Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a
description
Transcript of Teza Doctorat Muresan Cezara (UMF a
Universitatea de Medicina si Farmacie „Victor Babes”
Timisoara
Analogii-GnRH in reproducerea umana asistata
Tehnici actuale in reproducerea umana asistata – ICSI si
crioconservarea
Doctorand: Muresan Maria-Cezara
Conducator stiintific
Academician Prof. Dr. Ioan Munteanu
2005
Universitatea de Medicina si Farmacie „Victor Babes”
Timisoara
Analogii-GnRH in reproducerea umana asistata
Tehnici actuale in reproducerea umana asistata – ICSI si crioconservarea
Dr. Muresan Maria Cezara
Conducator stiintific Academician Prof. Dr. Ioan Munteanu
II
Cuvant inainte
Sterilitatea / infertilitatea ca patologie ocupa un loc important in cadrul ginecologiei.
Adeseori tratamentul sterilitatii necesita timp si rabdare din partea pacientei, succesul (obtinerea
sarcinii) fiind si el asteptat in timp. Cu tot ajutorul medical acordat, ramane un procent din
cuplurile cu sterilitate care nu vor concepe. Numarul acestor cupluri a fost insa influentat odata
cu introducerea fertilizarii in vitro – o realizare de seama a secolului XX. Problema conceptiei in
exteriorul organismului i-a preocupat pe oamenii de stiinta cu multe decade in urma. La
inceputul secolului XX (1900) este citat biologul Ilya Ivanov cu cercetarile sale despre
inseminarea artificiala la animale. Initial studiile s-au limitat la animale. Cand s-a observat ca
incercarile au dat roade, s-a trecut si la aplicarea acestor proceduri la om. Pionierii in acest
domeniu sunt considerati a fi britanicii P. Steptoe si R.G. Edwards, carora le datoram fertilizarea
in vitro de astazi. Ei sunt cei care au reusit fecundarea in vitro a gametilor feminin si masculin,
cu obtinerea embrionului, implantarea sa intrauterina, si obtinerea unei sarcina ce s-a finalizat cu
nasterea primului “copil in eprubeta” (notiune ce avea sa se incetateneasca mai tarziu). Ei si-au
anuntat succesul printr-un scurt articol intr-o revista de specialitate. Acestui prim success i-au
urmat multe altele si in curand tehnica fertilizarii in vitro s-a extins pe aproape intreg globul.
De-a lungul anilor s-au adus imbunatatiri ale metodei si s-au dezvoltat noi tehnici, mai
performante, care sa permita cresterea ratei sarcinilor la cuplurile cu sterilitate. Fertilizarea in
vitro poate fi considerata, pe drept cuvant, una dintre minunile lumii, reprezentand o cucerire
fantastica a stiintei, totodata, implinind visul multor cercetatori. Astfel, prin fecundarea in vitro
s-au rezolvat problemele multor familii fara copii, carora pana atunci le era imposibil sa
conceapa.
La noi in tara meritul introducerii acestei metode ii apartine Academicianului Prof. Dr.
Ioan Munteanu, cu o veche preocupare in domeniul sterilitatii si care a luptat pentru progresul
medicinei romanesti. Chiar de la prima fertilizare in vitro efectuata la 20.05.1995, in cadrul
Centrului de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din
Clinica Universitara de Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara, s-a si obtinut sarcina. La
6.02.1996 s-a nascut primul roman „din eprubeta”.
Am avut sansa de-a ma numara printre invataceii d-lui Acad. Prof. Dr. Ioan Munteanu,
care mi-a calauzit pasii spre acest capitol al ginecologiei – sterilitatea - si in final tratamentul
III
sterilitatii – tehnicile de reproducere asistata. Acesta este in parte si motivul pentru care am ales
reproducerea asistata ca tema pentru teza de doctorat.
Doresc pe aceasta cale sa aduc multumirile mele si profunda recunostiinta d-lui Acad.
Prof. Dr. Ioan Munteanu, personalitate marcanta in ginecologia din Romania, conducatorul
stiintific al prezentei teze de doctorat. De asemenea ii sunt recunoscatoare pentru generozitatea
cu care mi-a indrumat cercetarea, pentru materialul bibliografic pe care mi l-a pus la dispozitie,
pentru indicatiile competente pe care mi le-a oferit si care sunt izvorate dintr-o inegalabila
experienta si valoare, cat si pentru sustinerea in definitivarea acestei teze.
Pentru aprofundarea cunostintelor in domeniul reproducerii umane am beneficiat de o
bursa DAAD (Deutscher Akademischer Austauschdienst) in cadrul pregatirii pentru doctorat si
am urmat un stagiu de 6 luni la Clinica Universitara de Ginecologie, Heidelberg, Germania, in
Departamentul de Fertilizare in Vitro. Acest departament are o veche traditie in tratamentul
sterilitatii si in tehnicile reproducerii umane asistate. Am avut la dispozitie material bibliografic,
acces la baza de date si am lucrat efectiv in cadrul acestei sectii. Ii multumesc colectivului
acestui departament, condus de Prof. Dr. Thomas Strowitzki si Prof. Dr. Thomas Rabe, care au
avut intotdeauna un sfat competent pentru cercetarea mea.
Multumirile mele se indreapta si catre dl. Prof. Dr. Virgil Ancar, Spitalul Sf. Pantelimon -
Bucuresti, care a condus cursul si stagiile de pregatire in cadrul supraspecializarii de fertilizare in
vitro, pe care am urmat-o. Cu Domnia sa mi-am sustinut examenul de supraspecializare in anul
2005. Cu ocazia efectuarii acestei supraspecializari am beneficiat si de cunostintele d-lui Prof.
Ancar, o personalitate de seama in domeniul reproducerii umane asistate in Romania.
Nu in ultimul rand doresc sa-i multumesc familiei mele, care m-a sustinut si m-a incurajat
in realizarea - si mai ales in finalizarea tezei si care m-a impulsionat in momentele mai dificile
din conceperea lucrarii.
IV
Introducere
Lucrarea de fata s-a conturat si a luat nastere in urma sfaturilor competente ale d-lui
Academician Prof. Dr. Ioan Munteanu, renumita personalitate a ginecologiei romanesti,
recunoscuta si peste hotare, initiatorul fertilizarii in vitro in tara noastra. Domnia sa este
conducatorul stiintific al acestei teze.
O serie de date si informatii am avut ocazia sa le obtin de la Departamentul de Fertilizare
in Vitro din cadrul Clinicii Universitare de Ginecologie din Heidelberg, Germania. Acolo am
urmat un stagiu de 6 luni in cadrul unei burse doctorale DAAD.
Subiectul acestei teze abordeaza tratamentul modern al sterilitatii, si anume reproducerea
umana asistata. Este un domeniu unde cercetarile, si mai ales cele legate de capitole intricate, ca
embriologia si diagnosticul genetic preimplantational – asteapta inca multe raspunsuri si noi
descoperiri.
Am ales in partea generala a tezei, pentru inceput, descrierea hormonului hipotalamic
GnRH, precum si motivele si criteriile pentru care acesta este considerat a avea rol central in
reproducerea umana. Am insistat asupra unor aspecte moderne, descrise mai recent, si anume
activitatea generatorului de pulsuri-GnRH. La fel sunt expuse si amanunte legate de receptorii-
GnRH. Din structura hormonului hipotalamic au derivat substante cu mecanism analog –
agonistii- si antagonistii-GnRH (Capitolul 1).
In acest mod am efectuat o trecere spre clasa de substante - a analogilor-GnRH, care sunt
utilizate pe scara larga in reproducerea umana asistata. Rolul lor este de-a produce o supresie a
functiei hipofizare. Protocoalele cu agonisti-GnRH sunt cunoscute si sunt aplicate mai demult,
spre deosebire de protocoalele cu antagonisti-GnRH, care sunt de data mai recenta. Cele 2 tipuri
de analogi inca constituie subiect de dezbatere si controverse referitor la impactul lor asupra ratei
sarcinilor in urma tehnicilor de reproducere asistata. Am descris structura substantelor agoniste si
antagoniste, inclusiv exemple de preparate utilizate in practica clinica. Am subliniat avantajele si
dezavantajele acestor doua clase de substante si am detaliat protocoalele terapeutice. Totodata
am expus si datele statistice din studii de specialitate, din literatura internationala, cu referire la
diversele tipuri de protocoale (Capitolul 3).
In cadrul stimularii ovariene controlate se utilizeaza clomifen citratul, gonadotropinele,
combinarea celor doua sau asocierea gonadotropinelor. Dupa ce am trecut in revista un scurt
V
istoric al preparatelor gonadotropinice, m-am axat pe descrierea mecanismului cresterii foliculare
sub actiunea gonadotropilor hipofizari, inclusiv teoria celor doua compartimente celulare. Am
considerat necesara amintirea si detalierea mecanismului intim al recrutarii si dezvoltarii
folicolului dominat pentru a justifica semnificatia gonadotropinelor in reproducerea umana
asistata.
Un ultim capitol al partii generale se refera la tehnicile reproducerii umane asistate. Initial
am descris fertilizarea in vitro conventionala, clasica, si mai apoi tehnicile de micromanipulare a
gametilor umani, culminand cu metoda microinjectarii intracitoplasmatice a unui singur
spermatozoid in ovocit – metoda ICSI si care scurtcircuiteaza toate barierele ce stau in calea
patrunderii spermiei in ovocit. In completarea descrierii acestor tehnici, cu amanunte si din
partea de biologie, am adus cateva imagini din microscopie ale ovocitelor, a celulelor in stadiul
de prezigot si a embrionilor. In finalul partii generale am amintit si studii din literatura, care
redau rezultate ale tehnicilor reproducerii umane asistate.
Pentru a se putea aplica metodele reproducerii umane asistate este deci nevoie de a
stimula controlat ovarul (este vorba de o suprastimulare controlata) prin terapie cu gonadotropine
(modern cu preparate sintetizate genetic), motiv pentru care am insistat asupra preparatelor
gonadotropinice, in capitolul 2. Pentru a evita cresterea prematura a LH-ului endogen, fiind
cunoscute efectele sale negative asupra maturarii foliculare si pentru a evita o ovulatie
necontrolata in cadrul schemelor de stimulare ovariana, se doreste inhibarea hipofizei. In acest
scop se administreaza agonistii- sau antagonistii-GnRH. In acest mod am conceput si am
structurat partea initiala a tezei – partea generala.
Partea speciala este o expunere comparativa, in cadrul unui studiu propriu, a
protocoalelor cu agonisti- si antagonisti-GnRH, in ideea de-a desprinde unele observatii
referitoare la influenta lor asupra ratei sarcinilor, obiectivul final al reproducerii umane asistate.
Studiul este unul retrospectiv, intins pe o perioada de 3 ani (1999; 2000 si 2001). In cadrul
acestei analize am luat in calcul o serie de factori, incercand sa gasesc corelatii intre varsta
pacientei, durata si doza stimularii ovariene cu gonadotropine, nivelul estradiolului seric obtinut
in ziua inducerii ovulatiei, cu rasunet asupra raspunsului ovarian. Pentru fiecare an si grup de
paciente din cadrul fiecarui protocol sunt redate procentele tehnicilor reproducerii umane asistate
aplicate si a rezultatelor lor: numarul de ovocite recoltate, numarul de celule fecundate.
VI
Subcapitolele „Observatii” cuprind detaliat complicatiile de tipul raspunsului redus („low
response”) sau a celui exagerat (sindrom de hiperstimulare) la terapia de stimulare ovariana.
Pentru aceste complicatii am incercat sa gasesc ce factori au influentat raspunsul ovarian
inadecvat – corelatii intre varsta pacientei, durata medie a stimularii ovariene si numarul mediu
de unitati de gonadotropina administrata, nivelul mediu al estradiolului seric obtinut, comparativ
cu valorile medii ale acestor parametri pentru intreg lotul de paciente. De asemenea am precizat
la fiecare acest caz ce tip de protocol s-a aplicat.
Subcapitolele „Concluzii” redau detaliat numarul si evolutia sarcinilor obtinute, inclusiv
tehnica aplicata, tipul protocolului utilizat si gonadotropina administrata.
Fiecare statistica in parte cuprinde un subcapitol ”Discutii” cu remarci comparative
asupra influentei acestor parametri in rata sarcinilor.
Am considerat deosebit de utila expunerea statisticii Centrului de Laparoscopie,
Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul Clincii Universitare de
Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara. Avand in vedere ca acest centru este un centru de
referinta in Romania si a acumulat deja experienta in domeniu, am amintit statistica pe primii 5
ani de activitate.
Un ultim capitol din partea speciala acorda atentie crioconservarii, metoda moderna ce
ofera posibilitatea pastrarii la –196°C a celulelor fecundate si a spermatozoizilor si cu utilizarea
lor ulterioara, dupa decongelare. In acest capitol, dupa o scurta expunere teoretica, am dorit sa
reliefez impactul agonistilor- versus antagonisti-GnRH in obtinerea acestor celule, si anume -
care tip de protocol se insoteste de un procent mai mare de celule fecundate, din care o parte se
crioconserva. Procesul congelarii si al decongelarii, dar si calitatea celulelor fecundate, posibil
influentata (?) de agonisti/antagonisti au impact asupra ratei supravieturii celulare dupa
decongelare.
Prin aceste cercetari, teza de fata isi propune o discutie si unele observatii asupra
avantajelor si dezavantajelor protocoalelor cu agonisti comparativ cu antagonisti-GnRH in cadrul
tehnicilor de reproducere umana asistata, cu impactul lor asupra ratei sarcinilor si incearca prin
aceasta sa contribuie la un progres al tratamentului cuplurilor cu sterilitate, ce intra in programe
de reproducere asistata.
VII
Abrevieri GnRH: hormon eliberator de gonadotropine
GABA: acid gamaaminobutiric
SNC: sistem nervos central
FSH: hormon foliculostimulant
LH: hormon luteinizant
HCG: coriogonadotropina umana
TSH: hormon tireostimulant
rFSH: preparat recombinat al FSH
HMG: gonadotropina umana obtinuta din urina menopauzala
FSH-HP: preparat inalt purificat al FSH
ß-HCG: fractiunea beta a hormonului coriogonadotropinic uman
E2: estradiol
PCOS: sindromul ovarelor micropolichistice
FIV: fertilizare in vitro
ET: embriotransfer
GIFT: transfer intratubar al gametilor
ZIFT: transfer intratubar al zigotului
ZD: perforarea zonei pellucida
PZD: disectia partiala a zonei pellucida
SUZI: inseminare subzonala
ICSI: injectie intracitoplasmatica a spermatozoidului
MESA: aspirarea microchirurgicala a spermatozoizilor din epididim
TESE: extragerea chirurgicala a spermatozoizilor din testicul
PESA: aspirare percutan a spermatozoizilor epididimali
PN: pronuclei
UI: unitati internationale
ESHRE: Societatea Europeana de Reproducere Umana si Embriologie
VIII
Cuvant inainte
Introducere
Abrevieri
Cuprins
A. Partea generala pag. 1
GnRH – molecula princeps in reproducere Gonadotropii – terapie de stimulare ovariana Agonisti si antagonisti-GnRH; protocoale in cadrul reproducerii umane asistate Tehnici de reproducere umana asistata. De la fertilizarea in vitro la tehnicile de micromanipulare si ICSI
Capitolul 1- GnRH - rolul si implicatia sa in reproducere pag. 2
Capitolul 1.1
GnRH – molecula princeps in reproducere
Capitolul 1.2
Generatorul de pulsatii GnRH
Capitolul 1.3
Influentele neurotransmitatorilor
Capitolul 1.4
Variatia fiziologica a pulsatiilor GnRH
Capitolul 1.5
Structura GnRH
Capitolul 1.6
Receptorul GnRH
Capitolul 2 – Gonadotropii pag. 13
Capitolul 2.1
Scurt istoric
Capitolul 2.2
Structura si efectele generale ale gonadotropilor hipofizari
Capitolul 2.3
Reglarea secretiei gonadotropilor hipofizari
IX
Capitolul 2.4
Efectele gonadotropilor hipofizari in reglarea cresterii foliculare
Capitolul 2.5
Gonadotropii utilizati in suprastimularea ovariana controlata
Capitolul 3 – Analogii-GnRH pag. 25
Capitolul 3.1
Agonistii-GnRH
Capitolul 3.2
Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor agonisti-GnRH
Capitolul 3.3
Efectul agonistilor asupra fazei luteale
Capitolul 3.4
Antagonistii-GnRH
Capitolul 3.5
Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor antagonisti-GnRH
Capitolul 4 – Raspunsul pacientelor la stimularea ovariana controlata pag. 36
Capitolul 4.1
Raspuns insuficient al pacientelor la terapia de stimulare
Capitolul 4.2
Raspuns exagerat al pacientelor la terapia de stimulare. Sindromul de hiperstimulare ovariana
Capitolul 4.3
Medicatia hormonala administrata in reproducerea asistata si cancerul
Capitolul 5 - Tehnici de reproducere umana asistata
– fertilizarea in vitro (FIV) pag. 43
Capitolul 5.1
Istoric
Capitolul 5.2
Tehnici de recoltare ovocitara
Capitolul 5.3
Extinderea FIV in lume. FIV in Romania
Capitolul 5.4
X
Tehnica FIV
Capitolul 5.5
Prelucrarea spermei
Capitolul 5.6
Controlul fecundatiei
Capitolul 5.7
Realizarea embriotransferului
Capitolul 5.8
Rezultatele generale ale FIV
Capitolul 5.9
GIFT (gamete intrafallopian transfer) si ZIFT (zygote intrafallopian transfer)
Capitolul 6 - Tehnici de micromanipulare
in cadrul reproducerii umane asistate pag. 62
Capitolul 6.1
Tehnici de micromanipulare anterioare ICSI
Capitolul 6.2
ICSI (intracytoplasmatic sperm injection)
Capitolul 6.3
Tehnica microinjectarii
Capitolul 6.4
Rezultatele ICSI
B. Partea speciala
Studiu comparativ pe 3 ani al administrarii agonistilor- si antagonistilor-GnRH in
reproducerea umana asistata referitor la rata sarcinilor pag. 78
Capitolul 1 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu agonisti-GnRH in reproducerea
umana asistata pag. 80
Capitolul 1.1
Statistica pe anul 1999 pentru protocoalele cu agonisti-GnRH
a. Material si metoda
XI
b. Rezultate
c. Observatii
d. Concluzii
e. Discutii
Capitolul 1.2
Statistica pe anul 2000 pentru protocoalele cu agonisti-GnRH
a. Material si metoda
b. Rezultate
c. Observatii
d. Concluzii
e. Discutii
Capitolul 1.3
Statistica pe anul 2001 pentru protocoalele cu agonisti-GnRH
a. Material si metoda
b. Rezultate
c. Observatii
d. Concluzii
e. Discutii
Capitolul 1.4
Statistica pe cei 3 ani pentru protocoalele cu agonisti-GnRH
a. Material si metoda
b. Rezultate
c. Observatii
d. Concluzii
e. Discutii
Capitolul 2 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH in reproducerea
umana asistata pag. 135
Capitolul 2.1
Statistica pe anul 1999 pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH
a. Material si metoda
XII
b. Rezultate
c. Observatii
d. Concluzii
e. Discutii
Capitolul 2.2
Statistica pe anul 2000 pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH
a. Material si metoda
b. Rezultate
c. Observatii
d. Concluzii
e. Discutii
Capitolul 2.3
Statistica pe anul 2001 pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH
a. Material si metoda
b. Rezultate
c. Observatii
d. Concluzii
e. Discutii
Capitolul 2.4
Statistica pe cei 3 ani pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH
a. Material si metoda
b. Rezultate
c. Observatii
d. Concluzii
e. Discutii
Capitolul 3 – Discutii pag. 190
XIII
Capitolul 4 – Statistica pe primii 5 ani a Centrului de Laparoscopie, Chirurgie
Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul
Clincii Universitare de Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara pag. 206
Capitolul 5 – Crioconservarea pag. 215
Capitolul 5.1 Crioconservarea si locul acesteia in cadrul reproducerii umane asistate Capitolul 5.2
Efecte fizice in cursul congelarii
Capitolul 5.3
Substantele crioprotectoare
Capitolul 5.4
Crioconservarea celulara
Capitolul 5.5
Rezultatele dupa decongelarea celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu agonisti-
GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata
Capitolul 5.6
Rezultatele dupa decongelare a celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu
antagonisti-GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata
Capitolul 5.7
Discutii crioconservare
Capitolul 5.8
Concluzii crioconservare
Capitolul 6 -- Concluzii generale pag. 246
Bibliografie pag. 253
1
A. Partea generala
GnRH – molecula princeps in reproducere Gonadotropii – terapie de stimulare ovariana Agonisti- si antagonisti-GnRH; protocoale in cadrul reproducerii umane Tehnici de reproducere umana asistata. De la fertilizarea in vitro la tehnicile de micromanipulare si ICSI
2
Capitolul 1
GnRH - rolul si implicatia sa in reproducere
Capitolul 1.1
GnRH – molecula princeps in reproducere
In controlul nervos al sistemului reproductiv feminin rolul central il detine GnRH
(gonadotropin releasing hormone, LHRH(F) – luteinizing releasing hormone sau factor) - un
hormon cu secretie pulsatila, produs in neuronii din unele zone ale hipotalamusului (nucleul
arcuat, zona preoptica, zona periventriculara anterioara) [1]; [2].
Secretia hormonala este realizata in nucleii hipotalamici; ulterior, la nivelul terminatiilor
axonilor, hormonii sunt eliberati in sistemul port hipofizar si prin circulatia descrise de Gr.T
Popa si Fielding (1930) ajung la nivelul hipofizei anterioare [3]; [4].
La acest nivel se elibereaza gonadotropii: hormonii FSH (hormon foliculostimulant, folitropina)
si LH (hormon luteinizant) (secretati tot in sistem pulsatil) cu rol in coordonarea ciclului
menstrual. De abia in 1978 s-a demonstrat si s-a recunoscut interventia hormonului GnRH in
reglarea functiei ovariene, rol constatat prin faptul ca administrarea continua a GnRH determina
secretia scazuta a hormonilor FSH si LH. Este meritul cercetarilor a 2 oameni de stiinta – Dr.
Andrew Schally si Dr. Roger Guillemin si a echipelor lor de studiu, care au reusit descrierea
structurii si sinteza GnRH (1971). Activitatea acestora a fost incununata prin decernarea
premiului Nobel in domeniul fiziologiei endocrinologiei reproductive (1977) [5]; [6].
Neuronii secretori ai GnRH isi au originea extracerebral, la nivelul placii olfactive si
migreaza de-a lungul nervului olfactiv spre septul nazal si strabat placa cribriforma, ajungand in
final la nucleul arcuat. Afectarea migrarii neuronale asociaza hipogonadismul hipogonadotrop cu
anosmia (sindrom Kallmann). Migrarea neuronala si pasajul acestora prin placa cribriforma sunt
influentati de o serie de factori reglatori.
S-a constatat ca GnRH este prezent in structurile nervoase embrionare inca din saptamana
9-10 de gestatie, dar de abia din saptamana 14-15 sunt realizate toate conexiunile intre neuronii
hipotalamici si sistemul port hipofizar iar FSH si LH sunt detectati din saptamana a 10-a de
gestatie la nivelul structurilor nervoase si in sange la 12 saptamani de gestatie [7]; [8].
3
Nivelurile embrionare/ fetale de FSH si LH cresc pana la jumatatea perioadei de gestatie ca apoi
sa scada. GnRH este secretat in tot timpul vietii intrauterine, cu rol in perioada fetala tardiva si in
cea neonatala (rol in dezvoltarea normala a organelor genitale externe).
Secretia pulsatila a GnRH are un rol crucial in mentinerea functiei reproductive.
Modificari ale ritmului pulsatil cauzate, de exemplu, de stress sau de infectii pot afecta functia
endocrina a hipofizei si a gonadelor. Activitatea pulsatorie a hipotalamusului este influentata de
diversi neurotransmitatori de tipul norepinefrinei, a dopaminei, a serotoninei, a acidului gama-
aminobutiric (GABA), de steroizi (estradiol, progesteron, testosteron), de opioide endogene
(beta-endorfina), de neuropeptide (neuropeptidul Y, proencefalina) [9].
Capitolul 1.2
Generatorul de pulsatii GnRH
Neuronii GnRH apartin unei retele hipotalamice, numita generator de pulsatii GnRH,
care induce si coordoneaza secretia episodica a neuropeptidelor. Acest concept de generator de
pulsatii GnRH a fost verificat initial experimental si ulterior dovedit si la om si este general
valabil pentru toate mamiferele [10].
Generatorul de pulsatii GnRH are urmatoarele caracteristici: este localizat in regiunea
arcuata a hipotalamusului mediobazal; reprezinta o proprietate intrinseca a acestei structuri,
capabila de-a functiona fara stimuli neuronali extrahipotalamici sau stimuli hormonali. Pulsatiile
GnRH coincid cu pulsatiile gonadotropinelor. Eliberarea ritmica de GnRH in sistemul port
hipofizar determina o secretie pulsatila de gonadotropine [11].
Recent s-au descris din punct de vedere electrofiziologic componentele acestui generator
de pulsatii GnRH. Acestea sunt cresteri ritmice ale unei activitati electrice la nivelul unor unitati
multiple, care sunt sincrone cu initierea pulsatiilor de LH. Prin analiza unei singure unitati s-a
evidentiat faptul ca aceste descarcari electrice reprezinta o crestere a ratei descarcarilor unitatilor
individuale si nu activarea unor celule dormante [12].
Importanta secretiei pulsatile a fost verificata experimental (pe maimuta). Prin lezarea
hipotalamusului mediobazal si, prin administrarea exogena de GnRH in ritm continuu, se
constata scaderea nivelului gonadotropinelor. Administrarea pulsatila exogena de GnRH a
restabilit nivelul de gonadotropine anterior leziunii hipotalamice. Mentinerea unui ritm constant
4
de GnRH exogen poate induce totusi cicluri ovulatorii. Se poate aplica acest efect si la femei cu
secretie endogena deficitara, la care se va administra GnRH exogen prin pompa de GnRH pentru
a restabili ovulatia.
Generatorul de pulsatii GnRH are rol determinant in reglarea ciclului reproductiv
feminin. Acest generator de pulsatii GnRH este supus unor variatii importante in cursul fazelor
ciclului menstrual, in special datorita influentei modulatorii a steroizilor gonadali. Factori de
tipul neurotransmitatorilor si neuropeptidelor moduleaza activitatea generatorului de pulsatii
GnRH prin medierea actiunii hormonilor steroizi sau prin medierea efectelor inhibitorii ale
factorilor externi: stress, somn, efort fizic crescut, aport caloric redus (in anorexia nervoasa apare
amenoree hipogonadotropica pe motivul scaderii secretiei GnRH datorate cresterii opioizilor
endogeni, care inhiba activitatea generatorului de pulsatii GnRH). Activitatea generatorului de
pulsatii GnRH este oprita in sarcina si in alaptare. Orice schimbare in frecventa pulsurilor GnRH
va modifica la randul sau fazele unui ciclu menstrual normal. Pulsatii de GnRH de frecventa
inalta au ca efect exprimarea LH α-ARNm si nu a LH β –ARNm sau a FSH β –ARNm. Pe de alta
parte o frecventa joasa a pulsatiilor GnRH induc exprimarea FSH β –ARNm. Secretia fiziologica
a pulsatiilor GnRH se insoteste de eliberarea atat a FSH cat si a LH de la nivelul hipofizei [13].
5
Fig. 1 - Redarea schematica a controlului prin feed-back a axului hipotalamo-hipofizo-ovarian
NE=norepinefrina, E=epinefrina, DA=dopamina and EOP=opiode endogene (Marshall JC:
Regulation of gonadotropin secretion. In DeGroot LJ (Eds): Endocrinology (ed3). Philadelphia,
Saunders Press, 1995: 1993-2007)
Capitolul 1.3
Influentele neurotransmitatorilor
Neurotransmitatorii care influenteaza constant secretia de GnRH sunt catecolaminele,
opiozii endogeni, dopamina, neuropeptidul Y, galanina (cu rol mai redus) (Fig 1). Opiozii de la
nivelul SNC au in parte rolul de-a transmite si de-a amplifica inhibitia prin feed-back a
steroizilor gonadali asupra secretiei de GnRH, jucand un rol important in eliberarea dinamica a
gonadotropinelor in fazele ciclului menstrual [14]. Activitatea opioizilor endogeni si a
6
receptorilor acestora este reglata de estradiol si de progesteron; concentratia lor variaza functie
de concentratiile steroizilor, adica la inceputul ciclului menstrual – in faza foliculara incipienta,
cand secretia de estradiol este mica, atunci si concentratia opioizilor va fi scazuta. In faza luteala
creste concentratia opioizilor endogeni. O inhibitie a opioizilor in faza foliculara tardiva sau in
faza luteala (cand nivelurile lor sunt crescute) va produce o defrenare/dezinhibitie a GnRH-ului
si implicit vor creste si nivelurile de gonadotropi [15].
Administrarea intraventricular a norepinefrinei in mod pulsatil stimuleaza secretia de LH.
Tratamentul cu fenoxibenzamina (blocant al receptorilor α-catecolaminergici) inhiba secretia de
GnRH si de gonadotropi, tratamentul cu analogi morfinici scade secretia de gonadotropine si
tratamentul cu antagonisti opioizi (naloxone) creste eliberarea de LH [16].
Administrarea de naloxone in faza foliculara incipienta nu are ca efect modificari in secretia
diurna de GnRH si de LH, dar in cadrul secretiei nocturne va inhiba scaderea nivelului de GnRH,
iar in faza foliculara tardiva va produce o crestere in frecventa si amplitudine a FSH si LH. Se
presupune ca opioizii endogeni au rol si in declansarea ovulatiei prin influentarea peak-ului de
LH preovulator. Activitatea opioizilor scade la mijlocul ciclului menstrual si astfel este defrenata
secretia de FSH si LH [17].
In ceea ce priveste influentele dopaminei asupra modularii activitatii generatorului de
pulsatii GnRH se presupune ca are un efect de inhibare indirecta, mediata prin actiunea
opioizilor si posibil un efect de stimulare directa a secretiei de GnRH.
S-a demonstrat prin studii experimentale ca steroizii sexuali influenteaza atat in sens
stimulator cat si in sens inhibitor secretia de GnRH, efectele fiind in functie de durata si de doza.
Efectele lor sunt mediate de opioizii endogeni (neuromediatori de tipul β endorfinei,
norepinefrinei, dopaminei, neuropeptidului Y). Neuronii din zona preoptica si nucleul arcuat
prezinta o densitate mare de receptori estrogenici, pe de alta parte estrogenul este capabil sa
induca receptori pentru progesteron la nivelul neuronilor in zona mediobazala a hipotalamusului
[18]; [19].
Neuronii secretanti de opioizi prezinta o concentratie mare de receptori pentru steroizii sexuali,
la fel si neuronii dopaminergi exprima receptori pentru estrogen si progesteron [20].
Neuronii GnRH prezinta insa o densitate scazuta a receptorilor pentru steroizii sexuali [21].
Sinapsele intre neuronii GnRH includ GABA si GnRH. Neuronii GABA au rol de
pacemaker, nivelurile crescute si prelungite de GABA la nivel hipotalamic afecteaza negativ
7
activitatea generatorului de pulsatii GnRH. Aria preoptica (la nivelul hipotalamusului anterior)
contine neuroni GABA [22].
Prezenta sinapselor GnRH intre neuronii secretanti de GnRH explica exprimarea receptorilor-
GnRH la nivel hipotalamic. Injectarea intraventricular de GABA determina oprirea generatorului
de pulsatii GnRH, cu scaderea marcata consecutiv a LH-ului si scaderea exprimarii GnRH si a
receptorului-GnRH in hipotalamus in analogie cu receptorul-GnRH din hipofiza. Functia si
expresia genica a acestor receptori este in stricta dependenta de expunerea episodica la ligand.
Daca oprirea generatorului de pulsatii GnRH este asociata cu reducerea exprimarii genice, atunci
se produce un control autocrin al generatorului de pulsatii GnRH prin receptorii-GnRH
hipotalamici. Generatorul de pulsatii GnRH este reglat la diferite niveluri prin controlul
transcriptiei atat a genei GnRH cat si a genei receptorului-GnRH hipotalamic. Controlul autocrin
al neuronilor GnRH este cheia functionarii generatorului de pulsatii GnRH. Studii in vitro mai
recente au evidentiat ca semnalele ritmice pot proveni chiar din neuronii GnRH. Elucidarea
mecanismului de pacemaker si integrarea celulelor componente reprezinta o provocare pentru
viitor.
Capitolul 1.4
Variatia fiziologica a pulsatiilor GnRH
Ca structura, GnRH este un decapeptid, cu timp de injumatatire scurt, de 2-5 minute.
Secretia pulsatila este diferita in cadrul fazelor ciclului menstrual, atat amplitudinea cit si
frecventa descarcarii pulsatiilor (in faza foliculara amplitudinea este mai mica, dar frecventa mai
crescuta).
Se considera ca fiecare puls de GnRH poate actiona la nivel hipofizar. Intervalul dintre
doua pulsatii este intre 70-90 minute. Frecvente inalte (mai mult de 1 puls/ora) stimuleaza
secretia de LH, pe cand o frecventa mai joasa este raspunzatoare de secretia de FSH.
Secretia de GnRH si de gonadotropine este diferita in functie de varsta, astfel ca imediat
dupa nastere si in primele luni de viata creste secretia de GnRH si gonadotropi (posibil datorita
steroizilor sexuali de tipul estradiolului matern, care induc secretia de GnRH) [8]. Dupa primul
an de viata si pana la pubertate copiii au niveluri scazute de gonadotropi si de hormoni sexuali.
Pulsatiile de GnRH si de LH in perioada prepubertara au o frecventa si amplitudine joasa: 1 puls
8
la 3-4 ore la fetite si 1 puls/ora la baieti. Odata cu maturarea axului hipotalamo-hipofizo-ovarian
la pubertate se produce dezvoltarea unui model de secretie circadiana a LH-ului. Accentuarea
nocturna a secretiei gonadotropinelor marcheaza instalarea dezvoltarii sexuale. Cresterea
nivelurilor circulante de LH reflecta o crestere in amplitudine si o mai mica crestere in frecventa
a pulsatiilor GnRH in timpul fazelor initiale ale somnului. Pe parcursul maturarii se accentueaza
pulsatiile de LH spre trezire. Se presupune ca dezinhibitia secretiei LH este determinata de un
mecanism dependent de centri superiori din SNC (Fig. 2) [23]; [24].
La pubertate este modificat raspunsul sistemului neuroendocrin sub influenta steroizilor.
Initial, cresterea nocturna a secretiei de GnRH va influenta pozitiv secretia de FSH, care este
inhibata de cresterea secretiei estrogenice. Ulterior, cresterea in continuare a secretiei de GnRH
(in sensul amplitudinii si a frecventei) va influenta pozitiv secretia LH-ului. Estrogenii la randul
lor vor accentua secretia de LH [25].
Fig. 2 - Variatiile plasmatice al LH in decurs de 24 ore la fetite cu profil hormonal normal versus
hyperandrogenemie in pubertatea precoce versus pubertatea intarziata.
In pubertatea precoce cresc pulsatiile LH in somn (prezente, dar anormale in caz de
hiperandrogenemie), ulterior la pubertate pulsatiile se stabilizeaza la fetitele cu profil hormonal
normal.
9
Fig. 3 - Nivelurile plasmatice ale hormonilor in cadrul ciclului menstrual. Sagetile indica
pulsatiile GnRH, distanta dintre ele reprezinta frecventa pulsatiilor iar lungimea sagetilor –
cantitatea de GnRH secretata. (Marshall JC et al: Gonadotropin-releasing hormone pulses:
Regulators of gonadotropin synthesis and ovulatory cycles. Recent Prog Horm Res 47:155-189,
1991)
In perioada fertila a femeii secretia de GnRH este supusa influentelor steroizilor sexuali
(Fig. 3). In postmenopauza apare o dezinhibare a productiei de GnRH, urmata de o crestere a
nivelurilor de FSH si LH, consecinta a incetarii functiei ovariene (nu mai exista supresia
estrogenilor).
Capitolul 1.5
Structura GnRH
Lantul aminoacidic al GnRH este urmatorul: pGlu-His-Trp-Ser-Tir-Gli-Leu-Arg-Pro-Gli-
NH2. GnRH provine dintr-o molecula precursoare de dimensiuni mari: pre-pro GnRH, care
contine 92 aminoacizi. Prin studii enzimatice s-a constatat ca aminoacidul din pozitia 6 este
implicat in inactivarea hormonului (clivarea enzimatica a legaturii peptidice 6-7 produce peptide
biologic inactive), pe cand aminoacizii din pozitiile 2 si 3 au rol in secretia gonadotropilor.
Pozitiile 1, 6 si 10 sunt implicate in mentinerea structurii spatiale si in legare.
10
De la sinteza GnRH s-au mai descoperit la om si alte izotipuri (in total 3 izotipuri, cu
diferente de aminoacizi in structura – tipul I, II si III, conform tabelului 1) [26]. Se considera ca
genele pentru GnRH uman tipul I si II se afla pe cromozomul 8 si respectiv 20; gena pentru tipul
III inca nu a fost stabilita. De asemenea inca nu este elucidat daca cele 3 izotipuri de GnRH au
roluri fiziologice diferite si nu este cunoscuta inca distributia receptorilor pentru cele 3 izotipuri.
Izotipul I este GnRH-ul clasic care actioneaza in reglarea secretiei gonadotropilor.
Tabel 1 - Izotipuri GnRH Secventa aminoacizilor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
GnRH nativ pGlu His Trp Ser Tir Gli Leu Arg Pro Gli-
NH2
GnRH izotip I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
GnRH izotip II 1 2 3 4 His 6 Trp Tyr 9 10
GnRH izotip III 1 2 3 4 5 6 Trp Leu 9 10
Efectul GnRH la nivel hipofizar se manifesta prin legarea hormonului de receptorii
membranari specifici prezenti la nivelul celulelor gonadotrope [27].
Aceste celule reprezinta aproximativ 10% din masa celulara a adenohipofizei. Dupa legarea de
receptori are loc activarea sistemului “second-messenger” (fosfolipaze, calmodulin,
proteinkinaza C, inozitolfosfat, acid arahidonic, leucotriene, AMPc), care vor conduce la
producerea de gonadotropine. O celula este capabila sa secrete atat FSH cat si LH, eliberarea si
secretia gonadotropilor fiind stabilita de GnRH.
Capitolul 1.6
Receptorul GnRH
Membrana celulelor adenohipofizare secretante de gonadotropi are doua locusuri de
legare pentru moleculele de GnRH; receptorii pentru GnRH reprezinta de fapt zona cu afinitate
crescuta, iar partile cu afinitate mica sunt endopeptidaze. Receptorul pentru GnRH este o
glicoproteina ce are in structura sa si acid sialic.
11
Legarea GnRH de receptorul membranar implica modificarea structurii complexului
hormon-receptor specific si internalizarea totala a acestui complex, care urmeaza a fi degradat
lizozomal, in celula. Eliberarea de gonadotropi implica un proces dependent de Ca2+. Se
considera ca internalizarea complexului are rol in mecanismul de actiune al agonistilor-GnRH si
este mai putin important in secretia gonadotropilor [9].
Receptorii au o distributie uniforma la nivelul celulei. Dupa formarea complexului
GnRH-receptor apare migratia laterala a acestuia de-a lungul membranei celulare. Dupa
internalizarea complexului GnRH-receptor o parte sunt degradati intracelular iar o parte se
reintorc la nivelul membranei. Concentratia receptorilor membranari diminua odata cu inaintarea
in varsta si in cursul lactatiei si creste dupa ovariectomie. Refacerea rapida a receptorilor la
nivelul membranei celulare este o proprietate a GnRH-ului de-a mentine si regla concentratia
receptorilor sai.
Studiile mai recente au constatat ca receptorul pentru GnRH are o parte extramembranara, 7 parti
transmembranare helicoidale si o parte intracelulara care este legata de o proteina G [28].
La marea majoritate a vertebratelor exista mai multe tipuri de receptori. Locusul genic pentru
receptorul tipului I de GnRH este la nivelul cromozomului 4 iar locusul genic pentru tipul II se
afla pe cromozomul 1 [29]; [30]; [31].
La om este clar dovedit doar un tip de receptor GnRH. Legarea hormonului de receptor la nivelul
celulelor gonadotrope implica activarea proteinei G cu eliberarea de “second messenger”,
activarea protein-kinazei si eliberarea ionilor de Ca2+ [32]; [33].
Aceasta cascada are ca efect final secretia de gonadotropi. Secretia pulsatila este situatia
fiziologica in organism, daca insa se administreaza GnRH in mod constant, continuu, aceasta va
fi insotita de o crestere initiala a sintezei si secretiei de gonadotropi (efectul de “flare-up”), ca
apoi sa apara o desensibilizare a hipofizei cu scaderea consecutiva a gonadotropilor.
Se stie in cadrul acestui mecanism ca semnalizarea postreceptor este importanta si ca pierderea
receptorilor (“down-regulation”, supresia) joaca un rol de initiere a fenomenului [34].
Administrarea continua a GnRH are urmatoarele efecte asupra celulei hipofizare:
Scaderea numarului de receptori membranari de la nivelul celulelor gonadotrope;
Blocarea canalelor de calciu, care sunt mediate de acesti receptori;
Incapacitatea celulelor gonadotrope de a transforma gonadotropii din forma
nesecretanta in cea secretanta;
12
Hipofiza devine refractara la molecula de GnRH.
Odata cu descifrarea structurii hormonale si prin izolarea substantei s-a reusit si sinteza
unor compusi, numiti analogi ai GnRH, care au proprietati, afinitate fata de receptori, stabilitate,
activitate intrinseca diferita de molecula nativa. Astfel, dupa aceste caracteristici si dupa
mecanismul lor de actiune analogii se impart in agonisti si antagonisti ai GnRH. Ei isi gasesc
multiple aplicatii in tratamentul diferitelor afectiuni, ca de exemplu: in endometrioza; in
tratamentul sterilitatii; preoperator in cazul fibroamelor uterine (GnRH inhiba cresterea
leiomioamelor si prin efect negativ asupra proliferarii celulare si prin inducerea apoptozei); mai
recent in tratamentul cancerului mamar si cel al prostatei.
13
Capitolul 2
Gonadotropii
Capitolul 2.1
Scurt istoric
Adenohipofiza secreta sub actiunea GnRH hormonii gonadotropi – FSH (hormon
foliculostimulant, folitropina) si LH (hormon luteinizant). Zondek (in 1926-1927) a descoperit ca
functia ovariana se afla sub controlul hormonal a gonadotropilor. Ulterior, la mijlocul secolului
XX extractele urinare al gonadotropilor de la animale au fost introduse in tratamentele de
stimulare ovariana, initial experimental apoi si la om, obtinandu-se prima sarcina (1960) [35];
[36].
Cercetari si perfectionari continue au avut ca rezultat inlocuirea gonadotropilor de la
animale (datorita efectelor adverse – anticorpi, boala Creutzfeldt-Jacob) cu gonadotropina umana
menopauzala (obtinuta din urina femeilor aflate in postmenopauza, HMG). Ca si mod de actiune
HMG prin continutul sau in FSH induce cresterea nivelului de FSH in faza foliculara (zilele 3-7)
si permite o recrutare foliculara mai mare. Aceste preparate au efecte adverse datorita unui
continut crescut de proteine, chiar daca ele sunt administrate intramuscular (intoleranta, reactii
alergice). Pe langa acest fapt HMG contine si LH (menotropina: 75 UI FSH si 75 UI LH) si are
contraindicatii relative in cazul pacientelor cu PCOS (risc de aparitie a sindromului de
hiperstimulare ovariana) [124]. In anii ´80 s-au sintetizat preparatele HMG cu o componenta
extrem de redusa a LH-ului (urofolitropina: 0,1 UI LH la 75 UI FSH). Acestea au fost inlocuite
apoi in anii ´90 cu preparate de FSH inalt purificate (FSH-HP; highly purified follitropin), care
au eliminat componentele proteice si fractiunea LH si care se pot administra subcutan [37]. In
prezent se utilizeaza preparate de FSH uman recombinat (rFSH), sintetizat prin inginerie
genetica. Ele se obtin prin introducerea genelor ce codifica subunitatile α si β ale FSH in vectori
de expresie ce sunt transferati in linii celulare ovariene ale hamsterului chinezesc. Aceste noi
substante cu administrare subcutana sau intramusculara au si alte avantaje fata de predecesorii
lor; iar pe langa acestea nu exista nici riscul de infectie si nici de formare de anticorpi anti-
gonadotropina [38]; [39].
14
Capitolul 2.2
Structura si efectele generale ale gonadotropilor hipofizari
Ca structura, gonadotropii hipofizari sunt heterodimeri formati din 2 subunitati
polipeptidice glicozilate (α si β), lantul α este comun pentru FSH, LH, TSH (hormon
tireostimulant) si HCG (coriogonadotropina umana). Cele 2 lanturi contin legaturi non-covalente
si resturi oligozaharidice. In cadrul fiecarei subunitati exista legaturi disulfidice: 5 in lantul α si 6
in lantul β. Lantul α al FSH contine 92 aminoacizi si lantul β - 118 aminoacizi, care ii confera
proprietati unice si legarea de receptorul specific. Glucidele din componenta FSH sunt fructoza,
galactoza, manoza, glucozamina, galactozamina si acidul sialic, ultima componenta fiind
responsabila pentru timpul de injumatatire a hormonului (3-4 ore). Cu cat cantitatea de acid sialic
este mai mare, cu atat timpul de injumatatire este mai prelungit. Lantul β-FSH contine 2 unitati
carbohidrat acid sialic pe cand lantul β-LH doar una singura [40].
Gena pentru subunitatea α-FSH este localizata pe cromozomul 6p21.1-23, exprimata in diferite
celule si gena pentru subunitatea β - pe cromozomul 11p13, exprimata in celulele hipofizei si
aflata sub controlul GnRH, inhibata de actiunea inhibinei [41].
Cunoasterea si mapping-ul epitopurilor functionale pentru actiunea intra- si extracelulara
a hormonului are o importanta aparte in intelegerea functiei atat a hormonului in sine cat si a
receptorului sau. Recent s-a descris structura tridimensionala a FSH legat de regiuni
extracelulare ale receptorului sau (FSHRHB) (Fig.4). Structura complexului hormon-receptor
dovedeste ca amandoua subunitatile sunt implicate in mod diferit in legarea de receptorul
specific, subunitatii α ii revine rolul stereochimic [42].
15
Fig. 4 - Structura tridimensionala a FSH
Efectele FSH sunt dependente de sex: la femei in perioada reproductiva actioneaza
stimulator asupra cresterii foliculare si asupra secretiei esterogenice, la barbat, in sinergie cu
testosteronul efectele se rasfrang asupra stimularii spermiogenezei.
LH este sintetizat in aceleasi celule adenohipofizare si sub acelasi stimul. Lantul α are 89
aminoacizi si lantul β contine o secventa specifica de 112-115 aminoacizi care ii confera
activitatea hormonala proprie. Ca si in cazul FSH, greutatea moleculara a hormonului este in jur
de 30000-38000 Daltoni si continutul oligozaharidic este intre 16-30%. Se cunoaste doar o
singura gena care codifica lantul β (pe cromozomul 19q13,3) si gena pentru receptorul LH se afla
pe cromozomul 2p21 [43].
Efectele LH la femeie in perioada reproductiva, in faza foliculara, sunt de stimulare a
folicolului in secretia de estrogeni (in sinergie cu FSH). Peak-ul preovulator al LH completeaza
diviziunea ovocitului (meioza I) si in faza luteala LH are rol de stimulare a corpului galben de-a
secreta progesteron. Fiziologic, secretia LH in faza foliculara incipienta este mai scazuta
noaptea, in cursul somnului.
La barbat LH actioneaza asupra celulelor interstitiale testiculare si stimuleaza secretia
testosteronului.
16
Capitolul 2.3
Reglarea secretiei gonadotropilor hipofizari
Legarea GnRH de receptorii specifici membranari adenohipofizari are ca urmare sinteza,
secretia si depozitarea gonadotropilor. Se sintetizeaza lanturile α si β ale FSH si LH si ulterior
glicozilarea acestor subunitati. Dupa sinteza lor, moleculele FSH si LH sunt stocate in granule si
hormonul va fi eliberat prin exocitoza.
In secretia gonadotropilor sunt implicate urmatoarele mecanisme: leucotrienele au rol in secretia
hormonala si proteinkinaza C are ca efect sinteza si secretia gonadotropilor. Influxul de Ca2+
extracelular si activarea intracelulara a Ca2+ sunt raspunzatoare de eliberarea gonadotropinelor
din depozite.
Reglarea secretiei gonadotropilor se bazeaza pe mecanisme de feed-back. Se descriu 3
arcuri de feed-back, cu efect de stimulare sau de inhibare: arcul lung, scurt si ultrascurt (Fig. 5).
Arcul lung se refera la controlul exercitat de steroizii gonadali atat asupra hipotalamusului cat si
asupra hipofizei. Feed-back-ul pozitiv exercitat de estradiol este exemplificat de peak-ul de LH
preovulator iar controlul negativ consta in reglarea secretiei de FSH prin inhibina. In faza
foliculara estrogenii reduc secretia gonadotropilor, dar influenteaza in mod pozitiv sinteza si
depozitarea gonadotropilor (feed-back negativ). Progesteronul isi exercita controlul in mod
special asupra hipofizei si indirect asupra hipotalamusului, atat prin mecanism de feed-back
pozitiv cat si negativ, dar implica existenta secretiei estrogenice.
17
Fig. 5 - Reglarea secretiei gonadotropilor
Bucla de reglare scurta consta in controlul gonadotropinelor asupra secretiei lor de catre
hipofiza. Bucla de reglare ultrascurta se refera la controlul sintezei si secretiei de GnRH chiar
prin intermediul acestui hormon.
Gonadotropii prin actiunea lor la nivel ovarian induc formarea unui folicol dominant,
ovulatia si secretia corpului galben. Exista teoria celor 2 compartimente celulare (Fig. 6) care
explica interactiunea intre celulele granuloase si tecale din cadrul folicolului, dar si aceasta teorie
este incompleta.
18
Fig. 6 – Teoria celor doua compartimente celulare
Capitolul 2.4
Efectele gonadotropilor hipofizari in reglarea cresterii foliculare
FSH isi incepe actiunea in faza finala a unui ciclu menstrual si in faza foliculara
incipienta a urmatorului ciclu menstrual. Celulele granuloasei din folicol poseda receptori pentru
FSH. Acesti receptori isi cresc numarul odata cu cresterea nivelului intraovarian si periferic de
FSH printr-un mecanism de feed-back pozitiv [44]. Mecanismul de actiune al FSH la nivelul
receptorilor celulelor granuloasei implica un mecanism postreceptor mediat AMPc care induce
diferentierea si proliferarea celulelor granuloasei [45]. Factorii locali care intervin in procesul de
proliferare celulara sunt activina, β-TGF (transforming growth factor), factori paracrini.
Cresterea in continuare a FSH va produce proliferarea ceulelor granuloase si, potentat de
estrogeni, va induce receptori pentru LH la nivelul celulelor granuloase. Asa cum am amintit
anterior, cresterea secretiei de estradiol si inhibina exercita un efect de feed-back negativ (arcul
19
lung) asupra secretiei hipofizare de FSH. Prin acest fenomen se inhiba cresterea si maturarea
altor folicoli in afara celui dominant.
Un eveniment cheie in reglarea ciclului ovarian este peak-ul de gonadotropine de la
mijlocul ciclului. Folicolul dominant secreta in continuare estradiol, care daca ajunge la
concentratia serica de aproximativ 150 pg/ml, mentinuta pentru minim 36 ore, exercita un feed-
back pozitiv: la nivelul hipotalamusului creste secretia de GnRH iar la nivelul adenohipofizei
accentueaza sensibilitatea acesteia fata de GnRH, cu descarcare de FSH si LH. Ca o
particularitate: in cursul peak-ului preovulator secretia de GnRH nu mai este pulsatila.
Actiunea sinergica a FSH si a estradiolului creeaza un mecanism intraovarian autoreglator care
induce multiplicarea rapida a celulelor granuloase si prin urmare cresterea foliculara. Spre
deosebire de celulele granuloase care au receptori atat pentru FSH cat si pentru LH, celulele
interstitiale tecale nu exprima receptori decat pentru LH. Legarea LH de acesti receptori are ca
urmare formarea androgenilor, etapa antemergatoare fiind cea de scindare enzimatica a
colesterolului. Androgenii reprezinta substratul sintezei de estrogeni prin procesul de
aromatizare, proces realizat in celulele granuloase [44]. Androstendiona difuzeaza in lichidul
folicular si ca raspuns la efectul citocromului P450 (indus de FSH in celulele granuloase) are loc
procesul enzimatic de aromatizare cu formarea estronei. Ulterior estrona sub actiunea 17-β-
hidroxilazei este transformata in estradiol. Astfel, LH are o actiune secundara fata de FSH, dar o
actiune modulatoare in raspunsul folicolului la FSH. Pe baza studiilor in vitro efectuate la nivelul
tesutului ovarian s-a putut stabili ca LH stimuleaza activitatea aromatazei si sinteza inhibinei in
celulele granuloase din folicolul dominant si ca inhibina are rol paracrin in cresterea secretiei de
estrogeni de catre folicolul dominant [46]; [47].
Daca insa la nivelul folicolului cantitatea de FSH este insuficienta, atunci exista posibilitatea ca
folicolul sa fie degradat datorita efectului nociv al expunerii la o concentratie mare si neadecvata
de androgeni nearomatizati.
Diferite cercetari in vitro, atat experimentale cat si la om, au putut dovedi ca in celulele
granuloase FSH stimuleaza formarea unui factor care induce la randul sau o crestere a expresiei
citocromului P450c17α-ARNmesager stimulata de LH la nivel tecal si astfel o crestere a sintezei
androgenilor [48].
20
Alti factori care intervin in proliferarea si diferentierea celulara sunt factorii de crestere insulin-
like (IGF-I si IGF-II) precum si inhibina. Acestia sunt considerati factori paracrini de reglare
[49].
Receptorii pentru LH de la nivelul celulelor granuloase sunt raspunzatori de inducerea
secretiei progesteronului. In cadrul fazei luteale scade numarul receptorilor pentru FSH si LH.
Datele mai sus enuntate sunt exemplificate in figurile de mai jos (Fig. 7; Fig. 8).
Fig. 7 - Nivelurile serice ale gonadotropilor, progesteronului si inhibinei. Mecanismele intracelulare in cadrul fazei foliculare. [9]
Zi ciclu menstrual
21
Fig. 8 - Selectarea folicolului dominant [9]
Zi ciclu menstrual
22
Figura 9 exemplifica importanta mediului estrogenic in autoreglarea foliculara, respectiv
importanta mediului androgenic cu rol reglator in dezvoltarea foliculara.
Prin urmare FSH si LH sunt de importanta majora in reglarea cresterii foliculare, ei
intervin in recrutarea si selectarea folicolului dominant, in maturarea acestuia si secretia sa
estrogenica.
Capitolul 2.5
Gonadotropii utilizati in suprastimularea ovariana controlata
In urma celor descrise mai sus se deduce utilitatea gonadotropinei in cadrul terapiei de
stimulare ovariana la pacientele cu sterilitate. Prima sarcina in urma acestui tip de tratament a
fost obtinuta in 1960 de Lunenfeld [50].
Fig. 9 - Mediul androgenic si estrogenic intrafolicular in cadrul fazei foliculare [9]
Folicol preantral Cresterea foliculara
23
Ulterior preparatele de gonadotropina au fost introduse si in cadrul protocoalelor de
suprastimulare ovariana controlata din cadrul tehnicilor de reproducere asistata. Administrarea
lor in ciclul folicular incepe de timpuriu – din faza foliculara incipienta - in ziua a 3-a, deoarece
selectarea folicolului dominant se realizeaza pana in ziua 5-7. Scopul este de-a matura mai multi
folicoli in ideea de-a creste numarul ovocitelor si implicit rata fertilizarii si a sarcinilor. Totusi
protocoalele de stimulare ovariana se adapteaza functie de raspunsul fiecarei paciente, fiind un
tratament individualizat. S-au imaginat mai multe tipuri de protocoale, unele cu doza mica de
gonadotropina la inceputul stimularii, ca apoi doza sa fie in continuare scazuta (protocolul
Norfolk, “step-down”), iar altele, ca protocolul Bonn (“step-up”) folosesc o doza mai crescuta de
gonadotropina de la inceputul stimularii, ca apoi sa creasca aceasta doza pana anterior ovulatiei.
Amandoua aceste protocoale au avut insa rezultate similare in ceea ce priveste numarul
ovocitelor recoltate la punctia foliculara [51]; [52]; [124].
Sintetizarea rFSH a insemnat un enorm pas inainte in cadrul stimularii ovariene
controlate. Prima sarcina obtinuta in urma stimularii ovariene cu rFSH a fost in 1992 [53].
Aceste preparate s-au impus si actualmente se folosesc pe scara larga in tratamentul de
suprastimulare ovariana controlata din cadrul protocoalelor diverselor proceduri ale reproducerii
umane asistate. Pana in ziua de astazi exista multiple studii care pledeaza in favoarea utilizarii
rFSH, referitor la actiunea sa in cadrul stimularii ovariene comparativ cu HMG, in ceea ce
priveste numarul si calitatea ovocitelor, rata sarcinilor [54].
Se folosesc 2 preparate rFSH: folitropina α (sub forma comerciala Gonal-F, Serono) si
folitropina β (preparatul Puregon, Organon). S-a constata ca in urma administrarii preparatului
folitropin α efectele la locul administrarii sunt mai reduse [55]. Ca mod de actiune al rFSH se
cunoaste ca normalizeaza raportul LH/FSH si optimizeaza steroidogeneza foliculara [124].
Odata cu introducerea pe scara larga a preparatelor sintetizate genetic s-a dorit compararea
eficientei lor fata de substantele utilizate pana atunci (FSH urinar). Rezultatele unui studiu clinic
multicentric, randomizat au fost publicate in 1995 si au dovedit superioritatea rFSH (atat
folitropin α cat si β) fata de FSH-urinar in ceea ce priveste: numarul ovocitelor (mai multe in
cazul rFSH); durata stimularii (mai scurta pentru rFSH) si numarul de unitati FSH administrate
(mai putine pentru rFSH). Numarul embrionilor de calitate inalta a fost mai crescut la loturile
care au primit rFSH. Conditiile de inhibitie hipofizara, tipul de protocol, numarul pacientilor a
24
fost identic pentru grupele studiate. Nu s-au remarcat insa date semnificativ statistice in ceea ce
priveste rata implantarii si rata sarcinilor la grupele studiate [39].
O alta comparatie s-a efectuat intre preparatul rFSH si FSH inalt purificat. Rezultatele
unui studiu prospectiv randomizat, simplu orb folosind folitropin α versus FSH-HP in aceleasi
conditii de protocol lung (cu acelasi tip de analog-GnRH) au relevat un numar mai mare de
ovocite obtinute prin stimularea ovariana cu rFSH, numar mai mic de zile si doza mai redusa de
FSH in cazul rFSH. De asemenea, ca si in compararea cu FSH urinar, diferenta ratei sarcinilor a
fost nesemnificativa statistic (48% respectiv 47% per embriotransfer). In ceea ce priveste
incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana rezultatele sunt de asemenea comparabile.
Totusi numarul de embrioni crioconservati a fost mai mare (3.2±3.0 versus 1.7±2.5, p<0,0001) in
cazul lotului folosind rFSH fata de FSH urinar inalt purificat [56];[57].
Este cunoscuta degradarea enzimatica a gonadotropilor de catre enzimele digestive, astfel
ca inca nici un preparat sintetizat pana acum nu se poate administra decat parenteral (subcutanat
sau intramuscular).
Totusi, in urma observatiilor efectuate in timp asupra femeilor cu sterilitate la care s-a
efectuat stimularea ovariana cu gonadotropine s-a constatat ca nivelul seric crescut al
estradiolului (insumat prin secretia folicolilor stimulati) induce o crestere prematura a nivelului
de LH (”LH surge”) prin efect de feed-back pozitiv. Acest peak de LH, survenit mai rapid decat
intr-un ciclu normal, actioneaza defavorabil asupra folicolilor, in sensul ca nu toti se afla in
acelasi stadiu de maturare, deci nu toti sunt folicoli preovulatori. Se produce o luteinizare
precoce cu cresterea nivelului progesteronic fata de concentratia sa normala din faza foliculara.
Efectul negativ se repercuta in final asupra ratei sarcinilor [58];[59].
Aceste concluzii au schimbat radical tratamentul de stimulare ovariana din protocoalele utilizate
pentru reproducerea asistata, introducand astfel preparate care sa produca initial o supresie a
hipofizei (pentru a evita cresterea LH-ului endogen) si sa mentina aceasta inhibitie, pentru ca
ulterior sa se initieze stimularea ovariana cu gonadotropi [60].
25
Capitolul 3
Analogii-GnRH Capitolul 3.1
Agonistii-GnRH
Introducerea terapiei cu analogi-GnRH in stimularea ovariana controlata reprezinta o
etapa moderna in cadrul reproducerii asistate. Din aceasta clasa se contureaza 2 tipuri de
substante: agonistii-GnRH si antagonistii-GnRH.
Sunt agenti terapeutici care au fost sintetizati cu scopul de-a creste efectul GnRH.
Comparativ cu molecula nativa, sunt substante cu o rezistenta mai crescuta fata de degradarea
enzimatica, au o stabilitate mai mare si prezinta si o afinitate mai crescuta fata de receptorii-
GnRH (aproximativ de 100 - 200 de ori). Sintetizarea lor are loc prin modificarea configuratiei
moleculei native in pozitiile 6 sau/si 10 (modificarea la ambele niveluri are efect cumulativ).
Modificari la nivelul aminoacizilor din pozitiile 2 si 3 rezulta in substante cu efect antagonist.
Deletia aminoacidului din pozitia 10 se insoteste de legarea crescuta a substantei [61];[62].
O alta caracteristica este faptul ca timpul de injumatatire este mai lung si sunt substante
mai potente.
Tabelul 2 reda principalii agonisti-GnRH iar tabelul 3 - secventa aminoacizilor in preparatele
agonistilor-GnRH comparativ cu molecula nativa [63].
Tabel 2 - Exemple de agonisti-GnRH, preparate farmaceutice si modul de administrare
leuprolide Enantone Gyn i.m /Depot
buserelin Suprefact s.c/intranazal
nafarelin Synarela intranazal
goserelin Zoladex s.c/Depot
histrelin Supprelin s.c.
triptorelin Decapeptyl, Diphereline i.m/Depot
26
Tabel 3 - Secventa aminoacizilor in molecula nativa si analogi-GnRH Secventa aminoacizilor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
GnRH
nativ
pGlu His Trp Ser Tir Gly Leu Arg Pro Gli-NH2
Buserelin 1 2 3 4 5 D-Ser 7 8 9 Etilamida
Goserelin 1 2 3 4 5 D-Ser 7 8 9 AzGli
Leuprorelin 1 2 3 4 5 D-Leu 7 8 9 Etilamida
Triptorelin 1 2 3 4 5 D-Trp 7 8 9 Gli-NH2
Nafarelin 1 2 3 4 5 D-Nal 7 8 9 Gli-NH2
Eficacitatea agonistilor administrati sub forma spray-urilor nazale este de 2-5%
comparativ cu efectul obtinut pe cale subcutanata; toleranta insa este deosebit de crescuta si
efectele secundare sunt minime [62].
S-a constatat ca administrarea continua a agonistilor-GnRH se insoteste de o crestere de
scurta durata a receptorilor membranari, cu eliberarea depozitelor de FSH si LH, dupa care se
produce fenomenul de internalizare a complexului receptor-hormon, cu scaderea ulterioara a
numarului de receptori. Prin internalizare, acest complex este supus degradarii enzimatice
lizozomale. Canalele de calciu, care sunt dependente de acesti receptori, vor fi blocate. Se pierde
capacitatea celulei de-a transforma gonadotropii dintr-o forma nesecretanta intr-una secretanta.
