1

Universitatea Babeş-Bolyai Cluj-Napoca Facultatea de ŞtiinŃa şi Ingineria Mediului

TEHNOLOGII AVANSATE DE BIOREMEDIERE

SUPORT DE CURS SI LUCRARI PRACTICE

pentru

Specializarea Ingineria Sistemelor Biotehnice şi Ecologice

Titular:

Şef de lucrări dr.biolog Malschi Dana, Membru asociat al Academiei de ŞtiinŃe Agricole şi Silvice

2014-2015

2

Tehnologii avansate de bioremediere

Curs / ISBE 4 /2014-2015 Cuprins: Introducere in problematica tehnologiilor de bioremediere. Fisa disciplinei. Tematica. Cap. 1 . Biodegradarea şi extractia biologica a hidrocarburilor poluante.......................................6

1.1. Biodegradarea hidrocarburilor poluante sub actiunea microorganismelor...........6 1.1.1. Procesele de biodegradare a hidrocarburilor sub actiunea microorganismelor... 1.1.2. Bioremedierea cu ajutorul comunităŃilor microbiene…………………………….

1.1.3. CondiŃiile de aplicare a bioremedierii hidrocarburilor in situ in functie de : Structura chimică a poluanŃilor. Nutrientii. Caracteristicile solului. Biodisponibilitatea poluanŃilor. ……

1.2. Metode de bioremediere a solurilor contaminate cu hidrocarburi. 1.2.1. Metode de tratare a solurilor contaminate cu hidrocarburi (Atenuarea naturală monitorizată. Fitoremedierea. Tratarea cu ajutorul terenului agricol. Compostarea). 1.2.2.Principiile proceselor de bioremediere a solurilor contaminate cu hidrocarburi. 1.2.3.Factori care afectează biodegradarea solurilor poluate cu hidrocarburi (Densitatea populatiilor microbiene. Reactia solului. Concentratia elementelor nutritive. Continutul de apă al solului.)

Cap 2. Extractia biologica a metalelor grele.........................................................................................23 2.1. Metode biologice pentru determinarea gradului de toxicitate a solurilor.............. 2.2. Metode de bioremediere a solurilor contaminate cu metale grele.........................

Estimarea gradului de poluare a solurilor şi a eficienŃei tehnologiilor de remediere. Izolarea microorganismelor cu potenŃial ridicat de bioremediere. Rolul microorganismelor în fixarea sau mobilizarea metalelor în sol. Modele experimentale de bioremediere a solurilor contaminate. Bioremedierea solurilor contaminate cu metale grele, in-situ.

2. 3. Bioremedierea solurilor contaminate cu metale grele cu ajutorul plantelor.......26 Metode de fitoremedier. FitoextracŃia. Fitostabilizarea.

Cap. 3. Bioremedierea solurilor contaminate cu SO2, 3.1. Surse de dioxid de sulf. 3.2.Efectele poluării cu dioxid de sulf. Efecte asupra sǎnǎtǎŃii populaŃiei şi animalelor, plantelor, mediului. 3.3. Bioremedierea solurilor contaminate cu dioxid de sulf.

Cap. 4. Depoluarea solurilor contaminate in activităŃile industriei metalurgice 4.1.Metode de depoluare a solului.

4.2.Biotehnologii de remediere a mediului poluat de activitatile metalurgice Cap.5. Evaluarea ecotoxicitatii solului.

Solul ca substrat pentru microorganisme. Solul ca substrat pentru creşterea plantelor. Colectarea, transportul, depozitarea şi prepararea probelor. Prelucrarea datelor şi interpretarea statistică. Metode pentru determinarea ecotoxicitatii solului. Determinarea efectelor poluanŃilor asupra florei solului – Metodă pentru măsurarea creşterii rădăcinilor: IDT ISO 11269-1:1993. Determinarea efectului substanŃelor adăugate: ISO 11269. Calitatea solului – Determinarea efectelor poluanŃilor asupra florei

Cap. 6. Biomonitoringul poluării în mediu terestru si acvatic

Cap. 7. Tehnologii de reconstructie ecologica a siturilor degradate sau poluate industrial Plante ierboase utilizate în recultivarea terenurilor degradate. Arbori şi arbuşti utilizati in recultivarea terenurilor degradate. Speciile amelioratoare de sol (fixatoare de azot). Impădurirea haldelor. Lucrări de ameliorare a condiŃiilor pentru instalarea şi dezvoltarea vegetaŃiei forestiere.

Cap. 8. Biotehnologii de remediere a apelor poluate. Bibliografie.

3

FIŞA DISCIPLINEI

1. Date despre program 1.1 InstituŃia de învăŃământ superior Universitatea Babeş-Bolyai Cluj-Napoca 1.2 Facultatea ŞtiinŃa şi ingineria mediului 1.3 Departamentul Analiza si ingineria mediului 1.4 Domeniul de studii Ingineria mediului. Specializarea Ingineria sistemelor biotehnice si ecologice 2. Date despre disciplină 2.1 Denumirea disciplinei Tehnologii avansate de bioremediere 2.2 Titularul activităŃilor de curs Şef de lucrări dr.biolog Malschi Dana, CS I / membru asociat ASAS 2.3 Titularul activităŃilor de seminar Şef de lucrări dr.biolog Malschi Dana, CS I / membru asociat ASAS 2.4 Anul de studiu 4 2.5 Semestrul 1 2.6. Tipul de evaluare Colocviu 2.7 Regimul disciplinei Opti

onal

CompetenŃele specifice acumulate

Com

pete

nŃe

prof

esio

nale

Dobândirea competenŃelor importante pentru:

• Elaborarea bio- şi eco-tehnologiilor; • ReconstrucŃia ecologică prin bioremedierea şi recultivarea zonelor degradate, haldelor de steril, a

siturilor industriale şi urbane degradate. • Bioremedierea zonelor şi ecosistemelor degradate prin depoluare biologică: biotransformări,

biodegradări, bioacumulare, fitoextractie etc.

Com

pete

nŃe

tran

sver

sale

Dobândirea competenŃelor pentru:

• Elaborarea biotehnologiilor de protecŃie şi inginerie a mediului, • Managementul si controlul poluării industriale, agricole, silvice, urbane, • Valorificarea şi utilizarea resurselor naturale de biodiversitate pentru dezvoltarea durabilă

a mediului. Obiectivele disciplinei (reieşind din grila competenŃelor acumulate)

Tematica 8.1 Curs „Tehnologii avansate de bioremediere” (Teme) CAP. I. NoŃiuni de bază privind bioremedierea ecosistemelor naturale şi antropizate.

1. Obiectivele disciplinei. Introducere in problematica tehnologiilor de bioremediere. Biodegradarea poluanŃilor sub acŃiunea microorganismelor. Bioremedierea cu ajutorul comunităŃilor microbiene.

2. Diagnosticul poluării. Norme de calitate a apelor, aerului şi solurilor. 3. Indicatori biologici de poluare. Bioindicatori în mediul acvatic. Bioindicatori in mediul terestru. LegislaŃia de mediu privind metodele de evaluare a poluării prin bioindicatori. 4. Bioremedierea prin depoluarea şi biodegradarea substanŃelor organice.

CAP II. Tehnologii de bioremediere pentru depoluarea şi restaurarea biotopurilor şi ecosistemelor degradate. 5. Bioremedierea ecosistemelor acvatice (zone umede, râuri, lacuri, mări, estuare). Biotehnologii de remediere a apelor poluate. Epurarea biologică a apelor. Bioremedierea apelor subterane, contaminate şi a apelor uzate cu ajutorul microorganismelor (bacterii, cianobacterii, fungi) şi plantelor superioare. 6. Bioremedierea ecosistemelor terestre naturale şi antropizate. 7. Bioremedierea solurilor contaminate prin biodegradarea compusilor organici sintetici. 8. Bioremedierea solurilor contaminate cu hidrocarburi. Principiile proceselor de bioremediere a solurilor

contaminate cu hidrocarburi. Factori care afectează biodegradarea solurilor poluate cu hidrocarburi (Densitatea populatiilor microbiene. Reactia solului. Concentratia elementelor nutritive. Continutul de apă al solului.).

9. Bioremedierea solurilor contaminate cu metale grele. Metode de bioreremediere a solurilor şi substratelor

7.1 Obiectivul general al disciplinei

• Acumularea cunoştinŃelor avansate privind tehnologiile de bioremediere a calităŃii mediului utilizând factori biotici şi resurse de biodiversitate. Aceste cunoştinŃe sunt utile specialiştilor pentru înŃelegerea importanŃei elaborării strategiilor managementului integrat de mediu, incluzând şi biotehnologiile de depoluare, în contextul asigurării dezvoltării durabile a vieŃii.

7.2 Obiectivele specifice

• Insuşirea cunoştinŃelor teoretice şi practice privind bioremedierea mediului, în zone afectate de factori distructivi, în ecosisteme naturale şi antropizate;

• Dobândirea competenŃelor necesare pentru analiza şi evaluarea principalelor cazuri de dezechilibru şi disfuncŃionalităŃi naturale şi antropice şi pentru elaborarea biotehnologiilor adecvate de bioremediere.

4

contaminate cu metale grele. Bioremedierea cu ajutorul comunităŃilor microbiene. Bioremedierea solurilor contaminate cu metale grele, in-situ si ex-situ.

10. Bioremedierea solurilor contaminate cu dioxid de sulf. CAP.III. ReconstrucŃia ecologică prin bioremedierea şi recultivarea zonelor degradate.

11. Tehnologii de reconstructie ecologica prin bioremedierea si revegetarea siturilor degradate sau poluate industrial, a haldelor de steril, iazurilor de decantare, realizarea solurilor tehnogene.

