH pentru supresia hipofizara sunt in numar de 179

(21,51%) (Fig. 3.1). De remarcat ca 91(50,83%) din totalul acestor sarcini au fost nasteri

monofetale.

Pacientele care au urmat protocoale cu antagonisti-GnRH au fost in numar de 149 si din

acestea 17 au obtinut sarcina (11,40%). Majoritatea acestor sarcini (un numar de 8, respectiv

47,05%) s-au terminat cu nastere monofetala.

0100200300400500600700800900

Cicluriagonisti

Cicluriantagonisti

Numar sarcini

Total cicluri

Fig. 3.1 – Numarul total de sarcini si numarul total de cicluri initiale pentru protocoalele cu

agonisti/ antagonisti-GnRH

Tipurile de gonadotropine care s-au administrat la aceste paciente care au obtinut sarcina au

fost:

• rFSH in 153 de cazuri (85,47%);

• HMG in 15 cazuri (8,37%);

• rFSH+HMG in 7 cazuri (3,91%);

832

179

149

17

Page 215: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

201

• FSH-HP in 4 cazuri (2,23%).

Gonadotropinele care s-au utilizat in stimularea ovariana controlata pentru aceste 17 paciente

care au obtinut sarcina au fost:

• rFSH: 16 cazuri (94,11%);

• HMG: 1 caz (5,88%) (Fig. 3.2).

020406080

100120140160

Protocoale cu agonisti Protocoale cu antagonisti

rFSH

HMG

rFSH+HMG

FSH-HP

Fig. 3.2 – Tipurile de gonadotropine la pacientele cu sarcini din cadrul protocoalelor cu agonisti/

antagonisti-GnRH

Tipurile de protocoalele care s-au aplicat pentru fiecare medicatie cu analog-GnRH in parte

la pacientele cu sarcina au fost urmatoarele:

• Agonisti-GnRH:

Protocol lung: 170 cazuri (94,97%);

Protocol scurt: 3 cazuri (1,67%);

Protocol ultralung: 6 cazuri (3,35%).

Page 216: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

202

• Antagonisti-GnRH:

Protocol Lübeck: 17 cazuri (100%);

Protocol francez: 0 cazuri.

Se remarca ca protocolul lung in cadrul agonistilor-GnRH a fost cel mai frecvent aplicat;

este de altfel si tipul de protocol cu care se lucreaza cel mai des in practica clinica. Iar pentru

categoria sarcinilor din protocoalele cu antagonisti-GnRH, protocolul Lübeck a fost aplicat in

exclusivitate.

Ca si tehnici ale reproducerii asistate in cazul sarcinilor provenite din stimulare ovariana

si protocol agonist-GnRH s-au practicat FIV/ET in 118 cazuri (65,92%) si ICSI in 61 de situatii

(34,07%), dintre care 5 sarcini cu spermii provenite din crioTESE. Sarcinile pacientelor

provenite din lotul cu antagonisti-GnRH au fost obtinute in urma punctiei foliculare in cadrul

FIV/ET in 12 cazuri (70,58%) si ICSI in 5 cazuri (29,41%) (Fig. 3.3).

01020304050607080

FIV/ ET ICSIAgonisti

Antagonisti

Agonisti Antagonisti

Fig. 3.3 – Raportul procentual al tehnicilor de reproducere asistata la pacientele care au obtinut

sarcina in cadrul protocoalelor cu agonisti/antagonisti

65,92%

70,58%

34,07%

29,41%

Page 217: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

203

Se remarca din acest grafic ca tehnicile de reproducere asistata au avut aproximativ

aceeasi distributie procentuala pentru succesul ciclurilor de stimulare (obtinerea sarcinilor),

indiferent de analogul-GnRH folosit in cadrul protocolului.

Evolutia sarcinilor in cadrul celor 2 protocoale este redata cantitativ si procentual in

urmatorul tabel (Tabel 3.11):

Tabel 3.11 – Evolutia sarcinilor la cele 2 tipuri de protocoale

Evolutia

sarcinilor

Sarcina

biochimica

Avort Sarcina

ectopica

Nastere

monofetala

Nastere

gemelara

Nastere

tripla

Agonisti-

GnRH

27

15,08%

29

16,20%

9

5,02%

91

50,83%

24

13,40%

0

0%

Antagonisti-

GnRH

2

11,76%

4

23,52%

0

0%

8

47,05%

2

11,76%

1

5,88%

Exista o neconcordanta intre totalul de 179 de sarcini pentru pacientele cu agonisti-GnRH

si insumarea in tabel a sarcinilor (180) pentru acelasi lot de paciente, explicata prin faptul ca la o

pacienta s-a diagnosticat ecografic sarcina intrauterina concomitent cu sarcina extrauterina si

care s-a terminat prin avort si salpingectomie totala.

De mentionat ca sarcinile ectopice, rata avorturilor si incidenta sarcinilor multiple pentru

cele 2 categorii de analogi-GnRH nu au depasit procentual statisticile generale. Scopul final al

reproducerii asistate este obtinerea sarcinilor monofetale, deoarece sunt cunoscute riscurile

materno-fetale ale sarcinilor multiple.

Succesul tehnicilor reproducerii umane asistate este considerat a fi nasterea unui copil

sanatos [191]. O statistica efectuata pentru anul 2001 la Centrul de Fertilizare in Vitro Monash

(Australia) a analizat nasterile cu fat viu, unic, la termen si care au provenit dintr-o sarcina

FIV/ET. La acest centru, se considera ca un cuplu care urmeaza un tratament in cadrul

protocoalelor pentru FIV are o sansa de 11,1% de-a naste un fat viu, unic, la termen/ ciclu de

stimulare. Astfel ca standardul pentru succesul in cadrul programelor FIV este considerata

nasterea la termen a unui singur copil viu si sanatos/ ciclu FIV initiat (BESST: Birth

Emphasizing a Successful Singleton at Term).

Page 218: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

204

Conform criteriilor stabilite de standardul BESST, la lotul studiat pe cei trei ani se obtin

urmatoarele valori :

• in urma aplicarii protocolului cu agonist-GnRH s-au inregistrat un total de 91 de nasteri

monofetale la 832 cicluri de stimulare (10,94%) ;

• in cazul protocolului cu antagonisti-GnRH numarul de nasteri monofetale a fost de 8 din

totalul de149 de cicluri initiale, adica 5,37%.

Ca si o observatie se constata ca in cadrul protocolului cu agonist-GnRH valoarea

obtinuta pentru criteriile BESST se apropie de datele din literatura.

Incidenta malformatiilor intalnite in sarcinile din studiul actual pentru cele doua clase de

medicatie supresiva a hipofizei a fost in numar de 6 sarcini (3,35%) din totalul de sarcini

obtinute cu agonisti-GnRH si 1 sarcina (5,88%) in cazul aplicarii antagonistilor-GnRH.

Sarcini cu malformatii/ lotul cu agonisti-GnRH:

1 trisomie 21 la o pacienta de 41de ani (ICSI);

1 fat cu keilognatopalatoskizis(FIV/ET);

2 nasteri gemelare cu malformatii (neprecizate) (1 FIV/ET si 1 crioTESE);

1 trisomie 18 la o pacienta de 40 de ani (FIV/ET);

1 aneuploidie (neprecizata) prin biopsie vilozitati coriale la o pacienta de 38 de ani

(FIV/ET).

Aceste malformatii au fost intalnite la 4 cazuri cu sarcini provenite din FIV/ET si 2 sarcini - in

urma efectuarii ICSI (dintre care la 1 crioTESE). Este destul de dificil de apreciat daca procedeul

ICSI, respectiv crioTESE, prezenta sarcinii multiple sau varsta unora dintre paciente au jucat un

rol in incidenta malformatiilor din aceasta categorie de paciente.

Sarcini cu malformatii/ lotul cu antagonisti-GnRH:

1 caz la o sarcina tripla (cu malformatie intestinala la toti fetii), provenita din FIV/ET.

Nici in grupul pacientelor incluse in terapia cu antagonist-GnRH nu se pot stabili concluzii

pertinente pentru cauza malformatiilor.

Page 219: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

205

Din tabelul 3.12, unde sunt sumarizate ratele sarcinilor calculate pentru cele doua tipuri

de protocoale cu agonisti-, respectiv antagonisti-GnRH, se observa detasat o diferenta neta intre

procentele obtinute pentru agonisti, care se incadreaza in statistica generala si ratele stabilite in

cazul antagonistilor, care sunt evident mai mici.

Tabel 3.12 – Rata sarcinilor comparativ intre protocoalele cu agonisti/ antagonisti

Agonisti-GnRH Antagonisti-GnRH

Rata sarcinilor/cicluri

stimulare

21,51% 11,40%

Rata sarcinilor/punctii 21,96 % 11,88 %

Rata sarcinilor/ET 25,68% 12,78%

Rata implantarii 27,29% 15,03%

Baby take home rate 13,82%. 7,38%

Din analiza statistica reies urmatoarele :

• Pentru parametrul varsta - fiecare an in plus scade probabilitatea obtinerii unei sarcini

ce se finalizeaza cu nastere si care este semnificativ statistic;

• Pentru parametrul embriotransfer creste semnificativ probabilitatea obtinerii unei

sarcini cu fiecare embrion in plus transferat, dar acest lucru este valabil pana la

numarul de 3 embrioni;

• Alegerea protocolului cu antagonist-GnRH se repercuta negativ asupra succesului,

fiind pe analiza actuala considerat semnificativ statistic, cu valoarea lui ˝ p ˝ situata

putin peste limita de 0,05;

• Tehnica ICSI din cadrul reproducerii asistate are un succes scazut, dar nesemnificativ

statistic pe analiza luata in discutie;

• Unele paciente din loturile studiate au parcurs mai multe cicluri de stimulare. Cu toate

ca nu exista un model unitar pentru analiza diferentelor intre acestea, se poate

remarca ca sansa de succes este mai mica pentru a doua incercare si creste usor pentru

a treia incercare, aceasta corelatie nefiind insa semnificativ statistic

Page 220: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

206

Capitolul 4 – Statistica pe primii 5 ani a Centrului de Laparoscopie, Chirurgie

Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul Clincii

Universitare de Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara

Rezultatele pe o perioada de 5 ani de la infiintarea primului centru de reproducere umana

asistata din Romania, si anume Centrul de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in

Vitro si Embriotransfer din cadrul Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie „Bega”,

Timisoara, au fost publicate in Revista Obstetrica si Ginecologia, vol. XLVIII, Nr 1 [95].

Pe perioada 20.05.1995-31.12.1999 s-au efectuat 433 fertilizari in vitro, din care au

rezultat 88 de sarcini (rata de sarcini: 20,32%).

Din acestea:

63 (71,59%) au fost sarcini unice;

8 (9,09%) – sarcini gemelare;

4 (4,54%) sarcini triple;

1 (1,13%) sarcina cvadrupla.

S-au inregistrat 12 avorturi (13,63%).

Take home baby rate: 17,55% (la momentul respectiv 76 sarcini erau in evolutie).

Rata implantarii: 21,24%.

Numarul de copii: 92

S-au grupat pacientele in functie de tipul sterilitatii: primara si secundara, respectiv

sterilitate de cauza masculina. Cauzele sterilitatii la pacientele care s-au adresat in cadrul acestui

centru sunt sumarizate in tabelul 4.1. Sterilitatea secundara tubara este in procent majoritar

(65,58% din cazuri), asa cum era si de asteptat, iar cea prin factor masculin se afla la un procent

< 10%. De asemenea este specificat in tabel si procentul pacientelor la care s-a inregistrat

sarcina.

Page 221: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

207

Tabel 4.1 - Statistica pe afectiuni

Patologie Paciente Gravide

Sterilitate primara tubara 69 (15,93%) 14 (15,90%)

Sterilitate secundara

tubara

284 (65,58%) 56 (63,63%)

Sterilitate primara

idiopatica

22 (5,08%) 6 (6,81%)

Sterilitate cu

endometrioza

15 (3,46%) 3 (3,40%)

Sterilitate secundara

andrologica

17 (3,92%) 2 (2,27%)

Sterilitate primara

andrologica

16 (3,69%) 5 (5,68%)

Sterilitate primara

hiperandrogenemica

10 (2,30%) 2 (2,27%)

Cele mai multe paciente care au intrat in protocoale terapeutice in vederea efectuarii

fertilizarii in vitro au fost cu varsta cuprinsa intre 36 si 40 de ani (32,56), conform tabelului 4.2.

Tabel 4.2 - Statistica pe grupe de varsta

Varsta < 30 ani 31-35 ani 36-40 ani 41-42 ani > 42 ani

Paciente 95 (22,40%) 127

(29,33%)

141

(32,56%)

47 (10,85%) 23 (5,31%)

Activitatea primilor 5 ani (1995-1999) a cuprins numai protocoale cu agonisti-GnRH. In

cadrul schemelor de stimularea ovariana s-a practicat long protocol sau short protocol (Tabel

4.3). Sunt amintite si preparatele cu care s-a realizat inhibitia hipofizei.

Cel mai des uzitat a fost long protocol. Dupa supresia hipofizara se incepe stimularea

ovariana cu gonadotropina, initial 3 fiole/zi – 3 zile, apoi 2 fiole/zi si ulterior se ajusteaza doza

functie de ecografie si profilul hormonal.

Page 222: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

208

In short protocol se incepe agonistul-GnRH in ziua a 2-a de ciclu menstrual si se continua

pana in ziua declansarii ovulatiei, gonadotropina se introduce in ziua a 4-a.

Gonadotropinele utilizate in cadrul acestor protocoale au fost: HMG, FSH-HPsi rFSH

(preparate comerciale: Pergonal, Humegon: 75 UI FSH + 75 UI LH; Metrodin: 75 UI FSH;

Puregon: 50, 100, 150, UI rFSH).

Tabel 4.3 Tipuri de stimulare folosite in Centrul de Fertilizare in Vitro de la Clinica Universitara

de Obstetrica-Ginecologie “Bega”

Mod de stimulare Paciente Gravide

Short protocol Agonist-GnRH (Uno

Enantone) + HMG

48 (11,08%) 7 (14,58%)

Short protocol Agonist-GnRH (Uno

Enantone) + FSH

28 (6,46%) 9 (32,14%)

Short protocol Agonist-GnRH doza zilnica

(Decapeptyl 0,1) + HMG

30 (6,92%) 10 (33,33%)

Short protocol Agonist-GnRH doza zilnica

(Decapeptyl 0,1) + FSH

104 (24,01%) 21 (20,19%)

Short protocol Agonist-GnRH doza zilnica

(Decapeptyl 0,1) + recFSH

22 (5,08%) 6 (27,27%)

Page 223: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

209

Long protocol Agonist-GnRH retard

(Zoladex)+ HMG

11(2,54%) 2 (18,18%)

Long protocol Agonist-GnRH retard

(Zoladex)+ FSH

56 (12,93%) 9 (16,07%)

Long protocol Agonist-GnRH retard

(Decapeptyl 3,75)+ HMG

25(5,77%) 6 (24%)

Long protocol Agonist-GnRH retard

(Decapeptyl 3,75)+ FSH

97 (22,40%) 14 (14,43%)

Long protocol Agonist-GnRH retard

(Decapeptyl 3,75)+ recFSH

12 (2,77%) 4 (33,33%)

In urma punctiei foliculare s-au recoltat la majoritatea pacientelor (48,26%) un numar de

ovocite cuprins intre 5-10, conform tabelului 4.4. La aceste pacientele au si survenit cele mai

multe sarcini.

Tabel 4.4 Numar de ovocite recoltate

Numar

ovocite

1-4 5-10 11-15 16-20 >20

Paciente 110

(25,40%)

209

(48,26%)

75 (17,32%) 30 (6,92%) 9 (2,07%)

Gravide 10 (9,09%) 42 (20,09%) 15 (20%) 17 (56,66%) 4 (44,44%)

Intreruperea ciclurilor de stimulare initiale s-a produs la 54 paciente (14,71%), datorita

urmatoarelor motive:

13 paciente au prezentat chiste ovariene

5 cazuri - datorita sindromului de hiperstimulare ovariana

41 de paciente nu au raspuns corespunzator la tratamentul aplicat.

Page 224: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

210

Sindromul de hiperstimulare ovariana s-a intalnit in statistica Centrului de Fertilizare in Vitro

si Embriotransfer al Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie “Bega”, Timisoara doar in

30 cazuri (pe perioada 1995-1999), acestea fiind forme usoare si medii. Nu s-au inregistrat forme

severe. La 1 caz cu torsiune de ovar chistic la 12 saptamani de gestatie s-a intervenit chirurgical

si s-a rezolvat pe cale laparoscopica. Sarcina a evoluat ulterior normal, pana la termen.

Aspecte de embriologie De la cele 433 de cazuri punctionate s-au recoltat 3070 ovocite. Luand in considerare

numarul de ovocite recoltate/caz, distributia este urmatoarea (Tabel 4.5):

Tabel 4.5 – Numar ovocite recoltate/caz

Nr.

ovocite/caz

1-3 4-7 8-11 12-15 16-20 >20

Nr. cazuri 65 169 88 72 30 9

Procent 15% 39% 20% 17% 7% 2%

Prelucrarea spermei a inclus metoda swim-up in caz de normospermie si metoda Percoll

in caz de oligospermie severa. Inseminarea ovocitelor s-a efectuat cu 100.000 spermii bine

mobile/godeu daca s-a folosit mediu Ham’s F10 si 60.000-80.000/godeu daca s-a folosit mediul

FIV Medicult, intr-un godeu existand 1-4 ovocite. Daca s-a folosit ca si mediu de cultura al

ovocitelor si embrionilor mediul FIV Medicult si inseminarea a fost cu 100.000 spermii/godeu s-

a sesizat aparitia unui procent maai ridicat de prezigoti cu 3 PN.

Referitor la calitatea spermei la cele 433 cazuri cu FIV, situatia a fost urmatoarea:

398 (92%) cazuri cu normospermie

35 (8%) cu oligoastenozoospermie.

Din punct de vedere statistic distributia pe numar de pacienti a acestui parametru se prezinta

astfel (Tabel 4.6):

Page 225: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

211

Tabel 4.6 - Distributia numarului de spermatozoizi din prelucrarea spermei / cazuri

Nr.

spermatozoizi

(milioane/ml)

0-10 11-20 21-40 41-70 71-100 > 100

Nr. cazuri 13 22 69 143 91 95

Procent 3% 5% 16% 33% 21% 22%

La interpretarea acestor date trebuie luat in considerare faptul ca majoritatea cuplurilor la

care s-a practicat FIV au prezentat infertilitate de cauza feminina

Urmatorul tabel 4.7 expune informatii referitor la volumul spermei recoltate. Statistic

situatia se prezinta astfel:

Tabel 4.7 – Volumul spermei recoltate/ cazuri

Volum < 2ml 2,1 - 4 ml 4,1 - 6 ml 6,1 - 8 ml > 8 ml

Nr. cazuri 65 207 130 21 9

Procent 15% 48% 30% 5% 2%

Fecundarea

La cele 433 cupluri s-au recoltat un total de 3070 ovocite. Din acest numar de ovocite

2501 (81,5%) s-au fecundat iar 568 (18,5%) au fost nefecundate. La cele 2501 ovocite

fecundate – 2311 (92,4%) au prezentat 2PN si 190 (7,6%) au prezentat 3PN.