De asemenea se constata ca hipofiza devine refractara la stimularea GnRH nativ. Sinteza de novo
a receptorilor nu poate compensa o pierdere rapida a acestora, pierdere care are loc prin acest
fenomen. Totodata se inhiba si mecanismele postreceptor. Efectul este de scadere al FSH si LH
in celulele gonadotrope (Fig. 10).
27
Fig. 10 - Efectul legarii GnRH de receptor (molecula nativa si analogii-GnRH)
Valorile FSH si LH din ser scad, consecutiv scade si actiunea acestor hormoni. Nivelul
seric al estradiolului atinge nivelul postmenopauzal. Nu se mai produce cresterea si maturarea
foliculara. Blocarea hipofizei persista pe toata durata administrarii agonistului si este reversibila
odata cu intreruperea tratamentului. Normalizarea functiei hipofizare se reia, in medie, in 6
saptamini.
Efectul de „flare-up” consta intr-un efect de stimulare initială a hipofizei, dupa care se
instaleaza efectul de supresie propriu-zis. Dupa 14-21 de zile de la initierea terapiei se ating
valori ale E2 ca in postmenopauza (<50 pg/ml). Acest efect de “flare-up” declanseaza o crestere
initiala de 5 ori a concentratiei de FSH si de 10 ori a LH dupa un interval de 12 ore de la
administrare si consecutiv se inregistreaza un nivel seric al estradiolului marit, de aproximativ 4
ori [64]. Dupa acest efect initial de “flare-up” nivelul FSH va scadea mai rapid decat cel al LH.
28
Administrarea continua a agonistilor, asa numita castrare medicamentoasa, are aplicatii in
tratamentul preoperator al fibromului uterin, in tratamentul endometriozei, in cancerul mamar cu
receptori pozitivi pentru estrogeni, in pubertatea precoce, si nu in ultimul rand in cadrul
tehnicilor de reproducere asistata. La barbat terapia cu agonisti isi gaseste aplicatii in cancerul de
prostata.
In administrarea de lunga durata se constata si unele efecte nedorite, cum ar fi bufeurile
(81% din cazuri), cefaleea (30% din cazuri), greata si vertij (21 % din cazuri), scaderea
libidoului, labilitate psihica [65].
Nu este de neglijat deloc pericolul aparitiei osteoporozei. S-a constatat ca la o administrare de 6
luni apare o scadere a masei osoase intre 3,4% si 7,4% [66].
Agonistii-GnRH au fost introdusi in protocoalele de stimulare ovariana controlata din
cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata in scopul prevenirii cresterii premature si
necontrolabile de LH („LH surge”). Cresterea prematura de LH are efecte nedorite asupra
maturarii foliculare, implicit asupra calitatii ovocitelor si embrionilor [67].
Se considera ca anterior introducerii acestei terapii in jur de 15-20% din ciclurile de
stimulare erau abandonate pe motivul cresterii premature de LH, astfel ca prin administrarea unui
agonist GnRH s-a realizat astfel o imbunatatire a ratei sarcinilor [68].
Protocoalele de stimulare ovariana controlata folosesc atat efectul de „flare-up” cat si
supresia hipofizara produsa prin efectul de „down-regulation” al receptorilor-GnRH.
Conform datelor statistice, peste 78,8% din protocoalele in cadrul fertilizarii in vitro asociaza
agonisti-GnRH si stimulare ovariana cu preparate de FSH [69].
Capitolul 3.2
Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor agonisti-GnRH
Diedrich si colab. (1994) au constatat ca introducerea agonistilor a scazut rata ciclurilor
cu raspuns anormal pana la 2 % si permite planificarea momentului declansarii ovulatiei [68].
Anterior introducerii terapiei cu analogi-GnRH (atat agonisti cat si antagonisti), datorita cresterii
premature a secretiei endogene de LH, in jur de 20% din cicluri FIV erau abandonate (stimulare
doar cu gonadotropine) [70].
29
In cele ce urmeaza sunt redate cele mai des folosite tipuri de protocoale de stimulare
ovariana controlata ce cuprind inschema lor antagonisti-GnRH.
Protocoalele scurt si ultrascurt („short”, „ultrashort”) exploateaza efectul de “flare-up”,
adica nivelul crescut al secretiei gonadotropinice de la inceputul administrarii medicatiei,
folosind acest fenomen in sensul cresterii foliculare.
In cadrul protocolului scurt („short protocol”) - administrarea agonistului este zilnică,
incepand cu ziua 1 a ciclului menstrual, pina la stabilirea declansarii ovulatiei. Stimularea
ovariana cu FSH incepe din ziua 5 a ciclului menstrual.
Protocolul ultrascurt („ultrashort protocol”): agonistul GnRH se administreaza doar in
zilele 2,3 si 4 ale ciclului menstrual. Stimularea cu FSH incepe in ziua 2 a ciclului
menstrual.
Avantajele acestor 2 tipuri de protocoale sunt: durata stimularii este mai redusa si implicit costul
medicatiei utilizate este mai redusa. Dezavantaje: concentratia serica a LH-ului este crescuta in
prima parte a fazei foliculare, cu efect negativ asupra maturarii foliculare [71]. Nu intotdeauna
peak-ul de LH poate fi prevenit.
Prin studii retrospective s-a demonstrat ca numarul de ovocite obtinute prin punctie foliculara,
numarul de embrioni si rata sarcinilor a fost mai bun in cazul utilizarii protocoalelor lungi
(independent de preparatul folosit) [72].
In studii prospective rata difera, dar nu semnificativ.
Protocolul lung („long protocol”) este cel mai frecvent folosit, efectul scontat este cel de
desensibilizare a hipofizei, anterior initierii stimularii ovariene cu FSH. Administrarea
subcutanata/intranazala/intramusculara-depot a agonistului GnRH se incepe din mijlocul
fazei luteale (cel mai frecvent, din ziua 20-22) sau de la inceputul fazei foliculare (ziua 1
a ciclului menstrual). Dupa 14 zile de inceputul tratamentului se considera ca s-a realizat
supresia hipofizei si se efectueaza determinari hormonale (LH < 10 mUI/ml si E2 < 50
pg/ml), se considera necesara o ecografie transvaginala de rutina pentru a depista
eventualele formatiuni ovariene chistice (care temporizeaza administrarea de FSH), ca
apoi sa se inceapa stimularea ovariana cu FSH. Efectul supresiv hipofizar indus de
agonistul-GnRH dureaza pe tot parcursul stimularii ovariene cu FSH (in medie 10-14
zile). Inducerea ovulatiei cu 10.000 UI HCG se produce la dimensiunea foliculilor > 17
mm si niveluri serice de E2: 300-400 pg/ml/folicul.
30
Avantajul acestui protocol lung este dat prin inceperea administrarii agonistului din faza medio-
luteala si care consta in coinciderea cresterii fiziologice a gonadotropilor din aceasta perioada a
ciclului cu efectul de “flare-up”. Acest tip de protocol ofera o sincronizare a maturarii foliculare
si se permite recrutarea unui numar mai mare de foliculi si implicit de ovocite. Dezavantajul
poate exista in administrarea pe o sarcina incipienta, care nu este sesizata (nu s-au constatat insa
efecte malformative) [73].
Protocolul ultralung („ultralong protocol”) foloseste administrarea agonistului cu 1-3 luni
înainte de momentul începerii stimulării cu FSH.
Capitolul 3.3
Efectul agonistilor asupra fazei luteale
La 8 zile dupa administrarea HCG pentru inducerea ovulatiei se constata o scadere
marcata a concentratiilor serice de estrogeni si progesteron. Secretia endogena de LH ramine in
continuare blocata si se produce astfel o luteoliza precoce. Biopsiile de endometru releva o
incetinire in procesul de transformare secretorie in peste 50% din ciclurile stimulate [74].
Agonistii se leaga de receptorii prezenti la nivel folicular (la nivelul celulelor granuloase) si au
ca efect o scadere a productiei de progesteron. Acest fenomen a fost demonstrat pe baza studiilor
in vitro. Tot prin studii clinice s-a demonstrat impactul negativ al agonistului-GnRH asupra
corpului galben si a functiei luteale. Posibil insa ca mecanismul de actiune sa nu fie direct, avand
in vedere ca dupa oprirea administrarii agonistului acesta este eliminat rapid din organism.
Inhibarea sintezei de gonadotropine persista inca o perioada dupa intreruperea medicatiei (mai
ales in cazul protocoalelor lungi) astfel ca efectul asupra functiei luteale este unul indirect, prin
imposibilitatea eliberarii LH-ului hipofizar. Este deci obligatorie o sustinere a fazei luteale.
Aceasta se face prin administarea progesteronului – direct sau indirect – prin administarea HCG
(fiind cunoscut faptul ca HCG are o structura foarte asemanatoare cu a LH- ului). Uneori se
adopta amandoua modalitatile. Progesteronul se administreaza pe cale orala sau vaginala; s-a
demonstrat faptul ca acestea au o mult mai buna absorbtie decat calea intramusculara.
Dezavantajul administrarii HCG este faptul ca poate produce sau accentua sindromul de
hiperstimulare ovariana, daca acesta este deja existent, situatie in care se prefera administrarea de
progesteron. Concluziile lui Blumenfeld si Nahhas asupra ratei sarcinilor (mai crescute) si
31
numarului avorturilor (mai scazute) in urma sustinerii fazei luteale cu HCG se bazeaza si pe
faptul ca HCG are rol in implantarea embrionara prin producerea unor factori specifici [75].
Administrarea progesteronului se incepe in ziua punctiei foliculare si se continua pentru
14 zile. Administrarea HCG pentru sustinerea fazei luteale sau asocierea sa cu progesteronul se
decide in functie de situatia clinica si nivelul estradiolului seric. De obicei HCG se administreaza
in zilele 1,4,7 dupa punctia foliculara [76].
Capitolul 3.4
Antagonistii-GnRH
Fac parte din clasa analogilor-GnRH. Acesti compusi iau nastere prin modificarea
moleculei de decapeptid, care se leaga la nivel de receptor membranar hipofizar, fara insa a
determina eliberarea de gonadotropine (ca in cazul agonistilor, prin efectul de „flare-up”). Pana
in momentul de fata s-au sintetizat substante ce au fost incadrate in 3 clase sau generatii de
antagonisti. Substantele care s-au impus in schemele de tratament utilizate astazi sunt cetrorelix
si ganirelix (Tabel 5).
Prima generatie de antagonisti a rezultat prin inlocuirea aminoacizilor din pozitiile 2 si 3
din GnRH nativ (His si Trp), dar aveau efecte supresive doar la doze foarte crescute. Potenta
acestui tip de substanta a fost crescuta prin modificarea aminoacizilor din pozitia 1 si 6 si prin
incorporarea unui D-aminoacid in pozitia 6 (D-Arg), rezultand substante de generatia a 2-a, dar
care au avut efecte alergice (edem, eritem local, induratie), anafilactoide nedorite (edem
generalizat, reactie anafilactica) prin activitate histaminica accentuata. Acest efect secundar a
fost indepartat odata cu sintetizarea produsilor de generatia a 3-a, prin inlocuirea D-Arg din
pozitia 6 cu D-ureiloalkil aminoacid [77].
Tipuri de antagonist-GnRH de generatia a 3-a sunt cetrorelix, iturelix, azaline B, ganirelix,
abarelix si antarelix. In urma administrarii lor se obtine o supresie hipofizara mai marcata pentru
LH (70%) si mai putin pentru FSH (30%) dupa 6 ore de la administrare. Alte modificari aduse
generatiei 3 si substantelor ce sunt inca in studiu sunt la nivelul aminoacizilor din pozitiile
1,2,3,6 si 10 [78]; [79]; [80].
In tabelul 4 sunt redate principalele substante antagoniste-GnRH [63].
32
Tabel 4 - Principalii antagonisti-GnRH Secventa aminoacizilor
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
GnRH
nativ
pGlu His Trp Ser Tir Gly Leu Arg Pro Gli-
NH2
Cetrorelix D-Nal D-Phe D-Pal 4 5 D-Cit 7 8 9 D-Ala
Nal-Glu D-Nal D-Phe D-Pal 4 Arg D-Glu 7 8 9 D-Ala
Antide D-Nal D-Phe D-Pal 4 NicLis D-
NicLis
7 Lis(iPr) 9 D-Ala
Ganirelix D-Nal D-Phe D-Pal 4 5 D-
hArg
7 hArg 9 D-Ala
Azalina B D-Nal D-Phe D-Phe 4 Phe D-Phe 7 Lis(iPr) 9 D-Ala
Antarelix D-Nal D-Phe D-Pal 4 Phe D-Hcit 7 Lis(iPr) 9 D-Ala
Tabel 5 - Antagonisti-GnRH folositi in practica clinica Antagonist GnRH
(DCI)
Denumire
comerciala
Cale administrare Doza recomandata Doza minima
eficienta
s.c. Doza unica 2 mg Cetrotide Cetrorelix
s.c. Doza multipla 0,25 mg/zi
Orgalutran Ganirelix s.c. Doza multipla 0,25 mg/zi
Efectul este de scadere al gonadotropinelor si implicit a steroizilor sexuali la cateva ore
de la administarea lor. Efectul secundar cel mai important este de eliberare a histaminei, cu
efecte locale si sistemice. Acest fenomen se produce prin existenta receptorilor-GnRH la
suprafata celulelor mastocitare. Un alt efect secundar este cel de precipitare.
Principiul actiunii este diferit de cel al agonistilor. Antagonistul se afla in competitie cu
molecula nativa la nivel de receptori membranari hipofizari. Efectul de antagonizare incepe
imediat, fara stimularea initiala a hipofizei si este dependent de doza. La intreruperea medicatiei,
in decurs de citeva zile se normalizeaza functia hipofizara (comparativ cu agonistii, unde
reluarea functiei hipofizare are loc aproximativ la 6 saptamini).
Antagonistul nu are ca efect epuizarea rezervelor hipofizare a gonadotropilor si nici nu
inhiba sinteza acestora. Pe baza inhibitiei competitive la nivelul situsurilor de legare se poate si
33
“doza” efectul antigonadotrop al antagonistilor, cu rol in moderarea concentratiei restante de
estradiol. Moderarea concentratiei serice a E2 este importanta in diminuarea efectelor secundare
ale tratamentului cu antagonisti.
Capitolul 3.5
Protocoale de stimulare ovariana controlata ce cuprind in schema lor antagonisti-GnRH
Administrarea de scurta durata a antagonistului-GnRH inhiba secretia endogena hipofizara si
previne peak-ul precoce de LH [81]. Spre deosebire de agonisti, nu se produce o desensibilizare
a hipofizei, ci efectul de supresie se realizeaza prin inhibarea competitiva a receptorilor
hipofizari.
Protocolul german – Lübeck - foloseste administrarea zilnica de cetrorelix (doze mici – 0,25
mg/zi), subcutanat, incepand din ziua 5 sau 6 a ciclului menstrual, pana la declansarea ovulatiei.
Stimularea cu FSH se incepe din ziua 2 a ciclului menstrual, cu ajustarea pe parcurs a dozei.
Supresia de LH a fost rapida, s-au atins concentratii serice < 2 mUI/ml si nu s-a semnalat peak-
ul precoce de LH [82]. Declansarea ovulatiei cu 10.000UI HCG s-a efectuat conform criteriilor
ecografice (dimensiunea folicolilor >17 mm) si hormonale (E2: 300-400 pg/ml/folicol).
Sustinerea fazei luteale cu 5000 UI HCG s-a efectuat in ziua 2 si 5 dupa punctia foliculara.
Initial, pentru a stabili doza optima eficienta de cetrorelix, s-au utilizat comparativ pe loturi de
paciente doze de 3 mg, 1 mg si 0,5 mg. S-a constatat ca s-a obtinut o mai buna crestere a
concentratiei de estradiol la grupul ce a folosit 0,5 mg antagonist si rata formarii pronucleilor la
grupul de 0,5 mg cetrorelix a fost de 67,7 % [9]. Actualmente, in protocolul adoptat unanim, se
utilizeaza doza de 0,25mg/zi cetrorelix.
Protocolul francez, descris de grupul lui Olivennes [83] consta intr-o administare unica,
subcutanat de cetrorelix (3 mg), la un nivel seric al E2 de 150-200 pg/ml/ folicul > 14 mm ( in
general in ziua a 9-a). Daca in decurs de 48 h nu se indeplinesc criteriile de declansare a ovulatiei
se mai administreaza o doza de antagonist. Adminstrarea de FSH incepe in ziua a 2-a a ciclului
menstrual. Monitorizarea ecografica si hormonala (E2, LH, progesteron) este zilnica. Declansarea
ovulatiei s-a produs cu 10.000 UI HCG cand au fost indeplinite criteriile ecografice si hormonale
cunoscute. Sustinerea fazei luteale s-a efectuat cu progesteron natural administrat intravaginal.
34
Sub aceasta medicatie, hipofiza este in continuare sensibila la secretia endogena de GnRH si
ramane reactiva [82].
Dat fiind faptul ca la oprirea medicatiei antagoniste secretia endogena de LH se reia rapid, in
cateva ore, s-a discutat necesitatea sustinerii fazei luteale. Si in aceasta problema exista
suficiente controverse. Se pare ca totusi este influentata intr-o oarecare masura activitatea
corpului galben [84].
Este posibil ca dupa inhibitia hipofizara produsa de antagonistii-GnRH sa se reia ciclul
ovulator printr-o administare pulsatila de GnRH.
Dezavantajul agonistului fata de antagonist este faptul ca prin efectul initial de “flare-up”
produce o crestere de LH, care chiar daca este redusa, induce la randul ei o sinteza crescuta de
androgeni, mediu care este defavorabil dezvoltarii foliculare. Pe de alta parte, luand in
considerare modul de actiune al antagonistului – prin mecanismul de blocare competitiva a
receptorilor-GnRH, se deduce ca efectul sau are o durata de instalare rapida, dar odata oprita
medicatia, se revine rapid la situatia initiala. Efectul antagonistului este dependent de durata si
doza administrata, o doza crescuta de antagonist s-a dovedit a fi defavorabila pentru rata
sarcinilor din ciclurile FIV (Mannaerts, 1998 – studiu multicentric) [85].
In protocoalele utilizand antagonist s-a declansat ovulatia si prin administrarea GnRH, incercand
astfel evitarea sindromului hiperstimularii ovariene, care este favorizat si de HCG.
In figura 11 sunt redate protocoale de stimulare ovariana utilizate in tehnicile de
reproducere asistata, folosind agonisti sau antagonisti-GnRH in vederea supresiei hipofizare.
35
Fig. 11 - Protocoale de stimulare ovariana cu agonisti/antagonisti-GnRH
36
Capitolul 4
Raspunsul pacientelor la stimularea ovariana controlata
Capitolul 4.1
Raspuns insuficient al pacientelor la terapia de stimulare
In cadrul protocoalelor de suprastimulare ovariana controlata se poate intalni un raspuns
inadecvat, redus al pacientelor (situatie cunoscuta sub denumirea de „low-responder”). Este
motivul pentru care ciclurile de stimulare se intrerup, se abandoneaza. Acesta situatie apare in 9-
24% din ciclurile de stimulare (Keay, 1997) din cadrul fertilizarii in vitro (FIV) si nu se mai
ajunge la punctia foliculara [86].
Conditiile de definire a situatiei expuse sunt: nivel seric al estradiolului < 500 pg/ml, cu
dezvoltarea a ≤ 3 folicoli dominanti. Determinarea hormonilor bazali a pacientelor care intra in
cadrul protocoalelor de suprastimulare ovariana controlata au relevat o valoare crescuta a FSH
bazal (care la determinari repetate in cursul unui an se mentine ridicata), valori bazale ale
estradiolului de asemenea crescute si LH bazal < 3 mUI/ml. Explicatia este data de scaderea
rezervei ovariene de folicoli, care determina o secretie mai scazuta a inhibinei. In aceste conditii,
conform arcului de reglare ovar-hipofiza, se va secreta o cantitate mai crescuta de FSH, care la
randul ei va detemina cresterea estradiolului bazal. In aceste circumstante poate aparea peak-ul
prematur de LH, luteinizarea precoce a ovocitelor, cu alterarea calitatii lor [87].
Cel mai frecvent rezerva foliculara ovariana scazuta se intalneste odata cu inaintarea in varsta a
femeii, dar se descriu si situatii similare la femeile tinere [88].
S-au incercat multiple variante de adaptare a protocoalelor de stimulare ovariana cu
scopul de-a reduce semnificativ rata de abandon a ciclurilor de stimulare. O varianta este de
scadere a dozei si a timpului de inhibitie hipofizara a agonistului-GnRH, care la randul sau poate
afecta raspunsul ovarian. Astfel ca la protocolul lung cu agonist se opreste doza acestuia la
instalarea menstruatiei, ulterior se administreaza doze mai crescute de gonadotropine [89]. O alta
posibilitate este aplicarea protocoalelor scurt si ultrascurt la „low-responder”, care se bazeaza pe
efectul initial de „flare-up” al agonistului, cu stimularea gonadotropinelor endogene si inducerea
cresterii foliculare. Se administreaza in cadrul protocoalelor scurte (modificate) doze mai
crescute de agonist-GnRH si doze mai mari de gonadotropine [90].
37
Criteriile de abandonare a ciclurilor de stimulare sunt [91];[92]; [124]:
• Nivel seric al estradiolului < 600 pg/ml, asociat cu numar redus de folicoli ≥ 16 mm (≤
3);
• Cresterea prematura a LH-ului (> 10 mUI/ml) sau nivel seric al progesteronului > 1,5
ng/ml anterior inducerii ovulatiei;
• Sindrom de hiperstimulare ovariana (ovare mari, > 8 cm, cu numar mare (>10) de folicoli
< 16 mm si nivel seric al estradiolului > 3500 pg/ml
• Probleme de organizare
Capitolul 4.2
Raspunsul exagerat al pacientelor la terapia de stimulare. Sindromul de hiperstimulare
ovariana
Am amintit printre criteriile de abandonare a ciclurilor de stimulare si sindromul de
hiperstimulare ovariana - o complicatie de temut si nu rar intalnita in protocoalele din
reproducerea asistata. Este inversul situatiei fata de raspunsul insuficient („low-response”) la
stimularea cu gonadotropine, fiind un raspuns exagerat, insotit de un nivel seric crescut al
estradiolului si cu manifestari clinice variate, in functie de gradul severitatii. Este o complicatie
indusa iatrogen, care se insoteste de extravazarea plasmei in spatiul interstitial si acumularea
lichidului in cavitati, cu formare de edeme, ascita, hidrotorace si hidropericard. Hipovolemia se
insoteste de alterarea perfuziei renale, cu oligurie si in final insuficienta renala acuta.
Hemoconcentratia este cauza complicatiilor tromboembolice ce survin in acest sindrom de
hiperstimulare ovariana. De asemenea apar insuficienta respiratorie si hepatica. De obicei
aparitia sindromului de hiperstimulare se instaleaza la cateva zile dupa punctia foliculara,
frecvent in perioada embriotransferului.
Prevenirea sindromului de hiperstimulare este destul de dificila, deoarece dozele de
gonadotropine folosite pentru a obtine o stimulare ovariana adecvata sunt foarte apropiate de
dozele ce induc aceasta complicatie. In protocoalele pentru FIV/ICSI se incepe cu doze progresiv
crescande de gonadotropine, cu monitorizarea indeaproape a numarului si dimensiunii folicolilor
si a cresterii estradiolului seric. Administrarea HMG si rFSH in doze crescute odata cu initierea
stimularii ovariene are ca efect cresterea unui numar mai mare de folicoli, care se vor dezvolta
38
progresiv si acumuleaza receptori pentru LH. In final ei vor suferi un proces mai accentuat de
luteinizare. Unii autori considera ca folosirea unui protocol fix de stimulare nu scade aparitia
sindromului de hiperstimulare ovariana [93]. De asemenea introducerea agonistului-GnRH nu
scade riscul sindromului de hiperstimulare ovariana.
Se considera ca pacientele cu sindrom de ovare polichistice (PCOS) si cele cu disfunctie
ovariana, clasificarea OMS II (cu secretie normala de gonadotropi hipofizari) au o predispozitie
si un risc mai mare de dezvoltare a sindromului de hiperstimulare ovariana [94].
Nu exista nici o metoda care sa excluda complet aceasta complicatie. In general este
asociata unor nivele ridicate de estradiol seric in faza preovulatorie, dar se poate intalni si la
nivel scazut de estradiol. Pe de alta parte se descriu si situatii in care paciente cu valori foarte
crescute de estradiol nu dezvolta sindrom de hiperstimulare ovariana [95] .
S-a raportat in cateva situatii izolate aparitia sindromului de hiperstimulare ovariana si in cicluri
spontane [96] (fie la paciente cu PCOS sau la paciente cu profil hormonal normal).
O serie de date din literatura de specialitate apreciaza incidenta sindromului de
hiperstimulare ovariana pentru formele moderate si severe la valori cuprinse intre 3,1% - 6%
respectiv 0,25% - 1,8% [97].
S-au imaginat mai multe clasificari ale acestui sindrom de hiperstimulare ovariana,
fiecare insa este supusa modificarilor.
Clasificarea OMS [98] cuprinde 3 grade de severitate:
• gradul I (forma usoara) se refera la marirea in volum a ovarelor, bilateral (< 6cm),
estradiol seric > 1500 pg/ml, progesteron seric > 30 ng/ml
• gradul II (forma moderata) asociaza marirea in volum bilateral (pana la 12/12 cm) a
ovarelor cu disconfort abdominal, greata, voma, diaree, crestere ponderala, estradiol seric
la niveluri crescute
• gradul III (forma severa) asociaza pe langa ovarele marite in volum (> 12 cm),
simptomele descrise la gradul anterior si estradiolul crescut si prezenta lichidului de
ascita, eventual si hidrotorace/hidropericard; hipovolemie care poate evolua pana la soc
hipovolemic, hemoconcentratie marcata, tulburari electrolitice, tromboembolism.
39
O varianta de clasificare, mai recenta, este cea a lui Golan si colab. [99].
Forma usoara
Grad 1 – distensie si disconfort abdominal
Grad 2 – se adauga greata, varsaturi ± diaree, dimensiunile ovarelor sunt cuprinse intre 5-12 cm
Forma moderata
Grad 3 – semnele/simptomele formei usoare, la care se adauga prezenta ascitei (descrisa
ecografic)
Forma severa
Grad 4 – semnele/simptomele formei moderate la care se adauga prezenta ascitei si/sau
hidrotoracelui si dispnee
Grad 5 – toate cele enumerate anterior, la care se adauga modificari ale volumului sanguin, ale
vascozitatii sanguine prin hemoconcentratie, tulburari ale coagularii si alterarea perfuziei si
functiei renale.
Complicatiile sindromului de hiperstimulare ovariana
• Complicatiile vasculare sunt cele date de hemoconcentratie, se induce un status de
hipercoagulabilitate si apar fenomene tromboembolice. Se constata cresterea nivelelor
serice ale complexului plasma α2 – antiplasmina, trombina-antitrombina III, scaderea
precalicreinei si a APTT;
• Complicatii hepatice;
• Insuficienta respiratorie;
• Insuficienta renala acuta (prerenala, indusa de hipovolemie);
• Complicatii gastro-intestinale;
• Torsiune anexiala sau ruptura unui chist ovarian.
Asa cum am mai amintit, declansarea ovulatiei prin administrarea HCG determina inducerea
sindromului de hiperstimulare ovariana. Din acest motiv, in conditii de risc nu se indica HCG
pentru sustinerea luteala. Se poate inlocui HCG ca inductor al ovulatiei cu agonist-GnRH iar
pentru sustinerea luteala se va administra progesteron (intravaginal). Durata si severitatea
sindromului este mai accentuata in cazul instalarii sarcinii.
40
Fiziopatologia sindromului de hiperstimulare ovariana
In conceptia clasica se considera ca o crestere a permeabilitatii capilare este raspunzatoare de
acumularea lichidului in spatiul interstitial si in cavitati. Exista si o explicatie mai moderna
(Balasch si colab.) care presupune ca tulburarile circulatorii nu se datoreaza hipovolemiei, ci
unei vasodilatatii arteriolare marcate la nivel periferic, urmata de cresterea patului vascular si
hipotensiune arteriala consecutiva. Astfel se va produce in mod compensator o crestere a
frecventei cardiace si a debitului cardiac [100].
La nivel ovarian se remarca cresterea in volum a acestora, cu edem stromal, prezenta zonelor
de necroza, neovascularizatie, chiste foliculare hemoragice si luteinice.
S-au studiat intens mediatorii cresterii permeabilitatii vasculare. Un factor implicat in
acest proces este sistemul renina-angiotensina. Concentratia acestor substante este crescuta in
plasma si in directa corelatie cu severitatea sindromului de hiperstimulare ovariana.
Factorul de crestere endoteliala (VEGF: vascular endothelial growth factor) joaca un rol
important in patogenia hiperstimularii. Este o proteina ce leaga heparina si actioneaza direct
auspra endoteliului cu inducerea angiogenezei. In vivo creste permeabilitatea vasculara si are
implicatii in angiogeneza din cadrul dezvoltarii embrionare. Alte studii au gasit o corelatie intre
VEGF si angiogeneza din cadrul tesuturilor cu reinnoire ciclica (de tipul endometrului) si
activitate crescuta a VEGF in folicolul luteinizat [101]; [102]. VEGF este implicat si in reglarea
angiogenezei ciclice ovariene, creste permeabilitatea vaselor la nivel ovarian si poate fi un factor
in producerea lichidului din chistele ovariene. Este depistat in celulele tecale ale folicolului dar
nu se depisteaza in corpul galben degenerat sau in folicolul atretic. Cresterea rapida a folicolilor
din cursul stimularii si luteinizarea lor necesita angiogeneza marcata. Conform concluziilor
extrase din studii, VEGF este factorul major implicat in producerea permeabilitatii capilare si in
formarea ascitei din sindromul de hiperstimulare ovariana.
Alte cercetari recente si-au indreptat atentia spre interleukine si rolul lor in patogenia sindromul
de hiperstimulare ovariana, dar nu li se atribuie acelasi rol important ca si pentruVEGF [103].
Odata stabilit diagnosticul de sindrom de hiperstimulare ovariana se impune o
monitorizare si supraveghere (clinica si paraclinica) atenta a pacientei. Formele usoare si
moderate nu necesita spitalizare, care insa devine obligatorie in formele severe. Parametrii de
laborator care se urmaresc sunt: determinarea hematocritului si a numarului hematiilor,
41
creatinina si ureea sanguina, ionograma sanguina si urinara, profil al coagularii, transaminaze,
monitorizarea urinii. Printre alte analize se determina si ß-HCG-ul seric.
Ecografia este utila in urmarirea dimensiunii ovarelor, a prezentei lichidului de ascita, eventual a
prezentei sarcinii.
Tratamentul medical cuprinde restabilirea echilibrului volemic si acido-bazic prin
administrarea de fluide intravenos, electroliti, albumina, plasma-expanderi. Albumina corecteaza
tulburarile hemodinamice, creste presiunea oncotica si nu permite extravazarea lichidului din
patul vascular, este o substanta cu timp de injumatatire lung (10-15 zile). Prevenirea sau tratarea
fenomenelor tromboembolice implica administrarea anticoagulantilor. La pacientele cu oligurie
intra in discutie administrarea dopaminei.
Tratamentul chirurgical se refera la evacuarea lichidului de ascita prin paracenteza sau
prin punctie vaginala ecoghidata. Se imbunatateste starea generala a pacientei, se amelioreaza
simptomele, creste debitul renal si clearence-ul de cretainina. Prezenta hidrotoracelui impune
drenajul pleural. Laparoscopia, sau mai rar laparotomia, se practica doar in cazul torsiunii
ovariene, a rupturii unui chist anexial sau in cazul tratamentului sarcinii extrauterine asociate
sindromului de hiperstimulare ovariana.
Sindromul de hiperstimulare ovariana s-a intalnit in statistica Centrului de Fertilizare in
Vitro si Embriotransfer al Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie “Bega”, Timisoara
doar in 30 cazuri (pe perioada 20.05.1995-31.12.1999), acestea fiind forme usoare si medii. Nu
s-au inregistrat forme severe. La 1 caz cu torsiune de ovar chistic la 12 saptamani gestatie s-a
intervenit si s-a rezolvat pe cale laparoscopica, sarcina a evoluta ulterior normal, pana la termen
[95]; [104]; [105].
Masurile de prevenire ale sindromului de hiperstimulare ovariene cuprind identificarea
factorilor de risc (paciente cu PCOS, tinere, cu estradiol seric crescut, cu sindrom de
hiperstimulare aparut in stimulari anterioare, ecografic se descriu numerosi folicoli de
dimensiuni mici si folicoli ≥ 15 mm). O alta metoda este de retinere fata de administrarea HCG
in scopul inducerii ovulatiei („coasting”) la estradiol seric crescut, cu continuarea agonistului-
GnRH si oprirea medicatiei gonadotrope de stimulare. Monitorizarea concentratiei serice a
estradiolului (scaderea la 3000 pg/ml) reprezinta decizia de administrare a HCG [106].
Inlocuirea HCG cu agonist-GnRH ca inductor al ovulatiei este alta masura de prevenire a
sindromului de hiperstimulare ovariana. Aspirarea foliculara, suportul luteal cu progesteron,
42
crioconservarea embrionilor si embriotransferul lor in alt ciclu, administrarea profilactica a
albuminei la punctia foliculara sunt alte posibilitati de prevenire a hiperstimularii.
Capitolul 4.3
Medicatia hormonala administrata in reproducerea asistata si cancerul
In urma tratamentului hormonal care se administreaza in cantitati crescute sau cu durata
prelungita in cadrul protocoalelor din reproducerea asistata, respectiv repetarea protocoalelor in
intervale de timp variate s-a ridicat si problema efectelor secundare ale acestei medicatii. Cea
mai de temut complicatie in timp este fireste cancerul. S-au efectuat multiple studii in acest sens
in centre de reproducere asistata si in institutii de cercetare de referinta din intreaga lume si s-a
dovedit ca medicatia utilizata in tratamentul infertilitatii nu este cancerigena. Cu toate aceste
rezultate mai sunt necesare in viitor si alte studii care sa urmareasca in timp efectele terapiei
hormonale in infertilitate [107]; [108]; [109].
43
Capitolul 5
Tehnici de reproducere umana asistata - fertilizarea in vitro (FIV)
Capitolul 5.1
Istoric
Conform explicatiei din enciclopedie, termenul de fertilizare in vitro reprezinta procedeul
de-a concepe un embrion uman in exteriorul organismului matern. Se refera la cultivarea in
laborator a ovocitelor si spermatozoizilor, cu plasarea ulterior a embrionului/embrionilor
transcervical intrauterin [124]. Tendintele de-a concepe in vitro au existat inca de demult, astfel
ca din punct de vedere istoric se descriu incercarile lui M.C. Chang, care a relizat prima
fertilizare in vitro la mamifer (iepure) in 1959 [110] . In urmatoarea decada aceste incercari s-au
extins si la om.
Secolul 20 este marcat de multiple evenimente, dar unul in mod special a atras atentia lumii
intregi. Cercetarile de durata ale echipei de la Bourn Hall Clinic, Marea Britanie, formata in
principal de ginecologul P. Steptoe si fiziologul R. G. Edwards, au fost incununate de succes la
25 iulie 1978, prin nasterea fetitei Louise Brown („test tube baby”), provenind dintr-un cuplu cu
sterilitate de cauza tubara. Ei au marcat acest eveniment, ce avea insa sa schimbe radical
posibilitatile de reproducere de la acel moment incolo, cu un scurt articol aparut in revista Lancet
[111]; [124]. Stradaniile lor de-a obtine o sarcina in vitro s-au concretizat initial pe modele
experimentale si ulterior la om. In 1971, in urma multor incercari, Edwards si colab. au reusit
cresterea in vitro a ovocitelor fertilizate pana la stadiul de blastocist, lucru imposibil de realizat
pana atunci [112]. In 1976 au obtinut o sarcina tubara (un succes, dar totodata un esec prin
implantarea embrionara ectopica) [113].
Capitolul 5.2
Tehnici de recoltare ovocitara
Ca si metoda, Steptoe si Edwards au obtinut ovocitul dintr-un ciclu menstrual spontan,
prin aspirarea lui laparoscopica (pacienta avand o patologie tubara ireversibila), ulterior acesta a
fost fecundat in vitro si reimplantat prin embriotransfer. Intre timp s-a modificat calea de
44
recoltare a ovocitelor, fiind introdusa cea prin punctie transvaginala ecoghidata. La introducerea
FIV in SUA (1981) se practica recoltarea ovocitara prin laparoscopie dar, ulterior, in 1983 s-a
efectuat prima aspirare ovocitara transvaginala ecoghidata, aceasta fiind astazi curent folosita
[114].
Avand in vedere dezvoltarea actuala a laparoscopiei se poate practica in continuare acest
tip de recoltare, mai ales daca se doreste in mod special vizualizarea pelvisului (in situatia unei
patologii cunoscute sau presupuse) si in timpul recoltarii ovocitare se poate actiona si terapeutic
(liza aderentelor). Totusi in ziua de astazi ramane rar folosita aceasta metoda, este necesara
experienta si indemanarea operatorului; in unele situatii punctia foliculara poate fi mai
anevoioasa si interventia mai prelungita.
Aparitia ecografiei a permis o noua abordare a diagnosticului si tratamentului organelor
micului bazin. In 1981 Lenz a efectuat prima punctie foliculara sub ghidaj ecografic, metoda sa
fiind o punctie transabdominala transvezicala ecoghidata (transducer abdominal). Aceasta
tehnica are si ea dezavantajele ei (este dureroasa, produce frecvent hematurie, retentie de
cheaguri), fiind mai dificil de abordat ovarele si in cele din urma a fost abandonata [115].
Urmatoarea tehnica de aspirare ovocitara a fost cea prin punctie transvaginala, dar
ghidata ecografic transabdominal (metoda descrisa de Gleicher in 1981). Si aceasta tehnica a fost
inlocuita odata cu aparitia si perfectionarea transducerului vaginal. O alta varianta este aspirarea
ovocitara transuretrala si prin vezica urinara folosind un ghid ecografic transabdominal (este
folosita daca abordul ovarian este dificil, ovare inaccesibile vaginal, daca exista o infectie
vaginala sau daca sonda vaginala este defecta). In 1985 Wikland si colab. au descris pentru
prima data modul de aspirare al ovocitelor prin punctie transvaginala ecoghidata transvaginal,
prin atasarea unui ac de punctie la transducerul vaginal. Este tipul de punctie folosit astazi in
toate centrele de fertilizare in vitro [116].
Avantajele acestui tip de punctie sunt evidente: vizualizarea mai buna a organelor pelvine
(apropierea de sonda a ovarelor), dureri mult mai atenuate (fata de recoltarea transvezicala
ecoghidata), prin buna vizualizare a ovarelor se permite o aspirare adecvata a folicolilor si
obtinerea astfel a mai multor ovocite (inclusiv spalarea repetata a folicolilor pana la evidentierea
ovocitelor), risc mai mic de perforare a unui organ (risc de lezare a unui vas, intestin sau vezica
urinara < 1%), absenta disuriei, a infectiei (prezente in punctia transvezicala). Este de altfel si
varianta de punctie cea mai acceptata de paciente [124].
45
Anii care au urmat au fost marcati de noi evenimente si progrese, in sensul ca s-a introdus
stimularea ovariana controlata (initial cu clomifen si apoi cu gonadotropine), s-au introdus
ulterior analogii-GnRH in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana. Tratamentul de stimulare
ovariana controlata a permis obtinerea mai multor ovocite mature, care evident au dus la crestera
ratei implantarii/ciclu si la cresterea procentului sarcinilor. Agonistii-GnRH au permis scaderea
procentului de cicluri abandonate pe motivul peak-ului spontan si premature de LH. Astfel incat
la inceputul practicarii FIV rata sarcinilor a fost mult redusa (8%), ca apoi la sfarsitul anilor ´80
cel mai probabil datorita introducerii terapiei cu analogi-GnRH, ea sa creasca in jur de 15%. De
la inceputurile ei FIV a mai suferit si alte modificari, nu numai referitoare la modul de colectare
al ovocitelor sau la modul de stimulare ovariana, ci si paleta de indicatii a fost reconsiderata.
Initial FIV a fost practicata la cupluri cu sterilitate de cauza tubara, s-a extins insa si la paciente
cu endometrioza in diverse stadii, patologie uterina, sindromul ovarelor polichistice (PCOS),
infertilitate idiopatica. In plus, la pacientele cu insuficienta ovariana primara, menopauza precoce
sau ovariectomizate s-a introdus FIV cu ovocite donate. Mai mult, FIV este aplicata si la cupluri
cu factor masculin al sterilitatii sau cu infertilitate de cauza imunologica.
Capitolul 5.3
Extinderea FIV in lume
FIV in Romania
Intre timp aceasta tehnica de reproducere asistata s-a extins pe tot globul. La 4 ani de la
nasterea lui Louise Brown in Marea Britanie, s-a nascut in Germania, la Erlangen, primul baietel
(Oliver) prin FIV iar in 1983 s-a obtinut primul copil “in eprubeta” in SUA. De atunci aceasta
tehnica a cunoscut un enorm avant, numai in Germania s-au practicat pana in anul 2002 peste
60.000 cicluri FIV [117].
In Romania s-a introdus aceasta metoda a reproducerii asistate in anul 1995, cand la
Timisoara, la Clinica Universitara de Obstetrica-Ginecologie “Bega”, echipa condusa de Acad.
Prof. Dr. Ioan Munteanu a realizat prima fertilizare in vitro (20.05.1995) la o pacienta cu
sterilitate tubara, la care s-a obtinut sarcina, urmata de nasterea primului baietel roman conceput
“in eprubeta” (Daniel-Ioan), la 6 februarie 1996 [124]. Astfel ca Romania devenea a 18-a tara in
lume in care se practica FIV [123]. Ulterior acest success a fost urmat de multiple altele [122].
46
Centrul de fertilizare de la Timisoara - centru de referinta - a fost urmat de infiintarea altora
similare in Bucuresti, Cluj, Constanta [118]; [119]; [120]; [121].
Capitolul 5.4
Tehnica FIV
Tehnica fertilizarii in vitro si a embriotransferului presupune dupa o selectare riguroasa si
incadrare corecta a cuplurilor cu sterilitate in programele de reproducere asistata cateva etape
clare si precise. Fiecare laborator de embriologie detine o aparatura specifica (de exemplu:
incubator, centrifuga, microscop cu lumina inversata, cu contrast de faza, care sa aiba o suprafata
de lucru cu posibilitati de incalzire, camera Makler, instalatie de apa pura, banc de lucru,
consumabile, altele). Laboratorul este curatat si intretinut cu substante speciale, non-
embriotoxice.
Dupa stimularea ovariana prealabila (conform protocoalelor enumerate si folosind
supresia hipofizara cu analogi-GnRH) se induce ovulatia prin administarea a 10.000 IU HCG
intramuscular. Recoltarea ovocitara se va efectua la 34-39 ore (optim la 36 ore) de la
administrarea HCG. Recoltarea ovocitara prin punctie vaginala ecoghidata direct este efectuata
in conditii de asepsie in laboratorul de fertilizare sau in sala de operatie. Se prefera o anestezie
generala i.v. de scurta durata. Anterior punctiei este necesar de verificat pompa de aspiratie si
acul care urmeaza a fi atasat de sonda vaginala printr-un dispozitiv special construit. Pacienta se
afla in decubit dorsal pe masa ginecologica, cu membrele inferioare in abductie. Se introduce un
specul si se efectueaza lavajul din abundenta cu ser fiziologic a vaginului, dupa care se scoate
speculul si se introduce transducerul vaginal (sonda cu frecventa 5-7,5 MHz, preferabil
transducer electronic si nu mecanic, pentru calitatea imaginii) cu acul de punctie atasat.
Operatorul poarta manusi sterile netalcate, masca, boneta. La nivelul transducerului vaginal se
aplica un capison steril cu o cantitate mica de ecogel. Ecograful are la nivelul ecranului o linie de
ghidaj care ajuta la pozitionarea si manevrarea acului (este indicat ca acul sa coincida cu linia de
ghidaj) (ecograf Siemens, Kranzbuehler, Kretz). Inainte de punctionare se reverifica aspectul
ovarelor (prin modificarea pozitiei sondei in cele 2 planuri), daca exista ansa intestinala
interpusa, a se evita confunzia unui folicol cu sectiunea transversala a venei iliace. Punctionarea
foliculara se poate efectua fie cu un sistem de punctie automat sau manual. Acul de punctie in
47
sistemul automat are dezavantajul ca la fiecare punctionare foliculara perforeaza peretele
vaginal, cu risc mai mare de sangerare. La sistemul manual este intepat peretele vaginal o data
pentru ovarul drept si o data pentru cel stang. Punctionarea se incepe cu folicolii cei mai usor
accesibili, cei mai apropiati de transducer. Se punctioneaza si folicolii mici, care pot contine si ei
ovocite mature (mai rar) (Fig. 12). Daca este necesar se poate efectua lavajul unui folicol cu
aspirarea sa ulterior (in cazul in care nu s-a identificat ovocitul din prima aspirare). Inainte de
extragerea sondei vaginale, la terminarea interventiei se verifica fundul de sac Douglas (poate
contine fina lama de lichid – sangerare in urma procedurii aplicate). Se controleaza punctele de
punctie vaginala si o eventuala sangerare se opreste de obicei prin compresie de scurta durata.
Conform protocolului de la Bourn Hall Clinic se pot administra la sfarsitul interventiei
antibiotice (de exemplu autorii acestui ghid propun acid clavulanic: 1,2 g Augmentin i.v. si
metronidazol: 1 g Flagyl intrarectal) [125].
Fig. 12 - Aspectul ecografic al unui ovar stimulat
Complicatiile unei punctii foliculare transvaginale sunt in parte determinate de
indemanarea si experienta operatorului. Pe de alta parte gradul de accesibilitate (mai dificil sau
nu) al ovarelor sau sindromul aderential pelvin preexistent pot contribui la cresterea incidentei
complicatiilor. Complicatiile se refera in general la sangerare, infectie, punctia unui organ pelvin.
Fiecare centru de fertilizare are statistica sa proprie. Brinsmead si colab. constata un numar mare
de complicatii: 2-7% punctie venoasa, 40% sangerare la nivelul vezicii urinare, 24 % sangerare
vaginala, 14 % perforatie intestinala, 10% dureri pelvine post-punctie, 3% infectii in micul bazin
[126].
48
La sfarsitul interventiei pacienta este de obicei supravegheata timp de 2 ore (se prefera
repausul in clinostatism) dupa care poate parasi unitatea unde s-au recoltat ovocitele. Este bine
ca pacienta sa mentina legatura cu medicul care a efectuat punctia inca o perioada de
aproximativ 12 ore, timp in care pot aparea alte complicatii acute.
Ovocitele recoltate sunt preluate in laborator de catre embriolog. O persoana cheie in
relizarea tehnicilor de reproducere asistata o reprezinta tocmai embriologul.
Ovocitele umane sunt foarte sensibile la variatiile de temperatura, care pot produce
modificari ireversibile in fusul mitotic, cu afectare cromozomiala. Embrionii obtinuti din FIV si
la care s-au depistat anomalii cromozomiale pot contribui la explicatia procentului de sarcini
biochimice sau avorturi spontane intalnite dupa FIV sau GIFT (transfer intratubar de gameti),
posibil tocmai prin degradarea termica. Astfel incat in timpul manipularii ovocitelor si a
embrionilor este necesara pastrarea unei temperaturi constante [127]. Dupa recoltarea lor prin
aspirare foliculara (in eprubete) se identifica ovocitele la microscop. Complexul cumulus–ovocit
se poate vizualiza prin marimea lui si cu ochiul liber. Continutul folicular se varsa din eprubeta
pe placi Petri si se vizualizeaza la microscop (cu placa termica incalzita la 37 ºC si marire optica
40-125x). Manevra este rapida si efectuata in conditii sterile. Se spala pentru indepartarea
sangelui daca este necesar, cu ajutorul unei pipete. Se transfera imediat in mediul de cultura.
Placile cu godeuri in care se transfera ovocitele sunt placi cu capac (transparent). Pe fiecare se
inscriptioneaza numele pacientei. Fiecare ovocit aflat in mediu este ulterior examinat la
microscop in ceea ce priveste calitatea lui, gradul de maturare (prezenta sau absenta veziculei
germinale, prezenta globulului polar, ovocite degenerate, ovocite luteinizate) (Fig. 14; Fig. 15).
Ovocitul matur este o celula rotunda, cu citoplasma clara, se vizualizeaza primul globulul polar;
cumulus oophorus are o densitate scazuta, de asemenea corona radiata are o densitate celulara
scazuta (Fig.13). In timpul examinarii se mentin stabile temperatura si pH-ul. Ovocitele vor fi
apoi introduse in incubator, unde se pastreaza pana la momentul inseminarii cu sperma
(aproximativ la 3-4 ore de la punctia foliculara).
49
Fig. 13 - Ovocit de calitate foarte buna
Fig.15 - Ovocit de calitate scazuta
Spatiul de lucru al embriologului trebuie sa fie in imediata vecinatate a incaperii unde se
practica aspirarea ovocitelor, pentru a permite o manevrare rapida a acestor celule.
Pentru fiecare pacienta se intocmeste un formular/fisa tip care cuprinde pe langa datele
personale si cele inscrise de embriolog si cateva elemente de anamneza (cicluri anterioare,
particularitati ale FIV anterioare daca este cazul), date despre proba de sperma.
Actualmente exista numeroase medii de cultura comercializate industrial si numai este
nevoie de prepararea lor in laborator. Placile cu mediul de cultura ovocitar sunt echilibrate in
incubatorul CO2 cu 24 ore anterior punctiei foliculare in ceea ce priveste parametri pH,
temperatura, osmolaritate. Mediul incubatorului contine amestecul de gaze in urmatoarea
proportie 5% CO2, 5% O2, 90% N2 sau aer imbunatatit cu 5% CO2; obligatoriu temperatura
constanta (37ºC), umiditate crescuta si posibilitatea de echilibrare rapida la manevrele de
inchidere-deschidere.
Fig. 14 - Ovocit imatur
50
Capitolul 5.5
Prelucrarea spermei
A doua etapa dupa identificarea, spalarea si transferul ovocitelor in mediul de cultura este
reprezentata de prelucrarea spermei. Spre deosebire de mediul de cultura ovocitar, mediile de
preparare a spermei nu necesita incubare anterioara. De-a lungul timpului s-au dezvoltat mai
multe metode de prelucrare, de obicei fiecare laborator preferand una din aceste tehnici. Scopul
acestei preparari este de indepartare a lichidului seminal, care contine factori ce impiedica
capacitatia si fertilizarea; se doreste indepartarea detritusurilor si a resturilor celulare si
concentrarea spermatozoizilor cu mobilitate progresiva. Sperma se obtine prin masturbare, se
colecteaza intr-un recipient steril cu aproximativ 2 ore inainte de momentul inseminarii
ovocitelor. Se pot prepara si probe crioconservate si ulterior decongelate. Dupa recoltarea
spermei se lasa la lichefiat 30 minute, dupa care se examineaza la microscop in camera Makler.
Se stabileste daca se intrunesc criteriile OMS ale spermogramei si se urmareste mobilitatea
spermatozoizilor. Ei pot fi cu mobilitate rapid progresiva, mobilitate progresiva incetinita, nu
progreseaza, avand miscari pe loc sau sunt imobili.
Caracteristicile unei spermograme normale (normospermie, normokinezie) conform
criteriilor OMS (1992) [128]:
Volum ≥ 2 ml
pH: 7,2 – 8
Numar total/ejaculat: ≥ 40 x 106
Numar spermatozoizi/ml: ≥ 20 x 106
Mobilitate: ≥ 50 % cu mobilitate progresiva (clasele „a si b”) sau ≥ 25% mobilitate rapida
liniara (categoria „a” pana la 60 min de la colectare)
Morfologie: ≥ 30 % forme normale
In spermograma trebuie sa se regaseasca >50% spermatozoizi vii, numaratoarea
leucocitelor < 1x106 iar testul MAR sa fie negativ (anticorpi antispermatici).
Modificari in unul din parametri enumerati sau asocierea lor produce alterarea capacitatii
de fertilizare. Kruger si colab. au stabilit niste criterii stricte asupra morfologiei spermiei, de
asemenea cu implicatii in rata fertilizarii [129].
51
In ceea ce priveste morfologia spermiilor s-au gasit multiple corelatii intre aceasta si
fertilitatea [130]. Spermatozoizii sunt clasificati in 5 categorii: normali, cu cap anormal, anomalii
ale gatului/piesei intermediare, anomalii ale cozii, imaturi. Conform clasificarii OMS o
spermograma normala trebuie sa cuprinda > 30% forme normale (anterior valoarea era > 50%).
Alta metoda de evaluare morfologica este reprezentata de criteriile stricte ale lui Thinus
Kruger si colab. - Tygerberg Hospital, Africa de Sud. Acest sistem de clasificare se coreleaza tot
mai mult cu rezultatele FIV in comparatie cu clasificarea OMS. Defectele luate in calcul sunt
aceleasi ca si la incadrarea OMS, dar diferenta rezida in faptul ca aceste criterii foarte stricte
trebuie intrunite ca spermiile sa fie apreciate ca normale. Conform acestor criterii > 14% forme
normale sunt considerate pentru ca o sperma sa fie fertila. Restul se divide in 2 grupe:
5-14% forme normale: modelul “G”: prognostic bun de fertilizare (G: good)
0-4% forme normale: modelul “P”: prognostic prost de fertilizare (P: poor)
In opinia lui Riedel si colab., pentru ca o sperma sa intruneasca proprietatile minime
neceare pentru fecundare in cazul FIV conventional trebuie ca numarul total de spermatozoizi sa
fie minim 5x106, mobilitatea progresiva cel putin 30% si morfologia normala minim 30% [131].
Orice alta modificare in sens negativ a parametrilor unei spermograme altereaza fertilitatea si are
un prognostic de reusita mai redus.
Metodele de prelucrarea a spermei
Tehnica Percoll
urmareste separarea spermiilor cu mobilitatea crescuta (care avand o densitate mai mare
se sedimenteaza la partea inferioara a recipientului) de mediile de prelucrare, pipetate in
concentratii/densitati diferite. Tehnica Percoll foloseste un coloid din particule silicate
invelite in polivinilpirolidona (PVP), considerat actualmente cu potential toxic. A fost
retras de catre producatori, in ideea sigurantei. Etapele metodei au fost descrise de
Braude si Bolton [132].
In eprubeta de centrifuga se pipeteaza mediu Percoll dupa cum urmeaza: la fundul eprubetei 1 ml
mediu Percoll 80%, deasupra un strat de mediu 40% (1 ml) si ultimul strat – cel superficial –
sperma lichefiata. Se prepara astfel 2 eprubete continand mediu cu gradiente diferite si sperma la
suprafata. Sperma este obtinuta si lasata la lichefiat dupa modalitatea descrisa mai sus, respectiv
o proba din sperma se evalueaza anterior prelucrarii ei la camera Makler. Se centrifugheaza la
52
300 rotatii timp de 20-30 minute, dupa care se arunca supernatantul iar sedimentul de la fundul
eprubetei (pellet) ce contine spermatozoizii, se suspenda in mediul de cultura FIV (mediu
universal, Medicult) – 1,5 ml. Se centrifugheaza din nou la 550 rotatii timp de 10 minute. Se
resuspenda sedimentul in 0,2 ml mediu FIV si se preleveaza 10 µl care se numara in camera
Makler si se apreciaza mobilitatea, restul spermei se foloseste pentru inseminarea ovocitelor.
Este posibil ca aceste gradiente sa protejeze sperma in timpul centrifugarii.
Metoda Percoll a fost in timp inlocuita cu tehnica Sil Select, care foloseste gradiente de
45% si 90% ale unei solutii de particule de siliciu acoperite cu silan si care sunt diluate intr-o
solutie salina tamponata cu mediul Earle. Pasii tehnicii Percoll se regasesc in procedeul Sil
Select.
Metoda swim-up (descrisa de Lopata si colab. in 1976) [133]:
principiul metodei urmareste separarea spermatozoizilor mobili care dupa centrifugare
migreaza din sediment spre mediul proaspat adaugat si de aici vor fi selectionati pentru
inseminare. Etapele acestei tehnici sunt urmatoarele: se amesteca in raport de 1:1 o proba
din ejaculatul lichefiat (la fundul unei eprubete de centrifuga) cu mediu FIV. Sperma se
obtine prin masturbare intr-un recipient steril si prelucrarea ei incepe dupa 30 minute,
timp necesar lichefierii. Dupa amestecarea probei de sperma cu mediul FIV se
centrifugheaza la 550 rotatii timp de 10 minute. In cursul centrifugarii se depune
sedimentul cu spermatozoizi la fundul eprubetei iar supernatantul care contine lichidul
seminal cu componentele lui se arunca. Se resuspenda sedimentul in 3 ml mediu
universal FIV si se centrifugheaza din nou timp de 10 minute la 550 rotatii. Supernatantul
se arunca si se acopera sedimentul cu 1 ml mediu universal FIV dupa care se incubeaza in
incubatorul CO2. In acest timp spermatozoizii mobili vor ascensiona in mediul proaspat
adaugat, suspensia devenind opaca. Se pipeteaza 200 µl de la suprafata eprubetei in alta
mai mica si se masoara 10 µl din suspensie care se evalueaza in camera Makler (numar si
mobilitate). Aceasta tehnica are un prim timp in care mixeaza sperma neprelucrata cu
mediul FIV, situatie care in cursul centrifugarii favorizeaza formarea de radicali oxidanti
(ROS reactive oxygen species) (in cantitate mai crescuta in sperma neselectionata fata de
cea selectionata prin metoda stratificarii). Acesti produsi induc procese de peroxidare a
53
lipidelor in spermii normale sau anormale si scad capacitatea lor de fecundare. ROS sunt
produsi in mod special de polimorfonucleare (existente in mod normal in componenta
spermei, sunt de 3 feluri: anioni superoxid, peroxizi de hidrogen si radical hidroxil.
Plasma seminala contine antioxidanti care neutralizeaza ROS). Acesta reprezinta un
dezavantaj important al tehnicii swim-up [134]; [135].
Se utilizeaza si alte tehnici derivate din cele descrise mai sus.
Tehnica mini-swim-up urmareste concentrarea spermatozoizilor mobili in cel mai mic
volum de mediu posibil, fiind aplicata in cazul oligoastenosteratozoospermiei. Etapele
procedeului cuprind prepararea spermei dupa metoda swim-up si dupa acoperirea
sedimentului cu 1 ml mediu universal FIV se transfera intr-un tub Eppendorf, de unde se
centrifugheaza la 550 rotatii timp de 2-3 minute. Se indeparteaza cu grija supernatantul si
se resuspenda sedimentul cu 5-10µl mediu universal FIV. Se incubeaza de la cateva
minute pana la cateva ore. Suspensia se utilizeaza la inseminarea ovocitelor in cadrul FIV
clasice sau se foloseste pentru injectarea spermatozoidului in ovocit in cadrul ICSI
(injectia intracitoplasmatica a spermatozoidului).
Filtrarea printr-un filtru de vata de sticla are ca principiu separarea spermiilor moarte sau
anormale (care adera de acest filtru) de cele mobile, care traverseaza filtrul [136].
Adaugarea de pentoxifilina – imbunatateste mobilitatea spermiilor. Deoarece s-a
constatat ca altereaza unele mecanisme intracelulare s-a renuntat la aceasta tehnica de
crestere a calitatii spermei.
Centrifugarea – urmareste separarea celulelor si a componentelor plasmei seminale de
spermii. Se amesteca mediul de prelucrare cu sperma si se centrifugheaza de cateva ori la
300-550 rotatii. Sedimentul obtinut se resuspenda cu mediu si se utilizeaza pentru
inseminarea ovocitelor.
O metoda moderna de evaluare a concentratiei spermei si de stabilire a tipurilor de mobilitate
este CASA (computer-assisted semen analysis), care necesita un echipament costisitor. Nu se
efectueaza insa anterior unei evaluari OMS a spermogramei [179].
Sperma prelucrata dupa una din tehnicile descrise anterior se utilizeaza pentru inseminarea
ovocitara in vitro, procedeu efectuat aproximativ la 3-4 ore (dupa unii autori 4-6 ore) de la
recoltarea ei. Nu s-au remarcat insa procente diferite ale sarcinilor, chiar daca inseminarea s-a
54
efectuat la un interval mai mare (20 ore) de la aspirarea foliculilor, iar daca dupa 24 ore nu s-au
constatat celulele cu 2 pronuclei se mai poate tenta o inseminare sau o injectie
intracitoplasmatica a spermatozoizilor [137]. Numarul obisnuit de spermatozoizi la o inseminare
este de 100.000 spermatozoizi mobili/ml sau 25.000 per ovocit. Daca dupa prelucrarea spermei
se constata o mobilitate mai scazuta se va creste concentratia lor.
Placile cu capac ce contin in godeurile lor ovocitele suspendate in mediul de cultura se scot
din incubator si se aseaza pe placa microscopului aflata la 37 °C. Se calculeaza
cantitatea/concentratia de spermatozoizi ce urmeaza a fi inseminati si se pipeteaza rapid in
fiecare godeu. Dupa ce s-a finalizat pipetarea se inchide capacul si se verifica sub microscop
cantitatea de spermatozoizi, dupa care se introduc placile din nou in incubator. Daca a fost
necesar de adaugat o concentratie mai mare de spermatozoizi, se vor reimprospata mediile de
cultura mai rapid, deoarece spermatozoizii in concentratie crescuta consuma substantele
nutritive.
Capitolul 5.6
Controlul fecundatiei
Incubarea ovocitelor inseminate are loc inca 16-20 ore, dupa care urmeaza controlul
fecundatiei prin vizualizarea pronucleilor la microscopul cu lumina inversata (40-250 x marire
optica). In acest moment ovocitele sunt inconjurate de corona radiata si de celulele din cumulus.
Pentru o buna vizualizare se indeparteaza celulele granuloase (disectia embrionului), se cauta
numarul de pronuclei. Se evalueaza in continuare din punct de vedere morfologic ovocitele
fecundate (aspectul citoplasmei, fragmentarea), grosimea zonei pellucida. Aspectul normal
intalnit este cel de celula cu contur regulat, cu citoplasma clara, cu 2 pronuclei (2PN), 2 globuli
polari, cu zona pellucida intacta (Fig.16). Se mai pot intalni tot ca situatie normala si aspecte de
citoplasma fin granulara. Zigotul cu numar aberant de PN nu se pastreaza pentru embriotransfer
(Fig.17). Totusi s-a determinat prin analiza FISH ca zigotul cu 1 PN poate avea numar diploid de
cromozomi si daca clivarea lui ulterioara este normala se va putea folosi pentru implantare [138].
55
Fig.16 - Celula cu 2 PN
In general se selecteaza ovocitele cu 2 PN si se incubeaza inca 24-30 ore, timp in care
embrionul format se divide si ajunge in faza de 4 – 8 celule (Fig. 1; Fig.19). Zigotii care s-au
selectat pentru cultura ulterioara se transfera in alte recipiente ce contin mediu de cultura
preechilibrat. Nu se amesteca cu zigotii cu numar aberant de PN, care se cultiva separat.
Embriologul noteaza toate datele constatate la fiecare zigot in parte. Intarzierea fecundarii poate
fi o cauza de defect morfologic al ovocitului in marea majoritate a cazurilor (37%), mai rar un
defect al spermiei (14,8%) si de obicei embrionii au o evolutie normala [139].
Conform altor observatii, la ovocitele care dupa un numar de 17-27 ore de la inseminare nu au
prezentat aspectul de 2 PN s-a putut remarca a 2-a zi aspectul normal de clivare embrionara,
totusi 30% din zigoti si-au oprit evolutia a 2-a zi si rata de implantare a fost mai scazuta la acesti
embrioni comparativ cu cei proveniti din ovocite normal fecundate (6% comparativ cu 11,1%).
La analiza citogenetica s-au constatat anomalii cromozomiale ale acestor embrioni [140]; [141].