12. Recultivarea depozitelor de deşeuri urbane, industriale. 13. Evaluarea ecotoxicitatii solului. Metode pentru determinarea ecotoxicitatii solului. Metode de estimare a

eficienŃei tehnologiilor de remediere. Solul ca substrat pentru microorganisme. Solul ca substrat pentru creşterea plantelor.

14. ImportanŃa tehnologiilor de bioremediere aplicate la mediu. 8.2 Seminar / laborator (Teme / indici după lista bibliografică)

CAP. I. NoŃiuni de bază privind bioremedierea ecosistemelor naturale şi antropizate, a zonelor degradate.

1. Tehnologii de aplicare a bioremedierii in situ şi ex situ. 2. Analiza sistemică în ecologie. Bioacumularea poluanŃilor în sisteme vii 3. Metode biologice pentru determinarea toxicitatii solurilor şi evaluarea tehnologiilor de bioremediere. 4. Analize microbiologice: grupe ecofiziologice de bacterii. Procese enzimatice în biodegradare. Testele de

biodegradabilitate .

CAP II. Tehnologii de bioremediere pentru depoluarea şi restaurarea biotopurilor şi ecosistemelor degradate. 5. Indepărtarea metalelor grele din ape poluate şi din levigate ale solurilor contaminate cu ajutorul

cianobacteriilor. Bioremedierea prin zone de inundare artificiale sau zone umede construite (asociate de

plante acvatice, fungi şi microorganisme) pentru tratarea apelor uzate sau a eluatelor din soluri contaminate

cu metale grele. 6. Biotehnologii de remediere în pajişti, fănaŃe, culturi agricole, plantaŃii, păduri. 7. Studiul şi analiza microbiotei depoluante. Indicatori bacteriologici şi enzimologici de calitate a solului expus

tehnologiilor de bioremediere. Metode biologice de bioremediere şi depoluare a solurilor. Metode biologice

de imobilizare şi de extracŃie a poluanŃilor. 8. Metode de tratare a solurilor contaminate cu hidrocarburi. Biodegradarea hidrocarburilor poluante sub

actiunea microorganismelor. CondiŃiile de aplicare a bioremedierii hidrocarburilor in situ şi ex situ.

Atenuarea naturală monitorizată. Fitoremedierea. Tratarea cu ajutorul terenului agricol. Compostarea. 9. Rolul microorganismelor în fixarea sau mobilizarea metalelor în sol.Utilizarea plantelor şi

microorganismelor la extractia biologica a metalelor grele din soluri contaminate.FitoextracŃia.

Fitostabilizarea. Biomonitoringul poluării solului cu metale grele. 10. Microorganisme implicate în oxidarea sulfului din sol. CAP.III. ReconstrucŃia ecologică prin bioremedierea şi recultivarea zonelor degradate. 11. Plante ierboase utilizate în recultivarea terenurilor degradate. AsociaŃii de arbori şi arbuşti utilizati in

recultivarea terenurilor degradate. 12. Recultivarea depozitelor de deşeuri urbane industriale. Speciile amelioratoare de sol (fixatoare de azot).

Impădurirea haldelor. Lucrări de ameliorare a condiŃiilor pentru instalarea şi dezvoltarea vegetaŃiei

forestiere. 13. Metode de estimare a eficienŃei tehnologiilor de remediere. Solul ca substrat pentru microorganisme si

plante. Colectarea, transportul, depozitarea şi prepararea probelor. Prelucrarea datelor şi interpretarea statistică.Efectele poluanŃilor asupra florei solului – Metodă pentru măsurarea creşterii rădăcinilor: IDT

ISO 11269-1:1993. Determinarea efectului substanŃelor adăugate: ISO 11269. Calitatea solului –

Determinarea efectelor poluanŃilor asupra florei. 14. ImportanŃa tehnologiilor de bioremediere. Colocviu-prezentarea/analiza proiectului.

Tematica pentru proiect

1. Depoluarea biologică prin fitoextracŃia poluantilor (metale grele, coloranti, ftalati etc.). 2. Utilizarea unor plante acvatice (Lemna minor s.a.) pentru bioremedierea apelor poluate 3. Fitoremedierea (cu Lolium perenne etc.) a solurilor poluate 4. Bioremediere şi reconstrucŃie ecologică pe halde de steri, iazuri de decantare miniere,. 5. Bioremediere şi reconstrucŃie ecologică pe halde de deseuri urbane, chimice etc. 6. Utilizarea unor biotehnologii in combaterea integrata a dăunătorilor plantelor de cultură. Studii de caz

7. Metode de fitoremediere a apelor poluate industrial - Batalul Şomîrd-Mediaş, jud.Sibiu 8. Tehnologii de reconstrucŃie ecologică prin bioremediere a iazurilor de decantare la exploataŃia minieră Rodna, jud. BistriŃa –Năsăud“ 9. Reconstructia ecologică prin bioremediere a haldelor de steril in zona miniera Baia-Borsa, jud. Maramureş.

5

10. Reconstructia ecologică prin bioremediere in zona poluata istoric a exploataŃiei miniere Bloaja BăiuŃ, Maramureş. 11. FitoextracŃia de metale grele din apele acide din zona Certej/Muntii Metaliferi/Deva, jud.Hunedoara. 12. Reabilitare ecologică a poluarii istorice în arealul metalurgic Zlatna - fosta uzina de prelucrare a cuprului ampelum S.A./O.S. Abrud. 13. Tehnologii de reconstrucŃie ecologică în perimetrul exploataŃiei miniere Roşia Montană. 14. Tehnologii de bioremediere a haldelor de steril din zona minieră auríferă Baia-Mare. 15. Evaluarea riscului ambiental şi reconstrucŃia ecologică în perimetrul exploataŃiei miniere de sulf Călimani, jud. Suceava. 16. Managementul ecologic al exploataŃiei miniere Fundu-Moldovei, Jud.Suceava. 17. Bioremedierea terenurilor si apelor poluate din perimetrul platformei de deşeuri a Combinatului chimic Târnăveni 18. Tehnologii de decontaminare biologică a solului poluat cu petrol in perimetrul exploataŃiei petroliere Suplacul de Barcău. 19. Bioremediere şi reconstrucŃie ecologică pe zona poluata industrial a pârâului Cugir, jud.Alba. 20. Biotehnologiile de depoluare a apelor uzate la StaŃia de epurare BistriŃa. 21. Ecotehnologii de reîmpădurire dupa defrişări in zona Luduş-Târnăveni. 22. Beneficiile ambientale ale bio si ecotehnologiilor in agroecosistemul cu perdele forestiere de protectie antierozionala Cean-BolduŃ din Câmpia Transilvaniei sub aspectul impactului de mediu, evaluarii riscului si securitatii productiei agricole. 23. Utilizarea unor biotehnologii in combaterea integrata a dăunătorilor plantelor de cultură. 24. Utilizarea feromonilor in managementul integrat al lepidopterelor la cultura porumbului. 25. Depoluarea biologică prin fitoextracŃia poluantilor (metale grele, coloranti, ftalati etc.). 26. Utilizarea unor plante acvatice (Lemna minor) pentru bioremedierea apelor poluate 27. Fitoremedierea (cu Lolium perenne L.) a solurilor poluate Proiectul = un referat stiintific de aprox. 10 pagini, cu documentatie mentionata in text si in Bibliografie, predat in format ppt pentru prezentare si listat/indosariat.

• Bibliografie 1. Cristea, V., Simone Denaeyer, 2004. De la biodiversitate la OGM-uri? Colectia Universitas Seria Biologie, Ed. Eikon, Cluj-Napoca. 2. DenuŃ I. (Eds.), 2000. Reabilitarea Ecologică si Managementul Siturilor Degradate De Industria Minieră. Ed. Univ.De Nord, Baia-Mare 3. Elena Gavrilescu, 2006. Evaluarea Ecosistemelor Acvatice. Ed. Sitech, Craiova. 4. Ghidra V. 2004. Ecotoxicologia Si Monitorizarea Principalilor Poluanti. Ed. Studia. Cluj -Napoca 5. Kiss Şt. Ştefanic Gh., Daniela Paşca, Dragan-Bularda M., Eva Zborovschi, Crişan R., 1991. Enzimologia Mediului Înconjurător. Enzimele Şi Fertilitatea Solului. Vol. I. Ed. Ceres, Bucureşti 6. Kiss Ştefan, Dragan-Bularda Mihail, Daniela Paşca, 1993. Enzimologia Mediului Înconjurător. Enzimologia Solurilor Tehnogene. Vol. Ii. Ed. Ceres, Bucureşti 7. Oros V. 2002. Reabilitare Ecologica A Siturilor Degradate Industrial. Ed.Univ.Transilvania, Brasov 8. Malschi Dana, 2009. Integrated Pest Management In Relation To Environmental Sustainability. Part I. Ecological Management Of Wheat Pests. Course Notes And Practical Applications. Manual Online. Faculty Of Environmental Sciences, Babeş-Bolyai University, Cluj-Napoca. Bioflux Publishing House, P. 200. Http://Www.Editura.Bioflux.Com.Ro/Carti-2009/ 9. Malschi Dana, 2009. Biotehnologii Si Depoluarea Sistemelor Ecologice. (Tehnologii De Depoluare Biologica,Tehnologii De Bioremediere. Reconstructia Ecologica). Note De Curs Si Aplicatii Practice. Manual In Format Electronic. Facultatea De Stiinta Mediului. Universitatea Babes-Bolyai. Editura Bioflux, Cluj-Napoca. P. 200. 978-606-92028-5-2. Http://Www.Editura.Bioflux.Com.Ro/Carti-2009/ . 10. MALSCHI DANA, 2011, Caiet de practică pentru laboratorul didactic de biotehnologii, format electronic, http://enviro.ubbcluj.ro/cercetare/laboratoare/Laborator de biotehnologii.php/.

