Monolisa® Anti-HBs PLUS 192 teste 72566 TEST IMUNOENZIMATIC (EIA) PENTRU DETECŢIA ŞI DETRMINAREA TITRULUI ANTICORPILOR SPECIFICI DE ANTIGENUL DE SUPRAFAŢĂ AL VIRUSULUI HEPATITEI B (ANTI-HBs) ÎN SER SAU PLASMĂ UMANE

Controlul de calitate al fabricantului Toţi reactivii fabricaţi şi comercializaţi de Bio-Rad sunt supuşi unui sistem complet de asigurare a calităţii, începând de la recepţia materiilor prime şi până la comercializarea produsului finit. Calitatea fiecărui lot este atent controlată iar acesta este eliberat pe piaţă numai atunci când corespunde criteriilor de acceptare. Informaţiile referitoare la producţia şi controlul fiecărui lot sunt în proprietatea companiei noastre.

3

CUPRINS 1 – INTERESUL CLINIC 2 – PREZENTAREA TESTULUI 3 – PRINCIPIUL TESTĂRII

4 - CONŢINUTUL TRUSEI 5 – PRECAUŢII

6 – INSTRUCŢIUNI DE IGIENĂ ŞI PROTECŢIA MUNCII 7 – MATERIALE NECESARE NEINCLUSE ÎN TRUSĂ

8 – PREPARAREA REACTIVILOR 9 – PĂSTRAREA REACTIVILOR ŞI VALABILITATEA 10 – PROBELE BIOLOGICE

11 – PROCEDEUL DE TESTARE

12 – VALIDAREA REZULTATELOR PENTRU METODELE CALITATIVĂ ŞI CANTITATIVĂ

13 – CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR

14 – VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR 15 – LIMITELE METODEI 16 – PERFORMANŢELE ACESTUI TEST 17 – BIBLIOGRAFIE

4

1 – INTERESUL CLINIC MONOLISA® Anti-HBs PLUS este un test imunoenzimatic destinat detecţiei calitative şi cantitative în ser sau plasmă umane a anticorpilor totali specifici antigenului de suprafaţă al virusului Hepatitei B (anti-HBs).

2 – PREZENTAREA TESTULUI Prezenţa anticorpilor specifici antigenului de suprafaţă al virusului Hepatitei B (anti-HBs) reprezintă un factor important în diagnosticul şi prognosticul infecţiei cu virusul Hepatitei B (HBV). În infecţia acută cu HBV, anticorpii anti-HBs sunt detectaţi la aproape 80% dintre bolnavi în intervalul de 1-3 luni de la apariţia antigenului de suprafaţă al virusului Hepatitei B (AgHBs). Anti-HBs este adesea utilizat ca marcher de supraveghere epidemiologică, de evaluare a expunerii la Hepatita B în antecedente pentru potenţialii primitori de vaccin specific, de monitorizare a vaccinărilor şi de selecţionare a plasmei cu un titruri înalte de anticorpi în vederea preparării imunoglobulinelor specifice. Trusa MONOLISA® Anti-HBs PLUS este un test imunoenzimatic direct de tip sandviş ce foloseşte ca fază solidă microgodeuri sensibilizate cu AgHBs nativ (subtipurile ad şi ay) şi un conjugat alcătuit din AgHBs (uman, subtipurile ad şi ay) marcat cu peroxidază din hrean. Determinarea nivelurilor de anti-HBs a fost standardizată faţă de un preparat anti-HBs de referinţă OMS exprimat în miliunităţi internaţionale per mililitru (mUI/ml). Un nivel mai mare sau egal cu 10 mUI/ml se consideră în general ca valoare standard ce demonstrează protecţia post-vaccinală la HBV. Verificarea obţinerii unui titru de anti-HBs de cel puţin 10 mUI/ml, reprezentativ pentru titrul prag protector din punct de vedere imunologic, este crucială în gestionarea corectă a persoanelor vaccinate ce ulterior pot fi expuse fluidelor şi probelor AgHBs pozitive.

3 – PRINCIPIUL TESTĂRII În procedeul de testare cu trusa MONOLISA® Anti-HBs PLUS, probele pacienţilor şi controalele se incubează în microgodeurile sensibilizate cu antigen. Dacă anticorpii anti-HBs sunt prezenţi în probele testate sau în controale, aceştia se leagă la antigenul imobilizat. Excesul de probă se îndepărtează în etapa de spălare, apoi se adaugă conjugat în godeuri. Conjugatul se leagă la oricare complex antigen-anticorp prezent în godeuri. Excesul de conjugat este îndepărtat de asemenea într-o etapă de spălare, apoi în godeuri se pipetează soluţia de cromogen/substrat, permiţându-se incubarea. Dacă o probă conţine anti-HBs, enzima legată (peroxidaza din hrean, HRP) determină colorarea tetrametil benzidinei (TMB) din soluţia cromogenă şi virarea culorii la albastru. Culoarea albastră devine galbenă după adăugarea soluţiei de stopare. Dacă o probă nu conţine anti-HBs, soluţia de cromogen/substrat din godeuri rămâne incoloră pe durata incubării cu substratul, ca şi după adăugarea soluţiei de stopare. Intensitatea culorii măsurată spectrofotometric este proporţională cu cantitatea de anti-HBs prezentă în proba testată. Valorile citirilor absorbţiei pentru probele pacienţilor sunt comparate cu o valoare prag cut-off determinată de calibratorul de 10mUI/ml.

5

4 – CONŢINUTUL TRUSEI Toţi reactivii sunt destinaţi în exclusivitate diagnosticului in vitro.

ETICHETĂ NATURA REACTIVILOR ÎMPACHETARE R1 MICROPLACA : 12 barete a câte 8 godeuri sensibilizate cu un

amestec de antigene de suprafaţă de virus Hepatitic B, din subtipurile ad şi ay (de origine umană)

2 microplăci

R2 SOLUŢIE DE SPĂLARE CONCENTRATĂ (20 x) Tampon Tris NaCl pH 7,4 Conservant : ProClin™300 (0,04 %)

1 flacon 235 ml

C0 CONTROL ANTI-HBS NEGATIV Tampon cu ser fetal de viţel şi stabilizatori pentru proteine Conservant : ProClin™ 300 (0,5%)

1 flacon 2,2 ml

C1 CALIBRATOR 10 mUI/ml * Anticorpi Anti-HBs de origine umană în tampon cu ser fetal de viţel, stabilizatori pentru proteine şi colorant indicator pentru controlul pipetării Conservant : ProClin™ 300 (0,5%)