La 5 din cazurile FIV nu s-a obtinut fecundare. 3 din aceste cazuri au fost cu

normospermie si s-au recoltat 4; 6 si respectiv 9 ovocite. In aceste cazuri se poate

suspiciona o cauza (genetica) legata de spermie (lipsa acrozomului?). La 2 din cazuri s-au

recoltat 7 si respective 8 ovocite, dar a existat factorul masculin reprezentat prin

oligoastenozoospermie (Tabel 4.8).

Page 226: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

212

Tabel 4.8 – Realizarea fecundarii la cazurile punctionate

Fecundatie

%/caz

0% <50% 51-70% 71-90% 91-100%

Nr.cazuri 5 17 106 149 156

Procent 1,15% 4% 24,5% 34,5% 35,85%

S-au efectuat constatari avand in vedere corelatia dintre ziua recoltarii si procentul de

fecundatie. Ovocitele recoltate in ziua 15 de stimulare s-au fecundat in procent de 95%, cele

recoltate in ziua a 16-a s-au fecundat in 89%, ovocitele recoltate in ziua 14 s-au fecundat in

procent de 82%. Numai 61% din ovocitele recoltate in ziua 12 si 13 au fost fecundate.

Daca au existat mai mult de 3 embrioni si recoltarea ovocitelor a fost in ziua 14 sau 15 de

stimulare, s-au cultivat embrionii pentru 72 ore (ajung in stadiul de 8 celule).

Daca numarul de embrioni a fost intre 1-3 s-au transferat in ziua a 2-a.

In mod obisnuit se transfera un numar ≤ 3 embrioni. La pacientele > 40 ani si daca au fost

disponibili mai multi embrioni s-au transferat si 4 embrioni.

Cu privire la calitatea embrionilor, marea majoritate au avut un ritm de dezvoltare

corespunzator, cu morfologie normala, dar au existat si embrioni cu blastomere inegale sau

fragmentate sau embrioni care au ramas in stadiul de 2 PN sau de zigot nesegmentat (Tabel 4.9).

Tabel 4.9 – Repartitia pe clase a embrionilor din punct de vedere al calitatii lor

Calitate

embrioni

Clasa I Clasa II Clasa III-IV Embrioni

opriti in

dezvoltare

Nr. embrioni 1394 370 246 41

Procent 68% 18% 12% 2%

La un numar mai mic de cazuri s-au cultivat embrionii in mediul FIV Medicult si numarul de

embrioni cu blastomere fragmentate a fost mai mare comparativ cu cei cultivati in mediul Ham’s

F10.

Page 227: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

213

Tabel 4.10 – Rezultatele cazurilor punctionate

Total cazuri

punctionate

Nr. cazuri cu fecundare

prezenta

Nr. cazuri cu ET realizat

Numar Procent Numar Procent

433 428 98,84% 428 98,84%

Rezultate In urma celor 428 de embriotransferuri s-au inregistrat 88 de sarcini.

Rata sarcinilor/embriotransfer: 20,32%.

La 34 gravide (38,65%) embriotransferul s-a efectuat a 2-a zi dupa punctie, cu embrioni in

stadiul de 2-4 blastomere.

La celelalte 54 gravide (61,36%) embriotransferul s-a efectuat la 72 ore dupa punctie, embrionii

avand in general 7-8 sau 8-12 blastomere.

Sarcina s-a instalat dupa primul embriotransfer la 61 paciente (69%) si la 15 paciente (17%)

sarcina a survenit dupa al 2-lea embriotransfer. Doar la 12 paciente (14%) sarcina s-a instalat

dupa a 3-a incercare.

Observatii

Daca se ia in considerare varsta pacientei, rezultatele sunt urmatoarele:

• 95 paciente au avut varsta < 30 ani (28%) si la 27 din ele (28 %) s-a instalat sarcina;

• 268 paciente au avut varsta intre 30-40 ani (65%) si din acest grup la 54 s-a instalat

sarcina (20,14%)

• 70 paciente (7%) au avut varsta > 40 ani si doar la 7 din ele (10%) a survenit sarcina.

Sarcina a survenit in procentul cel mai mare la pacientele tinere < 30 de ani.

Concluzii

La inaugurarea primului centru de FIV din Romania s-a inregistrat si primul success (prima

punctie s-a insotit de sarcina, urmata de nastere). Pe perioada celor 5 ani de activitate s-a

inregistrat o rata de graviditate prin FIV de 20,32%, comparabila cu a altor centre. Nu s-au

intalnit malformatii ale fetilor.

Page 228: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

214

Discutii

In urma rezultatelor obtinute in cadrul Centrului de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica,

Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie

„Bega” pentru o perioada de 5 ani de activitate se poate afirma ca rata de success este influentata

de mai multi factori:

• varsta pacientei - se considera ca sansele sunt mai mari la o varsta < 30 ani;

• tipul stimularii ovariene;

• numarul de ovocite recoltate, cifra optima fiind de 6-10 ovocite;

• calitatea si tipul mediului de cultura folosit;

• numarul de spermii bine mobile/godeu;

• ziua embriotransferulu; se considera optim embriotransferul la 72 ore.

Page 229: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

215

Capitolul 5

Crioconservarea

Capitolul 5.1

Crioconservarea si locul acesteia in cadrul reproducerii umane asistate

Definitia crioconservarii consta in pastrarea celulelor si a organismelor (in cazul

reproducerii asistate - embrioni) la temperaturi mai mici decat temperatura de congelare (de

obicei la –196°C), situatie in care sunt oprite toate procesele metabolice celulare. Initial

crioconservarea s-a aplicat experimental si dupa ce s-au obtinut sarcini la animale, utilizand

celule care au fost congelate/ decongelate, s-a trecut si la om [192].

Din punct de vedere istoric primele sarcini care s-au obtinut utilizand celule

crioconservate (si anume spermatozoizi) au fost in anul 1953. Spermatozoizii au fost pastrati la

gheata, la - 80°C si s-a utilizat glicerolul ca agent crioprotector [193].

Cercetarile experimentale ulterioare s-au extins si prin congelarea/ decongelarea ovarelor de

soareci si sobolani, care au fost transplantate de la un animal la altul, s-a obtinut ovulatie si

gestatie [194], [195].

Tehnicile de crioconservare au parcurs etape de dezvoltare, celulele fiind conservate in

azot lichid (la - 196°C), astfel ca la un deceniu dupa raportarea primelor sarcini obtinute prin

folosirea spermatozoizilor congelati/ decongelati s-au comunicat primele sarcini care au utilizat

spermii crioconservate in azot lichid [196].

Mai mult, in 1984, s-a nascut primul copil obtinut din decongelarea unui embrion in stadiul de 8

celule, care a fost transferat intrauterin (1984 - Queen Victoria Hospital, Melbourne, Australia)

[197].

Desigur ca si aceasta metoda de pastrare a celulelor a starnit multiple controverse, atat

din punct de vedere medical, cat si etic, religios si legal. In functie de legile existente in fiecare

tara se pot crioconserva gametii feminini si masculini, tesut ovarian, tesut testicular, celule in

stadiul de prezigoti (cu 2 pronuclei), embrioni, blastocisti. Se considera ca prin crioconservarea

celulelor in stadiul de 2PN fata de crioconservarea embrionilor se pot evita o serie de aspecte

Page 230: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

216

etice, sociale, morale si religioase legate de acest procedeu. Pe de alta parte s-a ajuns la concluzia

ca rata poliploidiilor este crescuta la sarcini ce au fost obtinute din ovocite crioconservate (atat la

animale, cat si la om) [198], [199].

Crioconservarea este aplicata pe scara larga in urma efectuarii tehnicilor de reproducere

umana asistata si se motiveaza necesitatea ei pe baza urmatoarelor aspecte:

• existenta mai multor ovocite sau embrioni /ciclu FIV;

• permite evitarea unei noi stimulari si implicit reduce costul acesteia;

• creste rata sarcinii / pacienta / punctie (sau per ciclu);

• permite evitarea sindromului de hiperstimulare ovariana.

Se ridica uneori si probleme legate de factorul masculin (numarul de spermatozoizi

poate fi variabil de la o recoltare la alta, cu fluctuatii mari) sau partenerul este absent in

ziua inseminarii ovocitelor. In aceste situatii este utila crioconservarea spermiilor din

ejaculat. In cazul unei azoospermii cunoscute se impune recoltarea spermiilor prin biopsie

testiculara si este justificata crioconservarea spermatozoizilor, pentru a evita punctii

testiculare repetate.

Capitolul 5.2

Efecte fizice in cursul congelarii

Congelarea per se consta in formarea cristalelor de gheata in citoplasma. Prin cedarea

energiei termice o celula sufera un proces de racire, temperatura ajunge la punctul de inghet si il

poate depasi, fara a se produce cristalizarea (fenomen denumit in literatura de specialitate

„supercooling”).

Formarea spontana a cristalelor extracelular va determina o crestere usoara a temperaturii

datorita energiei termice ce se elibereaza prin formarea cristalelor. Ulterior, temperatura atinge

din nou temperatura de inghet. Dupa o perioada de echilibru termic (temperatura mediului fiind

mai scazuta, acesta absoarbe energia termica eliberata), va predomina temperatura scazuta, astfel

incat procesul de racire continua.

Declansarea cristalizarii in mediul extracelular se produce la valori termice de -3°C

-5°C si in mediul intracelular are loc la -10°C.

Page 231: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

217

Datorita discrepantei intre punctele de inghet ale mediilor intra- si extracelulare, apa

intracelulara va fi cedata mediului extracelular printr-un gradient osmotic. Tot mai multa apa

extracelulara va cristaliza, iar electrolitii din mediul extracelular se vor concentra. In concluzie,

acest proces favorizeaza supravietuirea celulara la scaderi in continuare ale temperaturii,

formandu-se cantitati mici de cristale intracelular, ce nu lezeaza celulele (proces denumit

„rescuable ice formation”). Absenta acestui proces se insoteste de formarea intracelulara de

cristale de gheata, urmate de degradarea celulei (denumirea incetatenita in literatura este „lethal

intracelular ice formation”) [200].

Factorii de care depinde lezarea celulei in cadrul procesului de congelare si decongelare

sunt [201]:

• specia (umana, animala);

• stadiul celular;

• crioprotectori (tipul si concentratia lor);

• viteza de congelare si de decongelare;

• amorsarea cristalizarii;

• temperatura la care se introduce in azot lichid.

Deteriorarea celulara trebuie evitata in cursul congelarii prin evitarea formarii cristalelor

de gheata intracelular, care se produc in intervalul de temperatura - 15°C si - 60°C. Dar si cu

ocazia decongelarii celulele vor parcurge acest interval, insa in sens invers [202].

Afectarea celulara in cadrul congelarii/ decongelarii rapide

La viteze mari de congelare se produce cristalizarea intracelulara, dar in echilibru

osmotic (celulele isi pastreaza forma). Cu cat viteza de congelare este mai mare, cu atat se

formeaza mai multe cristale mici. La o temperatura mai mica de - 90°C cristalele se afla intr-un

stadiu dezorganizat. Incalzirea de la - 90°C la - 40°C induce fenomenul de recristalizare, astfel

incat cristalele se aglomereaza si cresc in dimensiuni.

Cristalele mici au o energie de suprafata mare, au tendinta de a scade aceasta energie

superficiala prin scaderea suprafetei, astfel incat se produce cresterea si aglomerarea cristalelor si

au loc distrugeri membranare si lezare celulara.

Recristalizarea necesita timp, necesitand o viteza de decongelare mai scazuta.

La o decongelare rapida se trece peste acest interval de timp critic, nu apare recristalizarea si nu

apar modificari importante in structura cristalelor [200].

Page 232: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

218

Leziuni celulare in cadrul congelarii lente

Cristalizarea intracelulara este exclusa daca 90% din apa intracelulara a fost cedata

mediului, fenomen ce necesita insa timp. Celulele sunt expuse o perioada indelungata unor

conditii hipertone. Dupa cristalizare, apa cedata mediului extern determina concentrarea

intracelulara a sarurilor.

Se considera ca exista o agresiune asupra lipidelor si lipoproteinelor membranare prin

concentratia crescuta de electroliti, cu formare de discontinuitati membranare, care la

decongelare permit liza osmotica a celulei printr-o crestere a permeabilitatii membranare.

O alta ipoteza presupune producerea de mici leziuni la nivelul membranei celulare in

cursul deshidratarii (de la un anumit volum celular), care ulterior permit liza osmotica in cursul

decongelarii.

In concluzie, procesul de congelare rapida necesita si o decongelare rapida (pentru

evitarea recristalizarii), respectiv congelarea lenta este urmata de o decongelare lenta (pentru

evitarea lizei osmotice).

Leziuni celulare prin fenomenul de „supercooling”

Punctul de inghet al majoritatii mediilor se situeaza intre - 3°C / -5°C. „Supercooling”

reprezinta fenomenul de depasire al acestui punct, astfel incat se ajunge la - 12°C sau

temperaturi mai scazute, fara aparitia cristalizarii.

Pentru evitarea fenomenului de „supercooling” se induce cristalizarea la - 3°C / - 6°C,

(adica imediat la temperaturi aflate sub punctul de inghet). Inducerea cristalizarii extracelulare si

initierea procesului de deshidratare se produce prin atingerea solutiei/ introducerea unui

instrument racit (tija/ bagheta la al carei capat temperatura este mai scazuta). Fenomenul a primit

denumirea de „insamantare” („seeding”).

Viteza optima de congelare este cea la care se evita formarea intracelulara de cristale, dar

care este suficienta pentru a expune cat mai putin celulele unor efecte de liza.

[124], [200], [201].

Termenul „racire” se refera la scaderea temperaturii de la valoarea temperaturii camerei

la 5°C si cel de „congelare” se refera la scaderea temperaturii de la 5°C la - 30°C.

Page 233: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

219

Rata de racire a unei celule depinde de permeabilitatea celulei si de raportul dintre

suprafata si volum. De exemplu in cazul ovocitului, care este o celula mare, rata optima de racire

este < 1°C / minut.

Capitolul 5.3

Substantele crioprotectoare

Crioprotectorii sunt substante care prin adaugarea lor incearca sa protejeze celulele in

procesul de inghet. Ele sunt reprezentate de: glicerol, zaharoza, polivinilpirolidona (PVP),

dimetilsulfoxid (DMSO), 1-2 propandiol. Ca si caracteristici generale - sunt substante cu greutate

moleculara mica, sunt miscibile cu apa si penetreaza usor celula. Ele se adauga in solutie in

concentatii de 1 pana la 2 molar. Protectia celulara se obtine prin efectul acestora de deshidratare

celulara produsa inainte de congelare, prin efectul hiperton pe care il creaza in mediul de

congelare. De obicei timpul de expunere la crioprotectori este de 10-20 minute.

Crioprotectorii se impart in 2 clase: substante penetrante si nepenetrante.

penetrante (sunt cel mai des folosite; exemple de crioprotectori penetranti sunt

DMSO si glicerolul). Sunt substante hidrofile, cu un efect puternic deshidratant. Efectul lor este

de scadere a punctului de inghet, astfel la 1 mol DMSO temperatura se va reduce de la -10°C la -

35°C / -45°C, permitand intarzierea cristalizarii si astfel ramane mai mult timp pentru

deshidratarea intracelulara, in special in cazul congelarii lente. Efectul lor consta probabil in

legarea apei intracelulare si cedarea ei la temperaturi mai scazute, astfel incat se ajunge abia

atunci la concentratii critice de electroliti;

nepenetrante (exemplul este PVP – care este relativ toxic; alt crioprotector

nepenetrant este sucroza). Efectul lor consta in extragerea apei intracelulare (deshidratare) si

astfel se scade concentratia electrolitilor extracelulari. Prin urmare ei cauzeaza o scadere a

punctului de congelare si astfel temperatura la care mediul intracelular va ingheta este mult mai

redusa. Totodata se reduce si concentratia absoluta a sarurilor ce raman in solutia/mediul

necongelat si se evita „efectul de solutie”. Acest efect este nociv prin alterarea structurii

Page 234: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

220

membranare (lipide si lipoproteine) la o expunere celulara indelungata intr-un mediu cu

concentratii crescute de saruri.

Efectele adverse ale crioprotectorilor sunt cele de toxicitate pentru PVP, iar glicerolul si

DMSO pot interfera cu Na+/K+ ATP-aza (la anumite concentratii).

Este important ca in cadrul decongelarii sa se indeparteze crioprotectorul prin spalari

succesive.

Amorsarea cristalizarii are loc prin procesul de „insamantare” („seeding”) cu urmatoarele

efecte:

• scurteaza fenomenul de supercooling;

• cristalizarea extracelulara se induce la temperaturi usor scazute sub punctul de inghet.

Ca si metode se descriu:

• adaugarea crioprotectorului, echilibrare la 0°C, introducerea eprubetelor cu celule intr-o baie

la -6°C / -7°C ; dupa 5-10 min. se introduce o bucata de gheata, ce va induce cristalizarea;

• amorsarea cristalizarii printr-un instrument in prealabil racit;

• cu eprubete la al caror capat exista o tija in “L”; la extremitatea inferioara a acesteia se atinge

o temperatura mult mai scazuta (10-20 K) si se produce amorsarea cristalizarii.

Crioconservarea in sistem deschis (este varianta moderna) consta in plasarea eprubetelor

deasupra unui recipient cu azot lichid la -196°C . Starea de vapori a azotului de la suprafata

lichidului are temperaturi tot mai mari pe masura cresterii distantei fata de suprafata lichidului.

Eprubetele se vor deplasa cu o anumita viteza spre recipientul cu azot lichid, unde in final vor fi

scufundate. Decongelarea nu necesita aparatura speciala, produsul congelat se trece direct din

azot lichid intr-o baie de apa la 20°C / 30°C. Ulterior, prin diluare, se indeparteaza o cantitate de

crioprotector si se urmareste microscopic viabilitatea celulara.

Celulele intacte se cultiva 30 min. - 3 ore in mediul specific, dupa care se mai observa

inca o data microscopic. Celulele cu pronuclei se vor folosi ulterior pentru transferul intrauterin.

Nu s-au observat anomalii (scindare ADN, aberatii numerice sau morfologice

cromozomiale) la nivelul celulelor dupa crioconservare.

Crioconservarea se aplica pentru: ovocite mature/ imature, celule in stadiul de 2 PN,

embrioni (!), spermatozoizi.