MALSCHI DANA, 2014. Indrumar de lucrari practice “Biotehnologii si depoluarea sistemelor ecologice”, format electronic, http://enviro.ubbcluj.ro/cercetare/laboratoare/Laborator de biotehnologii.php/ Evaluare Tip activitate 10.1 Criterii de evaluare 10.2 metode de evaluare 10.3 Pondere

din nota finală 10.4 Curs Colocviu /prezentare proiect Colocviu 50 % 10.5 Seminar/laborator PrezenŃă, răspunsuri,

proiect.

Notare pe parcurs şi proiect.

50 %

6

Cap. 1. Biodegradarea şi extractia biologica a hidrocarburilor poluante. Bibliografie: *** (http://www.resolmet.utcluj.ro. Raport RESOLMET, contract 32161 / 2008) *** (http://www.dsmz.de/strains/degradtn.htm. DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany. DSMZ - Degradation (including Fermentation, Oxidation, Utilization) Importanta hidrocarburilor poluante

Hidrocarburile sunt un grup de compuşi ce conŃin H şi C. Reprezintă cel mai important

grup de substanŃe chimice datorită abundenŃei lor, importanŃei industriale, folosirii lor ca sursă primară de energie, dar şi datorită toxicităŃii.

Hidrocarburile petroliere sunt substanŃe chimice naturale folosite de către om pentru o mulŃime de activităŃi, incluzând carburanŃi pentru vehicule şi încălzirea locuinŃelor.

Gazul natural, petrolul brut, smoala şi asfaltul sunt tipuri de hidrocarburi petroliere ce conŃin în proporŃii diferite

o alcani (metan, etan, propan), o hidrocarburi aromatice (ex. benzen, toluen, etilbenzen şi xilen, grupă

cunoscută sub numele de BTEX) şi o hidrocarburi policiclice aromatice (PAH, ex. naftalen, fenantren,

antracen, benzo(a)pyren) (Frick şi colab, 1999). Poluarea cu hidrocarburi este cauzată de erupŃii, accidente in timpul procesului de extracŃie

şi transport, accidente asupra conductelor de transport a produselor finite (benzină şi motorină), etc. În funcŃie de direcŃia de deplasare a poluantului, pot fi identificate trei tipuri de poluare: o poluare descendentă, produsă de erupŃii, deversarea din careul sondei, spargerea

conductelor şi bazinelor de stocare, etc.; o poluare ascendentă, produsă de ridicarea nivelului apei freatice încărcată cu

hidrocarburi, şi o poluare suprapusă, provocată de amestecul celor două forme de poluare prezentate. Hidrocarburile formează un film impermeabil la suprafaŃa solului, care impiedică circulaŃia

apei şi schimbul de gaze, provocând sufocarea rădăcinilor şi favorizând procesele de reducere. Pe măsură ce mediul devine mai anaerob, numărul şi activitatea metabolică a bacteriilor se reduce.

ExistenŃa hidrocarburilor în solurile cultivate afectează germinaŃia seminŃelor, creşterea plantelor şi producŃia. La contact, hidrocarburile pot penetra seminŃele şi pot omorî embrionul ori afecta germinaŃia prin reducerea fluxului de apă către seminŃe ori prin descreşterea oxigenului necesar pentru germinare.

Deoarece petrolul este bogat în carbon, raportul C:N din sol creşte, având o influenŃă negativă asupra activităŃii microbiologice şi nutriŃiei plantelor cu azot (Overcash şi Pal, 1979). O severă salinizare a solului poate avea loc acolo unde apare poluarea cu hidrocarburi şi apă sărată; o creştere alarmantă a sodiului schimbabil poate fi înregistrată.

Cercetările au evidenŃiat că, în condiŃii climatice normale, fără irigaŃii, ar trebui 5-10 ani pentru a putea îndepărta din sol elementele poluante.

În ultimele decenii au fost instalate sute de mii de bazine de stocare subterane (şi bazine de stocare la suprafaŃa solului) conŃinând produse petroliere şi substanŃe chimice periculoase. Multe din aceste bazine au fost abandonate ori şi-au depăşit perioada de viaŃă activă şi sunt părăsite, constituind un risc serios pentru aprovizionarea cu apă de suprafaŃă şi subterană, dar şi pentru bunăstarea şi sănătatea publică.

La sfârşitul anului 1996, in România, 45,1% din populaŃie trăia in zona rurală. Pentru aceştia, aprovizionarea cu apă potabilă se făcea din freaticul superficial. Mici cantităŃi de benzină scursă din tancurile petroliere subterane sau de suprafaŃă pot contamina milioane de litri de apă freatică potabilă cu substanŃe considerate a fi cancerigene, cum este benzenul.

7

Benzina, exceptând componenŃii care conŃin sulf, oxigen şi azot, este un amestec de hidrocarburi. În orice benzină comercială există mai mult de 100 de hidrocarburi diferite în proporŃii variate. Compuşii aromatici (benzen şi toluen), alcanii (n-hexan) şi alte molecule cu mai mult de 8 atomi de carbon sunt componentele principale ale benzinei.

Hidrocarburile aromatice ca benzenul şi toluenul au coeficienŃi de partiŃie aer- apă mici şi vor tinde să se repartizeze în faza apoasă. Alcanii ca n-hexanul au coeficienŃi de partiŃie aer - apă mari, determinând repartiŃia lor în aer. Ciclohexanul şi 1-hexanul reprezintă hidrocarburile cu coeficienŃi de partiŃie intermediari.

În Ordinul Ministrului Apelor, Pădurilor şi ProtecŃiei Mediului nr.756 din 3 noiembrie 1997 pentru aprobarea Reglementării privind evaluarea poluării mediului, sunt prezentate ca valori ghid pentru conŃinutul total de hidrocarburi petroliere în sol următoarele:

o valori normale: mai puŃin de 100 mg/kg; o valori de alertă pentru soluri sensibile: 200 mg/kg; o valori de alertă pentru soluri mai puŃin sensibile: 1.000 mg/kg; o valori de intervenŃie pentru soluri sensibile: 500 mg/kg; o valori de intervenŃie pentru soluri mai puŃin sensibile: 2.000 mg/kg.

Solurile sensibile includ toate solurile din zonele rezidenŃiale şi recreaŃionale, solurile folosite pentru scopuri agricole şi solurile din zonele nedezvoltate.

Solurile mai puŃin sensibile includ toate solurile cu folosinŃă comercială şi industrială şi suprafeŃele de teren care vor căpăta o astfel de folosinŃă în viitorul apropiat.

Estimarea intensităŃii gradului de încărcare a solului cu petrol (după Toti şi colab., 1999) este următorul:

o sub 0,1%: extrem de slab încărcat; o 0,1-0,2%: foarte slab încărcat; o 0,2-0,4%: slab încărcat; o 0,4-0,5%: slab-moderat încărcat; o 0,5-1,0%: moderat încărcat; o 1,0-5,0%: puternic încărcat; o 5,0-10,0%: foarte puternic încărcat; o peste 10,0%: excesiv încărcat.

1.1. Biodegradarea poluantilor de tipul hidrocarburi sub actiunea microorganismelor

ProducŃia la scară largă, procesarea şi utilizarea chimicalelor au dus la grave contaminări a

suprafeŃei solului şi subsolului cu o gamă largă de hidrocarburi periculoase şi toxice. Astfel de hidrocarburi, sintetizate în cantităŃi mari, sunt:

o bifenolii-policloruraŃi (PCB), tricloretilenă (TCE) şi alŃii, care diferă foarte mult de compuşii organici naturali prin structura chimică, şi sunt denumite substanŃe xenobionte datorită faptului că nu pot fi biodegradate uşor;

o hidrocarburile aromatice policiclice (PAH), care sunt de asemenea toxice şi datorită masei moleculare mari (cu patru sau mai multe cicluri aromatice în structură) sunt nebiodegradabile sau greu biodegradabile. Hidrocarburile aromatice policiclice (PAH), produse din combustia incompletă a materialelor organice naturale şi a hidrocarburilor, apar în sol ca rezultat al incendiilor naturale din păduri. Intensificarea proceselor industriale producătoare de energie, inevitabila producere de reziduuri şi produse secundare ca PAH, au condus la serioase contaminări ale solului în zonele industriale.

Cercetarile actuale (după DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) precizeaza numeroase specii de microorganisme care pot degrada TCE, PCB, PAH:

8

Bacterii: Trichloroethylena (TCE): Desulfitobacterium hafniense, Burkholderia cepacia Burkholderia kururiensis, Desulfuromonas chloroethenica, Janibacter terrae. Pseudomonas putida, Rhodococcus ruber, Wautersia numazuensis. Biphenyl: Burkholderia xenovorans, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Cupriavidus necator, Rhodococcus opacus, Rhodococcus ruber, Novosphingobium aromaticivorans, Sphingomonas sp. , Novosphingobium stygium , Novosphingobium subterraneum , Sphingobium yanoikuyae, Thamnostylum piriforme, Biphenyli: Yarrowia lipolytica. PAH : Mycobacterium vanbaalenii. Fungi: PAH : Coriolopsis floccosa, Dichomitus squalens, Fomitopsis spraguei, Ganoderma lucidum, Irpex lacteus, Lentinus crinitus, Lentinus sp., Oligoporus sp. , Phanerochaete chrysosporium, Phellinus gilvus, Pleurotus eryngii , Stropharia rugosoannulata, Trametes villosa , Trichaptum byssogenus. (după www.dsmz.de/strains/degradtn.htm. DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany. DSMZ - Degradation (including Fermentation, Oxidation, Utilization)

Produsele chimice organice. Acumularea în mediu, în special în sol, a produselor chimice organice, are o importanŃă

deosebită datorită toxicităŃii lor, inclusiv acŃiunea cancerigenă, dar şi datorită capacităŃii de a se acumula în sistemele vii.