1 flacon 3 ml

C2 CALIBRATOR 100 mUI/ml – CONTROL POZITIV Anticorpi Anti-HBs de origine umană în tampon cu ser fetal de viţel, stabilizatori pentru proteine şi colorant indicator pentru controlul pipetării Conservant : ProClin™ 300 (0,5%)

1 flacon 2,2 ml

C3 CALIBRATOR 400 mUI/ml Anticorpi Anti-HBs de origine umană în tampon cu ser fetal de viţel, stabilizatori pentru proteine şi colorant indicator pentru controlul pipetării Conservant : ProClin™ 300 (0,5%)

1 flacon 2,2 ml

C4 CALIBRATOR 1000 mUI/ml Anticorpi Anti-HBs de origine umană în tampon cu ser fetal de viţel, stabilizatori pentru proteine şi colorant indicator pentru controlul pipetării Conservant : ProClin™ 300 (0,5%)

1 flacon 2,2 ml

R6 DILUANT PENTRU PROBE Tampon cu ser fetal de viţel, stabilizatori proteici şi indicator de culoare pentru controlul pipetării Conservant : ProClin™ 300 (0,1%)

1 flacon 27 ml

R7a CONJUGAT CONCENTRAT (11 x) AgHBs (subtipurile umane ad şi ay) marcat cu peroxidază în tampon suplimentat cu stabilizatori pentru proteine Conservant : ProClin™ 300 (0,5%)

1 flacon 2,5 ml

R7b DILUANT PENTRU CONJUGAT Tampon cu ser fetal de viţel şi stabilizatori pentru proteine Conservant : ProClin™ 300 (0,1%)

1 flacon 25 ml

R8 TAMPON SUBSTRAT Soluţie de acid citric şi acetat de sodiu pH 4,0 ce conţine H2O2 (0,015 % ) şi DMSO (4%)

1 flacon 60 ml

R9 CROMOGEN Soluţie de Tetrametil Benzidină (TMB)

1 flacon 5 ml

R10 SOLUŢIE DE STOPARE Soluţie de acid sulfuric 1 N

1 flacon 28 ml

* Controalele sunt calibrate în conformitate cu un material de referinţă intern care, la rându-i, este calibrat în conformitate cu standardul OMS 1st IRP WHO 1977.

Păstraţi trusa la 2-8°C. Aduceţi toţi reactivii CU EXCEPŢIA Conjugatului Concentrat la temperatura camerei (18-30°C) înainte de utilizare. Returnaţi reactivii la 2-8°C imediat după folosire. Păstraţi baretele/plăcile neutilizate în ambalajul original resigilat. Nu scoateţi materialul deshidratant. Păstraţi plăcile cu barete la 2-8°C.

6

5 - PRECAUŢII Calitatea rezultatelor depinde de aplicarea corectă a următoarelor Bune Practici de Laborator: � Denumirea testului, ca şi numărul specific de identificare al acestuia, sunt

inscripţionate pe rama fiecărei microplăci, ca şi pe fiecare baretă a microplăcii. Monolisa® Anti-HBs PLUS : Număr ID Specific = 63. Verificaţi numărul specific de identificare înainte de fiecare utilizare. Dacă numărul de identificare lipseşte sau diferă faţă de cel menţionat, bareta nu poate fi folosită.

� Nu utilizaţi reactivi expiraţi. � Nu amestecaţi reactivi din loturi diferite în aceeaşi serie de lucru.

REMARCĂ: Pentru soluţia de spălare (R2, identificare pe etichetă : 20x, scris cu verde), substratul peroxidazei (R8, identificare pe etichetă: TMB buf, scris cu albastru), cromogen (R9, identificare pe etichetă: TMB 11x, scris cu mov) şi soluţia de stopare (R10, identificare pe etichetă: 1N, scris cu roşu), este permisă folosirea altor loturi decât cele incluse în trusă, cu condiţia ca într-o serie de lucru să se folosească acelaşi lot. Aceşti reactivi se pot folosi şi cu alte produse ale companiei Bio-Rad. În plus, soluţia de spălare (R2, etichetă de identificare: 20X scris cu verde) poate fi amestecată cu celelalte 2 soluţii incluse în diferite truse de reactivi Bio-Rad (R2, etichete de identificare: 10X scris cu albastru sau 10X scris cu portocaliu) cu condiţia să fie correct reconstituite şi să se folosească numai un singur amestec într-o serie de lucru dată. Contactaţi serviciul nostru tehnic pentru informaţii suplimentare.

� Toţi reactivii trebuie aduşi la temperatura camerei cu 30 de minute înainte de începerea testării.

� Reconstituiţi reactivii cu grijă, evitând orice contaminare. � Nu executaţi testul în atmosferă cu vapori reactivi (acizi, alcalini, aldehidici) sau cu

praf, deoarece aceste noxe pot altera activitatea enzimatică a conjugatului. � Utilizaţi sticlărie spălată temeinic şi clătită cu apă deionizată sau, preferabil,

materiale de unică folosinţă. � Nu lăsaţi microplaca să se usuce între spălări şi pipetarea următorului reactiv. � Reacţia enzimatică este foarte sensibilă la metale şi ioni metalici. Prin urmare

diferitele soluţii ce conţin conjugat sau soluţia de substrat nu trebuie să vină în contact cu elemente metalice.

� Soluţia de revelare (tampon substrat + cromogen) trebuie să fie de culoare roz. Modificarea coloraţiei roz în câteva minute de la reconstituire indică alterarea reactivului care nu poate fi folosit, trebuind să fie înlocuit.

� Prepararea soluţiei de developare trebuie făcută într-un recipient curat de unică folosinţă sau container de sticlă prespălat cu HCl 1N şi clătit temeinic cu apă distilată, apoi perfect uscat. Acest reactiv se păstrează la întuneric.

� Schimbaţi vârfurile pipetelor pentru fiecare ser. � Spălarea este o etapa vitală în realizarea testului. Respectaţi în mod strict numărul

de cicluri de spălare. Asiguraţi-vă că toate godeurile sunt bine umplute şi apoi golite complet. Spălarea incorectă cauzează rezultate imprecise.

� Nu folosiţi niciodată acelaşi container pentru distribuirea conjugatului şi a soluţiei de developare.

7

6 – INSTRUCŢIUNI DE IGIENĂ ŞI PROTECŢIA MUNCII Unii reactivi conţin ProClin™ 300 (0,04%, 0,1% şi/sau 0,5%) R43 : Poate determina sensibilizare la contactul cu tegumentele. S28-37 : După contactul cu pielea, spălaţi imediat cu multă apă şi săpun. Purtaţi echipament de protecţie adecvat.