Fig.17 - Multipli PN (aberant)
56
Fig.18 - Embrion cu 2 celule
Capitolul 5.7
Realizarea embriotransferului (ET)
Cuplul la care urmeaza sa se efectueze embriotransferul (ET) trebuie sa ia decizia impreuna cu
medicul si embriologul asupra numarului de embrioni ce urmeaza a fi transferati si asupra
posibilitatii crioconservarii zigotilor supranumerari. Se crioconserva zigotii cu 2 PN, clar vizibili,
cu zona pellucida intacta si cu contur celular regulat. La 48 ore de la punctia foliculara embrionii
ajung in stadiul de 4 pana la 8 blastomere. Se selecteaza embrionii calitativ inalti si se transfera
maxim 3 (in functie de particularitatile cazului chiar 1 sau 2 embrioni). Embrionii de ziua a 2-a
se afla de fapt in stadiul in care in vivo ei se regasesc in trompa. Clasificarea embrionilor in
functie de numarul blastomerelor, de marimea si forma lor, aspectul citoplamei si simetrie
incearca sa stabileasca embrionii calitativ cei mai buni. Aceste clasificari sunt insa incomplete si
sufera mereu imbunatatiri. O varianta de clasificare este urmatoarea [142]:
Gradul 1 – numar par sau impar de blastomere, regulate, sferice, zona pellucida intacta,
fragmentarea blastomerelor < 10%
Gradul 2 – apare neregularitate a formei si fragmentare ≤ 10%
Gradul 3 - < 50% din blastomere apar fragmentate, restul embrionului trebuie sa corespunda
gradului 2
Fig.19 - Embrion cu 4 blastomere
57
Gradul 4 - > 50% din blastomere sunt fragmentate
Gradul 5 – zigot cu 2 PN in ziua a 2-a
Gradul 6 – blastomere lizate, embrion fara viabilitate.
Rata implantarii scade semnificativ odata cu cresterea gradului de apreciere calitativa a
embrionilor.
ET se realizeaza ziua 2 sau 3 de la recoltarea ovocitara. Se poate implanta embrionul si in stadiul
de blastocist, in ziua 5-6 de la punctia foliculara, stadiu in care embrionul patrunde in cavitatea
uterina in vivo si care se insoteste de un procent mai mare al implantarii (Fig. 20). Se prefera
embrionii calitativ inalti. Daca in ziua a 2-a se intalnesc doar zigoti cu 2 PN se mai pastreaza in
mediu de cultura inca o zi, pentru a se obtine clivarea scontata.
Fig.20 - Blastocist ziua a 5-a
Pacienta se afla in decubit dorsal pe masa ginecologica, cu membrele inferioare in
abductie. Se aplica un specul si se efectueaza lavajul vaginului cu ser fiziologic dupa care se
tamponeaza cu un tampon steril. Medicul (care poarta manusi sterile netalcate) va cateteriza
canalul cervical cu un cateter special de embriotransfer, patrunzand in cavitatea uterina in
imediata vecinatate a fundului uterin (fara insa a-l atinge). Se extrage mandrenul cateterului si se
asteapta embriologul. Aceasta manevra trebuie sa fie atraumatica.
In acest timp embriologul extrage embrionii din mediul de cultura, dupa ce i-a selectat pe cei mai
aspectuosi (1, 2 sau maxim 3 embrioni). Se aspira embrionii intr-un cateter impreuna cu mediu si
58
se ataseaza unei seringi, ce contine de asemenea mediu. Volumul care se transfera este de 15-20
µl. Embriologul introduce cu miscari fine cateterul cu embrioni prin teaca cateterului plasat
intrauterin si injecteaza continutul (mediu si embrioni), dupa care este obligatorie verificarea
microscopica, pentru a nu se lasa embrioni pe parcursul cateterului. ET se poate efectua si
ecoghidat. Unele centre folosesc calciu ca marcaj (vizibil la ecoghidaj) pentru a indica pozitia
intrauterina a varfului cateterului. Daca ET a reusit se va extrage cateterul si speculul iar pacienta
ramane in repaus aproximativ 2 ore. Testul de sarcina se efectueaza la 10-12 zile dupa ET (β-
HCG). In aceasta perioada faza luteala este sustinuta cu progestativ: progesteron micronizat
(doza variabila, de obicei 3x200 mg/zi, intravaginal sau oral).
Conform unui studiu efectuat in anul 2004 (studiu dublu-orb, randomizat, controlat
placebo) la care s-au administrat 10 mg piroxicam per os cu 1-2 ore anterior ET, s-a constatat o
rata mai mare de implantare (18,7 versus 8,6%) si o rata mai mare de sarcini (46,7% versus
27,6%) comparativ cu lotul control. Pacientele care au intrat in studiu au avut varsta sub 40 de
ani; cauza tubara, masculina de sterilitate, endometrioza, infertilitate idiopatica. Nu s-a observat
un beneficiu al administrarii piroxicamului in cazul infertilitatii idiopatice sau la paciente peste
40 ani. La aceste paciente s-a efectuat FIV/ET cu embrioni proaspeti (ET la 72 ore dupa
inseminarea ovocitelor) sau cu embrioni decongelati (la 72 ore dupa declansarea ovulatiei).
Efectul se datoreaza posibil cresterii fluxului sanguin uterin, scaderii contractilitatii uterine ce
apare frecvent in cursul ET si care poate fi raspunzatoare de expulzia embrionului [143].
Capitolul 5.8
Rezultatele generale ale FIV
Initial rata de succes in urma FIV/ET a fost de 20-25%, actualmente rata
sarcinilor/embriotransfer depaseste in unele centre 25%. Desigur ca aceste procente sunt
influentate de varsta pacientei, de factorul masculin supraadaugat. In jur de 5% din sarcinile
obtinute sunt sarcini extrauterine, explicate probabil prin ovulatiile multiple si nivelurile
hormonale crescute prin suprastimulare [144].
Rata sarcinilor multiple este ridicata, se situeaza in jur de 30%, fiind crescuta si de ET cu
2 sau 3 embrioni. Rata avorturilor este comparativa cu populatia care concepe natural (in jur de
20 %). Un studiu efectuat intre anii 1994-1999 pe 6045 ET a constatat o rata de 16% avorturi
59
(cazuri de sarcina incipienta, definita inainte de 6-7 saptamani de gestatie), avand ca factori de
risc fumatul si transferul unor embrioni de calitate redusa [145].
Ceea ce este deosebit de important si s-a constatat in urma supravegherii copiilor nascuti
din sacini provenite FIV/ET este ca acest procedeu nu creste numarul malformatiilor congenitale;
acestea se situeaza la nivelul populatiei care concepe pe cale naturala.
Datele furnizate de grupul Norfolk pentru rata cumulativa a sarcinilor pentru 1-6 cicluri
FIV/ET sunt urmatoarele [146]:
1 ciclu: 13,5%
2 cicluri: 25,3%
3 cicluri: 38,5%
4 cicluri: 47%
5 cicluri: 49,3%
6 cicluri: 57,8%
S-au exclus din start cuplurile cu factor masculin de sterilitate. Rata sarcinilor nu se modifica
radical la cicluri FIV/ET succesive. Pacientele care parcurg intre 3-6 cicluri au o sansa buna de-a
obtine sarcina. Datele sunt similare cu cele obtinute la Hallam Medical Centre (Londra) unde
45 % din femeile < 35 ani au nascut 1 copil in cadrul a 5 cicluri FIV/ET [147].
Capitolul 5.9
GIFT (gamete intrafallopian transfer) si ZIFT (zygote intrafallopian transfer)
De la primele reusite ale FIV pana in ziua de astazi s-au adus multiple perfectionari
metodei, dar au fost dezvoltate si alte procedee, in scopul de-a imbunatati rata sarcinilor. O
metoda de reproducere asistata este reprezentata de GIFT (gamete intrafallopian transfer), adica
transferul intratubar al gametilor. Ofera avantajul ca fecundatia are loc in vivo, embrionii se
formeaza in mediul lor natural si parcurg traseul lor fiziologic spre cavitatea uterina. Se evita
astfel riscul de expulzie al embrionilor, care exista in cazul unui ET. Transferul gametilor are loc
prin doua modalitati, fie se introduc in trompa pe cale laparoscopica prin capatul distal tubar, fie
se introduc transcervical-transuterin sub ghidaj ecografic [148]. Este important de injectat foarte
lent, cu o viteza de 1µl/secunda, iar volumul injectat este de asemenea redus (<50µl).
60
Tehnica presupune obtinerea spermei cu minim 2 ore inainte de inceperea procedurii.
Sperma se obtine si se prepara ca la tehnicile descrise pentru FIV clasic. Se doresc in final
obtinerea a 3-5 milioane spermii mobile/ml, astfel incat in trompa se vor transfera 100.000-
200.000 spermii. Recoltarea ovocitara are loc prin punctie foliculara transvaginala ecoghidata
direct (transvaginal), metoda care a fost expusa la FIV conventionala. Recoltarea ovocitara se
mai poate efectua pe cale laparoscopica, dar foarte rar. In urma aspiratului folicular se identifica
ovocitele, se spala si se selecteaza cele mature (metafaza II). Manipularea ovocitelor se face in
conditii constante de temperatura, pentru a evita degradarea lor datorita variatiilor termice. Pe o
placa Petri calda (37°C) se picura 50-100 µl din suspensia spermei prelucrate si ulterior se
transfera ovocitele. Se spala o seringa si un cateter GIFT cu mediu de cultura si se aspira
amestecul ovocite-sperma (20 µl aer, 30-40 µl ovocite+sperma, 10-20µl aer). In cazul in care
volumul de sperma a fost insuficient, se prefera aspirarea in cateter dupa cum urmeaza: 20 µl aer,
10-15 µl sperma, 10 µl ovocite suspendate in mediu, 10-15 µl sperma, 20 µl aer [142].
Continutul cateterului se transfera imediat in trompa. La sfarsitul procedurii este
obligatorie examinarea cateterului sub microscop, pentru a nu ramane ovocite pe parcursul
acestuia.
Rata sarcinilor obtinute in urma procedeului GIFT, conform datelor provenind din SUA
si Canada pe anul 1991, au fost de 26,5% nasteri/punctie foliculara. In acelasi an (1991) rata
sarcinilor pentru FIV/ET a fost de 15,25%/punctie foliculara (18% pentru femeile de varsta <40
ani). S-a exclus din start factorul masculin. Numarul de sarcini extrauterine a fost comparabil
pentru cele doua tehnici (3% pentru GIFT si 5% pentru FIV/ET) si numarul de sarcini multiple a
fost de asemenea comparabil (aproximativ 30%) [149].
World Collaborative Report on Assisted Reproduction a publicat in 1993 rezultatele a
99.314 de cicluri FIV/ET, dintre care 10% au fost reprezentate de GIFT. Rata sarcinilor clinice in
cazul FIV a fost de 17,9% si o rata de nou nascuti vii de 12,9%. Comparativ cu FIV, in cazul
GIFT procentele au fost mai ridicate: 29,3% rata sarcinilor clinice si 20,8% procentul nou
nascutilor vii. Probabil ca acestea se datoreaza faptului ca procesul de fecundare se realizeaza in
vivo, in conditiile sale naturale, cu parcurgerea unui traseu natural pana la implantare, implicand
inca o serie de factori necunoscuti [150].
O alta posibilitate de transfer intratubar (tot in ideea de-a creste rata implantarii si a
sarcinilor) presupune plasarea zigotului la acest nivel (ZIFT – zygote intrafallopian transfer),
61
modalitatile de transfer fiind ca la GIFT. Statisticile din anul 1991 arata ca numarul de
sarcini/punctie ZIFT este de 19,7%. Odata cu introducerea ZIFT entuziasmul a fost mare, dar
actualmente se considera ca ZIFT nu este superior FIV/ET.
Conform datelor din unele cercetari clinice rezultatele FIV sunt comparabile cu cele
GIFT/ZIFT [151]; [152].
Alegerea uneia dintre variante depinde si de istoricul pacientei. Daca a fost verificata
fecundarea cu alta ocazie, se poate tenta GIFT. Evident ca daca exista leziune tubara, cele 2
metode - GIFT si ZIFT, nu isi au rostul si se aplica FIV/ET.
S-a mai descris si transferul tubar de embrioni (TET – tubal embryo transfer) care
presupune transferul embrionilor clivati in trompa sau POST (peritoneal oocyte and sperm
transfer) – transferul de ovocite si sperma intraperitoneal, metode care sunt de ordin istoric [153].
62
Capitolul 6
Tehnici de micromanipulare in cadrul reproducerii umane asistate
Capitolul 6.1
Tehnici de micromanipulare premergatoare ICSI
Esecul fecundarii la procedeul conventional de FIV/ET este o problema majora in cazul
cuplului cu factor masculin preponderent. Rata fertilizarii in aceste cazuri este cu mult mai
scazuta fata de alte etiologii ale sterilitatii (factor tubar, endometrioza, chiar si infertilitatea
idiopatica). In anii ′80 s-au pus la punct metode de microinjectie care au reusit imbunatatirea
procentului fertilitatii si la aceste cupluri cu factor masculin. Scopul este de a indeparta barierele
naturale care se afla in calea spermatozoizilor, spermatozoizi care prezinta anomalii de numar,
mobilitate sau asocierea acestora, posibil si alti factori.
Este vorba de procedeele ZD (zona drilling – perforarea zonei pellucida, Gordon si colab.), PZD
(partial zona dissection – disectia partiala a zonei pellucida) (Cohen si colab.), SUZI (subzonal
insemination – inseminarea subzonala) (Ng si colab.), ICSI (intracytoplasmic sperm injection-
injectarea intracitoplasmatica a unui spermatozoid intr-un ovocit) (Lanzendorf si colab., Palermo
si colab.), care au imbunatatit substantial ratele de fertilizare si au crescut si ratele de implantare
in mod simtitor. Reprezinta un enorm progres al tehnicilor de reproducere asistata.
Zona drilling (ZD) a fost efectuata pentru prima oara pe embrion uman de catre Gordon
si Talansky in anul 1986, reusind digestia enzimatica a zonei pellucida cu o solutie acida Tyrode.
S-a dovedit ulterior ca aceasta substanta inhiba dezvoltarea embrionara si metoda a fost
abandonata [154].
O alta varianta de penetrare a zonei pellucida pentru a usura patrunderea spermiilor este
PZD (partial zona dissection). A fost practicata in 1989 de Cohen si colab.[155]; [156].
Dupa creearea unui orificiu la nivelul zonei (metoda mecanica) s-a incubat ovocitul cu sperma
(100.000 spermatozoizi/ 50 µl). Rata fertilizarii a fost imbunatatita si rata sarcinilor a crescut.
Totusi o deschidere mai mare la nivelul zonei poate face embrionul vulnerabil la alti factori sau
poate favoriza eliminarea unor blastomere prin acest orificiu [157]. PZD se poate aplica unor
63
cupluri cu factor masculin moderat modificat, nu se poate realiza daca nu exista spermatozoizi
capacitati, cu reactie acrozomiala si mobili; doar acestia pot patrunde liber prin orificiul creeat.
Se intalneste mai frecvent in cazul PZD polispermia, ceea ce reduce implicit numarul de
embrioni pentru ET.
O tehnica mai elaborata, care faciliteaza si mai mult penetrarea spermiilor prin inlaturarea
si mai accentuata a obstacolelor, este SUZI (subzonal insemination). Prima sarcina obtinuta dupa
acest procedeu de microinjectie/micromanipulare a fost in 1988 (Ng si colab.) [158]. Se
injecteaza aproximativ 3-5 spermatozoizi in spatiul perivitelin (se evita injectarea unui numar
foarte mare pentru a nu favoriza polispermia). La fel ca si pentru metoda anterioara (PZD) doar
spermatozoizii capacitati si cu reactie acrozomiala pot penetra in continuare oolema, dar spre
deosebire de PZD, in cazul SUZI se pot injecta spermatozoizi imobili sau cu mobilitate foarte
scazuta. Se aplica cazurilor cu oligozoospermie, astenozoospermie, teratozoospermie sau
combinarea acestora [159].
Capitolul 6.2
ICSI (intracytoplasmic sperm injection)
ICSI (intracytoplasmic sperm injection) implica injectarea directa a unui singur
spermatozoid in interiorul ovocitului. ICSI a fost aplicata ca tehnica inca din anii ’60 pe model
experimental pentru a cerceta succesiunea evenimentelor ce au loc in cadrul fecundarii [160].
Ulterior s-a aplicat pe scara larga in modelele experimentale in studiul fuziunii gametilor, a
formarii celor 2 PN. La om a fost introdusa de diverse grupuri de studiu (Cohen si colab.,
Lanzendorf si colab., Ng si colab., Palermo si colab., Fishel si colab.) intre anii 1988-1992.
Lanzendorf si colab. au efectuat prima ICSI pe ovocit uman in scopul studierii formarii
pronucleului masculin [161], [180].
Prima sarcina obtinuta la om a fost in 1992 de catre Palermo si colab. [162]. Tehnica
ICSI scurtcircuiteaza penetrarea oolemei si fuziunea cu membrana ovocitara si poate injecta
intraovocitar orice spermatozoid. S-a demonstrat ca dupa injectarea capului spermatozoidului se
produce decondensarea si eliminarea materialului genetic cu formarea ulterior a pronucleului
masculin. Astfel ca se poate injecta si spermatozoid imobil sau mort sau cu defecte majore [163].
64
Injectarea capului spermatozoidului sau numai a nucleului are ca efect decondensarea
nucleului; centriolul proximal (din portiunea intermediara) va forma fusul mitotic si joaca un rol
important in formarea si dezvoltarea embrionului. Prin aceasta se deduce ca atat capul cat si
piesa intermediara a spermatozoidului au rol in dezvoltarea embrionului [164]. Imobilizarea
mecanica a spermatozoidului (anterior efectuarii ICSI) prin compresia si rularea cozii sale induce
in grad variabil alterarea si in unele situatii chiar pierderea acrozomului, modificare ce se
insoteste de o rata mai crescuta a fertilitatii [186].
Prin perfectionarea acestei tehnici de microinjectie s-au adus mari sperante cuplurilor
carora pana atunci le era imposibil sa conceapa. Succesul ICSI depinde de tehnica injectarii,
caracteristicile spermei si ale ovocitelor (maturarea ovocitara). Factorul decisiv este insa
activarea ovocitului si nu reactia acrozomiala [165].
Nu este inca clar stabilit care este factorul de activare ovocitara, se pare ca spermatozoidul joaca
acest rol, posibil prin eliberarea unui factor citoplasmatic [164].
Dintre toate procedeele de micromanipulare care se aplica in caz de factor masculin de
infertilitate, este evident ca ICSI are procentul cel mai crescut de reusita, s-au obtinut cele mai
mari rate de sarcini, fiind actualmente metoda preferata pentru reproducerea asistata.
Indicatiile ICSI
Ejaculat:
- oligozoospermie (< 20 x106)
- astenozoospermie (< 40% spermatozoizi cu mobilitate progresiva, din care minim 10% sunt tip
„a”)
- teratozoospermie (conform criteriilor stricte ale lui Kruger < 14% forme normale)
combinarea celor 3 parametri
- globozoospermie
- anticorpi antispermatici prezenti (testul MAR pozitiv)
- esecul repetat la FIV/ET conventional (absenta fecundarii)
- ejaculare retrograda
Sperma din epididim (absenta congenitala a vaselor deferente, esec la reanastomoza dupa
sterilizarea masculina – vaso-epididimostomie sau vaso-vasostomie, obstructie bilaterala
a ductelor deferente)
65
Spermatozoizi testiculari (indicatiile spermei epididimale, fibroza epididimala,
azoospermia de diverse cauze, necrozoospermia)
Succese mai mari se obtin la injectarea unui spermatozoid mobil intraovocitar. Daca nu se
depisteaza in proba de sperma decat spermatozoizi imobili, se recurge la teste de viabilitate.
Testul cu eozina exclude spermatozoizii morti. Testul de reactie la mediul hipoosmotic urmareste
identificarea spermatozoizilor vii, care avand membrana intacta si introdusi in mediul salin
hipoosmotic acumuleaza apa in portiunea lor distala. Acestia vor fi selectati pentru ICSI [166].
Unele studii au considerat ca anticorpii antispermatici nu influenteaza negativ sansele ICSI
[167].
In cazul in care in ejaculat nu se gasesc spermatozoizi vii se poate recurge la obtinerea unei
probe testiculare de spermatozoizi.
Obtinerea spermatozoizilor din epididim se face printr-o metoda microchirurgicala – MESA
(microsurgical epididymal aspiration) care presupune extragerea lor prin aspirare, sub anestezie
generala. Mai rar se foloseste PESA (percutaneous epididymal sperm aspiration) care este o
aspirare percutana efectuata in anestezie locala [168]. Daca nici in proba epididimala nu se
gasesc spermatozoizi se apeleaza la biopsia testiculara. Uneori si aceasta poate fi repetata. Se
intalnesc situatii la care nici in cazul biopsiilor testiculare repetate (in cazul azoospermiei) nu se
identifica spermatozoizi. Ca tehnica se practica fie o biopsie testiculara deschisa, excizionala
(TESE – testicular sperm extraction) sau o biopsie prin aspirare pe ac subtire [169]. Prelucrarea
pieselor de biopsie se face fie mecanic, fie enzimatic. Foarte frecvent se crioconserva
spermatozoizii din piesele de biopsie sau din epididim, evitand astfel procedeele
microchirurgicale [170].
Capitolul 6.3
Tehnica microinjectarii
Pentru a efectua procedeul ICSI este necesara o aparatura performanta, care sa permita
injectarea unui spermatozoid intr-un ovocit. Echipamentul pentru ICSI presupune un microscop
cu lumina inversata, cu putere de marire de 200-400 x, cu placa de lucru ce se incalzeste si
mentine temperatura constanta. La acest microscop sunt atasate 2 unitati de manipulatori care
permit miscari in cele 3 planuri, un manipulator electric ce permite miscari mai ample, mai putin
fine si un manipulator hidraulic cu un joystick, care este utilizat la miscarile fine. Micropipetele
66
de sticla, care sunt dirijate de manipulatoarele descrise, au rolul de-a fixa ovocitul (una dintre
pipete) si de-a aspira si ulterior injecta spermatozoidul (cealalta pipeta) (Fig. 21). Sistemul de
manipulare este conectat de micropipete prin tuburi de teflon, in care se afla ulei mineral. Cele 2
micropipete au lungimea de 10 cm, prezinta cateva diferente intre ele, amandoua sunt insa
angulate, formand intre cele 2 brate un unghi obtuz si cu orizontala un unghi de 30°. Micropipeta
de fixare are orificiul extern al bratului scurt (nivelul la care se fixeaza ovocitul) sectionat
vertical, diametrul extern este de 80-100µ si cel intern de 15-20µ. Micropipeta de aspirare-
injectare are varful bratului scurt retezat oblic (nivel la care se aspira spermatozoidul, se inteapa
oolema si apoi se injecteaza), diametrul interior: 5-6µ si cel extern: 7-8µ. Aceste micropipete se
comercializeaza industrial, exista insa centre/laboratoare care le manufactureaza singure.
Intregul sistem de micromanipulare este plasat pe o masa rezistenta la vibratiile din mediul
extern. Se poate atasa un monitor la sistemul optic si se urmareste procedeul pe ecranul
monitorului. De asemenea exista si posibilitatea efectuarii unor filmari sau a unor imagini statice.
Fig.21 - Cele 2 micropipete de sticla ale sistemului de microinjectie
Ovocitele se recolteaza in aceeasi maniera ca si in FIV conventionala. Se alege procedeul cel
mai potrivit de stimulare ovariana si aspirarea foliculara are loc la 36 ore dupa administrarea
HCG, prin punctie vaginala ecoghidata transvaginal. Eprubetele cu lichidul folicular sunt
preluate de embriolog, se identifica ovocitele, se indeparteaza cumulus oophorus si corona
radiata (mecanic si enzimatic cu hialuronidaza) pentru o mai buna apreciere a maturitatii
celulelor si pentru a permite injectarea acestora. Pentru ICSI se aleg doar ovocitele mature –
67
metafaza II (si nu ovocite imature sau degenerate ca in Fig. 22). Se vizualizeaza la microscop cu
marire optica 200x, se analizeaza si apectul zonei pellucida, care trebuie sa fie intacta. Ovocitele
cu vezicula germinala prezenta se cultiva in mediu 24 ore si se injecteaza ulterior (in cazul in
care ovocitele in metafaza II sunt putine). S-au obtinut putine sarcini in urma injectarii ovocitelor
imature [171]. Dupa selectarea ovocitelor mature, spalate si denudate, acestea se pastreaza in
incubator in mediul de cultura pana in momentul injectarii.
Fig. 22 - Ovocit degenerat
Spermatozoizii pentru microinjectie se obtin fie din prepararea ejaculatului sau prin procedee
microchirurgicale - spermatozoizi obtinuti de la nivelul epididimului sau testicul. De asemenea
se poate prelucra sperma crioconservata. Prepararea spermei a fost deja expusa.
Tehnica de injectare propriu-zisa consta in plasarea unei placi speciale pe suprafata incalzita
a microscopului (37°C), placa care are 1 godeu central ce contine solutie PVP
(polivinilpirolidona) si 1µl din suspensia de sperma, plasata la periferia picaturii PVP. Rolul
solutiei PVP este de-a incetini miscarea spermiilor, pentru ca acestea sa fie mai usor aspirate si
totodata previne aderarea spermiilor de peretii micropipetei. Godeul central este inconjurat de
alte 8 godeuri ce contin fiecare cate un ovocit plasat in mediul de cultura, acoperit cu ulei
mineral. (Fig. 23) Microinjectia se efectueaza la microscopul cu lumina inversata, la marire
optica de 400x.
68
Fig. 23 - Placa de microinjectie cu cele 9 godeuri
Se urmaresc 3 etape importante:
- selectarea si aspirarea spermatozoidului (de preferat mobil) in micropipeta
- pozitionarea corecta a ovocitului (prin fixarea lui cu micropipeta de fixare)
- inteparea mebranei ovocitare inainte de injectarea spermatozoidului.
Primul timp este de alegere al spermatozoidului viu, mobil si care dupa imobilizare se aspira in
micropipeta corespunzatoare. In momentul aspiratiei se urmareste lezarea cozii
spermatozoidului, dar intotdeauna la un punct inferior de piesa intermediara (care contine
centriolul proximal). S-a dovedit ca imobilizarea spermiei are rol in activarea ovocitara, care
constituie un punct cheie in mecanismul fecundarii (prin eliberarea unor factori citozolici din
spermie). Aspirarea spermatozoidului in micropipeta are loc intotdeauna intai cu coada, astfel
incat capul spermiei se afla intotdeuna mai aproape de varful micropipetei. Se urmareste
injectare celulei impreuna cu un volum minim de mediu. Se aspira de fiecare data doar un
spermatozoid in pipeta, pipeta ce contine solutie PVP.
Micropipeta de fixare va mentine intr-o pozitie stabila ovocitul, printr-un usor proces de
aspirare. S-a constatat ca pozitionarea corecta este cea cu globulul polar in pozitia „6”, perforarea
oolemei avand loc la ora „3” si micropipeta de fixare imobilizeaza ovocitul la ora „9” (Fig. 24).
69
In aceasta pozitie nu se lezeaza fusul mitotic in cursul injectarii. Urmatorul pas este de penetrare
a zonei pellucida (relativ usor) si a oolemei (mai dificil) cu varful micropipetei ce contine
spermatozoidul. Penetrarea are loc in planul ecuatorial al ovocitului (Fig. 25). Pentru a facilita
inteparea membranei ovocitare se aspira usor cu micropipeta de aspirare (artificiu de tehnica). O
accelerare a fluxului semnifica penetrarea membranei si patrunderea ooplasmei in micropipeta.
Se opreste suctiunea si se injecteaza incet spermatozoidul in citoplasma ovocitului (Fig. 26),
dupa care se retrage micropipeta de aspiratie. In acelasi mod se procedeaza cu urmatoarele
ovocite. Se injecteaza doar un spermatozoid intr-un singur ovocit (Fig.27). Nu se injecteaza mai
mult de 3-4 ovocite succesiv intr-o etapa.
Fig. 24 - Fixarea ovocitului
Fig. 25 - Inteparea oolemei, spermatozoidul se vizualizeaza in micropipeta
70
Fig. 26 - Injectarea spermatozoidului
Dupa injectarea tuturor ovocitelor, acestea se spala, se transfera in placi ce contin mediu de
cultura, acoperit cu ulei de parafina si se introduc la incubator (temperatura 37°C, atmosfera de
5% O2, 5% CO2, 90% N2). Controlul fertilizarii are loc la 16-20 ore de la microinjectarea
ovocitelor, prin vizualizarea celulelor cu 2 PN, la fel ca si in cazul FIV clasice (Fig. 28). Si in
cazul ICSI, embriologul noteaza pe o fisa tip datele pacientei, numarul de ovocite injectate,
gradul lor de maturare, aspectul lor, aspectul zonei pellucida, descrierea spermatozoizilor si
provenienta lor, procedeul de prelucrare a spermei, eventual daca s-a folosit sperma
crioconservata. La controlul fecundarii se noteaza aspectul celulelor, numarul PN si al globulilor
polari. Se aleg pentru ET (embriotransfer) doar celulele cu 2 PN. Ovocitele injectate care
prezinta doar 1 PN (aproximativ 3%) posibil ca au rezultat din activare partenogenetica si nu se
transfera. Ovocitele injectate ce au 3 PN (aproximativ 4 %) probabil ca nu au eliminat cel de-al
2-lea globul polar si nici acestea nu se transfera [172].
Fig.27- ICSI, ovocit fixat, cu primul globul polar in pozitia „12” (mai rar)
71
Fig.28 - Prezigot, sunt vizibili cei 2 PN
Ovocitele cu 2 PN care au fost selectate pentru ET se pastreaza in mediu de cultura in
incubator inca 24 ore. Dupa aceea se examineaza la microscop si se apreciaza numarul si
aspectul blastomerelor, fragmentarea celulara. Se stabileste o clasificare a calitatii embrionilor
dupa dimensiunea si egalitatea blastomerelor si numarul de fragmente anucleate.
Sunt 4 categorii de incadrare a embrionilor:
• Tip A: embrioni calitativ foarte buni, fara fragmente anucleate, blastomerele au aceeasi
marime;
• Tip B: embrioni calitativ buni, blastomere inegale si fragmente anucleate ≤ 20% din
volumul embrionului;
• Tip C: embrioni calitativ mediu, fragmente anucleate 21-50% din volumul embrionului;
• Tip D: embrioni slab calitativ, cu fragmente anucleate ≥ 50% din volumul embrionului.
In urma acestei clasificari se transfera doar embrionii de tip A,B,C. Se prefera transferul a 2
embrioni, in functie de particularitatile cazului si 3 embrioni, dar niciodata peste 3 embrioni.
Datele actuale sustin ca in urma ciclurilor de stimulare ovariana in vederea ICSI este posibil in
90% din cazuri transferul a macar unui embrion si nu exista influente determinate de provenienta
spermatozoizilor [172].
72
De obicei se transfera embrioni de 48 ore, dar s-au obtinut rate similare de implantare si
in cazul transferurilor cu embrioni de 72 ore (Fig. 29 a si b). Embrionii tip A sau B care sunt in
plus se pot crioconserva.
Fig. 29 a si b - Embrioni (ICSI) cu 8 blastomere (72 ore) (in imaginea b: in planul focusat se
vizualizeaza 6 din cele 8 blastomere)
Modalitatea de ET este similara cu cea din FIV clasica, descrisa deja. Sustinerea fazei
luteale are loc de asemenea cu progesteron (doze variabile, intravaginal sau oral) – cel mai
frecvent sau cu HCG (administrat intramuscular). Efectuarea testului de sarcina prin
determinarea β-HCG are loc la 10-12 zile de la ET.
Capitolul 6.4
Rezultatele ICSI
Odata cu introducerea tehnicii ICSI si cu perfectionarea echipelor de lucru a crescut tot
mai mult numarul practicarii acestui procedeu, astfel ca in 1993 s-au raportat 3.157 cicluri ICSI,
numarul lor a crescut la 12.586 in 1994 si in 1995 a ajuns la 47.654 (Tarlatzis, 1996) [173].
a b
73
Cel de-al 2-lea raport al ESHRE Task Force despre ICSI cuprinde rezultatele a 13.666
cicluri ICSI efectuate in 1994 de catre 94 centre in 24 tari [174].
Din aceste cicluri ICSI in 94,4% s-au injectat spermatozoizi din ejaculat, in 4,1% din epididim si
in 1,5% spermatozoizii erau de provenienta testiculara. In 12.284 din aceste cicluri s-au obtinut
in medie 8,3 ovocite/ciclu stimulat. Rata de supravietuire a ovocitelor dupa ICSI (dupa injectare)
a fost de aproximativ 90%, nu s-au observat diferente in functie de provenienta spermiilor. Rata
sarcinilor (β-HCG pozitiv)/punctie foliculara a fost intre 28-32,8%, de asemenea nu s-au
semnalat diferente semnificative intre cele 3 grupe de spermii. Din numarul total de sarcini s-au
nascut in 71,2 % din cazuri – 1 copil, in 26,2% din cazuri – gemeni si in 2,4% din cazuri-tripleti.
In dorinta de-a cunoaste cat mai clar siguranta si eficacitatea ICSI, Societatea Europeana
de Reproducere Umana si Embriologie (ESHRE) a stabilit cateva obiective majore in scopul de-a
colecta anual rezultatele clinice. Aceste rezultate insumate pe perioada 1993-1995 (din centrele
unde se efectueaza ICSI) au aratat ca din totalul de 39.675 de cicluri – 36.774 au folosit
spermatozoizi din ejaculat, 1784 spermii din epididim si 1153 cicluri – spermii din testicul. Rata
de fertilizare raportata la originea spermatozoizilor a fost de 61,5% pentru ejaculat, 57,6% pentru
epididim si 51,5% pentru testicul. Rata sarcinilor viabile a fost de 23,9%; 25,7% si respectiv
31,3%. Prin urmare rata fertilizarii si a sarcinii a fost crescuta si nu a depins de provenienta
spermatozoizilor. Nu s-a remarcat un risc mai crescut pentru malformatii majore sau minore si a
fost considerat ca similar fata de FIV/ET sau conceptia naturala. Pe de alta parte, incidenta
aberatiilor legate de cromozomul sexual si a celor autozomale au fost mai crescute la copiii
rezultati din sarcini ICSI fata de populatia neonatala generala. Explicatia rezida in mostenirea
anomaliilor cromozomiale provenite de la mama cat si defecte depistate de-novo la nivelul
cromozomilor sexuali si autozomali [183].
O statistica pe un numar de 2820 cicluri ICSI (Liu si colab., 1995) a aratat urmatoarele
rezultate: s-au injectat 29.415 ovocite in metafaza II, adica o medie de 10,4 ovocite/ciclu.
Numarul de ovocite intacte dupa ICSI a fost de 26.228 (89,2% din ovocitele injectate). Numarul
de ovocite injectate cu succes/ciclu a fost de 9,3. Numarul de ovocite fertilizate a fost 18.364,
adica 70% din ovocitele injectate cu succes, care reprezinta 62,4% din ovocitele in metafaza II,
respectiv 50,4% din ovocitele obtinute/punctie foliculara. Numarul de ovocite ce au prezentat
fertilizare anormala a fost de 2185 (care au prezentat prezigoti cu 1 PN si cu 3 PN). In tabelul 6
74
sunt redate sumarizat datele fertilizarii si a dezvoltarii embrionare in functie de provenienta
spermei utilizate in cadrul ICSI [175].
Tabel 6 - Statistica pe 2820 cicluri ICSI cu spermii de diferite proveniente
Spermii din ejaculat Spermii din epididim Spermii din testicul
Cicluri ICSI 2572 128 120
Ovocite injectate 26.343 1.628 1.444
% ovocite intacte
dupa microinjectare
89% 90% 89%
Celule cu 2 PN 16.758 844 767
% embrioni transferati 74 67 71
Din tabel reiese ca numarul de embrioni transferati a fost ceva mai mare in cazul ICSI cu
spermatozoizi din ejaculat fata de cei obtinuti din epididim si din testicul.
Tabel 7 - Rata sarcinilor in functie de numarul de embrioni transferati si de provenienta
spermatozoizilor
Ejaculat Epididim Testicul
Numar % Numar % Numar %
Cicluri 2572 - 128 - 120 -
Transfer 2382 93 117 91 108 90
Sarcini/ET
1 embrion 21/204 10 1/7 14 2/14 14
2 embrioni 78/321 24 3/15 20 4/13 32
2 embrioni (electiv)
218/488 45 3/14 21 3/12 25
3 embrioni 253/694 36 17/37 46 10/21 48
3 embrioni (electiv)
254/544 47 17/24 71 11/20 55
>3 embrioni 47/131 36 9/20 45 13/28 46
Sarcini/ET 871/2382 37 50/117 43 43/108 40
Sarcini/ciclu 34 39 36
75
Daca se analizeaza la acelasi numar de cicluri ICSI rata sarcinilor /numar embrioni
transferati si dependent de provenienta spermatozoizilor se obtin datele sumarizate in tabelul 7.
Din tabel reiese ca din cele 2820 cicluri ICSI initiale s-a efectuat embriotransfer in 2607
(92,6%) cicluri. Rata de transfer a fost comparabila la cele 3 grupuri care au folosit
spermatozoizi de la 3 niveluri diferite. Rata sarcinilor/transfer a fost de asemenea similara pentru
ICSI cu spermatozoizi din ejaculat (37%) fata de spermatozoizi din epididim (43%) si din
testicul (40%). Rata sarcinilor a fost influentata pozitiv daca ET s-a efectuat cu 2 sau 3 embrioni
electivi.
Statisticile expuse si multe alte studii clinice efectuate ulterior confirma rata de fertilizare
si de implantare crescuta, eficienta crescuta a metodei ICSI fata de celelalte tehnici de
reproducere asistata in cazul sterilitatii de cauza masculina.
Alegerea unei metode de reproducere asistata depinde de factorul de infertilitate, de
succes, de costurile procedurii si nu in ultimul rand de riscuri. FIV/ET clasic, conventional are ca
indicatie clara factorul tubar de sterilitate, endometrioza, factorul masculin usor alterat, PCOS,
factorul idiopatic. GIFT si ZIFT nu se aleg in caz de afectiuni ale trompelor. Totodata GIFT si
ZIFT cu transfer per laparoscopic necesita sala de operatie, anestezie si cresc costurile metodei.
Exista si situatii rare in care o patologie a colului uterin poate contraindica transferul
transcervical de embrioni si atunci se prefera GIFT sau ZIFT. ICSI este de departe preferata in
caz de factor masculin cu afectare de diverse grade, in special in afectare severa sau in caz de
esec repetat al FIV/ET [153].
Succesele tehnicilor de reproducere asistata in Germania pe anul 2002 sunt redate
comparativ - FIV/ET si ICSI - in Registrul National de FIV (Deutsches IVF Register - DIR)
conform tabelului 8 [117].
76
Tabel 8 - Succesele tehnicilor de reproducere umana in Germania (2002)
Numar Procent
Cicluri stimulate 69961 100 %
Punctii foliculare 62306 91,3%
Rata fertilizarii
FIV 21502 89,8%
ICSI 36465 96,7%
Sarcini clinice
FIV 5632 26,2%
ICSI 9696 26,6%
„Baby-take home” rate
FIV 2708 12,6%
ICSI 4855 13,3%
Datorita multor aspecte necunoscute ale ICSI, sarcinile cuplurilor care apelau la acest
procedeu au fost urmarite foarte atent, respectiv evolutia ulterioara a copiilor a fost atent studiata.
S-au efectuat multiple diagnostice prenatale in scopul de-a sesiza aberatiile cromozomiale si mai
ales daca aceasta tehnica de microinjectie favorizeaza ea insasi anomaliile cromozomiale. In
1995 s-au efectuat diagnostice prenatale (prin biopsie de vilozitati coriale sau amniocenteza) la
primele 486 de sarcini obtinute prin ICSI si s-au constatat 6 (1,2%) anomalii cromozomiale,
dintre care 1 trisomie 21 (0,2%) (la o pacienta de 41 ani) si restul de 5 – anomalii ale
cromozomilor sexuali. Observatiile au condus la faptul ca se iregistreaza o foarte usoara crestere
a aberatiilor legate de cromozomii sexuali [176].
Din 877 copii nascuti din sarcini ICSI (1995) la 23 (2,6%) s-au inregistrat malformatii
congenitale majore, insa procentul nu este crescut comparativ cu malformatiile obtinute in
populatia generala [177].
In’t Veld si colab. [181] raporteaza o incidenta crescuta a aberatiilor cromozomiale legate
de cromozomul sexual, depistata intr-un numar redus de teste de diagnostic prenatal, dependente
de varsta materna. Alte rezultate in urma testelor prenatale [180] efectuate pe 1082 sarcini
obtinute prin ICSI (la Centre for Reproductive Medicine of the Brussels Free University
Hospital) au constat ca din cele 690 amniocenteze efectuate - 15 au prezentat anomalii, din 392
77
biopsii de vilozitati coriale - 13 au fost anormale; 7 cordocenteze - care au fost probe martor
anterioare unor amniocenteze si care au fost normale. Varsta medie a gravidelor carora li s-a
efectuat amniocenteza a fost de 32,7 ani si a celor cu biopsie de vilozitati coriale – 32,1 ani. S-a
constatat un procent de 1,66% (numar de paciente: 18) anomalii cromozomiale. Dintre acestea, 9
(0,83%) au fost legate de cromozomul sexual si alte 9 anomalii (0,83%) au fost autozomale. Este
considerat semnificativ crescut procentul aberatiilor cromozomiale legate de cromozomul sexual.
Incidenta aberatiilor autozomale (trisomii) poate fi corelat cu varsta materna, iar a celor
structurale care este mai mare fata de populatia generala (si in procent mai crescut fata de
literatura: 0,36% versus 0,07%) [182] se poate explica prin patologia factorului masculin, care
este purtator de anomaliile structurale.
Cu toate ca in urma acestor constatari nu exista motive majore de ingrijorare referitor la
procentul malformatiilor congenitale in urma aplicarii ICSI, totusi unul din obiectivele majore
referitor la ICSI stabilite de Societatea Europeana de Reproducere Umana si Embriologie
(ESHRE Task Force) este acela de urmarire in continuare a copiilor proveniti din sarcini ICSI
[178]; [183].
Un studiul multicentric a incercat stabilirea unui profil psihologic al copiilor la varsta de
5 ani si care provin din sarcini ICSI, comparativ cu copiii din sarcini obtinute prin conceptie
naturala. S-au ales cativa parametri ce au fost respectati pentru toti copiii (varsta mamelor, varsta
copiilor, genitorii). Din punct de vedere al dezvoltarii cognitive nu s-au sesizat diferente. In
cadrul unor subteste s-au observat insa diferente semnificative care implica activitatile motorii de
asamblare, de desen, la un numar mare de copii ICSI. Au fost puse pe seama prezentei stress-ului
mai crescut in familiile cu copii ICSI, cu diferente in educatie, ce pot induce unele tulburari
comportamentale la copil. Si aceste aspecte ale evolutiei psihologice la copiii ICSI necesita studii
suplimentare [184]; [185].
78
B. Partea speciala
Studiu comparativ pe 3 ani al administrarii agonistilor-
GnRH si al antagonistilor-GnRH in reproducerea
umana asistata cu referire la rata sarcinilor
Observatii si discutii
79
Obiectivele acestor statistici analizate separat pe cei 3 ani (1999- 2000-2001) si ulterior
insumarea datelelor pe perioada totala, urmaresc stabilirea unor parametri clinici sau/si
paraclinici, care pot influenta raspunsul la terapia aplicata, adica tratamentul supresiv hipofizar
realizat prin intermediul agonistilor-GnRH si stimularea ovariana controlata. Studiul acestei teze
incearca sa desprinda unele observatii referitoare la eficienta terapiei agoniste versus antagoniste,
care in final se rasfrange asupra ratei sarcinii, ce constituie scopul final al reproducerii asistate.
Medicatia agonista este utilizata de o perioada mai lunga si s-a „incetatenit” atat pentru
practicieni, cat si pentru paciente. Substantele antagoniste sunt sintetizate de data recenta si
experienta cu administrarea lor fireste ca nu o depaseste pe ce a agonistilor-GnRH. La
introducerea in practica clinica au avut de intampinat unele reticente. Datele din literatura bazate
pe studii clinice dovedesc daca nu superioritatea fata de agonisti, dar totusi unele avantaje ale
antagonistilor-GnRH care trebuie luate in considerare.
Voi analiza pacientele care au apelat la tehnici de reproducere asistata si carora li s-au
administrat agonisti-GnRH sau antagonisti-GnRH in scopul inhibarii secretiei hipofizare
endogene. Efectele agonistilor- si ale antagonistilor-GnRH si rolul lor in cadrul reproducerii
asistate a fost detaliat pe larg in partea generala a tezei.
80
Capitolul 1 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu agonisti-GnRH in reproducerea umana asistata
Capitolul 1.1
Statistica pe anul 1999 – agonisti-GnRH
a. Material si metoda
In anul 1999 s-au adresat in vederea reproducerii asistate si au fost selectionate un grup de
258 paciente.
Varsta medie a pacientelor a fost de 34,2 ani, cu mediana de 34,5 ani. Pacienta cea mai tanara
din grupul analizat a fost de 21 ani, respectiv varsta cea mai inaintata a fost de 46 ani. Repartitia
pe grupe de varsta este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.1.1). De remarcat ca majoritatea
pacientelor se situeaza in grupul 35-39 ani, urmate de pacientele cu varsta cuprinsa intre 30-34
ani. O alta impartire functie de varsta imparte lotul de paciente in 2 parti egale: varsta < 35 ani:
129 paciente, varsta ≥ 35 ani: 129 paciente.
Tabel 1.1.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor (agonisti-GnRH/ 1999)
Varsta (ani) Numar paciente Procent
< 30 44 17,05 %
30-34 ani 85 32,94 %
35-39 ani 96 37,20 %
≥ 40 ani 33 12,79 %
Pacientele au intrat in protocol de stimulare ovariana controlata, utilizandu-se mai multe
tipuri de gonadotropine. Preparatul cel mai des administrat a fost rFSH, urmat apoi de
combinatia rFSH cu HMG, HMG administrat singur, FSH-HP administrat singur sau asociat cu
rFSH sau HMG, conform tabelului 1.1.2 si figurii 1.1.1 de mai jos.
81
Tabel 1.1.2 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/ 1999)
Tip gonadotropina Numar paciente Procent
rFSH 200 77,51 %
HMG 20 7,75 %
FSH-HP 1 0,38 %
rFSH + HMG 34 13,17 %
rFSH + FSH-HP 1 0,38 %
rFSH + HMG + FSH-HP 2 7,75 %
0
50
100
150
200
rFSH
HM
G
FSH
-HP
rFSH
+HM
G
rFSH
+FSH
-HP
rFSH
+HM
G+F
SH-H
P
rFSH
HMG
FSH-HP
rFSH+HMG
rFSH+FSH-HP
rFSH+HMG+FSH-HP
Fig. 1.1.1 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/ 1999)
82
Durata stimularii ovariene controlate a fost in medie de 11,46 zile, cu mediana de 11 zile.
Cea mai scurta perioada de stimulare a fost de 7 zile, respectiv cea mai lunga de 21 de zile.
Deviatia standard: 2,203.
Pentru stimulare s-au folosit o medie de 2784,98 UI FSH (din preparatele enuntate
anterior), cu o mediana de 2400 UI, deviatia standard: 1692,569. Cantitatea maxima administrata
a fost de 14.700 (!!!) UI FSH si cantitatea cea mai redusa de 750 UI FSH. La pacienta la care s-a
administrat aceasta doza enorma a prezentat, in ciuda stimularii masive, un raspuns insuficient
(„low responder”).
Protocolul cel mai des aplicat a fost cel lung („long protocol”) in 239 cazuri (92,63%),
urmat de cel scurt („short protocol”) in 12 cazuri (4,65%) si apoi ultra-lung („ultralong
protocol”) in 7 cazuri (2,71%), conform figurii urmatoare (Fig. 1.1.2).
Protocol lung
Protocol scurt
Protocolultralung
Fig. 1.1.2 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonist-GnRH / 1999
Nivelul E2 seric obtinut in urma stimularii ovariene, masurat anterior inducerii ovulatiei
cu HCG a fost ca valoare medie 1862,16 pg/ml, cu mediana de 1563 pg/ml. Valoarea maxima a
estradiolului seric a fost de 22.580 pg/ml iar cea minima de 135 pg/ml, deviatia standard:
239
12 7
83
1747,692. Daca se urmareste defalcat valoarea estradiolului seric determinat anterior punctiei se
obtine urmatorul tabel (Tabel 1.1.3). Marea majoritate a pacientelor (53,09%) cu tratament de
stimulare ovariana au prezentat valori serice ale E2 peste valoarea mediana, deci peste 1500
pg/ml.
Tabel 1.1.3 - Valorile defalcate ale E2 seric (agonisti-GnRH/ 1999)
Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent
< 1000 56 21,70%
1000-1499 65 25,19%
1500-1999 49 18,99%
≥ 2000 88 34,10%
Pe langa determinarea serica a estradiolului s-a efectuat si masurarea LH-ului, pentru a
surprinde o crestere (nedorita) a hormonului endogen. Valoarea medie a LH-ului la grupul de
258 de paciente a fost de 2,43 mUI/ml, cu mediana de 2 mUI/ml. Valoarea maxima inregistrata a
fost 38 - si cea mai mica de 0,1 mUI/ml; deviatia standard: 2,698.
Examinarea ecografica a urmarit evolutia folicolilor ca masura a reactivitatii la
tratamentul de stimulare ovarian. Sunt date valorile determinate anterior stabilirii momentului
inducerii ovulatiei (Tabel 1.1.4). Asa cum de fapt este de asteptat in urma stimularii ovariene
controlate, se doreste obtinerea unui numar mai mare de folicoli de 16-18 mm si respectiv > 18
mm, comparativ cu folicolii de dimensiuni mai mici.
Din tabelul expus reiese ca numarul mediu si mediana folicolilor > 18 mm este mai mare
fata de valorile folicolilor de 13-15 mm si 16-18 mm.
Tabel 1.1.4 - Parametri statistici ai folicolilor masurati prin ecografie (agonisti-GnRH/ 1999)
Dimensiune
folicoli
Media Mediana Numarul
minim
Numarul
maxim
Deviatia
standard
13-15 mm 2,61 2 0 10 2,246
16-18 mm 3,26 3 0 22 2,726
> 18 mm 3,67 4 0 11 1,828
84
La grupul de paciente studiate s-au efectuat punctii foliculare in vederea FIV
conventionale in 135 de cazuri, iar in 115 situatii s-au aspirat ovocitele si s-a procedat la
microinjectia lor, conform metodei ICSI. 8 cicluri nu au fost urmate de punctie foliculara (Fig.
1.1.3).
La 6 microinjectari din cadrul ICSI s-au utilizat spermii de provenienta testiculara, recoltate prin
biopsie (TESE).
FIV conventionala: 135 cazuri (52,32%);
ICSI: 115 cazuri (44,57%);
Cazuri nepunctionate: 8 (3,10%).
FIV
ICSI
Cazurinepunctionate
Fig. 1.1.3 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul grupului cu agonisti-GnRH pe
anul 1999
b. Rezultate
In urma punctiilor foliculare s-a obtinut un numar mediu de 8,26 ovocite, cu mediana de
8 ovocite. Numarul maxim de ovocite aspirate a fost de 29 iar numarul minim: 0 ovocite,
deviatia standard: 5,410 (Tabel 1.1.5).
115 135
8
85
Tabel 1.1.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu
agonisti-GnRH/1999
Numar mediu
ovocite
Mediana Numar maxim
recoltat
Numar minim
recoltat
Deviatia
standard
8,26 8 29 0 5,410
Controlul fecundarii realizat la 16-20 ore dupa inseminarea/microinjectarea ovocitelor a
aratat urmatoarele observatii: numarul mediu de celule cu 2PN este de 3,89; cu mediana de 3
celule cu 2PN. Numarul maxim de ovocite fecundate s-a inregistrat pentru 23 si numarul minim:
0; deviatia standard: 3,191 (Tabel 1.1.6).
Tabel 1.1.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN/ protocol cu agonisti-GnRH/1999
Numar mediu
celule cu 2PN
Mediana Numar maxim
celule cu 2PN
Numar minim
celule cu 2PN
Deviatia
standard
3,89 3 23 0 3,191
Crioconservarea s-a efectuat la 126 de paciente; dintre acestea in 68 de cazuri (53,96%) a
fost vorba de celule cu 2PN provenite din FIV iar in 58 de cazuri (46,03%) celulele cu 2PN au
provenit din fecundarea ovocitelor microinjectate in cadrul procedurii ICSI (Fig 1.1.4).
Embriotransferul s-a efectuat cu 1; 2 sau 3 embrioni. Au fost 28 de cazuri fara
embriotransfer raportate la cele 258 cicluri initiale. Media embrionilor transferati a fost de 1,85
iar mediana de 2 embrioni.
86
50
55
60
65
70 Crio-FIV
Crio-ICSI
Fig. 1.1.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI
(agonisti-GnRH/ 1999)
La 56 de paciente s-a inregistrat sarcina (inclusiv sarcina biochimica). Evolutia cazurilor
in parte este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.1.7). Din avorturile spontane s-au descris situatii
cu 1, 2 sau 3 saci amniotici; la sarcinile extrauterine a fost 1 caz cu 2 saci amniotici, respectiv la
sarcinile gemelare si triple au existat cazuri cu oprirea in evolutie pe parcurs a 1 respectiv 2
fat/feti, in final sarcina evoluand spre o nastere monofetala.
Tabel 1.1.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu agonisti-GnRH/1999
Sarcina Sarcina
biochimica
Avort
Sarcina
ectopica
Nastere
monofetala
Nastere
gemelara
Nastere
tripla
Nr. cazuri 6 7 3 34 6 0
Procent 10,71% 12,5% 5,35% 60,71% 10,71% 0
68
58
87
Complicatiile care s-au inregistrat in cadrul acestui lot de 258 de paciente se grupeaza in:
• lipsa raspunsului la stimularea ovariana controlata („low responder” – cu valori mici ale
E2 seric, dezvoltare minora a folicolilor)
• cresterea prematura a LH-ului endogen (supresie insuficienta prin agonist-GnRH)
• aparitia sindromului de hiperstimulare ovariana.
Motivele pentru care nu s-a mai practicat punctia foliculara la cele 8 paciente au fost: in 7
cazuri lipsa raspunsului la stimularea ovariana si in 1caz instalarea sindromului de hiperstimulare
ovariana, cu prezenta in amnadoua ovarele a mai mult de 40 folicoli de ≥ 10 mm. In tabelul de
mai jos sunt redate sumarizat elementele importante care constituie criterii de diagnostic al
statusului de „low responder” (Tabel 1.1.8).
Tabel 1.1.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara) (agonisti-GnRH/1999) Caz Cauza
Varsta
(ani)
Tip
FSH
Durata
stimularii
Nr.
total
UI
Tip
protocol
agonist
E2
(pg/ml)
LH
(UI/l)
Nr. folicoli
- 13-15
- 16-18
- > 18
1 Low
response
25 rec 10 zile 1725 long 797 1 1/ 2/ 3
2 Low
response
25 rec 12 zile 2105 long 464 0,4 2/ 2/ 3
3 Low
response
41 rec+HMG 12 zile 7200 long 213 2,4 0/ 0/ 2
4 Low
response
40 rec+HMG 13 zile 6600 long 400 3,1 0/ 0/ 1
5 Low
response
32 rec 12 zile 2400 long 135 3,1 0/ 1/ 1
6 Low
response
37 rec+HMG 25 zile !! 14.700
!!
short 277 38 !!! 0/ 1/ 1
7 Low
response
25 rec 9 zile 750 long 158 0,1 10/ 4/ 0
8 Sindr.
hiper-
stimulare
25 rec 7 zile 900 long 2264 2,3 5/ 1/ 1
> 40 fol.≥10
mm
88
c. Observatii
1. De remarcat ca in aceste 7 cazuri varsta medie a pacientelor este de 32,14 ani; deci o
varsta tanara. Este stiut ca marea majoritate a pacientelor cu raspuns scazut la stimulare
se incadreaza in grupe de varsta mai inaintate, care au o rezerva ovariana in mod
fiziologic redusa. Nivelul seric scazut al E2 corespunde cu criteriul clasic de intrerupere a
ciclului de stimulare si la monitorizarea ecografica se constata un numar insuficient al
folicolilor dominanti.
2. Doar 1 caz a prezentat o crestere prematura de LH, la aceasta pacienta a fost nevoie de o
stimulare excesiva - de 25 de zile si cu o doza totala imensa de FSH: 14.700 UI rFSH
asociat cu HMG, cu un E2 seric extrem de redus. Protocolul cu agonist-GnRH a fost unul
scurt, in dorinta de-a exploata efectul initial de „flare-up” al administrarii agonistului si
de-a creste FSH-ul endogen si implicit dezvoltarea foliculara. In ciuda acestei strategii
aplicate rezultatul la stimularea ovariana a fost dezastruos.
3. La o pacienta la care nu s-a mai practicat punctie foliculara a fost vorba de intreruperea
ciclului nu datorita raspunsului redus, ci dimpotriva - datorita reactiei exagerate la
stimularea ovariana, cu o dezvoltare a unui numar de > 40 folicoli ≥ 10 mm la o doza de
numai 900 UI FSH in decurs de doar 7 zile si un E2 seric de 2264 pg/ml.
Incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana in grupul de 258 de paciente a fost de
11 cazuri, adica 4,26 %, un procent deloc de neglijat comparativ cu statisticile din
literatura (conform celor expuse in partea generala). Detaliile referitoare la sindromul de
hiperstimulare ovariana sunt schematizate in tabelul de mai jos (Tabel 1.1.9).
89
Tabel 1.1.9 - Sindrom de hiperstimulare ovariana (agonisti-GnRH/ 1999) Caz Grad
hiperstim.
E2
(pg/ml)
Punctie
folic.
ET Criocons. Sarcina Avort/
Nastere
1 II 1058 da da - da nastere
2 II 2493 da da - da avort
3 II 3568 da da - da avort
gemel.
4 II 1400 da nu da (tot) - -
5 II 8139 da nu da (tot) - -
6 I 2385 da da - da nastere
7 II 1640 da da - da avort
8 III 2264 nu - - - -
9 II 1635 da da - da nastere
10 I/ II 1388 da da - da nastere
11 II/ III 2342 da da - da nastere
d. Concluzii
1. Sindromul de hiperstimulare ovariana apare in lotul studiat cel mai frecvent de gradul II
(forma moderata), rar in formele extreme: usoara sau severa.
2. Valoarea medie a estradiolului seric inainte de declansarea ovulatiei a fost de 2573,81
pg/ml, cu aproximativ 1000 pg/ml mai ridicat fata de valoarea medie si mediana calculate
pentru intregul lotul de 258 de paciente.
3. Nu este obligatorie asocierea sindromului de hiperstimulare cu valori crescute ale
estradiolului seric. Ca exemplu de exeptie in neconcordanta estradiol seric – aparitia
sindromului de hiperstimulare este cazul unei paciente de 37 ani, cu protocol lung si
stimulare cu rFSH timp de 11 zile, doza totala de 1200 UI, estradiol seric: 22.580 pg/ml,
folicoli: 13-15 mm= 8; 16-18 mm= 7; > 18 mm= 5. La FIV s-au aspirat 24 ovocite, 23 s-
au fecundat, dintre care 20 s-au crioconservat. Embriotransferul s-a efectuat cu 3
embrioni. Nu s-a obtinut nici o sarcina. Nu s-a semnalat sindrom de hiperstimulare
ovariana.
90
4. In 10 cazuri din 11 (90,90%) de sindrom de hiperstimulare ovariana s-a efectuat aspirarea
foliculara; doar la 1 caz cu un numar de > 40 folicoli ≥ 10 mm s-a abandonat ciclul de
stimulare. Acest caz a si prezentat forma severa de sindrom de hiperstimulare.
5. Din cele 10 cazuri punctionate numai la 2 paciente nu s-a realizat embriotransferul si
toate celulele in stadiul de 2PN au fost crioconservate. S-a considerat ca o masura de
siguranta aceasta evitare a embriotransferului.
6. Toate cazurile la care s-a efectuat embriotransferul au fost insotite de prezenta sarcinii
(evolutia ulterioara fiind de 3 avorturi si 5 nasteri).
Alte incidente:
- in 2 cazuri: nu s-a realizat fecundarea pe motivul absentei spermiilor;
- la 1 caz nu s-a efectuat ET pe motivul prezentei unui polip endometrial;
- la 1 caz nu s-a realizat ET si s-a preferat crioconservarea pe motivul prezentei
unui endometriom.
Din 258 cicluri de stimulare initiate - 8 nu au fost urmate de punctie foliculara, deci s-au
efectuat doar 250 de punctii (96,89% din cicluri punctionate). Din aceste 250 de punctii la 1 caz
nu s-au aspirat ovocite si din acest numar de 250 punctii in 16 cazuri nu s-a realizat fecundarea.
O apreciere a esecurilor din totalul de 258 de cicluri de stimulare initiale este urmatoarea (Tabel
1.1.10):
- 8 cazuri nepunctionate (intreruperi de cicluri: 3,1%);
- 1 caz fara ovocite;
- 16 cazuri fara fecundare;
- 29 cazuri fara embriotransfer realizat.
Tabel 1.1.10 Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ an 1999
Total punctii efectuate Total cazuri cu celule
cu 2PN
Total ET efectuate Total
cicluri
stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent
258 250 96,89% 233 90,31% 229 88,75%
91
Sarcini/ 1999: 56
• 34 sarcini au rezultat din FIV/ET si 22 sarcini - din ICSI (1 sarcina din crioTESE);
• 51 paciente care au obtinut sarcina (inclusiv biochimica) au fost stimulate cu rFSH, 3
paciente: stimulare ovariana cu HMG, 2 paciente: rFSH asociat cu HMG;
• la 53 de paciente s-a aplicat protocolul lung, la 3 paciente – protocolul ultra-lung.
Rata sarcinilor/ciclu: 21,70 %
Rata sarcinilor/punctie: 22,40%
Rata sarcinilor/embriotransfer: 24,45%
Rata implantarii = nr. saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 28,38%
Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 15,50%
e. Discutii
1. Comparativ cu lotul de 41 de paciente care au urmat tratament de stimulare ovariana
controlata si cu anatgonisti-GnRH in schema de protocol pe perioada anului 1999, lotul
de paciente cu schema cu agonisti-GnRH a fost mult mai numeros, ceea ce semnifica o
complianta mai mare fata de acest tip de medicatie.
2. Procentul majoritar al pacientelor din grupul studiat se afla intre 35-39 ani, urmat
indeaproape de pacientele cu varsta 30-34 ani.
3. In urma parametrilor calculati referitor la durata, tipul si doza totala a unitatilor de
gonadotropina nu se remarca diferente semnificative cu lotul de paciente cu protocol cu
antagonist-GnRH. De asemenea numarul de ovocite recoltate si numarul de celule cu
2PN este comparabil la cele 2 grupe de paciente.
4. Rata sarcinilor calculate in functie de numarul de cicluri de stimulare/ punctii efectuate/
embriotransferuri realizate este net superior la lotul de agonisti versus antagonisti-GnRH.
92
Capitolul 1.2
Statistica pe anul 2000 – agonisti-GnRH
a. Material si metoda
In anul 2000 s-au adresat in vederea reproducerii asistate si au fost selectionate un grup
de 303 paciente. Varsta medie a pacientelor a fost de 34,46 ani, cu mediana de 35 ani. Pacienta
cu varsta cea mai tanara din grupul analizat a fost de 23 ani, respectiv varsta cea mai inaintata a
fost de 45 ani. Repartitia pe grupe de varsta este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.2.1). De
remarcat ca pacientele intre 35-39 ani sunt grupul cel mai numeros, dar urmate indeaproape de
pacientele cu varsta cuprinsa intre 30-34 ani.
Tabel 1.2.1 - Repartitia pacientelor pe grupe de varsta (agonisti-GnRH/anul 2000)
Varsta (ani) Numar paciente Procent
< 30 56 18,48 %
30-34 ani 93 30,69 %
35-39 ani 103 33,99 %
≥ 40 ani 51 16,83 %
Dintre tipurile de gonadotropine utilizate in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana
controlata se observa ca preponderent a fost administrat rFSH (76,23%) (Tabel 1.2.2, Fig. 1.2.1).