O mare varietate de produse chimice industriale pe bază de azot, se produc pentru industria petrolieră, cea a coloranŃilor, polimerilor, pesticidelor, explozivilor şi medicamentelor.

Principalele grupe de chimicale sunt reprezentate de substanŃe nitro-aromatice, esteri cu azot şi heterocicluri ce conŃin azot. Multe din aceste chimicale sunt toxice şi dăunătoare omului, fiind clasate ca şi substanŃe periculoase de către AgenŃia de ProtecŃia Mediului/Statele Unite.

1.1.1. Procesele de biodegradare a hidrocarburilor sub actiunea microorganismelor

Interesul pentru bioremedierea solurilor şi apelor poluate a crescut în ultimii douăzeci de ani, în primul rând datorită faptului că s-a descoperit că microorganismele sunt capabile să descompună compuşii xenobiotici care până acum s-au considerat a fi rezistenŃi în faŃa proceselor biologice ce au loc în sol.

Degradarea compuşilor organici contaminanŃi poate fi realizată şi în cadrul proceselor chimice şi fizice, dar, bioremedierea este considerată o metodă mai sigură şi mai puŃin costisitoare pentru îndepărtarea contaminanŃilor periculoşi şi producerea de substanŃe secundare netoxice (Providenti et al., 1993; Ward et al., 2003/ Raport RESOLMET, 32161/2008).

Microorganismele au un prim rol catalitic în bioremediere, cunoştinŃele legate de transformările din cadrul comunităŃilor microbiene sunt in continuă dezvoltare în procesul de elaborare a tehnologiilor avansate de bioremediere (Iwamoto şi Nasu, 2001; Dua et al., 2002, citaŃi in Raport RESOLMET, 32161 / 2008).

PoluanŃii din mediu sunt un rezultat al contaminării directe produse de centrele industriale în creştere, aplicarea pesticidelor, erbicidelor şi insecticidelor, şi al contaminării indirecte rezultate din transportul atmosferic pe distanŃe mari ce contribuie la distribuirea contaminanŃilor persistenŃi ca bifenolii policlorinaŃi (PCB – polyclorinated biphenyls) în jurul pământului.

Caracteristicile poluanŃilor, condiŃiile de mediu, tipul vegetaŃiei şi solului, precum şi apropierea de sursă, crează un complex de condiŃii ce influenŃează circuitul poluanŃilor.

9

Solurile reprezintă rezervoare cheie pentru poluanŃii din mediu, depozitarea şi persistenŃa poluanŃilor în sol fiind dependente de o serie de factori: de schimburile atmosferice, de formarea reziduurilor de graniŃă, de îngroparea poluanŃilor şi de biodegradarea lor.

Biodegradarea implică desfacerea compuşilor organici, • prin intermediul biotransformării în metaboliŃi mai puŃin complecşi, • prin mineralizarea în minerale anorganice, H2O, CO2 (aerob) sau CH4

(anaerob). Atât bacteriile cât şi fungii au fost intens studiaŃi pentru capacitatea de a degrada o gamă

largă de poluanŃi ai mediului, inclusiv hidrocarburi aromatice policiclice, hidrocarburi halogenate şi compuşi nitroaromatici.

Enzimele/lanŃurile biochimice necesare pentru studiile iniŃiale ale transformării sunt adesea specifice pentru anumiŃi contaminanŃi ai mediului, transformându-i în metaboliŃi care pot fi asimilaŃi în mai multe lanŃuri principale desfăşurate de bacterii.

Gradul şi rata biodegradării depind de mai mulŃi factori cum ar fi pH-ul, temperatura, oxigenul, populaŃiile microbiene, gradul de aclimatizare, accesibilitatea la nutrienŃi, structura chimică a compuşilor, proprietăŃile de transport celular şi degradarea chimică pe medii de cultură.

Unele substanŃe chimice noi, nedegradabile, care arareori apar în natură, pot fi transformate incomplet, deoarece lipsesc căile microorganismelor pentru degradarea lor completă. Întrucât microorganismele nu au lanŃuri metabolice pentru mineralizarea anumitor chimicale sintetice noi, au totuşi capacitatea de a dezvolta în timp astfel de sisteme catabolice.

În procesele de bioremediere, se întâlneşte des ca obiectiv folosirea tehnologiilor microbiene pentru a accelera rata de descompunere a poluanŃilor.

MulŃi contaminanŃi ai solului se găsesc în condiŃii anaerobe. Cu câŃiva ani în urmă, prin observaŃiile asupra declorinării anaerobe în timp a PCB

(bifenoli-policloruraŃi) din sedimentele Râului Hudson, s-a demonstrat că microorganismele pot transforma contaminanŃii în condiŃii anaerobe.

La sfârşitul anilor ’80, s-a arătat clar că hidrocarburile pot fi degradate şi în absenŃa oxigenului. Acest sistem anaerob de degradare, necesită prezenŃa unor acceptori de electroni terminali precum fierul (III), oxidul de mangan sau azotat, pentru a înlocui funcŃia de acceptor de electroni a oxigenului, din sistemele aerobe.

Sunt foarte intense cercetările legate de mecanismele catalitice ce facilitează catabolismul anaerob al poluanŃilor. Procesele anaerobe sunt foarte eficiente pentru îndepărtarea atomilor clorinaŃi din PCB şi în degradarea altor contaminanŃi halogenaŃi.

Incapacitatea microorganismelor de a mineraliza unii contaminanŃi specifici şi capacitatea

lor de a-i transforma parŃial este o dovadă că aceste organisme necesită alte substraturi pentru creştere. În astfel de situaŃii, contaminanŃii sunt transformaŃi, ca exemplu, în „cometabolism”. Gama largă de structuri pentru moleculele de PAH- hidrocarburi aromatice policiclice necesită ca microorganismele degradatoare să posede o gamă de enzime capabile să accepte PAH ca şi substrat, sau să posede un număr mic de enzime care să fie specifice faŃă de substraturile cu PAH. În timp, într-un anumit sistem particular de bioremediere, unele dintre hidrocarburile aromatice policiclice (PAH) pot să nu se transforme deloc sau pot fi doar parŃial catabolizate până la produşi finali.

Procesele aerobe şi anaerobe cometabole participă de asemenea la degradarea compuşilor organici halogenaŃi.

Deşi mecanismele degradării aerobe a contaminanŃilor chimici sintetici pe bază de azot nu au fost complet elucidate, multe cercetări se desfăşoară pentru a determina mecanismele degradative implicate. Tipurile de reacŃii catalitice participative cuprind dezaminări, nitroreduceri, N-dezalchilări, deesterificări, declorinări şi hidrolize. În primele etape ale catabolismului sunt mult implicate monooxigenazele şi dioxigenazele, nitroreductazele şi esterazele (Raport RESOLMET, 32161 / 2008).

10

Biotehnologiile joacă un important rol în desfăşurarea proceselor de tratare a solurilor

contaminate. Ca în cazul oricărui proces microbian, optimizarea condiŃiilor de mediu în cadrul bioremedierii reprezintă un obiectiv important întrucât activităŃile microbiologică, fiziologică şi biochimică sunt dirijate către biodegradarea contaminaŃilor Ńintă.

Factorii de mediu care influenŃează creşterea şi bioactivitatea microbiană, includ conŃinutul de umiditate, temperatura, pH-ul, tipul de sol, concentraŃia contaminanŃilor şi oxigenul în procesele aerobe sau potenŃialul redox în degradările anaerobe.

Modificările acestor parametri dincolo de valorile optime pot modifica rata de creştere microbiană precum şi substraturile vizate şi pot determina încetarea prematură şi nereuşita procesului de bioremediere.

PotenŃialul de biodegradare poate fi de asemenea limitat de către toxicitatea poluanŃilor. Unele specii pot să-şi elaboreze sisteme de apărare celulară, ceea ce le permite să tolereze concentraŃiile mari de contaminanŃi toxici.

Deoarece majoritatea proceselor de bioremediere se bazează pe activitatea comunităŃilor microbiene complexe, se impune aflarea cât mai multor aspecte despre rolul interactiv şi interdependent jucat de speciile individuale la nivelul acestor comunităŃi.(Raport RESOLMET, 32161 / 2008). 1.1.2 Bioremedierea cu ajutorul comunităŃilor microbiene

Printre tehnologiile de remediere a solului disponibile pentru decontaminarea şi detoxifierea solurilor contaminate de hidrocarburi, bioremedierea este una dintre cele mai sigure din punct de vedere al impactului de mediu şi al costurilor de aplicare.

Microorganismele şi-au dezvoltat o varietate de căi biochimice pentru a degrada sau detoxifia hidrocarburile. Hidrolazele şi oxigenazele sunt clasele cele mai importante dintre enzime, care sunt răspunzătoare pentru catalizarea reacŃiilor de biotransformare. Hidrolazele (hidrolaze, esteraze, amidaze) nu necesită factori şi sunt stabile la o variaŃie mare de pH şi temperatură.

Deoarece comunităŃile microbiene joacă un rol important în ciclurile biogeochimice, este esenŃială analiza structurii comunităŃilor microbiene şi modificările ce apar pe parcursul procesului de bioremediere.

Este necesară cercetarea pentru caracterizarea rolului jucat de organismele ce metabolizează hidrocarburile în degradarea substraturilor petroliere prezente în solurile contaminate cu hidrocarburi.

În caracterizarea comunităŃilor microbiene se folosesc atât metode culturale cât şi cele independente de cultivare. Schimbările în timp şi spaŃiale din comunităŃile microbiene pe parcursul bioremedierii se pot determina folosind metode moleculare complexe (Stapleton et al., 1998; Van Elsas et al., 1998; Widada et al., 2002, citaŃi in Raport RESOLMET, 32161/2008).