Xi IRITANT

• Monolisa® Anti-HBs PLUS conţine componente derivate din sânge uman, testate şi găsite nereactive pentru antigenul de suprafaţă al virusului Hepatitei B (AgHBs), anticorpi specifici de virusul Hepatitei C (anti-HCV), şi anticorpii specifici de virusurile imunodeficienţei umane dobândite (anti-HIV-1 şi anti-HIV-2). Deoarece nici o metodă de testare cunoscută nu poate garanta în mod absolut absenţa agenţilor infecţioşi, consideraţi reactivii şi probele pacienţilor ca materiale potenţial infecţioase.

• Consideraţi orice echipament ce vine în contact direct cu probele, şi cu soluţiile de spălare, ca produse contaminate şi trataţi-le ca atare.

• Evitaţi stropirea cu probe sau soluţii care conţin probe. • Purtaţi mănuşi de unică folosinţă în timpul manipulării reactivilor şi probelor şi spălaţi-

vă pe mâini după manipulări. • Nu pipetaţi niciodată cu gura. • Probele, reactivii de origine umană, precum şi materialele şi produsele contaminate

trebuie decontaminate înainte de a fi aruncate: - fie prin imersie timp de 30 de minute în hipoclorit de sodiu la concentraţie finală de

5% (1 volum de hipoclorit de sodiu la 10 volume de lichid sau apă contaminate). - fie prin autoclavare la 1210 C timp de cel puţin 2 ore. Autoclavarea la 121°C timp de minim 1 oră este cea mai bună metodă de inactivare a virusurilor HIV şi HBV. ATENŢIE: NU INTRODUCEŢI ÎN AUTOCLAVĂ SOLUŢII PE BAZĂ DE HIPOCLORIT DE SODIU.

• Picăturile se clătesc cu hipoclorit de sodiu (clor menajer) diluat la o concentraţie de 10%. Dacă fluidul contaminant este acid, neutralizaţi mai întâi cu bicarbonat de sodiu, apoi clătiţi cu clor şi uscaţi cu hârtie absorbantă. Materialul folosit la curăţenie trebuie aruncat în containerul pentru deşeuri contaminate.

• Nu uitaţi să neutralizaţi şi/sau să autoclavaţi înainte de a vărsa în chiuvetă soluţiile sau lichidul de spălare sau oricare alt fluid ce conţine probe biologice.

• Fişele cu informaţii referitoare la protecţia mediului (MSDS) sunt disponibile la cerere.

7 – MATERIALE NECESARE NEINCLUSE ÎN TRUSĂ � Apa distilată sau deionizată � Hipoclorit de sodiu (clor menajer) şi bicarbonat de sodiu � Micropipete semiautomate sau automate, reglabile sau fixe, care pot măsura şi

distribui volume de la 10-200µl, 1 ml, 5 ml şi 10 ml � Cilindri gradaţi cu capacităţi de 25 ml, 100 ml şi 1000 ml � Container pentru deşeurile infectate � Baie de apă termostatată ajustată la 37°± 1°C sau incubator pentru microplăci

echivalent. � Spălător de placi manual, semiautomat sau automat � Cititor de microplăci echipat cu filtre de 450, 490 şi 620 nm. � Hârtie absorbantă � Mănuşi de unică folosinţă � Containere curate de polipropilenă pentru prepararea TMB.

8

8 – PREPARAREA REACTIVILOR Înainte de utilizare lăsaţi reactivii din trusa Monolisa® Anti-HBs PLUS sa ajungă la temperatura camerei timp de 30 de minute.

1) Reactivi gata de utilizare Microplaca (R1) nainte de a deschide ambalajul, lăsaţi microplaca să camerei în ambalajul original, condensării apei în godeuri. Reintroduceţi siţi înapoi în ambalaj. Resigilaţi cu grijă a eliminând pe cât poserior şi lipiţi ă adezivă. Păstraţ

Diluant pentru probe (R6) Control anti-HBs negativ (C0) Calibrator 10 mUI/ml (C1) Calibrator 100 mUI/ml - Control anti-HBs pozitiv (C2) Calibrator 400 mUI/ml (C3) Calibrator 1000 mUI/ml (C4) Înainte de utilizare, omogenizaţi reactivii prin agitare sau răsturnare blândă.

2) Reactivi de reconstituit Soluţie de spălare concentrată (20 x) : R2

Diluaţi soluţia de spălare R2 în proporţie de 1 : 20 cu apă distilată pentru a obţine soluţia de spălare gata de lucru. Preparaţi 800 ml pentru o placă de 12 barete.

Soluţie de conjugat de lucru (R7a + R7b)

Aduceţi diluantul de conjugat (R7b) la temperatura camerei.

Înainte de amestecare, omogenizaţi prin răsturnare flaconul cu diluant de conjugat (R7b, soluţie incoloră, sau colorată cel mult galben pai) şi flaconul de conjugat concentrat (R7a, soluţie de culoare verde).

Pentru fiecare baretă de testat, diluaţi reactivul R7a în reactivul R7b în proporţie de 1 : 11 (de exemplu: 100 µl de conjugat concentrat (R7a) la fiecare 1 mililitru de diluant de conjugat (R7b)), folosind o eprubetă curată de polipropilenă. Pentru calculul facil al volumelor necesare, consultaţi tabelul următor. Omogenizaţi cu blândeţe evitând formarea spumei.

Soluţia de conjugat de lucru trebuie protejată de lumină, atât la temperatura camerei cât şi la +2-8°C.

Soluţia de conjugat trebuie să fie de culoare verde şi este stabilă 8 ore la temperatura camerei, sau 24 de ore dacă se păstrează la +2-8°C.

O altă alternativă este de a prepara conjugatul de lucru prin pipetarea întregului conţinut al flaconului de conjugat concentrat (R7a) direct în flaconul de diluant de conjugat (R7b). Soluţia de conjugat de lucru trebuie întotdeauna amestecată prin răsturnare chiar înainte de utilizare.

Imediat după folosire, restul de conjugat concentrat (R7a) se returnează la frigider.

Pentru evitarea contaminării conjugatului, purtaţi mănuşi de unică folosinţă şi nu atingeţi vârfurile pipetelor.