Tabel 1.2.2 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2000)
Tip gonadotropina Numar paciente Procent
rFSH 231 76,23%
HMG 42 13,86 %
FSH-HP 2 0,66 %
rFSH + HMG 28 9,24 %
93
0
50
100
150
200
250
rFSH
HMG
FSH-HP
rFSH+HMG
Fig.1.2.1 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2000)
Durata stimularii ovariene controlate cu preparatele de gonadotropina enumerate a fost in
medie de 11,24 zile, cu mediana de 11 zile. Cea mai scurta perioada de stimulare a fost de 6 zile,
respectiv cea mai lunga de 24 de zile. Deviatia standard: 2,gonadotropina, cu mediana de 2250
UI, deviatia standard: 1337,421. Cantitatea maxima administrata a fost de 8400 UI
gonadotropina si cantitatea cea mai redusa de 825 UI gonadotropina.
Ca si in statistica anului 1999, cel mai des aplicat a fost protocolul lung („long protocol”)
in 269 cazuri (88,77%), urmat de cel scurt („short protocol”) in 22 cazuri (7,26%) si apoi ultra-
lung („ultralong protocol”) in 12 cazuri (3,96%); situatie rezumata in urmatoarea figura (Fig.
1.2.2).
94
Protocol lung
Protocol scurt
Protocolultralung
Fig. 1.2.2 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonist-GnRH / anul 2000
Corelarea foliculometriei cu nivelul E2 seric obtinut in urma stimularii ovariene au fost
factorii decisivi pentru alegerea momentului inducerii ovulatiei cu HCG. Valoarea medie a E2
seric a fost de 1877,16 pg/ml, cu mediana de 1529 pg/ml. Valoarea maxima a estradiolului seric
a fost de 27.669 pg/ml iar cea minima de 205 pg/ml, deviatia standard: 1917,754. Daca se
urmareste defalcat valoarea E2 seric determinat anterior punctiei se obtine urmatorul tabel (Tabel
1.2.3). Marea majoritate a pacientelor (33%) cu tratament de stimulare ovariana au prezentat
valori serice ale E2 peste 2000 pg/ml iar 51,81% din paciente au avut concentratia E2 seric peste
valoarea medianei.
Tabel 1.2.3 - Valorile defalcate ale E2 seric (agonist-GnRH/ anul 2000)
Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent
< 1000 71 23,43%
1000-1499 75 24,75%
1500-1999 57 18,81%
≥ 2000 100 33%
269
22 12
95
Determinarea concentratiei serice a LH-ului isi gaseste utilitatea in depistarea unei
cresteri premature a hormonului endogen, ce semnifica o inhibitie hipofizara insuficienta.
Valoarea media a LH-ului in lotul de paciente a fost de 2,57 UI/l, mediana de 2,1 UI/l. Valoarea
maxima depistata a fost de 21,6 UI/l la o pacienta la care s-a si intrerupt ciclul de stimulare si nu
s-a mai efectuat punctia foliculara. Valoarea minima determinata a fost de 0,1 UI/l si deviatia
standard: 2,073.
In corelatie cu valoarea E2 seric se efectueaza ecografii seriate – foliculometrii care
determina raspunsul ovarian la terapia aplicata. Tabelul urmator (Tabel 1.2.4) sumarizeaza
dimensiunile folicolilor si parametri statistici ai acestora. Scopul stimularii este de-a creste
folicoli dominanti in amandoua ovarele. Se remarca din tabel ca media si mediana folicolilor >
18 mm este mai mare decat a folicolilor de dimensiuni mai mici.
Tabel 1.2.4 Parametri statistici ai folicolilor masurati prin ecografie (agonist GnRH/anul 2000)
Dimensiune
folicoli
Media Mediana Numarul
minim
Numarul
maxim
Deviatia
standard
13-15 mm 2,99 2 0 15 2,431
16-18 mm 3,14 2 0 24 2,626
> 18 mm 3,60 3 0 16 2,059
Tehnicile de reproducere asistata care s-au utilizat in cazul lotului de 303 de paciente ce
au urmat protocol cu agonisti-GnRH pe anul 2000 au fost: FIV conventionala in 209 cazuri si
ICSI in 91 situatii. La pacientele cu ICSI, in 14 cazuri originea spermiilor a fost testiculara, prin
decongelarea probelor recoltate cu alta ocazie (crio-TESE). In 3 situatii s-a abandonat ciclul si nu
s-au punctionat folicolii (Fig. 1.2.3).
• FIV: 209 cazuri (68,97%);
• ICSI: 91 cazuri (30,03%);
• Cazuri nepunctionate: 3 (0,99%).
96
FIV
ICSI
Cazurinepunctionate
Fig. 1.2.3 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul grupului cu agonisti-GnRH pe
anul 2000
b. Rezultate
In urma punctiilor foliculare s-a obtinut un numar mediu de 8,29 ovocite, cu mediana de
8 ovocite. Numarul maxim de ovocite aspirate a fost de 32 iar numarul minim: 0 ovocite,
deviatia standard: 5,465 (Tabel 1.2.5).
Tabel 1.2.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu
agonisti-GnRH/ anul 2000
Numar mediu
ovocite
Mediana Numar maxim
recoltat
Numar minim
recoltat
Deviatia
standard
8,29 8 32 0 5,465
Controlul fecundarii realizat la 16-20 ore dupa inseminarea/microinjectarea ovocitelor a
relevat urmatoarele: numarul mediu de celule cu 2PN este de 3,56; cu mediana de 3 celule cu
2PN. Numarul maxim de ovocite fecundate a fost 16 si numarul minim: 0; deviatia standard:
3,530 (Tabel 1.2.6).
291
91
3
97
Tabel 1.2.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (agonisti-GnRH/ anul 2000)
Numar mediu
celule cu 2PN
Mediana Numar maxim
celule cu 2PN
Numar minim
celule cu 2PN
Deviatia
standard
3,56 3 16 0 3,530
Crioconservarea s-a efectuat la 121 de paciente; dintre acestea in 73 de cazuri (60,33%) a
fost vorba de celule cu 2PN provenite din FIV iar in 48 de cazuri (39,66%) celulele cu 2PN au
provenit din fecundarea ovocitelor microinjectate in cadrul procedurii ICSI (Fig 1.2.4).
0
20
40
60
80
Crio-FIV Crio-ICSI
Fig. 1.2.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI
(agonisti-GnRH/ anul 2000).
Embriotransferul s-a efectuat cu 1; 2 sau 3 embrioni. Au fost 66 de cazuri fara
embriotransfer raportate la cele 303 cicluri initiale. Media embrionilor transferati a fost de 1,67
iar mediana de 2 embrioni, deviatia standard: 1,052
73
48
98
Din cele 303 paciente care au inceput stimularea ovariana in vederea reproducerii
asistate, la 64 de cazuri a survenit sarcina. La o pacienta s-a stabilit ecografic diagnosticul de
sarcina intrauterina concomitent cu sarcina extrauterina, din acest motiv neconcordanta dintre 64
sarcini inregistrate fata de 65 (care reprezinta suma sarcinilor din tabel). Sarcinile intra- si
extrauterina simultana s-au soldat cu avort si respectiv salpingectomie. Evolutia sarcinilor
inregistrate este redata in urmatorul tabel (Tabel 1.2.7).
Tabel 1.2.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu agonisti-GnRH/ anul 2000
Sarcina Sarcina
biochimica
Avort
Sarcina
ectopica
Nastere
monofetala
Nastere
gemelara
Nastere
tripla
Nr. cazuri 13 13 5 23 11 0
Procent 20,31% 20,31% 7,81% 35,93% 17,18% 0
In cadrul acestor sarcini s-au constatat in cateva situatii malformatii fetale cu ocazia
investigatiilor prenatale si ulterior la examinarea postpartum a nou nascutilor.
• 1 avort a fost efectuat din motiv terapeutic, fiind stabilit diagnosticul de trisomie 21,
pacienta avand varsta de 41 ani!!!
• La o nastere monofetala s-a stabilit ca malformatie keilognatopalatoskizis.
• 2 nasteri gemelare au prezentat de asemenea malformatii.
Inregistrarea anomaliilor depistate ca procent in cadrul acestor sarcini a fost de 6 feti la 64
sarcini: 9,37%. Acest procent ridicat se explica odata prin prezenta trisomiei 21 la o pacienta
cu varsta > 35 de ani, situatie care se intalneste cu frecventa mai crescuta si in conceptiile
naturale. Pe de alta parte, la 2 sarcini gemelare se remarca malformatii – de asemenea este
cunoscut faptul ca riscul malformativ creste la sarcinile multiple fata de cele monofetale.
c. Observatii
Ca si esec intalnit in cadrul stimularii ovariene, asa cu am redat si in celelalte statistici,
mentionez lipsa raspunsului la terapie.
Cele 3 paciente la care nu s-a mai practicat punctie foliculara au avut raspuns ovarian redus
la tratamentul de stimulare si s-au intrunit criteriile de abandonare a ciclului de stimulare, cu
99
niveluri scazute ale E2 seric si intr-un caz s-a intalnit o crestere prematura a LH-ului endogen. La
pacienta care a prezentat cresterea prematura a LH-ului, la un nou ciclu de stimulare s-a obtinut
raspuns favorabil din punct de vedere al dezvoltarii foliculare, cu un numar de 17 ovocite la
punctie, dar fara a se fecunda ulterior niciunul (Tabel 1.2.8).
Varsta medie a pacientelor a fost de 34 ani, doar pacienta la care nu s-a obtinut nici un
raspuns (fara crestere foliculara) a avut 42 de ani. Toate pacientele au fost stimulate cu rFSH, in
cadrul protocoalelor lungi cu agonisti-GnRH, cu o durata medie de stimulare de 11 zile.
Tabel 1.2.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara) - agonisti-GnRH/ an 2000 Caz Cauza
Varsta
(ani)
Tip
FSH
Durata
stimularii
Nr.
total
UI
Tip
protocol
agonist
E2
(pg/ml)
LH
(UI/l)
Nr.
folicoli
- 13-15
- 16-18
- > 18
1 Low
response
33 rec 13 zile 3300 long 236 0,1 1/ 2/ 3
2 ↑
prematura
LH
27 rec 7 zile 975 long 1127 21,6 1/ 3/ 2
3 No
response
42 rec 11 zile 2475 long 294 1,4 0/ 0/ 0
Pentru alte 3 paciente s-a constatat situatia de „low responder”, dar s-a practicat totusi
punctia foliculara, in ciuda valorilor scazute ale estradiolului seric si ale numarului extrem de
redus al folicolilor. La pacienta cu varsta de 43 de ani s-a intalnit chiar valoarea cea mai scazuta
a estradiolului din intreg lotul de 303 paciente care au urmat tratament de stimulare ovariana cu
protocoale ce cuprindeau in schema agonist-GnRH / anul 2000. Din aceste 3 paciente cu raspuns
scazut la stimulare intr-un caz nu s-au aspirat ovocite si in 2 cazuri la punctia foliculara s-a
recoltat cate 1 ovocit, fara insa a se fecunda (Tabel 1.2.9). La aceste paciente varsta medie a fost
de 36,33 ani, doar 1 pacienta a fost de 43 de ani. Media unitatilor de gonadotropina administrata
a fost 4500 UI, deci a fost necesara o doza mare de stimulare. In 2 situatii s-a asociat rFSH cu
HMG in vederea stimularii ovariene.
100
Cu toate acestea nivelul E2 seric s-a mentinut in toate cele 3 cazuri < 500 pg/ml si dezvoltarea
folicolilor a fost minima.
La o pacienta s-a virat de la protocolul lung la cel scurt la a doua incercare, in scopul folosirii
efectului de „flare-up” al agonsitului, dar fara efectul dorit. S-a remarcat doar o scadere a duratei
si dozei de stimulare (cazul 1 si 2 din tabel).
Tabel 1.2.9 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – agonisti-GnRH/ an
2000 Caz Cauza
Varsta
(ani)
Tip
FSH
Durata
stimularii
Nr.
total
UI
Tip
protocol
agonist
E2
(pg/ml)
LH
(UI/l)
Nr.
folicoli - 13-15
- 16-18
- > 18
Rezultat
punctie
1 Low
resp.
33 rec+HMG 14 zile 5400 long 415 0,5 0/ 2/ 1 FIV,
Ø
ovocite
2 Low
resp.
33 rec+HMG 8 zile 4800 short 282 3,1 1/ 1/ 1 FIV, 1
ovocit
Ø
fecund.
3 Low
resp.
43 rec 10 zile 3300 long 205 1,6 1/ 1/ 1 FIV, 1
ovocit,
Ø
fecund.
Din cele 2 tabele anterioare, care exemplifica statusul de „low responder” al unor paciente, se
remarca ca factorul varsta nu are in aceste cazuri rol decisiv.
O complicatie a stimularii ovariene controlate este sindromul de hiperstimulare ovariana,
exemplificat in tabelul de mai jos (Tabel 1.2.10). Nu s-au remarcat cazuri de gravitate crescuta in
grupul de 303 paciente analizate.
101
Tabel 1.2.10 - Sindrom de hiperstimulare ovariana - agonisti-GnRH/ an 2000 Caz Grad
hiperstim.
E2
(pg/ml)
Nr.
folicoli - 13-15
- 16-18
- > 18
Punctie
folic.
ET Criocons. Sarcina Avort/
Nastere
1 II 2856 1/2/5 da da - nu -
2 II 3513 7/7/3 da da - da nastere
gemel.
3 II 1125 3/6/5 da nu - - -
4 I 2925 2/2/4 da da - nu -
5 II 935 1/1/2 da da da avort
6 II 1106 2/1/6 da da - nu -
7 II 5018 1/5/8 da da - nu -
8 II 1100 1/2/4 da da - da avort
9 II 8123 14/24/1 da nu da (tot) - -
10 I 1082 1/1/10 da da - nu -
• Doar 3 situatii au fost insotite de prezenta sarcinii.
• Incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana la totalul de 303 paciente este de 3,3%.
• Media E2 seric la aceste 10 cazuri a fost de 2778,3 pg/ml, cu extremele intre 925 si 8123
pg/ml.
• La pacienta cu valoarea cea mai crescuta a estradiolului seric (8123 pg/ml ) s-a preferat
crioconservarea tuturor celulelor cu 2PN, fara a se mai efectua embriotransferul. Prezenta
unei sarcini ar fi agravat sindromul de hiperstimulare. Tot la aceasta pacienta s-au
dezvoltat foarte multi folicoli de 13-15 si 16-18 mm (14 respectiv 24), factor ce a inclinat
de asemenea spre evitarea embriotransferului.
d. Concluzii
Din numarul de 303 paciente care au inceput ciclul de stimulare ovariana controlata:
• in 3 cazuri nu s-a efectuat punctie foliculara;
• la 4 paciente la aspiratia folicolilor nu s-au recoltat ovocite (punctie negativa);
• in 57 de situatii nu s-a realizat fecundatia;
102
• la 2 paciente s-au crioconservat toate ovocitele fecundate (toti prezigotii) si nu s-a mai
efectuat embriotransferul;
• in total la 66 de paciente ciclul de stimulare inceput nu s-a finalizat cu embriotransfer
(Tabelul 1.2.11).
Tabel 1.2.11 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ an 2000
Total punctii efectuate Total cazuri cu celule
cu 2PN
Total ET efectuate Total
cicluri
stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent
303 300 99% 246 81,18% 237 78,21%
Sarcini/ 2000: 64
• 43 sarcini au fost obtinute din FIV/ET si 21 de sarcini – din ICSI (3 sarcini din
crioTESE);
• la 47 de paciente stimularea s-a efectuat cu rFSH, la 10 paciente – cu HMG, la 2 paciente
cu FSH-HP, la 5 paciente: asociere rFSH cu HMG;
• din aceste paciente care au obtinut sarcina s-a aplicat protocolul lung la 59 de paciente,
cel scurt la 3 paciente si cel ultra-lung la 2 paciente.
Rata sarcinilor/ciclu: 21,12 %
Rata sarcinilor/punctie: 21,33%
Rata sarcinilor/embriotransfer: 27%
Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. embriotransferuri: 27%
Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 11,22%
e. Discutii
1. Numarul pacientelor care au inceput cicluri de stimulare ovariana controlata si au avut
protocoale cu agonisti-GnRH/ anul 2000 este de 8 ori mai mare comparativ cu ciclurile
cu antagonisti-GnRH din acelasi an.
103
2. Grupul majoritar al pacientelor care au urmat terapia de stimulare a fost intre 30-39 ani
(64,68%); procente foarte apropiate ale pacientelor de 35-39 ani cu cele de 30-34 ani.
3. Varsta pacientelor care au prezentat „low response” la terapia de stimulare nu a
reprezentat un factor favorizant pentru aceasta situatie nici in cadrul pacientelor cu
protocol cu agonist-GnRH, nici la cele cu antagonist-GnRH.
4. Pentru stimularea ovariana s-a preferat rFSH si a fost utilizat in procent covarsitor
protocolul lung.
5. Din cele 64 de sarcini survenite la lotul de 303 paciente, in 59 de cazuri s-a utilizat
protocolul lung, in 2 cazuri protocolul ultra-lung si in 3 cazuri protocolul scurt. Se
observa ca rata de implantare a fost mai crescuta (19,47%) in cazul aplicarii protocolului
lung.
6. In urma tratamentului de stimulare s-a obtinut un numar mediu de 8,29 ovocite, cu
mediana de 8 ovocite, deviatia standard: 5,465. In cazul protocoalelor cu anatgonisti-
GnRH/ 2000 s-au aspirat un numar mediu de 8,24 ovocite, mediana: 7 ovocite, deviatia
standard: 5,741. Datele sunt comparabile, fara a exista diferente semnificative. Este
cunoscut din datele din literatura ca in cazul protocoalelor cu antagonisti-GnRH se obtin
ceva mai putine ovocite [190].
7. In cazul agonistilor-GnRH/ anul 2000 - rata sarcinilor/ciclu; rata sarcinilor/punctie; rata
sarcinilor/ET; rata implantarii si respectivbaby take home rate sunt cu mult mai mari
comparativ cu ciclurile cu protocoale antagonisti-GnRH/ 2000. Pentru fiecare protocol cu
agonist- respectiv anatagonist-GnRH in parte procentele de punctii efectuate raportate la
numarul de cicluri initiate; rata de fecundare si rata embriotransferurilor sunt
asemanatoare.
104
Capitolul 1.3
Statistica agonisti-GnRH pe anul 2001
a. Material si metoda
Un grup de 271 de paciente au urmat in anul 2001 tratament de stimulare ovariana
controlata in vederea efectuarii metodelor de reproducere asistata. Aceste paciente au avut in
schema lor de terapie agonisti-GnRH ca medicatie de supresie hipofizara, medicatie administrata
sub diverse protocoale (exemplificate in partea generala a tezei).
Pacientele au avut media de varsta de 34,77 ani, cea mai tanara pacienta cuprinsa in acest
lot a fost de 22 de ani si cea mai varstnica – de 45 de ani; mediana: 35 de ani, deviatia standard:
4,690. Asa ca si la celelalte interpretari ale loturilor de paciente din anii 1999 si 2000, voi
prezenta repartitia (procentul) femeilor incluse in studiu in functie de grupe de varsta (Tabel
1.3.1).
Tabel 1.3.1 - Repartitia pacientelor pe grupe de varsta (agonisti-GnRH/anul 2001)
Varsta (ani) Numar paciente Procent
< 30 43 15,86 %
30-34 ani 81 29,88 %
35-39 ani 99 36,53 %
≥ 40 ani 48 17,71 %
Ca si in celelalte loturi de paciente, grupul majoritar este format de femeile cu varsta intre
35-39 de ani, urmat imediat de cele cu varsta intre 30-34 de ani. Insumate procentele pentru
aceste 2 varste depasesc cu mult numarul pacientelor ce se situeaza la extreme, adica < 30 de ani
si > 40 de ani. Este explicabila incidenta mai crescuta a femeilor > 35 de ani care se adreseaza
centrelor de reproducere asistata, deoarece tendinta femeilor moderne este de-a se implica social
activ, fapt care amana in acest fel momentul (poate chiar si dorinta) conceptiei.
105
Gonadotropinele care au fost utilizate pentru stimularea ovariana au fost in special
preparatele sintetizate genetic, urmate de gonadotropinele sintetizate din urina menopauzala,
asocierea celor 2 preparate enumerate si in cel mai mic procent - preparatele gonadotropinice
inalt purificate (Tabel 1.3.2) (Fig. 1.3.1). Conform statisticilor prezentate in partea generala s-a
dovedit ca preparatele moderne - cele sintetizate genetic - sunt superioare celorlalte
gonadotropine in ceea ce priveste calitatea si numarul ovocitelor si a embrionilor.
Tabel 1.3.2 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2001)
Tip gonadotropina Numar paciente Procent
rFSH 229 84,50 %
HMG 35 12,91 %
FSH-HP 3 1,10 %
rFSH + HMG 4 1,47 %
050100
150200250
rFSH
HMG
rFSH+HMG
FSH-HP
Fig. 1.3.1 - Incidenta administrarii tipurilor de gonadotropina (agonisti-GnRH/anul 2001)
229
35 4 3
106
Durata stimularii ovariene controlate cu preparatele de gonadotropina enumerate a fost in
medie de 11,41 zile; cu mediana de 11 zile. Cea mai scurta perioada de stimulare a fost de 6 zile,
respectiv cea mai lunga de 29 de zile. Deviatia standard: 2,350.
Pentru stimulare s-a folosit o medie de 2556,86 UI gonadotropina, cu mediana de 2250
UI, deviatia standard: 1232,866. Cantitatea maxima care a fost administrata s-a ridicat la
valoarea de 9225 UI gonadotropina, iar cantitatea cea mai mica de unitati a fost de 1050 UI
gonadotropina.
Ca si in statistica anului 1999 si 2000, cel mai des uzitat protocol pentru inhibitia
hipofizara a fost cel lung („long protocol”) in 253 de cazuri (93,35%), urmat de cel scurt („short
protocol”) in 10 cazuri (3,69%) si apoi ultra-lung („ultralong protocol”) in 8 cazuri (2,95%);
situatie redata de urmatoarea figura (Fig. 1.3.2).
Protocol lung
Protocol scurt
Protocol ultralung
Fig. 1.3.2 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonist-GnRH / anul 2001
Determinarea E2 seric corelat cu foliculometria sunt factori determinanti ai stabilirii
momentului inducerii ovulatiei si implicit al zilei de punctie foliculara. Media valorilor E2 seric
pentru lotul de 271 de paciente este 2042,04 pg/ml, cu mediana de 1800 pg/ml si deviatia
253
10 8
107
standard de 1369,984. Cea mai mica valoare determinata a fost de 34 pg/ml (!!!) si cea mai
crescuta s-a situat la 10.889 pg/ml.
Tabelul 1.3.3 reda procentul pacientelor in functie de anumite paliere valoarea E2 seric, cu scopul
de-a vizualiza pacientele cu concentratii ale hormonului mai mici sau mai mari fata de medie si
mediana.
Tabel 1.3.3 - Valorile defalcate ale E2 seric (agonist-GnRH/ anul 2001)
Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent
< 1000 49 18,08 %
1000-1499 57 21,03 %
1500-1999 50 18,45 %
≥ 2000 115 42,43 %
Pe langa determinarea serica a E2 este necesara si masurarea LH-ului, pentru a urmari
eficienta inhibitiei hipofizare realizata de catre agonistul-GnRH. Cresterile premature de LH
produc o luteinizare precoce a folicolului si au efect negativ asupra calitatii ovocitului. In cazul
de fata, la lotul de paciente, s-a determinat o medie a LH-ului ca fiind la 2,34 mUI/ml, cu
mediana: 2 mUI/ml si deviatia standard: 2,157. Cea mai mare valoare a LH-ului din acest grup
de paciente s-a situat la 28,2 mUI/ml si cea mai mica valoare inregistrata a fost de 0,1 mUI/ml.
Monitorizarea ecografica urmareste practic succesul stimularii ovariene prin cresterea folicolilor,
ca masura a tratamentului aplicat. Tabelul 1.3.4 de mai jos exemplifica parametri statistici ai
folicolilor.
Tabel 1.3.4 - Parametri statistici ai folicolilor masurati prin ecografie (agonist GnRH/anul 2001)
Dimensiune
folicoli
Media Mediana Numarul
minim
Numarul
maxim
Deviatia
standard
13-15 mm 2,74 2 0 10 2,182
16-18 mm 2,89 2 0 13 2,283
> 18 mm 4,16 4 0 16 2,356
108
Metodele de reproducere asistata care s-au aplicat pentru obtinerea embrionilor au fost
FIV conventionala si ICSI. La 181 de paciente s-a practicat FIV clasica si la 84 de paciente –
ICSI (din acestea - 10 cazuri au folosit spermii pentru microinjectie recoltate prin biopsie
testiculara, proba fiind crioprezervata pana in momentul folosirii ei: crioTESE). La 6 paciente nu
s-a mai efectuat punctia foliculara pe motivul raspunsului redus la terapia de stimulare si s-au
oprit ciclurile de stimulare (Fig. 1.3.3).
• FIV: 181 cazuri (66,78 %);
• ICSI: 84 cazuri (30,99 %);
• Cazuri nepunctionate: 6 (2,21 %).
FIV
ICSI
Cazuri nepunctionate
Fig. 1.3.3 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul grupului cu agonisti-GnRH pe
anul 2001
b. Rezultate
Punctiile foliculare au fost urmate de recoltarea unui numar mediu de 8,76 ovocite, cu
mediana de 8 ovocite. Numarul maxim de ovocite aspirate a fost de 25 iar numarul minim: 0,
deviatia standard: 5,281 (Tabel 1.3.5).
84
181
6
109
Tabel 1.3.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu
agonisti-GnRH/ anul 2001
Media
ovocitelor
Mediana Numar maxim
recoltat
Numar minim
recoltat
Deviatia
standard
8,76 8 25 0 5,281
In urma controlului fecundarii la intervalul de 16-20 de ore de la inseminarea
conventionala sau microinjectia ovocitelor s-a obtinut un numar mediu al celulelor cu 2PN de
3,71; mediana de 3 celule cu 2PN, deviatia standard: 3,047. Cel mai mare numar de ovocite
fertilizate a fost de 17 iar numarul minim: 0 (Tabel 1.3.6).
Tabel 1.3.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (agonisti-GnRH/ anul 2001)
Media
celulelor cu
2PN
Mediana Numar maxim
celule cu 2PN
Numar minim
celule cu 2PN
Deviatia
standard
3,71 3 17 0 3,047
Crioconservarea a fost posibila la 136 de paciente; dintre acestea in 91 de cazuri
(66,91%) a fost vorba de celule cu 2PN provenite din FIV iar in 45 de cazuri (33,08 %) celulele
cu 2PN au provenit din fecundarea ovocitelor microinjectate in cadrul procedurii ICSI (Fig
1.3.4). Parametrii statistici pentru celulele crioconservate releva urmatoarele: media celulelor
crioconservate a fost de 1,93, cu un maxim de 14 si minim de 0 celule, respectiv mediana de 0,5
celule si deviatia standard: 2,568.
Embriotransferul s-a efectuat cu 1; 2 sau 3 embrioni. Au fost 41 de cazuri fara
embriotransfer raportate la cele 271 cicluri initiale. Media embrionilor transferati a fost de 1,76
iar mediana de 2 embrioni, deviatia standard: 0,925
110
0
20
40
60
80
100
Crio-FIV Crio-ICSI
Fig. 1.3.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI
(agonisti-GnRH/ anul 2001)
In urma tehnicilor de reproducere asistata s-a inregistrat un numar total de 59 de sarcini.
Dintre acestea, la o pacienta de 40 de ani s-a stabilit diagnosticul de trisomie 18 si s-a efectuat
avort terapeutic (la 18 sapatamani de gestatie). La alta pacienta, de 38 de ani, prin efectuarea
biopsiei de vilozitati coriale, s-a constatat o aberatie cromozomiala a produsului de conceptie,
care a fost urmata de avort terapeutic (la 9 sapatamani de gestatie). Amandoua sarcinile au
provenit din embrioni obtinuti in urma FIV conventionale. In afara de aceste 2 cazuri nu s-au
inregistrat si alte anomalii. Procentul aberatiilor cromozomiale pentru acest grup de paciente este
3,38 %. Trebuie luat in considerare ca acest procent este dat si de faptul ca varsta celor 2 femei a
fost > 35 de ani (risc natural mai crescut pentru aneuploidii).Nu s-au intalnit sarcini triple.
Preponderente au fost sarcinile monofetale. Se remarca in acest lot de paciente ca procentul
91
45
111
avorturilor, al sarcinilor ectopice si al celor multiple (considerate „esec” al reproducerii asistate)
se inscriu in procentele enuntate de datele din literatura (Tabel 1.3.7).
Tabel 1.3.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu agonisti-GnRH/ anul 2001
Sarcina Sarcina
biochimica
Avort
Sarcina
ectopica
Nastere
monofetala
Nastere
gemelara
Nastere
tripla
Nr. cazuri 8 9 1 34 7 0
Procent 13,55% 15,25% 1,69% 57,62 % 11,86 % 0
c. Observatii
Esecurile terapiei de stimulare ovariana controlata, manifestate prin lipsa de raspuns la
medicatie, au fost inregistrate in numar de 6 pentru grupul de paciente analizate, cazuri care nu
s-au soldat cu punctie foliculara (Tabel 1.3.8).
Pacientele care nu au raspuns favorabil la medicatia de stimulare ovariana au prezentat o
medie de varsta de 34,5 ani, doar 2 dintre ele s-au situat la 38 si 42 de ani. Nici in aceste cazuri
varsta nu are rolul esential in lipsa de raspuns la tratamentul aplicat.
Pentru aceste paciente s-a folosit o medie a unitatilor de gonadotropina (4150 UI) mult peste
media calculata pentru intregul lot de 271 de paciente (2556,86 UI). Media duratei de stimulare a
fost insa asemanatoare: 12 zile fata de 11 zile pentru intregul lot.
Cazurile 5 si 6 reprezinta doua incercari de stimulare la aceeasi pacienta. Prima tentativa
a folosit protocolul lung. Avand in vedere esecul - prin lipsa de raspuns si cresterea prematura de
LH - s-a preferat pentru urmatoarea stimulare inhibitia hipofizara prin protocolul scurt, care in
acelasi timp, prin efectul sau initial de „flare up” sa stimuleze secretia de FSH endogen,
sperandu-se astfel o imbunatatire a situatiei. Nici aceasta a doua modalitate nu a avut succes.
112
Tabel 1.3.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara) - agonisti-GnRH/ an 2001 Caz Cauza
Varsta
(ani)
Tip
FSH
Durata
stimularii
Nr.
total
UI
Tip
protocol
agonist
E2
(pg/ml)
LH
(UI/l)
Nr.
folicoli
- 13-15
- 16-18
- > 18
1 Low
response
33 rec 14 zile 6300 long 348 1,9 1/ 0/ 1
2 Low
response
42 rec 12 zile 3450 long 121 0,8 0/0/1
3 No
response
38 HMG 10 zile 6000 short 34 !!! 3,9 0/0/0
4 No
response
28 rec+HMG 15 zile 2775 long 892 1,9 0/0/1
5 ↑
prematura
LH; low
response
33 rec 12 zile 2325 long 192 28,2 1/ 0/ 0
6 Low
response
33 rec 9 zile 4050 short 534 5,1 0/ 0/ 2
Reactia pacientelor in sensul hiperstimularii s-a inregistrat in 8 cazuri, descrise in tabelul
1.3.9. Sunt amintiti in tabel numarul de folicoli si dimensiunile lor, precum si concentratiile E2
seric, care conform definitiei gradelor de hiperstimulare, cresc odata cu gravitatea sindromului.
Nu este insa obligatorie aceasta corelare.
• La 6 paciente din cele 8 enumerate nivelul E2 seric s-a situat > 1500 pg/ml. Media
valorilor E2 seric la cele 8 paciente este de 3929,5 pg/ml, cu mult mai ridicata fata de
media valorilor pentru intregul lot de 271 de paciente (2042,04 pg/ml).
• Gravitatea sindromului de hiperstimulare a fost usoara si moderata.
• In toate cele 8 cazuri s-a efectuat embriotransferul.
• Nu a fost cazul de crioconservare a celulelor cu 2PN.
• Se remarca ca 7 din aceste 8 cazuri s-au insotit de prezenta sarcinii. Este cunoscut faptul
ca sarcina poate agrava sindromul de hiperstimulare.
113
Tabel 1.3.9 - Sindrom de hiperstimulare ovariana (agonisti-GnRH/ 2001) Caz Grad
hiperstim.
E2
(pg/ml)
Nr.
folicoli - 13-15
- 16-18
- > 18
Punctie
folic.
ET Criocons. Sarcina
Avort/
Nastere
1 II 1889 9/4/5 da da - da
nastere
2 II 6696 9/7/6 da da - da
nastere
3 II 2712 5/8/4 da da - da
nastere
4 II 3143 3/2/6 da da - nu
5 II 5608 7/2/5 da da - da
nastere
6 II 1326 1/1/3 da da - da
nastere
7 I/II 8592 8/7/7 da da - da
nastere
8 I 1470 3/2/3 da da - da
avort
d. Concluzii
Din totalul de 271 de paciente care au inceput ciclurile de stimulare in 6 cazuri nu s-a
efectuat punctie foliculara (pe motivul abandonarii ciclurilor).
• La 2 punctii foliculare nu s-au recoltat ovocite.
• In 33 de situatii nu s-a realizat fecundarea.
• In total la 41 de paciente nu s-a efectuat ET (date sumarizate in tabelul 1.3.10).
114
Tabel 1.3.10 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ an 2001
Total punctii efectuate Total cazuri cu
fecundare realizata
Total ET efectuate Total
cicluri
stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent
271 265 97,78 % 238 87,82 % 230 84,87 %
Sarcini/ 2001: 59
• 41 de sarcini din totalul de 59 s-au obtinut in urma metodei FIV/ET si 18 sarcini – din
aplicarea tehnicii ICSI (1 sarcina din crioTESE)
• la 55 de paciente care au obtinut sarcina s-a administrat rFSH in vederea stimularii
ovariene, la 2 paciente: HMG si la 2 paciente: FSH-HP
• dintre aceste paciente care au obtinut sarcina - protocolul lung a fost aplicat in 58 de
cazuri si la 1 pacienta s-a utilizat protocolul ultra-lung.
Rata sarcinilor/ciclu: 21,77 %
Rata sarcinilor/punctie: 22,26 %
Rata sarcinilor/embriotransfer: 25,65%
Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 26,52 %
Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 15,12 %
e. Discutii
1. Se remarca fata de anul anterior (2000) o scadere a numarului de paciente carora li s-a
administrat protocol cu agonisti-GnRH si o crestere a pacientelor care au apelat la
protocoalele cu antagonisti-GnRH. Acest fapt se datoreaza probabil si prin castigarea in
experienta in terapia cu antagonisti-GnRH, cat si prin interpretarea rezultatelor (a
procentului de sarcini) ca fiind comparabil intre agonisti- si antagonisti-GnRH.
2. Media de varsta a pacientelor din lotul agonisti-GnRH este de 34,77 ani, comparativ cu
33,66 ani la lotul ce a folosit antagonisti-GnRH.
3. Durata de stimulare cu gonadotropina este asemanatoare la cele 2 loturi, la fel si
frecventa crescuta a administrarii preparatului rFSH fata de alte gonadotropine. Difera
115
insa doza de stimulare, care la lotul cu antagonisti-GnRH este in valoare medie mai mica
decat la lotul cu agonisti-GnRN (1975,35 UI versus 2556,86 UI).
4. Procentul de raspuns nefavorabil la tratament, cu intreruperea ciclului este comparabil la
cele 2 loturi, desigur fiecare raportat la numarul total de cicluri initiale.
5. Media ovocitelor si a celulelor cu 2PN este usor mai scazuta in grupul cu agonisti-GnRH
comparativ cu antagonisti-GnRH/ anul 2001.
6. Rata sarcinilor raportata la numarul de cicluri initiate, la numarul de punctii efectuate si
la numarul de embriotransferuri realizate este insa superioara in grupul cu agonisti-GnRH
fata de antagonisti-GnRH:
Rata sarcinilor/ciclu: 21,77% versus 14,08%
Rata sarcinilor/punctie: 22,26 % versus 14,49%
Rata sarcinilor/ET: 25,65% versus 16,12%
Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 26,52 % versus 17,74%
Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 15,12 % versus 9,85%.
116
Capitolul 1.4
Statistica pe 3 ani (1999-2000-2001) - Agonisti-GnRH
a. Material si metoda
In perioada celor cei 3 ani studiati (1999; 2000; 2001) un total de 832 de paciente s-au
adresat in vederea reproducerii asistate si au urmat protocoale de stimulare ovariana ce
cuprindeau in schema lor agonisti-GnRH (Tabel 1.4.1) (Fig. 1.4.1).
Media de varsta a pacientelor se situeaza la 34,49 ani, cu mediana de 35 de ani si deviatia
standard: 4,727. Varsta minima din acest grup de paciente a fost de 21 ani si varsta maxima de
46 ani.
Tabel 1.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - agonisti-GnRH/ 3 ani
Varsta pacientelor (ani) Numar paciente Procent
< 30 143 17,18 %
30-34 259 31,12 %
35-39 298 35,81 %
≥ 40 132 15,86 %
Se remarca ca in cei 3 ani examinati separat, majoritatea pacientelor se situau in grupele
de varsta 30-34 sau 35-39 ani, iar datele insumate arata ca procentul majoritar al pacientelor ce
au urmat tratament in cadrul tehnicilor de reproducere asistata au avut varsta cuprinsa intre 35-39
ani, urmate indeaproape de pacientele in intervalul de varsta 30-34 de ani. Pacientele tinere < 30
ani si cele cu varsta ≥ 40 ani au de asemenea valori apropiate ca procente, dar sunt cu
aproximativ jumatate mai putine (fiecare luate separat) decat cele din grupele 30-34 si 35-39 de
ani.
Femeile cu varsta >35 ani se adreseaza mai frecvent consultului si terapiei in vederea
reproducerii asistate. Un factor important este acela ca actualmente femeia moderna este
117
implicata activ in viata sociala si profesionala si pe acest motiv amana momentul conceptiei dupa
varsta de 30 sau chiar 35 de ani.
< 30 ani
30-34 ani
35-39 ani
> 40 ani
Fig. 1.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - agonisti-GnRH/ 3 ani
Pacientelor ce au urmat protocoale cu agonisti-GnRH li s-au administrat mai multe tipuri
de gonadotropine in vederea stimularii ovariene controlate, conform tabelului 1.4.2 si figurii
1.4.2.
Tabel 1.4.2 - Repartitia tipurilor de gonadotropine - agonisti-GnRH/ 3 ani
Tipuri gonadotropine Numar paciente Procent
rFSH 660 79,32%
HMG 97 11,65%
rFSH + HMG 66 7,93%
FSH-HP 6 0,72%
rFSH + FSH-HP 1 0,12%
rFSH + HMG + FSH-HP 2 0,24%
298
259
143
132
118
Din tabel si figura se observa ca cel mai frecvent s-a utilizat preparatul sintetizat genetic.
In partea generala a tezei am amintit studii care analizeaza comparativ rFSH si HMG si apoi
rFSH si FSH-HP si evidentiaza superioritatea rFSH referitor la calitatea ovocitelor si a
embrionilor. Costul acestei medicatii sintetizata genetic ramane inca ridicat si constituie un
argument suficient de important pentru alegerea si altor tipuri de gonadotropine.
0100200300400500600700
rFSH
HM
G
rFSH
+ H
MG
FSH
-HP
rFSH
+FSH
-HP
rFSH
+HM
G+F
SH-
HP
rFSH
HMG
rFSH + HMG
FSH-HP
rFSH+FSH-HP
rFSH+HMG+FSH-HP
Fig. 1.4.2 - Repartitia tipurilor de gonadotropine din stimularea ovariana - agonisti-GnRH/ 3 ani
Asa cum se intalneste si in literatura de specialitate, protocolul lung a fost si in acesti 3
ani cel mai des aplicat protocol cu agonisti-GnRH la lotul de 832 de paciente. Avantajele si
dezavantajele fiecarui protocol in parte, precum si momentul introducerii medicatiei supresive
hipofizare si durata administrarii agonistului-GnRH au fost prezentate pe larg in partea generala.
Protocolul lung a fost urmat ca frecventa de catre protocolul scurt si pe locul al treilea s-a situat
protocolul ultra-lung (Tabel 1.4.3); (Fig. 1.4.3).
660
97 66
6 1 2
119
Tabel 1.4.3 - Incidenta tipurilor de protocol cu agonisti-GnRH/ 3 ani
Tip protocol 1999 2000 2001 TOTAL
Lung 239 269 253 761
Scurt 12 22 10 44
Ultra-lung 7 12 8 27
• Protocol lung: 761 cazuri (91,46%);
• Protocol scurt: 44 cazuri (5,28%);
• Protocol ultra-lung: 27 cazuri (3,24%).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Protocol lung Protocol scurt Protocol ultra-lung
Fig. 1.4.3 - Incidenta aplicarii celor 3 protocoale cu agonisti-GnRH/ 3 ani
761
44 27
120
Durata medie a stimularii ovariene a fost comparabila in cei 3 ani studiati (Tabel 1.4.4) si
comparabila cu datele din studii internationale.
Insumate, datele au fost urmatoarele: durata medie a stimularii ovariene: 11,36 zile, valoarea
minima - 6 zile si cea maxima - 29 zile, mediana: 11 zile, deviatia standard: 2,336.
Un procent de 56,37 % din paciente au necesitat o durata a stimularii intre 11-15 zile, fiind
intervalul cel mai apropiat de mediana si media perioadei calculate pentru intregul lot; este
comparabila si cu statistica generala. Valori ceva mai lungi (16-19 zile) si foarte prelungite ale
stimularii (≥ 20 zile) s-au intalnit in procente scazut (Tabel 1.4.5).
Tabel 1.4.4 - Parametri statistici ai duratei de stimulare ovariana - agonisti-GnRH/ 3 ani
An studiat Durata
medie a
stimularii
(zile)
Minim zile
stimulare
Maxim zile
stimulare
Mediana
(zile)
Deviatia
standard
1999 11,46 7 21 11 2,198
2000 11,24 6 24 11 2,438
2001 11,41 6 29 11 2,350
TOTAL ani 11,36 6 29 11 2,336
Tabel 1.4.5 - Variatia pacientelor in functie de numarul de zile de stimulare ovariana - agonisti-
GnRH/ 3 ani
Nr. zile stimulare Nr. paciente Procent
≤ 10 zile 324 38,94 %
11-15 zile 469 56,37 %
16-19 zile 34 4,08 %
≥ 20 zile 5 0,60 %
In ceea ce priveste doza medie calculata pentru unitatile de gonadotropina administrata la
cele 832 de paciente a fost de 2635,19 UI, doza minima a fost de 750 UI si doza maxima la care
s-a ajuns in cursul tratamentului – 14.700 UI (!!!); mediana: 2250 UI gonadotropina si deviatia
121
standard: 1428,368 (Tabel 1.4.6). Se observa ca doza medie de UI pentru fiecare an in parte cat
si cea calculata pentru intreaga perioada de 3 ani se situeaza in jurul valorii de 2500 UI si usor
mai crescuta peste aceasta valoare. Valorile maxime determinate pentru gonadotropinele
administrate pentru fiecare an in parte este insa foarte diferita, fiind cauzata de raspunsul la
terapia de stimulare al fiecarei paciente in parte si sugereaza statusul de „low responder”.
Tabel 1.4.6 - Parametri statistici ai gonadotropinelor - agonisti-GnRH/ 3 ani
An studiat Doza medie
a stimularii
(UI)
Minim doza
stimulare
(UI)
Maxim
doza
stimulare
(UI)
Mediana
(UI)
Deviatia
standard
1999 2784,98 750 14.700 2400 1692,569
2000 2577,42 825 8400 2250 1337,421
2001 2556,86 1050 9225 2250 1232,866
Total ani 2635,19 750 14.700 2250 1428,368
Ca si determinare hormonala a fost indispensabila si deosebit de importanta masurarea
valorii serice a E2 pe parcursul stimularii, iar rezultatele din tabele se refera la ultima valoare
anterior punctiei foliculare, fiind in ziua administrarii HCG. Acest hormon reflecta practic
functia foliculilor si raspunsul la terapia de stimulare. De o deosebita utilitate este si dozarea
serica al LH-ului, in vederea controlului supresiei hipofizare si a eficientei agonistului-GnRH.
Pe perioada celor 3 ani valoarea medie a E2 seric, masurat anterior inducerii ovulatiei, a
fost pentru intregul lot de paciente de 1926,21 pg/ml, cu o valoare minima obtinuta in ziua
administrarii HCG de 34 pg/ml (!!!) si o valoare maxima de 27.669 pg/ml; mediana: 1602,5
pg/ml, deviatia standard: 1702,215.
Tabelele urmatoare reflecta determinarile E2 seric pe paliere de valori. Ca si constatare:
cele mai multe paciente (36,41 %) au avut valori ale E2 seric > 2000 pg/ml in ziua administrarii
HCG, valori care se apropie de concentratii ce pot produce un sindrom de hiperstimulare
ovariana, (Tabel 1.4.7 si tabel 1.4.8).
122
Tabel 1.4.7 - Valorile defalcate ale E2 seric (pg/ml) - agonisti-GnRH/ 3 ani
Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent
< 1000 pg/ml 176 21,15 %
1000-1499 pg/ml 197 23,67 %
1500-1999 pg/ml 156 18,75 %
>2000 pg/ml 303 36,41 %
Tabel 1.4.8 - Parametri statistici ai nivelului E2 seric - agonisti-GnRH/ 3 ani
An studiat Nivel mediu
E2 (pg/ml)
Minim nivel
E2 (pg/ml)
Maxim
nivel E2
(pg/ml)
Mediana
(pg/ml)
Deviatia
standard
1999 1862,16 135 22.580 1563 1747,692
2000 1877,16 205 27.669 1529 1917,754
2001 2042,04 34 10.889 1800 1369,984
TOTAL ani 1926,21 34 27.669 1602,5 1702,215
In ceea ce priveste valorile LH se constata urmatorii parametrii statistici (Tabelul 1.4.9).
Tabel 1.4.9 - Parametri statistici pentru LH seric - agonisti-GnRH/ 3 ani
Determinare
LH seric
Valoarea
medie
Valoarea
minima
Valoarea
maxima
Mediana Deviatia
standard
1999 2,43 UI/l 0,1 UI/l 38 UI/l 2 UI/l 2,698
2000 2,57 UI/l 0,1 UI/l 21,6 UI/l 2,1 UI/l 2,073
2001 2,34 UI/l 0,1 UI/l 28,2 UI/l 2 UI/l 2,157
TOTAL ani 2,45 UI/l 0,1 UI/l 38 UI/l 2 UI/l 2,307
Doar in 4 cazuri (0,48%) au fost sesizate valori ale LH-ului > 10 UI/l.
123
3 paciente au fost stimulate cu rFSH si la o pacienta i s-a administrat asocierea rFSH si HMG.
In 3 situatii supresia hipofizara s-a realizat in cadrul unui protocol lung si la pacienta cu
asocierea de gonadotropine s-a preferat protocolul scurt.
Foliculometria seriata este un parametru important de urmarit alaturi de dozarea E2 seric
si semnifica reactivitatea pacientei la tratamentul administrat prin raspunsul ovarian. Am ales ca
parametru de urmarire marimea foliculara, cu 3 paliere de dimensiuni, pentru evaluarea
raspunsului ovarian. Masurarea ecografica a folicolilor s-a efectuat in paralel cu cea a dozarii E2
seric, valorile din tabel fiind ultimele masurate (anterior inducerii ovulatiei).
La lotul de 832 de paciente in cei 3 ani s-au obtinut urmatoarele valori in cadrul protocoalelor cu
agonisti-GnRH (Tabel 1.4.10):
Tabel 1.4.10 - Parametri statistici pentru foliculometrie - agonisti-GnRH/ 3 ani
Dimensiune
folicoli
(mm)
Numar
mediu
Numar
minim
Numar
maxim
Mediana Deviatia
standard
13-15 mm 2,79 0 15 2 2,298
16-18 mm 3,09 0 24 3 2,554
> 18 mm 3,80 0 16 4 2,107
Tehnicile de reproducere asistata aplicate cel mai des in cei 3 ani luati separat si per
ansamblu au fost fertilizarile conventionale, comparativ cu ICSI. De remarcat ca numarul de
cicluri abandonate a variat intre 0,99 si 3,1% in cei 3 ani analizati si valoarea procentuala
raportata la totalul de paciente a fost de 2,04%, care nu reprezinta o cifra semnificativa. (Tabel
1.4.11); (Fig. 1.4.4).
124
Tabel 1.4.11 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu agonisti-
GnRH/ 3 ani
FIV ICSI Fara punctie An Nr.
paciente Numar Procent Numar Procent Numar Procent
1999 258 135 52,32% 115 44,57% 8 3,10%
2000 303 209 68,97% 91 30,03% 3 0,99%
2001 271 181 66,78% 84 30,99% 6 2,21%
TOTAL 832 525 63,10% 290 34,85% 17 2,04%
FIV/ET
ICSI
Fara punctie
Fig. 1.4.4 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu agonisti-
GnRH/ 3 ani
525
290
17
125
b. Rezultate
Punctiile foliculare efectuate pentru FIV sau ICSI au recoltat o medie de 8,43 ovocite,
numarul maxim de ovocite aspirat in cadrul unei punctii fiind de 32 iar numarul minim de 0,
mediana: 8 ovocite, deviatia standard: 5,387.
La controlul fecundarii realizat la 16-20 ore de la inseminarea sau microinjectarea
ovocitelor s-a obtinut o medie de 3,71 celule cu 2PN, numarul maxim a fost de 23 celule cu 2PN
si un numar minim de 0 celule cu 2PN (absenta fecundarii), mediana: 3 celule cu 2PN, deviatia
standard: 3,273. S-au luat in calcul toate ciclurile de stimulare ovariana initiate.
ET s-a efectuat cu 1, 2 sau maxim 3 embrioni (criteriile au fost variate: varsta pacientei,
patologie, aspectul embrionilor, posibilitatea crioconservarii). Numarul mediu de embrioni
pentru transfer a fost de 1,76, mediana: 2 embrioni, deviatia standard: 0,958. Au existat si situatii
in care nu s-au transferat embrioni pe motivul sindromului de hiperstimulare (au fost
crioconservati), fie calulele cu 2PN s-au oprit in evolutie. Cazul cel mai nefericit este cel la care
in urma inseminarii/microinjectarii ovocitelor nu s-a realizat fecundarea. Au fost in total 135
cazuri la care nu s-a realizat embriotransfer. Rata realizarii embriotransferului a fost de 83,77%
pentru cele 832 cazuri.
Din totalul de 832 de cicluri initiale s-a reusit crioconservarea in 383 de cicluri (Tabel
1.4.12). S-a crioconservat o medie de 1,97 celule cu 2PN, numarul maxim fiind de 20, respectiv
numarul minim de 0 celule cu 2 PN; mediana: 0, deviatia standard: 2,860.
Tabel 1.4.12 - Repartitia crioconservarii functie de tehnica de reproducere asistata - agonisti-
GnRH/ 3 ani
Crio-FIV Crio-ICSI An Nr.
paciente
Total crio
Numar Procent Numar Procent
1999 258 126 68 53,96% 58 46,03%
2000 303 121 73 60,33% 48 39,66%
2001 271 136 91 66,91% 45 33,08%
TOTAL 832 383 232 60,57% 151 39,42%
126
c. Observatii
Complicatiile de tipul raspunsului redus la stimularea ovariana („low responder/no
responder”) intalnite pe parcursul celor 3 ani la cele 832 de paciente s-au soldat cu intreruperea
ciclului de stimulare si neefectuarea punctiei foliculare. Au existat si 3 cazuri la care in ciuda
existentei criteriilor de abandonare a stimularii s-a tentat totusi aspirarea foliculara dar fie a fost
punctia negativa – fara ovocite sau unicul ovocit extras nu s-a fecundat. In tabelul urmator (Tabel
1.4.13) sunt redate toate cazurile de „low responder” (cu sau fara punctie), situatie stabilita in
functie de criteriile ecografice si hormonale. S-au exclus cazurile la care nu s-a efectuat punctia
pe motivul sindromului de hiperstimulare.
Tabel 1.4.13 - Raspunsul redus la terapia de stimulare – agonisti-GnRH/ 3 ani Protocol agonist-
GnRH Tip gonadotropina Low
responder
Varsta
medie
(ani)
Medie UI
gonado-
tropina
Durata
medie
stim.
(zile)
lung scurt ultra-
lung
rFSH HMG rFSH+HMG
18 cicluri 34,22 4425,27 12,27 14 4 0 11 1 6
Raspunsul exagerat la terapia de stimulare, manifestat sub forma sindromului de
hiperstimulare, se intalneste in 29 de cazuri (3,48%) din totalul de 832 cicluri cu agonisti-GnRH/
3 ani.
Formele si gravitatea acestui sindrom au fost de la cea usoara la moderata si severa, cu
preponderenta celei moderate (in 21 de cazuri).
Valoarea E2 seric se coreleaza in majoritatea situatiilor, exista insa si exceptii, la care nu se
intalneste E2 seric crescut. Acest fapt a fost amintit in partea generala; fiind citate si cazuri de
sindrom de hiperstimulare care apare in ciclu spontan (rar).
Valoarea medie a E2 seric determinate pentru aceste paciente a fost de 3018,31 pg/ml, care se
situeaza cu mult peste concentratia medie a E2 seric calculat la lotul total de 832 de paciente
(1926,21 pg/ml).
La 18 paciente s-a inregistrat si prezenta sarcinii.
127
d. Concluzii
In perioada celor 3 ani analizati s-au obtinut pentru cele 832 de cicluri de stimulare
ovariana controlata cu protocoale cu agonisti-GnRH un numar total de 179 de sarcini (21,51%).
Nu s-au obtinut decat 27 sarcini biochimice (15,08%), 29 sarcini s-au terminat cu avort (spontan
sau terapeutic) (16,2%) iar numarul sarcinilor ectopice s-a ridicat la 9 (5,02%). Sarcinile multiple
au fost de asemenea reduse comparativ cu sarcinile monofetale (13,40% versus 50,83%),
sarcinile multiple fiind reprezentate doar de sarcini gemelare.
Rata avorturilor, a sarcinilor extrauterine si a celor multiple se inscriu procentual in datele din
literatura de specialitate (exemplificat in partea generala) (Tabel 1.4.14).
Tabel 1.4.14 - Numarul de sarcini/ nasteri la pacientele cu agonisti-GnRH/ 3 ani An Nr.
paciente
Nr.
sarcini
Sarcini
biochimice
Avort Sarcina
ectopica
Nastere
monofetala
Nastere
gemelara
Nastere
multipla
1999 258 56 6 7 3 34 6 0
2000 303 64 13 13 5 23 11 0
2001 271 59 8 9 1 34 7 0
TOTAL 832 179
21,51%
27
29
9
91
24
0
Sarcini/ 1999: 56
• 34 sarcini au rezultat din FIV/ET si 22 sarcini - din ICSI (1 sarcina din crioTESE);
• 51 paciente care au obtinut sarcina (inclusiv biochimica) au fost stimulate cu rFSH, 3
paciente: stimulare ovariana cu HMG, 2 paciente: rFSH asociat cu HMG;
• la 53 de paciente s-a aplicat protocolul lung, la 3 paciente – protocolul ultra-lung.
Sarcini/ 2000: 64
• 43 sarcini au fost obtinute din FIV/ET si 21 de sarcini – din ICSI (3 sarcini din
crioTESE);
• la 47 de paciente stimularea s-a efectuat cu rFSH, la 10 paciente – cu HMG, la 2 paciente
cu FSH-HP, la 5 paciente: asociere rFSH cu HMG;
128
• din aceste paciente care au obtinut sarcina s-a aplicat protocolul lung la 59 de paciente,
cel scurt la 3 paciente si cel ultra-lung la 2 paciente.
Sarcini/ 2001: 59
• 41 de sarcini din totalul de 59 s-au obtinut in urma metodei FIV/ET si 18 sarcini – din
aplicarea tehnicii ICSI (1 sarcina din crioTESE);
• la 55 de paciente care au obtinut sarcina s-a administrat rFSH in vederea stimularii
ovariene, la 2 paciente: HMG si la 2 paciente: FSH-HP;
• dintre aceste paciente care au obtinut sarcina - protocolul lung a fost aplicat in 58 de
cazuri si la 1 pacienta s-a utilizat protocolul ultra-lung.
Conform tabelelor 1.4.15 – 1.4.17 si a figurilor 1.4.5 - 1.4.7 se conclude ca:
• de la introducerea rFSH, acesta a castigat in incredere si si-a dovedit superioritatea
fata de preparatele gonadotropinice anterioare, fiind administrat in studiul actual in
procent de 85,47%;
Tabel 1.4.15 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cadrul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti-GnRH
Nr. sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent
rFSH 51 47 55 153 85,47%
HMG 3 10 2 15 8,37%
FSH-HP 0 2 2 4 2,23%
rFSH+HMG 2 5 0 7 3,91%
129
0
10
20
30
40
50
60
rFSH HMG FSH-HP rFSH+HMG
1999
2000
2001
Fig. 1.4.5 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti/GnRH
• tipul de protocol care a fost administrat in cazul marii majoritati a pacientelor a fost
cel lung (94,97%). Exista acumulata o experienta suficient de mare in cazul acestui
protocol si literatura de specialitate confirma avantajele acestuia;
Tabel 1.4.16 - Frecventa tipurilor de protocoale cu agonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani
Nr.sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent
Protocol lung 53 59 58 170 94,97%
Protocol scurt 0 3 0 3 1,67%
Protocol ultra-
lung
3 2 1 6 3,35%
130
0
10
20
30
40
50
60
Protocol lung Protocol scurt Protocolultralung
1999
2000
2001
Fig. 1.4.6 - Frecventa tipurilor de protocoale cu agonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani
• fertilizarile conventionale FIV/ET au fost in fiecare an superioare ca numar tehnicilor de microinjectie ICSI (65,92% versus 34,07%) si aplicate conform indicatiilor fiecarei metode.
Tabel 1.4.17 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti/GnRH
1999 2000 2001 TOTAL
Total
sarcini
56 64 59 179
Procent
FIV/ET
ICSI
34
22
43
21
41
18
118
61
65,92%
34,07%
131
05
1015202530354045
FIV/ET ICSI
1999
2000
2001
Fig. 1.4.7 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ agonisti/GnRH
Din 258 cicluri de stimulare initiate in anul 1999:
• 8 cazuri nepunctionate;
• 1 caz fara ovocit la punctie;
• 16 cazuri fara fecundare;
• in total: 29 cazuri fara ET.
Cele 303 paciente care au inceput ciclul de stimulare ovariana controlata in anul 2000:
• in 3 cazuri nu s-a efectuat punctie foliculara;
• la 4 paciente la aspiratia folicolilor nu s-au recoltat ovocite (punctie negativa);
• in 57 de situatii nu s-a realizat fecundatia;
• la 2 paciente s-au crioconservat toate ovocitele fecundate (toti prezigotii) si nu s-a mai
efectuat ET;
• in total la 66 de paciente ciclul de stimulare inceput nu s-a finalizat cu ET.
Din totalul de 271 de paciente care au inceput ciclurile de stimulare in anul 2001:
132
• in 6 cazuri nu s-a efectuat punctie foliculara (pe motivul abandonarii ciclurilor);
• la 2 punctii foliculare nu s-au recoltat ovocite;
• in 33 de situatii nu s-a realizat fecundarea;
• in total la 41 de paciente nu s-a efectuat ET.
(Tabel 1.4.18)
Tabel 1.4.18 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu agonisti-GnRH/ 3 ani
Total punctii
efectuate
Total cazuri cu
fecundare realizata
Total ET efectuate An Total
cicluri
stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent
1999 258 250 96,89% 233 90,31% 229 88,75%
2000 303 300 99% 246 81,18% 237 78,21%
2001 271 265 97,78 % 238 87,82 % 230 84,87 %
TOTAL 832 815 97,95% 717 86,17% 696 83,65%
Datele finale ale ratei sarcinilor sunt exemplificate in tabelul 1.4.19. Toate procentele
defalcate pe ani in parte pentru rata sarcinilor/ciclu se coreleaza cu procentele din statisticile
generale de 20-25% iar baby take home rate pentru cei 3 ani (13,82%) este de asemenea
comparabila cu datele din literatura.
Rata sarcinilor/cicluri stimulate: 21,51%
Rata sarcinilor/punctii efectuate: 21,96 %
Rata sarcinilor/embriotransfer: 25,68%
Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 27,29%
Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 13,82%.
133
Tabelul 1.4.19 - Rata sarcinilor – protocol agonisti-GnRH/ 3 ani
1999 2000 2001 TOTAL Rata
sarcini/ciclu 21,70% 21,12% 21,77% 21,51%
Rata sarcini/ punctie
22,40% 21,33% 22,26 % 21,96%
Rata sarcini/ET
24,45% 27% 25,65% 25,68%
Rata implantarii
28,38% 27% 26,52 % 27,29%
Baby take home rate
15,50% 11,22% 15,12 % 13,82%
e. Discutii
1. Numarul de paciente care s-a adresat intr-o perioada de 3 ani unui centru de reproducere
umana asistata si au fost incluse in program de stimulare ovariana cu protocol agonisti-
GnRH a fost cu mult superior lotului de paciente cu protocol cu antagonisti-GnRH. O
explicatie este faptul ca agonistii sunt cunoscuti mai demult si experienta acumulata cu
acestia este mai mare. Sinteza substantelor antagoniste si introducerea lor in practica
curenta este de data mai recenta. Este necesara o perioada de timp pentru a fi acceptata
aceasta medicatie atat de medic cat si de pacienta.
2. Se remarca ca media de varsta a pacientelor se situeaza la 34,49 ani, cu mediana de 35 de
ani, extremele sunt de 21 de ani si 46 de ani. Conform tendintei actuale a femeii moderne
de implicare activa in viata profesionala, se deduce de ce perioada alocata conceptiei se
situeaza in jurul acestei varste.
3. Din punctul de vedere al tipului de protocol – cel lung a fost aplicat in procent covarsitor
in cei 3 ani analizati separat si per ansamblu, existand mai bune rezultate cu acest
protocol.
4. Referitor la stimularea ovariana, preparatul care s-a impus este cel sintetizat genetic, cu
efecte mai bune asupra numarului si calitatii ovocitare si embrionare, comparativ cu
celelalte gonadotropine cunoscute.
134
5. Durata stimularii ovariene este in medie de 11,36 zile, majoritatea pacientelor (56,37%)s-
au incadrat in grupa perioadei cuprinse 11-15 zile.
6. Valoarea medie a E2 seric (dozat in ziua inducerii ovulatiei) a fost 1926,21 pg/ml pentru
intregul lot de 832 de paciente, cu o valoare minima - 34 pg/ml (!!!) si o valoare maxima
de 27.669 pg/ml (dependent de raspunsul individual); mediana: 1602,5 pg/ml.
7. Cresteri premature al LH-ului endogen> 10 UI/l s-au determinat doar in 4 cazuri (0,48%)
LH-ului, ceea ce semnifica o buna complianta a tratamentului. 3 din aceste cazuri au fost
asociere de protocol lung si rFSH, iar intr-o situatie a fost vorba de protocol scurt si
rFSH+HMG.
8. Incidenta tehnicii clasice de FIV/ET a fost cu mult mai crescuta fata de metoda
microinjectiei ICSI, atat in cazul intregului lot de paciente cat si la cele care au obtinut
sarcina. ICSI are indicatii clare, limitate la un grup mai restrans de patologie, in special la
cea masculina si care poate constitui un factor de fertilitate mai scazuta.
9. Numarul mediu de ovocite recoltat prin punctie foliculara a fost de 8,43, care se inscrie in
datele din literatura de specialitate.
10. Ciclurile abandonate pe motivul de raspuns redus la terapie, complicatia de low
responder sau dimpotriva, cea de sindrom de hiperstimulare ovariana nu se afla
procentual la valori care sa depaseasca statisticile generale.
11. Rata sarcinilor/ciclu: 21,51% si baby take home rate se incadreaza de asemenea in
parametri generali.