Se descriu multiple protocoale pentru congelare, cat si pentru decongelare (manual sau

computerizat) si care includ timpi si viteze diferite pentru aceste procese.

Page 235: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

221

Capitolul 5.4

Crioconservarea celulara

Crioconservarea spermatozoizilor a fost anticipata de Spallanzani in 1776, care a observat

pentru prima data ca spermatozoizii isi pastreaza motilitatea dupa ce au fost expusi la temperaturi

scazute. Prima sarcina dupa inseminare intrauterina ce a folosit spermatozoizi decongelati a fost

obtinuta in 1953 [124], [193], [201].

Indicatiile crioconservarii spermatozoizilor sunt:

• neoplazie ce necesita radio- si chimioterapie si care este urmata de sterilitate;

• sterilizare chirurgicala (vasectomie);

• tulburari de ejaculare;

• absenta partenerului in ziua efectuarii inseminarii intrauterine, FIV, ICSI;

• variatii largi ale calitatii spermei;

• donatori/ banci de sperma.

Crioconservarea spermatozoizilor din tesutul testicular se recomanda in cazul tumorilor

testiculare, a biopsiei testiculare in cazul azoospermiei sau pentru evitarea unei noi biopsii.

Fara crioprotectori supravietuirea celulara este de < 15%, ceea ce implica necesitatea

adaugarii de substante crioprotectoare, care scad mult punctul de inghet, mentin pH-ul, scad

concentratia electrolitilor. Se utilizeaza glicerol in concentratie de 5-10%. Adaugarea

crioprotectorului se face treptat, pentru a preveni hiperosmolaritatea, a minimaliza leziunile si a

evita deshidratarea celulara severa. Spermatozoidul are o permeabilitate crescuta la glicerol, care

este dependenta de temperatura [203].

Dupa decongelare se urmareste viabilitatea spermatozoizilor, motilitatea, capacitatea de

fecundare. S-a constatat ca:

• motilitatea spermatozoizilor este afectata dupa decongelare, in special la spermograme cu

oligo/ astenospermie;

• morfologia spermatozoizilor consta in afectarea membranei acrozomiale si a portiunii

terminale [204];

Page 236: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

222

• referitor la capacitatea de fecundare si rata sarcinilor: nu exista studii edificatoare (se

compara sperma proaspata si cea decongelata de la acelasi individ). Diversele studii ofera

concluzii contradictorii [205].

Se stie insa ca procesele de congelare si decongelare actioneaza negativ asupra unei

spermograme deja alterate [206].

Se pot folosi substante ce optimizeaza presiunea osmotica si pH-ul, previn contaminarea

bacteriana si stabilizeaza membrana celulara, denumite „extender” sau substante cu rol in

stabilizarea membranei celulare (de ex. galbenus de ou) si care poarta denumirea de

„cryobuffer”.

Procesul de congelare utilizeaza 2 metode: tehnica cu vapori (sistem deschis) sau in

tehnica in sistem computerizat.

Procesul de congelare cu vapori: consta in plasarea orizontala a tuburilor 15 min la 35 cm

deasupra nivelului lichidului, apoi inca 15 min la 15 cm, dupa care se scufunda in azot lichid la -

196°C.

Congelarea in sistem computerizat are urmatoarele etape: racirea cu 1°C/min pana la 5

°C; congelarea cu o viteza de 10°C/min pana la -80°C si apoi de 25°C/min pana la -130°C, unde

se mentine o ora, dupa care se scufunda in azot lichid la -196°C.

Decongelarea consta in plasarea recipientelor cu sperma la 37°C timp de 10 min (in cazul

procesului de congelare cu vapori) sau la temperatura camerei timp de 10 min (pentru sistemul

computerizat). Se indeparteaza crioprotectorul si se analizeaza sperma si se prepara pentru

inseminare intrauterina, FIV, ICSI.

Si aici este valabil ca o congelare rapida obliga la o decongelare rapida, respectiv o

congelare lenta - la o decongelare lenta.

Crioconservarea ovocitelor implica unele aspecte etice, juridice. Se indica in:

• afectiuni oncologice (inainte de radio- si chimioterapie);

• in caz de interventii chirurgicale terapeutice pentru afectiuni benigne ale ovarului;

• terapie ce afecteaza ovarul, de exemplu in endometrioza.

Rata sarcinilor/transfer este mult scazuta (4-5%) fata de celule cu 2 PN. S-a constatat si

ca rata poliploidiei este crescuta deoarece apar modificari la nivelul granulelor corticale si

Page 237: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

223

membrana devine permisiva pentru spermatozoizi, se produce liza membranara, apar modificari

ale zonei pellucida. Polispermia si poliploidia se pot evita prin aplicarea ICSI [198].

Se studiaza crioconservarea ovocitelor imature (rezultate bune se inregistreaza dupa

ICSI) si a tesutului ovarian [207].

S-a observat ca in cazul crioconservarii ovocitelor imature in stadiul de vezicula

germinala apare o protectie a cromozomilor (care se afla in profaza primei diviziuni meiotice si

sunt protejati de o membrana nucleara). Ulterior aceste celule au fost decongelate si maturate in

vitro iar dupa fertilizarea in vitro s-a ajuns la dezvoltare embrionara si la obtinerea de sarcini.

Aceste rezultate au fost obtinute doar la animale [208].

In cazul cercetarilor la om, maturarea in vitro a ovocitelor imature care au fost congelate

si ulterior decongelate a intampinat numeroase dificultati [209].

Crioconservarea celulara in stadiul de 2 pronuclei (2PN) prezinta unele avantaje, si

anume:

• schimbul osmotic este mai rapid si expunerea la crioprotector este mai scurta (5 - 10 min fata

de 30 - 90 min - ca in cazul ovocitelor);

• rata supravietuirii este mai crescuta;

• se evita o noua recoltare de sperma.

Crioconservarea embrionilor presupune de obicei congelarea embrionilor de ziua a 2-a.

Rata de supravietuire si rata ciclurilor la care s-a efectuat un ET este mai scazuta decat cea a

ciclurilor cu celule cu 2PN [210], [211].

Discutii

Observatiile si discutiile privind rolul crioconservarii se refera asupra obtinerii unei

sarcini folosind celule crioconservate. Asa cum am prezentat se pot utiliza gameti, celule deja

fecundate (stadiul de prezigot) sau embrioni. Locul si avantajele utilizarii crioconservarii in

cadrul reproducerii umane asistate sunt redate schematizat :

• se poate creste rata sarcinii/ ciclu FIV;

• se evita sindromul de hiperstimulare ovariana;

• se evita o noua punctie foliculara si se scad implicit costurile;

• este importanta in ICSI;

Page 238: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

224

• permite diagnosticul preimplantational.

Conform datelor din literatura - rata sarcinilor, evolutia acestora si rata nasterilor este

comparabila in cazul tehnicilor reproducerii asistate ce folosesc embrioni proaspeti fata de cei

crioconservati si decongelati.

Crioconservarea, dupa unele tehnici noi ca ICSI, poate ridica cateva probleme (prin

injectarea spermatozoidului se pot produce lezari ale zonei pellucida si ale oolemei, care sa

permita modificari in pasajul apei si a crioprotectorilor). Rezultatele dupa FIV si ICSI ale

diferitelor studii ofera date comparabile referitoare la rata implantarii si rata sarcinilor.

In sensul acestor consideratii teoretice am intentionat efectuarea unei analize comparative

a crio-ciclurilor pentru o perioada de 3 ani (1999-2000-2001) si rezultatele (numarul sarcinilor

obtinute) prin embriotransferul cu celule decongelate. Au fost luate in studiu celule care au

provenit din cicluri FIV si ICSI anterioare, la care in protocoalele de stimulare s-au administrat

agonisti-GnRH sau antagonisti-GnRH. Am cautat si posibile efecte asupra calitatii celulare

produse de cele 2 clase de substante; efecte care se pot repercuta in sensul unui numar mai scazut

de sarcini. Celulele crioconservate au fost in stadiul de 2PN si la decongelare s-a urmarit

viabilitatea celulara si ulterior diviziunea acestora. Pacientele la care s-au urmarit acesti

parametri au fost tratate in cadrul Departamentului de Fertilizare in Vitro din cadrul Clinicii

Universitare de Ginecologie, Heidelberg, Germania.

Embriotransferul cu celule decongelate s-a efectuat fie in ciclu spontan, dupa o prealabila

monitorizare a folicolului dominant corelat cu secretia de estradiol, a cresterii endometriale si a

determinarilor peak-ului de LH, in vederea stabilirii momentului optim (ET se efectueaza de

regula la 3 zile dupa detectarea peak-ului de LH).

Pentru pacientele la care s-a considerat efectuarea unui ciclu substituit hormonal, s-au

administrat preparate cu estrogen, in scopul pregatirii endometrului. O schema cuprinde

administrarea de estradiol valerat (2 mg): 2 tablete/zi pentru zilele 3-6 de ciclu menstrual, apoi

cresterea la 3 tablete/ zi pentru perioada zilelor 7-10, urmata de o noua ajustare a dozei la 4

tablete/zi din ziua 11 a ciclului menstrual. Doza de estrogen se adapteaza inainte de

embriotransfer si se adauga progesteron intravaginal. Aceasta medicatie estro-progestativa se

administreaza in continuare si dupa ET (in dozele stabilite de medic) si in cazul prezentei sarcinii

– pana la 12 saptamani de amenoree. De obicei se asociaza si progesteron injectabil

Page 239: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

225

(intramuscular-50 mg/zi) cu 2 zile anterior ET, care se continua de asemenea pana la

determinarea testului de sarcina, respectiv pana la 12 saptamani de amenoree in cazul existentei

sarcinii.

Exista si alte scheme de pregatire hormonala a endometrului, ce cuprind fie stimulari cu

gonadotropine (injectabil) sau chiar o supresie hipofizara prin administrarea din faza

medioluteala a ciclului menstrual a unui agonist-GnRH. Cand s-a realizat supresia (verificata

prin control ecografic si hormonal) se reduce doza de agonist-GnRH si se incepe o terapie de

substitutie cu 2 mg/zi estradiol valerat (oral) timp de 6 zile, apoi se creste doza la 4 mg/zi alte 4

zile, cu o noua crestere la 6 mg/zi timp de 4 zile, ca apoi sa se reduca doza la 4 mg/zi din ziua a

14-a. Administrarea de progesteron decurge din ziua a 15-a si se dubleaza dupa ziua a 17-a.

Embriotransferul se efectueaza in ziua 17 a ciclurilor stimulate [212].

Page 240: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

226

Capitolul 5.5

Rezultatele dupa decongelarea celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu agonisti-GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata

a. Material si metoda

In anul 1999 - 141 de paciente s-au prezentat pentru embriotransfer (ET) cu celule

provenite din crioconservare (crio-ET). Varsta lor medie a fost de 34,531 ani, cu extremele de 44

si de 24 de ani, mediana – 35 ani si deviatia standard – 4,071. Numarul de paciente din anul 2000

a fost comparabil cu cel anterior (143 de paciente) si se remarca o usoara crestere in anul 2001 a

numarului de paciente (160) care au solicitat embriotransfer cu celule decongelate provenite in

urma ciclurilor FIV si ICSI anterior. Din tabelul de mai jos (Tabel 5.5.1) se poate constata o

suprapunere a varstei pacientelor si in ceea ce priveste varsta medie, extremele varstelor

pacientelor incluse in lotul de studiu precum si mediana (care este de 35 de ani in calculul pentru

cei 3 ani insumati).

Tabel 5.5.1 – Parametrul varsta in cazul pacientelor care au efectuat crio-ET

An Nr.

paciente

Varsta

medie

(ani)

Varsta

maxima

(ani)

Varsta

minima

(ani)

Mediana

(ani)

Deviatia

standard

1999 141 34,531 44 24 35 4,071

2000 143 33,993 43 22 34 4,030

2001 160 33,918 44 24 35 4,572

Total - 3

ani

444 34,137 44 22 35 4,245

Embriotransferul a fost efectuat la paciente fie in ciclu spontan fie in ciclu stimulat

hormonal (susbtituit). S-au efectuat in acest sens determinari hormonale serice, cu evaluarea

parametrilor estradiol si LH pentru stabilirea momentului optim al ET.

Page 241: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

227

In tabelul 5.5.2 sunt exemplificate valorile estradiolului seric (pg/ml) comparativ pentru fiecare

an si, ulterior, pentru perioada celor 3 ani insumati.

Tabel 5.5.2 – Valorile pentru estradiolul seric (pg/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si

stimulate

Estradiol

seric

(pg/ml)

An

Valoare

medie

Valoare

maxima

Valoare

minima

Mediana

Deviatia

standard

1999 188,340 501 4 168 91,083

2000 327,615 750 24 303 140,269

2001 318,844 656 89 299 129,622

Total - 3

ani

280,850 750 4 257 137,565

In acelasi sens s-a dozat si valoarea serica a LH-ului (Tabel 5.5.3).

Tabel 5.5.3 – Determinarea LH-ului seric (mUI/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si stimulate

LH seric

(mUI/ml)

An

Valoare

medie

Valoare

maxima

Valoare

minima

Mediana

Deviatia

standard

1999 3,750 47 0,1 1,6 6,233

2000 18,764 70,5 0,2 14,2 15,339

2001 21,761 83,6 0,7 17 15,620

Total - 3

ani

15,223 83,6 0,1 11,4 15,412

b. Rezultate/ anul 1999

Page 242: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

228

Din punctul de vedere al numarului de crio-cicluri, in anul 1999 au fost 14 crio-cicluri

spontane si 116 crio-cicluri stimulate efectuate. In alte 11 cazuri la care s-a initiat tratamentul

hormonal de pregatire a endometrului nu s-a putut realiza embriotransferul, deoarece la

decongelare toate celulele au fost degenerate. Deci, totalul de crio-cicluri stimulate initiate a fost

de 127.

Din crio-ciclurile spontane in 9 cazuri (64,28%) celulele decongelate au provenit din

FIV, in 4 cazuri (28,57%) au provenit din cicluri ICSI si in 1 caz (7,14%) din GIFT. In ciclurile

de provenienta a celulelor congelate si ulterior decongelate s-au folosit protocoale cu agonisti si

rFSH in 12 cazuri (85,71%), HMG la 1 pacienta (7,14%) si combinarea rFSH + HMG intr-o

situatie (7,14%).

Degenerarea celulara in cadul procesului de decongelare s-a constatat in 4 situatii

(28,57%) (degenerare doar a unor celule cu 2 PN, astfel incat ET a fost realizabil). Aceste cazuri

au avut celule crioconservate cu provenienta din cicluri anterioare FIV. La aceste cicluri FIV in

protocoalele de stimulare s-a utilizat rFSH la 3 paciente si HMG la o pacienta.

Referitor la crio-ciclurile substituite (stimulate hormonal), din cele 127 initiate, doar la

116 s-a realizat ET. Diferenta de 11 paciente o reprezinta cazurile la care in cadrul decongelarii

au degenerat toate celulele, nemaipermitand ET. Din totalul de 127 de cazuri cu crio-cicluri

substituite la un numar de 68 de cazuri (53,54%) celulele au provenit din cicluri anterioare FIV

iar la 55 de cazuri (43,30%) – din cicluri anterioare ICSI. In 4 situatii (3,14%) nu sunt precizate

protocoalele de stimulare si procedura tehnicii de reproducere asistata in cazul provenientei

celulelor congelate. Analizand din protocoalele de stimulare de provenienta se constata ca s-au

utilizat produsele de rFSH in 108 cazuri (85,03%), HMG in 6 cazuri (4,72%), FSH-HP in 4

cazuri (3,14%), rFSH+HMG : 4 cazuri (3,14%), rFSH+HMG+FSH-HP: 1 caz (0,78%). La 4

paciente nu sunt date despre protocoalele de stimulare (3,14%).

Degenerarea celulara dupa decongelare a fost intalnita in 59 de cazuri (46,45%), din care

in 39 de situatii celulele au provenit din cicluri FIV anterioare si in 19 situatii din cicluri ICSI

anterioare. La 1 pacienta nu se precizeaza metoda de reproducere asistata utilizata. Protocoalele

de stimulare au folosit in 49 de situatii rFSH, la 4 paciente – HMG, la 3 paciente rFSH+HMG, la

1 pacienta: FSH-HP, la 1 caz : rFSH+HMG+FSH-HP si 1 caz este neprecizat.

Page 243: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

229

Observatii

Din aceste date se observa pentru crio-ciclurile din anul 1999 o preponderenta a ciclurilor

FIV si a rFSH utilizat in schemele de stimulare ovariana controlata.

In total la crio-ciclurile din 1999 s-a constatat deteriorare celulara la decongelare in 63 de

cazuri din cele 141 de paciente initiale, reprezentand un procent de 44,68%.

c. Rezultate/ anul 2000

In anul 2000 s-au initiat un total de 143 de crio-cicluri. La 1 pacienta s-a interupt crio-

ciclul pe motivul cresterii insuficiente a endometrului, nefiind urmat de decongelare celulara. In

alte 11 cazuri nu s-a efectuat ET din cauza degenerarii tuturor celulelor cu 2 PN decongelate.

Un numar initial de 43 de paciente au solicitat ET in crio-ciclu spontan, doar la 41 de

paciente s-a realizat ET iar in 2 situatii degenerarea celulara la decongelare nu a mai permis ET.

Celulele crioconservate si decongelate au provenit in 23 de cazuri (53,48%) din cicluri anterioare

FIV, in 19 situatii din cicluri anterioare ICSI (44,18%) si la 1 pacienta – din GIFT (2,32%).

Protocoalele de stimulare ovariana controlata au inclus rFSH la 34 de paciente (79,06%), HMG

la 7 paciente (16,27%) si rFSH+HMG in 2 cazuri (4,65%).

In ceea ce priveste degenerarea celulara la decongelare (doar a unor celule sau a tututor

celulelor), ea a fost intalnita in 18 situatii (41,86%); dintre acestea in 9 cazuri celulele au

provenit din cicluri anterioare FIV si in 9 cazuri din cicluri anterioare ICSI. Pentru cazurile in

care s-a intalnit deteriorare la decongelare s-a remarcat ca in 14 situatii s-a utilizat rFSH in

stimularea pentru ciclurile de provenienta celulara, in 2 situatii – HMG si in 2 cazuri -

rFSH+HMG.

Crio-ciclurile substituite hormonal au fost in total de 99, dar pe motivul deteriorarii

tuturor celulelor in urma decongelarii numai la 90 de paciente s-a putut efectua ET. Ciclurile de

provenienta au fost FIV in 57 de cazuri (57,57%), ICSI in 40 de situatii (40,40%) (din acestea 2

ICSI-TESE) si la 2 cazuri (2,02%) nu sunt precizate aceste date. Medicatia de stimulare ovariana

controlata in aceste cicluri de provenienta a utilizat rFSH la 85 de paciente (85,85%), HMG la 9

paciente (9,09%), FSH-HP la 1 caz (1,01%) si rFSH +HMG la 2 paciente (2,02%). In alte 2

cazuri (2,02%) nu se specifica aceste date.