9

Prepararea soluţiei de conjugat în funcţie de numărul de barete folosit

Număr de barete necesar

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12*

24**

Conjugat concentrat R7a (µl)

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

2400

Diluant de conjugat R7b (ml)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

24

* 1 placă completă ** 2 plăci complete

Soluţie de developare a reacţiei enzimatice (R8 + R9) Aduceţi Cromogenul (R9) şi Tamponul substrat (R8) la temperatura camerei. Amestecaţi prin răsturnare ambele soluţii înainte de utilizare. Diluaţi reactivul R9 în reactivul R8 în proporţie de 1 : 11 (exemplu: 1 ml reactiv R9 în 10 ml reactiv R8), ţinând cont că 12 ml sunt necesari şi suficienţi pentru 1-12 barete. Omogenizaţi. Înainte de pipetare amestecaţi cu blândeţe soluţia astfel preparată. Aşteptaţi 5 minute înainte de a o folosi. Soluţia de developare se păstrează la întuneric şi la temperatura camerei, putând fi utilizată în maxim 8 ore de la preparare. Soluţia de developare (cromogenă) trebuie să aibă culoarea roz. Orice altă culoare indică contaminarea reactivului, situaţie în care nu trebuie folosit. Nu preparaţi decât cantitatea de folosit în decurs de 6 ore. Asiguraţi-vă că volumul preparat este suficient pentru testarea în desfăşurare. Pentru volumele de amestecat, ghidaţi-vă după tabelul următor: Prepararea soluţiei de developare enzimatică în funcţie de numărul de barete

Număr de barete necesar

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12*

24**

Cromogen R9 (µl)

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

2400

Tampon substrat R8 (ml)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

24

* 1 placă completă ** 2 plăci complete

9 – PĂSTRAREA REACTIVILOR ŞI VALABILITATEA Înainte de utilizare, trusa se păstrează la +2°-8°C. Dacă se respectă această temperatură, fiecare reactiv din trusă se poate folosi până la data de expirare menţionată pe ambalaj (cu excepţia instrucţiunilor speciale).

• R1 : După deschiderea pungii, baretele păstrate la +2-8°C în ambalajul original resigilat cu grijă, se pot folosi timp de 1 lună.

• R2 : După diluare, soluţia de spălare se păstrează la +2-30°C timp de 2 săptămâni. Soluţia de spălare concentrată (R2) se poate depozita la +2-30°C.

• R7a + R7b : Soluţia de conjugat de lucru trebuie protejată de lumină, atât la temperatura camerei cât şi la +2-8°C. După reconstituire, soluţia de conjugat de lucru se poate folosi în interval de 8 ore la temperatura ambientală (+18-30°C) şi în 24 de ore dacă se păstrează la +2-8°C.

• R8 + R9 : După reconstituire, soluţia de developare de lucru se poate folosi timp de 6 ore, dacă se păstrează la întuneric şi la temperatura ambientală (18-30°C).

După desigilare, toţi ceilalţi reactivi sunt stabili până la data de expirare înscrisă pe cutie, cu condiţia să fie păstraţi la +2-8°C.

10

10 – PROBELE BIOLOGICE Probele de sânge se recoltează în conformitate cu practicile uzuale. Testul se execută pe seruri sau plasmă. Au fost testate numai următoarele tipuri de probe: seruri recoltate în eprubete standard sau eprubete cu gel de separare şi plasmă recoltată cu anticoagulanţi de tip EDTA sau heparină. În cazul plasmei recoltate pe citrat sau ACD, rezultatele sunt mai joase cu 20% faţă de cele obţinute la ser. Probele cu agregate trebuie clarificate prin centrifugare înainte de testare. Agregatele sau particulele de fibrină în suspensie pot produce rezultate fals pozitive. Probele vor fi păstrate la +2-8°C dacă testarea urmează să fie efectuată în decurs de 7 zile, în caz contrar vor fi congelate imediat la -20°C. Evitaţi congelările şi decongelările repetate. Probele congelate şi decongelate mai mult de 3 ori nu se pot folosi. Dacă probele trebuie transportate, împachetaţi-le în conformitate cu reglementările privind transportul agenţilor etiologici şi transportaţi-le de preferinţă congelate REMARCĂ : Probele cu mai mult de 90 g/l de albumină şi bilirubină mai mare de 100 mg/l, probele lipemice cu până la 36 g/l echivalent de trigliceride, ca şi cele hemolizate având până la 2,55 g/l hemoglobină nu afectează rezultatele testării. Nu testaţi probe tratate termic la 56°C timp de 30 de minute.

11 – PROCEDEUL DE TESTARE Respectaţi cu stricteţe procedeul propus. Testaţi serurile de control negativ şi pozitiv în fiecare serie de lucru în vederea validării calităţii testării. Aplicaţi Bunele Practici de Laborator. Metodele 1. Stabiliţi cu atenţie poziţia probelor în placă şi planul de identificare. 2. Aduceţi toţi reactivii la temperatura camerei înainte de începerea procedeului de

testare. 3. Preparaţi soluţia de Conjugat de lucru (R7a + R7b), soluţia de lucru de substrat

(R8 + R9) şi soluţia de spălare de lucru (R2 diluată). 4. Scoateţi cadrul microplăcii şi baretele (R1) din ambalajul protector. Reţineţi

numărul necesar de barete pe cadru, iar în spaţiile goale plasaţi barete virgine (marcate Null Strips).

5. Diluaţi probele, Calibratorii şi controalele la ¾ (pe trei sferturi, ATENŢIE LA EXPLICAŢIILE DE MAI JOS !) cu diluant pentru probe R6, după unul din procedeele următoare. a. Diluarea direct în godeuri: mai întâi pipetaţi câte 25 µl de Diluant pentru

probe R6, apoi 75 µl de probă sau control, apoi omogenizaţi uşor prin cel puţin 2 aspiraţii, evitând spumarea), încadrându-vă în15 minute.

a. Pregătirea diluţiilor înainte de pipetarea în godeuri: de exemplu, pipetaţi 150 µl de probă şi 50 µl de Diluant pentru probe R6, amestecaţi blând pentru evitarea spumării, apoi transferaţi 100 µl în godeu).

NOTĂ: După adăugarea probei, culoarea diluantului se modifică din mov în albastru. Este posibilă verificarea prezenţei probelor în godeuri prin citire spectrofotometrică la 620 nm (consultaţi capitolul 14 : VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR).