135
Capitolul 2 – Statistica pe 3 ani pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH in
reproducerea umana asistata
Capitolul 2.1
Statistica protocoalelor cu antagonisti-GnRH - anul 1999
a. Material si metoda
Numarul de paciente la care s-au efectuat tehnici de reproducere asistata utilizand
antagonisti-GnRH in cadrul schemelor de stimulare ovariana au fost 41.
Varsta medie a acestora a fost de 36,21 ani, mediana: 37 ani, cu valorile minime si maxime de 24
si 42 ani. Deviatia standard: 4,210 (Tabel 2.1.1).
Tabel 2.1.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor (antagonist-GnRH/ 1999)
Varsta pacientelor (ani) Numar paciente Procent
< 30 3 7,31 %
30-34 5 12,19 %
35-39 24 58,53 %
≥ 40 9 21,95 %
Se observa din acest tabel ca majoritatea pacientelor s-au incadrat in grupul de varsta 35-
39 de ani. Stimularea ovariana a folosit mai multe tipuri de preparate, cel mai frecvent a fost
administrat rFSH (in 31 cazuri, 75,6%) (Tabel 2.1.2); (Fig. 2.1.1).
Tabel 2.1.2 - Preparate de gonadotropine in stimularea ovariana (antagonist-GnRH/ 1999)
Tipuri gonadotropine Numar paciente Procent
rFSH 31 75,6 %
HMG 4 9,75 %
rFSH+HMG 5 12,19 %
FSH-HP 1 2,43 %
136
rFSH
HMG
rFSH+HMG
FSH-HP
Fig. 2.1.1 - Repartitia preparatelor gonadotropinice in stimularea ovariana (antagonist-GnRH/
1999)
In total s-au folosit pentru stimularea ovariana o medie de 2176,58 UI gonadotropina, cu
limitele intre 525 UI si 6000 UI; mediana: 1875 UI, deviatia standard: 1118,79.
Durata medie a stimularii a fost de 9,58 de zile, cu limitele intre 6 si 17 zile, mediana: 9
zile, deviatia standard: 2,144.
Dintre tipurile de protocol cu anatgonist-GnRH a fost preferat protocolul german
(Lübeck) in 37 de cazuri, fata de protocolul francez – in 3 cazuri (Fig. 2.1.2).
31
4
5
1
137
protocolLubeck
Protocolfrancez
Fig. 2.1.2 Tipurile de protocol cu antagonist-GnRH/ an 1999
Valoarea maxima atinsa a estradiolului seric a fost in medie de 1141,39 pg/ml, cu
extremele intre 219-2650 pg/ml, mediana: 1056 pg/ml, deviatia standard: 553,508 (Tabel 2.1.3)
Tabel 2.1.3 - Valori defalcate ale estradiolului seric (pg/ml) (antagonist-GnRH/ 1999)
Nivel E2 (pg/ml) Numar paciente Procent
< 1000 pg/ml 20 cazuri 48,78%
1000-1499 pg/ml 14 cazuri 34,14%
1500-1999 pg/ml 4 cazuri 9,75%
>2000 pg/ml 3cazuri 7,31%
Ca si o observatie: valoarea minima a estradiolului a fost de 219 pg/ml, totusi la aceasta
pacienta s-a efectuat punctie foliculara si s-a obtinut si fecundare. Complicatii de tipul
sindromului de hiperstimulare ovariana nu s-au intalnit la cele mai mari nivele atinse ale
estradiolului seric, ci la un nivel mediu, de 1269 pg/ml.
37
3
138
Concentratia medie serica a LH-ului a fost de 2,38 mUI/ml, cu extremele de 0,1 si 27,9
mUI/ml, mediana: 1,6 mUI/ml, deviatia standard: 4,301.
Ecografic s-au descris folicoli cu dimensiunile (Tabel 2.1.4):
• Media folicolilor 13-15 mm: 2,4. Mediana: 2 folicoli, deviatia standard: 2,013;
• Media folicolilor 16-18 mm: 2,12. Mediana: 2 folicoli, deviatia standard: 1,791;
• Media folicolilor > 18 mm: 4,12. Mediana: 3 folicoli, deviatia standard: 2,767.
Preponderenti au fost folicolii > 18 mm, asa cum de fapt se si doreste in cadrul unei stimulari
ovariene controlate.
Tabel 2.1.4 - Parametri statistici ai folicolilor (antagonisti-GnRH/anul 1999)
Dimensiune
folicoli
Media Mediana Numarul
minim
Numarul
maxim
Deviatia
standard
13-15 mm 2,4 2 0 7 2,013
16-18 mm 2,12 2 0 6 1,791
> 18 mm 4,12 3 1 17 2,767
Tehnicile de reproducere asistata care s-au efectuat au fost FIV conventionala in 24
cazuri si ICSI in 16 situatii, dintre care la 1 pacienta s-au folosit spermii crioconservate si
decongelate, obtinute din biopsie testiculara (TESE).
Intr-o situatie nu s-a aplicat nici o metoda pe motivul abandonului ciclului („low responder”)
(Fig. 2.1.3).
• FIV: 24 cazuri (58,53%);
• ICSI: 16 cazuri (39,02%);
• Cazuri nepunctionate: 1 (2,43%).
139
FIVconventionala
ICSI
Caznepunctionat
Fig. 2.1.3 - Tehnici de reproducere asistata aplicate (antagonisti-GnRH/anul 1999)
b. Rezultate
Numarul de ovocite obtinute in medie la aspiratul folicular a fost de 7,56, cu valoarea
minima de 0 (intr-un caz in care s-a efectuat punctie foliculara, cu toate ca se intruneau criterii de
abandon a ciclului) si valoarea maxima de 19 ovocite. Mediana: 6 ovocite, deviatia standard:
4,975 (Tabel 2.1.5).
Tabel 2.1.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu
antagonisti-GnRH/ anul 1999
Numar mediu
ovocite
Mediana Numar maxim
recoltat
Numar minim
recoltat
Deviatia
standard
7,56 6 19 0 4,975
Fecundarea, obtinerea celulelor cu 2 PN, s-a intalnit in 39 de cazuri din totalul de 41
cicluri stimulate (95,12%). Media celulelor fertilizate a fost de 4,19, cu limite intre 1 si 12 celule
cu 2 PN, mediana: 3 celule cu 2 PN, deviatia standard 3,226 (Tabel 2.1.6).
16 24
1
140
Tabel 2.1.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ anul 1999)
Numar mediu
celule cu 2PN
Mediana Numar maxim
celule cu 2PN
Numar minim
celule cu 2PN
Deviatia
standard
4,19 3 12 1 3,226
Numarul de embrioni care s-au transferat au fost intre 0 si 3, niciodata > 3 embrioni, cu o
medie de 2,07, mediana de 2 embrioni si deviatia standard: 0,905.
Crioconservarea celulelor cu 2 PN s-a putut efectua in 20 de cazuri, dintre care in 14
situatii celulele au provenit din FIV conventionala si in 6 cazuri – de la ICSI. Media celulelor cu
2 PN care s-au crioconservat a fost de 2,12, cu extremele de 1 si 10 (fig. 2.1.4).
02468
101214
Crio-FIV Crio-ICSI
Fig. 2.1.4 - Incidenta crioconservarii ca provenienta a celulelor fecundate din FIV, respectiv ICSI
(antagonisti-GnRH/ anul 1999).
14
6
141
In urma acestor proceduri s-a obtinut un total de 4 sarcini, evolutia acestora fiind
urmatoarea:
• 2 avorturi spontane (la 6 si 8 saptamani de gestatie)
• 2 nasteri - la termen, pe cale naturala, sarcini monofetale, copiii nascuti – cariotip
normal
Nu s-a intalnit nici o sarcina biochimica, extrauterina si nu au fost sarcini multiple (Tabel 2.1.7).
Tabel 2.1.7 - Evolutia sarcinilor la pacientele cu antagonisti-GnRH/ anul 1999
Sarcina Sarcina
biochimica
Avort
spontan
Sarcina
ectopica
Nastere
monofetala
Nastere
gemelara
Nastere
tripla
Nr. cazuri 0 2 0 2 0 0
Procent 0 50% 0 50% 0 0
c. Observatii
Esecurile intalnite au fost 2 la numar, reprezentate de o crestere prematura de LH si o
situatie de „low responder”.
• Situatia de „low responder” se descrie la o pacienta de 38 de ani, la care s-a stimulat
ovarian cu rFSH timp de 11 zile, un numar total de UI de 1875, in cadrul protocolului
Lübeck. Estradiolul seric maxim obtinut a fost de 381 pg/ml si valoarea LH a fost de 0,1
mUI/ml. Ecografic s-au masurat 2 folicoli 13-15 mm si 2 folicoli > 18 mm. Avand in
vedere criteriile de abandon ale stimularii la aceasta pacienta nu s-a efectuat punctie
foliculara (Tabel 2.1.8).
• Cresterea prematura de LH s-a intalnit la o pacienta de 41 de ani, la care s-a aplicat
protocolul francez, stimularea fiind cu rFSH timp de 9 zile, total UI FSH: 1575.
Estradiolul seric a fost de 771 pg/ml si LH a crescut la 27,9 mUI/ml. Ecografic s-au
masurat 4 folicoli de 13-15 mm si 2 folicoli > 18 mm. Cu toate ca aspectul ecografic, cel
al nivelurilor hormonale si varsta pacientei au pledat pentru intreruperea stimularii, totusi
s-a efectuat aspirat folicular in cadrul FIV conventionale, dar nu s-a obtinut nici un ovocit
(Tabelul 2.1.9).
142
Tabel 2.1.8 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ anul 1999 Caz Cauza
Varsta
(ani)
Tip
FSH
Durata
stimularii
Nr.
total
UI
Tip
protocol
E2
(pg/ml)
LH
(UI/l)
Nr.
folicoli
- 13-15
- 16-18
- > 18
1 Low
response
38 rec 11 zile 1875 Lubeck 381 0,1 2/ 0/ 2
Tabel 2.1.9 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – antagonisti-GnRH/ anul 1999 Caz Cauza
Varsta
(ani)
Tip
FSH
Durata
stimularii
Nr.
total
UI
Tip
protocol
E2
(pg/ml)
LH
(UI/l)
Nr.
folicoli
- 13-15
- 16-18
- > 18
Rezultat
punctie
1 ↑
prematura
LH
41 rec 9 zile 1575 francez 771 27,9 4/ 0/ 2 FIV.
Øovocit
Observatii particulare:
• Valoarea cea mai mica a estradiolului seric din grupul de 41 de paciente a fost de 219
pg/ml (valoare extrem de redusa) la o pacienta de 35 de ani, stimulata ovarian cu 1800 UI
rFSH timp de 8 zile, in cadrul protocolului Lübeck. Valoarea masurata a LH-ului: 3,2
mUI/ml. Folicolii masurati ecografic au fost: 3 folicoli 13-15 mm; 1 folicol 16-18 mm; 2
folicoli > 18 mm. S-a efectuat FIV conventionala si s-au obtinut 6 ovocite, dintre care 2
s-au fecundat. Embriotransferul s-a efectuat cu 2 embrioni, dar nu s-a obtinut nici o
sarcina.
• Toate cele 4 sarcini obtinute au fost in urma punctiei foliculare din cadrul FIV clasice, la
toate pacientele s-a folosit ca si gonadotropina - rFSH si s-a utilizat protocolul Lübeck.
Ca si complicatie in sensul raspunsului exagerat amintesc 1 caz de sindrom de
hiperstimulare ovariana grad I, care a aparut la o pacienta in varsta de 39 ani, la care s-a stimulat
143
cu rFSH timp de 6 zile, doza totala: 1275 UI, s-a aplicat protocolul Lübeck. Valoarea maxima a
estradiolului seric a fost de 1269 pg/ml, iar LH a fost de 0,2 mUI/ml. Ecografic folicolii au fost
in numar de 17 si toti > 18 mm. S-a practicat FIV clasica si s-au recoltat 19 ovocite, dintre care
11 s-au fecundat. 3 dintre aceste celule s-au cultivat pana a 2-a zi si s-a efectuat embriotransfer
cu 3 embrioni. Restul de 8 celule cu 2 PN s-au crioconservat. Nu s-a obtinut nici o sarcina.
De remarcat: criteriul de intrerupere a stimularii a fost indeplinit prin numarul mare de
folicoli > 18 mm, dar cu o secretie inadecvata de estradiol (mica pentru numarul si dimensiunea
folicolilor, neconcordanta). S-a indus ovulatia cu 10.000 UI HCG si s-a sustinut faza luteala cu
progesteron intravaginal 600 mg/zi.
d. Concluzii
Din cele 41 cicluri stimulate initial la 1 caz nu s-a efectuat punctie foliculara pe motivul
„low responder” (s-au efectuat doar 40 punctii). In 2 cazuri nu s-au obtinut ovocite (1 caz nu a
fost punctionat si intr-un caz nu s-au recoltat ovocite. Prin urmare, din totalul de 41 cicluri
stimulate, doar in 39 de cazuri s-a realizat embriotransferul (Tabel 2.1.10).
Tabel 2.1.10 - Rezultatele ciclurilor cu antagonisti-GnRH/ an 1999
Total punctii efectuate Total ET realizate Numar cicluri
stimulate Numar Procent Numar Procent
41 40 97,56% 39 95,12%
Rata sarcinilor/ciclu: 9,75%
Rata sarcinilor/punctie: 10%
Rata sarcinilor/embriotransfer: 10,25%
Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 10,25%
Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 4,87%
144
e. Discutii
1. Numarul de paciente din lotul ce au utilizat protocoale de stimulare ovariana cu
antagonisti-GnRH in schema au fost intr-un numar de 6 ori mai redus comparativ cu
pacientele care s-au adresat reproducerii asistate si care au fost incluse in protocoale cu
agonisti-GnRH.
2. Varsta medie a pacientelor se situeaza intre 35-39 ani.
3. Tipul de gonadotropina, durata medie a stimularii si doza medie totala a unitatilor de
gonadotropina sunt similare la lotul agonist versus antagonist-GnRH.
4. Numarul de punctii foliculare raportate la ciclurile initiale de stimulare ovariana si
procentul de ET realizate, raportate tot la ciclurile de stimulare, se ridica la valori similare
cu situatia intalnita la grupul cu agonist-GnRH.
5. Media si mediana ovocitelor rezultate in urma punctiei foliculare sunt mai reduse
comparativ cu grupul de paciente din acelasi an si carora li s-a administrat protocol cu
agonist-GnRH
6. Complicatii de tipul „low response” si sindrom de hiperstimulare ovariana se intalnesc in
procent redus (2,43%).
7. Totalul de sarcini obtinute au fost in urma tratamentului de stimulare cu rFSH in cadrul
protocolului Lübeck. Acest tip de protocol a fost administrat in procent majoritar
comparativ cu protocolul francez.
8. Raportarea sarcinilor la numarul de cicluri de stimulare/ la numarul de punctii efectuate si
la numarul de ET realizate este mult mai scazut in grupul antagonist-GnRH versus
agonist-GnRH.
145
9. Baby take home rate are valori reduse atat in comparatie cu datele din literatura de
specialitate, cat si fata de rezultatele obtinute la lotul de paciente cu agonist-GnRH.
146
Capitolul 2.2
Statistica protocoalelor cu antagonisti-GnRH - anul 2000
a. Material si metoda
Un numar de 37 de paciente au efectuat cicluri cu antagonisti-GnRH in anul 2000.
Varsta medie a pacientelor a fost 34,13 ani, cu limitele intre 26-43 ani, mediana: 34 ani,
deviatia standard: 4,001. Pacientele majoritare s-au situat in grupul de varsta 30-39 ani. Doar 3
paciente din grupul de 37 au avut varsta <30 ani. (Tabel 2.2.1)
Tabel 2.2.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor care au efectuat cicluri cu antagonist-
GnRH/ 2000
Varsta pacientelor Numar paciente Procent (%)
<30 ani 3 8,1
30-34 ani 16 43,24
35-39 ani 15 40,54
≥ 40 ani 3 8,1
Pentru stimularea ovariana s-au folosit preponderent preparatele de rFSH (34 paciente), la
2 paciente s-a utilizat HMG iar la 1 pacienta s-au combinat cele 2 preparate (rFSH si HMG) (Fig.
2.2.1).
Durata medie a stimularii cu gonadotropina a fost de 9,83 zile, durata cea mai scurta fiind
de 7 si cea maxima de 31 zile, mediana: 9 zile, deviatia standard: 3,869.
Media uitatilor de gonadotropina folosite pe parcursul stimularii ovariene a fost de
1939,32 UI FSH, cu extremele de 900 si 6225 UI, mediana: 1650 UI, deviatia standard: 912,635.
147
0
5
10
15
20
25
30
35
rFSH
HMG
HMG+rFSH
Fig. 2.2.1 - Preparate folosite pentru stimularea ovariana (antagonist-GnRH/ 2000)
Tipurile de protocol cu antagonist-GnRH au fost:
• Protocolul francez (doza unica): 6 cazuri (16%)
• Protocolul Lűbeck: 31 cazuri (84%) (Fig. 2.2.2)
Protocolfrancez
ProtocolLubeck
Fig. 2.2.2 - Tipurile de protocol cu antagonist-GnRH/ anul 2000
31
6
34
2 1
148
Nivelul seric obtinut pentru E2 (valoarea medie) in ziua administrarii HCG a fost de
1237,13 pg/ml, cu valoarea minima de 101 si maxima de 5494 pg/ml (Tabel 2.2.2), mediana
1105 pg/ml, deviatia standard: 1012,796.
Se observa ca in 48,64 % din cazuri cresterea estradiolului seric pe parcursul stimularii
(determinata inaintea administrarii HCG) a fost < 1000 pg/ml. In aceste cazuri se inscriu si cele
la care s-au abandonat ciclurile de stimulare pe motivul cresterii monofoliculare sau a scaderii
concentratiei de estradiol.
Tabel 2.2.2 - Nivelul defalcat al estradiolului seric – antagonisti-GnRH/ an 2000
Nivel seric estradiol
(pg/ml)
Nr. cazuri %
< 1000 18 48,64
1000-1500 9 24,32
1500-2000 4 10,81
>2000 6 16,21
S-a controlat pe parcursul stimularii si nivelul LH-ului endogen (mUI/ml), a carui valoare
medie a fost de 2,056; cu minima de 0,1 si maxima de 19,6 mUI/ml, mediana 0,9 mUI/ml,
deviatia standard: 3,305.
Doar 1 caz a prezentat o crestere prematura de LH (> 10 mUI/ml), constituind un criteriu de
abandon al ciclului si nu s-a efectuat punctie foliculara.
Masurarea ecografica a folicolilor a aratat urmatoarele valori (Tabel 2.2.3):
• Folicoli 13-15 mm - (media): 2,67 (valori extreme: 0-10);
• Folicoli 16-18 mm - (media): 2,35 (valori extreme: 0-10);
• Folicoli > 18 mm - (media): 3,51 (valori extreme: 0-12);
149
Tabel 2.2.3 – Parmateri statistici pentru folicoli – protocol cu antagonist-GnRH/ an 2000
Dimensiune
folicoli
Media Mediana Valoarea
minima
Valoarea
maxima
Deviatia
standard
13-15 mm 2,67 2 0 10 2,224
16-18 mm 2,35 2 0 10 1,917
> 18 mm 3,51 3 0 12 2,168
Din totalul de cicluri cu antagonist-GnRH/ anul 2000, la 21 cazuri s-a efectuat FIV/ET si
la 13 cazuri - ICSI. (Fig. 2.2.3) Majoritatea ciclurilor au fost de fertilizare conventionala. 3
cicluri din 37 totale au fost abandonate si nu s-a mai practicat punctie foliculara.
• FIV 21 cazuri (56,75%);
• ICSI: 13 cazuri (35,13%);
• Cazuri nepunctionate: 3 (8,1%).
FIV/ ET ICSI Cazuri nepunctionate
Fig. 2.2.3 - Proportia FIV/ET si ICSI la cele 34 cicluri antagonisti GnRH/ anul 2000 cu punctie
efectuata (din totalul de 37 cicluri stimulate)
2113
3
150
b. Rezultate
La punctia foliculara s-au obtinut in medie 8,24 ovocite comparabil cu datele din
literatura), cu valoarea minima de 0 si maxima de 24 ovocite, mediana: 7 ovocite, deviatia
standard: 5,741 (Tabel 2.2.4).
Tabel 2.2.4 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu
antagonisti-GnRH/ anul 2000
Numar mediu
ovocite
Mediana Numar maxim
recoltat
Numar minim
recoltat
Deviatia
standard
8,24 7 24 0 5,741
Fecundarea (celulele cu 2 PN) a fost controlata la 16-20 ore de la inseminarea sau
microinjectarea ovocitelor si s-a constatat o medie de 4,05 celule cu 2 PN, cu extremele intre 0 si
13 celule cu 2 PN, mediana: 3 celule cu 2 PN, deviatia standard: 3,390 (Tabel 2.2.5).
Tabel 2.2.5 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ anul 2000)
Numar mediu
celule cu 2PN
Mediana Numar maxim
celule cu 2PN
Numar minim
celule cu 2PN
Deviatia
standard
4,05 3 13 0 3,390
Celulele crioconservate (in stadiul de 2 PN) au fost in medie 2,05, cu limitele intre 1 si 10
celule.
Crioconservarea s-a efectuat in total la 17 cazuri, dintre care la 6 s-au obtinut celulele cu 2 PN
din cicluri ICSI si la 11 cazuri celulele crioconservate au provenit din cicluri FIV/ET. (Fig.
2.2.4).
151
Crio-FIV/ET
Crio-ICSI
Fig. 2.2.4 - Raportul celulelor cu 2 PN crioconservate ca provenienta din cicluri FIV/ET si ICSI
Media embrionilor transferati a fost de 2, cu limitele intre 0 (unde nu s-a obtinut
fertilizare) si 3, mediana: 2 embrioni, deviatia standard: 1. Nu s-a transferat un numar mai mare
de 3 embrioni (nici chiar la varsta extrema din grupul studiat).
In urma tehnicilor de reproducere umana asistata la grupul de 37 paciente care au efectuat
protocol de stimulare ovariana ce cuprindea in schema lor antagonist-GnRH s-a obtinut un
numar de 3 sarcini:
• 1 sarcina a fost biochimica (cresterea β-HCG si scaderea lui pe parcurs, fara a se
vizualiza sac gestational ecografic);
• 2 sarcini au fost terminate prin nasteri. Amandoua sarcinile au fost multiple: una
tripla, terminata prin operatie cezariana la 33 S.G; cei 3 nou nascuti au prezentat
stenoza intestinala, parintii au fost depistati cu deficit de 21-OH hidroxilaza si
mama a dezvoltat diabet gestational. A 2-a sarcina multipla a fost gemelara,
terminata prin operatie cezariana la 37 SG (Tabel 2.2.6).
Toate cele 3 sarcini au provenit din embrioni de la cicluri FIV, in care s-a folosit pentru
stimularea ovariana rFSH si protocol Lübeck cu antagonisti-GnRH.
6
11
152
Tabel 2.2.6 – Evolutia sarcinilor obtinute in urma tehnicilor de reproducere asistata – protocol
anatagonist-GnRH/ an 2000
Sarcina Sarcina
biochimica
Avort
spontan
Sarcina
ectopica
Nastere
monofetala
Nastere
gemelara
Nastere
tripla
Nr. cazuri 1 0 0 0 1 1
Procent 33,33% 0 0 0 33,33% 33,33%
c. Observatii
Esecurile in aceste 37 de cazuri au fost reprezentate de:
• 1 crestere monofoliculara;
• 2 valori scazute ale E2 seric pe parcursul stimularii;
• 2 cazuri cu absenta fecundarii.
Varsta pacientelor la care s-au inregistrat aceste esecuri a fost de:
26 ani: E2 seric scazut;
29 ani: E2 seric scazut;
32 ani: crestere monofoliculara;
34 ani: absenta fecundarii;
36 ani: absenta fecundarii.
Se poate remarca ca in acest grup de paciente varsta acestora nu poate constitui un factor
implicat in raspunsul slab („low responder”) la stimularea ovariana controlata.
Din totalul celor 37 cicluri nu s-a efectuat punctie foliculara in 3 cazuri, cu abandonarea
ciclurilor, si anume (Tabel 2.2.7):
• 1 caz a prezentat o crestere monofoliculara (1 folicol > 18 mm), la o pacienta de 32 ani,
cu E2 seric: 442 pg/ml, cu nivel seric al LH-ului: 19,6 mUI/ml, protocol francez (doza
unica) si un total de 1500 UI rFSH pe parcursul a 8 zile de stimulare;
• Al 2-lea caz - cu concentratia serica a E2 de 204 pg/ml, (1 folicol =15 mm), concentratia
LH endogen= 4,2 mUI/ml, la care s-a efectuat protocolul Lübeck, cu un total de 6225 UI
153
rFSH pe o durata de 31 de zile de stimulare. Varsta pacientei a fost de 29 ani. De
remarcat durata enorma de stimulare, cu o cantitate foarte mare de FSH administrat si
cresterea foliculara si hormonala insuficienta. Pacienta a avut un raspuns foarte prost la
acest tip de protocol, care nu a fost determinat de factorul varsta.
• Al 3-lea caz: nivelul seric al E2 redus, de 101 pg/ml, (ecografic: 10 folicoli intre 13 - 15
mm), concentratia LH endogen= 3,1 mUI/ml. Protocolul cu antagonist Gn-RH a fost cel
german-Lübeck si stimularea ovariana s-a efectuat cu rFSH 900 UI in total, pe o durata
de 10 zile. Varsta pacientei a fost de 26 de ani. Nici in acest caz varsta pacientei nu a
reprezentat un motiv pentru „low responder”.
Tabel 2.2.7 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ an 2000 Caz Cauza
Varsta
(ani)
Tip
FSH
Durata
stimularii
Nr.
total
UI
Tip
protocol
E2
(pg/ml)
LH
(UI/l)
Nr.
folicoli
- 13-15
- 16-18
- > 18
1 Low
response
si ↑ LH
32 rec 8 zile 1500 francez 442 19,6 !! 0/ 0/1
2 Low
response
29 rec 31 zile !! 6225 Lubeck 204 4,2 1/ 0/ 0
3 Low
response
26 rec 10 zile 900 Lubeck 101 3,1 10/ 0/ 0
Celelalte 2 cazuri de esec au fost reprezentate de absenta fecundarii:
• 1 caz – pacienta de 34 de ani, la care s-a practicat protocolul Lübeck, cu 2700 UI
rFSH, timp de 9 zile, nivelul E2 seric: 912 pg/ml si al LH-ului: 2,1 mUI/ml. S-au
obtinut prin punctie foliculara 2 ovocite si s-au inseminat conventional (FIV).
• Al 2-lea caz: pacienta de 36 de ani, protocol Lübeck; 1500 UI rFSH pe o durata de 9
zile, E2 seric: 2022 pg/ml si LH: 3 mUI/ml. La punctia foliculara s-au obtinut 8
ovocite care au fost inseminate conventional (FIV).
154
Tabel 2.2.8 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – antagonisti-GnRH/
an 2000 Caz Cauza
Varsta
(ani)
Tip
FSH
Durata
stimularii
Nr.
total
UI
Tip
protocol
E2
(pg/ml)
LH
(UI/l)
Rezultat
punctie
1 Low
response
34 rec 9 zile 2700 Lubeck 912 2,1 FIV, 2
ovocite,
Ø
fecund.
2 Low
response
36 rec 9 zile 1500 Lubeck 2022 3 FIV, 8
ovocite,
Ø
fecund.
Ca si o observatie la cele 2 cazuri de absenta a fecundarii se remarca similitudini : ale
varstei pacientei, a tipurilor de protocoale stimulate si a tipurilor de gonadotropina utilizata, cat
si durata stimularii ovariene. In al 2 –lea caz nivelul E2 seric a fost mult crescut fata de primul,
cu un numar evident mai mare de folicoli punctionati, fapt ce reiese si intr-un numar mai mare de
ovocite obtinute. Amandoua cazurile au fost FIV clasica. Varsta pacientelor (in jur de 35 ani) nu
a constituit un motiv de abandon a ciclului de stimulare, in aceste cazuri s-au obtinut folicoli si s-
au aspirat ovocite.
Din punct de vedere al tipurilor de protocoale folosite se observa ca in cazul celui francez
s-a obtinut o crestere monofoliculara cu abandonarea stimularii ovariene si o crestere a LH-ului
endogen. Doza de antagonist-GnRH (3 mg) a fost administrata in ziua a 7-a a ciclului menstrual.
Protocolul Lübeck s-a utilizat in celelalte 4 situatii de esec: 2 cazuri cu absenta fecundarii si 2
cazuri de nivel scazut al estradiolului seric.
Complicatiile inregistrate in cele 37 cazuri de stimulare ovariana folosind un protocol cu
antagonisti-GnRH au fost reduse, limitandu-se la 1 caz (2,7%) de hiperstimulare ovariana stadiul
II/III, la o pacienta de 33 de ani. S-a folosit in acest caz protocolul francez, s-a stimulat cu un
total de 1800 UI rFSH timp de 8 zile, estradiol seric: 1191 pg/ml. S-au punctionat 1 folicol 13-15
mm, 10 folicoli 16-18 mm si 3 folicoli > 18 mm. Ovocitele (11 obtinute) au fost supuse tehnicii
155
de microinjectie ICSI si in urma fecundarii s-au obtinut 5 celule cu 2 PN, dintre acestea 3 s-au
crioconservat si 2 s-au incubat pana a 2-a zi pentru embriotransfer. In acest caz nu s-a obtinut
sarcina.
De remarcat in acest caz numarul mare de folicoli cu dimensiunea de 16-18 mm, fara insa
a avea un nivel crescut de estradiol seric in momentul declansarii ovulatiei. Fenomenul de
hiperstimulare s-a dezvoltat pe parcurs.
d. Concluzii
Din cele 37 de cicluri stimulate initial, la 3 cicluri nu s-a efectuat punctie foliculara (s-au
efectuat doar 34 punctii). In 2 cazuri nu s-a obtinut fecundare (s-au efectuat doar 32
embriotransferuri) (Tabel 2.2.9).
Tabel 2.2.9 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu antagonisti-GnRH/ an 2000
Total punctii efectuate Total cazuri cu
fecundare realizata
Total ET efectuate Total
cicluri
stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent
37 34 91,89% 32 86,48% 32 86,48%
Rata sarcinilor/ciclu: 8,1%
Rata sarcinilor/punctie: 8,82%
Rata sarcinilor/embriotransfer: 9,37%
Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 15,62%
Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 5,4%
e. Discutii
1. Majoritatea pacientelor care efectueaza cicluri de stimulare in cadrul tehnicilor de
reproducere asistata se incadreaza in grupele de varsta 30-34 si 35-39 de ani, cu mici
diferente de la un an la altul si comparabile intre loturile de paciente care urmeaza
protocoale cu agonisti-GnRH fata de cele cu antagonisti-GnRH.
156
2. Durata medie a stimularii cu gonadotropina a fost de 9,83 zile pentru lotul cu antagonist-
GnRH / an 2000 fata de lotul cu agonist-GnRH/ an 2000, la care a fost ceva mai lunga, de
11,24 zile.
3. Media uitatilor de gonadotropina folosite pe parcursul stimularii ovariene la lotul cu
protocol cu antagonist-GnRH a fost de 1939,32 UI fata de lotul cu agonist-GnRH la care
a fost mai ridicata, de 2577,42 UI.
4. Procedeele de reproducere asistata utilizate au fost in amandoua loturile in procent mai
crescut FIV conventionale. De remarcat ca procentul cazurilor nepunctionate, a ciclurilor
abandonate, a fost mai mare in grupul cu antagonisti-GnRH fata de cel cu agonisti-GnRH
( 8,1% fata de 0,99%).
5. Numarul mediu al ovocitelor recoltate prin aspirare foliculara (8,24 versus 8,29) si al
celulelor fecundate (4,05 versus 3,56) este fara diferente semnificative la grupul
antagonist- fata de agonist-GnRH.
6. Incidenta sindromuluii de hiperstimulare ovariana este ceva mai redusa (2,7%) in lotul cu
antagonist-GnRH fata de agonist-GnRH (3,3%).
7. Rata sarcinilor obtinute in urma aplicarii portocolului cu antagonist-GnRH se situeaza la
valori mai mici fata de protocolul cu agonist-GnRH.
• Rata sarcinilor/ciclu: 8,1% versus 21,12 %
• Rata sarcinilor/punctie: 8,82% versus 21,33%
• Rata sarcinilor/ET: 9,37% versus 27%
• Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 15,62% versus 27%
• Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 5,4% versus 11,22%
157
Capitolul 2.3
Statistica protocoalelor cu antagonisti-GnRH - anul 2001
a. Material si metoda
In anul 2001 un numar de 71 paciente au efectuat cicluri de stimulare ovariana care
cuprind in schema antagonisti-GnRH.
Varsta medie a pacientelor a fost de 33,66 ani, cu valoarea minima de 27 ani si cea
maxima de 42 ani; mediana: 34 ani; deviatia standard: 4,159. Din totalul de 71 de paciente
grupul majoritar a fost reprezentat de femeile cu varsta intre 30 - 39 ani (Tabel 2.3.1).
Tabel 2.3.1 - Repartitia pacientelor pe grupe de varsta (antagonisti-GnRH/anul 2001)
Varsta (ani) Numar paciente Procent
< 30 15 1,4 %
30-34 27 38,02 %
35-39 23 32,39 %
≥ 40 6 8,45 %
Pentru stimularea ovariana s-a apelat la mai multe tipuri de gonadotropine: rFSH in 64
cazuri; HMG in 6 cazuri; rFSH+HMG - 1 caz, asa cum este ilustrat in urmatorul tabel si in figura
de mai jos (Tabel 2.3.2), (Fig. 2.3.1). Se remarca, ca si in toate grupurile de paciente analizate
pana acum, ca rFSH a fost administrat cel mai frecvent.
Tabel 2.3.2 - Tipurile de gonadotropine utilizate in stimularea ovariana (antagonisti-GnRH/anul
2001)
Tipuri gonadotropine Numar paciente Procent
rFSH 64 90,14 %
HMG 6 8,45 %
rFSH+HMG 1 1,4 %
158
FSH rec
HMG
FSH rec+HMG
Fig. 2.3.1 Repartitia frecventei tipurilor de gonadotropine utilizate in stimularea ovariana
(antagonisti-GnRH/anul 2001)
Durata stimularii ovariene a fost in medie de 10,23 zile, durata minima fiind de 7 zile si
cea maxima de 17 zile; mediana: 10 zile, deviatia standard: 2,174.
Pentru stimulare s-au administrat o medie de 1975,35 UI gonadotropina, doza minima a
fost de 450 UI si doza maxima - de 7425UI; mediana: 1800 UI, deviatia standard: 963,118.
Dintre cele 2 tipuri de protocoale cu antagonisti-GnRH, cel german – Lübeck (doze
multiple) a fost aplicat in toate cele 71 de cazuri si cel francez (doza unica) in nici un caz.
Prin stimularea ovariana s-a atins o medie a E2 seric (determinat in ziua inducerii
ovulatiei) de 1834,30 pg/ml, cea mai mica valoare a estradiolului masurata a fost de 142 pg/ml
iar cea maxima de 8704 pg/ml; mediana: 1610 pg/ml, deviatia standard: 1247,689. In tabelul
2.3.3 sunt redate defalcat valoarile E2 seric.
64
6 1
159
Tabel 2.3.3 - Valorile defalcate ale estradiolului seric (pg/ml) (antagonisti-GnRH/anul 2001)
Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent
< 1000 pg/ml 17 cazuri 23,94%
1000-1499 pg/ml 13 cazuri 18,30%
1500-1999 pg/ml 15 cazuri 21,12%
>2000 pg/ml 26 cazuri 36,61%
Determinarea concentratiei serice a LH-ului a relevat o medie de 2,12 mUI/ml, cu o
valoare minima obtinuta de 0,1 mUI/ml si una maxima de 18,7 mUI/ml; mediana 1,3 mUI/ml,
deviatia standard: 2,987.
Masuratoarea ecografica a folicolilor a demonstrat urmatoarele (Tabel 2.3.4):
• Folicoli 13-15 mm - (media): 3,09 (valori extreme: 0-10)
• Folicoli 16-18 mm - (media): 2,84 (valori extreme: 0-12)
• Folicoli > 18 mm - (media): 4,05 (valori extreme: 1-11)
Tabel 2.3.4 - Parametri statistici ai folicolilor (antagonisti-GnRH/anul 2001)
Dimensiune
folicoli
Media Mediana Numarul
minim
Numarul
maxim
Deviatia
standard
13-15 mm 3,09 2 0 10 2,778
16-18 mm 2,84 2 0 12 2,364
> 18 mm 4,05 4 1 11 2,260
In anul 2001, pentru cele 71 paciente care au urmat protocoale cu antagonisti-GnRH, s-au
efectuat un total de 26 FIV conventionale si un numar de 43 ICSI (din care in 2 cazuri s-au
folosit spermii din biopsii testiculare decongelate (crioTESE) (Fig. 2.3.2). In 2 situatii, la care era
planificata FIV, nu s-a mai practicat punctie foliculara, cu abandonarea stimularii ovariene pe
motivul raspunsului insuficient la terapie.
FIV: 26 cazuri (36,61%);
160
ICSI: 43 cazuri (60,56%);
Cazuri nepunctionate: 2 (2,81%)
FIV ICSI Cazuri nepunctionate
Fig. 2.3.2 - Repartitia tehnicilor de reproducere asistata din cadrul protocoalelor cu antagonisti-
GnRH/2001
b. Rezultate
In urma punctiei foliculare s-au recoltat ovocite, cu o valoare medie de 9,028 ovocite,
mediana: 7 ovocite, numarul minim aspirat a fost de 0 ovocite si numarul maxim de 31 ovocite;
deviatia standard: 6,940 (Tabel 2.3.5).
Tabel 2.3.5 - Parametri statistici pentru ovocitele recoltate prin punctie foliculara/protocol cu
antagonisti-GnRH/ anul 2001
Numar mediu
ovocite
Mediana Numar maxim
recoltat
Numar minim
recoltat
Deviatia
standard
9,02 7 31 0 6,940
26
43
2
161
La controlul fecundarii s-a obtinut o medie de 4,07 celule cu 2 PN, mediana: 3 celule cu 2
PN; deviatia standard: 3,473. Au fost situatii unde nu s-a realizat fecundarea; numarul maxim al
ovocitelor fecundate a fost de 14 (Tabel 2.3.6).
Tabel 2.3.6 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ anul 2001)
Numar mediu
celule cu 2PN
Mediana Numar maxim
celule cu 2PN
Numar minim
celule cu 2PN
Deviatia
standard
4,07 3 14 0 3,473
In 5 cazuri nu s-a realizat fecundarea ovocitelor, dintre acestea - 4 au provenit din punctie
foliculara efectuata in cadrul FIV si 1 caz a fost prin aspirat folicular pentru ICSI. La 2 paciente
nu s-au recoltat ovocite, fiind vorba de 2 cazuri de FIV clasica.
In 35 cazuri s-a efectuat crioconservarea celulelor cu 2 PN, din acest total, 23 (65,71%)
au reprezentat crioconservari ale celulelor fecundate provenite din ICSI si in 12 cazuri (34,28%)
- celule provenite din FIV clasica (mediana: 1, deviatia standard: 0,503) (Fig. 2.3.3).
Crio-FIV
Crio-ICSI
23
12
162
Fig. 2.3.3 - Crioconservarea celulelor cu 2 PN ca provenienta din diferitele tehnici de
reproducere asistata (antagonisti-GnRH/ 2001)
Numarul maxim posibil de celule cu 2 PN care s-au crioconservat a fost de 12, numarul
minim fiind de 2, media celulelor crioconservate: 2,29; mediana: 0, deviatia standard: 3,173
(Tabel 2.3.7).
Tabel 2.3.7 Parametri statistici ai celulelor crioconservate (antagonisti-GnRH/ 2001)
Media Mediana Numar
minim
Numar
maxim
Deviatia
standard
Nr celule cu 2
PN
crioconservate 2,29 0 0 12 3,172
Numarul embrionilor care s-au transferat a variat intre 0 si maxim 3 embrioni, mediana:
2, deviatia standard: 0,883.
In urma acestor proceduri s-a obtinut un numar total de 10 sarcini (14,08%), dintre care:
• 1 sarcina biochimica
• 2 avorturi spontane (la 7 si 14 saptamani de gestatie)
• 7 nasteri. Din aceste sarcini 2 au fost gemelare din start. La 1 caz unul dintre feti s-a oprit
in evolutie la 15 saptamani de gestatie, celalalt fat a evoluat pana la 36 saptamani de
gestatie, dupa care a fost extras prin operatie cezariana (greutate: 2295 g, IA-8/9), deci
pana la final a evoluat ca o sarcina monofetala.
• Nu s-au intalnit sarcini extrauterine si nici sarcini triple (Tabel 2.3.8).
Tabel 2.3.8 - Evolutia sarcinilor in urma protocoalelor cu antagonisti-GnRH / 2001
Sarcina Sarcina
biochimica
Avorturi
spontane
Sarcini
extrauterine
Nasteri
monofetale
Nasteri
gemelare
Nasteri
cu
tripleti
Nr.
cazuri
1 2 0 6 1 0
Procent 10% 20% 0 60% 10% 0
163
c. Observatii
Esecuri de tipul ciclurilor abandonate s-au intalnit in 2 situatii de “low responder”, in care
nu s-a mai practicat punctia foliculara.
• La un caz s-a masurat nivel scazut de E2 seric. Este vorba de o pacienta in varsta de 29 de
ani, cu stimulare ovariana cu rFSH in cadrul unui protocol Lübeck in vederea efectuarii
punctiei foliculare pentru FIV. S-au folosit un total de 2175 UI FSH pe o durata de
stimulare de 11 zile. S-au dezvoltat doar 3 folicoli de dimensiune > 18 mm, cu estradiol
de 142 pg/ml, valoarea LH: 0,1 mUI/ml.
• Cel de-al doilea caz s-a inregistrat la o pacienta de 32 de ani, de asemenea cu terapie de
stimulare ovariana cu rFSH in cadrul protocolului Lübeck, in vederea FIV. Durata
stimularii a fost de 8 zile, s-au administrat un total de 3600 UI, estradiolul determinat
anterior punctiei a fost de 161 pg/ml si valoarea LH: 1,7 mUI/ml. Ecografic s-au
dezvoltat 1 folicol de 13-15 mm, 1 folicol de 16-18 mm si 1 folicol > 18 mm. Si in acest
caz s-a renuntat la efectuarea punctiei.
In cele 2 cazuri pacientele au prezentat statusul de “low responder”, cu dezvoltare foliculara
inadecvata si o crestere insuficienta de E2. Au fost intrunite criteriile de intrerupere a stimularii
ovariene si nu s-a mai practicat punctie foliculara. In cel de-al 2-lea caz se remarca o cantitate
mai crescuta de gonadotropina administrata pacientei, cu raspuns foarte slab in urma acestei
stimulari.
Tabel 2.3.9 - Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ an 2001 Caz Cauza
Varsta
(ani)
Tip
FSH
Durata
stimularii
Nr.
total
UI
Tip
protocol
E2
(pg/ml)
LH
(UI/l)
Nr.
folicoli
- 13-15
- 16-18
- > 18
1 Low
response
29 rec 11 zile 2175 Lubeck 142 0,1 0/ 0/ 3
2 Low
response
32 rec 8 zile 3600 Lubeck 161 1,7 1/ 1/ 1
164
Esecul fecundarii – efectuarea aspiratului folicular cu recoltarea ovocitelor dar absenta
fecundarii acestora (absenta celulelor cu 2 PN) s-a inregistrat la 5 paciente. Sunt exemplificate in
cele ce urmeaza detaliat aceste situatii (Tabel 2.3.10).
Tabel 2.3 10 - Absenta fecundarii in grupul de paciente cu protocol cu antagonisti-GnRH/an
2001 Caz Varsta
(ani)
Tip
gonado
tropina
Proto-
col
Zile
de
Stim.
Total
UI
E2
pg/ml
LH
UI/l
Fol.
13-
15
mm
Fol.
16-
18
mm
Fol.
>
18
mm
IVF ICSI Nr.
ovoc.
1 35 rFSH+
HMG
Lubeck 13 7425 1536 2 3 3 3 DA - 2
2 27 rFSH Lubeck 9 2025 1143 1,2 2 1 4 DA - 6
3 27 rFSH Lubeck 12 1125 8704 14,8 10 12 2 DA - 23
4 34 rFSH Lubeck 9 2025 1620 1,1 2 5 1 - DA 8
5 39 rFSH Lubeck 10 2850 810 0,6 1 2 4 DA - 4
Ca si remarca generala asupra acestor paciente se observa varsta lor cu o variatie larga,
intre 27 si 39 ani.
Remarci particulare asupra acestor cazuri:
La pacienta cu varsta de 35 ani (cazul 1) s-au asociat gonadotropine pentru stimulare
ovariana (rFSH si HMG), fiind vorba si de durata cea mai lunga a stimularii – 13 zile. Tot
in acest caz s-a inregistrat si un numar foarte mare de unitati de gonadotropina folosite
(7425 UI), cu o dezvoltare relativ modesta a folicolilor si o crestere moderata a
estradiolului seric. Numarul de ovocite recoltate a fost redus: 2. Avand in vedere acest
esec al fecundarii, la pacienta in cauza s-a repetat cu ocazia altei incercari stimularea, dar
cu rFSH (numar mult mai scazut de unitati administrate fata de prima tentativa: 3600
versus 7425UI), cu o crestere mai accentuata a folicolilor > 18 mm (4 ca numar) si s-a
efectuat de aceasta data ICSI. Din cele 3 ovocite recoltate s-a fecundat doar 1 (toate cele
3 ovocite au fost mature, metafaza II). Raspunsul a fost de asemenea slab referitor la
dezvoltarea foliculara, dar s-a probat totusi fecundarea, fara obtinerea unei sarcini.
Cazul 2 - pacienta de 27 ani – a mai prezentat o stimulare anterioara, similara ca tip de
gonadotropina si antagonist-GnRH, dar cu durata mai lunga de stimulare (14 zile fata de
165
9 zile). In incercarea anterioara s-a realizat o dezvoltare foliculara asemanatoare si s-a
obtinut un numar de 2 ovocite cu fecundarea doar a uneia. Raspunsul la stimulare a fost si
in acea prima incercare foarte modest.
La pacienta de 27 ani (cazul 3), la care s-a inregistrat nivelul seric cel mai crescut al E2:
8704 pg/ml, s-a determinat si o concentratie mare a LH-ului: 14,8 mUI/ml. Dezvoltarea
foliculara a fost exagerata referitor la numarul folicolilor moderati (10 folicoli de 13-15
mm), folicolii de 16-18 mm au fost in numar de 12 si s-au descris doar 2 folicoli > 18
mm. Numarul de ovocite recoltate a fost foarte mare (23 ovocite). Ca si o observatie
aparte: nu s-a semnalat sindrom de hiperstimulare ovariana la aceasta pacienta, desi erau
indeplinite conditiile hormonale. Ca si o posibila explicatie a esecului fecundarii trebuie
luata in considerare cresterea prematura aLH-ului, care a produs o luteinizare a
folicolilor, cu alterarea calitatii ovocitare. De mentionat pentru aceasta pacienta s-a
efectuat ulterior, o alta stimulare (tot protocol Lübeck cu antagonisti-GnRH), dar cu
microinjectarea ovocitelor (ICSI) si s-a realizat fecundarea, dar fara a se obtine in
respectiva procedura si sarcina.
Cazul 4 (pacienta de 34 ani) a mai efectuat o procedura ICSI anterioara (tot protocol cu
antagonisti-GnRH), in urma caruia s-au microinjectat 3 ovocite mature si s-a obtinut
fecundarea pentru 2 celule, fara a se obtine sarcina.
La cazul 5, pacienta de 39 ani, s-a demonstrat prezenta fecundarii la o fertilizare
conventionala anterioara, in conditii de stimulare asemanatoare referitor la durata (12
versus 10 zile) si cantitatea de rFSH administrat (2550 versus 2850 UI), tot protocol cu
antagonisti-GnRH. Dezvoltarea foliculara si cresterea estradiolului seric a fost relativ
aceeasi (1038 versus 810 pg/ml). S-au recoltat 6 ovocite, dintre care 2 s-au fecundat, nu
s-a obtinut sarcina.
O alta observatie se refera la cazul unei paciente din grupul de 71 stimulari, la care s-a
inregistrat cel mai crescut nivel de LH seric (18,4 mUI/ml). La aceasta pacienta s-a efectuat
stimulare ovariana cu rFSH (total: 450 UI) in vederea unei inseminarii intrauterine. Tinand cont
de raspunsul pacientei la terapie (estradiol seric maxim: 1172 pg/ml, 1 folicol: 16-18 mm, 3
folicoli > 18 mm) si cu acordul acesteia s-a administrat antagonist-GnRH (protocol Lübeck: 2
doze de 0,25 mg/zi, incepand cu ziua 11 de ciclu menstrual) si s-a virat la FIV clasica. S-au
166
recoltat 4 ovocite, care s-au fecundat toate. Nu s-a efectuat embriotransfer in urma punctiei, ci
cele 4 celulele cu 2PN s-au crioconservat in acel stadiu.
Ca si complicatii se citeaza 3 cazuri de sindrom de hiperstimulare ovariana: 2 cazuri de grad
II si un caz de grad III. Doar la cel de grad III s-a inregistrat si sarcina, care a evoluat pana la
termen (Tabel 2.3.11).
• 1 caz cu severitate de grad II s-a inregistrat la o pacienta de 35 ani, care s-a stimulat
ovarian cu rFSH, durata de 13 zile, numar total de 2100 UI FSH, in cadrul protocolului
Lübeck, valoarea maxima a E2 seric in urma stimularii: 1429 pg/ml, valoarea LH: 0,3
mUI/ml, Ecografic se descriu 1 folicol de 13-15 mm, 4 folicoli de 16-18 mm si 4 folicoli
> 18 mm. In urma punctiei foliculare s-au obtinut 4 ovocite, care au fost microinjectate
conform procedeului ICSI. Controlul fecundarii a aratat doar o celula cu 2 PN. ET s-a
realizat cu 1 embrion. Nu s-a obtinut sarcina.
• Cel de-al 2-lea caz: pacienta de 29 ani, stimulare ovariana cu rFSH timp de 8 zile,
valoarea totala a gonadotropinei: 1050UI, protocol Lübeck , valoarea maxima a
estradiolului seric: 2993 pg/ml si LH: 2 mUI/ml. Masurarea ecografica anterior
declansarii ovulatiei a relevat 10 folicoli cu dimensiuni de 13-15 mm, 4 folicoli de 16-18
mm si 2 folicoli > 18 mm. Aspiratul folicular a obtinut 17 ovocite (12 in metafaza II si 5
cu vezicula germinala), dintre care prin tehnica ICSI s-au fecundat doar 8. ET s-a efectuat
cu 2 embrioni si 6 celule in stadiul de 2 PN au fost crioconservate. S-a obtinut o sarcina
monofetala, care a evoluat pana la termen. Sindromul de hiperstimulare ovariana a fost ca
si gravitate corespunzatoare gradului III.
• Al 3-lea caz: sindrom de hiperstimulare ovariana grad II la o pacienta de 32 ani, cu
stimulare ovariana in cadrul protocolului Lübeck efectuata cu rFSH, timp de 11 zile, doza
totala de 1525 UI. S-au masurat ecografic 8 folicoli de 13-15 mm, 8 folicoli de 16-18 mm
si 7 folicoli > 18 mm. Aici s-a procedat la efectul de “coasting”, si anume s-a oprit
stimularea cu rFSH si s-a continuat administrarea antagonistului-GnRH (inceput in ziua a
8-a de stimulare si 8 doze administrate in total) pana la scaderea E2 seric si de abia in
acest moment s-a administrat HCG pentru inducerea ovulatiei. E2 seric masurat anterior
inducerii ovulatiei a fost de 2872 pg/ml si valoarea LH: 0,8 mUI/ml. Punctia foliculara
pentru IVF conventionala a extras 31 ovocite, dintre care doar 9 s-au fecundat. Toate cele
167
9 celule in stadiul de 2 PN s-au crioconservat. La aceasta pacienta nu s-a efectuat ET in
urma punctiei, s-a considerat prea riscant si s-a amanat ET pentru un ciclu spontan.
Tabel 2.3.11 - Sindrom de hiperstimulare ovariana - antagonisti-GnRH/ an 2001 Caz Grad
hiperstim.
E2
(pg/ml)
Nr.
folicoli - 13-15
/ 16-18
/ > 18
Punctie
folic.
ET Criocons. Sarcina Avort/
Nastere
1 II 1429 1/4/4 da da - nu -
2 III 2993 10/4/2 da da - da nastere
monofet.
3 II 2872 8/8/7 da nu da (tot) - -
d. Concluzii
Din totalul de 10 sarcini obtinute - 5 (50%) au fost in urma procedeului clasic de FIV/ET
si celelalte 5 sarcini s-au inregistrat in urma procedeului de microinjectie ICSI.
La toate pacientele s-a utilizat protocolul Lübeck. Gonadotropina folosita a fost rFSH in 9
cazuri din cele 10 (procent majoritar de 90%) si intr-un caz s-a administrat HMG.
Evolutia sarcinilor dupa FIV/ET:
• 1 sarcina biochimica
• 1 avort spontan
• 1 nastere (sarcina gemelara cu 1 fat oprit in evolutie si 1 fat nascut)
• 1 nastere (sarcina gemelara)
• 1 nastere (sarcina monofetala).
Evolutia sarcinilor dupa ICSI:
• 1 avort spontan
• 4 nasteri (sarcini monofetale).
168
La cele 71 de cazuri s-au intrerupt ciclurile de stimulare in 2 situatii de „low responder”
si nu s-a efectuat punctie foliculara (punctie doar in 69 cazuri).
La 5 paciente s-a inregistrat esec al fecundarii.
La 1 caz de sindrom de hiperstimulare ovariana s-a preferat crioconservarea celulele cu 2
PN.
La o pacienta, pe motivul unei stimularii mai marcate in vederea unei inseminari
intrauterine, s-a virat la FIV si ovocitele recoltate si ulterior fecundate s-au crioconservat in
stadiul de 2 PN, urmand de asemenea un embriotransfer intr-un ciclu spontan.
In concluzie, din cele 71 cicluri stimulate initial in 9 cazuri nu s-a efectuat embriotransfer
(Tabel 2.3.12).
Tabel 2.3.12 - Rezultatele ciclurilor de stimulare cu protocoale cu antagonisti-GnRH/ an 2001
Total punctii efectuate Total cazuri cu
fecundare realizata
Total ET efectuate Total
cicluri
stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent
71 69 97,18% 64 90,14% 62 87,32%
Rata sarcinilor/ciclu: 14,08%
Rata sarcinilor/punctie: 14,49%
Rata sarcinilor/embriotransfer: 16,12%
Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 17,74%
Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 9,85%.
e. Discutii
1. Grupul de paciente cu varsta intre 30-34 ani a fost cel mai bine reprezentat in cadrul
lotului de 71 paciente care au inceput cicluri de stimulare cu protocol cu antagonisti-
GnRH si ca procent imediat urmator au fost pacientele ce s-au situat intre 35-39 de ani.
2. Gonadotropina rFSH a fost administrata in procent majoritar ca terapie de stimulare
ovariana.
169
3. S-a utilizat in exclusivitate protocolul Lübeck.
4. In cadrul acestui lot de paciente s-a folosit mai des tehnica microinjectiei ovocitelor –
ICSI fata de FIV conventionala, posibil si prin dezvoltarea in timp a acestei metode si a
indemanarii si experientei echipei de embriologi.
5. Rata sarcinilor raportata la numarul de cicluri; la numarul de punctii si la numarul de
embriotransferuri efectuate, respectiv baby take home rate se ridica la procente mai mari
fata de loturile de paciente cu protocol cu antagonist-GnRH din anii 1999 si 2000, si
comparabile cu datele din literatura.
170
Capitolul 2.4
Statistica pe 3 ani (1999-2000-2001) – protocoale cu antagonisti-GnRH
a. Material si metoda
In cei 3 ani studiati (1999; 2000; 2001) un total de 149 paciente au urmat protocoale de
stimulare ovariana ce cuprindeau in schema lor antagonisti-GnRH (Tabel 2.4.1); (Fig. 2.4.1).
Tabel 2.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - antagonisti-GnRH/ 3 ani
Varsta pacientelor (ani) Numar paciente Procent
< 30 21 14,09%
30-34 48 32,21%
35-39 62 41,61%
≥ 40 18 12,08%
< 30 ani
30-34 ani
35-39 ani
> 40 ani
Fig. 2.4.1 - Repartitia pe grupe de varsta a pacientelor - antagonisti-GnRH/ 3 ani
62
48
21 18
171
Varsta minima a acestui grup de paciente a fost de 24 ani si varsta maxima de 43 ani.
Media varstei totalului de paciente este de 34,48 de ani si mediana de 35 de ani, deviatia
standard: 4,246.
Se remarca ca daca in datele examinate pe cei 3 ani separat majoritatea pacientelor se
situau in grupele de varsta 30-34 sau 35-39 ani, datele insumate arata ca procentul majoritar al
pacientelor ce au urmat tratament in cadrul tehnicilor de reproducere asistata au avut varsta 35-
39 ani, cu un procent foarte apropiat al pacientelor tinere < 30 ani de al celor ≥ 40.
In general se adreseaza consultului si terapiei in vederea reproducerii asistate femei care
au deja un istoric obstetrical sau ginecologic, cu esec in conceptie, care au epuizat alte variante
de tratament pana in acel moment si care prin natura situatiei ajung la o varsta > 35 ani. Cu toate
acestea, tendinta generala a femeilor (observata pe plan mondial) este de-a concepe natural dupa
varsta de 30, chiar si 35 de ani.
In cazul acestor paciente ce au urmat protocoale cu antagonisti-GnRH s-au folosit mai
multe tipuri de gonadotropine pentru stimularea ovariana controlata, conform tabelului 2.4.2 si
figurii 2.4.2.
Tabel 2.4.2 Repartitia tipurilor de gonadotropine din stimularea ovariana - antagonisti-GnRH/ 3
ani
Tipuri gonadotropine Numar paciente Procent
rFSH 129 86,57%
HMG 12 8,05%
rFSH+HMG 7 4,69%
FSH-HP 1 0,67%
Din tabel se remarca de departe procentul mare pe care l-a castigat rFSH in competitia
pentru stimularea ovariana fata de celelalte preparate existente. Avantajele si rezultatele
medicatiei au fost descrise la partea generala a acestei lucrari. Totusi si in ziua de astazi costul
acestei medicatii sintetizata genetic ramane ridicat, mai ales in situatia in care pacienta isi asigura
terapia. Sunt tari in care programele de sanatate finanteaza cateva incercari in cadrul tehnicilor
172
de reproducere asistata. Se pot astfel prefera (in unele situatii particulare) si alte tipuri de
gonadotropine pe seama costurilor mai reduse.
0
20
40
60
80100
120
140
rFSHHMGrFSH +HMG
FSH-HP
rFSH
HMG
rFSH + HMG
FSH-HP
Fig. 2.4.2 Repartitia tipurilor de gonadotropine din stimularea ovariana - antagonisti-GnRH/ 3
ani
Cele 2 tipuri de protocoalele de stimulare ovariana care cuprind in schema lor
antagonisti-GnRH au fost detaliate din punct de vedere al dozelor si modului de administrare in
partea generala a tezei. S-a constatat ca la pacientele studiate pe durata a celor 3 ani s-a aplicat
majoritar protocolul Lübeck, care foloseste o doza zilnica de 0,25 mg antagonist-GnRH, cu
repetare pana in momentul declansarii ovulatiei.
Protocolul francez s-a administrat in 9 cazuri (6,04%), iar protocolul Lübeck la 140 paciente
(93,95%) (Fig. 2.4 3).
173
0
50
100
150
Protocol Lubeck Protocol francez
Fig. 2.4.3 - Incidenta aplicarii celor 2 protocoale cu antagonisti-GnRH/ 3 ani
Durata medie a stimularii ovariene a fost comparabila in cei 3 ani studiati (Tabel 2.4.3) si
comparabila cu datele din studii internationale.
Tabel 2.4.3 - Parametri statistici ai duratei de stimulare ovariana - antagonisti-GnRH/ 3 ani
An studiat Durata
medie a
stimularii
(zile)
Minim zile
stimulare
Maxim zile
stimulare
Mediana
(zile)
Deviatia
standard
1999 9,58 6 17 9 2,144
2000 9,83 7 31 9 3,869
2001 10,23 7 17 10 2,174
TOTAL ani 9,95 6 31 9 2,683
Insumate, datele au redat urmatoarele: durata medie a stimularii ovariene a fost de 9,95 zile,
valoarea minima de 6 zile si cea maxima de 31 zile, mediana: 9 zile, deviatia standard: 2,683. Un
140
9
174
procent de 69,79% din paciente au necesitat o durata a stimularii ≤ 10 zile, comparabila si cu
statistica generala. Valori foarte prelungite ale stimularii (≥ 15 zile) s-au intalnit in cazuri de
raspuns redus la stimulare si aceasta doar intr-un procent scazut (Tabel 2.4.4).
Tabel 2.4.4 - Variatia pacientelor in functie de numarul de zile de stimulare ovariana -
antagonisti-GnRH/ 3 ani
Nr. zile stimulare Nr. paciente Procent
≤ 10 zile 104 69,79 %
11-15 zile 40 26,84 %
16-19 zile 4 2,68 %
≥ 20 zile 1 0,67 %
Doza medie a unitatilor de gonadotropina administrata la cele 149 de paciente a fost de
2021,779 UI, doza minima a fost de 450 UI si doza maxima la care s-a ajuns in cursul
tratamentului – 7425 UI; mediana: 1800 UI gonadotropina si deviatia standard: 994,482 (Tabel
2.4.5).
Tabel 2.4.5 - Parametri statistici a gonadotropinelor in stimularea ovariana - antagonisti-GnRH/ 3
ani
An studiat Doza medie
a stimularii
(UI)
Minim doza
stimulare
Maxim
doza
stimulare
Mediana
(UI)
Deviatia
standard
1999 2176,58 525 UI 6000 UI 1875 1118,79
2000 1939,32 900 UI 6225 UI 1650 912,635
2001 1975,35 450 UI 7425 UI 1800 963,118
Total ani 2021,779 450 UI 7425 UI 1800 994,482
Determinarile hormonale au vizat masurarea valorii serice a estradiolului anterior
punctiei foliculare, care reflecta secretia foliculilor, precum si nivelul seric al LH-ului, pentru a
depista o eventuala crestere prematura a acestui hormon (efect nedorit de altfel).
175
Pe perioada celor 3 ani valoarea medie a estradiolului seric, masurat anterior inducerii
ovulatiei a fost de 1495,34 pg/ml, cu o valoare minima obtinuta in acest moment de 101 pg/ml si
o valoare maxima de 8704 pg/ml; mediana: 1259 pg/ml, deviatia standard: 1084,019.
Tabelele urmatoare reflecta determinarile estradiolului seric defalcat, cu o preponderenta
a valorilor < 1000 pg/ml in cursul stimularii. Dar nici valorile > 2000 pg/ml, care se apropie de
concentratii ce pot induce posibil un sindrom de hiperstimulare ovariana, nu au fost intr-un
procent neglijabil (23,48%) (Tabel 2.4.6 si Tabel 2.4.7).
Tabel 2.4.6 - Valorile defalcate ale E2 seric (pg/ml) pe cei 3 ani - antagonisti-GnRH
Nivel E2 seric (pg/ml) Numar paciente Procent
< 1000 pg/ml 55 cazuri 36,91%
1000-1499 pg/ml 36 cazuri 24,16%
1500-1999 pg/ml 23 cazuri 15,43%
>2000 pg/ml 35 cazuri 23,48%
Tabel 2.4.7 - Parametri statistici ai nivelului E2- antagonisti-GnRH/ 3 ani
An studiat Nivel mediu
E2 (pg/ml)
Minim nivel
E2 (pg/ml)
Maxim
nivel E2
(pg/ml)
Mediana
(pg/ml)
Deviatia
standard
1999 1141,39 219 2650 1056 553,508
2000 1237,13 101 5494 1105 1012,796
2001 1834,30 142 8704 1610 1247,689
TOTAL ani 1495,34 101 8704 1259 1084,019
In ceea ce priveste valorile LH se constata urmatorii parametrii statistici (Tabelul 2.4.8).