Page 244: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

230

Din totalul de 99 de crio-cicluri substituite - la 55 de paciente (55,55%) s-a remarcat

alterare celulara dupa decongelare. In aceste situatii celulele crioconservate au provenit in 30 de

cazuri din cicluri FIV si in 25 de cazuri din cicluri ICSI. Dintre gonadotropinele folosite in

stimularile ovariene din ciclurile de provenienta (urmate de alterare celulara la dezghetare) s-a

folosit rFSH in 48 de cazuri, HMG la 5 paciente si rFSH+HMG la 2 paciente.

Observatii

Ca si pentru anul 1999, crio-ciclurile din anul 2000, atat cele spontane cat si substituite,

au avut celule ce au provenit in majoritate din cicluri anterioare FIV iar rFSH a fost preferat in

protocoalele de stimulare ovariana controlata.

In ansamblu - la 73 de paciente (51,40%) din totalul de 142 de paciente cu crio-cicluri

(am exclus acea pacienta la care s-a abandonat crio-ciclul pe motivul endometrului subtire) se

constata deteriorare celulara in urma decongelarii. Degenerarea celulara se refera la o parte din

celulele decongelate sau la intregul numar de celule dezghetate.

d. Rezultate/ anul 2001

Pentru anul 2001 au fost incluse initial in lotul de studiu un numar de 160 de paciente, la

care urma sa se efectueze ET cu celule decongelate, care au provenit din cicluri cu agonisti

GnRH. Spre deosebire de grupul de paciente din anul 2000, nu au fost abandonari de crio-cicluri

pe motiv al cresterii necorespunzatoare a endometrului. In total in 13 situatii nu s-a realizat

embriotransferul pe motivul alterarii celulare integral la decongelare.

Crio-ciclurile spontane au fost in numar de 60 (initiale) si 56 realizate efectiv (cu

embriotransfer efectuat). La 4 paciente s-a constatat la decongelare o degradare a tututor

celulelor. Din aceste paciente – in 35 de cazuri (58,33%) celulele au provenit din cicluri

anterioare FIV si 25 (41,66%) din cicluri ICSI (dintre care 1 TESE). La aceste cicluri de

provenienta s-au administrat in protocoalele de stimulare rFSH in 47 din cazuri (78,33%), HMG

– 12 cazuri (20%) si rFSH+HMG in 1 situatie (1,66%).

Degenerare la decongelare s-a constatat la 31 de cazuri (a uneia, mai multor sau a tuturor

celulelor cu 2PN) si doar la 4 paciente nu s-a ajuns la finalitatea procedurii (adica la ET). Aceste

31 de cazuri de deteriorare celulara au provenit din 20 cicluri anterioare FIV si 11 cicluri

Page 245: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

231

anterioare ICSI. S-a utilizat la aceste paciente in ciclul de stimulare rFSH in 27 de cazuri; HMG

in 3 cazuri si rFSH+HMG la 1 pacienta.

Numarul de crio-cicluri substituite hormonal a fost initial de 100, dar numai la 91 de

paciente s-a finalizat prin ET. In 9 cazuri celulele alterate la decongelare nu au mai permis ET.

Ciclurile de origine a celulelor congelate/decongelate au fost cicluri FIV la 67 de paciente (67%);

cicluri ICSI la 30 de paciente (30%) (dintre care - 1 TESE) si in 3 cazuri – GIFT (3%). Ciclurile

de origine au folosit ca schema de stimulare ovariana rFSH in 88 de situatii (88%), HMG in 10

cazuri (10%) si FSH-HP la 2 paciente (2%).

In urma decongelarii celulelor cu 2PN s-a remarcat la 44 din cazuri prezenta deteriorarii a

unora sau a tuturor celulelor, la 9 paciente din numarul total fiind alterare celulala in totalitate.

Celulele degenerate au provenit din cicluri anterioare FIV in 27 de cazuri si ICSI in 17 cazuri;

respective protocoalele de stimulare ovariana controlata au cuprins rFSH la 38 de paciente, HMG

la 4 paciente si FSH-HP la 2 paciente.

Observatii

Efectuand calculul in ansamblu la cele 160 de paciente care au fost incluse in crio-cicluri

(spontane si substituite hormonal) pentru anul 2001 se remarca ca la 75 dintre ele a fost prezenta

deteriorare celulara la decongelare (a uneia sau mai multor celule cu 2PN), reprezentand un

procent de 46,87%. Ca si in anii anteriori, ciclurile FIV de origine a celulelor crioconservate au

predominat fata de ciclurile ICSI, iar GIFT s-a intalnit intr-un numar extrem de redus de

paciente. Protocoalele de stimulare ovariana controlata pentru ciclurile de origine a celulelor

crioconservate au utilizat rFSH in procent covarsitor.

Page 246: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

232

Capitolul 5.6

Rezultatele dupa decongelare a celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu antagonisti-GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata

a. Material si metoda

Am considerat acelasi mod de interpretare al rezultatelor pentru pacientele cu crio-cicluri,

care au fost incluse in studiu pentru anii 1999-2000-2001, dar de aceasta data cu crio-ET efectuat

cu celule crioconservate provenite din cicluri ce au avut in protocoalele lor antagonisti-GnRH.

Ca si o observatie, numarul de paciente care au solicitat crio-ET a fost in continua

crestere de la un an la altul, dar semnificativ in numar mai redus fata de crio-ciclurile cu celule

crioconservate ce au provenit din cicluri anterioare si au utilizat in protocoalele lor agonisti-

GnRH. Numarul total de crio-cicluri din antagonisti-GnRH (reprezentat de 69 de paciente) este a

sasea parte din numarul pacientelor cu crio-cicluri din agonisti-GnRH, fiind 444.

Parametrul varsta (varsta medie, mediana, limitele extreme) este superpozabil in cele 2

tabele cu crio-cicluri (utilizand celule crioconservate din cicluri de origine cu agonisti-GnRH,

respectiv antagonisti-GnRH) (Tabel 5.6.1).

Tabel 5.6.1 – Parametrul varsta in cazul pacientelor care au efectuat crio-ET

An Nr.

paciente

Varsta

medie

(ani)

Varsta

maxima

(ani)

Varsta

minima

(ani)

Mediana

(ani)

Deviatia

standard

1999 17 34,058 40 24 35 4,534

2000 23 35,957 40 30 36 2,961

2001 29 33,655 42 27 33 3,647

Total - 3

ani

69 34,521 42 24 35 3,771

Page 247: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

233

Ca si pentru crio-ciclurile cu celule originare din protocoale cu agonisti-GnRH, in cazul

de fata am analizat si momentul optim de efectuare al ET (atat pentru crio-cicluri spontane cat si

pentru cele substituite hormonal) prin prisma analizelor hormonale. Au fost incluse aici

determinarile serice ale estradiolului (pg/ml) si a LH-ului (mUI/ml) (Tabel 5.6.2 si Tabel 5.6.3).

Tabel 5.6.2 – Valorile pentru estradiolul seric (pg/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si

stimulate

Estradiol

seric

(pg/ml)

An

Valoare

medie

Valoare

maxima

Valoare

minima

Mediana

Deviatia

standard

1999 246,812 568 97 189,5 145,514

2000 339 1038 145 227 215,018

2001 282,931 486 118 291 100,538

Total - 3

ani

293,397 1038 97 258 159,452

Tabel 5.6.3 – Determinarea LH-ului seric (mUI/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si stimulate

LH seric

(mUI/ml)

An

Valoare

medie

Valoare

maxima

Valoare

minima

Mediana

Deviatia

standard

1999 4,293 21 0,1 1,7 6,230

2000 19,260 64,6 0,1 13,4 17,669

2001 27,517 231 2,3 18,5 41,176

Total - 3

ani

19,260 231 0,1 13,2 30,046

Page 248: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

234

b. Rezultate/ anul 1999

Crio-ciclurile din anul 1999 au fost in numar de 17, dintre care 1 caz crio-ciclu spontan si

15 cazuri de crio-cicluri substituite hormonal. La 1 pacienta s-a abandonat si nu s-a mai efectuat

ET pe motivul cresterii insuficiente a endometrului, nu s-a mai produs nici decongelarea

celulelor cu 2PN. La restul de 16 crio-cicluri initiate s-a reusit efectuarea ET, deci nu a existat

alterarea tuturor celulelor dupa dezghetare.

Crio-ciclul spontan a utilizat celule provenite din ciclu FIV anterior si folosind in schema

sa de stimulare ovariana controlata rFSH, pe langa protocolul cu antagonist-GnRH. In acest crio-

ciclu nu s-a constatat degenerare celulara la decongelare.

Crio-ciclurile substituite hormonal au avut celule crioconservate cu origine in cicluri FIV

in 8 cazuri (53,33%) si cicluri ICSI in 7 cazuri (46,66%). Stimularea ovariana controlata in

ciclurile de origine a folosit rFSH pentru 14 paciente (93,33%) si FSH-HP la 1 caz (6,66%).

Din aceste crio-cicluri in 5 situatii a aparut degenerare celulara in urma dezghetarii si

aceste celule au provenit din 3 cicluri FIV si 2 cicluri ICSI, respectiv gonadotropinele pentru

stimularea ovariana au fost rFSH in 4 situatii si FSH-HP la 1 pacienta.

Observatii

Aceste date furnizeaza informatii despre “comportamentul” celulelor crioconservate la

decongelare si ciclurile lor de provenienta, incercand o relationare intre substantele folosite in

protocoalele de stimulare si modificarile ce apar in procesul dezghetarii. Ciclurile de

provenienta majoritare au fost FIV si rFSH a fost preferata pentru stimularea ovariana controlata.

La numarul total de 16 paciente (a fost exclusa pacienta la care s-a interupt crio-ciclul din cauza

cresterii necorespunzatoare a endometrului) s-au constatat doar 5 cazuri de deteriorare celulara,

care reprezinta un procent de 31,25%.

c. Rezultate/ anul 2000

Anul 2000 a inregistrat un numar de 23 de paciente la care s-au initiat crio-cicluri, si

anume la 8 paciente a fost vorba de crio-ciclu spontan; la 15 paciente – crio-ciclu substituit

Page 249: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

235

hormonal si doar in 3 cazuri din total nu s-a realizat ET din cauza degradarii celulare integral

dupa dezghetare.

Cele 8 paciente la care s-a inceput crio-ciclul spontan au avut celulele cu origine in

cicluri anterioare FIV in 2 cazuri (25%) si cicluri anterioare ICSI in 6 situatii (75%). Pentru

aceste cicluri de origine s-au administrat gonadotropine de tipul rFSH la 6 paciente (75%) si

rFSH+HMG la 2 paciente (25%). La 1 pacienta nu s-a efectuat ET (toate celulele degenerate),

deci au fost doar 7 cazuri care s-au finalizat prin ET.

Degenerarea celulara la decongelare s-a remarcat doar in 2 cazuri (unul fiind cu

deteriorarea tuturor celulelor); acestea au provenit din ciclu FIV la 1 pacienta si din ciclu ICSI in

celalalt caz, ambele situatii au avut in schema de stimulare ovariana rFSH.

Pentru cele 15 cazuri de crio-cicluri substituite initiate s-au decongelat celule de

provenienta din 12 (80%) cicluri FIV anterioare si 3 cicluri ICSI anterioare (20%). Toate

cazurile au folosit in protocolul de stimulare ovariana controlata rFSH (100%).

La decongelare s-a remarcat ca in 2 cazuri din 15 paciente s-au deteriorat toate celulele si

nu s-a mai efectuat ET iar la alte 9 paciente a fost o alterare doar a unora din celulele dezghetate,

deci in total au fost 13 ET. Prezenta degenerarii celulare s-a constatat la celule care au provenit

din 9 cicluri FIV si 2 cicluri ICSI anterioare, toate ciclurile de stimulare ovariana au avut in

schema lor rFSH.

Observatii

Calculand in ansamblu din cele 23 de paciente care au fost incluse in studiul crio-

ciclurilor, la 13 dintre ele s-a intalnit degradare celulara in cadrul dezghetarii, reprezentand un

procent de 56,52%. Aceste celule au provenit din 10 cicluri FIV anterioare si 3 cicluri ICSI

anterioare. Deci, si pentru anul 2000, ciclurile de provenienta majoritare au fost cele FIV si

gonadotropina cea mai des uzitata din cadrul stimularii a fost rFSH.

d. Rezultate/ anul 2001

Pentru anul 2001 numarul de paciente a caror rezultate au fost luate in calcul a fost de 29.

Din acest total de 29 crio-cicluri initiate, doar in 3 situatii nu s-a finalizat prin ET datorita

degradarii celulare complete prin decongelare.

Page 250: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

236

Crio-ciclurile spontane initiate au fost in numar de 9 si doar 8 realizate (1 caz cu

degenerare celulara totala la decongelare). Celulele dezghetate au fost cu origine din 4 cicluri

FIV anterioare (44,44%) si 5 cicluri anterioare ICSI (55,55%), iar gonadotropinele din protocolul

de stimulare au fost rFSH la 6 paciente (66,66%) si HMG in 3 situatii (33,33%).

Degenerare celulara (totala sau partiala) prin decongelare s-a intalnit in aceste crio-cicluri

in 4 cazuri; 3 fiind cu celule de origine din cicluri FIV si 1 caz – ciclu anterior ICSI.

Gonadotropinele din protocoalele de stimulare au fost rFSH pentru 3 paciente si HMG pentru 1

pacienta.

Crio-ciclurile substituite hormonal s-au aplicat la 20 de paciente, doar 18 s-au finalizat cu

ET. Celulele crioconservate au provenit din 10 cicluri FIV anterioare (50%) si 10 cicluri ICSI

anterioare (50%) (din care 1 TESE). Protocoalele din ciclurile de stimulare au fost cu

antagonisti-GnRH si rFSH pentru toate cele 20 de paciente (100%).

Prin decongelare s-a produs alterarea unora dintre celule sau a tuturor in 11 cazuri; celule

care au provenit din 6 cicluri FIV anterioare si 5 cicluri ICSI anterioare. La toate aceste 11

paciente schemele de stimulare ovariana au administrat rFSH.

Observatii

Calculul degenerarii celulare (partial sau complet) prin dezghetare la toate cele 29 de

paciente cu crio-cicluri/ anul 2001 este de 15 cazuri, semnificand un procent de 51,72%. Celulele

crioconservate au fost cu origine majoritatea in cicluri anterioare FIV si rFSH a fost administrat

preponderent pentru stimularea ovariana.

Page 251: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

237

Capitolul 5.7

Discutii crioconservare

Schematizand intr-un tabel (Tabel 5.7.1) datele procentuale ale deteriorarii celulare in

urma procedeului de decongelare a celulelor in functie de substantele administrate in

protocoalele de origine, respectiv agonisti-GnRH versus antagonisti-GnRH, se obtin urmatoarele

rezultate:

Tabel 5.7.1 – Alterarea celulara prin decongelare (exprimata procentual) in functie de agonist-

GnRH versus antagonist-GnRH

Substanta din protocolul de origine An Degradare

celulara

(%)

Agonist-GnRH Antagonist-GnRH

1999 44,68 31,25

2000 51,40 56,52

2001 46,87 51,72

Analiza acestui tabel reda comparativ pentru cei 3 ani procentul constatat dupa

dezghetare a celulelor crioconservate degradate si se observa ca nu exista discrepante majore

intre aceste date. In anul 1999 procentul crio-ciclurilor cu agonisti-GnRH in ciclurile de origine a

celulelor este ceva mai crescut decat pentru ciclurile cu antagonisti-GnRH. O explicatie se poate

gasi si prin faptul ca in 1999 s-a inregistrat cel mai mic numar de paciente cu crio-

cicluri/antagonisti-GnRH din intregul lot studiat. Pentru urmatorii 2 ani insa crio-

ciclurile/antagonisti-GnRH inregistreaza un procent usor crescut fata de crio-ciclurile/agonisti-

GnRH. In cadrul aceleiasi clase de substante administrate in protocoalele de origine (atat pentru

agonisti cat si pentru antagonisti) se remarca ca in anul 2001 apare o scadere a procentului de

alterare prin decongelare.

Page 252: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

238

Am calculat rata de supravietuire celulara la decongelare pe perioada celor 3 ani

insumati, atat pentru crio-ciclurile care au provenite din protocoale anterioare cu agonisti-GnRH,

respectiv cu antagonisti-GnRH.

Supravietuire celulara la decongelare/ crio-cicluri cu protocoale anterioare cu agonisti-GnRH:

67,82%

Supravietuire celulara la decongelare/ crio-cicluri cu protocoale anterioare cu antagonisti-GnRH:

67,04%.

Cele doua rezultate sunt similare!

Rezultatele arata ca in cazul crioconservarii efectele de degradare asupra celulelor

sunt strict dependente de procesele de congelare/ decongelare, iar analogul GnRH ( agonistii-

GnRH sau antagonistii-GnRH) din protocoalele de origine a celulelor nu are nici o influenta

asupra calitatii celulelor.

Page 253: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

239

Capitolul 5.8

Concluzii crioconservare

Rezultatul final al acestor crio-cicluri (spontane sau substituite hormonal) il reprezinta de

fapt obtinerea unei sarcini. O problematica a acestei teze de doctorat o alcatuieste intrebarea

referitoare la influenta agonistilor-GnRH versus antagonisti-GnRH asupra calitatii celulare (a

celulelor crioconservate), si in special la degradarea acestora in urma decongelarii, la care se

adauga deteriorarea prin procesul dezghetarii per se.

Voi reda comparativ numarul de sarcini obtinute in urma decongelarii celulelor

crioconservate din cicluri de origine ce au cuprins in protocoalele lor agonisti-GnRH sau

antagonisti-GnRH, cu referiri si asupra tehnicilor de reproducere asistata si a gonadotropinelor

administrate in stimularea ovariana (Tabel 5.8.1 si Tabel 5.8.2).

Sarcini /crio-cicluri care au provenit din protocoale cu agonisti-GnRH

In anul 1999 s-au obtinut din crio-cicluri un numar total de 16 sarcini, dintre care 5 au

fost avorturi spontane; 2 sarcini extrauterine si 9 s-au finalizat prin nasteri. Din sarcinile avortate

– 1 a fost o sarcina tripla. Din sarcinile care au evoluat pana la nastere – 1 sarcina a fost

gemelara, 1 sarcina a prezentat malformatie fetala si la 1 pacienta (sarcina gemelara) s-a depistat

la unul dintre feti cu trisomie 21 (s-a efectuat embrioreductie la acel produs de conceptie si s-a

nascut un copil normal).