6. Adăugaţi direct, fără spălarea prealabilă a plăcii, şi în succesiunea stabilită în funcţie de metoda aleasă:

11

Determinarea calitativă - Control Anti-HBs Negativ (C0) în godeul A1, - Calibrator 10 mUI/ml (C1) în godeurile B1, C1 şi D1, - Calibrator 100 mUI/ml – Control Pozitiv (C2) în godeul E1, - Probele, începând cu godeul F1, G1, şi aşa mai departe. Determinarea cantitativă - Control Anti-HBs Negativ (C0) în godeul A1, - Calibrator 10 mUI/ml (C1) în godeurile B1 şi C1, - Calibrator 100 mUI/ml – Control Pozitiv (C2) în godeul D1, - Calibrator 400 mUI/ml (C3) în godeul E1, - Calibrator 1000 mUI/ml (C4) în godeul F1, - Probele, începând cu godeul G1, H1, şi aşa mai departe. În funcţie de sistemul utilizat, este posibilă modificarea poziţiei controalelor în placă sau a ordinii de pipetare. 7. Acoperiţi dacă se poate cu folie adezivă. Presaţi ferm pe toată suprafaţa plăcii

pentru a asigura etanşeitatea godeurilor. 8. Incubaţi placa timp de 60 ± 5 minute la 37 ± 2°C. 9. Îndepărtaţi folia adezivă. Aspiraţi conţinutul tuturor godeurilor într-un container de

deşeuri lichide şi adăugaţi imediat în fiecare cel puţin 0,375 ml de soluţie de spălare. Lăsaţi în contact 30 până la 60 de secunde (timp de aşteptare) până la următorul ciclu de spălare. Aspiraţi din nou. Repetaţi etapa de spălare de încă 4 ori (în total minim 5 spălări). Volumul rezidual nu trebuie să depăşească 10 µl (la nevoie întoarceţi placa şi tapotaţi-o cu gura în jos pe hârtie absorbantă).

10. Dacă folosiţi un spălător automat, respectaţi acelaşi procedeu de spălare. 11. Pipetaţi rapid 100 µl de soluţie de Conjugat de lucru (R7a + R7b) în fiecare godeu.

Acoperiţi godeurile cu o nouă folie adezivă şi incubaţi 60 ± 5 minute la 37°C ± 1°C. NOTĂ: Conjugatul este de culoare verde. Este posibilă verificarea prezenţei conjugatului în godeuri prin citire spectrofotometrică la 620 nm (consultaţi capitolul 14 : VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR).

12. Îndepărtaţi folia adezivă. Aspiraţi conţinutul tuturor godeurilor într-un container de deşeuri lichide şi adăugaţi imediat cel puţin 0,375 ml de soluţie de spălare în fiecare godeu. Lăsaţi în contact 30 până la 60 de secunde până la următorul ciclu de spălare. Aspiraţi din nou. Repetaţi etapa de spălare de încă 4 ori (minim 5 spălări în total). Volumul rezidual nu trebuie să depăşească 10 µl (la nevoie întoarceţi placa şi tapotaţi-o cu gura în jos pe o hârtie absorbantă).

13. Dacă folosiţi un spălător automat, respectaţi acelaşi procedeu de spălare. 14. Pipetaţi rapid 100 µl de soluţie de lucru de Substrat (R8 + R9) în toate godeurile.

Lăsaţi reacţia să se developeze la întuneric timp de 30 ± 5 minute la temperatura camerei (18 - 30°C). Pe durata acestei incubări NU se foloseşte folie adezivă. NOTĂ: Soluţia de Substrat de lucru are culoarea roz. Este posibilă verificarea prezenţei substratului în godeuri prin citire spectrofotometrică la 490 nm (consultaţi capitolul 14: VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR).

15. Adăugaţi 100 µl de soluţie de Stopare (R10) în aceeaşi ordine şi cu aceeaşi viteză cu care aţi pipetat soluţia de Substrat. Omogenizaţi amestecul de reacţie.

16. Ştergeţi cu atenţie fundul godeurilor. După cel puţin 4 minute de la stoparea reacţiei, dar fără a depăşi 30 de minute de la stopare, citiţi densitatea optică (absorbţia) la 450/620-700 nm şi la 405/620-700 nm folosind cititorul de microplăci.

12

Înainte de a transcrie rezultatele, verificaţi vizual corespondenţa dintre citiri şi microplacă, cu distribuţia probelor în diagrama de placă şi cu planul de identificare.

12 – VALIDAREA REZULTATELOR METODELOR CALITATIVĂ ŞI CANTITATIVĂ Valoarea prag cut-off (CO) corespunde mediei absorbţiei măsurate pentru calibratorul de 10 mUI/ml (C1). Pentru Controlul Anti-HBs Negativ (C0) Absorbţia măsurată trebuie să fie mai mare ca 0,000 şi mai mică sau egală cu 0,070 (0,000 < DOC0 ≤ 0,070). Pentru Controlul Pozitiv (C2) Absorbţia măsurată trebuie să fie mai mare sau egală cu 0,400 (DOC2 ≥ 0,400). Pentru Controlul Negativ (C0) şi Pozitiv (C2), dacă unul din criteriile de validare nu este întrunit la metoda calitativă sau la metoda cantitativă, testul este invalid şi trebuie refăcut. Pentru Calibratorul de 10 mUI/ml (C1) Absorbţia măsurată trebuie să fie superioară sau egală valorii de 0,050 şi inferioară sau egală cu valoarea de 0,200. (0,050 ≤ DOC1 ≤ 0,200). Fiecare valoare a absorbţiei măsurate trebuie să fie mai mare sau egală cu de 1,5 x valoarea absorbţiei Control Negativ (C0) : DOC1 ≥ (1,5 x DOC0).

Pentru metoda calitativă, dacă una din cele 3 valori DOC1 măsurate iese din limitele cerute pentru validare (valoarea DOC1 măsurată trebuie să fie mai mare sau egală cu 0,050 şi mai mică sau egală cu 0,200), se va calcula media folosind cele 2 valori rămase valide. Testarea va fi, prin urmare, validă. Dacă mai multe valori DOC1 măsurate ies din limitele necesare validării, testarea este invalidată şi trebuie repetată.

Pentru metoda cantitativă, dacă una din cele 2 valori cut-off (DOC1) măsurate iese din limitele cerute pentru validare (DOC1 măsurată trebuie să fie mai mare sau egală cu 0,050 şi mai mică sau egală cu 0,200), testarea este invalidă şi trebuie repetată.

13 - CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR Prezenţa sau absenţa anticorpilor anti-HBs se determină comparând absorbţia înregistrată pentru fiecare probă cercetată cu aceea calculată a valorii prag (cut-off).

1. Metoda calitativă

Calculaţi media absorbţiilor măsurate pentru Calibratorul de 10 mUI/ml (C1) Exemplu: Calibrator 10 mUI/ml (C1) DO B1 0,078 C1 0,079 D1 0,089

Total = 0,246

Media DOC1 = 0,246 / 3 = 0,082 Dacă una din valorile DOC1 măsurate iese din limitele de validare menţionate anterior (DOC1 măsurată trebuie să fie mai mare sau egală cu 0,050 şi mai mică sau egală cu 0,200), se va calcula media celor 2 valori rămase valide.