Recentele descoperiri din tehnicile moleculare, combinate cu informaŃiile genomice, aduc ajutor microbiologilor în aflarea misterelor legate de diversele roluri pe care le au microorganismele în cadrul comunităŃilor. Genele pentru catabolism au capacitatea de a se răspândi cu o mare frecvenŃă în cadrul comunităŃilor microbiene (Top şi Springael, 2003; Van der Meer şi Senchilo, 2003, citaŃi in Raport RESOLMET, 32161/2008).

La începutul secolului trecut, cercetările erau orientate spre îmbunătătirea fertilităŃii

solului şi creşterii producŃiei agricole. Până în anii ’50, s-au studiat diferite tipuri de microorganisme (fixatoare de azot,

nitrificatoare, sulfo-oxidatoare etc) şi relaŃiile dintre acestea şi nutriŃia plantelor. În anii ’60, cercetările s-au axat pe corelaŃiile dintre transformările solului, populaŃiile

microbiene şi activităŃile enzimatice pentru sporirea fertilităŃii solului.

11

În anii ’70, investigaŃiile au avut în plan rezolvarea problemelor cu privire la asigurarea hranei (inocularea solului cu bacterii fixatoare de azot din genul Azospirillum fiind primul pas important în acest sens).

După anii ’70, a avut loc în microbiologia solului un salt de la aplicarea acestei ştiinŃe în agricultură, la folosirea microorganismelor în decontaminarea mediului poluat.

După anii ’80, bioremedierea solurilor devine din ce în ce mai importantă. Începând cu anii ’80, s-au realizat primele experimente de laborator în care s-a folosit inocularea cu tulpini de microorganisme cu abilităŃi degradative ale compuşilor organici.

Pornind de la activităŃile degradative ale microorganismelor au fost elaborate numeroase tehnologii de depoluare, care sunt cuprinse generic în termenul de bioremediere (Alexander, 1994, citat in Raport RESOLMET, 32161/2008).

Microorganismele capabile să degradeze substanŃele xenobiotice sunt prezente, în general, în respectivele medii poluate, însă biodegradarea naturala are loc cu rate foarte scăzute.

De aceea, s-au elaborat diverse tehnologii de bioremediere care presupun: • cunoaşterea căilor de optimizare a condiŃiilor biodegradării, • cunoaşterea comportării şi efectelor substanŃelor chimice introduse în sol asupra

ecosistemului, • selectarea unor microorganisme cu abilităŃi degradative superioare.

• Cercetări privind identificarea şi caracterizarea bacteriilor şi fungilor ce proliferează în solurile poluate cu petrol şi apa sărată au fost efectuate de Toti si colab. (1989, 1991, 1992, 1999, citaŃi in Raport RESOLMET, 32161/2008).

• S-au identificat principalele bacterii ce contribuie la degradarea petrolului (specii ale genurilor Pseudomonas, Flavobacterium, Corynebacterium etc), bacterii care se întâlnesc şi în zăcămintele de ŃiŃei.

• De asemenea, s-au stabilit unele condiŃii în care aceste bacterii proliferează sau dispar şi modul cum pot fi stimulate.

• S-au efectuat şi studii asupra plantelor pionier ce se instalează pe terenurile poluate şi asupra speciilor cultivate ce pot fi folosite în cursul ameliorării.

• S-a efectuat un studiu amplu de caracterizare a distribuŃiei cantitative şi calitative a bacteriilor heterotrofe şi fungilor filamentoşi în solurile afectate de poluare din teritorii apartinând schelelor de extractie a ŃiŃeiului de pe întreg teritoriul României (Voiculescu Anca şi colab., 2001).

• În sol, desi reprezintă o fracŃiune minusculă din greutatea totală (0,35%), microorganismele au o importanŃă esenŃială, fiind elementul activ, efectorul funcŃiilor de fertilitate a solului (Eliade si colab., 1983, citaŃi in Raport RESOLMET, 32161/2008).

• Activitatea microorganismelor din sol este influenŃată de prezenŃa microhabitatelor, de tipul de sol, de structura şi textura acestuia, de asigurarea cu substanŃe organice şi nutrienŃi şi de factorii de mediu. În funcŃie de multitudinea de factori care acŃionează, activitatea microorganismelor este variabilă, atât din punct de vedere biologic (alternanŃa fazelor vegetative cu fazele de latenŃă), cât şi din punct de vedere al activităŃii metabolice şi de nutriŃie.

Numeroase microorganisme din sol au capacitatea de a utiliza hidrocarburile gazoase, solide şi lichide din seria alifatică si aromatică drept unică sursă de carbon şi energie, descompunându-le la compuşi cu greutate moleculară mai mică, sau chiar la dioxid de carbon şi apă.

Răspândite larg în mediile naturale, şi uneori semnificative numeric, microorganismele active atacă diferiŃi compuşi, ca: petrolul, kerosenul, uleiurile minerale, parafina, gazul de iluminat, gazele de sondă, cauciucul natural şi sintetic, uleiurile de răcire, suprafeŃele asfaltate, conductele subterane şi cablurile electrice protejate de coroziune cu ajutorul materialelor impregnate cu parafină, elastomeri sau diferiŃi derivaŃi ai hidrocarburilor.

12

Primele observaŃii asupra acestui proces de a degrada hidrocarburile datează din anul 1895, când Miyoshi (Geamanu, 2002) a observat că straturile subŃiri de parafină (considerată biologic inertă) sunt pătrunse de hifele de Bothrytis cinerea.

Ulterior, s-a demonstrat că mai multi microfungi din sol, inclusiv Penicillium glaucum pot ataca parafina, descompunând-o si utilizând-o ca unică sursa de carbon şi energie.

ImportanŃa fenomenului în natură a fost semnalată pe baza frecvenŃei ridicate a microorganismelor active în sol şi a incapacităŃii de acumulare a unor hidrocarburi sintetizate de plante sau unor ceruri produse de insecte.

Capacitatea de a degrada hidrocarburile este larg raspândită în lumea

microorganismelor, fiind întâlnită la bacterii (inclusiv actinomicete), la levuri, la fungii filamentoşi, la alge.

Prezente în sol, în apele dulci şi marine şi în unele sedimente, într-o gamă largă de condiŃii de mediu, aceste microorganisme au capacitatea de a sintetiza un spectru larg de enzime care asigură degradarea hidrocarburilor individuale şi potenŃialul de îndepărtare sau de conversie a ŃiŃeiului din mediu.

În timp ce în ecosistemele nepoluate numărul microorganismelor care utilizează hidrocarburile poate reprezenta doar 0,1% din total, în cele poluate poate ajunge pâna la 100% din numarul microorganismelor viabile. Aceasta se datorează faptului că în mediile cu niveluri înalte de poluare are loc modificarea compoziŃiei în specii microbiene prin eliminarea acelora sensibile la poluant.

În ultimele trei decenii s-au identificat peste 200 de specii de microorganisme capabile să

metabolizeze hidrocarburile, microorganisme care au fost numite hidrocarbonoclastice. În urma analizării microbiologice a probelor de soluri poluate cu ŃiŃei unele în concentraŃii

excesive (>30%), au fost izolate tulpini bacteriene cu o înaltă rată de supravieŃuire în aceste condiŃii severe de poluare. Tulpinile bacteriene au fost multiplicate, izolate şi purificate prin cultivarea diluŃiilor zecimale succesive de sol pe medii nutritive solidificate. 1.1.3 CondiŃiile de aplicare a bioremedierii hidrocarburilor in situ

Bioremedierea in situ faŃă de celelalte tehnici de remediere este în mai mare măsură dependentă de condiŃiile locale şi de proprietăŃile solului. Astfel, factorii care joacă un rol important în proiectarea cu succes a unui sistem de bioremediere cuprind:

• structura chimică a poluanŃilor • suplimente naturale de macro/micronutrienŃi, • disponibilitatea acceptorilor, • prezenŃa unor bacterii indigene capabile să degradeze poluanŃii şi • caracteristicile subsolului.

• Structura chimică a poluanŃilor

Biodegradabilitatea produşilor petrolieri este dependentă de structura chimică a diferitelor componente. Astfel, cu cât hidrocarburile petroliere sunt mai solubile cu atât ele sunt mai biodegradabile. Hidrocarburile cu viscozitate mare sunt mai puŃin biodegradabile din cauza dificultăŃilor fizice în stabilirea contactului între poluanŃi şi microorganisme, sau între nutrienŃi şi acceptori. Exemplu: Gazolina care are o solubilitate între 50 şi 100 ppm şi o viscozitate cuprinsă între 0,5 şi 0,6 cSt; este considerată mult mai uşor biodegradabilă decât motorina, care are o solubilitate de 1 ppm şi o viscozitate cuprinsă între 40 şi 600 cSt.

Structurile chimice simple sunt mai uşor de degradat decât structurile ramificate care se degradează mai lent. Degradarea hidrocarburilor de către microorganisme este în general atribuită bacteriilor, însă şi ciupercile indigene pot realiza acest lucru.

13

Bacterii şi fungi consumatoare de hidrocarburi izolate din sol (după Raport RESOLMET, 32161/2008)

Achromobacter sp. Acinetobacter sp. Aerobacter aerogenes

Agrobacterium tumefaciens

Alcaligenes dinitrificans Alcaligenes eutrophus Alcaligenes xylosoxidans Arthrobacter sp. Bacillus brevis

Bacillus cereus

Bacillus circulans

Bacillus coagulans

Bacillus megaterium

Bacillus pumilis

Bacillus subtilis

Brevibacterium sp. Chromobacterium sp. Citrobacter freundii

Clostridium pasteurianum

Clostridium michiganense

Clostridium rectum

Corynebacterium sp. Cytophaga sp. Erwina sp. Flavobacterium sp. Klebsiella pneumoniae

Micrococcus sp. Mycobacterium sp. Nocardia sp. Proteus sp. Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas cepacia

Pseudomonas diminuta

Pseudomonas melophthara

Pseudomonas putida Pseudomonas flourescens

Pseudomonas stutzeri

Rhodococeus corallinus

Rhyzobium sp. Sarcina sp. Serratia marsescens Spirillum sp. Sphingomonas herbicidivorans

Sphingomonas paucimobilis

Streptomyces annomoneus Vibrio sp.