Numarul de sarcini din anul 2000 a fost de 18; dintre care 3 avorturi spontane, 1 sarcina

extrauterina, 14 nasteri (dintre care 3 gemelare). Doar la 1 nou-nascut s-a descris o malformatie

izolata (keilognatoskizis).

In anul 2001 s-au inregistrat un numar de 34 de sarcini, evolutia lor fiind distribuita

astfel: 8 sarcini biochimice, 7 avorturi spontane (1 avort gemelar), 19 nasteri (dintre care 4

gemelare, 1 tripla).

Page 254: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

240

O scurta analiza a acestor date releva faptul ca numarul de sarcini a fost in continua

crestere de la un an la altul si ciclurile FIV de origine a celulelor crioconservate au fost egale

intr-un an si in rest mai numeroase fata de ciclurile ICSI. Dintre gonadotropinele administrate in

stimulare s-a preferat rFSH; restul tipurilor de gonadotropine au fost in numar comparabil.

Tabel 5.8.1 – Numarul de sarcini din crio-cicluri/ agonisti-GnRH

An 1999 2000 2001

Nr. crio-cicluri 141 144 (143) 160

Nr. sarcini 16 (11,34%) 18 (12,58%) 34 (21,25%)

1 2 12

15 15 22

0 1 0

Crio spontan

Crio substituit

Neprecizat

8 (5,67%) 11 (7,69%) 24 (15%)

8 (5,67%) 6 (4,19%) 10 (6,25%)

FIV

ICSI

Neprecizat 0 1 (0,69%) 0

Tip gonadotropina

14 17 30

2 0 1

0 0 3

RFSH

FSH-HP

HMG

Neprecizat 0 1 0

Sarcini / crio-cicluri care au provenit din protocoale cu antagonisti-GnRH

Pentru anul 1999 la cele 17 paciente din lotul de studiu s-a obtinut un numar de 2 sarcini,

din acestea 1 a fost biochimica si la celalalt caz s-a inregistrat un avort spontan.

Anul 2000 inregistreaza la cele 23 de paciente incluse in studiu, la care s-au efectuat ET

cu celule crioconservate provenite din cicluri cu antagonisti-GnRH in protocoalele de origine, un

numar de 6 sarcini. Evolutia acestora a fost de 3 avorturi spontane si 3 nasteri (cu feti unici).

Page 255: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

241

In anul urmator – 2001 – la cele 29 de crio-cicluri initiate s-a obtinut un numar de 7

sarcini; dintre acestea 2 au fost avorturi spontane si 5 s-au finalizat prin nastere (1 nastere

gemelara).

Tabel 5.8.2 – Numarul de sarcini din crio-cicluri/ antagonisti-GnRH

An 1999 2000 2001

Nr. crio-cicluri 17 23 29

Nr. sarcini 2 (11,76%) 6 (26,08%) 7 (24,13%)

0 2 2

2 4 5

Crio spontan

Crio substituit

1 (5,88%) 4 (17,39%) 3 (10,34%) FIV

ICSI 1 (5,88%) 2 (8,69%) 4 (13,79%)

Tip gonadotropina

1 6 5

1 0 0

RFSH

FSH-HP

HMG 0 0 2

Ca si pentru crio-ciclurile cu celule de provenienta din protocoale cu agonisti-GnRH, in

acest tabel ce analizeaza datele din crio-cicluri/ antagonisti-GnRH se remarca ca numarul de

sarcini este in crestere de la un an la altul, dar numarul lor este mai mic comparativ cu acelasi an

si cu crio-ciclurile/ agonisti-GnRH. Pentru procedurile de reproducere asistata aplicate nu se

poate trage o concluzie, deoarece variaza de la un an la altul si in sensul cresterii si al scaderii

numarului tehnicilor FIV fata de ICSI. Totusi rFSH din medicatia de stimulare ovariana este mai

des administrata fata de celelalte gonadotropine.

Figura 5.8.1 ilustreaza comparativ numarul sarcinilor obtinute in urma crio-ciclurilor care

au folosit celule crioconservate cu provenienta din cicluri cu agonisti-GnRH fata de cele cu

antagonisti-GnRH.

Page 256: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

242

0

5

10

15

20

25

30

35

1999 2000 2001

Nr sarcini criocicluri/agonisti-GnRHNr sarcini criocicluri/antagonisti-GnRH

Fig. 5.8.1 - Numarul sarcinilor din crio-cicluri cu agonisti-GnRH versus antagonisti-GnRH

Este evident ca din cele exemplificate numarul sarcinilor obtinute folosind celule

crioconservate din cicluri anterioare cu agonisti-GnRH in schema de stimulare il depaseste pe cel

utilizand celule crioconservate cu originea din cicluri cu antagonisti-GnRH. Totusi trebuie facut

si comentariul referitor la numarul pacientelor carora li s-a administrat agonist-GnRH si de

asemenea este mai mare fata de lotul pacientelor cu antagonisti-GnRH.

Importanta este rata sarcinilor/crio-ciclu; rata sarcinilor/ET si „baby take home rate”.

Am ilustrat comparativ numarul de sarcini raportat la numarul de crio-cicluri pentru

pacientele la care s-au administrat agonisti-GnRH (Tabel 5.8.3), respectiv antagonisti-GnRH

(Tabel 5.8.4) in ciclurile de origine ale celulelor crioconservate.

Baby take home rate repezinta numarul de copii nascuti vii raportat la numarul de crio-

ET efectuate.

16 18

34

2 6

7

Page 257: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

243

Tabel 5.8.3 – Rata sarcinilor crio-cicluri/ agonisti-GnRH

An Nr. crio-

cicluri (din

agonisti-

GnRH)

ET

realizat

Nr. total

sarcini

Sarcini/

crio-cicluri

(%)

Sarcini/

ET

(%)

Baby

take

home

rate

(%)

1999 141 130 16 11,34 % 12,30% 7,69

2000 143 131 18 12,58% 13,74% 12,97

2001 160 147 34 21,25% 23,12% 17,00

Tabel 5.8.4 – Rata sarcinilor crio-cicluri/ antagonisti-GnRH

An Nr. crio-

cicluri (din

antagonisti-

GnRH)

ET

realizat

Nr. total

sarcini

Sarcini/

crio-cicluri

(%)

Sarcini/

ET

(%)

Baby

take

home

rate

(%)

1999 17 16 2 11,76% 12,50% 0

2000 23 20 6 26,08% 30,00% 15

2001 29 26 7 24,13% 26,92% 23,07

Un alt parametru este compararea efectuata intre rezultatele (numarul de sarcini) obtinute

in urma ciclurilor de stimulare ce au utilizat analog-GnRH in schema lor si celule crioconservate

provenite din cicluri anterioare cu analogi-GnRH. Comparatia se realizeaza in cadrul aceluiasi

tip de substanta – agonist sau antagonist-GnRH. Tabelul 5.8.5 ilustreaza procentual rata

sarcinilor/ciclu de stimulare respectiv rata sarcinilor/crio-cicluri din protocoale de stimulare ce

au in schema lor agonisti-GnRH si din crio-cicluri cu provenienta celulara in cicluri anterioare cu

agonist-GnRH. Aceleasi date obtinute sunt redate (tot procentual) referitor la rata sarcinilor/ET

cu embrioni proaspeti si cu embrioni proveniti din celule cu 2PN decongelate si baby take home

Page 258: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

244

rate. Tabelul 5.8.6 cuprinde aceleasi comparatii dar efectuate in cadrul clasei antagonistilor-

GnRH.

Tabel 5.8.5 – Rezultate comparative intre protocoale de stimulare cu agonisti-GnRH si crio-

cicluri/ agonisti-GnRH

Agonisti-GnRH Crio-cicluri cu protocoale

anterioare cu agonisti-

GnRH

Rata sarcinilor/cicluri 21,51% 15,31%

Rata sarcinilor/ET 25,68% 16,66%

Baby take home rate 13,82%. 12,74%

Tabel 5.8.6 – Rezultate comparative intre protocoale de stimulare cu antagonisti-GnRH si crio-

cicluri/ antagonisti-GnRH

Antagonisti-GnRH Crio-cicluri cu protocoale

anterioare cu antagonisti-

GnRH

Rata sarcinilor/cicluri 11,40% 21,73%

Rata sarcinilor/ET 12,78% 24,19%

Baby take home rate 7,38% 14,51%

Similar cu rezultatele din studiile publicate, numarul de sarcini obtinute folosind

embrioni proaspeti este mai mare fata de cele ce au utilizat embrioni proveniti din celule cu 2PN

criocongelate. Acest rezultat este valabil in cadrul clasei agonistilor-GnRH. Asa cum am

remarcat in urma rezultatelor procentuale ale supravietuirii celulare la decongelare, agonistii- si

antagonistii-GnRH nu au influente diferite asupra calitatii celulare si efectele fizice din cadrul

congelarii/ decongelarii sunt cele care dicteaza rata de supravietuire.

Datele obtinute in cazul antagonistilor-GnRH nu sunt in acelasi sens, situatie in care crio-

ciclurile dovedesc o rata mai buna a sarcinilor cu celule crioconservate (valori de 2 ori mai mari

fata de ciclurile initiale de stimulare !). Acest fapt poate fi interpretat si prin prisma unui numar

mult mai mic al ciclurilor cu antagonisti care au fost efectuate - atat protocoalele de stimulare cu

Page 259: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

245

antagonisti cat si crio-ciclurile care au provenit din aceste protocoale au fost mult mai reduse ca

numar fata de cele cu agonisti-GnRH.

Analiza statistica (utilizand acelasi model aplicat si pentru calculele anterioare)

evidentiaza faptul ca ET cu celule crioconservate se repercuta negativ asupra ratei sarcinilor,

fiind un parametru semnificativ statistic, cu valoarea lui p < 0,0001.

Analysis Of Initial Parameter Estimates Standard Wald 95% Chi- Parameter DF Estimate Error Confidence Limits Square Pr > ChiSq kryo 1 -1.0334 0.3977 -1.8128 -0.2540 6.75 0.0094 Embrtran 1 0.7522 0.1276 0.5020 1.0023 34.74 <.0001 Scale 0 1.0000 0.0000 1.0000 1.0000

Analysis Of GEE Parameter Estimates Empirical Standard Error Estimates Standard 95% Confidence Parameter Estimate Error Limits Z Pr > |Z| kryo -1.0332 0.4072 -1.8314 -0.2351 -2.54 0.0112 Embrtran 0.7517 0.1052 0.5455 0.9578 7.15 <.0001

Page 260: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

246

Capitolul 6

Concluzii generale

1. Analogii-GnRH ca substante derivate din structura hormonului hipotalamic GnRH si-au

gasit aplicabilitatea si in reproducerea umana asistata. Introducerea acestor substante in

protocoalele de stimulare ovariana controlata au imbunatatit considerabil rezultatele tehnicilor

reproducerii asistate prin efectul lor de supresie hipofizara, astfel evitatandu-se ovulatiile

necontrolate.

2. Sinteza agonistilor-GnRH (prin inlocuirea cel mai frecvent a 2 aminoacizi din pozitiile 6

si 10 ale decapeptidul moleculei native de GnRH) a fost urmarea fireasca a descoperirii structurii

si a sintezei hormonului. In schimb, pentru sinteza antagonistilor-GnRH (in sensul unor substante

cu efecte secundare minime si cu un profil farmacocinetic sigur) a fost necesara o perioada de

aproape 30 de ani. Astfel, pentru agonistii-GnRH exista o experienta de utilizare mai bogata

comparativ cu antagonistii-GnRH.

3. Substantele agoniste au fost concepute pentru a determina o stimulare hipofizara mai

accentuata, respectiv a antagonistului pentru a exercita un efect inhibitor asupra hipofizei

(« hipofizectomie » medicamentoasa) si astfel asupra secretiei gonadotropilor. S-a constatat insa

ca in cazul administrarii continue a agonistului-GnRH, dupa o faza initiala de stimulare

hipofizara (efectul de ″flare-up″), se obtine un efect supresiv hipofizar. Aceste efecte ale

analogilor-GnRH au fost exploatate in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana controlata din

tehnicile reproducerii asistate. Schemele cu antagonisti-GnRH insa implica o durata mai redusa a

protocolului si prin urmare si costuri mai scazute ale medicatiei de stimulare administrate.

4. Motivele pentru care introducerea antagonistului-GnRH in protocoalele reproducerii

asistate nu a reusit sa devanseze rezultatele (rata sarcinilor) obtinute in urma aplicarii agonistilor-

GnRH nu sunt pe deplin cunoscute si se efectueaza cercetari care incearca gasirea unor explicatii

(vezi efectele asupra hormonilor sexuali, IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, IGFBP-4 si PAPP-A).

5. Faptul ca antagonistul-GnRH presupune o durata de stimulare ovariana mai scurta si doza

totala a medicatiei gonadotropinice este mai redusa, poate avea efecte asupra numarului de

ovocite recoltate si deci si a embrionilor obtinuti (posibil uneori mai scazut in cazul

antagonistilor-GnRH fata de agonisti-GnRH).

Page 261: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

247

6. Din studiul efectuat pe cei 3 ani pentru pacientele care au parcurs cicluri de stimulare

ovariana in cadrul protocoalelor cu agonisti-GnRH si cu antagonisti-GnRH reiese ca varsta

pacientei este un parametru important. Fiecare an in plus scade probabilitatea obtinerii unei

sarcini care se finalizeaza prin nastere. Parametrul varsta este semnificativ statistic.

7. Distributia pacientelor in functie de varsta la grupul cu agonisti-GnRH este comparabila

(in urma analizei statistice) cu varsta pacientelor din lotul cu antagonisti-GnRH. Se remarca in

general o preponderenta a pacientelor cu varsta situata peste 35 de ani, usor mai crescut in grupul

cu antagonisti-GnRH (41,61% versus 35,81%). Aceasta diferenta se poate explica prin faptul ca

pacientele au apelat initial la protocoale cu agonisti-GnRH. Esecul reproductiv sau alta indicatie

au condus la cea de-a 2-a optiune terapeutica (protocoalele cu antagonisti-GnRH).

8. Gonadotropinele utilizate in medicatia de stimulare ovariana controlata au fost rFSH,

HMG, FSH-HP sau combinarea a 2 sau chiar 3 dintre ele. Pentru amandoua tipurile de analogi-

GnRH a predominat in protocoalele de stimulare rFSH, urmat de HMG (procente comparabile),

nefiind inregistrate date semnificative statistic.

9. Este cunoscut in literatura faptul ca protocoalele cu antagonisti-GnRH au o durata mai

scurta si ca gonadotropinele utilizate in stimulare se administreaza in doza totala mai mica

comparativ cu schemele cu agonisti-GnRH. Aceleasi concluzii se desprind si din studiul actual,

insa se considera ca diferentele dintre durata totala a stimularii si cantitatea totala a

gonadotropinelor nu au repercusiuni asupra succesului (nasterea), neavand influenta

semnificativa statistic.

10. In cadrul lotului de paciente cu antagonist-GnRH am remarcat o supresie hipofizara

insuficienta pentru protocolul francez, adica in cazul administrarii unei doze unice de antagonist.

Astfel ca pentru actualul studiu se considera ca rezultate mai bune se obtin printr-o administrare

repetitiva a antagonistului-GnRH, ca si in protocolul Lübeck.

11. Valorile medii ale estradiolului seric in cazul pacientelor ce li s-a administrat agonist-

GnRH sunt cu aproximativ 500 pg/ml mai crescute fata de pacientele din lotul cu antagonist-

GnRH, aspect care se coreleaza cu durata de stimulare gonadotropinica mai lunga. Nu este inca

clar definit daca valoarea estradiolului seric are impact covarsitor asupra ratei obtinerii sarcinilor.

De altfel nici incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana nu se coreleaza intotdeauna cu

valori mari ale estradiolului seric. Datele analizei actuale se suprapun peste datele din literatura.

Page 262: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

248

12. Monitorizarea serica a LH-ului este utila in depistarea cresterii premature a LH-ului.

Pentru studiul de fata protocoalele cu agonisti-GnRH au avut in 0,48% din cazuri valori ale LH

>10 UI/l, iar pentru antagonisti-GnRH procentul a fost de 2,68%. Conform studiilor se considera

pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH ca realizarea supresiei hipofizare marcate in ziua a 8-a

de stimulare se insoteste de o rata mai mare a sarcinilor si de evolutivitate a acesteia. Pentru

valori ale LH-ului < 0,5 UI/l in ziua a 8-a de stimulare se constata cea mai mare rata de

implantare si apoi de sarcina in evolutie

13. Frecventa aparitiei sindromului de hiperstimulare ovariana este similara pentru cele 2

tipuri de substante: 3,48% in cazul agonistilor versus 3,35% pentru antagonisti-GnRH, amandoua

protocoalele au utilizat HCG pentru inducerea ovulatiei.

14. Numarul folicolilor dominanti nu a variat semnificativ in cadrul celor 2 loturi de

paciente; in cazul agonistilor-GnRH numarul mediu si mediana folicolilor dominate au fost 3,80

si 4 comparativ cu 3,93 si 3 pentru antagonisti-GnRH.

15. Calculul statistic referitor la cele 2 tehnici aplicate in cadrul reproducerii asistate: FIV si

ICSI pentru lotul de paciente arata ca metoda ICSI a inregistrat un succes mai redus, dar acest

parametru nu este semnificativ statistic. O posibila explicatie a succesului mai mic in cazul ICSI

fata de metoda FIV se poate datora indicatiilor procedurii ICSI - in caz de esec reproductiv prin

FIV, infertilitate idiopatica, factor masculin cu afectare severa. Toate aceste situatii se insotesc

obisnuit si frecvent de rate scazute de fertilizare.

16. Analiza cazurilor releva ca numarul de cicluri ICSI a crescut de la un an la altul, dar

acestea raman totusi mai putine fata de FIV conventionala.

17. Tehnicile de reproducere asistata au avut aproximativ aceeasi distributie procentuala

pentru succesul ciclurilor de stimulare (obtinerea sarcinilor), indiferent de analogul-GnRH

administrat (FIV/ET : 65,92% pentru agonist versus 70,58% pentru antagonist ; respectiv ICSI :

34,07% din protocoale cu agonist versus 29,41% din protocoale cu antagonist).

18. Punctiile foliculare s-au insotit de un numar mediu al ovocitelor, comparabil intre cele 2

tipuri de protocoale (agonisti- si antagonisti-GnRH). Este deosebit de importanta concluzia

desprinsa din aceasta analiza, si anume ca protocolul cu antagonisti-GnRH nu influenteaza in

sens negativ numarul si calitatea ovocitelor recoltate/punctie foliculara.

19. In urma fecundarii, numarul de celule cu 2PN arata aceleasi rezultate in cadrul

protocoalelor cu agonisti-GnRH, cat si cu antagonisti-GnRH. Astfel incat se deduce ca

Page 263: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

249

antagonistul nu are efecte nefavorabile asupra procesului de fecundare, acesta depinzand de

multipli factori.