13

Calculul valorii prag cut-off (CO) Valoarea-prag corespunde mediei absorbţiilor (DO) măsurate pentru Calibratorul 10 mUI/ml (C1): CO = Media DOC1

Interpretarea rezultatelor Probele a căror densitate optică (absorbţie) măsurată este mai mare sau egală cu valoarea prag cut-off sunt considerate iniţial reactive. Probele a căror densitate optică (absorbţie) măsurată este mai mică decât valoarea prag cut-off sunt considerate nereactive. Probele a căror densitate optică (absorbţie) măsurată este mai mare decât limita superioară de citire a cititorului de microplăci vor fi considerate reactive. REMARCĂ: În funcţie de diversitatea anticorpilor şi de diversitatea antigenelor folosite în fiecare trusă de testare, rezultatele obţinute pot diferi de la trusă la trusă. Strategii de vaccinare: în funcţie de regiunea geografică şi de ţara vizată se propun recomandări diferite. Dacă se schimbă metoda de analiză pe durata supravegherii rezultatelor vaccinării, în perioada de tranziţie de la o trusă la alta, titrurile anticorpilor anti-HBs trebuie determinate în paralel prin cele două metode.

2. Metoda cantitativă În vederea determinării concentraţiei anticorpilor anti-HBs în probele cercetate (ser sau plasmă), trebuie folosiţi Calibratorii C0 (0 mUI/ml), C1(10 mUI/ml), C2 (100 mUI/ml), C3 (400 mUI/ml) şi C4 (1000 mUI/ml). Calibratorii se pipetează direct în godeuri, fără spălarea prealabilă a microplăcii, şi în succesiunea indicată în protocol (a se consulta Capitolul 11 : Procedeul de testare). Citiţi densităţile optice cu cititorul de microplăci la 450/620-700 nm (A450). Pentru acele probe a căror absorbţie măsurată la 450 nm (A450) este mai mare sau egală cu cea a Calibratorului 400 mUI/ml C3 (A450 ≥ DOC3), citiţi densitatea optică (absorbţia) la 405/620-700 nm.

Absorbţia măsurată la 450 nm (A450) pentru cei 4 calibratori C0, C1, C2 şi C3, se raportează grafic în funcţie de concentraţiile corespunzătoare, alegând regresia polinomială (cvadratică). Valoarea A450 a Calibratorului C4 (1000 mUI/ml) NU poate fi folosită la construirea curbei etalon, deoarece valoarea absorbţiei poate depăşi capacitatea de citire a cititorului, de unde apare şi necesitatea celui de-al doilea grafic. Probele ale căror valori de absorbţie măsurată sunt mai mici decât DOC3 se vor interpreta pe curba construită cu cei patru calibratori, pe baza citirilor la 450 nm.

Absorbţia măsurată la 405 nm (A405) pentru Calibratorii C3 (400 mUI/ml) şi C4 (1000 mUI/ml) se raportează grafic în funcţie de concentraţiile acestora, construind o curbă punct cu punct şi trasând o linie ce uneşte aceste puncte. Concentraţia de anticorpi anti-HBs (mUI/ml) a fiecărei probe cercetate poate fi astfel citită la intersecţia cu curba a valorii absorbţiei acelei probe. Curba construită pe baza absorbţiilor la 405 nm se foloseşte pentru determinarea concentraţiei de anticorpi anti-HBs a probelor (de ser sau plasmă) a căror valoare este mai mare de 400 mUI/ml şi mai mică sau egală cu 1000 mUI/ml.

Probele a căror concentraţie de anticorpi anti-HBs depăşeşte 1000 mUI/ml pot fi diluate folosind soluţia de spălare diluată (R2 diluată) şi retestate pentru a afla concentraţia exactă.

14

14 - VERIFICAREA SPECTROFOTOMETRICĂ A PIPETĂRII PROBELOR ŞI A REACTIVILOR (OPŢIONALĂ)

VERIFICAREA PIPETĂRII DILUANTULUI (R6) ŞI A PROBELOR

După pipetarea probei, diluantul R6 virează de la mov la albastru.

Prezenţa simultană a diluantului R6 şi a probei sau a controlului poate fi verificată prin citire spectrofotometrică la 620 nm: valoarea DO măsurată în fiecare godeu va trebui să fie mai mare sau egală ci 0,150 (o valoare sub norma cerută indică pipetarea necorespunzătoare a probei sau a controlului).

VERIFICAREA PIPETĂRII SOLUŢIEI DE CONJUGAT (R7a + R7b)

Soluţia de conjugat (R7a + R7b) este de culoare verde.

Prezenţa soluţiei de conjugat în godeuri poate fi verificată prin citire spectrofotometrică la 620 nm: valoarea DO măsurată în fiecare godeu va trebui sa fie mai mare sau egală cu 0,070 (o valoare sub norma cerută indică pipetarea necorespunzătoare a soluţiei de conjugat).

VERIFICAREA PIPETĂRII SOLUŢIEI REVELARE ENZIMATICĂ (R8 + R9)

Soluţia de revelare a activităţii enzimatice este de culoare roz.

Este posibil să se verifice prezenţa soluţiei de revelare de culoare roz prin citire automată la 490 nm: un godeu cu soluţie de revelare trebuie să aibă o densitate optică mai mare de 0,100 (o DO mai scăzută indică pipetarea necorespunzătoare a soluţiei de revelare). Se observă o diferenţă semnificativă de culoare între un godeu gol şu unul în care s-a pipetat soluţie de revelare de culoare roz.

15 - LIMITELE METODEI • Pentru detecţia anticorpilor anti-HBs, atât protocolul de lucru cat şi interpretarea rezultatelor trebuie respectate întocmai în vederea analizării probelor de ser sau plasmă. Se recomandă fiecărui utilizator al acestei truse să citească atent prospectul de utilizare înainte de efectuarea oricărei testări. În mod deosebit, protocolul de distribuţie a probelor şi a reactivilor, etapele de spălare, ca şi cele de incubare trebuie riguros respectate. • O proastă distribuţie a probelor sau a reactivilor poate determina rezultate fals negative. Se recomandă retestarea acelor eşantioane pentru care sunt dubii în ceea ce priveşte respectarea protocolului. • Factorii ce ar putea influenţa validitatea rezultatelor sunt: proasta distribuţie a probelor în godeuri, o etapă de spălare ineficientă a godeurilor, temperaturi sau timpi de incubare incorecte, adăugarea unui alt reactiv în godeuri decât cel cerut în etapa respectivă, prezenţa metalelor sau a apei de Javel în godeuri. • Rezultatele cu valori scăzute trebuie interpretate cu precauţie deoarece răspunsurile imune sunt variabile de la un individ la altul, atât cele consecutive unei infecţii cu virusul hepatitei B, cât şi după vaccinare sau administrarea imunoglobulinelor injectabile în scop terapeutic.

11 - PERFORMANŢELE ACESTUI TEST Performanţele analitice următoare au fost obţinute în cursul evaluărilor trusei MONOLISA Anti-HBs PLUS. Rezultatele obţinute în laborator pot fi diferite de cele prezentate în continuare.