BACTERII

Xanthomonas sp. Acremonium sp. FUNGI Aspergillus sp.

14

Aureobasidium sp. Beauveria sp. Candida sp. Chrysosporium sp. Cladosporium sp. Cochliobolus sp. Cyathus bulleri

Cylindrocarpon sp. Debarymyces sp. Fusarium sp. Geotrichum sp. Gliocladium sp. Graphium sp. Humicola sp. Monila sp. Mortierella sp. Paecilomyces sp. Penicillium sp. Phanerochaete chrysosporium

Phanerochaete sordida

Phorma sp. Rhodotorula sp. Saccharomyces sp. Scolecobasidium sp. Sporobolomyces sp. Sprotrichum sp. Spicaria sp. Tolypocladium sp. Torulopsis sp. Trametes versicolor

Trichoderma viride

Pentru degradarea completă a hidrocarburilor uşoare, sunt necesare mai multe specii de bacterii. PopulaŃiile indigene de bacterii prezente în sol conŃin amestecul necesar de bacterii pentru a face posibilă degradarea. În cazul hidrocarburilor mai grele, se adaugă preparate comerciale pentru suplimentarea populaŃiei de bacterii native.

• NutrienŃii NutrienŃii sunt elementele chimice necesare bunei dezvoltări a microorganismelor, care pot

fi clasificaŃi în micronutrienŃi şi macronutrienŃi. Pentru o dezvoltare şi o reproducere optimă a microorganismelor implicate în procesul de bioremediere trebuie ca la nivelul solului să fie disponibile cantităŃi suficiente de nutrienŃi, iar aceştia să fie în formele şi concentraŃiile specifice fiecărui proces.

MacronutrienŃii necesari populaŃiilor de bacterii sunt reprezentaŃi de carbon, azot şi fosfor, iar raportul optim dintre cei trei compuşi C:N:P este de 100:10:1.

În sol există cantităŃi suficiente din cei trei macronutrienŃi. Astfel, sursele cele mai frecvente de azot sunt amoniacul şi sărurile nitrate, în timp ce cele mai frecvente surse de fosfor sunt ortofosfaŃii şi tripolifosfaŃii. Preparatele comerciale de bacterii disponibile pe piaŃă constau în amestecurile de azot, fosfor şi enzime, componente de neutralizare şi soluŃii tampon sau surse pure de azot şi/sau fosfor.

MicronutrienŃii necesari la nivelul solului pentru o bună desfăşurare a procesului de bioremediere sunt: sulful, potasiul, sodiul, calciul, magneziul, fierul, manganul, zincul şi cuprul.

15

În cazul metabolismului anaerob, pe lângă microelementele enumerate anterior sunt necesare cobaltul şi nichelul.

La nivelul metabolismului aerob, oxigenul molecular (O2) joacă rolul acceptorului de electroni. Astfel, pentru transformarea a 453,6 g de hidrocarburi în bioxid de carbon şi apă sunt necesare 1360,8 g de oxigen.

În procesul de bioremediere anaerobă în locul oxigenului se folosesc substituenŃi ai acceptorului de electroni, precum: nitraŃi (NO3

-), oxizi de mangan IV (MnO2), oxizi de fier III (Fe(OH)3), sulfaŃi (SO4

2-) şi dioxid de carbon (CO2). Utilizarea unui anumit acceptor depinde de disponibilitatea sa, de prezenŃa altor acceptori şi de potenŃialul oxido-reducător al mediului.

Energia produsă de microorganismele din metabolismul hidrocarburilor variază. Astfel, pentru reacŃii aerobe este utilizat cu precădere oxigenul, deoarece acesta conduce la obŃinerea unei cantităŃi mari de energie (Raport RESOLMET, 32161/2008).

• Caracteristicile solului Dintre factorii care condiŃionează buna desfăşurare a procesului de bioremediere,

caracteristicile solului sunt foarte importante, deoarece există un control redus asupra condiŃiilor de sub pământ. Astfel, acolo unde există o deficienŃă a acceptorilor sau a nutrienŃilor, sistemul poate fi proiectat astfel încât să ofere aceşti factori. Chiar şi acolo unde o anumită specie de bacterii implicată în procesul de biodegradare este absentă, bacteria poate fi cultivată în laborator şi introdusă în sol – proces denumit biocreştere - bioaugmentare. Cu toate acestea însă, nu se pot face multe lucruri pentru a compensa condiŃiile zonei care nu acceptă procesul de bioremediere sau care nu oferă condiŃii ideale pentru implementarea unui sistem de biorestaurare.

Există multe proprietăŃi ale solului şi parametri ai apelor subterane care influenŃează procesul de bioremediere. Dintre acestea cele mai importante sunt tipul şi permeabilitatea solului, distribuŃia structurii granulare, conŃinutul hidratant al solului, pH-ul, temperatura, geochimia apelor subterane, adâncimea apelor subterane şi conductivitatea acestora.

• Tipul solului este o variabilă importantă în proiectarea procesului de bioremediere. Astfel, solurile noncoezive, precum pietrişul şi nisipul, sunt mai bune pentru aplicarea bioremedierii decât solurile compacte (dense).

• Permeabilitatea solului este un factor cheie în succesul procesului de bioremediere, datorită facilitării transportului şi distribuŃiei nutrienŃilor şi acceptorilor. Astfel, cu cât solul este mai permeabil cu atât sunt mai bune condiŃiile pentru aplicarea cu succes a procesului de bioremediere, acest lucru fiind valabil atât pentru zona nesaturată (vadoasă) cât şi pentru cea saturată.

• CirculaŃia aerului şi apei în sol este influenŃată de permeabilitatea acestuia. Astfel, în soluri cu permeabilitate mare este facilitată introducerea şi deplasarea aerului prin bioventilaŃie şi, de asemenea, circulaŃia şi distribuŃia apelor subterane într-o zonă saturată. Acest lucru este valabil atât pentru bioremedierea in situ cât şi pentru cea ex situ. În afară de facilitarea transportului în subteran, permeabilitatea are un rol important şi în prevenirea colmatării acvatice excesive. Procesul de biodegradare însuşi reprezintă o sursă de biomasă microbiană, ceea ce influenŃează procesul de colmatare. SoluŃia colmatării este prevenirea sau evitarea fenomenului de biopoluare la scară largă şi precipitarea chimică. Aceste două procese restricŃionează deplasarea apelor subterane. În aceste condiŃii, solul trebuie să fie suficient de permeabil, pentru a preveni ca masa microbiană să determine colmatarea porilor. În acest sens, cercetătorii propun ca siturile să aibă o conductivitate hidraulică mai mare de 10-4 cm/s, această valoare permiŃând desfăşurarea bioremedierii in situ cu rezultate bune. Un rol la fel de important ca şi permeabilitatea în prevenirea biopoluării îl joacă distribuŃia structurii granulare a solului. Studiile în acest domeniu arată că materialele foarte poroase, cu structuri granulare depărtate, sunt mult mai sensibile la biopoluare decât materialele cu porozitate mărită (Raport RESOLMET, 32161/2008).

• Biodisponibilitatea poluanŃilor Pentru a se realiza o degradare microbiană eficientă a contaminanŃilor chimici, aceştia

trebuie să fie biodisponibili în faŃa celulelor responsabile de degradare. Rata de biodegradare a contaminanŃilor depinde de rata de preluare a contaminanŃilor şi de transferul de masă.

16

Biodisponibilitatea contaminanŃilor din sol este influenŃată de un număr de factori precum desorbŃia, difuzia şi disoluŃia.

Scăderea biodisponibilităŃii datorată prelungitei contaminări a solului, este rezultatul reacŃiilor de oxidare chimică şi a slabei difuziuni chimice a contaminanŃilor în porii mici care încorporează contaminanŃii în materia organică.

Folosirea bio-surfactanŃilor sau a altor substanŃe chimice pe parcursul procesului de biodegradare contribuie la creşterea biodisponibilităŃii (Van Hamme et al., 2003, citat in Raport RESOLMET, 32161/2008).

Structura moleculară a contaminanŃilor şi hidrofobia pot să influenŃeze de asemenea preluarea poluanŃilor de către microorganisme.

Celulele microorganismelor pot avea sisteme active sau selective pentru transportarea contaminanŃilor în celule. Datorită faptului că aceşti contaminanŃi au o solubilitate scăzută în medii apoase, înŃelegerea mecanismelor prin care sunt preluate de către microorganismele degradatoare şi dezvoltarea strategiilor pentru iniŃierea sau accelerarea accesibilităŃii, reprezintă aspecte importante pentru procesul propriu-zis de bioremediere. Hidrofobia sau slaba solubilitate în apă a hidrocarburilor aromatice policiclice, determină asocierea lor cu compuşii hidrofobi din sol, astfel limitând accesibilitatea lor către microorganisme. Astfel, un material fără drenaj este mult mai predispus la bioremediere decât un material bine drenat. Umezeala solului este o proprietate foarte importantă în sistemele de tratare a zonei nesaturate (vadoase), deoarece microorganismele au nevoie de apă ca suport pentru procesul metabolic. În procesul de bioremediere umiditatea ideală a solului este de 50%. La utilizarea sistemelor de bioventilaŃie umiditatea solului suferă o diminuare în timp.