20. Embriotransferul s-a efectuat la lotul de paciente cu un numar intre 1 si maxim de 3

embrioni. Pentru fiecare embrion in plus transferat se creste semnificativ statistic probabilitatea

obtinerii unei sarcini.

21. Repetarea ciclurilor de stimulare ovariana controlata la aceeasi pacienta a condus la

concluzia ca a 2-a incercare are o rata de succes mai mica decat prima si la o a 3-a incercare

sansa de succes creste usor. Avand in vedere ca nu toate pacientele au parcurs acelasi numar de

cicluri de stimulare si nu exista in acest sens un model unitar, nu se poate considera

semnificativa statistic aceasta corelatie. Totusi este de remarcat aceasta diferenta fata de datele

furnizate de grupul Norfolk care arata o crestere a probabilitatii succesului de la primul la cel de-

al saselea ciclu pentru aceeasi pacienta (pag. 59).

22. Din compararea rezultatelor obtinute in urma administrarii agonistilor-GnRH si a

antagonistilor-GnRH in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana, rezultate care se refera la rata

sarcinilor/cicluri; rata sarcinilor/punctie; rata sarcinilor/ET; rata implantarii si baby take home

rate, se remarca ca pentru toti acesti parametri valorile procentuale sunt mai crescute in cazul

agonistilor-GnRH. Aceste rezultate se inscriu in statisticile internationale si au semnificatia unui

impact mai bun al agonistului-GnRH asupra succesului (obtinerea sarcinii si finalizarea prin

nastere).

23. O analiza comparativa a protocoalelor cu agonist-GnRH si antagonist-GnRH din cadrul

acestui studiu releva faptul ca antagonistul-GnRH are totusi efect negativ asupra succesului si

este considerat semnificativ statistic, cu valoarea lui « p » putin peste limita 0,05.

24. Daca se considera ca standardul pentru succesul in cadrul reproducerii asistate este

nasterea unui singur copil viu si sanatos/ciclu FIV initiat (BESST : Birth Emphasizing a

Successful Singleton at Term) [191] – atunci pentru grupul cu agonist-GnRH rezultatul este de

10,94% si pentru pacientele la care s-a aplicat protocolul cu antagonist - de 5,37%. Comparativ

cu o statistica pe anul 2001 a Centrului de Fertilizare in Vitro Monash – Australia, valoarea

obtinuta pentru agonist-GnRH se apropie de datele din literatura.

25. Incidenta anomaliilor constatate la studiul de fata este de 3,35% pentru sarcinile obtinute

din protocoalele cu agonist-GnRH si de 5,88% in cazul protocoalelor cu antagonist-GnRH. In

interpretarea acestor procente intra si varsta pacientelor ( in 3 cazuri > 35 de ani), prezenta

Page 264: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

250

sarcinii multiple si foarte dificil de estimat – tipul procedurii aplicate (in cazul ICSI). Valorile

procentuale ale incidentei anomaliilor se incadreaza intre limitele din literatura de specialitate.

26. Reversibilitatea rapida a functiei hipofizei dupa oprirea medicatiei antagoniste lasa loc

altor posibilitati terapeutice, care sa scada riscul sindromului de hiperstimulare ovariana. Astfel

ca o alta aplicatie a agonistului-GnRH se refera la declansarea ovulatiei in loc de HCG, in cazul

protocoalelor de stimulare ovariana controlata in care s-a utilizat antagonist-GnRH pentru

supresia hipofizara [215]. S-a remarcat un numar mai mare de ovocite de metafaza II [216], insa

rata sarcinilor in evolutie a fost mai scazuta si rata avorturilor mai crescuta in cazul utilizarii

agonistului-GnRH fata de HCG ca inductor al ovulatiei [217], [218] din aceste protocoale cu

antagonist-GnRH. Explicatia poate fi data de un defect de faza luteala in cazul agonistului-GnRH

comparativ cu HCG. Un avantaj al declansarii ovulatiei cu agonist-GnRH fata de terapia

standard cu HCG se remarca prin scaderea incidentei sindromului de hiperstimulare ovariana

[215], dar dupa alti autori nu se poate stabili inca o concluzie clara [217].

27. Mecanismele intime, la nivel de procese intracelulare, prin studierea concentratiei

hormonilor sexuali (estradiol, progesteron si testosteron) din lichidul intrafolicular si a raportului

acestora, au menirea de-a stabili daca exista un efect semnificativ al agonistului- sau

antagonistului-GnRH asupra secretiei steroizilor in vivo. S-au gasit diferente semnificative

statistic in cazul concentratiei medii a E2 folicular, ca fiind mai scazut la pacientele tratate cu

antagonist-GnRH si corelat cu valoarea medie serica a E2 la aceleasi paciente. Nu s-au gasit

diferente semnificative ale concentratiei progesteronului folicular iar testosteronul folicular a fost

in concentratii similare. Raportul E2/ testosteron folicular a fost scazut la lotul tratat cu

antagonist-GnRH. Nu au fost diferente referitor la raportul progesteron/ testosteron si E2/

progesteron la cele 2 grupuri de substante. Este cunoscut efectul nefavorabil al mediului

androgenic intrafolicular in cadrul dezvoltarii foliculare si se stabileste astfel ca terapia cu

antagonist-GnRH in cadrul stimularii ovariene are un efect important asupra steroidogenezei

foliculare [213].

28. Alte studii se preocupa de efectele IGF (Insulin-like growth factors) si proteinele lor de

legare (IGFBP), care au rol major in reglarea autocrina si paracrina a foliculogenezei. Se

compara concentratiile din lichidul folicular a IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, IGFBP-4 si PAPP-A

(pregnancy-associated plasma protein) si raporturile dintre acestea in scopul de-a gasi o diferenta

in concentratiile acestor substante in cadrul protocoalelor cu agonist- si cu antagonist-GnRH din

Page 265: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

251

stimularea ovariana controlata. Rezultatele au aratat ca durata stimularii ovariene a fost

semnificativ mai lunga, doza de gonadotropine, concentratia serica de E2, precum si numarul de

ovocite recoltate au fost mai crescute in grupul cu agonisti-GnRH (long protocol). Concentratiile

din lichidul folicular pentru IGF-II si IGFBP-4 au fost semnificativ mai crescute si raportul: IGF-

I/ IGFBP-4 a fost semnificativ mai scazut in grupul cu agonisti-GnRH (long protocol). Valoarea

E2 seric/ folicol matur nu a diferit pentru cele 2 substante. Se concluzioneaza ca exista diferente

in mediul intrafolicular in ciclurile cu agonist-GnRH fata de antagonist-GnRH, dar totusi nu s-

au semnalat diferente in rezultatele clinice [214].

29. Aceste studii dovedesc ca fiecare substanta are avantaje si dezavantaje si nici una nu o

poate inlocui pe cealalta, astfel incat raman inca multe raspunsuri de gasit inainte de-a inclina

balanta spre terapia cu agonist-GnRH sau cu antagonist-GnRH. Este util de-a adapta fiecare

situatie in functie de particularitatea cazului, de-a folosi diferentiat cele 2 substante, cu ajustare

optima in cadrul protocoalelor FIV.

30. Introducerea crioconservarii in cadrul reproducerii asistate aduce un plus de avantaje prin

existenta mai multor ovocite sau embrioni /ciclu stimulare; prin evitarea unei noi stimulari si

reducerea costului acesteia; creste rata sarcinii / pacienta / punctie (sau /ciclu) si permite evitarea

sindromului de hiperstimulare ovariana.

31. Evaluarea procentuala a supravietuirii celulare dupa decongelare arata ca agonistii-GnRH

si antagonistii-GnRH utilizati in ciclurile de origine a celulelor nu influenteaza acest parametru.

Deteriorarea celulara este dependenta de efectele fizice din cadrul procesului de dezghetare si

analogii-GnRH nu influenteaza negativ crioconservarea.

32. Compararea procentuala a sarcinilor rezultate prin ET cu embrioni proaspeti versus celule

crioconservate denota faptul ca in cazul agonistilor-GnRH rata sarcinilor cu embrioni proaspeti

este superioara celei cu celule congelate/ decongelate. Pentru antagonisti-GnRH, situatia este

oarecum contradictorie, in sensul ca ET cu embrioni proaspeti are valori mai mici fata de rata

sarcinilor cu celule crioconservate. Inclusiv in compararea ratelor sarcinilor prin ET cu celule

crioconservate intre agonisti si antagonisti, balanta procentuala inclina in favoarea antagonistilor.

Acest rezultat se poate interpreta in contextul unui numar mult mai redus al ciclurilor de

stimulare cu protocoale cu antagonisti-GnRH fata de agonisti si a numarului de crio-cicluri din

antagonisti (numarul ciclurilor si al crio-ciclurilor ce au folosit protocoale cu antagonisti de

Page 266: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

252

GnRH pot fi un esantion nereprezentativ statistic). Se impun studii ulterioare care sa verifice

aceste ultime rezultate.

33. Analiza statistica evidentiaza faptul ca ET cu celule crioconservate se repercuta negativ

asupra ratei sarcinilor, fiind un parametru semnificativ statistic, cu valoarea lui p < 0,0001.

Page 267: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

253

BIBLIOGRAFIE

1. Nauta WJH, Haymaker W, (1969) Hypothalamic nuclei and fiber connections in

Haymaker W, Anderson E, Nauta WJH (eds); The Hypothalamus, Charles C Thomas

Publisher: 136-209

2. Carmel PW, Araki S, Ferin M (1976) Pituitary stalk portal blood collection in rhesus

monkeys: evidence of pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH),

Endocrinology 99: 243-248

3. Lechan RM, Toni R (2004) Functional Anatomy of the Hypothalamus and Pituitary,

Chapter 3b in Neuroendocrinology, Hypothalamus and Pituitary, Grossman A (ed),

Endotext.org

4. Barry J, Hoffman GE, Wray S (1985) LHRH-containing systems, In Handbook of

Chemical Neuroanatomy 4, GABA and Neuropeptides in the CNS, Part I, Björklund A,

Hökfelt T (eds), Amsterdam-New-York-Oxford Elsevier: 166-215

5. Filicori M, Flamigni C (1995) Treatment with GnRH Analogs: Controversies and

Perspectives, Parthenon Publishing Group: Xiii

6. Arimura A (1991) The backstage story of the discovery of LHRH, Endocrinology 129:

1687-1689

7. Rasmussen DD, Gambacciani M, Swartz W, Tueros VS, Yen SSC (1989) Pulsatile

gonadotropin-releasing hormone release from the human mediobasal hypothalamus in

vitro: Opiate receptor mediated suppression, Neuroendocrinology 49: 150

8. Waldhauser F, Weissenbacher G, Frisch H, Pollak A (1981) Pulsatile secretion of

gonadotropins in early infancy, European Journal of Pediatrics 137 (1): 71-74

9. Felberbaum R, Rabe T, Diedrich K (2000) Gonadotropin-Releasing Hormons: Agonists

and Antagonists in Rabe T, Diedrich K, Strowitzki T (Eds.): Manual on Assisted

Reproduction, Springer Verlag Berlin-Heidelberg: 133-164

10. Wildt L, Hausler A, Marshall G, Hutchinson IS, Plant TM, Belchetz PE Knobil E (1981)

Frequency and amplitude of gonadotropine-releasing hormone stimulation and

gonadotropin secretion in the rhesus monkey, Endocrinology 109: 376

11. Knobil E (1989) The electrophysiology of the GnRH pulse generator, J Steroid Biochem

33: 669

Page 268: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

254

12. Jarry H, Molecular Mechanism of the GnRh pulse generator, Dept. of Clin and Exptl.

Endocrinology, University of Gottingen, Germany, Deutsche Forschungsgemeinschaft

grant JA 398/4)

13. Grunwald K, Rabe T, Runnebaum B (2000) Physiology of the menstrual cycle, in Rabe

T, Diedrich K, Strowitzki T (eds), Manual on Assisted Reproduction, 2nd updated

Edition, Springer Verlag Berlin-Heidelberg: 29

14. Yen SCC, Quigley ME, Reid RL, Cetel NS (1985) Neuroendocrinology of opioid

peptides and their role in the control of gonadotropin and prolactin secretion, Am J

Obstet Gynecol 152: 485

15. Wehrenberg WB, Ling H, Bohlen P, Esch F, Brazeau P, Guillemin R (1982)

Physiological roles of somatocrinin and somatostatin in the regulation of growth hormone

secretion, Biochem Biophys Res Commun 109: 562

16. Prendergast K, Heras-Herzig A, Dalkin A (2002) GnRH – Gonadotropin Physiology and

Pathology in Neuroendocrinology, Hypothalamus and Pituitary, Grossman A (ed),

Endotext.org

17. Rossmanith WG, Mortola JF, Yen SCC (1988) Role of endogenous opioid peptides in the

initiation of the midcycle luteinizing hormone surge in normal cycling women, J Clin

Endocrinol Metab 61: 695

18. Gross DS (1980) Effect of castration and steroid replacement on immunoreactive

gonadotropin-releasing hormone in the hypothalamus and preoptic area, Endocrinology

106: 1442-145

19. Jarry H, Leonhardt S, Schwarze T, Wuttke W (1995) Preoptic rather than mediobasal

hypothalamic amino acid neurotransmitter release regulates GnRH secretion during the

estrogen-induced LH surge in the ovariectomized rat, Neuroendocrinology, 62(5): 479-86

20. Romano GJ, Krust A, Pfaff DW (1989) Expression and estrogen regulation of

progesterone receptor mRNA in neurons of the mediobasal hypothalamus: an in situ

hybridization study, Mol Endocrinol 3:1295

21. Fox SR, Harlan RE, Shivers BD, Pfaff DW (1990) Chemical characterization of

neuroendocrine targets for progesterone in female rat brain and pituitary

Neuroendocrinology 51: 276

Page 269: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

255

22. Jarry H, Leonhardt S, Wuttke W (1991) Gamma-aminobutyric acid neurons in the

preoptic/anterior hypothalamic area synchronize the phasic activity of the gonadotropin-

releasing hormone pulse generator in ovariectomized rats, Neuroendocrinology, 53(3):

261-7

23. Wu FC, Butler G,. Kelnar CJ, Huhtaniemi I, Veldhuis JD (1996) Ontogeny of pulsatile

gonadotropin releasing hormone secretion from midchildhood, through puberty, to

adulthood in the human male: a study using deconvolution analysis and an ultrasensitive

immunofluorometric assay, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 81(5):

1798-1805

24. Apter D, Butzow TL, Laughlin GA, Yen SS (1993) Gonadotropin-releasing hormone

pulse generator activity during pubertal transition in girls: pulsatile and diurnal patterns

of circulating gonadotropins, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 76(4):

940-949

25. Grunwald K, Rabe T, Runnebaum B (2000) Physiology of the menstrual cycle, in Rabe

T, Diedrich K, Strowitzki T (eds), Manual on Assisted Reproduction, 2nd updated

Edition, Springer Verlag Berlin-Heidelberg: 27

26. GnRH Agonists, Antagonists and Assisted Conception (2002) Thieme Medical

Publishers: Semin Reprod Med 20(4): 349 –364

27. Clayton RN, Catt KJ (1981) Gonadotropin-releasing hormon receptors: characterization,

physiological regulation and relationship to reproductive function, Endocr Rev 2: 186-

209

28. Probst JC, Skutella T, Muller-Schmid A, Jirikowski GF, Hoffmann W (1995) Molecular

and cellular analysis of rP1.B in the rat hypothalamus: in situ hybridization and

immunohistochemistry of a new P-domain neuropeptide, Brain Res Mol Brain Res 33:

269-276

29. Kottler ML, Lorenzo F, Bergametti F, Commercon P, Souchier C, Counis R (1995)

Subregional mapping of the human gonadotropin-releasing hormone receptor (GnRH-R)

gene to 4q between the markers D4S392 and D4S409, Hum Genet 96: 477-480

30. Millar R, Lowe S, Conklin D, et al. (2001) A novel mammalian receptor for the

evolutionarily conserved type II GnRH. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 9636-9641

Page 270: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

256

31. Neill JD, Duck LW, Sellers JC, Musgrove LC (2002) A gonadotropin-releasing hormone

(GnRH) receptor specific for GnRH II in primates, Biochem Biophys Res Commun 282:

1012-1018

32. Stojilkovic SS, Reinhart J, Catt KJ (1994)Gonadotropin-releasing hormone receptors:

structure and signal transduction pathways, Endocr Rev 15: 462-499

33. Kaiser UB, Conn PM, Chin WW (1997) Studies of gonadotropin-releasing hormone

(GnRH) action using GnRH receptor-expressing pituitary cell lines, Endocr Rev 18: 46-

70

34. Conn PM, Crowley WF Jr. (1994) Gonadotropin-releasing hormone and its analogs,

Annu Rev Med 45: 391-405

35. Zondek B (1926) Uber die Funktion des Ovariums, Z Geburtshilfe Gynakol 90: 327

36. Zondek B, Aschheim S (1927) Das Hormon des Hypophysenvorderlappens; Testobjekt

zum Nachweis des Hormons, Klin Wochenschr 6: 248

37. Howles C, Barri P, Cittadini E, Diedrich K, Fioretti P, et al. (1993) Metrodin HP: clinical

experience with a new highly purified follicle stimulating hormone preparation suitable

for subcutaneous administration, In Lunenfeld B (ed) FSH alone in ovulation induction,

Parthenon, New York: 45-61

38. Loumaye E, Campbell R, Salat-Baroux J (1995) Human follicle-stimulating hormone

produced by recombinant DNA technology: a review for clinicians, Hum Reprod Update

1: 188-199

39. Recombinant Human FSH Study Group (1995) Clinical assessment of recombinant

human follicle-stimulating in stimulating ovarian follicular development before in vitro

fertilization, Fertil Steril 63: 77-86

40. Rajaniemi HP, Petaja-Repo UE, Pietila EM (1996) Structure and functional significance

of the carbohydrates of the LH/CG receptor, Mol Cell Endocrinol 125(1-2): 101-105

41. Ulloa-Aguirre A, Timossi C (1998) Structure-function relationship of follicle stimulating

hormone and its receptor, Human Reproduction Update vol 4, nr 3: 260-283

42. Fan QR, Hendrickson WA, Nature (2005) 433: 269-277

43. Lamminen T, Min Jiang, Manna PR, Pakarinen P, Simonsen H, Herrera RJ, Huhtaniemi I

(2002) Functional study of a recombinant form of human LHß-subunit variant carrying

Page 271: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

257

the Gly102Ser mutation found in Asian populations, Molecular Human Reproduction Vol.