Doar in 4 cazuri au fost sesizate valori ale LH-ului > 10 UI/l. Toate aceste paciente au
fost stimulate cu rFSH.
In 2 dintre aceste cazuri cu crestere prematura a LH-ului s-a considerat ca este mai
practic sa se intrerupa stimularea si s-a abandonat ciclul. La aceste 2 paciente s-a aplicat
protocolul francez si stimulare ovariana cu rFSH.
176
Celelalte 2 cazuri au fost punctionate in cadrul FIV conventionale, cu protocol Lübeck si
stimulare cu rFSH; in amandoua situatiile s-au recoltat ovocite (1 pacienta cu LH= 18,7 UI/l a
prezentat fecundare, dar fara sarcina; la a 2-a pacienta, cu LH= 14,8 UI/l nu s-a realizat
fecundarea ovocitelor, posibil datorita luteinizarii si a aspectului lor de ovocite postmature.
Tabel 2.4.8 - Parametri statistici pentru LH seric - antagonisti-GnRH/ 3 ani
Determinare
LH seric
Valoarea
medie
Valoarea
minima
Valoarea
maxima
Mediana Deviatia
standard
1999 2,38 UI/l 0,1 UI/l 27,9 UI/l 1,6 UI/l 4,301
2000 2,05 UI/l 0,1 UI/l 19,6 UI/l 0,9 UI/l 3,305
2001 2,12 UI/l 0,1 UI/l 18,7 UI/l 1,3 UI/l 2,987
TOTAL ani 2,18 UI/l 0,1 UI/l 27,9 UI/l 1,2 UI/l 3,449
Ca si o concluzie partiala in urma schemelor de tratament cu antagonisti-GnRH se
observa ca protocolul Lübeck a fost mult mai des aplicat (93,95%) in cele 149 cazuri analizate.
Din cele 4 paciente cu crestere prematura a LH-ului (> 10 UI/l), 2 au apartinut grupului la
care s-a produs supresia hipofizara cu doza unica de antagonist, adica in cadrul protocolului
francez. La aceste 2 paciente s-a renuntat la a se mai practica punctia foliculara. Celelalte 2
paciente cu valori ale LH-ului > 10 UI/l au apartinut protocolului Lübeck, s-a efectuat
punctie, cu fecundare intr-un caz si fara fecundare in al doilea.
Posibil ca efectul antagonistului-GnRH in cadrul unui protocol cu doza unica de
administrare sa nu realizeze in toate situatiile o inhibitie suficienta a hormonilor endogeni.
Foliculometria alaturi de dozarea parametrilor hormonali reflecta raspunsul ovarian
adecvat sau inadecvat (in sensul raspunsului insuficient sau exagerat) la terapia de stimulare
administrata. Din acest motiv a fost ales ca parametru de urmarire si dimensiunea foliculara, cu 3
paliere de dimensiuni, pentru evaluarea raspunsului ovarian. Masurarea ecografica a folicolilor a
aratat pentru cei 3 ani urmatoarele valori obtinute in cadrul protocoalelor cu antagonisti-GnRH
(Tabel 2.4.9):
177
Tabel 2.4.9 - Parametri statistici pentru foliculometrie - antagonisti-GnRH/ 3 ani
Dimensiune
folicoli
(mm)
Numar
mediu
Numar
minim
Numar
maxim
Mediana Deviatia
standard
13-15 mm 2,81 0 10 2 2,456
16-18 mm 2,52 0 12 2 2,123
> 18 mm 3,93 0 17 3 2,385
La grupul de 149 paciente care au apelat la tehnici de reproducere asistata si la care s-au
introdus protocoalele de stimulare ovariana cu schema de antagonisti-GnRH s-au efectuat un
total de 71 FIV conventionale, 72 microinjectari ICSI si in 6 situatii nu s-a mai practicat punctie
foliculara (abandon cicluri). Analizat pe cei 3 ani separat se observa ca numarul de paciente a
crscut simtitor in anul 2001 fata de cei 2 ani anteriori, In anul 2001, atat in valoare absoluta cat si
procentual, procedeul ICSI a fost mult mai des aplicat (60,56%). Per global insa practicarea FIV
clasice comparativ cu ICSI nu a aratat diferente semnificativ statistic (47,65% versus 48,32%)
(Tabel 2.4.10); (Fig. 2.4.4).
Numarul de cicluri abandonate per total se situeaza la valoarea de 6 (4,02%), cu o
crestere usoara a valorii pentru anul 2000, unde s-a si inregistrat cel mai mic numar de paciente
carora li s-a administrat protocol cu antagonist-GnRH.
O posibila explicatie pentru practicarea din ce in ce mai frecvent a procedeului ICSI este
utilitatea aplicarii lui in cazuri de esec intalnit in cadrul FIV clasice (absenta pronucleilor), motiv
pentru care trebuie verificat procesul de fecundare si in mod special in cazurile cu sterilitate
masculina. Inainte de punerea la punct a metodei ICSI, lipsa fecundarii in cadrul FIV
conventionale ramanea deseori fara o explicatie clara.
178
Tabel 2.4.10 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu antagonisti-
GnRH/ 3 ani
FIV ICSI Fara punctie An Nr.
paciente Numar Procent Numar Procent Numar Procent
1999 41 24 58,53% 16 39,02% 1 2,43%
2000 37 21 56,75% 13 35,13% 3 8,10%
2001 71 26 36,61% 43 60,56% 2 2,81%
TOTAL 149 71 47,65% 72 48,32% 6 4,02%
FIV/ET
ICSI
Fara punctie
Fig. 2.4.4 - Incidenta tehnicilor de reproducere asistata in cadrul protocoalelor cu antagonisti-
GnRH/ 3ani
71 72
6
179
b. Rezultate
In urma punctionarii foliculare pentru FIV sau ICSI s-au obtinut o medie de 8,42 ovocite,
numarul maxim de ovocite aspirat la o punctie fiind de 31 iar numarul minim de 0, mediana: 7
ovocite, deviatia standard: 6,154 (Tabel 2.4.11).
Tabel 2.4.11 - Parametri statistici pentru ovocite (antagonisti-GnRH/ 3 ani)
Media Mediana Numar
minim
Numar
maxim
Deviatia
standard
Nr. ovocite
8,42 7 0 31 6,154
La controlul fecundarii realizat la 16-20 ore de la inseminarea sau microinjectarea
ovocitelor s-au obtinut o medie de 4,1 celule cu 2PN, un numar maxim de 14 celule cu 2PN si un
numar minim de 0 celule cu 2PN (absenta fecundarii), mediana: 3 celule cu 2PN, deviatia
standard: 3,364. S-au luat in calcul toate ciclurile de stimulare ovariana initiate (Tabel 2.4.12).
Tabel 2.4.12 - Parametri statistici pentru celulele cu 2PN (antagonisti-GnRH/ 3 ani)
Media Mediana Numar
minim
Numar
maxim
Deviatia
standard
Nr celule cu 2
PN
crioconservate 4,1 3 0 14 3,364
Embriotransferul s-a efectuat cu 1, 2 sau maxim 3 embrioni, numarul mediu de embrioni
pentru transfer a fost de 1,89, mediana: 2 embrioni, deviatia standard: 0,923.
Au existat si situatii in care nu s-au transferat embrioni pe motivul sindromului de
hiperstimulare (au fost crioconservati) sau in urma culturii celulelor cu 2PN a 2-a zi embrionii s-
au oprit in evolutie sau, cazul cel mai nefericit, la care in urma inseminarii/microinjectarii
ovocitelor nu s-a realizat fecundarea.
Au fost in total 17 cazuri la care nu s-a realizat embriotransfer. Rata realizarii
embriotransferului a fost de 88,59% pentru cele 149 cazuri.
180
Din totalul de 149 cicluri initiate s-a reusit crioconservarea in 72 cicluri (Tabel 2.4.13).
S-a crioconservat o medie de 4,5 celule cu 2PN, numarul maxim fiind de 12, respectiv numarul
minim de 1 celula cu 2 PN; mediana: 4, deviatia standard: 2,823. In acest calcul au fost stabiliti
parametrii statistici doar pentru cele 72 de cicluri cu crioconservari efectuate.
Tabel 2.4.13- Repartitia crioconservarii functie de tehnica de reproducere asistata - antagonisti-
GnRH/ 3ani
Crio-FIV Crio-ICSI An Nr.
paciente
Total crio
Numar Procent Numar Procent
1999 41 20 14 70% 6 30%
2000 37 17 11 64,7% 6 35,29%
2001 71 35 12 34,28% 23 65,71%
TOTAL 149 72 37 51,38% 35 48,61%
c. Observatii
Numarul de paciente care au prezentat un raspuns insuficient la stimularea ovariana
controlata si la care nu s-a mai practicat punctie foliculara sunt in numar de 6 (4,02%).
Din tabelul 2.4.14 se constata ca varsta medie a pacientelor este de 31 de ani, mai mica
decat varsta medie a totalului de 149 de paciente (34,48 ani), deci in acest caz varsta nu are rol
important in suspicionarea raspunsului redus la terapia de stimulare ovariana.
In toate situatiile s-a utilizat rFSH ca si tip de gonadotropina si in 5 din 6 cazuri (83,33%)
s-a aplicat protocolul Lübeck.
Valoarea medie a UI de gonadotropina este 2712,5.
Durata stimularii ovariene a fost in medie de 13,16 zile, prelungita fata de 9,95 zile, care
reprezinta media duratei de stimulare pentru intregul grup de paciente.
Numarul maxim de zile atins a fost de 31, situatie cand s-a administrat si doza cea mai
mare de rFSH dintre aceste 6 paciente (si anume 6225 UI). Valorile E2 seric s-au situat sub < 500
pg/ml (media valorilor: 238,5 pg/ml).
181
Doar la o singura pacienta s-a inregistrat cresterea prematura a LH-ului endogen, fiind
vorba de in acest caz de aplicarea protocolului francez.
Exista o corelatie clara pentru aceste cazuri a statusului de „low responder” cu durata medie a
perioadei de stimulare ovariana si cu nivelul scazut al E2 seric. Factorul varsta nu este implicat in
aceste cazuri.
Tabel 2.4.14- Cicluri abandonate (fara punctie foliculara)- antagonisti-GnRH/ 3 ani Caz Cauza
Varsta
(ani)
Tip
FSH
Durata
stimularii
Nr.
total
UI
Tip
protocol
E2
(pg/ml)
LH
(UI/l)
Nr.
folicoli
- 13-15
- 16-18
- > 18
1 Low
response
38 rec 11 zile 1875 Lübeck 381 0,1 2/ 0/ 2
2 Low
response
si ↑ LH
32 rec 8 zile 1500 francez 442 19,6 !! 0/ 0/1
3 Low
response
29 rec 31 zile !! 6225 Lübeck 204 4,2 1/ 0/ 0
4 Low
response
26 rec 10 zile 900 Lübeck 101 3,1 10/ 0/ 0
5 Low
response
29 rec 11 zile 2175 Lübeck 142 0,1 0/ 0/ 3
6 Low
response
32 rec 8 zile 3600 Lübeck 161 1,7 1/ 1/ 1
Au existat si situatii de raspuns ovarian inadecvat, dar in care totusi s-a efectuat punctia
foliculara. In aceste 3 cazuri exemplificate in tabelul 2.4.15 este vorba de paciente la care in
urma punctiei s-au recoltat un numar de 0; 2 si respectiv 8 ovocite, dar nici una din FIV nu s-a
insotit de fecundare.
Varsta medie a acestor 3 paciente este de 37 de ani, toate au fost stimulate cu rFSH si
doar intr-un caz s-a aplicat protocolul francez, acesta fiind insotit si de cresterea LH-ului
endogen (27,9 UI/l).
Numarul de UI de gonadotropina a variat intre 1500 si 2700.
182
Durata stimularii a fost in toate cele 3 cazuri de 9 zile si comparabila cu durata medie de
stimulare (9,95 de zile) a lotului total de paciente.
Concentratia medie a E2 seric pentru aceste 3 paciente se situeaza sub valoarea medie a
lotului total de 149 de paciente (1235 pg/ml comparativ cu 1495,34 pg/ml).
Se remarca din nou asocierea protocolului francez cu cresterea prematura a LH-ului
endogen, existand astfel posibilitatea ca o doza unica de antagonist sa fie insuficienta in
realizarea supresiei hipofizare.
Tabel 2.4.15 - Cicluri cu punctie efectuata, dar cu status de „low responder” – antagonisti-GnRH/ 3 ani Caz Cauza
Varsta
(ani)
Tip
FSH
Durata
stimularii
Nr.
total
UI
Tip
protocol
E2
(pg/ml)
LH
(UI/l)
Rezultat
punctie
1 ↑
prematura
LH
41 rec 9 zile 1575 francez 771 27,9 FIV.
Øovocit
2 Low
response
34 rec 9 zile 2700 Lubeck 912 2,1 FIV, 2
ovocite,
Ø
fecund.
3 Low
response
36 rec 9 zile 1500 Lubeck 2022 3 FIV, 8
ovocite,
Ø
fecund.
Sindromul de hiperstimulare s-a inregistrat la 5 cazuri din totalul de 149 de paciente si
reprezinta un procent de 3,35%. S-au constatat toate tipurile de gravitate ale acestui sindrom.
Valoarea medie a E2 seric pentru cele 5 paciente este de 1950,8 pg/ml si este mai mare decat
valoarea medie a lotului total de 149 de paciente (1495,34 pg/ml) (factor pozitiv de corelare al
aparitiei sindromului de hiperstimulare).
Se remarca conform definitiei criteriilor de abandonare a ciclurilor de stimulare prezenta mai
multor folicoli mici sau a unui numar mare de folicoli dominanti.
Doar 1 caz s-a insotit de prezenta sarcinii.
183
La o singura pacienta s-au crioconservat toate celulele fecundate si nu s-a efectuat ET, aceasta
fiind considerata o masura de siguranta (Tabel 2.4.16).
Tabel 2.4.16 - Sindrom de hiperstimulare ovariana - antagonisti-GnRH/ 3 ani Caz Grad
hiperstim.
E2
(pg/ml)
Nr.
folicoli 13-15
/ 16-18
/ > 18
Punctie
folic.
ET Criocons.
integral
Sarcina Avort/
Nastere
1 I 1269 0/0/17 da da - nu -
2 II/III 1191 1/10/3 da da - nu -
3 II 1429 1/4/4 da da - nu -
4 III 2993 10/4/2 da da - da nastere
monofet.
5 II 2872 8/8/7 da nu da (tot) - -
d. Concluzii
Numarul total de sarcini in perioada celor 3 ani analizati pentru cele 149 cicluri de
stimulare ovariana controlata cu protocoale cu antagonisti-GnRH a fost de 17. Nu s-au obtinut
decat 2 sarcini biochimice, 4 avorturi spontane si nici o sarcina ectopica. Sarcinile multiple au
fost de asemenea reduse comparativ cu sarcinile monofetale (17,64% versus 47,05%), date care
nu depasesc cele inregistrate in statisticile mondiale (exemplificat in partea generala) (Tabel
2.4.17).
Tabel 2.4.17 - Numarul de sarcini si evolutia lor la pacientele cu antagonisti-GnRH/ 3 ani An Nr.
paciente
Nr.
sarcini
Sarcina
biochimica
Avort
spontan
Sarcina
ectopica
Nastere
monofetala
Nastere
gemelara
Nastere
tripla
1999 41 4 0 2 0 2 0 0
2000 37 3 1 0 0 0 1 1
2001 71 10 1 2 0 6 1 0
TOTAL 149 17 2
11,76%
4
23,52%
0 8
47,05%
2
11,76%
1
5,88%
184
O particularitate care s-a intalnit in grupul de paciente a fost cea referitoare la o sarcina
initial gemelara, a carei evolutie a fost ulterior monofetala: unul dintre feti s-a oprit in evolutie la
15 saptamani de gestatie iar celalalt si-a continuat evolutia pana in momentul extractiei sale prin
operatie cezariana (la 36 saptamani de gestatie).
Sarcini/1999
Cele 4 sarcini au provenit din FIV conventionale, unde s-a utilizat rFSH pentru stimularea
ovariana si s-a aplicat procedeul Lübeck.
Sarcini/ 2000
Toate cele 3 sarcini au provenit din embrioni de la cicluri FIV, in care s-a folosit pentru
stimularea ovariana rFSH si protocol Lübeck
Sarcini/ 2001
Din totalul de 10 sarcini, 5 sarcini au provenit din embrioni FIV si 5 sarcini din embrioni ICSI.
In 9 cazuri s-a utilizat rFSH si protocol Lübeck, doar in 1 caz s-a administrat HMG in vederea
stimularii ovariene si s-a aplicat tot protocolul Lübeck (1 sarcina obtinuta in urma tehnicii ICSI).
Insumand sarcinile pe cei 3 ani se pot conclude urmatoarele:
• pentru stimularea ovariana s-au folosit in 16 cazuri rFSH (94,11%) si in 1 caz HMG
(5,88%) (Tabel 2.4.18); (Fig. 2.4.5)
Tabel – 2.4.18 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cadrul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/ antagonisti-GnRH
Nr. sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent
rFSH 4 3 9 16 94,11%
HMG 0 0 1 1 5,88%
185
0123456789
rFSH HMG
1999
2000
2001
Fig. 2.4.5 - Frecventa tipurilor de gonadotropine in cadrul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/
antagonisti-GnRH
• din 17 sarcini inregistrate in urma schemelor cu antagonisti-GnRH, acestea au fost in
exclusivitate obtinute dupa inhibitia hipofizara conform protocolului Lübeck (Tabel
2.4.19); (Fig. 2.4.6);
Tabel 2.4.19 - Frecventa tipurilor de protocoale cu antagonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani
Nr.sarcini 1999 2000 2001 TOTAL Procent
Protocol
Lübeck
4 3 10 17 100%
Protocol
francez
0 0 0 0 0
186
0123456789
10
Protocol Lubeck Protocol francez
1999
2000
2001
Fig. 2.4.6 - Frecventa tipurilor de protocoale cu antagonisti-GnRH in cazul sarcinilor obtinute in
cei 3 ani
• in 12 cazuri din total (70,58%) embrionii au provenit in urma fecundarii ovocitelor
punctionate in cadrul FIV conventionale. In 5 cazuri (29,41%) s-au obtinut sarcini
dupa embriotransferul in urma fecundarii ovocitelor microinjectate conform metodei
ICSI (Tabel 2.4.20); (Fig. 2.4.7).
Tabel 2.4.20 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/
antagonisti/GnRH
1999 2000 2001 TOTAL
Total
sarcini
4 3 10 17
Procent
FIV/ET
ICSI
4
0
3
0
5
5
12
5
70,58%
20,51%
187
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
FIV/ET ICSI
1999
2000
2001
Fig. 2.4.7 - Incidenta tehnicilor reproducerii asistate in cazul sarcinilor obtinute in cei 3 ani/
antagonisti/GnRH
S-au inceput 149 de cicluri de stimulare in cei 3 ani descrisi, dintre care punctii foliculare
s-au efectuat doar in 143 situatii si embriotransferuri in 133 cazuri (Tabel 2.4.21).
Numarul mai mic de punctii foliculare se explica pe baza abandonarii ciclurilor (situatie detaliata
la fiecare an in parte) iar numarul mai mic al embriotransferurilor este dat de esecul fecundarii
dupa inseminarea/microinjectarea ovocitelor, respectiv absenta embrionilor. Au fost si cazuri
particulare in care s-au crioconservat celulele cu 2PN, urmand a fi decongelate si transferate cu
ocazia unui ciclu spontan (in situatia sindromului de hiperstimulare ovariana) (in acest mod nu s-
a mai ajuns la embriotransfer in urma ciclului inceput).
188
Tabel 2.4.21 - Rezultatele ciclurilor cu antagonisti-GnRH/ 3 ani
Total punctii efectuate
Total cazuri cu fecundare realizata
Total ET efectuate Total cicluri
stimulare Numar Procent Numar Procent Numar Procent
1999 41 40 97,56% 39 95,12% 39 95,12%
2000 37 34 91,89% 32 86,48% 32 86,48%
2001 71 69 97,18% 64 90,14% 62 87,32%
3 ani 149 143 95,97% 135 90,60% 133 89,26%
Comparativ pentru cei 3 ani se remarca o scadere a ratei embriotransferului in anul 2000 fata de
ceilalti ani, in acest an s-a inregistrat si cel mic mare numar de paciente cu antagonisti-GnRH.
Rata punctiilor efectuate in anul 2000 este de asemenea cea mai mica procentual comparativ cu
celilalti doi ani.
Rata sarcinilor/cicluri stimulate: 11,40%
Rata sarcinilor/punctii efectuate: 11,88 %
Rata sarcinilor/embriotransfer: 12,78%
Rata implantarii = numar saci gestationali(ecografic)/nr. ET: 15,03%
Baby take home rate = numar nasteri/cicluri efectuate: 7,38%
(Tabel 2.4.2).
Tabelul 2.4.22 - Rata sarcinilor – protocol antagonisti-GnRH/ 3 ani
1999 2000 2001 TOTAL Rata
sarcini/ciclu 9,75% 8,1% 14,08% 11,40%
Rata sarcini/ punctie
10% 8,82% 14,49% 11,88%
Rata sarcini/ET
10,25% 9,37% 16,12% 12,78%
Rata implantarii
10,25% 15,62% 17,74% 15,03%
Baby take home rate
4,87%
5,4% 9,85%. 7,38%
189
e. Discutii
1. Se observa ca in anii 1999 si 2000 numarul de paciente care au inceput cicluri de
stimulare si au beneficiat de protocoale cu antagonisti-GnRH au fost apropiate (41 si 37),
dar numarul pacientelor a crescut pentru anul 2001 la 71 de cazuri. Explicatia rezida in
faptul ca a crescut complianta pacientelor la un tratament relativ recent introdus, s-au
sedimentat informatiile despre antagonisti. Acelasi lucru este valabil si pentru clinicieni,
care au castigat si ei in experienta si in incredere in aplicarea unui protocol diferit.
2. Tehnicile de reproducere asistata care au fost aplicate in aceasta perioada de 3 ani au fost
comparabile ca incidenta: 47,65% FIV si 48,32% ICSI, dar numarul de sarcini obtinute in
urma FIV este mai mare (70,58%) fata de cele rezultate din ICSI (29,41%).
3. Cu toate ca numarul mediu de ovocite recoltate si media celulelor fecundate este
comparabil cu datele din literatura, totusi rata sarcinilor se situeaza la procente scazute.
190
Capitolul 3 - Discutii
In introducerea partii speciale am expus obiectivele prezentului studiu. Este o analiza
comparativa a doua substante provenite din structura hormonului hipofizar GnRH, si anume
agonistii si antagonistii-GnRH. Odata cu introducerea tehnicilor de reproducere umana asistata s-
au pus la punct si tratamentele de stimulare ovariana. S-a constatat ca pentru evitarea cresterii
premature a LH-ului endogen, care compromite ovocitele prin luteinizare precoce si influenteaza
in sens negativ calitatea acestora si prin aceasta rata fertilitatii, este necesar de introdus un
protocol care sa inhibe secretia hipofizara de gonadotropi. In acest mod s-au dezvoltat
protocoalele cu agonisti-GnRH. Aceste protocoale sunt deja folosite uzual, exista experienta in
aplicarea lor si se obtin rezultate bune cu ele. Evolutia cercetarilor a introdus mai recent
medicatia antagonista, care prin protocoalele sale a adus avantajul reducerii duratei de stimulare,
cu administrarea unei doze mai scazute de gonadotropine comparativ cu protocoalele deja
existente, ce folosesc agonisti. Astfel se obtine si o reducere a costurilor suportate de pacienta. Se
ridica insa intrebarea daca efectul lor asupra ratei sarcinii este similar; de crestere, sau
dimpotriva, de scadere a ratei, fata de protocoalele devenite clasice pana in momentul
introducerii antagonistilor.
Aceasta analiza isi propune o comparare a celor doua medicatii, in final fiind analizata
rata sarcinilor/ ciclu; rata sarcinilor/ punctie, rata sarcinilor/ ET; rata implantarii si take home
baby rate. Am luat in considerare mai multi parametri pentru a gasi impactul si influenta lor in
raspunsul pacientei la terapie. Acesti factori, separat sau asociat, pot juca un rol in raspunsul
ovarian, in numarul de ovocite recoltate si calitatea lor, au efecte asupra procesului fecundarii si
implantarii embrionului.
Studiul se intinde pe durata a 3 ani (1999, 2000 si 2001), este retrospectiv si analizeaza
comparativ loturile de paciente care s-au adresat Departamentului de Reproducere Asistata (din
cadrul Clinicii Universitare de Ginecologie, Heidelberg) si care au intrat in protocoale de
stimulare ovariana pentru FIV sau ICSI. S-au luat in calcul mai multi parametri: varsta, durata
tratamentului, doza de stimulare si medicatia gonadotropinica administrata, tipurile de protocoale
aplicate. Monitorizarea foliculara si cea hormonala (estradiol si LH seric) sunt considerati
markeri ai raspunsului ovarian la stimulare, respectiv LH-ul reda statusul inhibat corect al
191
hipofizei. Rezultatele sunt reprezentate de numarul de ovocite recoltate, numarul de celulele
fecundate si, in special, sarcinile obtinute (cu detaliile specifice). Obtinerea sarcinilor este de
altfel scopul reproducerii umane asistate, iar rata sa constituie obiectivul prezentei analize: si
anume aprecierea influentei celor doua clase de analogi-GnRH asupra fertilitatii.
Datele obtinute au fost prelucrate cu ajutorul regresiei logice.
Modelul pentru aceasta este cel binomial, unde „p” reprezinta probabilitatea succesului.
p/(1-p) descrie relatia probabilitatilor intre succes si esec. Este redata urmatoarea corelatie
lineara:
xp
p βα +=
−1
log
unde α reprezinta termenul general, iar prima parte a relatiei este logit din “p”.
Evaluarea s-a efectuat cu ajutorul procedeului SAS GENMOD (Generalized Models). Acest
procedeu permite evaluarea datelor prin regresia logica si in acelasi timp se iau in considerare
valorile pentru aceeasi pacienta care sunt interdependente.
Pacientele care s-au adresat in vederea reproducerii asistate si au urmat tratament ce a
inclus protocoalele cu agonisti-GnRH sunt in numar de 832, de aproximativ 6 ori mai
numeroase, comparativ cu cele ce au inclus protocoale cu antagonisti-GnRH - in numar de 149.
Aceasta diferenta se explica si prin increderea castigata in timp de agonsiti fata de antagonisti,
prin experienta acumulata cu terapia cu agonisti si poate existenta unei rezerve fata de
antagonisti, introdusi mai recent in practica clinica, si implicit o experienta de utilizare mai mica.
Un prim factor care este luat in discutie se refera la varsta pacientelor. Este deja obisnuit
pentru centrele de reproducere asistata ca pacientele incluse in terapie sa se situeze in jurul
varstei de 35 de ani sau chiar peste aceasta varsta. Se motiveaza aceasta incidenta crescuta a
varstei ≥ 35 de ani, prin faptul ca in perioada contemporana femeia moderna este angrenata mai
mult in viata sociala/profesionala, interesul reproductiv (implinirea familiala) trecand pe loc
secund. Astfel ca momentul conceptiei este de multe ori amanat, dupa implinirea carierei.
Factorul varsta este important, deoarece este implicat in raspunsul ovarian: femeile cu varsta >
35 de ani pot prezenta o frecventa mai crescuta a abandonarii ciclului de stimulare.
192
Se remarca din tabelul 3.1 ca varsta medie si mediana sunt ceva mai crescute in cazul
protocoalelor cu antagonisti, de asemenea procentul pacientelor cu varsta cuprinsa intre 35-39 de
ani il depaseste pe cel din protocoalele cu agonisti. Este posibil ca aceasta crestere sa fie
explicata si prin faptul ca o serie de paciente ce au apelat in trecut la protocoalele cu agonisti sa
incerce o noua stimulare cu medicatia mai recenta, in speranta obtinerii sarcinii cu un tratament
mai modern. Extremele varstelor sunt comparabile (21 versus 24 de ani respectiv 46 versus 43 de
ani).
Tabel 3.1 - Comparatie a parametrului varsta pentru protocoalele cu agonisti/antagonisti
Varsta medie (ani) Mediana (ani) Procent cazuri cu
varsta 35-39 ani
Agonisti-GnRH 34,49 35 35,81%
Antagonisti-GnRH 36,21 37 41,61%
Standard Wald 95% Chi-
Parameter DF Estimate Error Confidence Limits Square Pr > ChiSq
Varsta 1 -0.0780 0.0201 -0.1173 -0.0387 15.10 0.0001
Standard 95% Confidence Parameter Estimate Error Limits Z Pr > |Z|
Varsta -0.0780 0.0184 -0.1141 -0.0419 -4.24 <.0001
Distributia pacientelor in functie de varsta in cele doua loturi analizate este
comparabila, conform analizei statistice.
Referitor la stimularea gonadotropinica, sunt de departe preferate preparatele sintetizate
genetic, si anume rFSH. Acest fapt este constata in studiul actual pentru amandoua protocoalele -
agonist/antagonist, dar este valabil si pentru celelalte centre mondiale unde se practica
reproducerea umana asistata. FSH recombinat are prioritate fata de celelalte preparate deoarece
are activitate pur FSH, evita reactiile alergice; are insa dezavantajul unui cost mai ridicat. A doua
optiune in stimularea ovariana ramane HMG (Tabel 3.2). Din punctul de vedere al stimularii
193
ovariene, amandoua substantele – agonist si antagonist - au utilizat acelasi tip de gonadotropine,
cu influente pozitive asupra numarului si calitatii ovocitelor, asa cum dovedesc datele din
literatura.
Tabel 3.2 - Comparatie a tipurilor de gonadotropina din stimulare - protocoale cu
agonisti/antagonisti
rFSH HMG
Agonisti-GnRH 79,32% 11,69%
Antagonisti-GnRH 86,57% 8,05%
Parameter DF Estimate Error Confidence Limits Square Pr >ChiSq
recFSH 1 -0.7336 0.4270 -1.5706 0.1034 2.95 0.0858
HMG 1 -1.2141 0.4620 -2.1197 -0.3085 6.90 0.0086
FSH-HP 1 0.0159 0.7380 -1.4305 1.4624 0.00 0.9828
Standard 95% Confidence Parameter Estimate Error Limits Z Pr > |Z|
recFSH -0.7337 0.4385 -1.5931 0.1258 -1.67 0.0943 HMG -1.2140 0.4190 -2.0352 -0.3927 -2.90 0.0038 FSH-HP 0.0156 0.6810 -1.3192 1.3503 0.02 0.9818
In urma analizei statistice, protocoalele cu analogi-GnRH au folosit pentru stimularea
ovariana aceleasi gonadotropine cu diferente nesemnificative statistic (rFSH, HMG), cu
exceptia FSH-HP.
Durata medie a stimularii ovariene a fost pentru pacientele cu protocoale cu agonisti mai
lunga fata de cazurile cu antagonisti, acelasi lucru este valabil si pentru mediana (Tabel 3.3).
Valorile extreme ale perioadei de stimulare sunt comparabile (minim 6 zile si maxim 29 zile
agonist versus 21 zile antagonist).
Pacientele utilizand protocoale cu agonisti au prezentat un procent de 38,94% pentru
durata ≤ 10 zile si 56,37% pentru o perioada intre 11-15 zile. Antagonistii-GnRH au avut un
procent de 69,79% din paciente cu durata a stimularii ≤ 10 zile si 26,84% din cazuri cu stimulare
intre 11-15 zile.
194
Din studiu reiese ca durata stimularii este mai scurta in cazurile cu antagonisti comparativ
cu agonisti, ceea ce este consemnat si in datele din literatura. Procentele pacientelor care au
necesitat o perioada de stimulare prelungita (> 15 zile, fiind inclusa aici si perioada > 20 de zile)
sunt comparabile: agonisti 4,68% iar anatagonisti 3,35%.
Tabel 3.3 – Comparatie a duratei stimularii ovariane – protocoale agonisti/antagonisti
Durata medie a
stimularii (zile)
Mediana (zile)
Agonisti-GnRH 11,36 11
Antagonisti-GnRH 9,95 9
Doza medie a gonadotropinei utilizata in stimulare este alt factor luat in discutie. Este
cunoscut faptul ca in cadrul protocolului cu antagonisti este o durata mai redusa de stimulare
care poate atrage dupa sine si un necesar mai scazut al unitatilor de FSH. Din cadrul
protocoalelor cu agonisti, cel lung are de obicei necesarul cel mai crescut de unitati de FSH.
In analiza actuala se observa o diferenta de 600 UI intre valorile medii ale dozelor de
FSH din cadrul stimularii ovariene. Se observa in tabelul 3.4 ca in cazul protocoalelor cu agonisti
este necesara o doza medie de gonadotropi mai crescuta. De altfel si valorile extreme ale dozelor,
in speta cele maxime atinse in stimulare, sunt mult mai mari pentru agonisti (14.700 UI) fata de
antagonisti (7425 UI).
Tabel 3.4 – Comparatie a dozei medii de unitati FSH – protocoale agonisti/antagonisti
Doza medie (UI) Mediana (UI)
Agonisti-GnRH 2635,19 2250
Antagonisti-GnRH 2021,77 1800
Chiar daca au existat diferente intre durata totala a stimularii si cantitatea totala de
gonadotropina administrata, acesti parametri nu au influentat semnificativ statistic succesul
protocoalelor (nasterea).
195
Tipurile de protocoale din cadrul fiecarei medicatii supresive hipofizare au si ele
importanta lor, demonstrata in practica de-a lungul anilor prin rezultatele obtinute. Avantajele
pentru fiecare tip de protocol le-am expus in partea generala.
Agonistii au utilizat cel mai frecvent protocolul lung (91,46%) si in cazul antagonistilor
s-a folosit protocolul Lübeck (cu doze multiple) in 93,95% din cazuri.
In anul 2001(ultimul an studiat) protocolul Lübeck s-a administrat in exclusivitate. In cercetarea
actuala protocolul francez nu a produs o inhibitie corespunzatoare a hipofizei, astfel incat din 9
cicluri cu protocol francez, in 2 cazuri s-a inregistrat cresterea prematura a LH-ului (22,22%). La
140 de cazuri cu protocol Lübeck s-au remarcat tot 2 situatii de crestere prematura a LH-ului
(1,42%). Este evidenta diferenta intre cele doua procente ale protocoalelor cu antagonisti si
dovedeste, cel putin pentru analiza actuala, faptul ca supresia hipofizara („down-
regulation) a fost inadecvata in cazul administrarii unice a antagonistului (protocol
francez) si in aceste situatii s-a intrerupt ciclul de stimulare.
Raspunsul ovarian la stimulare este in mod fidel caracterizat de corelarea a doi parametri,
si anume dezvoltarea folicolilor ovarieni si secretia de estradiol a acestora, cuantificate prin
numarul si dimensiunea ecografica a folicolilor si ,respectiv, concentratia estradiolului seric.
Acesta este motivul pentru care am inclus in analiza comparativa acesti factori si valorile lor sunt
redate astfel: pentru dezvoltarea folicolilor - numarul/dimensiunea lor in ziua in care se
stabileste momentul administrarii HCG (ocazie cu care se si opreste stimularea); iar pentru
estradiol concentratia serica a acestuia in ziua administrarii HCG.
Pacientele care au fost incluse in protocoalele cu agonisti au inregistrat o valoare medie a
E2 seric in ziua inducerii ovulatiei cu aproximativ 500 pg/ml mai mult decat valoarea aceluiasi
hormon la pacientele ce au folosit antagonisti (Tabel 3.5). Valorile maxime ale E2 seric la care s-
a ajuns au fost de 27.669 pg/ml pentru o pacienta din lotul cu agonisti fata de 8704 pg/ml –
valoarea maxima atinsa la o pacienta cu antagonisti-GnRH.
Valorile mai crescute ale E2 seric in cazul agonistilor sunt in corelatie si cu durata mai
prelungita a stimularii ovariene si cu doza medie mai crescuta de administrare a
gonadotropinelor.
196
Tabel 3.5 – Valoarea medie a E2 seric comparativ pentru agonisti/antagonisti
Valoare medie
(pg/ml)
Mediana (pg/ml)
Agonisti-GnRH 1926,21 1602,5
Antagonisti-GnRH 1495,34 1529
Din datele publicate in literatura actuala se considera ca nu exista o corelatie
semnificativa intre valoarea E2 seric si rata obtineri sarcinilor in cadrul FIV la protocoalele unde
inhibitia hipofizara este realizata cu agonisti-GnRH. Sunt studii retrospective care sugereaza
acest fapt. Totusi, pentru practica clinica, sunt utile studii prospective care sa aduca noi
informatii, atat in cadrul protocoalelor cu agonisti, cat si pentru antagonisti [187].
Incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana in cadrul lotului cu agonisti a fost de
3,48% iar pentru pacientele cu antagonisti - 3,35% . Valorile mai crescute ale E2 seric din grupul
agonistilor nu se coreleaza intotdeauna cu incidenta aparitiei sindromului de hiperstimulare. Este
si concluzia care se desprinde din analiza pacientelor cu sindrom de hiperstimulare, detaliata in
cadrul fiecarui an si tip de protocol. Acestea sunt probate si de statisticile din literatura, care nu
au gasit o corelatie clara intre concentratia E2 seric si aparitia hiperstimularii, cu toate ca in
majoritatea cazurilor acest sindrom se insoteste de valori crescute ale hormonului amintit [189].
Exista insa un consens asupra faptului ca E2 seric crescut poate reprezenta un marker important
in depistarea multor paciente cu risc de hiperstimulare ovariana.
Dozarile hormonale cuprind pe langa E2 seric si determinarea concentratiei LH seric. Este
deosebit de utila aceasta masuratoare a hormonului endogen, tocmai in eventualitatea
surprinderii unei cresteri premature a acestuia. Aceasta crestere precoce reprezina un criteriu de
abandonare a ciclului si semnifica un esec al stimularii ovariene.
Pacientele cu protocoale cu agonisti au prezentat 4 situatii (0,48%) ale valorii LH > 10
UI/l, dintre care 3 cazuri au avut asociere de rFSH si protocol lung; respectiv 1 caz de asociere
rFSH+HMG si protocol scurt.
Pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH s-au inregistrat tot 4 cazuri de crestere prematura a
LH-ului (2,68%). Cele 2 paciente cu asociere rFSH si protocol francez au intrerupt stimularea, pe
197
cand la celelalte 2 cazuri de rFSH si protocol Lübeck s-a efectuat punctia foliculara, dar fara
obtinerea unei sarcini.
Se considera in cazul protocoalelor cu antagonisti ca realizarea unei supresii hipofizare marcate
in ziua a 8-a de stimulare se insoteste de o rata mai mare a obtinerii sarcinii si de evolutivitate a
acesteia. La pacientele cu LH< 0,5 UI/l in ziua a 8-a de stimulare a fost inregistrata cea mai mare
rata de implantare si apoi de sarcina in evolutie [188].
In analiza prezenta valoarea medie a LH-ului pentru agonisti a fost de 2,45 UI/l si
mediana 2 UI/l, iar pentru antagonisti – de 2,18 UI/l, mediana: 2,2 UI/l.
Foliculometria seriata a fost permanent corelata cu dozarea E2 seric. Amandoua protocoalele
dovedesc prin valorile medii ale folicolilor, exemplificate pe paliere de dimensiuni, o
predominanta a folicolilor > 18 mm, ceea ce reprezinta si scopul stimularii ovariene controlate –
de-a obtine folicoli dominanti si nu folicoli multi si de dimensiuni reduse (Tabel 3.6).
Tabel 3.6 – Numarul folicolilor comparativ agonisti/antagonisti
Agonisti-GnRH Antagonisti-GnRH Dimensiune
folicoli (mm) Numar mediu Mediana Numar mediu Mediana
13-15 2,79 2 2,81 2
16-18 3,09 3 2,52 2
> 18 3,80 4 3,93 3
Rata sarcinilor este influentata si de tehnica reproducerii asistate, in sensul ca pentru
fiecare metoda exista indicatii clare de aplicare, respectiv fiecare tehnica are o rata specifica de
succes.
Numarul pacientelor cu cicluri cu antagonisti a crescut din anul 2000 la anul 2001, la fel
si procentul celor la care s-a efectuat ICSI.
Se remarca din tabelul 3.7 ca numarul ciclurilor intrerupte, care nu s-au soldat cu punctie
foliculara, este usor mai crescut in cazul ciclurilor cu antagonisti. Se poate corela aceasta
informatie si cu faptul ca tot in cazurile antagonstilor procentul cresterii premature a LH-ului este
mai ridicat fata de agonisti. Comparativ insa cu numarul de punctii efectuate in cadrul fiecarui tip
de protocol, cazurile care au ramas nepunctionate sunt in procent foarte reduse.
198
Tabel 3.7 - Frecventa tehnicilor de reproducere umana asistata – comparativ agonisti/antagonisti
FIV ICSI Fara punctie
Agonisti-GnRH 525 (63,10%) 290 (34,85%) 17 (2,04%)
Antagonisti-GnRH 71 (47,65%) 72 (48,32%) 6(4,02%)
Se observa ca frecventa ICSI in protocoalele cu agonist fata de antagonist se situeaza la
valorile 34,85% versus 48,32%. Diferenta rezida si din indicatiile pentru care s-a efectuat ICSI :
severitatea cazului, tipul sterilitatii, rezultatele de la punctii anterioare (daca s-au efectuat).
Prin diferenta restul cazurilor au beneficiat de FIV, in cazul agonistilor in proportie de 63,10%
fata de antagonisti – 47,65%.
Punctiile s-au insotit de o valoare medie a ovocitelor comparabila intre cele doua tipuri de
protocoale, respectiv asemanatoare cu datele din literatura (Tabel 3.8).
O concluzie foarte importanta care se desprinde din aceste date este ca protocolul cu
antagonisti nu influenteaza in sens negativ numarul si calitatea ovocitelor obtinute per
punctie foliculara.
Tabel 3.8 – Comparatie intre numarul ovocitelor recoltate / punctie foliculara –
agonisti/antagonisti
Numar mediu al
ovocitelor recoltate
Mediana ovocitelor
recoltate
Agonisti-GnRH 8,43 8
Antagonisti-GnRH 8,42 7
Fecundarea, apreciata prin prezenta celulelor cu 2PN, arata aceleasi rezultate comparativ
pentru pacietele care au urmat protocoale cu agonisti-antagonisti, ca si in cazul ovocitelor.
Tabel 3.9 - Comparatie intre numarul celulelor fecundate / punctie – agonisti/antagonisti
Numar mediu al
celulelor cu 2PN
Mediana celulelor cu
2PN
Agonisti-GnRH 3,71 3
Antagonisti-GnRH 4,10 3
199
Diferenta, de altfel minora, intre aceste valori medii poate fi explicata prin faptul ca in
cazul antagonistilor s-a utilizat in procent mai crescut procedeul ICSI (48,32%) fata de
protocoalele cu agonisti (34,85%) iar in cazul ICSI se scurtcircuiteaza toate barierele intre
spermatozoid si mediul intern al ovocitului.
Rezultatele expuse demonstreaza ca substantele antagoniste nu au efect negativ asupra
fecundarii, in sensul in care acesta depinde in mare masura, pe langa alti factori, si de
calitatea ovocitelor.
Deci agonistii si antagonistii-GnRH au rezultate similare in ceea ce priveste numarul
si calitatea ovocitelor si numarul celulelor fecundate.
Am considerat sa compar si valorile medii ale embrionilor transferati, pentru ca se poate
deduce de aici calitatea embrionilor (daca s-a produs clivajul la prezigoti si daca acestia si-au
continuat evolutia pana la stadiul de embrion). Intotdeauna s-au transferat intre 1 si 3 embrioni.
Tabel 3.10 - Comparatie intre numarul embrionilor transferati – agonisti/antagonisti
Numar mediu al
embrionilor
transferati
Mediana
embrionilor
transferati
Cazuri fara
embriotransfer
Agonisti-GnRH 1,76 2 135
16,23%
Antagonisti-GnRH 1,89 2 16
10,73%
Standard Wald 95% Chi- Parameter DF Estimate Error Confidence Limits Square Pr > ChiSq
ET 1 0.7522 0.1276 0.5020 1.0023 34.74 <.0001
Standard 95% Confidence Parameter Estimate Error Limits Z Pr > |Z| ET 0.7517 0.1052 0.5455 0.9578 7.15 <.0001
200
Sarcinile care s-au inregistrat la cele 832 de paciente care au efectuat cicluri de stimulare si
au utilizat protocoale cu agonisti-GnRH pentru supresia hipofizara sunt in numar de 179
(21,51%) (Fig. 3.1). De remarcat ca 91(50,83%) din totalul acestor sarcini au fost nasteri
monofetale.
Pacientele care au urmat protocoale cu antagonisti-GnRH au fost in numar de 149 si din
acestea 17 au obtinut sarcina (11,40%). Majoritatea acestor sarcini (un numar de 8, respectiv
47,05%) s-au terminat cu nastere monofetala.
0100200300400500600700800900
Cicluriagonisti
Cicluriantagonisti
Numar sarcini
Total cicluri
Fig. 3.1 – Numarul total de sarcini si numarul total de cicluri initiale pentru protocoalele cu
agonisti/ antagonisti-GnRH
Tipurile de gonadotropine care s-au administrat la aceste paciente care au obtinut sarcina au
fost:
• rFSH in 153 de cazuri (85,47%);
• HMG in 15 cazuri (8,37%);
• rFSH+HMG in 7 cazuri (3,91%);
832
179
149
17
201
• FSH-HP in 4 cazuri (2,23%).
Gonadotropinele care s-au utilizat in stimularea ovariana controlata pentru aceste 17 paciente
care au obtinut sarcina au fost:
• rFSH: 16 cazuri (94,11%);
• HMG: 1 caz (5,88%) (Fig. 3.2).
020406080
100120140160
Protocoale cu agonisti Protocoale cu antagonisti
rFSH
HMG
rFSH+HMG
FSH-HP
Fig. 3.2 – Tipurile de gonadotropine la pacientele cu sarcini din cadrul protocoalelor cu agonisti/
antagonisti-GnRH
Tipurile de protocoalele care s-au aplicat pentru fiecare medicatie cu analog-GnRH in parte
la pacientele cu sarcina au fost urmatoarele:
• Agonisti-GnRH:
Protocol lung: 170 cazuri (94,97%);
Protocol scurt: 3 cazuri (1,67%);
Protocol ultralung: 6 cazuri (3,35%).
202
• Antagonisti-GnRH:
Protocol Lübeck: 17 cazuri (100%);
Protocol francez: 0 cazuri.
Se remarca ca protocolul lung in cadrul agonistilor-GnRH a fost cel mai frecvent aplicat;
este de altfel si tipul de protocol cu care se lucreaza cel mai des in practica clinica. Iar pentru
categoria sarcinilor din protocoalele cu antagonisti-GnRH, protocolul Lübeck a fost aplicat in
exclusivitate.
Ca si tehnici ale reproducerii asistate in cazul sarcinilor provenite din stimulare ovariana
si protocol agonist-GnRH s-au practicat FIV/ET in 118 cazuri (65,92%) si ICSI in 61 de situatii
(34,07%), dintre care 5 sarcini cu spermii provenite din crioTESE. Sarcinile pacientelor
provenite din lotul cu antagonisti-GnRH au fost obtinute in urma punctiei foliculare in cadrul
FIV/ET in 12 cazuri (70,58%) si ICSI in 5 cazuri (29,41%) (Fig. 3.3).
01020304050607080
FIV/ ET ICSIAgonisti
Antagonisti
Agonisti Antagonisti
Fig. 3.3 – Raportul procentual al tehnicilor de reproducere asistata la pacientele care au obtinut
sarcina in cadrul protocoalelor cu agonisti/antagonisti
65,92%
70,58%
34,07%
29,41%
203
Se remarca din acest grafic ca tehnicile de reproducere asistata au avut aproximativ
aceeasi distributie procentuala pentru succesul ciclurilor de stimulare (obtinerea sarcinilor),
indiferent de analogul-GnRH folosit in cadrul protocolului.
Evolutia sarcinilor in cadrul celor 2 protocoale este redata cantitativ si procentual in
urmatorul tabel (Tabel 3.11):
Tabel 3.11 – Evolutia sarcinilor la cele 2 tipuri de protocoale
Evolutia
sarcinilor
Sarcina
biochimica
Avort Sarcina
ectopica
Nastere
monofetala
Nastere
gemelara
Nastere
tripla
Agonisti-
GnRH
27
15,08%
29
16,20%
9
5,02%
91
50,83%
24
13,40%
0
0%
Antagonisti-
GnRH
2
11,76%
4
23,52%
0
0%
8
47,05%
2
11,76%
1
5,88%
Exista o neconcordanta intre totalul de 179 de sarcini pentru pacientele cu agonisti-GnRH
si insumarea in tabel a sarcinilor (180) pentru acelasi lot de paciente, explicata prin faptul ca la o
pacienta s-a diagnosticat ecografic sarcina intrauterina concomitent cu sarcina extrauterina si
care s-a terminat prin avort si salpingectomie totala.
De mentionat ca sarcinile ectopice, rata avorturilor si incidenta sarcinilor multiple pentru
cele 2 categorii de analogi-GnRH nu au depasit procentual statisticile generale. Scopul final al
reproducerii asistate este obtinerea sarcinilor monofetale, deoarece sunt cunoscute riscurile
materno-fetale ale sarcinilor multiple.
Succesul tehnicilor reproducerii umane asistate este considerat a fi nasterea unui copil
sanatos [191]. O statistica efectuata pentru anul 2001 la Centrul de Fertilizare in Vitro Monash
(Australia) a analizat nasterile cu fat viu, unic, la termen si care au provenit dintr-o sarcina
FIV/ET. La acest centru, se considera ca un cuplu care urmeaza un tratament in cadrul
protocoalelor pentru FIV are o sansa de 11,1% de-a naste un fat viu, unic, la termen/ ciclu de
stimulare. Astfel ca standardul pentru succesul in cadrul programelor FIV este considerata
nasterea la termen a unui singur copil viu si sanatos/ ciclu FIV initiat (BESST: Birth
Emphasizing a Successful Singleton at Term).
204
Conform criteriilor stabilite de standardul BESST, la lotul studiat pe cei trei ani se obtin
urmatoarele valori :
• in urma aplicarii protocolului cu agonist-GnRH s-au inregistrat un total de 91 de nasteri
monofetale la 832 cicluri de stimulare (10,94%) ;
• in cazul protocolului cu antagonisti-GnRH numarul de nasteri monofetale a fost de 8 din
totalul de149 de cicluri initiale, adica 5,37%.
Ca si o observatie se constata ca in cadrul protocolului cu agonist-GnRH valoarea
obtinuta pentru criteriile BESST se apropie de datele din literatura.
Incidenta malformatiilor intalnite in sarcinile din studiul actual pentru cele doua clase de
medicatie supresiva a hipofizei a fost in numar de 6 sarcini (3,35%) din totalul de sarcini
obtinute cu agonisti-GnRH si 1 sarcina (5,88%) in cazul aplicarii antagonistilor-GnRH.
Sarcini cu malformatii/ lotul cu agonisti-GnRH:
1 trisomie 21 la o pacienta de 41de ani (ICSI);
1 fat cu keilognatopalatoskizis(FIV/ET);
2 nasteri gemelare cu malformatii (neprecizate) (1 FIV/ET si 1 crioTESE);
1 trisomie 18 la o pacienta de 40 de ani (FIV/ET);
1 aneuploidie (neprecizata) prin biopsie vilozitati coriale la o pacienta de 38 de ani
(FIV/ET).
Aceste malformatii au fost intalnite la 4 cazuri cu sarcini provenite din FIV/ET si 2 sarcini - in
urma efectuarii ICSI (dintre care la 1 crioTESE). Este destul de dificil de apreciat daca procedeul
ICSI, respectiv crioTESE, prezenta sarcinii multiple sau varsta unora dintre paciente au jucat un
rol in incidenta malformatiilor din aceasta categorie de paciente.
Sarcini cu malformatii/ lotul cu antagonisti-GnRH:
1 caz la o sarcina tripla (cu malformatie intestinala la toti fetii), provenita din FIV/ET.
Nici in grupul pacientelor incluse in terapia cu antagonist-GnRH nu se pot stabili concluzii
pertinente pentru cauza malformatiilor.
205
Din tabelul 3.12, unde sunt sumarizate ratele sarcinilor calculate pentru cele doua tipuri
de protocoale cu agonisti-, respectiv antagonisti-GnRH, se observa detasat o diferenta neta intre
procentele obtinute pentru agonisti, care se incadreaza in statistica generala si ratele stabilite in
cazul antagonistilor, care sunt evident mai mici.
Tabel 3.12 – Rata sarcinilor comparativ intre protocoalele cu agonisti/ antagonisti
Agonisti-GnRH Antagonisti-GnRH
Rata sarcinilor/cicluri
stimulare
21,51% 11,40%
Rata sarcinilor/punctii 21,96 % 11,88 %
Rata sarcinilor/ET 25,68% 12,78%
Rata implantarii 27,29% 15,03%
Baby take home rate 13,82%. 7,38%
Din analiza statistica reies urmatoarele :
• Pentru parametrul varsta - fiecare an in plus scade probabilitatea obtinerii unei sarcini
ce se finalizeaza cu nastere si care este semnificativ statistic;
• Pentru parametrul embriotransfer creste semnificativ probabilitatea obtinerii unei
sarcini cu fiecare embrion in plus transferat, dar acest lucru este valabil pana la
numarul de 3 embrioni;
• Alegerea protocolului cu antagonist-GnRH se repercuta negativ asupra succesului,
fiind pe analiza actuala considerat semnificativ statistic, cu valoarea lui ˝ p ˝ situata
putin peste limita de 0,05;
• Tehnica ICSI din cadrul reproducerii asistate are un succes scazut, dar nesemnificativ
statistic pe analiza luata in discutie;
• Unele paciente din loturile studiate au parcurs mai multe cicluri de stimulare. Cu toate
ca nu exista un model unitar pentru analiza diferentelor intre acestea, se poate
remarca ca sansa de succes este mai mica pentru a doua incercare si creste usor pentru
a treia incercare, aceasta corelatie nefiind insa semnificativ statistic
206
Capitolul 4 – Statistica pe primii 5 ani a Centrului de Laparoscopie, Chirurgie
Laparoscopica, Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul Clincii
Universitare de Obstetrica-Ginecologie „Bega”, Timisoara
Rezultatele pe o perioada de 5 ani de la infiintarea primului centru de reproducere umana
asistata din Romania, si anume Centrul de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica, Fertilizare in
Vitro si Embriotransfer din cadrul Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie „Bega”,
Timisoara, au fost publicate in Revista Obstetrica si Ginecologia, vol. XLVIII, Nr 1 [95].
Pe perioada 20.05.1995-31.12.1999 s-au efectuat 433 fertilizari in vitro, din care au
rezultat 88 de sarcini (rata de sarcini: 20,32%).
Din acestea:
63 (71,59%) au fost sarcini unice;
8 (9,09%) – sarcini gemelare;
4 (4,54%) sarcini triple;
1 (1,13%) sarcina cvadrupla.
S-au inregistrat 12 avorturi (13,63%).
Take home baby rate: 17,55% (la momentul respectiv 76 sarcini erau in evolutie).
Rata implantarii: 21,24%.
Numarul de copii: 92
S-au grupat pacientele in functie de tipul sterilitatii: primara si secundara, respectiv
sterilitate de cauza masculina. Cauzele sterilitatii la pacientele care s-au adresat in cadrul acestui
centru sunt sumarizate in tabelul 4.1. Sterilitatea secundara tubara este in procent majoritar
(65,58% din cazuri), asa cum era si de asteptat, iar cea prin factor masculin se afla la un procent
< 10%. De asemenea este specificat in tabel si procentul pacientelor la care s-a inregistrat
sarcina.
207
Tabel 4.1 - Statistica pe afectiuni
Patologie Paciente Gravide
Sterilitate primara tubara 69 (15,93%) 14 (15,90%)
Sterilitate secundara
tubara
284 (65,58%) 56 (63,63%)
Sterilitate primara
idiopatica
22 (5,08%) 6 (6,81%)
Sterilitate cu
endometrioza
15 (3,46%) 3 (3,40%)
Sterilitate secundara
andrologica
17 (3,92%) 2 (2,27%)
Sterilitate primara
andrologica
16 (3,69%) 5 (5,68%)
Sterilitate primara
hiperandrogenemica
10 (2,30%) 2 (2,27%)
Cele mai multe paciente care au intrat in protocoale terapeutice in vederea efectuarii
fertilizarii in vitro au fost cu varsta cuprinsa intre 36 si 40 de ani (32,56), conform tabelului 4.2.
Tabel 4.2 - Statistica pe grupe de varsta
Varsta < 30 ani 31-35 ani 36-40 ani 41-42 ani > 42 ani
Paciente 95 (22,40%) 127
(29,33%)
141
(32,56%)
47 (10,85%) 23 (5,31%)
Activitatea primilor 5 ani (1995-1999) a cuprins numai protocoale cu agonisti-GnRH. In
cadrul schemelor de stimularea ovariana s-a practicat long protocol sau short protocol (Tabel
4.3). Sunt amintite si preparatele cu care s-a realizat inhibitia hipofizei.
Cel mai des uzitat a fost long protocol. Dupa supresia hipofizara se incepe stimularea
ovariana cu gonadotropina, initial 3 fiole/zi – 3 zile, apoi 2 fiole/zi si ulterior se ajusteaza doza
functie de ecografie si profilul hormonal.
208
In short protocol se incepe agonistul-GnRH in ziua a 2-a de ciclu menstrual si se continua
pana in ziua declansarii ovulatiei, gonadotropina se introduce in ziua a 4-a.
Gonadotropinele utilizate in cadrul acestor protocoale au fost: HMG, FSH-HPsi rFSH
(preparate comerciale: Pergonal, Humegon: 75 UI FSH + 75 UI LH; Metrodin: 75 UI FSH;
Puregon: 50, 100, 150, UI rFSH).
Tabel 4.3 Tipuri de stimulare folosite in Centrul de Fertilizare in Vitro de la Clinica Universitara
de Obstetrica-Ginecologie “Bega”
Mod de stimulare Paciente Gravide
Short protocol Agonist-GnRH (Uno
Enantone) + HMG
48 (11,08%) 7 (14,58%)
Short protocol Agonist-GnRH (Uno
Enantone) + FSH
28 (6,46%) 9 (32,14%)
Short protocol Agonist-GnRH doza zilnica
(Decapeptyl 0,1) + HMG
30 (6,92%) 10 (33,33%)
Short protocol Agonist-GnRH doza zilnica
(Decapeptyl 0,1) + FSH
104 (24,01%) 21 (20,19%)
Short protocol Agonist-GnRH doza zilnica
(Decapeptyl 0,1) + recFSH
22 (5,08%) 6 (27,27%)
209
Long protocol Agonist-GnRH retard
(Zoladex)+ HMG
11(2,54%) 2 (18,18%)
Long protocol Agonist-GnRH retard
(Zoladex)+ FSH
56 (12,93%) 9 (16,07%)
Long protocol Agonist-GnRH retard
(Decapeptyl 3,75)+ HMG
25(5,77%) 6 (24%)
Long protocol Agonist-GnRH retard
(Decapeptyl 3,75)+ FSH
97 (22,40%) 14 (14,43%)
Long protocol Agonist-GnRH retard
(Decapeptyl 3,75)+ recFSH
12 (2,77%) 4 (33,33%)
In urma punctiei foliculare s-au recoltat la majoritatea pacientelor (48,26%) un numar de
ovocite cuprins intre 5-10, conform tabelului 4.4. La aceste pacientele au si survenit cele mai
multe sarcini.
Tabel 4.4 Numar de ovocite recoltate
Numar
ovocite
1-4 5-10 11-15 16-20 >20
Paciente 110
(25,40%)
209
(48,26%)
75 (17,32%) 30 (6,92%) 9 (2,07%)
Gravide 10 (9,09%) 42 (20,09%) 15 (20%) 17 (56,66%) 4 (44,44%)
Intreruperea ciclurilor de stimulare initiale s-a produs la 54 paciente (14,71%), datorita
urmatoarelor motive:
13 paciente au prezentat chiste ovariene
5 cazuri - datorita sindromului de hiperstimulare ovariana
41 de paciente nu au raspuns corespunzator la tratamentul aplicat.
210
Sindromul de hiperstimulare ovariana s-a intalnit in statistica Centrului de Fertilizare in Vitro
si Embriotransfer al Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie “Bega”, Timisoara doar in
30 cazuri (pe perioada 1995-1999), acestea fiind forme usoare si medii. Nu s-au inregistrat forme
severe. La 1 caz cu torsiune de ovar chistic la 12 saptamani de gestatie s-a intervenit chirurgical
si s-a rezolvat pe cale laparoscopica. Sarcina a evoluat ulterior normal, pana la termen.
Aspecte de embriologie De la cele 433 de cazuri punctionate s-au recoltat 3070 ovocite. Luand in considerare
numarul de ovocite recoltate/caz, distributia este urmatoarea (Tabel 4.5):
Tabel 4.5 – Numar ovocite recoltate/caz
Nr.
ovocite/caz
1-3 4-7 8-11 12-15 16-20 >20
Nr. cazuri 65 169 88 72 30 9
Procent 15% 39% 20% 17% 7% 2%
Prelucrarea spermei a inclus metoda swim-up in caz de normospermie si metoda Percoll
in caz de oligospermie severa. Inseminarea ovocitelor s-a efectuat cu 100.000 spermii bine
mobile/godeu daca s-a folosit mediu Ham’s F10 si 60.000-80.000/godeu daca s-a folosit mediul
FIV Medicult, intr-un godeu existand 1-4 ovocite. Daca s-a folosit ca si mediu de cultura al
ovocitelor si embrionilor mediul FIV Medicult si inseminarea a fost cu 100.000 spermii/godeu s-
a sesizat aparitia unui procent maai ridicat de prezigoti cu 3 PN.
Referitor la calitatea spermei la cele 433 cazuri cu FIV, situatia a fost urmatoarea:
398 (92%) cazuri cu normospermie
35 (8%) cu oligoastenozoospermie.
Din punct de vedere statistic distributia pe numar de pacienti a acestui parametru se prezinta
astfel (Tabel 4.6):
211
Tabel 4.6 - Distributia numarului de spermatozoizi din prelucrarea spermei / cazuri
Nr.
spermatozoizi
(milioane/ml)
0-10 11-20 21-40 41-70 71-100 > 100
Nr. cazuri 13 22 69 143 91 95
Procent 3% 5% 16% 33% 21% 22%
La interpretarea acestor date trebuie luat in considerare faptul ca majoritatea cuplurilor la
care s-a practicat FIV au prezentat infertilitate de cauza feminina
Urmatorul tabel 4.7 expune informatii referitor la volumul spermei recoltate. Statistic
situatia se prezinta astfel:
Tabel 4.7 – Volumul spermei recoltate/ cazuri
Volum < 2ml 2,1 - 4 ml 4,1 - 6 ml 6,1 - 8 ml > 8 ml
Nr. cazuri 65 207 130 21 9
Procent 15% 48% 30% 5% 2%
Fecundarea
La cele 433 cupluri s-au recoltat un total de 3070 ovocite. Din acest numar de ovocite
2501 (81,5%) s-au fecundat iar 568 (18,5%) au fost nefecundate. La cele 2501 ovocite
fecundate – 2311 (92,4%) au prezentat 2PN si 190 (7,6%) au prezentat 3PN.
La 5 din cazurile FIV nu s-a obtinut fecundare. 3 din aceste cazuri au fost cu
normospermie si s-au recoltat 4; 6 si respectiv 9 ovocite. In aceste cazuri se poate
suspiciona o cauza (genetica) legata de spermie (lipsa acrozomului?). La 2 din cazuri s-au
recoltat 7 si respective 8 ovocite, dar a existat factorul masculin reprezentat prin
oligoastenozoospermie (Tabel 4.8).