• Elementele chimice în apele subterane. Buna funcŃionare a sistemului de tratare in situ este influenŃată în mare măsură de prezenŃa şi concentraŃia unor elemente chimice în apele subterane, cele mai importante dintre acestea fiind fierul şi manganul. În majoritatea sistemelor de ape subterane aflate în condiŃii anaerobe sau reducătoare, fierul şi manganul sunt prezente în forme dizolvate sau reduse.

• PotenŃialul redox al apelor subterane. PotenŃialul redox al apelor subterane (Eh), măsurat în milivolŃi este un alt indicator al

condiŃiilor aerobe/ anaerobe. PotenŃialul redox este o mărime a stării de oxidare sau reducere din sistem, astfel că un potenŃial redox ridicat indică un mediu aerob (condiŃii oxidante), în timp ce un potenŃial redox scăzut indică un mediu anaerob (condiŃii reducătoare). PotenŃialul redox al apelor subterane poate oferi indicaŃii asupra tipului reacŃiei redox care are loc în zona acvatică. Acest lucru este posibil deoarece reacŃiile redox mediate de bacterii urmează o secvenŃă specifică bazată pe potenŃialul redox al mediului.

o InteracŃiunea microbiană cu hidrocarburile.

InteracŃiunea microbiană cu hidrocarburile a fost un important obiectiv de studiu în ultimii 50 de ani. Deşi cercetările iniŃiale s-au axat pe implicarea microorganismelor în formarea depozitelor de petrol recent studiile s-au redirecŃionat spre catabolismul microbian al hidrocarburilor. Acest studiu a fost motivat de nevoia crescândă de remediere a mediilor contaminate ca rezultat al dispersării diferiŃilor combustibili. Înaintea anilor 1980, studiile asupra catabolismului microbian al hidrocarburilor s-au desfăşurat în condiŃii aerobe, iar degradarea anaerobă a hidrocarburilor de către microorganisme nu a fost luată în consideraŃie (RESOLMET, 32161/2008).

Benzenul, de exemplu, prezintă numeroase utilizări şi reprezintă unul din cele mai importante 20 de substanŃe chimice produse în Statele Unite ale Americii, ceea ce reprezintă 35% din producŃia globală. Pe lângă adăugarea sa în combustibilii ce au la bază petrol, benzenul se utilizează pentru obŃinerea diferitelor alte substanŃe chimice, cauciucuri, lubrifianŃi, detergenŃi, droguri şi pesticide. Surse alternative ca vulcani, incendii forestiere şi fum de Ńigară contribuie semnificativ la răspândirea benzenului în mediu.

17

Benzenul este considerat unul din cei mai importanŃi poluanŃi organici în apele subterane (Anderson şi Lovley, 1997, citaŃi in Raport RESOLMET, 32161/2008) prezintă un factor de risc ridicat pentru sănătatea populaŃiei datorită toxicităŃii şi solubilităŃii sale ridicate. Este clasat pe locul 5 pe lista priorităŃilor naŃionale din Statele Unite ale Americii (NPL = National Priorities List) şi s-a găsit în mai mult de 50% din 1428 site-uri ale NPL.

Hidrocarburile cu un singur nucleu aromatic, ca: benzenul, toluenul, etilbenzenul, xilenul, cunosute sub numele generic de BTEX, sunt de obicei conŃinute în benzină şi sunt substanŃe foarte volatile. Datorită toxicităŃii şi solubilităŃii lor ridicate, aceştia reprezintă factori de risc ridicat pentru sănătatea populaŃiei.

Toluenul. În ceea ce priveşte biodegradarea toluenului, Geobacter metallireducens a fost primul organism obŃinut în cultură pură capabil să oxideze anaerob toluenul, transformându-l complet în CO2, cu reducerea Fe III. Specia a fost incapabilă să reducă alŃi compuşi BTEX. Primul pas în catabolismul toluenului este adiŃia de fumarat la gruparea metil a toluenului, cu formare de benzilsuccinat (Fig. 1), reacŃie realizată de enzima benzilsuccinat sintază. Benzilsuccinatul liber se întâlneşte în bulionul de Thauera aromatica, drept produs intermediar şi se consideră a fi cel care determină calea genetică pentru catabolismul toluenului.

Fig. 1

Diferite studii au demonstrat că specii ale genurilor Thauera şi Azoarcus degradează

toluenul. Thauera aromatica şi Azoarcus tolulyticus (Raport RESOLMET, 32161/2008). Primele două microorganisme capabile de degradarea anaerobă a benzenului au fost

izolate şi descrise de Coates et al., 2001, 2002 citati de Raport RESOLMET, 32161/2008); aceste microorganisme sunt înrudite şi fac parte din genul Dechloromonas; ele oxidează benzenul la CO2 în absenŃa O2. Calea biochimică de degradare anaerobă a benzenului nu este cunoscută, dar există idei pentru reacŃiile iniŃiale, incluzând o alchilare cu formare de toluen, o hidroxilare cu formare de fenol sau o carboxilare cu formare de benzoat (Fig. 2). Studii anterioare independente, realizate pe sedimente sau pe culturi îmbogăŃite, au demonstrat formarea fenolului şi benzoatului ca intermediari extracelulari, în timpul procesului de degradare anaerobă a benzenului. Degradarea anaerobă a etilbenzenului. Doar trei microorganisme au fost descrise ca fiind capabile de acest tip de metabolism (Raport RESOLMET, 32161/2008).

Biodegradarea anaerobă a celor trei izomeri structurali ai xilenului a fost sudiată în condiŃii azotat- şi sulfat-reducătoare. Studii bazate pe sedimente sau culturi îmbogăŃite au demonstrat biodegradarea p-xilenului în absenŃa oxigenului, dar nu există nici o cultură pură care să mineralizeze complet p-xilenul, până la CO2.

De asemenea, au fost izolate diferite microorganisme capabile să mineralizeze complet meta- şi orto-xilenul. Multe din aceste microorganisme sunt înrudite una cu cealaltă, dar şi cu cele care degradează toluenul. ReacŃiile iniŃiale implicate în oxidarea anaerobă a m-xylenul sunt considerate ca fiind similare cu cele care oxidează toluenul în condiŃii azotat-reducătoare şi presupun o adiŃie iniŃială de fumarat la una din grupările metil, cu formare de 3-metilbenzilsuccinat (sau 2- metilbenzilsuccinat, după caz) care este rapid oxidat la 3-metilbenzoat (sau 2-metilbenzoat, după caz) (Raport RESOLMET, 32161/2008).

18

Hidrocarburile alifatice saturate (alcanii) sunt larg răspândite în mediul terestru şi marin.

Aceştia fie sunt produşi de organismele vii sau rezultă din diferite procese. În comparaŃie cu numeroase hidrocarburi aromatice, alcanii sunt consideraŃi netoxici, chiar dacă cei cu catenă scurtă se ştie că afectează membranele biologice. Prima evidenŃiere a procesului de degradare anaerobă a alcanilor de către o cultură pură s-a realizat cu un microorganism sulf-reducător, înrudit cu specii ale genului Desulfococcus (Raport RESOLMET, 32161/2008).

o pH-ul mediului

Procesul de bioremediere se desfăşoară în condiŃii optime pentru un pH cuprins între 6 şi 8, cu valoarea ideală în jurul valorii 7. În zonele în care activitatea bacteriană este intensă, există posibilitatea apariŃiei unor soluri uşor acide, datorate apariŃiei de componenŃi acizi intermediari. În plus, dioxidul de carbon, un produs final al metabolismului hidrocarburilor, contribuie la scăderea pH-ului deoarece dioxidul de carbon dizolvat formează acid carbonic. Majoritatea produşilor disponibili în procesul de bioremediere oferă şi agenŃi de neutralizare şi soluŃii tampon.

o Temperatura

Este un factor care influenŃează bioactivitatea, astfel că rata de biodegradare a hidrocarburilor aproape se dublează, la fiecare variaŃie de 10oC peste o temperatură medie cuprinsă între ± 5 şi ± 25 ºC. În plus, temperatura apelor subterane poate afecta disponibilitatea oxigenului, deoarece acesta este dependent de temperatură, astfel că oxigenul este mai solubil în apă rece decât în apă caldă. Un avantaj al bioremediereii in situ este acela că temperatura în subteran rămâne aproape constantă în timpul anului.

Fig. 2

19

1.2. Bioremedierea solurilor contaminate cu hidrocarburi 1.2.1. Metode de tratare a solurilor contaminate cu hidrocarburi

În ultimii ani, o multitudine de metode au fost investigate, dezvoltate şi folosite pentru tratarea solurilor contaminate cu reziduuri petroliere:

vitrifierea, incinerarea, evacuarea şi depunerea selectivă, volatilizarea, încapsularea, spălarea cu diferiŃi solvenŃi, bioremedierea şi folosirea straturilor absorbante (Preslo şi colab.,1989), atenurea naturală monitorizată (Pope and Jones,1999), fitoremedierea (Frick şi colab.1999). Aceste metode diferă de la una la alta nu numai prin tratamentul folosit ci şi prin cantitatea

şi calitatea produselor petroliere pentru care ele sunt pretabile, prin efectele secundare care pot apare şi costuri. Alegerea unei metode de tratare se face în acord cu evaluarea riscului de mediu pentru zona contaminată. Atenuarea naturală monitorizată

O strategie potenŃială de remediere a locurilor contaminate o constituie atenuarea naturală monitorizată, care în accepŃiunea AgenŃiei de ProtecŃie a Mediului din SUA se referă la sprijinul pe care procesele naturale îl oferă pentru atingerea obiectivelor de remediere specifice locului. Pentru a fi considerată o alternativă acceptabilă, această metodă trebuie să realizeze obiectivele remedierii într-un timp care este rezonabil prin comparaŃie cu cel oferit de alte metode mai active (Pope şi Jones, 1999). Atenuarea naturală monitorizată este întotdeauna folosită în combinaŃie cu controlul sursei, care constă în îndepărtarea sursei de contaminanŃi cât mai mult posibil. Procesele de atenuare naturală includ o varietate de procese fizice, chimice ori biologice, care, în condiŃii favorabile, acŃionează fără intervenŃia oamenilor pentru a reduce masa, toxicitatea, volumul lor, concentrarea contaminanŃilor în sol sau în apa freatică. Atenuarea naturală se referă şi la metodele de tratare cunoscute sub numele de remediere intrinsecă, bioatenuare ori bioremediere intrinsecă. Aceste procese includ: ♦biodegradarea, ♦dispersia, ♦diluŃia, ♦sorbŃia, ♦volatilizarea şi ♦stabilizarea chimică ori biologică, ♦transformarea ori destrucŃia contaminanŃilor.