8, No. 10: 887-892

44. Dorrington JH, Armstrong DT (1979) Effects of FSH on gonadal functions, Rec Prog.

Horm Res 39: 301

45. Richards JS (1994) Hormonal control of gene expression in the ovary, Endocr. Rev 15:

752-751

46. Hillier SG (1991) Regulatory functions for inhibin and activin in human ovaries J

Endocrinol 131: 171-175

47. Findlay JK (1993) An update on teh roles of inhibin, activin and follistatin as local

regulators of folliculogenesis, Biol Reprod 48: 15-23

48. Smyth CD, Miro F, Whitelaw PF, Howles CM, Hillier SG (1993) Ovarian

thecal/interstitial androgen synthesis is enhanced by a follicle-stimulating hormone-

stimulated paracrine mechanism, Endocrinology 133: 1532-1538

49. Giudice L (1992) Insulin-like growth factors and ovarian follicular development, Endocr

Rev 13: 641-669

50. Lunenefeld B, Menzi A, Volet B (1960) Clinical effects of human postmenopausal

gonadotropin, Rass Clin Ter Sci Affini 59: 213-217

51. Diedrich K, Van Der Ven H, Al-Hasani S, Krebs D (1988) Ovarian stimulation for in

vitro fertilisation, Hum Reprod 3: 39-44

52. Jones HW, Acosta A, Andrews MC, Garcia JE, Jones GS, Mantzawinos T, McDowell J,

Sandow B, Veeck L, Whibley T (1983) The importance of follicular phase to success and

failure in in vitro fertilization, Fertil Steril 40: 317-321

53. Devroey P, Van Steirteghem A, Mannaerts B, Coelingh Bennink H (1992) First singleton

term birth after ovarian superovualtion with rh-FSH, Lancet 340: 1108-1109

54. Daya S, Gunby J (1999) Recombinant versus urinary follicle stimulating hormone for

ovarian stimulation in assisted reproduction, Hum Reprod 14: 2207-2215

55. Brinsden PR, Akagbosu F, Gibbons , et al. (1998) Gonal-F versus Puregon: results from a

randomized, assessor-blind, comparative study in women undergoing assisted

reproductive technologies, Hum Reprod 13: 0-140

56. Berg C, Howles CM, Borg K, et al. (1997) Recombinat human follicle stimulating

hormone (r-FSH; Gonal-F) versus highly purified urinary FSH (Metrodin HP): results of

Page 272: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

258

a randomized comparative study in women undergoing assisted reproductive techniques,

Hum Reprod 13: 0-185

57. Ancar V, Costea D, Vladareanu R (1999) Puregonul in stimularea ovariana – experienta

Clinicii Medsana Bucuresti, vol rezumate Primul Congres National de Reproducere

Umana Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 30

58. Macnamee MC, Howles CM (1987) The occurence, characteristics and management of

the LH surge in IVF, Hum Reprod 2, Suppl 1:46

59. Urbancsek J, Rabe T, Grunwald K, Kiesel L, Runnebaum B (1990a) Analysis of

hormonal changes during combined buserelin/hMG treatment, Hum Reprod 5: 675-681

60. Fleming R, Adam AH, Barlow DH, Black WP, Macnaughton MC, Coutts JRT (1982) A

new systematic treatment for infertile women with abnormal hormone profiles, Br J

Obstet Gynaecol 89: 80-83

61. Fujino M, Kobayashi S, Obayashi M (1972) Structure activity relationships in the C-

terminal part of luteinising-hormone (LHRH), Biochem Biophys Res Commun 49: 863-

869

62. Moghissi KS (2000) A Clinician’s Guide to the Use of Gonadotropin-Releasing Hormone

Analogues in Women, Medscape General Medicine 2(1)

63. Akagbosu FT (1999) The use of GnRH agonists and antagonists in infertility, in A

textbook of In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Brinsden PR (Ed), 2nd

Edition, Parthenon Publishing Group: 84

64. Lemay A, Maheux R, Faure N, Jean C, Fazekas ATA (1984) Reversible hypogonadism

induced by a luteinizing releasing-hormone (LH-RH) agonist (Buserelin) as a new

therapeutic approach for endometriosis, Fertil Steril 41: 863-871

65. Kiesel L, Runnebaum B (1992) Gonadotropin-releasing-Hormon und Analoga-

Physiologie und Pharmakologie,Gynakol Geburtshilfliche Rundsch 32: 22-30

66. Matta WH, Shaw RW, Hesp R, Evans R (1988) Reversible trabecular bone density loss

following induced hypoestrogenism with GnRh-analogue Buserelin in premenopausal

women, Clin Endocrinol 29: 45-51

67. Loumaye E (1990) The control of endogenous secretion of LH by gonadotropin releasing

hormone agonists during ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization and embryo

transfer, Hum Reprod 5: 357-376

Page 273: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

259

68. Schmutzler RK, Diedrich K (1990) Basic and clinical aspects of GnRH agonists in

reproduction. Int J Gynecol Obstet 321: 311-324

69. De Mouzon J, Lancaster P (1995) World collaborative report 1993, 15th World Congress

on Fertility and Sterility, Montpellier, September 17-22, 1995

70. Diedrich K, Diedrich C, Santos E, et al. (1994) Suppression of the endogenous

luteinizing hormone surge by the gonadotropin-releasing hormone antagonist Cetrorelix

during ovarian stimulation, Hum Reprod 9: 788-791

71. Regan L, Owen EJ, Jacobs HS (1990) Hypersecretion of luteinising hormone, infertility

and misscarriage, Lancet 2:1141-1144

72. Tan Sl, Kingsland C, Campbell S, Mills C, Bradfield J, et al. (1992) The long protocol of

administration of gonadotropin-releasing hormone agonist is superior to the short

protocol for ovarian stimulation for in vitro fertilization, Fertil Steril 57: 810-814

73. Ron-El R, Golan A, Herman A, Raziel A, Soffer Y, Caspi E (1990) Midluteal

gonadotropin-releasing hormone analog administration in early pregnancy, Fertil Steril:

572-574

74. Smitz J, Devroey P, Bourgain C, Camus M, VanWasberghe I, Wisanto A,

VanSteirteghem AC (1988) Luteal supplementation regimes after combined GnRH

agonist/HMG superovulation, J Reprod Fertil Abstr Ser 2:18

75. Blumenfeld Z, Nahhas F (1988) Luteal dysfunction in ovulation induction: the role of

repetitive human chorionic gonadotropin supplementation during the lutael phase, Fertil

Steril 50: 403-407

76. Costea D, Ancar V, Pacu I (1999) Suportul luteal in Reproducerea Asistata, vol rezumate

Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala,

Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 43

77. Schally AV (1999) Luteinizing hormone-releasing hormone analogs: their impact on the

control of tumorigenesis, Peptides 20:1247-1262

78. Klingmuller D, Diedrich K, Sommer L (1993) Effects of the GnRH antagonist Cetrorelix

in normal women, Gyneocl Endocrinol 7: 2

79. Bajusz S, Kovacs M, Gazdag M (1988) Highly potent antagonists of luteinizing

hormone-releasing hormone free of edematogenic effects. Proc Natl Acad Sci U S A, 85:

1637- 1641

Page 274: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

260

80. Nestor JJ Jr, Tahilramani R, Ho TL, Goodpasture JC, Vickery BH, Ferrandon P (1992)

Potent gonadotropin releasing hormone antagonists with low histamine-releasing activity,

J Med Chem 35: 3942-3948

81. Dittkoff EC, Cassidenti DL, Paulson RJ, Sauer MV, Wellington LP, et al. (1991) The

gonadotropin releasing hormone antagonist (Nal-Glu) acutely blocks the luteinizing

hormone surge but allows for resumption of folliculogenesis in normal women, Am J

Obstet Gynecol 165: 1811-1817

82. Felberbaum R, Reissmann T, Diedrich K (1995) Entwicklung und

Anwendungsmoeglichkeiten der GnRH-Antagonisten im Rahmne der Sterilitaetstherapie-

Eine Uebersicht, Fertilitaet 11: 11-21

83. Olivennes F, Fanchin R, Bouchard P, De Ziegler D, Taieb J, Selva J, Frydman R (1994)

The single or dual administration of the gonadotropin-releasing-hormone-antagonist

Cetrorelix in an in vitrofertilization-embryo transfer program, Fertil Steril 62: 468-476

84. Lin Y, Kahn JA, Hillensjo T (1999) Is there a difference in the function of granulosa

luteal cells in patients undergoing in vitro fertilization either with gonadotropin-releasing

hormone agonist or antagonist? Hum Reprod 14: 885-888

85. Mannaerts B, Devroey P, Abyholm T, Diedrich K, Hedon B, et al. (1998) A double blind

randomised dose finding study to the efficacy of the gonadotropin-releasing hormone

antagonist ganirelix (Org 37462) to prevent premature luteinizing surges in women

undergoing ovarian stimulation with recombinant follicle stimulating hormone (Puregon-

R), Hum Reprod 13: 3023-3031

86. Keay SD, Liversedge HN, Mathur RS, Jenkins KM (1997) Assisted conception following

poor ovarian response to gonadotropin stimulation, Br J Obstet Gynaecol 104: 521-527

87. Klein NA, Battaglia DE, Fujimoto VY, Davis GS, Bremner WJ, Soules MR (1996)

Reproductive aging: accelerated ovarian follicular development associated with a

monotropic FSH rise in normal older women, J Clin Endocrinol Metab 81: 1038-1045

88. Hannoch J, Lavy Y, Holzer H, Hurwitz A, Simon A, et al. (1998) Young low responders

protected from the untoward effects of reduced ovarian response, Fertil Steril 69: 1001-

1004

Page 275: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

261

89. Faber BM, Mayer J, Cox B, Jones D, Toner JP, et al. (1998) Cessation of

gonadotropin-releasing hormone agonist therapy combined with high-dose gonadotropin

stimulation yields favorable pregnancy results in low responders, Fertil Steril 60: 826-830

90. Weissmann A, Farhi J, Royburt M, Nahum H, Glezerman M, et al. (2003)

Prospective evaluation of two stimulation protocols for low responders who were

undergoing in vitro fertilization-embryo transfer, Fertil Steril 79, Nr 4: 886-892

91. Urbancsek J, Rabe T, Grunwald K, Runnebaum B (1990b) Diagnose, Haufigkeit

und klinische Bedeutung des vorzeitigen Anstiegs/Gipfels bei Patientinnen eines

IVF/GIFT Programmes, Geburtsh Frauenheilkd 50: 454-462

92. Urbancsek J, Rabe T, Thuro H, Grunwald K, Runnebaum B (1991b) Kombinierte

Behandlung mit einem GnRH-Analogon und Gonadotropinen bei IVF-ET/GIFT

Patientinnen nach vorangegangenen erfolglosen reinen HMG-Stimulation, Zentralbl

Gynaekol 113: 563-574

93. Rizk B, Vere M (1991) Incidence of severe ovarian hyperstimulation syndrome

after GnRH agonist/HMG superovulation for in vitro fertilization, Proceedings of the VII

World Congress on In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Paris, Hum Reprod

94. Rizk B, Aboulghar MA, Mansour RT, et al. (1991) Severe ovarian

hyperstimulation syndrome: analytical study of twenty-one cases, Proceedings of the VII

World Congress on In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Paris, Hum Reprod:

368-369

95. Munteanu I, Checiu I, Checiu M, Policec S, Craina M, Budau G, Hrubaru N,

Vladescu E (2000) 5 ani de fertilizare in vitro (FIV) in Romania, Obstetrica si

Ginecologia, vol. XLVIII, Nr 1: 73-79

96. Abdalla HI, Rizk B (1999) Ovarian Hyperstimulation Syndrome, In Assisted

Reproductive Technology, Abdalla HI, Rizk B (eds), Abingdon Oxford Health Press: 37-

39

97. Lunenfeld B, Insler V, Glezerman M (1993) Diagnosis and treatment of functional

infertility, Publ Blackwell Wissenschaft, Berlin, 3rd rev. ed: 98

98. World Health Organization (1973) Agents stimulating gonadal function in

humans, WHO Tech Rep Series, Nr 514

Page 276: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

262

99. Golan A, Ron El R, Herman A, et al. (1989) Ovarina hyperstimulation syndrome:

an update review, Obstet Gynecol Surv 44: 430-440

100. Balasch J, Arroyo V, Carmona F, et al. (1991) Severe ovarian hyperstimulation

syndrome: role of peripheral vasodilatation, Fertil Steril 56: 1077-1083

101. Ravindranath N, Little-Ihrig LL, Phillios HS, et al. (1992) Vascular endothelial

growth factor messenger ribonucleic acid expression in the primate ovary, Endocrinol

131: 254-260

102. Millauer B, Wizigmann-Voos S, Schnurch H, et al. (1993) High affinity VEGF

binding and developmental expression suggest FLK-1 as a major regulator of

vasculogenesis and angiogenesis, Cell 72: 835-846

103. Schenker JG (1999) Ovarian Hyperstimulation Syndrome – Experimental and

Clinical Data, vol. rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata,

cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 21

104. David S, Munteanu I, Policec S, David D, Bernad E (1999) Sindromul de

suprastimulare ovariana – forma grava la Centru de Fertilizare in Vitro din Clinica Bega,

vol rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare

internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 48

105. Munteanu I, Checiu I, Policec S, David S, Craina M, Vladescu E (2001) Apects

regarding ovarian hyperstimulation syndrome at the IVF Center of the Universitary

Clinic of Obstetrics and Gynecology „Bega”, Timisoara, Romania, Gynecol Endocrinol,

Vol 15, Suppl Nr 5: 138

106. Sher G, Salem R, Fernman M, et al. (1993) Eliminating the risks of life-dangering

complications following overstimulation with menotropin fertility agents: a report on

women undergoing in vitro fertilization and embryotransfer, Obstet Gynecol 81: 1009-

1011

107. Burkman RT, Tang MTC, Malone KE, Marchbanks PA, McDonald JA, et al.

(2003) Infertility drugs and the risk of bresat cancer: findings from the National Institute

of Child Health and Human Development Women’s Contraceptive and Reproductive

Experiences Study, Fertil Steril 79, Nr 4: 844-851

108. Healy DL, Venn A (2003) Infertility medication and the risk of breast cancer,

Fertil Steril 79, Nr 4: 852-854

Page 277: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

263

109. Althuis MD, Scoccia B, Lamb EJ, Moghissi KS, Westhoff CL, et al. (2005)

Melanoma, thyroid, cervical, and colon cancer risk after use of fertility drugs, Am J

Obstet Gynaecol 193: 668-674

110. Chang M C (1959) Fertilization of rabbit ova in vitro, Nature 184: 466–467

111. Steptoe PC, Edwards RG (1978) Birth after the reimplantation of a human

embryo, Lancet 2(8085): 366

112. Steptoe PC et al. (1971) Human blastocysts grown in culture, Nature 229: 132–

133

113. Steptoe PC, Edwards RG (1976) Reimplantation of human embryo with

subsequent tubal pregnancy, Lancet 1: 880-882

114. Gleicher N, Friberg J, Fullan N, Giglia RV, Mayden K, Kesky T, Siegel I (1983)

Egg retrieval for in vitro fertilization by sonographically controlled vaginal culdocentesis,

Lancet 2: 508-9

115. Lenz S, Lauritsen JG, Kjellow M (1981) Collection of human oocytes for in vitro

fertilization by ultrasonically guided follicular puncture, Lancet 1: 1163-1164

116. Wikland M, Enk L, Hamberger L (1985) Transvesical and transvaginal

approaches for the aspiration of follicles by the use of ultrasound, Ann NY Acad Sci 442:

683-689

117. Kuenstliche Befruchtung oder assistierte Reproduktion, Kap.3.3 In Gynaekologie

und Geburtshilfe-Lehrbuch fuer Studium und Praxis, Schmidt-Matthiesen H, Wallwiener

D (eds), 10.Auflage, Schattauer Verlag Stuttgart, 2005: 139-146

118. Munteanu I, Checiu I, Policec S (1995) Fertilizarea in vitro si embriotransfer in

Romania, Obstetrica si Ginecologia XLIII: 167-170

119. Checiu I, Checiu M, Policec S, Munteanu I (1998) Aspecte al experientei

Centrului IVF Bega cu privire la tehnica fecundatiei in vitro si a cultivarii embrionului

uman, vol rezumate Al XII-lea Congres National de Obstetrica si Ginecologie, Iasi: 38

120. Munteanu I, Rabe T, Checiu I, Policec S (1999) Realizarea reproducerii umane

asistate in Romania, vol. rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana

Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 27

121. Munteanu I, Anastasiu D, Gluhovschi A, Craina M, Dorneanu F (1999) Rezultate

si perspective pentru mileniul urmator privind Reproducerea Umana Asistata in Romania,

Page 278: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

264

vol rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare

internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 62

122. Policec S, Munteanu I, Checiu I, David S (1998) Experienta Centrului de

Fertilizare in Vitro a Clinicii „Bega” Timisoara in stimularea ovariana pentru fertilizarea

in vitro, vol. rezumate Al XII-lea Congres National de Obstetrica si Ginecologie, Iasi, 27-

30 mai 1998: 79

123. Rabe T, Gör ÜB, Urbancsek J, Runnebaum B (1997) Assisted Reproduction, In

Runnebaum B, Rabe T (eds.), Gynecological Endocrinology and Reproductive Medicine,

Vol. 2, Reproductive Medicine, Springer Verlag Berlin Heidelberg: 333

124. Rabe T, Munteanu I, Strowitzki T, Vladescu E (2000) Notiuni de reproducere

umana asistata, Capitolul 2.8 in Munteanu I (ed), Tratat de Obstetrica, Editura Academiei

Romane, Bucuresti: 175-234

125. Brinsden PR (1999) Oocyte recovery and embryotransfer techniques for in vitro

fertilization, in A textbook of In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Brinsden

PR (Ed), 2nd Edition, Parthenon Publishing Group: 180

126. Brinsmead M, Stanger J, Oliver M, Shumack J, Raymond S, Clark L (1989) A

randomized trial of laparoscopy and transvaginal ultrasound-directed oocyte pick-up for

in vitro fertilization, J In Vitro Fertil Embryo Transfer 6: 149-154

127. Pickering S, Braude P, Johnson M, et al. (1990) Transient cooling to room

temperature can cause irreversible disruption of the meiotic spindle in the human oocyte,

Fertil Steril 54: 102-108

128. World Health Organization. (1992) WHO Laboratory Manual for the Examination

of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. Cambridge: Cambridge

University Press

129. Kruger TF, Menkweld R, Stander FSH, et al. (1986) Sperm morphologic features

as a prognostic factor in in vitro fertilization, Fertil Steril 46: 1118-1123

130. Surcel IV, Apostol S, Lerintiu S, Parastie S (1998) Semnificatia unor parametri

morfologici in evaluarea capacitatii de fertilizare a spermei, vol rezumate Al XII-lea