212
Tabel 4.8 – Realizarea fecundarii la cazurile punctionate
Fecundatie
%/caz
0% <50% 51-70% 71-90% 91-100%
Nr.cazuri 5 17 106 149 156
Procent 1,15% 4% 24,5% 34,5% 35,85%
S-au efectuat constatari avand in vedere corelatia dintre ziua recoltarii si procentul de
fecundatie. Ovocitele recoltate in ziua 15 de stimulare s-au fecundat in procent de 95%, cele
recoltate in ziua a 16-a s-au fecundat in 89%, ovocitele recoltate in ziua 14 s-au fecundat in
procent de 82%. Numai 61% din ovocitele recoltate in ziua 12 si 13 au fost fecundate.
Daca au existat mai mult de 3 embrioni si recoltarea ovocitelor a fost in ziua 14 sau 15 de
stimulare, s-au cultivat embrionii pentru 72 ore (ajung in stadiul de 8 celule).
Daca numarul de embrioni a fost intre 1-3 s-au transferat in ziua a 2-a.
In mod obisnuit se transfera un numar ≤ 3 embrioni. La pacientele > 40 ani si daca au fost
disponibili mai multi embrioni s-au transferat si 4 embrioni.
Cu privire la calitatea embrionilor, marea majoritate au avut un ritm de dezvoltare
corespunzator, cu morfologie normala, dar au existat si embrioni cu blastomere inegale sau
fragmentate sau embrioni care au ramas in stadiul de 2 PN sau de zigot nesegmentat (Tabel 4.9).
Tabel 4.9 – Repartitia pe clase a embrionilor din punct de vedere al calitatii lor
Calitate
embrioni
Clasa I Clasa II Clasa III-IV Embrioni
opriti in
dezvoltare
Nr. embrioni 1394 370 246 41
Procent 68% 18% 12% 2%
La un numar mai mic de cazuri s-au cultivat embrionii in mediul FIV Medicult si numarul de
embrioni cu blastomere fragmentate a fost mai mare comparativ cu cei cultivati in mediul Ham’s
F10.
213
Tabel 4.10 – Rezultatele cazurilor punctionate
Total cazuri
punctionate
Nr. cazuri cu fecundare
prezenta
Nr. cazuri cu ET realizat
Numar Procent Numar Procent
433 428 98,84% 428 98,84%
Rezultate In urma celor 428 de embriotransferuri s-au inregistrat 88 de sarcini.
Rata sarcinilor/embriotransfer: 20,32%.
La 34 gravide (38,65%) embriotransferul s-a efectuat a 2-a zi dupa punctie, cu embrioni in
stadiul de 2-4 blastomere.
La celelalte 54 gravide (61,36%) embriotransferul s-a efectuat la 72 ore dupa punctie, embrionii
avand in general 7-8 sau 8-12 blastomere.
Sarcina s-a instalat dupa primul embriotransfer la 61 paciente (69%) si la 15 paciente (17%)
sarcina a survenit dupa al 2-lea embriotransfer. Doar la 12 paciente (14%) sarcina s-a instalat
dupa a 3-a incercare.
Observatii
Daca se ia in considerare varsta pacientei, rezultatele sunt urmatoarele:
• 95 paciente au avut varsta < 30 ani (28%) si la 27 din ele (28 %) s-a instalat sarcina;
• 268 paciente au avut varsta intre 30-40 ani (65%) si din acest grup la 54 s-a instalat
sarcina (20,14%)
• 70 paciente (7%) au avut varsta > 40 ani si doar la 7 din ele (10%) a survenit sarcina.
Sarcina a survenit in procentul cel mai mare la pacientele tinere < 30 de ani.
Concluzii
La inaugurarea primului centru de FIV din Romania s-a inregistrat si primul success (prima
punctie s-a insotit de sarcina, urmata de nastere). Pe perioada celor 5 ani de activitate s-a
inregistrat o rata de graviditate prin FIV de 20,32%, comparabila cu a altor centre. Nu s-au
intalnit malformatii ale fetilor.
214
Discutii
In urma rezultatelor obtinute in cadrul Centrului de Laparoscopie, Chirurgie Laparoscopica,
Fertilizare in Vitro si Embriotransfer din cadrul Clinicii Universitare de Obstetrica-Ginecologie
„Bega” pentru o perioada de 5 ani de activitate se poate afirma ca rata de success este influentata
de mai multi factori:
• varsta pacientei - se considera ca sansele sunt mai mari la o varsta < 30 ani;
• tipul stimularii ovariene;
• numarul de ovocite recoltate, cifra optima fiind de 6-10 ovocite;
• calitatea si tipul mediului de cultura folosit;
• numarul de spermii bine mobile/godeu;
• ziua embriotransferulu; se considera optim embriotransferul la 72 ore.
215
Capitolul 5
Crioconservarea
Capitolul 5.1
Crioconservarea si locul acesteia in cadrul reproducerii umane asistate
Definitia crioconservarii consta in pastrarea celulelor si a organismelor (in cazul
reproducerii asistate - embrioni) la temperaturi mai mici decat temperatura de congelare (de
obicei la –196°C), situatie in care sunt oprite toate procesele metabolice celulare. Initial
crioconservarea s-a aplicat experimental si dupa ce s-au obtinut sarcini la animale, utilizand
celule care au fost congelate/ decongelate, s-a trecut si la om [192].
Din punct de vedere istoric primele sarcini care s-au obtinut utilizand celule
crioconservate (si anume spermatozoizi) au fost in anul 1953. Spermatozoizii au fost pastrati la
gheata, la - 80°C si s-a utilizat glicerolul ca agent crioprotector [193].
Cercetarile experimentale ulterioare s-au extins si prin congelarea/ decongelarea ovarelor de
soareci si sobolani, care au fost transplantate de la un animal la altul, s-a obtinut ovulatie si
gestatie [194], [195].
Tehnicile de crioconservare au parcurs etape de dezvoltare, celulele fiind conservate in
azot lichid (la - 196°C), astfel ca la un deceniu dupa raportarea primelor sarcini obtinute prin
folosirea spermatozoizilor congelati/ decongelati s-au comunicat primele sarcini care au utilizat
spermii crioconservate in azot lichid [196].
Mai mult, in 1984, s-a nascut primul copil obtinut din decongelarea unui embrion in stadiul de 8
celule, care a fost transferat intrauterin (1984 - Queen Victoria Hospital, Melbourne, Australia)
[197].
Desigur ca si aceasta metoda de pastrare a celulelor a starnit multiple controverse, atat
din punct de vedere medical, cat si etic, religios si legal. In functie de legile existente in fiecare
tara se pot crioconserva gametii feminini si masculini, tesut ovarian, tesut testicular, celule in
stadiul de prezigoti (cu 2 pronuclei), embrioni, blastocisti. Se considera ca prin crioconservarea
celulelor in stadiul de 2PN fata de crioconservarea embrionilor se pot evita o serie de aspecte
216
etice, sociale, morale si religioase legate de acest procedeu. Pe de alta parte s-a ajuns la concluzia
ca rata poliploidiilor este crescuta la sarcini ce au fost obtinute din ovocite crioconservate (atat la
animale, cat si la om) [198], [199].
Crioconservarea este aplicata pe scara larga in urma efectuarii tehnicilor de reproducere
umana asistata si se motiveaza necesitatea ei pe baza urmatoarelor aspecte:
• existenta mai multor ovocite sau embrioni /ciclu FIV;
• permite evitarea unei noi stimulari si implicit reduce costul acesteia;
• creste rata sarcinii / pacienta / punctie (sau per ciclu);
• permite evitarea sindromului de hiperstimulare ovariana.
Se ridica uneori si probleme legate de factorul masculin (numarul de spermatozoizi
poate fi variabil de la o recoltare la alta, cu fluctuatii mari) sau partenerul este absent in
ziua inseminarii ovocitelor. In aceste situatii este utila crioconservarea spermiilor din
ejaculat. In cazul unei azoospermii cunoscute se impune recoltarea spermiilor prin biopsie
testiculara si este justificata crioconservarea spermatozoizilor, pentru a evita punctii
testiculare repetate.
Capitolul 5.2
Efecte fizice in cursul congelarii
Congelarea per se consta in formarea cristalelor de gheata in citoplasma. Prin cedarea
energiei termice o celula sufera un proces de racire, temperatura ajunge la punctul de inghet si il
poate depasi, fara a se produce cristalizarea (fenomen denumit in literatura de specialitate
„supercooling”).
Formarea spontana a cristalelor extracelular va determina o crestere usoara a temperaturii
datorita energiei termice ce se elibereaza prin formarea cristalelor. Ulterior, temperatura atinge
din nou temperatura de inghet. Dupa o perioada de echilibru termic (temperatura mediului fiind
mai scazuta, acesta absoarbe energia termica eliberata), va predomina temperatura scazuta, astfel
incat procesul de racire continua.
Declansarea cristalizarii in mediul extracelular se produce la valori termice de -3°C
-5°C si in mediul intracelular are loc la -10°C.
217
Datorita discrepantei intre punctele de inghet ale mediilor intra- si extracelulare, apa
intracelulara va fi cedata mediului extracelular printr-un gradient osmotic. Tot mai multa apa
extracelulara va cristaliza, iar electrolitii din mediul extracelular se vor concentra. In concluzie,
acest proces favorizeaza supravietuirea celulara la scaderi in continuare ale temperaturii,
formandu-se cantitati mici de cristale intracelular, ce nu lezeaza celulele (proces denumit
„rescuable ice formation”). Absenta acestui proces se insoteste de formarea intracelulara de
cristale de gheata, urmate de degradarea celulei (denumirea incetatenita in literatura este „lethal
intracelular ice formation”) [200].
Factorii de care depinde lezarea celulei in cadrul procesului de congelare si decongelare
sunt [201]:
• specia (umana, animala);
• stadiul celular;
• crioprotectori (tipul si concentratia lor);
• viteza de congelare si de decongelare;
• amorsarea cristalizarii;
• temperatura la care se introduce in azot lichid.
Deteriorarea celulara trebuie evitata in cursul congelarii prin evitarea formarii cristalelor
de gheata intracelular, care se produc in intervalul de temperatura - 15°C si - 60°C. Dar si cu
ocazia decongelarii celulele vor parcurge acest interval, insa in sens invers [202].
Afectarea celulara in cadrul congelarii/ decongelarii rapide
La viteze mari de congelare se produce cristalizarea intracelulara, dar in echilibru
osmotic (celulele isi pastreaza forma). Cu cat viteza de congelare este mai mare, cu atat se
formeaza mai multe cristale mici. La o temperatura mai mica de - 90°C cristalele se afla intr-un
stadiu dezorganizat. Incalzirea de la - 90°C la - 40°C induce fenomenul de recristalizare, astfel
incat cristalele se aglomereaza si cresc in dimensiuni.
Cristalele mici au o energie de suprafata mare, au tendinta de a scade aceasta energie
superficiala prin scaderea suprafetei, astfel incat se produce cresterea si aglomerarea cristalelor si
au loc distrugeri membranare si lezare celulara.
Recristalizarea necesita timp, necesitand o viteza de decongelare mai scazuta.
La o decongelare rapida se trece peste acest interval de timp critic, nu apare recristalizarea si nu
apar modificari importante in structura cristalelor [200].
218
Leziuni celulare in cadrul congelarii lente
Cristalizarea intracelulara este exclusa daca 90% din apa intracelulara a fost cedata
mediului, fenomen ce necesita insa timp. Celulele sunt expuse o perioada indelungata unor
conditii hipertone. Dupa cristalizare, apa cedata mediului extern determina concentrarea
intracelulara a sarurilor.
Se considera ca exista o agresiune asupra lipidelor si lipoproteinelor membranare prin
concentratia crescuta de electroliti, cu formare de discontinuitati membranare, care la
decongelare permit liza osmotica a celulei printr-o crestere a permeabilitatii membranare.
O alta ipoteza presupune producerea de mici leziuni la nivelul membranei celulare in
cursul deshidratarii (de la un anumit volum celular), care ulterior permit liza osmotica in cursul
decongelarii.
In concluzie, procesul de congelare rapida necesita si o decongelare rapida (pentru
evitarea recristalizarii), respectiv congelarea lenta este urmata de o decongelare lenta (pentru
evitarea lizei osmotice).
Leziuni celulare prin fenomenul de „supercooling”
Punctul de inghet al majoritatii mediilor se situeaza intre - 3°C / -5°C. „Supercooling”
reprezinta fenomenul de depasire al acestui punct, astfel incat se ajunge la - 12°C sau
temperaturi mai scazute, fara aparitia cristalizarii.
Pentru evitarea fenomenului de „supercooling” se induce cristalizarea la - 3°C / - 6°C,
(adica imediat la temperaturi aflate sub punctul de inghet). Inducerea cristalizarii extracelulare si
initierea procesului de deshidratare se produce prin atingerea solutiei/ introducerea unui
instrument racit (tija/ bagheta la al carei capat temperatura este mai scazuta). Fenomenul a primit
denumirea de „insamantare” („seeding”).
Viteza optima de congelare este cea la care se evita formarea intracelulara de cristale, dar
care este suficienta pentru a expune cat mai putin celulele unor efecte de liza.
[124], [200], [201].
Termenul „racire” se refera la scaderea temperaturii de la valoarea temperaturii camerei
la 5°C si cel de „congelare” se refera la scaderea temperaturii de la 5°C la - 30°C.
219
Rata de racire a unei celule depinde de permeabilitatea celulei si de raportul dintre
suprafata si volum. De exemplu in cazul ovocitului, care este o celula mare, rata optima de racire
este < 1°C / minut.
Capitolul 5.3
Substantele crioprotectoare
Crioprotectorii sunt substante care prin adaugarea lor incearca sa protejeze celulele in
procesul de inghet. Ele sunt reprezentate de: glicerol, zaharoza, polivinilpirolidona (PVP),
dimetilsulfoxid (DMSO), 1-2 propandiol. Ca si caracteristici generale - sunt substante cu greutate
moleculara mica, sunt miscibile cu apa si penetreaza usor celula. Ele se adauga in solutie in
concentatii de 1 pana la 2 molar. Protectia celulara se obtine prin efectul acestora de deshidratare
celulara produsa inainte de congelare, prin efectul hiperton pe care il creaza in mediul de
congelare. De obicei timpul de expunere la crioprotectori este de 10-20 minute.
Crioprotectorii se impart in 2 clase: substante penetrante si nepenetrante.
penetrante (sunt cel mai des folosite; exemple de crioprotectori penetranti sunt
DMSO si glicerolul). Sunt substante hidrofile, cu un efect puternic deshidratant. Efectul lor este
de scadere a punctului de inghet, astfel la 1 mol DMSO temperatura se va reduce de la -10°C la -
35°C / -45°C, permitand intarzierea cristalizarii si astfel ramane mai mult timp pentru
deshidratarea intracelulara, in special in cazul congelarii lente. Efectul lor consta probabil in
legarea apei intracelulare si cedarea ei la temperaturi mai scazute, astfel incat se ajunge abia
atunci la concentratii critice de electroliti;
nepenetrante (exemplul este PVP – care este relativ toxic; alt crioprotector
nepenetrant este sucroza). Efectul lor consta in extragerea apei intracelulare (deshidratare) si
astfel se scade concentratia electrolitilor extracelulari. Prin urmare ei cauzeaza o scadere a
punctului de congelare si astfel temperatura la care mediul intracelular va ingheta este mult mai
redusa. Totodata se reduce si concentratia absoluta a sarurilor ce raman in solutia/mediul
necongelat si se evita „efectul de solutie”. Acest efect este nociv prin alterarea structurii
220
membranare (lipide si lipoproteine) la o expunere celulara indelungata intr-un mediu cu
concentratii crescute de saruri.
Efectele adverse ale crioprotectorilor sunt cele de toxicitate pentru PVP, iar glicerolul si
DMSO pot interfera cu Na+/K+ ATP-aza (la anumite concentratii).
Este important ca in cadrul decongelarii sa se indeparteze crioprotectorul prin spalari
succesive.
Amorsarea cristalizarii are loc prin procesul de „insamantare” („seeding”) cu urmatoarele
efecte:
• scurteaza fenomenul de supercooling;
• cristalizarea extracelulara se induce la temperaturi usor scazute sub punctul de inghet.
Ca si metode se descriu:
• adaugarea crioprotectorului, echilibrare la 0°C, introducerea eprubetelor cu celule intr-o baie
la -6°C / -7°C ; dupa 5-10 min. se introduce o bucata de gheata, ce va induce cristalizarea;
• amorsarea cristalizarii printr-un instrument in prealabil racit;
• cu eprubete la al caror capat exista o tija in “L”; la extremitatea inferioara a acesteia se atinge
o temperatura mult mai scazuta (10-20 K) si se produce amorsarea cristalizarii.
Crioconservarea in sistem deschis (este varianta moderna) consta in plasarea eprubetelor
deasupra unui recipient cu azot lichid la -196°C . Starea de vapori a azotului de la suprafata
lichidului are temperaturi tot mai mari pe masura cresterii distantei fata de suprafata lichidului.
Eprubetele se vor deplasa cu o anumita viteza spre recipientul cu azot lichid, unde in final vor fi
scufundate. Decongelarea nu necesita aparatura speciala, produsul congelat se trece direct din
azot lichid intr-o baie de apa la 20°C / 30°C. Ulterior, prin diluare, se indeparteaza o cantitate de
crioprotector si se urmareste microscopic viabilitatea celulara.
Celulele intacte se cultiva 30 min. - 3 ore in mediul specific, dupa care se mai observa
inca o data microscopic. Celulele cu pronuclei se vor folosi ulterior pentru transferul intrauterin.
Nu s-au observat anomalii (scindare ADN, aberatii numerice sau morfologice
cromozomiale) la nivelul celulelor dupa crioconservare.
Crioconservarea se aplica pentru: ovocite mature/ imature, celule in stadiul de 2 PN,
embrioni (!), spermatozoizi.
Se descriu multiple protocoale pentru congelare, cat si pentru decongelare (manual sau
computerizat) si care includ timpi si viteze diferite pentru aceste procese.
221
Capitolul 5.4
Crioconservarea celulara
Crioconservarea spermatozoizilor a fost anticipata de Spallanzani in 1776, care a observat
pentru prima data ca spermatozoizii isi pastreaza motilitatea dupa ce au fost expusi la temperaturi
scazute. Prima sarcina dupa inseminare intrauterina ce a folosit spermatozoizi decongelati a fost
obtinuta in 1953 [124], [193], [201].
Indicatiile crioconservarii spermatozoizilor sunt:
• neoplazie ce necesita radio- si chimioterapie si care este urmata de sterilitate;
• sterilizare chirurgicala (vasectomie);
• tulburari de ejaculare;
• absenta partenerului in ziua efectuarii inseminarii intrauterine, FIV, ICSI;
• variatii largi ale calitatii spermei;
• donatori/ banci de sperma.
Crioconservarea spermatozoizilor din tesutul testicular se recomanda in cazul tumorilor
testiculare, a biopsiei testiculare in cazul azoospermiei sau pentru evitarea unei noi biopsii.
Fara crioprotectori supravietuirea celulara este de < 15%, ceea ce implica necesitatea
adaugarii de substante crioprotectoare, care scad mult punctul de inghet, mentin pH-ul, scad
concentratia electrolitilor. Se utilizeaza glicerol in concentratie de 5-10%. Adaugarea
crioprotectorului se face treptat, pentru a preveni hiperosmolaritatea, a minimaliza leziunile si a
evita deshidratarea celulara severa. Spermatozoidul are o permeabilitate crescuta la glicerol, care
este dependenta de temperatura [203].
Dupa decongelare se urmareste viabilitatea spermatozoizilor, motilitatea, capacitatea de
fecundare. S-a constatat ca:
• motilitatea spermatozoizilor este afectata dupa decongelare, in special la spermograme cu
oligo/ astenospermie;
• morfologia spermatozoizilor consta in afectarea membranei acrozomiale si a portiunii
terminale [204];
222
• referitor la capacitatea de fecundare si rata sarcinilor: nu exista studii edificatoare (se
compara sperma proaspata si cea decongelata de la acelasi individ). Diversele studii ofera
concluzii contradictorii [205].
Se stie insa ca procesele de congelare si decongelare actioneaza negativ asupra unei
spermograme deja alterate [206].
Se pot folosi substante ce optimizeaza presiunea osmotica si pH-ul, previn contaminarea
bacteriana si stabilizeaza membrana celulara, denumite „extender” sau substante cu rol in
stabilizarea membranei celulare (de ex. galbenus de ou) si care poarta denumirea de
„cryobuffer”.
Procesul de congelare utilizeaza 2 metode: tehnica cu vapori (sistem deschis) sau in
tehnica in sistem computerizat.
Procesul de congelare cu vapori: consta in plasarea orizontala a tuburilor 15 min la 35 cm
deasupra nivelului lichidului, apoi inca 15 min la 15 cm, dupa care se scufunda in azot lichid la -
196°C.
Congelarea in sistem computerizat are urmatoarele etape: racirea cu 1°C/min pana la 5
°C; congelarea cu o viteza de 10°C/min pana la -80°C si apoi de 25°C/min pana la -130°C, unde
se mentine o ora, dupa care se scufunda in azot lichid la -196°C.
Decongelarea consta in plasarea recipientelor cu sperma la 37°C timp de 10 min (in cazul
procesului de congelare cu vapori) sau la temperatura camerei timp de 10 min (pentru sistemul
computerizat). Se indeparteaza crioprotectorul si se analizeaza sperma si se prepara pentru
inseminare intrauterina, FIV, ICSI.
Si aici este valabil ca o congelare rapida obliga la o decongelare rapida, respectiv o
congelare lenta - la o decongelare lenta.
Crioconservarea ovocitelor implica unele aspecte etice, juridice. Se indica in:
• afectiuni oncologice (inainte de radio- si chimioterapie);
• in caz de interventii chirurgicale terapeutice pentru afectiuni benigne ale ovarului;
• terapie ce afecteaza ovarul, de exemplu in endometrioza.
Rata sarcinilor/transfer este mult scazuta (4-5%) fata de celule cu 2 PN. S-a constatat si
ca rata poliploidiei este crescuta deoarece apar modificari la nivelul granulelor corticale si
223
membrana devine permisiva pentru spermatozoizi, se produce liza membranara, apar modificari
ale zonei pellucida. Polispermia si poliploidia se pot evita prin aplicarea ICSI [198].
Se studiaza crioconservarea ovocitelor imature (rezultate bune se inregistreaza dupa
ICSI) si a tesutului ovarian [207].
S-a observat ca in cazul crioconservarii ovocitelor imature in stadiul de vezicula
germinala apare o protectie a cromozomilor (care se afla in profaza primei diviziuni meiotice si
sunt protejati de o membrana nucleara). Ulterior aceste celule au fost decongelate si maturate in
vitro iar dupa fertilizarea in vitro s-a ajuns la dezvoltare embrionara si la obtinerea de sarcini.
Aceste rezultate au fost obtinute doar la animale [208].
In cazul cercetarilor la om, maturarea in vitro a ovocitelor imature care au fost congelate
si ulterior decongelate a intampinat numeroase dificultati [209].
Crioconservarea celulara in stadiul de 2 pronuclei (2PN) prezinta unele avantaje, si
anume:
• schimbul osmotic este mai rapid si expunerea la crioprotector este mai scurta (5 - 10 min fata
de 30 - 90 min - ca in cazul ovocitelor);
• rata supravietuirii este mai crescuta;
• se evita o noua recoltare de sperma.
Crioconservarea embrionilor presupune de obicei congelarea embrionilor de ziua a 2-a.
Rata de supravietuire si rata ciclurilor la care s-a efectuat un ET este mai scazuta decat cea a
ciclurilor cu celule cu 2PN [210], [211].
Discutii
Observatiile si discutiile privind rolul crioconservarii se refera asupra obtinerii unei
sarcini folosind celule crioconservate. Asa cum am prezentat se pot utiliza gameti, celule deja
fecundate (stadiul de prezigot) sau embrioni. Locul si avantajele utilizarii crioconservarii in
cadrul reproducerii umane asistate sunt redate schematizat :
• se poate creste rata sarcinii/ ciclu FIV;
• se evita sindromul de hiperstimulare ovariana;
• se evita o noua punctie foliculara si se scad implicit costurile;
• este importanta in ICSI;
224
• permite diagnosticul preimplantational.
Conform datelor din literatura - rata sarcinilor, evolutia acestora si rata nasterilor este
comparabila in cazul tehnicilor reproducerii asistate ce folosesc embrioni proaspeti fata de cei
crioconservati si decongelati.
Crioconservarea, dupa unele tehnici noi ca ICSI, poate ridica cateva probleme (prin
injectarea spermatozoidului se pot produce lezari ale zonei pellucida si ale oolemei, care sa
permita modificari in pasajul apei si a crioprotectorilor). Rezultatele dupa FIV si ICSI ale
diferitelor studii ofera date comparabile referitoare la rata implantarii si rata sarcinilor.
In sensul acestor consideratii teoretice am intentionat efectuarea unei analize comparative
a crio-ciclurilor pentru o perioada de 3 ani (1999-2000-2001) si rezultatele (numarul sarcinilor
obtinute) prin embriotransferul cu celule decongelate. Au fost luate in studiu celule care au
provenit din cicluri FIV si ICSI anterioare, la care in protocoalele de stimulare s-au administrat
agonisti-GnRH sau antagonisti-GnRH. Am cautat si posibile efecte asupra calitatii celulare
produse de cele 2 clase de substante; efecte care se pot repercuta in sensul unui numar mai scazut
de sarcini. Celulele crioconservate au fost in stadiul de 2PN si la decongelare s-a urmarit
viabilitatea celulara si ulterior diviziunea acestora. Pacientele la care s-au urmarit acesti
parametri au fost tratate in cadrul Departamentului de Fertilizare in Vitro din cadrul Clinicii
Universitare de Ginecologie, Heidelberg, Germania.
Embriotransferul cu celule decongelate s-a efectuat fie in ciclu spontan, dupa o prealabila
monitorizare a folicolului dominant corelat cu secretia de estradiol, a cresterii endometriale si a
determinarilor peak-ului de LH, in vederea stabilirii momentului optim (ET se efectueaza de
regula la 3 zile dupa detectarea peak-ului de LH).
Pentru pacientele la care s-a considerat efectuarea unui ciclu substituit hormonal, s-au
administrat preparate cu estrogen, in scopul pregatirii endometrului. O schema cuprinde
administrarea de estradiol valerat (2 mg): 2 tablete/zi pentru zilele 3-6 de ciclu menstrual, apoi
cresterea la 3 tablete/ zi pentru perioada zilelor 7-10, urmata de o noua ajustare a dozei la 4
tablete/zi din ziua 11 a ciclului menstrual. Doza de estrogen se adapteaza inainte de
embriotransfer si se adauga progesteron intravaginal. Aceasta medicatie estro-progestativa se
administreaza in continuare si dupa ET (in dozele stabilite de medic) si in cazul prezentei sarcinii
– pana la 12 saptamani de amenoree. De obicei se asociaza si progesteron injectabil
225
(intramuscular-50 mg/zi) cu 2 zile anterior ET, care se continua de asemenea pana la
determinarea testului de sarcina, respectiv pana la 12 saptamani de amenoree in cazul existentei
sarcinii.
Exista si alte scheme de pregatire hormonala a endometrului, ce cuprind fie stimulari cu
gonadotropine (injectabil) sau chiar o supresie hipofizara prin administrarea din faza
medioluteala a ciclului menstrual a unui agonist-GnRH. Cand s-a realizat supresia (verificata
prin control ecografic si hormonal) se reduce doza de agonist-GnRH si se incepe o terapie de
substitutie cu 2 mg/zi estradiol valerat (oral) timp de 6 zile, apoi se creste doza la 4 mg/zi alte 4
zile, cu o noua crestere la 6 mg/zi timp de 4 zile, ca apoi sa se reduca doza la 4 mg/zi din ziua a
14-a. Administrarea de progesteron decurge din ziua a 15-a si se dubleaza dupa ziua a 17-a.
Embriotransferul se efectueaza in ziua 17 a ciclurilor stimulate [212].
226
Capitolul 5.5
Rezultatele dupa decongelarea celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu agonisti-GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata
a. Material si metoda
In anul 1999 - 141 de paciente s-au prezentat pentru embriotransfer (ET) cu celule
provenite din crioconservare (crio-ET). Varsta lor medie a fost de 34,531 ani, cu extremele de 44
si de 24 de ani, mediana – 35 ani si deviatia standard – 4,071. Numarul de paciente din anul 2000
a fost comparabil cu cel anterior (143 de paciente) si se remarca o usoara crestere in anul 2001 a
numarului de paciente (160) care au solicitat embriotransfer cu celule decongelate provenite in
urma ciclurilor FIV si ICSI anterior. Din tabelul de mai jos (Tabel 5.5.1) se poate constata o
suprapunere a varstei pacientelor si in ceea ce priveste varsta medie, extremele varstelor
pacientelor incluse in lotul de studiu precum si mediana (care este de 35 de ani in calculul pentru
cei 3 ani insumati).
Tabel 5.5.1 – Parametrul varsta in cazul pacientelor care au efectuat crio-ET
An Nr.
paciente
Varsta
medie
(ani)
Varsta
maxima
(ani)
Varsta
minima
(ani)
Mediana
(ani)
Deviatia
standard
1999 141 34,531 44 24 35 4,071
2000 143 33,993 43 22 34 4,030
2001 160 33,918 44 24 35 4,572
Total - 3
ani
444 34,137 44 22 35 4,245
Embriotransferul a fost efectuat la paciente fie in ciclu spontan fie in ciclu stimulat
hormonal (susbtituit). S-au efectuat in acest sens determinari hormonale serice, cu evaluarea
parametrilor estradiol si LH pentru stabilirea momentului optim al ET.
227
In tabelul 5.5.2 sunt exemplificate valorile estradiolului seric (pg/ml) comparativ pentru fiecare
an si, ulterior, pentru perioada celor 3 ani insumati.
Tabel 5.5.2 – Valorile pentru estradiolul seric (pg/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si
stimulate
Estradiol
seric
(pg/ml)
An
Valoare
medie
Valoare
maxima
Valoare
minima
Mediana
Deviatia
standard
1999 188,340 501 4 168 91,083
2000 327,615 750 24 303 140,269
2001 318,844 656 89 299 129,622
Total - 3
ani
280,850 750 4 257 137,565
In acelasi sens s-a dozat si valoarea serica a LH-ului (Tabel 5.5.3).
Tabel 5.5.3 – Determinarea LH-ului seric (mUI/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si stimulate
LH seric
(mUI/ml)
An
Valoare
medie
Valoare
maxima
Valoare
minima
Mediana
Deviatia
standard
1999 3,750 47 0,1 1,6 6,233
2000 18,764 70,5 0,2 14,2 15,339
2001 21,761 83,6 0,7 17 15,620
Total - 3
ani
15,223 83,6 0,1 11,4 15,412
b. Rezultate/ anul 1999
228
Din punctul de vedere al numarului de crio-cicluri, in anul 1999 au fost 14 crio-cicluri
spontane si 116 crio-cicluri stimulate efectuate. In alte 11 cazuri la care s-a initiat tratamentul
hormonal de pregatire a endometrului nu s-a putut realiza embriotransferul, deoarece la
decongelare toate celulele au fost degenerate. Deci, totalul de crio-cicluri stimulate initiate a fost
de 127.
Din crio-ciclurile spontane in 9 cazuri (64,28%) celulele decongelate au provenit din
FIV, in 4 cazuri (28,57%) au provenit din cicluri ICSI si in 1 caz (7,14%) din GIFT. In ciclurile
de provenienta a celulelor congelate si ulterior decongelate s-au folosit protocoale cu agonisti si
rFSH in 12 cazuri (85,71%), HMG la 1 pacienta (7,14%) si combinarea rFSH + HMG intr-o
situatie (7,14%).
Degenerarea celulara in cadul procesului de decongelare s-a constatat in 4 situatii
(28,57%) (degenerare doar a unor celule cu 2 PN, astfel incat ET a fost realizabil). Aceste cazuri
au avut celule crioconservate cu provenienta din cicluri anterioare FIV. La aceste cicluri FIV in
protocoalele de stimulare s-a utilizat rFSH la 3 paciente si HMG la o pacienta.
Referitor la crio-ciclurile substituite (stimulate hormonal), din cele 127 initiate, doar la
116 s-a realizat ET. Diferenta de 11 paciente o reprezinta cazurile la care in cadrul decongelarii
au degenerat toate celulele, nemaipermitand ET. Din totalul de 127 de cazuri cu crio-cicluri
substituite la un numar de 68 de cazuri (53,54%) celulele au provenit din cicluri anterioare FIV
iar la 55 de cazuri (43,30%) – din cicluri anterioare ICSI. In 4 situatii (3,14%) nu sunt precizate
protocoalele de stimulare si procedura tehnicii de reproducere asistata in cazul provenientei
celulelor congelate. Analizand din protocoalele de stimulare de provenienta se constata ca s-au
utilizat produsele de rFSH in 108 cazuri (85,03%), HMG in 6 cazuri (4,72%), FSH-HP in 4
cazuri (3,14%), rFSH+HMG : 4 cazuri (3,14%), rFSH+HMG+FSH-HP: 1 caz (0,78%). La 4
paciente nu sunt date despre protocoalele de stimulare (3,14%).
Degenerarea celulara dupa decongelare a fost intalnita in 59 de cazuri (46,45%), din care
in 39 de situatii celulele au provenit din cicluri FIV anterioare si in 19 situatii din cicluri ICSI
anterioare. La 1 pacienta nu se precizeaza metoda de reproducere asistata utilizata. Protocoalele
de stimulare au folosit in 49 de situatii rFSH, la 4 paciente – HMG, la 3 paciente rFSH+HMG, la
1 pacienta: FSH-HP, la 1 caz : rFSH+HMG+FSH-HP si 1 caz este neprecizat.
229
Observatii
Din aceste date se observa pentru crio-ciclurile din anul 1999 o preponderenta a ciclurilor
FIV si a rFSH utilizat in schemele de stimulare ovariana controlata.
In total la crio-ciclurile din 1999 s-a constatat deteriorare celulara la decongelare in 63 de
cazuri din cele 141 de paciente initiale, reprezentand un procent de 44,68%.
c. Rezultate/ anul 2000
In anul 2000 s-au initiat un total de 143 de crio-cicluri. La 1 pacienta s-a interupt crio-
ciclul pe motivul cresterii insuficiente a endometrului, nefiind urmat de decongelare celulara. In
alte 11 cazuri nu s-a efectuat ET din cauza degenerarii tuturor celulelor cu 2 PN decongelate.
Un numar initial de 43 de paciente au solicitat ET in crio-ciclu spontan, doar la 41 de
paciente s-a realizat ET iar in 2 situatii degenerarea celulara la decongelare nu a mai permis ET.
Celulele crioconservate si decongelate au provenit in 23 de cazuri (53,48%) din cicluri anterioare
FIV, in 19 situatii din cicluri anterioare ICSI (44,18%) si la 1 pacienta – din GIFT (2,32%).
Protocoalele de stimulare ovariana controlata au inclus rFSH la 34 de paciente (79,06%), HMG
la 7 paciente (16,27%) si rFSH+HMG in 2 cazuri (4,65%).
In ceea ce priveste degenerarea celulara la decongelare (doar a unor celule sau a tututor
celulelor), ea a fost intalnita in 18 situatii (41,86%); dintre acestea in 9 cazuri celulele au
provenit din cicluri anterioare FIV si in 9 cazuri din cicluri anterioare ICSI. Pentru cazurile in
care s-a intalnit deteriorare la decongelare s-a remarcat ca in 14 situatii s-a utilizat rFSH in
stimularea pentru ciclurile de provenienta celulara, in 2 situatii – HMG si in 2 cazuri -
rFSH+HMG.
Crio-ciclurile substituite hormonal au fost in total de 99, dar pe motivul deteriorarii
tuturor celulelor in urma decongelarii numai la 90 de paciente s-a putut efectua ET. Ciclurile de
provenienta au fost FIV in 57 de cazuri (57,57%), ICSI in 40 de situatii (40,40%) (din acestea 2
ICSI-TESE) si la 2 cazuri (2,02%) nu sunt precizate aceste date. Medicatia de stimulare ovariana
controlata in aceste cicluri de provenienta a utilizat rFSH la 85 de paciente (85,85%), HMG la 9
paciente (9,09%), FSH-HP la 1 caz (1,01%) si rFSH +HMG la 2 paciente (2,02%). In alte 2
cazuri (2,02%) nu se specifica aceste date.
230
Din totalul de 99 de crio-cicluri substituite - la 55 de paciente (55,55%) s-a remarcat
alterare celulara dupa decongelare. In aceste situatii celulele crioconservate au provenit in 30 de
cazuri din cicluri FIV si in 25 de cazuri din cicluri ICSI. Dintre gonadotropinele folosite in
stimularile ovariene din ciclurile de provenienta (urmate de alterare celulara la dezghetare) s-a
folosit rFSH in 48 de cazuri, HMG la 5 paciente si rFSH+HMG la 2 paciente.
Observatii
Ca si pentru anul 1999, crio-ciclurile din anul 2000, atat cele spontane cat si substituite,
au avut celule ce au provenit in majoritate din cicluri anterioare FIV iar rFSH a fost preferat in
protocoalele de stimulare ovariana controlata.
In ansamblu - la 73 de paciente (51,40%) din totalul de 142 de paciente cu crio-cicluri
(am exclus acea pacienta la care s-a abandonat crio-ciclul pe motivul endometrului subtire) se
constata deteriorare celulara in urma decongelarii. Degenerarea celulara se refera la o parte din
celulele decongelate sau la intregul numar de celule dezghetate.
d. Rezultate/ anul 2001
Pentru anul 2001 au fost incluse initial in lotul de studiu un numar de 160 de paciente, la
care urma sa se efectueze ET cu celule decongelate, care au provenit din cicluri cu agonisti
GnRH. Spre deosebire de grupul de paciente din anul 2000, nu au fost abandonari de crio-cicluri
pe motiv al cresterii necorespunzatoare a endometrului. In total in 13 situatii nu s-a realizat
embriotransferul pe motivul alterarii celulare integral la decongelare.
Crio-ciclurile spontane au fost in numar de 60 (initiale) si 56 realizate efectiv (cu
embriotransfer efectuat). La 4 paciente s-a constatat la decongelare o degradare a tututor
celulelor. Din aceste paciente – in 35 de cazuri (58,33%) celulele au provenit din cicluri
anterioare FIV si 25 (41,66%) din cicluri ICSI (dintre care 1 TESE). La aceste cicluri de
provenienta s-au administrat in protocoalele de stimulare rFSH in 47 din cazuri (78,33%), HMG
– 12 cazuri (20%) si rFSH+HMG in 1 situatie (1,66%).
Degenerare la decongelare s-a constatat la 31 de cazuri (a uneia, mai multor sau a tuturor
celulelor cu 2PN) si doar la 4 paciente nu s-a ajuns la finalitatea procedurii (adica la ET). Aceste
31 de cazuri de deteriorare celulara au provenit din 20 cicluri anterioare FIV si 11 cicluri
231
anterioare ICSI. S-a utilizat la aceste paciente in ciclul de stimulare rFSH in 27 de cazuri; HMG
in 3 cazuri si rFSH+HMG la 1 pacienta.
Numarul de crio-cicluri substituite hormonal a fost initial de 100, dar numai la 91 de
paciente s-a finalizat prin ET. In 9 cazuri celulele alterate la decongelare nu au mai permis ET.
Ciclurile de origine a celulelor congelate/decongelate au fost cicluri FIV la 67 de paciente (67%);
cicluri ICSI la 30 de paciente (30%) (dintre care - 1 TESE) si in 3 cazuri – GIFT (3%). Ciclurile
de origine au folosit ca schema de stimulare ovariana rFSH in 88 de situatii (88%), HMG in 10
cazuri (10%) si FSH-HP la 2 paciente (2%).
In urma decongelarii celulelor cu 2PN s-a remarcat la 44 din cazuri prezenta deteriorarii a
unora sau a tuturor celulelor, la 9 paciente din numarul total fiind alterare celulala in totalitate.
Celulele degenerate au provenit din cicluri anterioare FIV in 27 de cazuri si ICSI in 17 cazuri;
respective protocoalele de stimulare ovariana controlata au cuprins rFSH la 38 de paciente, HMG
la 4 paciente si FSH-HP la 2 paciente.
Observatii
Efectuand calculul in ansamblu la cele 160 de paciente care au fost incluse in crio-cicluri
(spontane si substituite hormonal) pentru anul 2001 se remarca ca la 75 dintre ele a fost prezenta
deteriorare celulara la decongelare (a uneia sau mai multor celule cu 2PN), reprezentand un
procent de 46,87%. Ca si in anii anteriori, ciclurile FIV de origine a celulelor crioconservate au
predominat fata de ciclurile ICSI, iar GIFT s-a intalnit intr-un numar extrem de redus de
paciente. Protocoalele de stimulare ovariana controlata pentru ciclurile de origine a celulelor
crioconservate au utilizat rFSH in procent covarsitor.
232
Capitolul 5.6
Rezultatele dupa decongelare a celulelor crioconservate obtinute in urma ciclurilor cu antagonisti-GnRH in cadrul tehnicilor de reproducere umana asistata
a. Material si metoda
Am considerat acelasi mod de interpretare al rezultatelor pentru pacientele cu crio-cicluri,
care au fost incluse in studiu pentru anii 1999-2000-2001, dar de aceasta data cu crio-ET efectuat
cu celule crioconservate provenite din cicluri ce au avut in protocoalele lor antagonisti-GnRH.
Ca si o observatie, numarul de paciente care au solicitat crio-ET a fost in continua
crestere de la un an la altul, dar semnificativ in numar mai redus fata de crio-ciclurile cu celule
crioconservate ce au provenit din cicluri anterioare si au utilizat in protocoalele lor agonisti-
GnRH. Numarul total de crio-cicluri din antagonisti-GnRH (reprezentat de 69 de paciente) este a
sasea parte din numarul pacientelor cu crio-cicluri din agonisti-GnRH, fiind 444.
Parametrul varsta (varsta medie, mediana, limitele extreme) este superpozabil in cele 2
tabele cu crio-cicluri (utilizand celule crioconservate din cicluri de origine cu agonisti-GnRH,
respectiv antagonisti-GnRH) (Tabel 5.6.1).
Tabel 5.6.1 – Parametrul varsta in cazul pacientelor care au efectuat crio-ET
An Nr.
paciente
Varsta
medie
(ani)
Varsta
maxima
(ani)
Varsta
minima
(ani)
Mediana
(ani)
Deviatia
standard
1999 17 34,058 40 24 35 4,534
2000 23 35,957 40 30 36 2,961
2001 29 33,655 42 27 33 3,647
Total - 3
ani
69 34,521 42 24 35 3,771
233
Ca si pentru crio-ciclurile cu celule originare din protocoale cu agonisti-GnRH, in cazul
de fata am analizat si momentul optim de efectuare al ET (atat pentru crio-cicluri spontane cat si
pentru cele substituite hormonal) prin prisma analizelor hormonale. Au fost incluse aici
determinarile serice ale estradiolului (pg/ml) si a LH-ului (mUI/ml) (Tabel 5.6.2 si Tabel 5.6.3).
Tabel 5.6.2 – Valorile pentru estradiolul seric (pg/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si
stimulate
Estradiol
seric
(pg/ml)
An
Valoare
medie
Valoare
maxima
Valoare
minima
Mediana
Deviatia
standard
1999 246,812 568 97 189,5 145,514
2000 339 1038 145 227 215,018
2001 282,931 486 118 291 100,538
Total - 3
ani
293,397 1038 97 258 159,452
Tabel 5.6.3 – Determinarea LH-ului seric (mUI/ml) in cazul crio-ciclurilor spontane si stimulate
LH seric
(mUI/ml)
An
Valoare
medie
Valoare
maxima
Valoare
minima
Mediana
Deviatia
standard
1999 4,293 21 0,1 1,7 6,230
2000 19,260 64,6 0,1 13,4 17,669
2001 27,517 231 2,3 18,5 41,176
Total - 3
ani
19,260 231 0,1 13,2 30,046
234
b. Rezultate/ anul 1999
Crio-ciclurile din anul 1999 au fost in numar de 17, dintre care 1 caz crio-ciclu spontan si
15 cazuri de crio-cicluri substituite hormonal. La 1 pacienta s-a abandonat si nu s-a mai efectuat
ET pe motivul cresterii insuficiente a endometrului, nu s-a mai produs nici decongelarea
celulelor cu 2PN. La restul de 16 crio-cicluri initiate s-a reusit efectuarea ET, deci nu a existat
alterarea tuturor celulelor dupa dezghetare.
Crio-ciclul spontan a utilizat celule provenite din ciclu FIV anterior si folosind in schema
sa de stimulare ovariana controlata rFSH, pe langa protocolul cu antagonist-GnRH. In acest crio-
ciclu nu s-a constatat degenerare celulara la decongelare.
Crio-ciclurile substituite hormonal au avut celule crioconservate cu origine in cicluri FIV
in 8 cazuri (53,33%) si cicluri ICSI in 7 cazuri (46,66%). Stimularea ovariana controlata in
ciclurile de origine a folosit rFSH pentru 14 paciente (93,33%) si FSH-HP la 1 caz (6,66%).
Din aceste crio-cicluri in 5 situatii a aparut degenerare celulara in urma dezghetarii si
aceste celule au provenit din 3 cicluri FIV si 2 cicluri ICSI, respectiv gonadotropinele pentru
stimularea ovariana au fost rFSH in 4 situatii si FSH-HP la 1 pacienta.
Observatii
Aceste date furnizeaza informatii despre “comportamentul” celulelor crioconservate la
decongelare si ciclurile lor de provenienta, incercand o relationare intre substantele folosite in
protocoalele de stimulare si modificarile ce apar in procesul dezghetarii. Ciclurile de
provenienta majoritare au fost FIV si rFSH a fost preferata pentru stimularea ovariana controlata.
La numarul total de 16 paciente (a fost exclusa pacienta la care s-a interupt crio-ciclul din cauza
cresterii necorespunzatoare a endometrului) s-au constatat doar 5 cazuri de deteriorare celulara,
care reprezinta un procent de 31,25%.
c. Rezultate/ anul 2000
Anul 2000 a inregistrat un numar de 23 de paciente la care s-au initiat crio-cicluri, si
anume la 8 paciente a fost vorba de crio-ciclu spontan; la 15 paciente – crio-ciclu substituit
235
hormonal si doar in 3 cazuri din total nu s-a realizat ET din cauza degradarii celulare integral
dupa dezghetare.
Cele 8 paciente la care s-a inceput crio-ciclul spontan au avut celulele cu origine in
cicluri anterioare FIV in 2 cazuri (25%) si cicluri anterioare ICSI in 6 situatii (75%). Pentru
aceste cicluri de origine s-au administrat gonadotropine de tipul rFSH la 6 paciente (75%) si
rFSH+HMG la 2 paciente (25%). La 1 pacienta nu s-a efectuat ET (toate celulele degenerate),
deci au fost doar 7 cazuri care s-au finalizat prin ET.
Degenerarea celulara la decongelare s-a remarcat doar in 2 cazuri (unul fiind cu
deteriorarea tuturor celulelor); acestea au provenit din ciclu FIV la 1 pacienta si din ciclu ICSI in
celalalt caz, ambele situatii au avut in schema de stimulare ovariana rFSH.
Pentru cele 15 cazuri de crio-cicluri substituite initiate s-au decongelat celule de
provenienta din 12 (80%) cicluri FIV anterioare si 3 cicluri ICSI anterioare (20%). Toate
cazurile au folosit in protocolul de stimulare ovariana controlata rFSH (100%).
La decongelare s-a remarcat ca in 2 cazuri din 15 paciente s-au deteriorat toate celulele si
nu s-a mai efectuat ET iar la alte 9 paciente a fost o alterare doar a unora din celulele dezghetate,
deci in total au fost 13 ET. Prezenta degenerarii celulare s-a constatat la celule care au provenit
din 9 cicluri FIV si 2 cicluri ICSI anterioare, toate ciclurile de stimulare ovariana au avut in
schema lor rFSH.
Observatii
Calculand in ansamblu din cele 23 de paciente care au fost incluse in studiul crio-
ciclurilor, la 13 dintre ele s-a intalnit degradare celulara in cadrul dezghetarii, reprezentand un
procent de 56,52%. Aceste celule au provenit din 10 cicluri FIV anterioare si 3 cicluri ICSI
anterioare. Deci, si pentru anul 2000, ciclurile de provenienta majoritare au fost cele FIV si
gonadotropina cea mai des uzitata din cadrul stimularii a fost rFSH.
d. Rezultate/ anul 2001
Pentru anul 2001 numarul de paciente a caror rezultate au fost luate in calcul a fost de 29.
Din acest total de 29 crio-cicluri initiate, doar in 3 situatii nu s-a finalizat prin ET datorita
degradarii celulare complete prin decongelare.
236
Crio-ciclurile spontane initiate au fost in numar de 9 si doar 8 realizate (1 caz cu
degenerare celulara totala la decongelare). Celulele dezghetate au fost cu origine din 4 cicluri
FIV anterioare (44,44%) si 5 cicluri anterioare ICSI (55,55%), iar gonadotropinele din protocolul
de stimulare au fost rFSH la 6 paciente (66,66%) si HMG in 3 situatii (33,33%).
Degenerare celulara (totala sau partiala) prin decongelare s-a intalnit in aceste crio-cicluri
in 4 cazuri; 3 fiind cu celule de origine din cicluri FIV si 1 caz – ciclu anterior ICSI.
Gonadotropinele din protocoalele de stimulare au fost rFSH pentru 3 paciente si HMG pentru 1
pacienta.
Crio-ciclurile substituite hormonal s-au aplicat la 20 de paciente, doar 18 s-au finalizat cu
ET. Celulele crioconservate au provenit din 10 cicluri FIV anterioare (50%) si 10 cicluri ICSI
anterioare (50%) (din care 1 TESE). Protocoalele din ciclurile de stimulare au fost cu
antagonisti-GnRH si rFSH pentru toate cele 20 de paciente (100%).
Prin decongelare s-a produs alterarea unora dintre celule sau a tuturor in 11 cazuri; celule
care au provenit din 6 cicluri FIV anterioare si 5 cicluri ICSI anterioare. La toate aceste 11
paciente schemele de stimulare ovariana au administrat rFSH.
Observatii
Calculul degenerarii celulare (partial sau complet) prin dezghetare la toate cele 29 de
paciente cu crio-cicluri/ anul 2001 este de 15 cazuri, semnificand un procent de 51,72%. Celulele
crioconservate au fost cu origine majoritatea in cicluri anterioare FIV si rFSH a fost administrat
preponderent pentru stimularea ovariana.
237
Capitolul 5.7
Discutii crioconservare
Schematizand intr-un tabel (Tabel 5.7.1) datele procentuale ale deteriorarii celulare in
urma procedeului de decongelare a celulelor in functie de substantele administrate in
protocoalele de origine, respectiv agonisti-GnRH versus antagonisti-GnRH, se obtin urmatoarele
rezultate:
Tabel 5.7.1 – Alterarea celulara prin decongelare (exprimata procentual) in functie de agonist-
GnRH versus antagonist-GnRH
Substanta din protocolul de origine An Degradare
celulara
(%)
Agonist-GnRH Antagonist-GnRH
1999 44,68 31,25
2000 51,40 56,52
2001 46,87 51,72
Analiza acestui tabel reda comparativ pentru cei 3 ani procentul constatat dupa
dezghetare a celulelor crioconservate degradate si se observa ca nu exista discrepante majore
intre aceste date. In anul 1999 procentul crio-ciclurilor cu agonisti-GnRH in ciclurile de origine a
celulelor este ceva mai crescut decat pentru ciclurile cu antagonisti-GnRH. O explicatie se poate
gasi si prin faptul ca in 1999 s-a inregistrat cel mai mic numar de paciente cu crio-
cicluri/antagonisti-GnRH din intregul lot studiat. Pentru urmatorii 2 ani insa crio-
ciclurile/antagonisti-GnRH inregistreaza un procent usor crescut fata de crio-ciclurile/agonisti-
GnRH. In cadrul aceleiasi clase de substante administrate in protocoalele de origine (atat pentru
agonisti cat si pentru antagonisti) se remarca ca in anul 2001 apare o scadere a procentului de
alterare prin decongelare.
238
Am calculat rata de supravietuire celulara la decongelare pe perioada celor 3 ani
insumati, atat pentru crio-ciclurile care au provenite din protocoale anterioare cu agonisti-GnRH,
respectiv cu antagonisti-GnRH.
Supravietuire celulara la decongelare/ crio-cicluri cu protocoale anterioare cu agonisti-GnRH:
67,82%
Supravietuire celulara la decongelare/ crio-cicluri cu protocoale anterioare cu antagonisti-GnRH:
67,04%.
Cele doua rezultate sunt similare!
Rezultatele arata ca in cazul crioconservarii efectele de degradare asupra celulelor
sunt strict dependente de procesele de congelare/ decongelare, iar analogul GnRH ( agonistii-
GnRH sau antagonistii-GnRH) din protocoalele de origine a celulelor nu are nici o influenta
asupra calitatii celulelor.
239
Capitolul 5.8
Concluzii crioconservare
Rezultatul final al acestor crio-cicluri (spontane sau substituite hormonal) il reprezinta de
fapt obtinerea unei sarcini. O problematica a acestei teze de doctorat o alcatuieste intrebarea
referitoare la influenta agonistilor-GnRH versus antagonisti-GnRH asupra calitatii celulare (a
celulelor crioconservate), si in special la degradarea acestora in urma decongelarii, la care se
adauga deteriorarea prin procesul dezghetarii per se.
Voi reda comparativ numarul de sarcini obtinute in urma decongelarii celulelor
crioconservate din cicluri de origine ce au cuprins in protocoalele lor agonisti-GnRH sau
antagonisti-GnRH, cu referiri si asupra tehnicilor de reproducere asistata si a gonadotropinelor
administrate in stimularea ovariana (Tabel 5.8.1 si Tabel 5.8.2).
Sarcini /crio-cicluri care au provenit din protocoale cu agonisti-GnRH
In anul 1999 s-au obtinut din crio-cicluri un numar total de 16 sarcini, dintre care 5 au
fost avorturi spontane; 2 sarcini extrauterine si 9 s-au finalizat prin nasteri. Din sarcinile avortate
– 1 a fost o sarcina tripla. Din sarcinile care au evoluat pana la nastere – 1 sarcina a fost
gemelara, 1 sarcina a prezentat malformatie fetala si la 1 pacienta (sarcina gemelara) s-a depistat
la unul dintre feti cu trisomie 21 (s-a efectuat embrioreductie la acel produs de conceptie si s-a
nascut un copil normal).
Numarul de sarcini din anul 2000 a fost de 18; dintre care 3 avorturi spontane, 1 sarcina
extrauterina, 14 nasteri (dintre care 3 gemelare). Doar la 1 nou-nascut s-a descris o malformatie
izolata (keilognatoskizis).
In anul 2001 s-au inregistrat un numar de 34 de sarcini, evolutia lor fiind distribuita
astfel: 8 sarcini biochimice, 7 avorturi spontane (1 avort gemelar), 19 nasteri (dintre care 4
gemelare, 1 tripla).
240
O scurta analiza a acestor date releva faptul ca numarul de sarcini a fost in continua
crestere de la un an la altul si ciclurile FIV de origine a celulelor crioconservate au fost egale
intr-un an si in rest mai numeroase fata de ciclurile ICSI. Dintre gonadotropinele administrate in
stimulare s-a preferat rFSH; restul tipurilor de gonadotropine au fost in numar comparabil.
Tabel 5.8.1 – Numarul de sarcini din crio-cicluri/ agonisti-GnRH
An 1999 2000 2001
Nr. crio-cicluri 141 144 (143) 160
Nr. sarcini 16 (11,34%) 18 (12,58%) 34 (21,25%)
1 2 12
15 15 22
0 1 0
Crio spontan
Crio substituit
Neprecizat
8 (5,67%) 11 (7,69%) 24 (15%)
8 (5,67%) 6 (4,19%) 10 (6,25%)
FIV
ICSI
Neprecizat 0 1 (0,69%) 0
Tip gonadotropina
14 17 30
2 0 1
0 0 3
RFSH
FSH-HP
HMG
Neprecizat 0 1 0
Sarcini / crio-cicluri care au provenit din protocoale cu antagonisti-GnRH
Pentru anul 1999 la cele 17 paciente din lotul de studiu s-a obtinut un numar de 2 sarcini,
din acestea 1 a fost biochimica si la celalalt caz s-a inregistrat un avort spontan.
Anul 2000 inregistreaza la cele 23 de paciente incluse in studiu, la care s-au efectuat ET
cu celule crioconservate provenite din cicluri cu antagonisti-GnRH in protocoalele de origine, un
numar de 6 sarcini. Evolutia acestora a fost de 3 avorturi spontane si 3 nasteri (cu feti unici).
241
In anul urmator – 2001 – la cele 29 de crio-cicluri initiate s-a obtinut un numar de 7
sarcini; dintre acestea 2 au fost avorturi spontane si 5 s-au finalizat prin nastere (1 nastere
gemelara).
Tabel 5.8.2 – Numarul de sarcini din crio-cicluri/ antagonisti-GnRH
An 1999 2000 2001
Nr. crio-cicluri 17 23 29
Nr. sarcini 2 (11,76%) 6 (26,08%) 7 (24,13%)
0 2 2
2 4 5
Crio spontan
Crio substituit
1 (5,88%) 4 (17,39%) 3 (10,34%) FIV
ICSI 1 (5,88%) 2 (8,69%) 4 (13,79%)
Tip gonadotropina
1 6 5
1 0 0
RFSH
FSH-HP
HMG 0 0 2
Ca si pentru crio-ciclurile cu celule de provenienta din protocoale cu agonisti-GnRH, in
acest tabel ce analizeaza datele din crio-cicluri/ antagonisti-GnRH se remarca ca numarul de
sarcini este in crestere de la un an la altul, dar numarul lor este mai mic comparativ cu acelasi an
si cu crio-ciclurile/ agonisti-GnRH. Pentru procedurile de reproducere asistata aplicate nu se
poate trage o concluzie, deoarece variaza de la un an la altul si in sensul cresterii si al scaderii
numarului tehnicilor FIV fata de ICSI. Totusi rFSH din medicatia de stimulare ovariana este mai
des administrata fata de celelalte gonadotropine.
Figura 5.8.1 ilustreaza comparativ numarul sarcinilor obtinute in urma crio-ciclurilor care
au folosit celule crioconservate cu provenienta din cicluri cu agonisti-GnRH fata de cele cu
antagonisti-GnRH.
242
0
5
10
15
20
25
30
35
1999 2000 2001
Nr sarcini criocicluri/agonisti-GnRHNr sarcini criocicluri/antagonisti-GnRH
Fig. 5.8.1 - Numarul sarcinilor din crio-cicluri cu agonisti-GnRH versus antagonisti-GnRH
Este evident ca din cele exemplificate numarul sarcinilor obtinute folosind celule
crioconservate din cicluri anterioare cu agonisti-GnRH in schema de stimulare il depaseste pe cel
utilizand celule crioconservate cu originea din cicluri cu antagonisti-GnRH. Totusi trebuie facut
si comentariul referitor la numarul pacientelor carora li s-a administrat agonist-GnRH si de
asemenea este mai mare fata de lotul pacientelor cu antagonisti-GnRH.
Importanta este rata sarcinilor/crio-ciclu; rata sarcinilor/ET si „baby take home rate”.
Am ilustrat comparativ numarul de sarcini raportat la numarul de crio-cicluri pentru
pacientele la care s-au administrat agonisti-GnRH (Tabel 5.8.3), respectiv antagonisti-GnRH
(Tabel 5.8.4) in ciclurile de origine ale celulelor crioconservate.
Baby take home rate repezinta numarul de copii nascuti vii raportat la numarul de crio-
ET efectuate.
16 18
34
2 6
7
243
Tabel 5.8.3 – Rata sarcinilor crio-cicluri/ agonisti-GnRH
An Nr. crio-
cicluri (din
agonisti-
GnRH)
ET
realizat
Nr. total
sarcini
Sarcini/
crio-cicluri
(%)
Sarcini/
ET
(%)
Baby
take
home
rate
(%)
1999 141 130 16 11,34 % 12,30% 7,69
2000 143 131 18 12,58% 13,74% 12,97
2001 160 147 34 21,25% 23,12% 17,00
Tabel 5.8.4 – Rata sarcinilor crio-cicluri/ antagonisti-GnRH
An Nr. crio-
cicluri (din
antagonisti-
GnRH)
ET
realizat
Nr. total
sarcini
Sarcini/
crio-cicluri
(%)
Sarcini/
ET
(%)
Baby
take
home
rate
(%)
1999 17 16 2 11,76% 12,50% 0
2000 23 20 6 26,08% 30,00% 15
2001 29 26 7 24,13% 26,92% 23,07
Un alt parametru este compararea efectuata intre rezultatele (numarul de sarcini) obtinute
in urma ciclurilor de stimulare ce au utilizat analog-GnRH in schema lor si celule crioconservate
provenite din cicluri anterioare cu analogi-GnRH. Comparatia se realizeaza in cadrul aceluiasi
tip de substanta – agonist sau antagonist-GnRH. Tabelul 5.8.5 ilustreaza procentual rata
sarcinilor/ciclu de stimulare respectiv rata sarcinilor/crio-cicluri din protocoale de stimulare ce
au in schema lor agonisti-GnRH si din crio-cicluri cu provenienta celulara in cicluri anterioare cu
agonist-GnRH. Aceleasi date obtinute sunt redate (tot procentual) referitor la rata sarcinilor/ET
cu embrioni proaspeti si cu embrioni proveniti din celule cu 2PN decongelate si baby take home
244
rate. Tabelul 5.8.6 cuprinde aceleasi comparatii dar efectuate in cadrul clasei antagonistilor-
GnRH.
Tabel 5.8.5 – Rezultate comparative intre protocoale de stimulare cu agonisti-GnRH si crio-
cicluri/ agonisti-GnRH
Agonisti-GnRH Crio-cicluri cu protocoale
anterioare cu agonisti-
GnRH
Rata sarcinilor/cicluri 21,51% 15,31%
Rata sarcinilor/ET 25,68% 16,66%
Baby take home rate 13,82%. 12,74%
Tabel 5.8.6 – Rezultate comparative intre protocoale de stimulare cu antagonisti-GnRH si crio-
cicluri/ antagonisti-GnRH
Antagonisti-GnRH Crio-cicluri cu protocoale
anterioare cu antagonisti-
GnRH
Rata sarcinilor/cicluri 11,40% 21,73%
Rata sarcinilor/ET 12,78% 24,19%
Baby take home rate 7,38% 14,51%
Similar cu rezultatele din studiile publicate, numarul de sarcini obtinute folosind
embrioni proaspeti este mai mare fata de cele ce au utilizat embrioni proveniti din celule cu 2PN
criocongelate. Acest rezultat este valabil in cadrul clasei agonistilor-GnRH. Asa cum am
remarcat in urma rezultatelor procentuale ale supravietuirii celulare la decongelare, agonistii- si
antagonistii-GnRH nu au influente diferite asupra calitatii celulare si efectele fizice din cadrul
congelarii/ decongelarii sunt cele care dicteaza rata de supravietuire.
Datele obtinute in cazul antagonistilor-GnRH nu sunt in acelasi sens, situatie in care crio-
ciclurile dovedesc o rata mai buna a sarcinilor cu celule crioconservate (valori de 2 ori mai mari
fata de ciclurile initiale de stimulare !). Acest fapt poate fi interpretat si prin prisma unui numar
mult mai mic al ciclurilor cu antagonisti care au fost efectuate - atat protocoalele de stimulare cu
245
antagonisti cat si crio-ciclurile care au provenit din aceste protocoale au fost mult mai reduse ca
numar fata de cele cu agonisti-GnRH.
Analiza statistica (utilizand acelasi model aplicat si pentru calculele anterioare)
evidentiaza faptul ca ET cu celule crioconservate se repercuta negativ asupra ratei sarcinilor,
fiind un parametru semnificativ statistic, cu valoarea lui p < 0,0001.