15

1. Reproductibilitatea intra-testare : s-au testat 5 probe pozitive şi una negativă de 10 ori în triplu în aceeaşi serie de lucru.

Proba Densitate optică medie DS CV% Anti-HBs Negativ 0,023 0,003 13,6 Anti-HBs Pozitiv ~ 20 mUI/ml 0,143 0,005 3,4 Anti-HBs Pozitiv ~ 50 mUI/ml 0,358 0,012 3,3 Anti-HBs Pozitiv ~ 100 mUI/ml 0,715 0,019 2,6 Anti-HBs Pozitiv ~ 150 mUI/ml 1,231 0,037 3,0 Anti-HBs Pozitiv ~ 300 mUI/ml 1,982 0,048 2,4

2. Reproductibilitatea inter-serii de testare S-au testat în dublu 3 probe pozitive şi una negativă, de două ori pe zi, timp de 20 de zile, după procedeul EP5 NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards)

Proba Densitatea optică medie DS CV% Anti-HBs Negativ 0,023 0,004 15,5 Anti-HBs Pozitiv ~ 20 mUI/ml 0,146 0,008 5,5 Anti-HBs Pozitiv ~ 150 mUI/ml 1,284 0,060 4,9 Anti-HBs Pozitiv ~ 300 mUI/ml 2,015 0,067 3,6

3. Acurateţea Rezultatele cantitative sunt exprimate în mUI/ml şi calibrate în conformitate cu un standard intern care este calibrat la rândul lui faţă de standardul OMS 1st IRP WHO Reference Standard 1977. S-a efectuat un studiu de corelaţie prin testarea concentraţiilor de 0, 10, 100, 400 şi 1000 mUI/ml derivate din standardul internaţional OMS în paralel cu Calibratorii din trusă. Coeficientul de corelaţie şi panta curbei de corelaţie sunt R2 = 0,99 şi a = 0,96.

4. Sensibilitatea analitică a fost sub 2 mUI/ml conform procedeului NCCLS. REMARCĂ: Sensibilitatea analitică corespunde limitei inferioare de detecţie care corespunde celei mai joase concentraţii măsurabile a analitului, diferită de valoarea zero şi calculată pe baza mediilor şi a deviaţiilor standard obţinute cu punctele 0 şi 10 mUI/ml.

5. Liniaritatea metodei S-au testat ca atare şi în diluţii binare de până la 1/32 sau 1/64 cinci (5) probe anti-HBs intens pozitive (cu titruri de 924 mUI/ml, 330 mUI/ml, 326 mUI/ml, 544 mUI/ml şi 857 mUI/ml). Procentele de recuperare au fost cuprinse între 92% şi 116%.

67. Efectul Hook* Pentru studiul efectului de aplatizare a curbei doză-răspuns (rezultat) s-au analizat 4 probe nediluate având concentraţii foarte mari de anticorpi anti-HBs (200000 mUI/ml, 5500 mUI/ml, 28000 mUI/ml şi 9000 mUI/ml).

Concentraţie 200000 mUI/ml 28000 mUI/ml 9000 mUI/ml 5500 mUI/ml

16

78. Specificitatea a) S-au testat cu Monolisa® Anti-HBs PLUS 179 pacienţi cu diferite afecţiuni

(hepatită A, hepatită C, HIV1, HIV2, HTLV, HSV, EBV, Rubeolă, Toxoplasmoză, Mieloame (IgG, IgM), FR, ANA, HAMA, ciroză şi transfuzii multiple). Dintre acestea, 21 de probe au fost testate pozitive atât cu Monolisa® Anti-HBs PLUS cât şi cu alte 2 teste de detecţie a anti-HBs marcate CE. O probă ANA pozitivă a fost găsită anti-HBs pozitivă numai cu trusa Monolisa® Anti-HBs PLUS. Alte 2 probe (1 HIV1 şi 1 HIV2) au fost găsite anti-HBs pozitive şi cu Monolisa® Anti-HBs PLUS şi cu un test de la competitor.

b) Specificitatea trusei Monolisa® Anti-HBs PLUS a fost determinată prin analiza probelor de la donatori de sânge şi de la bolnavi neselecţionaţi.

Centrul 1

Donatori & Spitalizaţi Centrul 2 Donatori

Centrul 3 Spitalizaţi

TOTAL

Număr probe 511 300 240 1051 Număr pozitivi 3 0 3 6 Specificitate % 99,4 100 98,7 99,4

Specificitatea este de 99,4% (98,8% - 99,8% cu un interval de confidenţă de 95%). 89. Sensibilitatea Folosind trusa Monolisa® Anti-HBs PLUS şi un alt test anti-HBs au fost analizate 654 de probe provenite de la diferite grupuri de pacienţi vaccinaţi sau infectaţi natural. Probele discordante au fost testate cu o a treia trusă marcată CE.

Concordanţa Monolisa® Profil pacienţi N Test 1 marcat CE Test 2 marcat CE* Vaccinaţi 347 98,8% 99,1% Hepatită B remisă 71 95,8% 100% Hepatite B cronice 37 100% Netestat Pacienţi spitalizaţi 199 98,6% Netestat Total 654 98,5% 99,5%

Din cei 654 de pacienţi testaţi, 617 au fost găsiţi anti-HBs pozitivi şi 37 negativi (pacienţi cu hepatită cronică) la testarea cu Test 1. Pentru cei 617 pacienţi concordanţa este de 98,4% (interval de confidenţă de 95%, 97% - 99,2%). *Sensibilitatea testului Monolisa® Anti-HBs PLUS evaluată după rezolvarea cazurilor discordante folosind Test 2, este egală cu 99,2% (98,1% - 99,7%, cu un interval de confidenţă de 95%).

17

17 - BIBLIOGRAFIE

1. Lai CL, Ratziu V, Yuen M-F, Poynard T: Viral hepatitis B. Lancet 362 : 2089-2094, 2003. 2. Maddrey WC: Hepatitis B : an important public health issue. J Med Virol 61: 362-366, 2000. 3. Delmonico FL, Snydman DR: Organ donor screening for infectious diseases. Transplantation

65 : 603-610, 1998. 4. Centers for Disease Control : Recommendations for preventing transmission of infections

among chronic hemodialysis patients. MMWR 50 (No. RR-5): 1-43, 2001. 5. Tiollais P, Pourcel C, Dejean A : The hepatitis B virus. Nature 317: 489-495, 1985. 6. Lee WM: Hepatitis B infection. New Engl J Med 337 : 1733-1745, 1997. 7. Mushahwar IK, Dienstag JL, Polesky HF, McGrath LC, Decker RH, Overby LR Interpretation

of various serological profiles of hepatitis B virus infection. Am J Clin Pathol 76: 773-777, 1981.