Congres National de Obstetrica si Ginecologie, Iasi, 27-30 mai 1998: 80-81

131. Riedel HH, Hubner F, Ensslen SC, et al. (1989) Minimal andrological

requirements for in vitro fertilization, Hum Reprod 4: 73-77

Page 279: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

265

132. Braude PR, Bolton VN (1984) The preparation of spermatozoa for in vitro

fertilization by buoyant density centrifugation. In Feichtinger W, Kemeter P (eds) Recent

Prognosis in Human In Vitro Fertilization. Palermo: Cofese: 125-134

133. Lopata A, Patullo MJ, Chang A, et al. (1976) A method for collecting motile

spermatozoa from human semen, Fertil Steril 27: 677-684

134. Aitken RJ, Clarkson JS (1987) Cellular basis of defective sperm function and its

association with the genesis of reactive oxygen species by human spermatozoa, J Reprod

Fertil 81: 459-469

135. Aitken RJ (1989) The role of free oxygen radicals and sperm function, Int J

Androl 12: 95-97

136. Daya S, Gwatkin RBL, Bissessar H (1987) Separation of motile human

spermatozoa by means of a glass bead column, Gamete Res 17: 375

137. Fisch B et al. (1989) The effect of preinsemination interval upon fertilization of

human oocytes in vitro, Hum Reprod 4: 954-956

138. Levron J, Munne S, Willadsen S, Rosenwaks Z, Cohen J (1995) Male and female

genomes associated in a single pronucleus in human zygotes, J Assist Reprod Genet 12,

Suppl: 27s

139. Oehninger A, Acosta AA, Veek LL, Simonetti S. Muasher J (1989) Delayed

fertilization during in vitro fertilization and embryo transfer cycles: analysis of cause and

impact of overall results, Fertil Steril 52: 991-997

140. Plachot M, Veiga A, Montagut J, et al. (1988) Are clinical and biological IVF

parameters correlated with chromosomal disorders in early life: a multicentric study,

Hum Reprod 3: 627-635

141. Plachot M, Mandelbaum J, Junca AM, Cohen J, Slat-Baroux J (1993) Coculture

of human embryo with granulosa cells, Contracept Fertil Sex 19: 632-634

142. Elder KT (1999) Laboratory techniques: Oocyte collection and embryo culture,

Ch. 12, In A textbook of In Vitro fertilization and Assisted Reproduction, Brinsden PR

(Ed), second edition, 1999, Parthenon Publishing Group: 185-201

143. Barclay L (2004) Piroxicam may increase pregnancy rate from in vitro

fertilization and embryo transfer, Fertil Steril 82: 816-820

Page 280: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

266

144. Fernandez H, Coste J, Job-Spira N (1991) Controlled ovarian hyperstimulation as

a risk factor for ectopic pregnancy, Obstet Gynecol 78: 656

145. Winter E, Wang J, Davies MJ, Norman R (2002) Early pregnancy loss following

assisted reproductive technology treatment, Hum Reprod, Vol 17, 11: 3220-3223

146. Guzick DS, Wilkes C, Jones HW Jr (1986) Cumulative pregnancy rates for in

vitro fertilization, Fertil Steril 46: 663

147. Tan SL, Royston P, Campbell S, Jacobs HS, Betts J, et al. (1992) Cumulative

conception and livebirth rates after in vitro fertilization, Lancet 339: 1390

148. Asch RH, Balmaceda JP, Ellsworth LR, Wong PC (1985) Gamete intrafallopian

transfer (GIFT): a new treatment for infertility, Int J Fertil 30: 41

149. Society for Assisted Reproductive Technology, The American Fertility Society

(1993) Assisted Reproductive Technology in the United States and Canada: 1991 results

from the Society for Assisted Reproductive Technology generated from the American

Fertility Society Registry, Fertil Steril 59: 956

150. Lancaster PAL (1995) Evaluation of infertility treatment: multicenter trial or

national registers? In Hedon B, Bringer J, Mares P (eds) Fertility and Sterility, Carnforth,

UK: Parthenon Publishing: 465-468

151. Balmaceda JP, Alam V, Roszjtein D, Ord T, Snell K, Asch R (1992) Embryo

implantation rates in oocyte donation: a prospective comparison of tubal versus uterine

transfers, Fertil Steril 57: 362

152. Tanbo T, Dale PO, Aabyholm T (1990) Assisted fertilization in infertile women

with patent fallopian tubes, A comparison of in vitro fertilization, gamete intrafallopian

transfer and tubal embryo stage transfer, Hum Reprod 5: 266

153. Assisted Reproduction (1994) Chapter 31, In Clinical Gynecologic Endocrinology

and Infertility, 5th edition, Speroff L, Glass RH, Kase NG (eds), Williams and Wilkins:

931-946

154. Gordon JW, Talansky BE (1986) Assisted fertilization by zona drilling: a mouse

model for correction of oligospermia, Journal of Experimental Zoology 239: 347-354

155. Cohen J, Malter H, Fehilly C, Wright G, Elsner C, et al. (1988) Implantation of

embryos after partial opening of oocyte zona pellucida to facilitate sperm penetration,

Lancet ii: 162

Page 281: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

267

156. Malter HE, Cohen J (1989) Blastocyst formation and hatching in vitro following

zona drilling of human embryos, Gamete Research 24: 67-80

157. Payne D (1994) Embryo viability associated with microassisted fertilization,

Chapter 10: Micromanipulation techniques, In Bailliere’s Clinical Obstetrics and

Gynecology, S. Fishel (ed), Bailliere Tindall Cambridge University Press, Vol 8: 157-175

158. Ng SC, Bongso TA, Ratnam SS, Sathananthan H, Chan CL, et al. (1988)

Pregnancy after transfer of multiple sperm under the zona, Lancet ii: 8614-8790

159. Ng SC, Bongso TA, Ratnam SS (1991) Microinjection of human oocytes: the

technique for severe oligoasthenoteratozoospermia, Fertility and Sterility 56: 1117-1123

160. Hiramoto Y (1962) Microinjection of the live spermatozoa into sea urchin eggs,

Experimental Cell Research 27: 416-426

161. Lanzendorf SE, Maloney MK, Veeck LL, Slusser J, Hodgen GD, et al. (1988b) A

preclinical evaluation of pronuclear formation by microinjection of human spermatozoa

into human oocytes, Fertility and Sterility 49: 835-842

162. Palermo G, Joris H, Devroey P, Van Steirteghem AC (1992) Pregnancies after

intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte, Lancet 340: 17-18

163. Lanzendorf SE, Maloney M, Ackerman S, Acost A, Hodgen G (1988a)

Fertilising potential of acrosome-defective sperm following microsurgical injection into

eggs, Gamete Research 19: 329-337

164. Hung-Ching Liu (1997) Embryonic therapy for implantation enhancement,

Chapter 5, In Embryonic Medicine &Therapy, Jauniaux E, Barnea E, Edwards E (eds),

Oxford University Press: 80

165. Lundin K, Sjogren A, Nilsson L, Hamberger L (1994) Fertilization and pregnancy

after intracytoplasmic microinjection of acrosomeless spermatozoa, Fertility and Sterility

62:1266-1267

166. Casper RF, Meriano JS, Jarvi KA, et al. (1996)The hypo-osmotic swelling test for

selection of viable sperm for intracytoplasmic sperm injection in men with complete

asthenospermia, Fertil Steril 65: 972-976

167. Nagy ZP, Verheyen G, Liu J, et al. (1995) Results of 55 intracytoplasmic sperm

injection cycles in the treatment of male immunological infertility, Hum Reprod 10:

1775-1780

Page 282: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

268

168. Shrivastav P, Nadkarni P, Wensvoort S, et al. (1994) Percutaneous epididymal

sperm aspiration for obstructive azoospermia, Hum Reprod 9: 2058-2061

169. Tournaye H, Clasen K, Aytoz A, et al. (1998) Fine needle aspiration versus open

biopsy for testicular sperm recovery: a controlled study in azoospermic patients with

normal spermatogenesis, Hum Reprod 13: 901-90

170. Ancar V, Costea D, Vladareanu R (1999) Experienta Clinicii Medsana Bucuresti

in Reproducerea Asistata prin ICSI - comentariu pe 86 cazuri, vol rezumate Primul

Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala,

Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 30

171. Jardoudi KA, Hollanders JMG, Sieck UV, et al. (1997) pregnancy after transfer of

embryos which were generated from in-vitro matured oocytes, Hum Reprod 12: 857-859

172. De Vos A, Van Steirteghem A (1997) Intracytoplasmic sperm injection In New

Insights in Gynecology and Obstetrics: Research and Practice, Ottesen B, Tabor A (eds),

Carnforth, UK, Parthenon Publishing Press: 89-96

173. Tarlatzis B (1996) Report on the activities of the ESHRE task force on

intracytoplasmic sperm injection, In Genetics and Assisted Human Conception, Van

Steirteghem A, Devroey P, Liebaers I (eds), Oxford University Press: 160-176

174. Van Steirteghem A, Bonduelle M, Hamberger L, et al. (1998) Assisted

reproduction by intracytoplasmic sperm injection: a survey on the clinical experience in

1994 and the children born after ICSI, carried out until 31 December 1993, Hum Reprod

13: 1737-1746

175. Liu J, Nagy Z, Joris H, Tournaye H, Smitz J, et al. (1995) Analysis of total 76 total

fertilization failure cycles out of 2732 intracytoplasmic sperm injection cycles, Hum

Reprod 10: 2630-2636

176. Liebaers I, Bonduelle M, Legein J, Wilikens A, Van Assche E, et al. (1995a)

Follow-up of children born after intracytoplasmic sperm injection, In Hedon B, Bringer J,

Mares P (eds), Fertility and Sterility. A current overview. Proceedings of the 15th World

Congress on Fertility and Sterility, Montpellier, 1995, Parthenon: 409-412

177. Liebaers I, Bonduelle M, Van Assche E, Devroey P, Van Steirteghem A (1995b)

Sex chromosome abnormalities after intracytoplasmic sperm injection, Lancet 346:1095

Page 283: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

269

178. Bonduelle M, Hamberger J, Loris H, Tarlatzis BC, Van Steirteghem AC (1995b)

Assisted reproduction by intracytoplasmic sperm injection: an ESHRE survey of clinical

experiences until 31 December 1993, Hum Reprod Update 1, no 3, CD-ROM

179. Guidelines on the application of CASA technology in the analysis of spermatozoa

(1998) Hum Reprod, Vol. 13, Nr. 1: 142-145

180. Incidence of chromosomal aberrations in children born after assisted reproduction

through intracytoplasmic sperm injection (1998), Editorial, Hum Reprod, vol.13 no.4:

781–782

181. In’t Veld P, Brandenburg H, Verhoeff A, et al. (1995) Sex chromosomal

abnormalities and intracytoplasmic sperm injection, Lancet, 346:773

182. Jacobs P, Browne C, Gregson N, et al. (1992) Estimates of the frequency of

chromosome abnormalities detectable in unselected newborns using moderate levels of

banding, J. Med. Genet, 29: 103–106

183. Tarlatzis BC (1999) Benefits and risks of ICSI in the treatment of male infertility,

vol. rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare

internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 15

184. Ponjaert-Kristoffersen I, Bonduelle M, Barnes J, Nekkebroeck J, Loft A, et al.

(2005) International Collaborative Study of Intracytoplasmic Sperm Injection-Conceived,

In Vitro Fertilization-Conceived, and Naturally Conceived 5-Year-Old Child Outcomes:

Cognitive and Motor Assessments, Pediatrics, 115(3): e283 - e289

185. Ponjaert-Kristoffersen I, Tjus T, Nekkebroeck J, Squires J, Verté D, et al. (2004)

Psychological follow-up study of 5-year-old ICSI children, Hum Reprod 19(12): 2791-

2797

186. Takeuchi T, Colombero LT, Neri QV, Rosenwaks Z, Palermo GD (2004) Does

ICSI require acrosomal disruption? An ultrastructural study, Hum Reprod, 19(1): 114-

117

187. Kosmas IP, Kolibianakis EM, Devroey P (2004) Association of estradiol levels on

the day of hCG administration and pregnancy achievement in IVF: a systematic review,

Hum Reprod 19(11): 2446-2453

188. Kolibianakis EM, Zikopoulos K, Schiettecatte J, Smitz J, Tournaye H, Camus M,

Van Steirteghem AC, Devroey P (2004) Profound LH suppression after GnRH antagonist

Page 284: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

270

administration is associated with a significantly higher ongoing pregnancy rate in IVF,

Hum Reprod, 19(11): 2490-2496

189. Mohamed Aboulghar (2003) Prediction of ovarian hyperstimulation syndrome

(OHSS), Estradiol level has an important role in the prediction of OHSS, Hum Reprod,

18 (6): 1140-1141

190. Out HJ, Rutherford A, Fleming R, Tay CCK, Trew G, et al. (2004) A randomized,

double-blind, multicentre clinical trial comparing starting doses of 150 and 200 IU of

recombinant FSH in women treated with the GnRH antagonist ganirelix for assisted

reproduction, Hum Reprod, Vol. 19, No. 1: 90-95

191. Min JK, Breheny SA, MacLachlan V, Healy DL (2004) What is the most relevant

standard of success in assisted reproduction? The singleton, term gestation, live birth rate

per cycle initiated: the BESST endpoint for assisted reproduction, Hum Reprod 19 (1): 3-

7

192. Mazur P (2000) Stopping biological time. The freezing of living cells, Annals

New York Academy of Sciences, Part XI: Cryopreservation: 514-529

193. Bunge RG, Sherman JK (1953) Fertilizing capacity of frozen spermatozoa, Nature

172: 767

194. Deanesley R (1954) Immature rat ovaries grated after freezing and thawing, J

Endocrinol 2: 197

195. Parker AS (1956) Grafting of mouse ovarian after freezing and thawing, J

Endocrinol 14 xxi

196. Sherman JK (1963) Improved methods of preservation of human spermatozoa by

freezing and freezing-drying, Fertil Steril 14: 49

197. Trounson A, Mohr L (1983) Human pregnancy following cryopreservation,

thawing and transfer of an eight cell embryo, Nature 305: 707

198. Al-Hasani S, Diedrich K, van der Ven H, Reinecke A, Hartje M, Krebs D (1987)

Cryopreservation of human oocytes, Hum Reprod 2: 695-700

199. Chen C (1986) Pregnancy after human oocyte cryopreservation, Lancet 1: 884

200. Edwards R, Brody S (eds.)(1995) Principles and Practice of Assisted Human

Reproduction, W.B. Saunders Company: 335-343 si 455-457

Page 285: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

271

201. Rabe T, Diedrich K, Strowitzki T (eds) (2000) Manual on assisted reproduction,

Springer Verlag, Heidelberg : 339-377

202. Mazur P (1984) Freezing of living cells: mechanism and implications, Am J

Physiol 247: C125-C142

203. Serres C, Jouannet P, Czyglik F, David G (1980) Effects of freezing on

spermatozoa motility in David G, Price WS (eds) Human artificial insemination and

semen preservation, Plenum, New York: 147-161

204. Henry MA, Noiles EE, Gao D, Mazur P, Critser JK (1993) Cryopreservation of

human spermatozoa. The effects of cooling rate and warming rate on the maintenance of

motility, plasma membrane integrity and mitochondrial function, Fertil Steril 60:911-918

205. Cohen J, Edwards RG, Fehilly CB, Fishel SB, Hewitt J, et al. (1985) In vitro

fertilization usin cryopreserved donor semen in cases where both partners are infertile,

Fertil Steril 43: 570-574

206. Englert Y, Delvigne A, Vekemans M, Lejeune B, Hemlisz A et al. (1989) Is fresh

or frozen sperm to be used in in vitro fertilization with donor sperm? Fertil Steril 51: 661-

664

207. Fabbri R, Porcu E, Marsella T, Rochetta G, Ventroli S, Flamigni C (2001) Human

oocyte cryopreservation: new perspectives regarding oocyte survival, Hum Reprod 16

(3): 411-416

208. Martino A, Songsasen N, Leibo SP (1996) Development into blastocysts of

bovine oocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling, Biol Reprod 54: 1059-1069

209. Son WY, Park SE, Lee KA, Lee WS, Koo JJ et al (1996) Effects of 1,2

propanediol and freezing-thawing on the in vitro developmental capacity of human

immature oocytes, Fertil Steril 66: 995-999

210. Ludwig M, Al-Hassani S, Felberbaum R, Diedrich K (1999) New aspects of

cryopreservation of oocytes and embryos in assisted reproduction and future

perspectives, Hum Reprod 14 Suppl. 1: 162-185

211. Reubinoff BE, Pera MF, Vajta G, Trounson AO (2001) Effective

cryopreservation of human embryonic stem cells bt the open pull straw vitrification

method, Hum Reprod 16(10): 2187-2194

Page 286: Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a

272

212. Sathanandan M, Macnamee MC, Wick K, et al. (1992) Clinical aspects of human

embryo cryopreservation, in Brinsden PR, Rainsbury PA (eds) A Textbook of in Vitro

Fertilization and Assisted Reproduction, Carnforth UK, Parthenon Publishing

213. Garcia-Velasco JA, Isaza V, Vidal C,Landazabal A, Remohi J, et al. (2001)

Human ovarian steroid secretion in vivo: effects of GnRH agonist versus antagonist

(cetrorelix), Hum Reprod 16 (12): 2533-2539

214. Young Sik Choi, Seung-Yup Ku, Byung-Chul Jee, Chang-Suk Suh, Young Min

Choi, et al. (2006) Comparison of follicular fluid IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, IGFBP-4 and

PAPP-A concentrations and their ratios between GnRH agonist and GnRH antagonist

protocols for controlled ovarian stimulation in IVF-embryo transfer patients, Hum

Reprod doi:10.1093/humrep/del091 (advance access 04.2006)

215. Olivennes F, Fanchin R, Bouchard P, et al. (1996) Triggering of ovulation by a

gonadotropin-releasing hormone (GnRH) agonist in patients pretreated with a GnRH

antagonist, Fertil. Steril 66(1):151-153

216. Humaidan P, Ejdrup Bredkjær H, Bungum L, Bungum M, Grøndahl ML,

Westergaard L, Yding Andersen C (2005) GnRH agonist (buserelin) or hCG for

ovulation induction in GnRH antagonist IVF/ICSI cycles: a prospective randomized

study, Hum Reprod 20(5):1213-1220

217. Griesinger G, Diedrich K, Devroey P, Kolibianakis EM (2006) GnRH agonist for

triggering final oocyte maturation in the GnRH antagonist ovarian hyperstimulation

protocol: a systematic review and meta-analysis Hum Reprod Update 12(2):159-168

218. Kolibianakis EM, Schultze-Mosgau A, Schroer A, van Steirteghem A, Devroey P,

Diedrich K, Griesinger G (2005) A lower ongoing pregnancy rate can be expected when

GnRH agonist is used for triggering final oocyte maturation instead of HCG in patients

undergoing IVF with GnRH antagonists, Hum Reprod 20(10): 2887-2892