Analysis Of Initial Parameter Estimates Standard Wald 95% Chi- Parameter DF Estimate Error Confidence Limits Square Pr > ChiSq kryo 1 -1.0334 0.3977 -1.8128 -0.2540 6.75 0.0094 Embrtran 1 0.7522 0.1276 0.5020 1.0023 34.74 <.0001 Scale 0 1.0000 0.0000 1.0000 1.0000
Analysis Of GEE Parameter Estimates Empirical Standard Error Estimates Standard 95% Confidence Parameter Estimate Error Limits Z Pr > |Z| kryo -1.0332 0.4072 -1.8314 -0.2351 -2.54 0.0112 Embrtran 0.7517 0.1052 0.5455 0.9578 7.15 <.0001
246
Capitolul 6
Concluzii generale
1. Analogii-GnRH ca substante derivate din structura hormonului hipotalamic GnRH si-au
gasit aplicabilitatea si in reproducerea umana asistata. Introducerea acestor substante in
protocoalele de stimulare ovariana controlata au imbunatatit considerabil rezultatele tehnicilor
reproducerii asistate prin efectul lor de supresie hipofizara, astfel evitatandu-se ovulatiile
necontrolate.
2. Sinteza agonistilor-GnRH (prin inlocuirea cel mai frecvent a 2 aminoacizi din pozitiile 6
si 10 ale decapeptidul moleculei native de GnRH) a fost urmarea fireasca a descoperirii structurii
si a sintezei hormonului. In schimb, pentru sinteza antagonistilor-GnRH (in sensul unor substante
cu efecte secundare minime si cu un profil farmacocinetic sigur) a fost necesara o perioada de
aproape 30 de ani. Astfel, pentru agonistii-GnRH exista o experienta de utilizare mai bogata
comparativ cu antagonistii-GnRH.
3. Substantele agoniste au fost concepute pentru a determina o stimulare hipofizara mai
accentuata, respectiv a antagonistului pentru a exercita un efect inhibitor asupra hipofizei
(« hipofizectomie » medicamentoasa) si astfel asupra secretiei gonadotropilor. S-a constatat insa
ca in cazul administrarii continue a agonistului-GnRH, dupa o faza initiala de stimulare
hipofizara (efectul de ″flare-up″), se obtine un efect supresiv hipofizar. Aceste efecte ale
analogilor-GnRH au fost exploatate in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana controlata din
tehnicile reproducerii asistate. Schemele cu antagonisti-GnRH insa implica o durata mai redusa a
protocolului si prin urmare si costuri mai scazute ale medicatiei de stimulare administrate.
4. Motivele pentru care introducerea antagonistului-GnRH in protocoalele reproducerii
asistate nu a reusit sa devanseze rezultatele (rata sarcinilor) obtinute in urma aplicarii agonistilor-
GnRH nu sunt pe deplin cunoscute si se efectueaza cercetari care incearca gasirea unor explicatii
(vezi efectele asupra hormonilor sexuali, IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, IGFBP-4 si PAPP-A).
5. Faptul ca antagonistul-GnRH presupune o durata de stimulare ovariana mai scurta si doza
totala a medicatiei gonadotropinice este mai redusa, poate avea efecte asupra numarului de
ovocite recoltate si deci si a embrionilor obtinuti (posibil uneori mai scazut in cazul
antagonistilor-GnRH fata de agonisti-GnRH).
247
6. Din studiul efectuat pe cei 3 ani pentru pacientele care au parcurs cicluri de stimulare
ovariana in cadrul protocoalelor cu agonisti-GnRH si cu antagonisti-GnRH reiese ca varsta
pacientei este un parametru important. Fiecare an in plus scade probabilitatea obtinerii unei
sarcini care se finalizeaza prin nastere. Parametrul varsta este semnificativ statistic.
7. Distributia pacientelor in functie de varsta la grupul cu agonisti-GnRH este comparabila
(in urma analizei statistice) cu varsta pacientelor din lotul cu antagonisti-GnRH. Se remarca in
general o preponderenta a pacientelor cu varsta situata peste 35 de ani, usor mai crescut in grupul
cu antagonisti-GnRH (41,61% versus 35,81%). Aceasta diferenta se poate explica prin faptul ca
pacientele au apelat initial la protocoale cu agonisti-GnRH. Esecul reproductiv sau alta indicatie
au condus la cea de-a 2-a optiune terapeutica (protocoalele cu antagonisti-GnRH).
8. Gonadotropinele utilizate in medicatia de stimulare ovariana controlata au fost rFSH,
HMG, FSH-HP sau combinarea a 2 sau chiar 3 dintre ele. Pentru amandoua tipurile de analogi-
GnRH a predominat in protocoalele de stimulare rFSH, urmat de HMG (procente comparabile),
nefiind inregistrate date semnificative statistic.
9. Este cunoscut in literatura faptul ca protocoalele cu antagonisti-GnRH au o durata mai
scurta si ca gonadotropinele utilizate in stimulare se administreaza in doza totala mai mica
comparativ cu schemele cu agonisti-GnRH. Aceleasi concluzii se desprind si din studiul actual,
insa se considera ca diferentele dintre durata totala a stimularii si cantitatea totala a
gonadotropinelor nu au repercusiuni asupra succesului (nasterea), neavand influenta
semnificativa statistic.
10. In cadrul lotului de paciente cu antagonist-GnRH am remarcat o supresie hipofizara
insuficienta pentru protocolul francez, adica in cazul administrarii unei doze unice de antagonist.
Astfel ca pentru actualul studiu se considera ca rezultate mai bune se obtin printr-o administrare
repetitiva a antagonistului-GnRH, ca si in protocolul Lübeck.
11. Valorile medii ale estradiolului seric in cazul pacientelor ce li s-a administrat agonist-
GnRH sunt cu aproximativ 500 pg/ml mai crescute fata de pacientele din lotul cu antagonist-
GnRH, aspect care se coreleaza cu durata de stimulare gonadotropinica mai lunga. Nu este inca
clar definit daca valoarea estradiolului seric are impact covarsitor asupra ratei obtinerii sarcinilor.
De altfel nici incidenta sindromului de hiperstimulare ovariana nu se coreleaza intotdeauna cu
valori mari ale estradiolului seric. Datele analizei actuale se suprapun peste datele din literatura.
248
12. Monitorizarea serica a LH-ului este utila in depistarea cresterii premature a LH-ului.
Pentru studiul de fata protocoalele cu agonisti-GnRH au avut in 0,48% din cazuri valori ale LH
>10 UI/l, iar pentru antagonisti-GnRH procentul a fost de 2,68%. Conform studiilor se considera
pentru protocoalele cu antagonisti-GnRH ca realizarea supresiei hipofizare marcate in ziua a 8-a
de stimulare se insoteste de o rata mai mare a sarcinilor si de evolutivitate a acesteia. Pentru
valori ale LH-ului < 0,5 UI/l in ziua a 8-a de stimulare se constata cea mai mare rata de
implantare si apoi de sarcina in evolutie
13. Frecventa aparitiei sindromului de hiperstimulare ovariana este similara pentru cele 2
tipuri de substante: 3,48% in cazul agonistilor versus 3,35% pentru antagonisti-GnRH, amandoua
protocoalele au utilizat HCG pentru inducerea ovulatiei.
14. Numarul folicolilor dominanti nu a variat semnificativ in cadrul celor 2 loturi de
paciente; in cazul agonistilor-GnRH numarul mediu si mediana folicolilor dominate au fost 3,80
si 4 comparativ cu 3,93 si 3 pentru antagonisti-GnRH.
15. Calculul statistic referitor la cele 2 tehnici aplicate in cadrul reproducerii asistate: FIV si
ICSI pentru lotul de paciente arata ca metoda ICSI a inregistrat un succes mai redus, dar acest
parametru nu este semnificativ statistic. O posibila explicatie a succesului mai mic in cazul ICSI
fata de metoda FIV se poate datora indicatiilor procedurii ICSI - in caz de esec reproductiv prin
FIV, infertilitate idiopatica, factor masculin cu afectare severa. Toate aceste situatii se insotesc
obisnuit si frecvent de rate scazute de fertilizare.
16. Analiza cazurilor releva ca numarul de cicluri ICSI a crescut de la un an la altul, dar
acestea raman totusi mai putine fata de FIV conventionala.
17. Tehnicile de reproducere asistata au avut aproximativ aceeasi distributie procentuala
pentru succesul ciclurilor de stimulare (obtinerea sarcinilor), indiferent de analogul-GnRH
administrat (FIV/ET : 65,92% pentru agonist versus 70,58% pentru antagonist ; respectiv ICSI :
34,07% din protocoale cu agonist versus 29,41% din protocoale cu antagonist).
18. Punctiile foliculare s-au insotit de un numar mediu al ovocitelor, comparabil intre cele 2
tipuri de protocoale (agonisti- si antagonisti-GnRH). Este deosebit de importanta concluzia
desprinsa din aceasta analiza, si anume ca protocolul cu antagonisti-GnRH nu influenteaza in
sens negativ numarul si calitatea ovocitelor recoltate/punctie foliculara.
19. In urma fecundarii, numarul de celule cu 2PN arata aceleasi rezultate in cadrul
protocoalelor cu agonisti-GnRH, cat si cu antagonisti-GnRH. Astfel incat se deduce ca
249
antagonistul nu are efecte nefavorabile asupra procesului de fecundare, acesta depinzand de
multipli factori.
20. Embriotransferul s-a efectuat la lotul de paciente cu un numar intre 1 si maxim de 3
embrioni. Pentru fiecare embrion in plus transferat se creste semnificativ statistic probabilitatea
obtinerii unei sarcini.
21. Repetarea ciclurilor de stimulare ovariana controlata la aceeasi pacienta a condus la
concluzia ca a 2-a incercare are o rata de succes mai mica decat prima si la o a 3-a incercare
sansa de succes creste usor. Avand in vedere ca nu toate pacientele au parcurs acelasi numar de
cicluri de stimulare si nu exista in acest sens un model unitar, nu se poate considera
semnificativa statistic aceasta corelatie. Totusi este de remarcat aceasta diferenta fata de datele
furnizate de grupul Norfolk care arata o crestere a probabilitatii succesului de la primul la cel de-
al saselea ciclu pentru aceeasi pacienta (pag. 59).
22. Din compararea rezultatelor obtinute in urma administrarii agonistilor-GnRH si a
antagonistilor-GnRH in cadrul protocoalelor de stimulare ovariana, rezultate care se refera la rata
sarcinilor/cicluri; rata sarcinilor/punctie; rata sarcinilor/ET; rata implantarii si baby take home
rate, se remarca ca pentru toti acesti parametri valorile procentuale sunt mai crescute in cazul
agonistilor-GnRH. Aceste rezultate se inscriu in statisticile internationale si au semnificatia unui
impact mai bun al agonistului-GnRH asupra succesului (obtinerea sarcinii si finalizarea prin
nastere).
23. O analiza comparativa a protocoalelor cu agonist-GnRH si antagonist-GnRH din cadrul
acestui studiu releva faptul ca antagonistul-GnRH are totusi efect negativ asupra succesului si
este considerat semnificativ statistic, cu valoarea lui « p » putin peste limita 0,05.
24. Daca se considera ca standardul pentru succesul in cadrul reproducerii asistate este
nasterea unui singur copil viu si sanatos/ciclu FIV initiat (BESST : Birth Emphasizing a
Successful Singleton at Term) [191] – atunci pentru grupul cu agonist-GnRH rezultatul este de
10,94% si pentru pacientele la care s-a aplicat protocolul cu antagonist - de 5,37%. Comparativ
cu o statistica pe anul 2001 a Centrului de Fertilizare in Vitro Monash – Australia, valoarea
obtinuta pentru agonist-GnRH se apropie de datele din literatura.
25. Incidenta anomaliilor constatate la studiul de fata este de 3,35% pentru sarcinile obtinute
din protocoalele cu agonist-GnRH si de 5,88% in cazul protocoalelor cu antagonist-GnRH. In
interpretarea acestor procente intra si varsta pacientelor ( in 3 cazuri > 35 de ani), prezenta
250
sarcinii multiple si foarte dificil de estimat – tipul procedurii aplicate (in cazul ICSI). Valorile
procentuale ale incidentei anomaliilor se incadreaza intre limitele din literatura de specialitate.
26. Reversibilitatea rapida a functiei hipofizei dupa oprirea medicatiei antagoniste lasa loc
altor posibilitati terapeutice, care sa scada riscul sindromului de hiperstimulare ovariana. Astfel
ca o alta aplicatie a agonistului-GnRH se refera la declansarea ovulatiei in loc de HCG, in cazul
protocoalelor de stimulare ovariana controlata in care s-a utilizat antagonist-GnRH pentru
supresia hipofizara [215]. S-a remarcat un numar mai mare de ovocite de metafaza II [216], insa
rata sarcinilor in evolutie a fost mai scazuta si rata avorturilor mai crescuta in cazul utilizarii
agonistului-GnRH fata de HCG ca inductor al ovulatiei [217], [218] din aceste protocoale cu
antagonist-GnRH. Explicatia poate fi data de un defect de faza luteala in cazul agonistului-GnRH
comparativ cu HCG. Un avantaj al declansarii ovulatiei cu agonist-GnRH fata de terapia
standard cu HCG se remarca prin scaderea incidentei sindromului de hiperstimulare ovariana
[215], dar dupa alti autori nu se poate stabili inca o concluzie clara [217].
27. Mecanismele intime, la nivel de procese intracelulare, prin studierea concentratiei
hormonilor sexuali (estradiol, progesteron si testosteron) din lichidul intrafolicular si a raportului
acestora, au menirea de-a stabili daca exista un efect semnificativ al agonistului- sau
antagonistului-GnRH asupra secretiei steroizilor in vivo. S-au gasit diferente semnificative
statistic in cazul concentratiei medii a E2 folicular, ca fiind mai scazut la pacientele tratate cu
antagonist-GnRH si corelat cu valoarea medie serica a E2 la aceleasi paciente. Nu s-au gasit
diferente semnificative ale concentratiei progesteronului folicular iar testosteronul folicular a fost
in concentratii similare. Raportul E2/ testosteron folicular a fost scazut la lotul tratat cu
antagonist-GnRH. Nu au fost diferente referitor la raportul progesteron/ testosteron si E2/
progesteron la cele 2 grupuri de substante. Este cunoscut efectul nefavorabil al mediului
androgenic intrafolicular in cadrul dezvoltarii foliculare si se stabileste astfel ca terapia cu
antagonist-GnRH in cadrul stimularii ovariene are un efect important asupra steroidogenezei
foliculare [213].
28. Alte studii se preocupa de efectele IGF (Insulin-like growth factors) si proteinele lor de
legare (IGFBP), care au rol major in reglarea autocrina si paracrina a foliculogenezei. Se
compara concentratiile din lichidul folicular a IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, IGFBP-4 si PAPP-A
(pregnancy-associated plasma protein) si raporturile dintre acestea in scopul de-a gasi o diferenta
in concentratiile acestor substante in cadrul protocoalelor cu agonist- si cu antagonist-GnRH din
251
stimularea ovariana controlata. Rezultatele au aratat ca durata stimularii ovariene a fost
semnificativ mai lunga, doza de gonadotropine, concentratia serica de E2, precum si numarul de
ovocite recoltate au fost mai crescute in grupul cu agonisti-GnRH (long protocol). Concentratiile
din lichidul folicular pentru IGF-II si IGFBP-4 au fost semnificativ mai crescute si raportul: IGF-
I/ IGFBP-4 a fost semnificativ mai scazut in grupul cu agonisti-GnRH (long protocol). Valoarea
E2 seric/ folicol matur nu a diferit pentru cele 2 substante. Se concluzioneaza ca exista diferente
in mediul intrafolicular in ciclurile cu agonist-GnRH fata de antagonist-GnRH, dar totusi nu s-
au semnalat diferente in rezultatele clinice [214].
29. Aceste studii dovedesc ca fiecare substanta are avantaje si dezavantaje si nici una nu o
poate inlocui pe cealalta, astfel incat raman inca multe raspunsuri de gasit inainte de-a inclina
balanta spre terapia cu agonist-GnRH sau cu antagonist-GnRH. Este util de-a adapta fiecare
situatie in functie de particularitatea cazului, de-a folosi diferentiat cele 2 substante, cu ajustare
optima in cadrul protocoalelor FIV.
30. Introducerea crioconservarii in cadrul reproducerii asistate aduce un plus de avantaje prin
existenta mai multor ovocite sau embrioni /ciclu stimulare; prin evitarea unei noi stimulari si
reducerea costului acesteia; creste rata sarcinii / pacienta / punctie (sau /ciclu) si permite evitarea
sindromului de hiperstimulare ovariana.
31. Evaluarea procentuala a supravietuirii celulare dupa decongelare arata ca agonistii-GnRH
si antagonistii-GnRH utilizati in ciclurile de origine a celulelor nu influenteaza acest parametru.
Deteriorarea celulara este dependenta de efectele fizice din cadrul procesului de dezghetare si
analogii-GnRH nu influenteaza negativ crioconservarea.
32. Compararea procentuala a sarcinilor rezultate prin ET cu embrioni proaspeti versus celule
crioconservate denota faptul ca in cazul agonistilor-GnRH rata sarcinilor cu embrioni proaspeti
este superioara celei cu celule congelate/ decongelate. Pentru antagonisti-GnRH, situatia este
oarecum contradictorie, in sensul ca ET cu embrioni proaspeti are valori mai mici fata de rata
sarcinilor cu celule crioconservate. Inclusiv in compararea ratelor sarcinilor prin ET cu celule
crioconservate intre agonisti si antagonisti, balanta procentuala inclina in favoarea antagonistilor.
Acest rezultat se poate interpreta in contextul unui numar mult mai redus al ciclurilor de
stimulare cu protocoale cu antagonisti-GnRH fata de agonisti si a numarului de crio-cicluri din
antagonisti (numarul ciclurilor si al crio-ciclurilor ce au folosit protocoale cu antagonisti de
252
GnRH pot fi un esantion nereprezentativ statistic). Se impun studii ulterioare care sa verifice
aceste ultime rezultate.
33. Analiza statistica evidentiaza faptul ca ET cu celule crioconservate se repercuta negativ
asupra ratei sarcinilor, fiind un parametru semnificativ statistic, cu valoarea lui p < 0,0001.
253
BIBLIOGRAFIE
1. Nauta WJH, Haymaker W, (1969) Hypothalamic nuclei and fiber connections in
Haymaker W, Anderson E, Nauta WJH (eds); The Hypothalamus, Charles C Thomas
Publisher: 136-209
2. Carmel PW, Araki S, Ferin M (1976) Pituitary stalk portal blood collection in rhesus
monkeys: evidence of pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH),
Endocrinology 99: 243-248
3. Lechan RM, Toni R (2004) Functional Anatomy of the Hypothalamus and Pituitary,
Chapter 3b in Neuroendocrinology, Hypothalamus and Pituitary, Grossman A (ed),
Endotext.org
4. Barry J, Hoffman GE, Wray S (1985) LHRH-containing systems, In Handbook of
Chemical Neuroanatomy 4, GABA and Neuropeptides in the CNS, Part I, Björklund A,
Hökfelt T (eds), Amsterdam-New-York-Oxford Elsevier: 166-215
5. Filicori M, Flamigni C (1995) Treatment with GnRH Analogs: Controversies and
Perspectives, Parthenon Publishing Group: Xiii
6. Arimura A (1991) The backstage story of the discovery of LHRH, Endocrinology 129:
1687-1689
7. Rasmussen DD, Gambacciani M, Swartz W, Tueros VS, Yen SSC (1989) Pulsatile
gonadotropin-releasing hormone release from the human mediobasal hypothalamus in
vitro: Opiate receptor mediated suppression, Neuroendocrinology 49: 150
8. Waldhauser F, Weissenbacher G, Frisch H, Pollak A (1981) Pulsatile secretion of
gonadotropins in early infancy, European Journal of Pediatrics 137 (1): 71-74
9. Felberbaum R, Rabe T, Diedrich K (2000) Gonadotropin-Releasing Hormons: Agonists
and Antagonists in Rabe T, Diedrich K, Strowitzki T (Eds.): Manual on Assisted
Reproduction, Springer Verlag Berlin-Heidelberg: 133-164
10. Wildt L, Hausler A, Marshall G, Hutchinson IS, Plant TM, Belchetz PE Knobil E (1981)
Frequency and amplitude of gonadotropine-releasing hormone stimulation and
gonadotropin secretion in the rhesus monkey, Endocrinology 109: 376
11. Knobil E (1989) The electrophysiology of the GnRH pulse generator, J Steroid Biochem
33: 669
254
12. Jarry H, Molecular Mechanism of the GnRh pulse generator, Dept. of Clin and Exptl.
Endocrinology, University of Gottingen, Germany, Deutsche Forschungsgemeinschaft
grant JA 398/4)
13. Grunwald K, Rabe T, Runnebaum B (2000) Physiology of the menstrual cycle, in Rabe
T, Diedrich K, Strowitzki T (eds), Manual on Assisted Reproduction, 2nd updated
Edition, Springer Verlag Berlin-Heidelberg: 29
14. Yen SCC, Quigley ME, Reid RL, Cetel NS (1985) Neuroendocrinology of opioid
peptides and their role in the control of gonadotropin and prolactin secretion, Am J
Obstet Gynecol 152: 485
15. Wehrenberg WB, Ling H, Bohlen P, Esch F, Brazeau P, Guillemin R (1982)
Physiological roles of somatocrinin and somatostatin in the regulation of growth hormone
secretion, Biochem Biophys Res Commun 109: 562
16. Prendergast K, Heras-Herzig A, Dalkin A (2002) GnRH – Gonadotropin Physiology and
Pathology in Neuroendocrinology, Hypothalamus and Pituitary, Grossman A (ed),
Endotext.org
17. Rossmanith WG, Mortola JF, Yen SCC (1988) Role of endogenous opioid peptides in the
initiation of the midcycle luteinizing hormone surge in normal cycling women, J Clin
Endocrinol Metab 61: 695
18. Gross DS (1980) Effect of castration and steroid replacement on immunoreactive
gonadotropin-releasing hormone in the hypothalamus and preoptic area, Endocrinology
106: 1442-145
19. Jarry H, Leonhardt S, Schwarze T, Wuttke W (1995) Preoptic rather than mediobasal
hypothalamic amino acid neurotransmitter release regulates GnRH secretion during the
estrogen-induced LH surge in the ovariectomized rat, Neuroendocrinology, 62(5): 479-86
20. Romano GJ, Krust A, Pfaff DW (1989) Expression and estrogen regulation of
progesterone receptor mRNA in neurons of the mediobasal hypothalamus: an in situ
hybridization study, Mol Endocrinol 3:1295
21. Fox SR, Harlan RE, Shivers BD, Pfaff DW (1990) Chemical characterization of
neuroendocrine targets for progesterone in female rat brain and pituitary
Neuroendocrinology 51: 276
255
22. Jarry H, Leonhardt S, Wuttke W (1991) Gamma-aminobutyric acid neurons in the
preoptic/anterior hypothalamic area synchronize the phasic activity of the gonadotropin-
releasing hormone pulse generator in ovariectomized rats, Neuroendocrinology, 53(3):
261-7
23. Wu FC, Butler G,. Kelnar CJ, Huhtaniemi I, Veldhuis JD (1996) Ontogeny of pulsatile
gonadotropin releasing hormone secretion from midchildhood, through puberty, to
adulthood in the human male: a study using deconvolution analysis and an ultrasensitive
immunofluorometric assay, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 81(5):
1798-1805
24. Apter D, Butzow TL, Laughlin GA, Yen SS (1993) Gonadotropin-releasing hormone
pulse generator activity during pubertal transition in girls: pulsatile and diurnal patterns
of circulating gonadotropins, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 76(4):
940-949
25. Grunwald K, Rabe T, Runnebaum B (2000) Physiology of the menstrual cycle, in Rabe
T, Diedrich K, Strowitzki T (eds), Manual on Assisted Reproduction, 2nd updated
Edition, Springer Verlag Berlin-Heidelberg: 27
26. GnRH Agonists, Antagonists and Assisted Conception (2002) Thieme Medical
Publishers: Semin Reprod Med 20(4): 349 –364
27. Clayton RN, Catt KJ (1981) Gonadotropin-releasing hormon receptors: characterization,
physiological regulation and relationship to reproductive function, Endocr Rev 2: 186-
209
28. Probst JC, Skutella T, Muller-Schmid A, Jirikowski GF, Hoffmann W (1995) Molecular
and cellular analysis of rP1.B in the rat hypothalamus: in situ hybridization and
immunohistochemistry of a new P-domain neuropeptide, Brain Res Mol Brain Res 33:
269-276
29. Kottler ML, Lorenzo F, Bergametti F, Commercon P, Souchier C, Counis R (1995)
Subregional mapping of the human gonadotropin-releasing hormone receptor (GnRH-R)
gene to 4q between the markers D4S392 and D4S409, Hum Genet 96: 477-480
30. Millar R, Lowe S, Conklin D, et al. (2001) A novel mammalian receptor for the
evolutionarily conserved type II GnRH. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 9636-9641
256
31. Neill JD, Duck LW, Sellers JC, Musgrove LC (2002) A gonadotropin-releasing hormone
(GnRH) receptor specific for GnRH II in primates, Biochem Biophys Res Commun 282:
1012-1018
32. Stojilkovic SS, Reinhart J, Catt KJ (1994)Gonadotropin-releasing hormone receptors:
structure and signal transduction pathways, Endocr Rev 15: 462-499
33. Kaiser UB, Conn PM, Chin WW (1997) Studies of gonadotropin-releasing hormone
(GnRH) action using GnRH receptor-expressing pituitary cell lines, Endocr Rev 18: 46-
70
34. Conn PM, Crowley WF Jr. (1994) Gonadotropin-releasing hormone and its analogs,
Annu Rev Med 45: 391-405
35. Zondek B (1926) Uber die Funktion des Ovariums, Z Geburtshilfe Gynakol 90: 327
36. Zondek B, Aschheim S (1927) Das Hormon des Hypophysenvorderlappens; Testobjekt
zum Nachweis des Hormons, Klin Wochenschr 6: 248
37. Howles C, Barri P, Cittadini E, Diedrich K, Fioretti P, et al. (1993) Metrodin HP: clinical
experience with a new highly purified follicle stimulating hormone preparation suitable
for subcutaneous administration, In Lunenfeld B (ed) FSH alone in ovulation induction,
Parthenon, New York: 45-61
38. Loumaye E, Campbell R, Salat-Baroux J (1995) Human follicle-stimulating hormone
produced by recombinant DNA technology: a review for clinicians, Hum Reprod Update
1: 188-199
39. Recombinant Human FSH Study Group (1995) Clinical assessment of recombinant
human follicle-stimulating in stimulating ovarian follicular development before in vitro
fertilization, Fertil Steril 63: 77-86
40. Rajaniemi HP, Petaja-Repo UE, Pietila EM (1996) Structure and functional significance
of the carbohydrates of the LH/CG receptor, Mol Cell Endocrinol 125(1-2): 101-105
41. Ulloa-Aguirre A, Timossi C (1998) Structure-function relationship of follicle stimulating
hormone and its receptor, Human Reproduction Update vol 4, nr 3: 260-283
42. Fan QR, Hendrickson WA, Nature (2005) 433: 269-277
43. Lamminen T, Min Jiang, Manna PR, Pakarinen P, Simonsen H, Herrera RJ, Huhtaniemi I
(2002) Functional study of a recombinant form of human LHß-subunit variant carrying
257
the Gly102Ser mutation found in Asian populations, Molecular Human Reproduction Vol.
8, No. 10: 887-892
44. Dorrington JH, Armstrong DT (1979) Effects of FSH on gonadal functions, Rec Prog.
Horm Res 39: 301
45. Richards JS (1994) Hormonal control of gene expression in the ovary, Endocr. Rev 15:
752-751
46. Hillier SG (1991) Regulatory functions for inhibin and activin in human ovaries J
Endocrinol 131: 171-175
47. Findlay JK (1993) An update on teh roles of inhibin, activin and follistatin as local
regulators of folliculogenesis, Biol Reprod 48: 15-23
48. Smyth CD, Miro F, Whitelaw PF, Howles CM, Hillier SG (1993) Ovarian
thecal/interstitial androgen synthesis is enhanced by a follicle-stimulating hormone-
stimulated paracrine mechanism, Endocrinology 133: 1532-1538
49. Giudice L (1992) Insulin-like growth factors and ovarian follicular development, Endocr
Rev 13: 641-669
50. Lunenefeld B, Menzi A, Volet B (1960) Clinical effects of human postmenopausal
gonadotropin, Rass Clin Ter Sci Affini 59: 213-217
51. Diedrich K, Van Der Ven H, Al-Hasani S, Krebs D (1988) Ovarian stimulation for in
vitro fertilisation, Hum Reprod 3: 39-44
52. Jones HW, Acosta A, Andrews MC, Garcia JE, Jones GS, Mantzawinos T, McDowell J,
Sandow B, Veeck L, Whibley T (1983) The importance of follicular phase to success and
failure in in vitro fertilization, Fertil Steril 40: 317-321
53. Devroey P, Van Steirteghem A, Mannaerts B, Coelingh Bennink H (1992) First singleton
term birth after ovarian superovualtion with rh-FSH, Lancet 340: 1108-1109
54. Daya S, Gunby J (1999) Recombinant versus urinary follicle stimulating hormone for
ovarian stimulation in assisted reproduction, Hum Reprod 14: 2207-2215
55. Brinsden PR, Akagbosu F, Gibbons , et al. (1998) Gonal-F versus Puregon: results from a
randomized, assessor-blind, comparative study in women undergoing assisted
reproductive technologies, Hum Reprod 13: 0-140
56. Berg C, Howles CM, Borg K, et al. (1997) Recombinat human follicle stimulating
hormone (r-FSH; Gonal-F) versus highly purified urinary FSH (Metrodin HP): results of
258
a randomized comparative study in women undergoing assisted reproductive techniques,
Hum Reprod 13: 0-185
57. Ancar V, Costea D, Vladareanu R (1999) Puregonul in stimularea ovariana – experienta
Clinicii Medsana Bucuresti, vol rezumate Primul Congres National de Reproducere
Umana Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 30
58. Macnamee MC, Howles CM (1987) The occurence, characteristics and management of
the LH surge in IVF, Hum Reprod 2, Suppl 1:46
59. Urbancsek J, Rabe T, Grunwald K, Kiesel L, Runnebaum B (1990a) Analysis of
hormonal changes during combined buserelin/hMG treatment, Hum Reprod 5: 675-681
60. Fleming R, Adam AH, Barlow DH, Black WP, Macnaughton MC, Coutts JRT (1982) A
new systematic treatment for infertile women with abnormal hormone profiles, Br J
Obstet Gynaecol 89: 80-83
61. Fujino M, Kobayashi S, Obayashi M (1972) Structure activity relationships in the C-
terminal part of luteinising-hormone (LHRH), Biochem Biophys Res Commun 49: 863-
869
62. Moghissi KS (2000) A Clinician’s Guide to the Use of Gonadotropin-Releasing Hormone
Analogues in Women, Medscape General Medicine 2(1)
63. Akagbosu FT (1999) The use of GnRH agonists and antagonists in infertility, in A
textbook of In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Brinsden PR (Ed), 2nd
Edition, Parthenon Publishing Group: 84
64. Lemay A, Maheux R, Faure N, Jean C, Fazekas ATA (1984) Reversible hypogonadism
induced by a luteinizing releasing-hormone (LH-RH) agonist (Buserelin) as a new
therapeutic approach for endometriosis, Fertil Steril 41: 863-871
65. Kiesel L, Runnebaum B (1992) Gonadotropin-releasing-Hormon und Analoga-
Physiologie und Pharmakologie,Gynakol Geburtshilfliche Rundsch 32: 22-30
66. Matta WH, Shaw RW, Hesp R, Evans R (1988) Reversible trabecular bone density loss
following induced hypoestrogenism with GnRh-analogue Buserelin in premenopausal
women, Clin Endocrinol 29: 45-51
67. Loumaye E (1990) The control of endogenous secretion of LH by gonadotropin releasing
hormone agonists during ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization and embryo
transfer, Hum Reprod 5: 357-376
259
68. Schmutzler RK, Diedrich K (1990) Basic and clinical aspects of GnRH agonists in
reproduction. Int J Gynecol Obstet 321: 311-324
69. De Mouzon J, Lancaster P (1995) World collaborative report 1993, 15th World Congress
on Fertility and Sterility, Montpellier, September 17-22, 1995
70. Diedrich K, Diedrich C, Santos E, et al. (1994) Suppression of the endogenous
luteinizing hormone surge by the gonadotropin-releasing hormone antagonist Cetrorelix
during ovarian stimulation, Hum Reprod 9: 788-791
71. Regan L, Owen EJ, Jacobs HS (1990) Hypersecretion of luteinising hormone, infertility
and misscarriage, Lancet 2:1141-1144
72. Tan Sl, Kingsland C, Campbell S, Mills C, Bradfield J, et al. (1992) The long protocol of
administration of gonadotropin-releasing hormone agonist is superior to the short
protocol for ovarian stimulation for in vitro fertilization, Fertil Steril 57: 810-814
73. Ron-El R, Golan A, Herman A, Raziel A, Soffer Y, Caspi E (1990) Midluteal
gonadotropin-releasing hormone analog administration in early pregnancy, Fertil Steril:
572-574
74. Smitz J, Devroey P, Bourgain C, Camus M, VanWasberghe I, Wisanto A,
VanSteirteghem AC (1988) Luteal supplementation regimes after combined GnRH
agonist/HMG superovulation, J Reprod Fertil Abstr Ser 2:18
75. Blumenfeld Z, Nahhas F (1988) Luteal dysfunction in ovulation induction: the role of
repetitive human chorionic gonadotropin supplementation during the lutael phase, Fertil
Steril 50: 403-407
76. Costea D, Ancar V, Pacu I (1999) Suportul luteal in Reproducerea Asistata, vol rezumate
Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala,
Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 43
77. Schally AV (1999) Luteinizing hormone-releasing hormone analogs: their impact on the
control of tumorigenesis, Peptides 20:1247-1262
78. Klingmuller D, Diedrich K, Sommer L (1993) Effects of the GnRH antagonist Cetrorelix
in normal women, Gyneocl Endocrinol 7: 2
79. Bajusz S, Kovacs M, Gazdag M (1988) Highly potent antagonists of luteinizing
hormone-releasing hormone free of edematogenic effects. Proc Natl Acad Sci U S A, 85:
1637- 1641
260
80. Nestor JJ Jr, Tahilramani R, Ho TL, Goodpasture JC, Vickery BH, Ferrandon P (1992)
Potent gonadotropin releasing hormone antagonists with low histamine-releasing activity,
J Med Chem 35: 3942-3948
81. Dittkoff EC, Cassidenti DL, Paulson RJ, Sauer MV, Wellington LP, et al. (1991) The
gonadotropin releasing hormone antagonist (Nal-Glu) acutely blocks the luteinizing
hormone surge but allows for resumption of folliculogenesis in normal women, Am J
Obstet Gynecol 165: 1811-1817
82. Felberbaum R, Reissmann T, Diedrich K (1995) Entwicklung und
Anwendungsmoeglichkeiten der GnRH-Antagonisten im Rahmne der Sterilitaetstherapie-
Eine Uebersicht, Fertilitaet 11: 11-21
83. Olivennes F, Fanchin R, Bouchard P, De Ziegler D, Taieb J, Selva J, Frydman R (1994)
The single or dual administration of the gonadotropin-releasing-hormone-antagonist
Cetrorelix in an in vitrofertilization-embryo transfer program, Fertil Steril 62: 468-476
84. Lin Y, Kahn JA, Hillensjo T (1999) Is there a difference in the function of granulosa
luteal cells in patients undergoing in vitro fertilization either with gonadotropin-releasing
hormone agonist or antagonist? Hum Reprod 14: 885-888
85. Mannaerts B, Devroey P, Abyholm T, Diedrich K, Hedon B, et al. (1998) A double blind
randomised dose finding study to the efficacy of the gonadotropin-releasing hormone
antagonist ganirelix (Org 37462) to prevent premature luteinizing surges in women
undergoing ovarian stimulation with recombinant follicle stimulating hormone (Puregon-
R), Hum Reprod 13: 3023-3031
86. Keay SD, Liversedge HN, Mathur RS, Jenkins KM (1997) Assisted conception following
poor ovarian response to gonadotropin stimulation, Br J Obstet Gynaecol 104: 521-527
87. Klein NA, Battaglia DE, Fujimoto VY, Davis GS, Bremner WJ, Soules MR (1996)
Reproductive aging: accelerated ovarian follicular development associated with a
monotropic FSH rise in normal older women, J Clin Endocrinol Metab 81: 1038-1045
88. Hannoch J, Lavy Y, Holzer H, Hurwitz A, Simon A, et al. (1998) Young low responders
protected from the untoward effects of reduced ovarian response, Fertil Steril 69: 1001-
1004
261
89. Faber BM, Mayer J, Cox B, Jones D, Toner JP, et al. (1998) Cessation of
gonadotropin-releasing hormone agonist therapy combined with high-dose gonadotropin
stimulation yields favorable pregnancy results in low responders, Fertil Steril 60: 826-830
90. Weissmann A, Farhi J, Royburt M, Nahum H, Glezerman M, et al. (2003)
Prospective evaluation of two stimulation protocols for low responders who were
undergoing in vitro fertilization-embryo transfer, Fertil Steril 79, Nr 4: 886-892
91. Urbancsek J, Rabe T, Grunwald K, Runnebaum B (1990b) Diagnose, Haufigkeit
und klinische Bedeutung des vorzeitigen Anstiegs/Gipfels bei Patientinnen eines
IVF/GIFT Programmes, Geburtsh Frauenheilkd 50: 454-462
92. Urbancsek J, Rabe T, Thuro H, Grunwald K, Runnebaum B (1991b) Kombinierte
Behandlung mit einem GnRH-Analogon und Gonadotropinen bei IVF-ET/GIFT
Patientinnen nach vorangegangenen erfolglosen reinen HMG-Stimulation, Zentralbl
Gynaekol 113: 563-574
93. Rizk B, Vere M (1991) Incidence of severe ovarian hyperstimulation syndrome
after GnRH agonist/HMG superovulation for in vitro fertilization, Proceedings of the VII
World Congress on In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Paris, Hum Reprod
94. Rizk B, Aboulghar MA, Mansour RT, et al. (1991) Severe ovarian
hyperstimulation syndrome: analytical study of twenty-one cases, Proceedings of the VII
World Congress on In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Paris, Hum Reprod:
368-369
95. Munteanu I, Checiu I, Checiu M, Policec S, Craina M, Budau G, Hrubaru N,
Vladescu E (2000) 5 ani de fertilizare in vitro (FIV) in Romania, Obstetrica si
Ginecologia, vol. XLVIII, Nr 1: 73-79
96. Abdalla HI, Rizk B (1999) Ovarian Hyperstimulation Syndrome, In Assisted
Reproductive Technology, Abdalla HI, Rizk B (eds), Abingdon Oxford Health Press: 37-
39
97. Lunenfeld B, Insler V, Glezerman M (1993) Diagnosis and treatment of functional
infertility, Publ Blackwell Wissenschaft, Berlin, 3rd rev. ed: 98
98. World Health Organization (1973) Agents stimulating gonadal function in
humans, WHO Tech Rep Series, Nr 514
262
99. Golan A, Ron El R, Herman A, et al. (1989) Ovarina hyperstimulation syndrome:
an update review, Obstet Gynecol Surv 44: 430-440
100. Balasch J, Arroyo V, Carmona F, et al. (1991) Severe ovarian hyperstimulation
syndrome: role of peripheral vasodilatation, Fertil Steril 56: 1077-1083
101. Ravindranath N, Little-Ihrig LL, Phillios HS, et al. (1992) Vascular endothelial
growth factor messenger ribonucleic acid expression in the primate ovary, Endocrinol
131: 254-260
102. Millauer B, Wizigmann-Voos S, Schnurch H, et al. (1993) High affinity VEGF
binding and developmental expression suggest FLK-1 as a major regulator of
vasculogenesis and angiogenesis, Cell 72: 835-846
103. Schenker JG (1999) Ovarian Hyperstimulation Syndrome – Experimental and
Clinical Data, vol. rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata,
cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 21
104. David S, Munteanu I, Policec S, David D, Bernad E (1999) Sindromul de
suprastimulare ovariana – forma grava la Centru de Fertilizare in Vitro din Clinica Bega,
vol rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare
internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 48
105. Munteanu I, Checiu I, Policec S, David S, Craina M, Vladescu E (2001) Apects
regarding ovarian hyperstimulation syndrome at the IVF Center of the Universitary
Clinic of Obstetrics and Gynecology „Bega”, Timisoara, Romania, Gynecol Endocrinol,
Vol 15, Suppl Nr 5: 138
106. Sher G, Salem R, Fernman M, et al. (1993) Eliminating the risks of life-dangering
complications following overstimulation with menotropin fertility agents: a report on
women undergoing in vitro fertilization and embryotransfer, Obstet Gynecol 81: 1009-
1011
107. Burkman RT, Tang MTC, Malone KE, Marchbanks PA, McDonald JA, et al.
(2003) Infertility drugs and the risk of bresat cancer: findings from the National Institute
of Child Health and Human Development Women’s Contraceptive and Reproductive
Experiences Study, Fertil Steril 79, Nr 4: 844-851
108. Healy DL, Venn A (2003) Infertility medication and the risk of breast cancer,
Fertil Steril 79, Nr 4: 852-854
263
109. Althuis MD, Scoccia B, Lamb EJ, Moghissi KS, Westhoff CL, et al. (2005)
Melanoma, thyroid, cervical, and colon cancer risk after use of fertility drugs, Am J
Obstet Gynaecol 193: 668-674
110. Chang M C (1959) Fertilization of rabbit ova in vitro, Nature 184: 466–467
111. Steptoe PC, Edwards RG (1978) Birth after the reimplantation of a human
embryo, Lancet 2(8085): 366
112. Steptoe PC et al. (1971) Human blastocysts grown in culture, Nature 229: 132–
133
113. Steptoe PC, Edwards RG (1976) Reimplantation of human embryo with
subsequent tubal pregnancy, Lancet 1: 880-882
114. Gleicher N, Friberg J, Fullan N, Giglia RV, Mayden K, Kesky T, Siegel I (1983)
Egg retrieval for in vitro fertilization by sonographically controlled vaginal culdocentesis,
Lancet 2: 508-9
115. Lenz S, Lauritsen JG, Kjellow M (1981) Collection of human oocytes for in vitro
fertilization by ultrasonically guided follicular puncture, Lancet 1: 1163-1164
116. Wikland M, Enk L, Hamberger L (1985) Transvesical and transvaginal
approaches for the aspiration of follicles by the use of ultrasound, Ann NY Acad Sci 442:
683-689
117. Kuenstliche Befruchtung oder assistierte Reproduktion, Kap.3.3 In Gynaekologie
und Geburtshilfe-Lehrbuch fuer Studium und Praxis, Schmidt-Matthiesen H, Wallwiener
D (eds), 10.Auflage, Schattauer Verlag Stuttgart, 2005: 139-146
118. Munteanu I, Checiu I, Policec S (1995) Fertilizarea in vitro si embriotransfer in
Romania, Obstetrica si Ginecologia XLIII: 167-170
119. Checiu I, Checiu M, Policec S, Munteanu I (1998) Aspecte al experientei
Centrului IVF Bega cu privire la tehnica fecundatiei in vitro si a cultivarii embrionului
uman, vol rezumate Al XII-lea Congres National de Obstetrica si Ginecologie, Iasi: 38
120. Munteanu I, Rabe T, Checiu I, Policec S (1999) Realizarea reproducerii umane
asistate in Romania, vol. rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana
Asistata, cu participare internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 27
121. Munteanu I, Anastasiu D, Gluhovschi A, Craina M, Dorneanu F (1999) Rezultate
si perspective pentru mileniul urmator privind Reproducerea Umana Asistata in Romania,
264
vol rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare
internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 62
122. Policec S, Munteanu I, Checiu I, David S (1998) Experienta Centrului de
Fertilizare in Vitro a Clinicii „Bega” Timisoara in stimularea ovariana pentru fertilizarea
in vitro, vol. rezumate Al XII-lea Congres National de Obstetrica si Ginecologie, Iasi, 27-
30 mai 1998: 79
123. Rabe T, Gör ÜB, Urbancsek J, Runnebaum B (1997) Assisted Reproduction, In
Runnebaum B, Rabe T (eds.), Gynecological Endocrinology and Reproductive Medicine,
Vol. 2, Reproductive Medicine, Springer Verlag Berlin Heidelberg: 333
124. Rabe T, Munteanu I, Strowitzki T, Vladescu E (2000) Notiuni de reproducere
umana asistata, Capitolul 2.8 in Munteanu I (ed), Tratat de Obstetrica, Editura Academiei
Romane, Bucuresti: 175-234
125. Brinsden PR (1999) Oocyte recovery and embryotransfer techniques for in vitro
fertilization, in A textbook of In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Brinsden
PR (Ed), 2nd Edition, Parthenon Publishing Group: 180
126. Brinsmead M, Stanger J, Oliver M, Shumack J, Raymond S, Clark L (1989) A
randomized trial of laparoscopy and transvaginal ultrasound-directed oocyte pick-up for
in vitro fertilization, J In Vitro Fertil Embryo Transfer 6: 149-154
127. Pickering S, Braude P, Johnson M, et al. (1990) Transient cooling to room
temperature can cause irreversible disruption of the meiotic spindle in the human oocyte,
Fertil Steril 54: 102-108
128. World Health Organization. (1992) WHO Laboratory Manual for the Examination
of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. Cambridge: Cambridge
University Press
129. Kruger TF, Menkweld R, Stander FSH, et al. (1986) Sperm morphologic features
as a prognostic factor in in vitro fertilization, Fertil Steril 46: 1118-1123
130. Surcel IV, Apostol S, Lerintiu S, Parastie S (1998) Semnificatia unor parametri
morfologici in evaluarea capacitatii de fertilizare a spermei, vol rezumate Al XII-lea
Congres National de Obstetrica si Ginecologie, Iasi, 27-30 mai 1998: 80-81
131. Riedel HH, Hubner F, Ensslen SC, et al. (1989) Minimal andrological
requirements for in vitro fertilization, Hum Reprod 4: 73-77
265
132. Braude PR, Bolton VN (1984) The preparation of spermatozoa for in vitro
fertilization by buoyant density centrifugation. In Feichtinger W, Kemeter P (eds) Recent
Prognosis in Human In Vitro Fertilization. Palermo: Cofese: 125-134
133. Lopata A, Patullo MJ, Chang A, et al. (1976) A method for collecting motile
spermatozoa from human semen, Fertil Steril 27: 677-684
134. Aitken RJ, Clarkson JS (1987) Cellular basis of defective sperm function and its
association with the genesis of reactive oxygen species by human spermatozoa, J Reprod
Fertil 81: 459-469
135. Aitken RJ (1989) The role of free oxygen radicals and sperm function, Int J
Androl 12: 95-97
136. Daya S, Gwatkin RBL, Bissessar H (1987) Separation of motile human
spermatozoa by means of a glass bead column, Gamete Res 17: 375
137. Fisch B et al. (1989) The effect of preinsemination interval upon fertilization of
human oocytes in vitro, Hum Reprod 4: 954-956
138. Levron J, Munne S, Willadsen S, Rosenwaks Z, Cohen J (1995) Male and female
genomes associated in a single pronucleus in human zygotes, J Assist Reprod Genet 12,
Suppl: 27s
139. Oehninger A, Acosta AA, Veek LL, Simonetti S. Muasher J (1989) Delayed
fertilization during in vitro fertilization and embryo transfer cycles: analysis of cause and
impact of overall results, Fertil Steril 52: 991-997
140. Plachot M, Veiga A, Montagut J, et al. (1988) Are clinical and biological IVF
parameters correlated with chromosomal disorders in early life: a multicentric study,
Hum Reprod 3: 627-635
141. Plachot M, Mandelbaum J, Junca AM, Cohen J, Slat-Baroux J (1993) Coculture
of human embryo with granulosa cells, Contracept Fertil Sex 19: 632-634
142. Elder KT (1999) Laboratory techniques: Oocyte collection and embryo culture,
Ch. 12, In A textbook of In Vitro fertilization and Assisted Reproduction, Brinsden PR
(Ed), second edition, 1999, Parthenon Publishing Group: 185-201
143. Barclay L (2004) Piroxicam may increase pregnancy rate from in vitro
fertilization and embryo transfer, Fertil Steril 82: 816-820
266
144. Fernandez H, Coste J, Job-Spira N (1991) Controlled ovarian hyperstimulation as
a risk factor for ectopic pregnancy, Obstet Gynecol 78: 656
145. Winter E, Wang J, Davies MJ, Norman R (2002) Early pregnancy loss following
assisted reproductive technology treatment, Hum Reprod, Vol 17, 11: 3220-3223
146. Guzick DS, Wilkes C, Jones HW Jr (1986) Cumulative pregnancy rates for in
vitro fertilization, Fertil Steril 46: 663
147. Tan SL, Royston P, Campbell S, Jacobs HS, Betts J, et al. (1992) Cumulative
conception and livebirth rates after in vitro fertilization, Lancet 339: 1390
148. Asch RH, Balmaceda JP, Ellsworth LR, Wong PC (1985) Gamete intrafallopian
transfer (GIFT): a new treatment for infertility, Int J Fertil 30: 41
149. Society for Assisted Reproductive Technology, The American Fertility Society
(1993) Assisted Reproductive Technology in the United States and Canada: 1991 results
from the Society for Assisted Reproductive Technology generated from the American
Fertility Society Registry, Fertil Steril 59: 956
150. Lancaster PAL (1995) Evaluation of infertility treatment: multicenter trial or
national registers? In Hedon B, Bringer J, Mares P (eds) Fertility and Sterility, Carnforth,
UK: Parthenon Publishing: 465-468
151. Balmaceda JP, Alam V, Roszjtein D, Ord T, Snell K, Asch R (1992) Embryo
implantation rates in oocyte donation: a prospective comparison of tubal versus uterine
transfers, Fertil Steril 57: 362
152. Tanbo T, Dale PO, Aabyholm T (1990) Assisted fertilization in infertile women
with patent fallopian tubes, A comparison of in vitro fertilization, gamete intrafallopian
transfer and tubal embryo stage transfer, Hum Reprod 5: 266
153. Assisted Reproduction (1994) Chapter 31, In Clinical Gynecologic Endocrinology
and Infertility, 5th edition, Speroff L, Glass RH, Kase NG (eds), Williams and Wilkins:
931-946
154. Gordon JW, Talansky BE (1986) Assisted fertilization by zona drilling: a mouse
model for correction of oligospermia, Journal of Experimental Zoology 239: 347-354
155. Cohen J, Malter H, Fehilly C, Wright G, Elsner C, et al. (1988) Implantation of
embryos after partial opening of oocyte zona pellucida to facilitate sperm penetration,
Lancet ii: 162
267
156. Malter HE, Cohen J (1989) Blastocyst formation and hatching in vitro following
zona drilling of human embryos, Gamete Research 24: 67-80
157. Payne D (1994) Embryo viability associated with microassisted fertilization,
Chapter 10: Micromanipulation techniques, In Bailliere’s Clinical Obstetrics and
Gynecology, S. Fishel (ed), Bailliere Tindall Cambridge University Press, Vol 8: 157-175
158. Ng SC, Bongso TA, Ratnam SS, Sathananthan H, Chan CL, et al. (1988)
Pregnancy after transfer of multiple sperm under the zona, Lancet ii: 8614-8790
159. Ng SC, Bongso TA, Ratnam SS (1991) Microinjection of human oocytes: the
technique for severe oligoasthenoteratozoospermia, Fertility and Sterility 56: 1117-1123
160. Hiramoto Y (1962) Microinjection of the live spermatozoa into sea urchin eggs,
Experimental Cell Research 27: 416-426
161. Lanzendorf SE, Maloney MK, Veeck LL, Slusser J, Hodgen GD, et al. (1988b) A
preclinical evaluation of pronuclear formation by microinjection of human spermatozoa
into human oocytes, Fertility and Sterility 49: 835-842
162. Palermo G, Joris H, Devroey P, Van Steirteghem AC (1992) Pregnancies after
intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte, Lancet 340: 17-18
163. Lanzendorf SE, Maloney M, Ackerman S, Acost A, Hodgen G (1988a)
Fertilising potential of acrosome-defective sperm following microsurgical injection into
eggs, Gamete Research 19: 329-337
164. Hung-Ching Liu (1997) Embryonic therapy for implantation enhancement,
Chapter 5, In Embryonic Medicine &Therapy, Jauniaux E, Barnea E, Edwards E (eds),
Oxford University Press: 80
165. Lundin K, Sjogren A, Nilsson L, Hamberger L (1994) Fertilization and pregnancy
after intracytoplasmic microinjection of acrosomeless spermatozoa, Fertility and Sterility
62:1266-1267
166. Casper RF, Meriano JS, Jarvi KA, et al. (1996)The hypo-osmotic swelling test for
selection of viable sperm for intracytoplasmic sperm injection in men with complete
asthenospermia, Fertil Steril 65: 972-976
167. Nagy ZP, Verheyen G, Liu J, et al. (1995) Results of 55 intracytoplasmic sperm
injection cycles in the treatment of male immunological infertility, Hum Reprod 10:
1775-1780
268
168. Shrivastav P, Nadkarni P, Wensvoort S, et al. (1994) Percutaneous epididymal
sperm aspiration for obstructive azoospermia, Hum Reprod 9: 2058-2061
169. Tournaye H, Clasen K, Aytoz A, et al. (1998) Fine needle aspiration versus open
biopsy for testicular sperm recovery: a controlled study in azoospermic patients with
normal spermatogenesis, Hum Reprod 13: 901-90
170. Ancar V, Costea D, Vladareanu R (1999) Experienta Clinicii Medsana Bucuresti
in Reproducerea Asistata prin ICSI - comentariu pe 86 cazuri, vol rezumate Primul
Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare internationala,
Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 30
171. Jardoudi KA, Hollanders JMG, Sieck UV, et al. (1997) pregnancy after transfer of
embryos which were generated from in-vitro matured oocytes, Hum Reprod 12: 857-859
172. De Vos A, Van Steirteghem A (1997) Intracytoplasmic sperm injection In New
Insights in Gynecology and Obstetrics: Research and Practice, Ottesen B, Tabor A (eds),
Carnforth, UK, Parthenon Publishing Press: 89-96
173. Tarlatzis B (1996) Report on the activities of the ESHRE task force on
intracytoplasmic sperm injection, In Genetics and Assisted Human Conception, Van
Steirteghem A, Devroey P, Liebaers I (eds), Oxford University Press: 160-176
174. Van Steirteghem A, Bonduelle M, Hamberger L, et al. (1998) Assisted
reproduction by intracytoplasmic sperm injection: a survey on the clinical experience in
1994 and the children born after ICSI, carried out until 31 December 1993, Hum Reprod
13: 1737-1746
175. Liu J, Nagy Z, Joris H, Tournaye H, Smitz J, et al. (1995) Analysis of total 76 total
fertilization failure cycles out of 2732 intracytoplasmic sperm injection cycles, Hum
Reprod 10: 2630-2636
176. Liebaers I, Bonduelle M, Legein J, Wilikens A, Van Assche E, et al. (1995a)
Follow-up of children born after intracytoplasmic sperm injection, In Hedon B, Bringer J,
Mares P (eds), Fertility and Sterility. A current overview. Proceedings of the 15th World
Congress on Fertility and Sterility, Montpellier, 1995, Parthenon: 409-412
177. Liebaers I, Bonduelle M, Van Assche E, Devroey P, Van Steirteghem A (1995b)
Sex chromosome abnormalities after intracytoplasmic sperm injection, Lancet 346:1095
269
178. Bonduelle M, Hamberger J, Loris H, Tarlatzis BC, Van Steirteghem AC (1995b)
Assisted reproduction by intracytoplasmic sperm injection: an ESHRE survey of clinical
experiences until 31 December 1993, Hum Reprod Update 1, no 3, CD-ROM
179. Guidelines on the application of CASA technology in the analysis of spermatozoa
(1998) Hum Reprod, Vol. 13, Nr. 1: 142-145
180. Incidence of chromosomal aberrations in children born after assisted reproduction
through intracytoplasmic sperm injection (1998), Editorial, Hum Reprod, vol.13 no.4:
781–782
181. In’t Veld P, Brandenburg H, Verhoeff A, et al. (1995) Sex chromosomal
abnormalities and intracytoplasmic sperm injection, Lancet, 346:773
182. Jacobs P, Browne C, Gregson N, et al. (1992) Estimates of the frequency of
chromosome abnormalities detectable in unselected newborns using moderate levels of
banding, J. Med. Genet, 29: 103–106
183. Tarlatzis BC (1999) Benefits and risks of ICSI in the treatment of male infertility,
vol. rezumate Primul Congres National de Reproducere Umana Asistata, cu participare
internationala, Timisoara, Romania, 27-29 mai 1999: 15
184. Ponjaert-Kristoffersen I, Bonduelle M, Barnes J, Nekkebroeck J, Loft A, et al.
(2005) International Collaborative Study of Intracytoplasmic Sperm Injection-Conceived,
In Vitro Fertilization-Conceived, and Naturally Conceived 5-Year-Old Child Outcomes:
Cognitive and Motor Assessments, Pediatrics, 115(3): e283 - e289
185. Ponjaert-Kristoffersen I, Tjus T, Nekkebroeck J, Squires J, Verté D, et al. (2004)
Psychological follow-up study of 5-year-old ICSI children, Hum Reprod 19(12): 2791-
2797
186. Takeuchi T, Colombero LT, Neri QV, Rosenwaks Z, Palermo GD (2004) Does
ICSI require acrosomal disruption? An ultrastructural study, Hum Reprod, 19(1): 114-
117
187. Kosmas IP, Kolibianakis EM, Devroey P (2004) Association of estradiol levels on
the day of hCG administration and pregnancy achievement in IVF: a systematic review,
Hum Reprod 19(11): 2446-2453
188. Kolibianakis EM, Zikopoulos K, Schiettecatte J, Smitz J, Tournaye H, Camus M,
Van Steirteghem AC, Devroey P (2004) Profound LH suppression after GnRH antagonist
270
administration is associated with a significantly higher ongoing pregnancy rate in IVF,
Hum Reprod, 19(11): 2490-2496
189. Mohamed Aboulghar (2003) Prediction of ovarian hyperstimulation syndrome
(OHSS), Estradiol level has an important role in the prediction of OHSS, Hum Reprod,
18 (6): 1140-1141
190. Out HJ, Rutherford A, Fleming R, Tay CCK, Trew G, et al. (2004) A randomized,
double-blind, multicentre clinical trial comparing starting doses of 150 and 200 IU of
recombinant FSH in women treated with the GnRH antagonist ganirelix for assisted
reproduction, Hum Reprod, Vol. 19, No. 1: 90-95
191. Min JK, Breheny SA, MacLachlan V, Healy DL (2004) What is the most relevant
standard of success in assisted reproduction? The singleton, term gestation, live birth rate
per cycle initiated: the BESST endpoint for assisted reproduction, Hum Reprod 19 (1): 3-
7
192. Mazur P (2000) Stopping biological time. The freezing of living cells, Annals
New York Academy of Sciences, Part XI: Cryopreservation: 514-529
193. Bunge RG, Sherman JK (1953) Fertilizing capacity of frozen spermatozoa, Nature
172: 767
194. Deanesley R (1954) Immature rat ovaries grated after freezing and thawing, J
Endocrinol 2: 197
195. Parker AS (1956) Grafting of mouse ovarian after freezing and thawing, J
Endocrinol 14 xxi
196. Sherman JK (1963) Improved methods of preservation of human spermatozoa by
freezing and freezing-drying, Fertil Steril 14: 49
197. Trounson A, Mohr L (1983) Human pregnancy following cryopreservation,
thawing and transfer of an eight cell embryo, Nature 305: 707
198. Al-Hasani S, Diedrich K, van der Ven H, Reinecke A, Hartje M, Krebs D (1987)
Cryopreservation of human oocytes, Hum Reprod 2: 695-700
199. Chen C (1986) Pregnancy after human oocyte cryopreservation, Lancet 1: 884
200. Edwards R, Brody S (eds.)(1995) Principles and Practice of Assisted Human
Reproduction, W.B. Saunders Company: 335-343 si 455-457
271
201. Rabe T, Diedrich K, Strowitzki T (eds) (2000) Manual on assisted reproduction,
Springer Verlag, Heidelberg : 339-377
202. Mazur P (1984) Freezing of living cells: mechanism and implications, Am J
Physiol 247: C125-C142
203. Serres C, Jouannet P, Czyglik F, David G (1980) Effects of freezing on
spermatozoa motility in David G, Price WS (eds) Human artificial insemination and
semen preservation, Plenum, New York: 147-161
204. Henry MA, Noiles EE, Gao D, Mazur P, Critser JK (1993) Cryopreservation of
human spermatozoa. The effects of cooling rate and warming rate on the maintenance of
motility, plasma membrane integrity and mitochondrial function, Fertil Steril 60:911-918
205. Cohen J, Edwards RG, Fehilly CB, Fishel SB, Hewitt J, et al. (1985) In vitro
fertilization usin cryopreserved donor semen in cases where both partners are infertile,
Fertil Steril 43: 570-574
206. Englert Y, Delvigne A, Vekemans M, Lejeune B, Hemlisz A et al. (1989) Is fresh
or frozen sperm to be used in in vitro fertilization with donor sperm? Fertil Steril 51: 661-
664
207. Fabbri R, Porcu E, Marsella T, Rochetta G, Ventroli S, Flamigni C (2001) Human
oocyte cryopreservation: new perspectives regarding oocyte survival, Hum Reprod 16
(3): 411-416
208. Martino A, Songsasen N, Leibo SP (1996) Development into blastocysts of
bovine oocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling, Biol Reprod 54: 1059-1069
209. Son WY, Park SE, Lee KA, Lee WS, Koo JJ et al (1996) Effects of 1,2
propanediol and freezing-thawing on the in vitro developmental capacity of human
immature oocytes, Fertil Steril 66: 995-999
210. Ludwig M, Al-Hassani S, Felberbaum R, Diedrich K (1999) New aspects of
cryopreservation of oocytes and embryos in assisted reproduction and future
perspectives, Hum Reprod 14 Suppl. 1: 162-185
211. Reubinoff BE, Pera MF, Vajta G, Trounson AO (2001) Effective
cryopreservation of human embryonic stem cells bt the open pull straw vitrification
method, Hum Reprod 16(10): 2187-2194
272
212. Sathanandan M, Macnamee MC, Wick K, et al. (1992) Clinical aspects of human
embryo cryopreservation, in Brinsden PR, Rainsbury PA (eds) A Textbook of in Vitro
Fertilization and Assisted Reproduction, Carnforth UK, Parthenon Publishing
213. Garcia-Velasco JA, Isaza V, Vidal C,Landazabal A, Remohi J, et al. (2001)
Human ovarian steroid secretion in vivo: effects of GnRH agonist versus antagonist
(cetrorelix), Hum Reprod 16 (12): 2533-2539
214. Young Sik Choi, Seung-Yup Ku, Byung-Chul Jee, Chang-Suk Suh, Young Min
Choi, et al. (2006) Comparison of follicular fluid IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, IGFBP-4 and
PAPP-A concentrations and their ratios between GnRH agonist and GnRH antagonist
protocols for controlled ovarian stimulation in IVF-embryo transfer patients, Hum
Reprod doi:10.1093/humrep/del091 (advance access 04.2006)
215. Olivennes F, Fanchin R, Bouchard P, et al. (1996) Triggering of ovulation by a
gonadotropin-releasing hormone (GnRH) agonist in patients pretreated with a GnRH
antagonist, Fertil. Steril 66(1):151-153
216. Humaidan P, Ejdrup Bredkjær H, Bungum L, Bungum M, Grøndahl ML,
Westergaard L, Yding Andersen C (2005) GnRH agonist (buserelin) or hCG for
ovulation induction in GnRH antagonist IVF/ICSI cycles: a prospective randomized
study, Hum Reprod 20(5):1213-1220
217. Griesinger G, Diedrich K, Devroey P, Kolibianakis EM (2006) GnRH agonist for
triggering final oocyte maturation in the GnRH antagonist ovarian hyperstimulation
protocol: a systematic review and meta-analysis Hum Reprod Update 12(2):159-168
218. Kolibianakis EM, Schultze-Mosgau A, Schroer A, van Steirteghem A, Devroey P,
Diedrich K, Griesinger G (2005) A lower ongoing pregnancy rate can be expected when
GnRH agonist is used for triggering final oocyte maturation instead of HCG in patients
undergoing IVF with GnRH antagonists, Hum Reprod 20(10): 2887-2892