8. McMahon BJ, Alward WLM, Hall DB, et al.: Acute hepatitis B infection: relation of age to the clinical expression of disease and subsequent development of the carrier state. J Infect Dis 151: 599-603, 1985.

9. Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM: Serologic diagnosis of acute and chronic viral hepatitis. Semin Liver Dis 11: 73-83, 1991.

10. 10.Centers for Disease Control: Hepatitis B vaccination—United States, 1982-2002. MMWR 51(No.25): 549-563, 2002.

11. Yu AS, Cheung RC, and Keefe EB : Hepatitis B vaccines. Clin Liver Dis 8: 283-300, 2004. 12. Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schuurs AHWM : 3,3',5,5' - tetramethylbenzidine as

an ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J Immunoassay 2 : 187-204, 1981.

13. Garner RC, Walpole AL, Rose FL : Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1 : 39-42, 1975.

14. Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, Ebert JW : Inactivation of hepatitis B virus by intermediate to high-level disinfectant chemicals. J Clin Microbiol 18: 535-538, 1983.

15. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Solid Waste : EPA Guide for Infectious Waste Management, Washington D.C., 1987. (USG PO 530-SW-86-014).

16. Sehulster LM, Hollinger FB, Dreesman GR, Melnick JL : Immunological and biophysical alteration of hepatitis B virus antigens by sodium hypochlorite disinfection. Appl and Envi Microbiol 42 : 762-767, 1981.

(GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)(FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro)(ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)(IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)(DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)(PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro)(SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik)(DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)(GR) - ����������� CE ( �������� ������ 98/79/CE � �� in vitro ��������� � ������ � �� � �)(PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro)(LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų)(HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről)(EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta)(SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy)(CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro)(NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk)(RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro)(BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия)

IVD

(GB) - For in vitro diagnostic use(FR) - Pour diagnostic in vitro(ES) - Para diagnóstico in vitro(IT) - Per uso diagnostico in vitro(DE) - In-vitro-Diagnostikum(PT) - Para uso em diagnóstico in vitro(SE) - In vitro-diagnostik(DK) - In vitro diagnose(GR) - ��� in vitro ���������� ����(PL) - Do stosowania in vitro(LT) - in vitro diagnostikai(HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra(EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks(SK) - Na diagnostiku in vitro(CZ) - Pro diagnostiku in vitro(NO) - Til in vitro-diagnostikk(RO) - Pentru diagnostic in vitro(BG) - За ин витро диагностика

(GB) - Catalogue number(FR) - Référence catalogue(ES) - Número de catálogo(IT) - Numero di catalogo(DE) - Bestellnummer(PT) - Número de catálogo(SE) - Katalognummer(DK) - Katalognummer(GR) - ������ ���������(PL) - Numer katalogu(LT) - Katalogo numeris(HU) - Cikkszám(EE) - Katalooginumber(SK) - Katalógové číslo(CZ) - Katalogové číslo(NO) - Katalognummer(RO) - Număr de catalog(BG) - Каталожен номер

(GB) - Manufacturer(FR) - Fabricant(ES) - Fabricante(IT) - Produttore(DE) - Hersteller(PT) - Fabricante(SE) - Tillverkad av(DK) - Fremstillet af(GR) - ����� �����(PL) - Producent(LT) - Gamintojas(HU) - Gyártó(EE) - Tootja(SK) - Výrobca(CZ) - Výrobce(NO) - Produsent(RO) - Producător(BG) - Производител

(GB) - Authorised Representative(FR) - Représentant agréé(ES) - Representante autorizado(IT) - Distributore autorizzato(DE) - Bevollmächtigter(PT) - Representante Autorizado(SE) - Auktoriserad representant(DK) - Autoriseret repræsentant(GR) - ���������� ��� �����������(PL) - Upoważniony Przedstawiciel(LT) - Įgaliotasis atstovas(HU) - Meghatalmazott Képviselő(EE) - Volitatud esindaja(SK) - Autorizovaný zástupca(CZ) - Zplnomocněný zástupce(NO) - Autorisert representant(RO) - Reprezentant autorizat(BG) - Упълномощен представител

(GB) - Batch code(FR) - Code du lot(ES) - Código de lote(IT) - Codice del lotto(DE) - Chargen-Bezeichnung(PT) - Código do lote(SE) - Batchnr(DK) - Batchkoden(GR) - ������� ��������(PL) - Numer serii(LT) - Serijos numeris(HU) - Gyártási szám(EE) - Partii kood(SK) - Číslo šarže(CZ) - Číslo šarže(NO) - Partikode(RO) - Număr de lot(BG) - Партиден номер

(GB) - Expiry date YYYY/MM/DD(FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ(ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD(IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG(DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT(PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD(SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD(DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD(GR) - � ������ ����� YYYY/MM/DD(PL) - Data ważności YYYY/MM/DD(LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD(HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN(EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP(SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD(CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD(NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD(RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ(BG) - Срок на годност година/месец/ден

(GB) - Storage temperature limitation(FR) - Limites de températures de stockage(ES) - Temperatura límite(IT) - Limiti di temperatura di conservazione(DE) - Lagertemperatur(PT) - Limites de temperatura de armazenamento(SE) - Temperaturbegränsning(DK) - Temperaturbegrænsning(GR) - � ������� � �������� ������ ���(PL) - Temperatura przechowywania(LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai(HU) - Tárolási hőmérsékleti határok(EE) - Piirangud säilitustemperatuurile(SK) - Skladovacia teplota od do(CZ) - Teplotní rozmezí od do(NO) - Oppbevaringstemperatur(RO) - Limitele de temperatură la stocare(BG) - Температурни граници на съхранение

(GB) - Consult Instruction for use(FR) - Consulter le mode d'emploi(ES) - Consulte las instrucciones de uso(IT) - Consultare le istruzioni per uso(DE) - Siehe Gebrauchsanweisung(PT) - Consulte o folheto informativo(SE) - Se bruksanvisningen(DK) - Se instruktion før brug(GR) - ������ �� �� ��� ����� � �����(PL) - Sprawdź instrukcję(LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje(HU) - Olvassa el a használati utasítást(EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni(SK) - Katalógové číslo(CZ) - Viz návod k použití(NO) - Se bruksanvisninger(RO) - Consultati prospectul de utilizare(BG) - Виж инструкцията за употреба

Bio-Rad3, bd Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette - FranceTél.: +33 1 47 95 60 00 09/2009Fax.: +33 1 47 41 91 33 Code: 883582