Procesele de atenuare naturală sunt deseori caracterizate ca distructive şi nedistructive. Procesele distructive distrug contaminantul. Procesele nedistructive nu distrug contaminantul dar produc o reducere în concentraŃiile contaminantului. Procesele de atenuare naturală pot

• reduce masa contaminantului (prin procese distructive cum sunt biodegradarea şi tranformările chimice);

• reducerea concentraŃiilor contaminantului (prin diluŃie simplă ori dispersie); ori • legarea contaminantului de particulele solului astfel încât contaminantul nu poate migra

prea departe (EPA, 1996). • Spre exemplu, apa relativ curată de la suprafaŃa solului pătrunde în apa freatică superficială

încărcată cu poluanŃi şi produce diluarea. Sau apa freatică curată curge printr-o zonă poluată şi produce dispersia poluanŃilor şi împrăştierea lor în afara zonei intens poluate reducând astfel concentraŃia contaminantului în zona luată în studiu. AdsorbŃia apare când contaminanŃii sunt fixaŃi de particulele din sol. Hidrocarburile din carburanŃi tind să respingă apa, la fel ca şi cele mai multe substanŃe petroliere. Când ele au posibilitatea să scape din apa freatică se ataşează de materia organică sau de mineralele argiloase, ceea ce permite contaminanŃilor să iasă din fluxul de apă freatică şi să rămână într-o zonă în care poate fi

20

mai usor tratat. SorbŃia, ca şi diluŃia şi dispersia, reduc concentraŃia şi masa contaminanŃilor în apa freatică, dar nu distrug contaminanŃii. În diferite situaŃii, atenuarea naturală constituie o opŃiune efectivă, ieftină de curăŃire şi cea

mai bună cale de a rezolva unele probleme de contaminare, chiar dacă unii autori o etichetează ca fiind lipsă de acŃiune. Atenuarea naturală este în realitate o abordare activă care se concentrează pe confirmarea şi monitorizarea proceselor de remediere naturală mai mult decât pe încrederea totală în tehnologiile inginereşti. Hidrocarburile mobile şi toxice din carburanŃi scurşi din rezervoare sunt candidaŃi buni pentru aplicarea atenuării naturale. Nu numai că este dificil să-i prinzi datorită mobilităŃii ridicate şi adâncimii mari la care se află, dar ei sunt şi contaminanŃii ce pot fi distruşi cel mai uşor prin biodegradare (US – EPA-1996).

Oppelt (1999) recomandă ca înainte de a decide ce metodă de remediere poate fi folosită să se trecă prin următoarele faze:

o identificarea poluanŃilor prezenŃi în acel loc; o evaluarea riscului pentru oameni şi mediu luând în considerare fiecare dintre poluanŃi; o investigarea vitezei şi dispersiei apei freatice; o evaluarea cantităŃii de poluanŃi localizaŃi în acel loc; o analiza metodelor accesibile de degradare fizică, chimică şi biochimică ori de atanuare

a poluanŃilor; o calculul duratei proceselor de remediere pentru fiecare metodă în parte; o evaluarea costurilor pentru fiecare metodă accesibilă; o cercetarea reacŃiei sociale la metodele propuse; o alegerea şi aplicarea celei mai potrivite metode de remediere.

Fitoremedierea

Centrul de Analiză a Tehnologiilor de CurăŃire a Apelor Freatice din Statele Unite ale Americii recomandă pentru curăŃirea solului şi apei poluate cu hidrocarburi fitoremedierea, metodă care utilizează plantele.

Avantajele majore raportate de fitoremediere în comparaŃie cu tehnologiile de curăŃire tradiŃionale includ posibilitatea generării a mai puŃine reziduuri secundare, asociată cu deranjarea minimă a mediului ambiant şi abilitatea de a lăsa solul pe loc şi în condiŃii folositoare pentru următorul tratament. Dezavantajele citate în literatură includ lungimea mare a timpului cerut pentru fitoremediere (de obicei mai multe sezoane de vegetaŃie), adâncimea limitată a apei freatice (90-300 cm) şi posibilitatea intrării contaminantului în lanŃul alimentar prin consumul plantelor de către animale.

Un interes particular îl prezintă faptul că diferite plante împreună cu microorganismele asociate lor, au fost identificate ca fiind capabile să crească viteza de îndepărtare a hidrocarburilor petroliere din solul contaminat.

În majoritatea studiilor gramineele şi leguminoasele au fost semnalate pentru potenŃialul lor de fitoremediere a locurilor contaminate cu hidrocarburi petroliere. Avantajul acestora îl constituie sistemul radicular fibros şi puternic dezvoltat, ce explorează un volum mare de sol până la adâncimea de 3 m. Acestea prezintă o diversitate genetică inerentă care le poate da un avantaj în competiŃia ce apare la instalarea în condiŃii de sol nefavorabile. În plus leguminoasele ar putea avea un avantaj faŃă de plantele neleguminoase în procesul de fitoremediere datorită abilităŃii lor de a fixa azotul, nemaifiind astfel în competiŃie cu microorganismele şi celelalte plante pentru cantităŃile limitate de azot asimilabil din solul contaminat cu petrol.

Cele trei mecanisme primare prin care plantele şi microorganismele curăŃă solul şi apa freatică poluate cu hidrocarburi petroliere sunt:

o degradarea, o înmagazinarea şi o transferul hidrocarburilor din sol în atmosferă.

21

Plantele şi rădăcinile lor pot influenŃa indirect degradarea prin alterarea condiŃiilor fizice şi chimice din sol. Explorarea solului de către rădăcini ajută în a prinde la un loc, într-un contact strâns, plantele, microorganismele, elementele nutritive şi contaminanŃii. Plantele oferă solului materie organică, atât după moartea lor cât şi în timpul vieŃii prin pierderea celulelor din vârful rădăcinilor şi excreŃiile de mucilagii, substanŃele gelatinoase fiind un lubrefiant pentru penetrarea rădăcinilor prin sol. Materia organică poate reduce bioaccesibilitatea unor hidrocarburi petroliere, în special a celor ce sunt lipofile şi legate de materia organică.

În accord cu cercetările efectuate de Dineen şi colab. (1989), succesul bioremedierii solurilor contaminate cu hidrocarburi petroliere depinde de următorii 5 factori:

o Microbiologia solului. Microorganismele ce degradează petrolul vor fi prezente în

zonele în care concentraŃia hidrocarburilor petroliere depăşeşte standardele care impun curăŃirea.

o Chimia solului. ConcentraŃiile de elemente nutritive (NPK) şi oxigen vor fi adecvate menŃinerii creşterii microorganismelor, şi, în acelaşi timp, sărurile şi metalele grele nu trebuie să fie prezente la nivele toxice.

o Fizica solului. Permeabilitatea pentru aer a solului trebuie să fie adecvată pentru a permite o bună mişcare a oxigenului şi azotului în solul afectat şi a evita creşterea concentraŃiilor de bioxid de carbon.

o Morfologia solului. StratificaŃia solului în zonele afectate va fi bine cunoscută pentru a putea proiecta un bun sistem de tratare.

• Adâncimea apei freatice, direcŃia şi gradientul de curgere a apei freatice, prezenŃa sau

absenŃa produselor de flotare şi concentraŃia hidrocarburilor petroliere în apa freatică trebuie să fie cunoscute înainte de implementarea bioremedierii in situ, în scopul evitării recontaminării solului curăŃat de către apa freatică.

• În cazul în care solul este poluat atât cu reziduuri de petrol cât şi cu apă sărată, măsurile de bioremediere se îmbină cu măsuri corespunzătoare de desalinizare, respectiv amenajări pentru spălarea sărurilor pe profilul de sol şi captarea apelor de spălare într-un sistem de drenaj pentru a putea fi epurate înainte de deversarea în emisar.

Tratarea cu ajutorul terenului agricol

Tratarea cu ajutorul terenului agricol este o tehnică de bioremediere, aerobă, la suprafaŃa solului în care

• nămolurile din petrol sunt aplicate pe sol ori • solul contaminat este imprăştiat în strate subŃiri, variind de la câŃiva milimetri

la zeci de centimetri grosime. Straturile de sol contaminat sunt amestecate cu ajutorul frezei pentru a distribui şi omogeniza elementele nutritive, umiditatea şi microorganismele. Lucrarea periodică a solului cu freza măreşte permeabilitatea şi aeraŃia solului. Deci, hidrocarburile grele sunt reduse prin stimularea biodegradării aerobe, iar constituenŃii uşori ai petrolului sunt volatilizaŃi, deoarece mai mult sol este afânat cu freza. Tratarea cu ajutorul terenului agricol poate fi aplicată numai în zonele cu suprafeŃe mari, în care aceste terenuri pot fi rezervate pentru scopuri neagricole (Fan, Tafuri, 1998).

Tratarea cu ajutorul terenului agricol a fost folosită de industria petrolieră pentru • tratarea nămolurilor de rafinărie timp de peste 25 de ani. Metoda a fost de

asemenea folosită pentru • tratarea solurilor contaminate cu produse petroliere grele (gudron, smoală)

conŃinând hidrocarburi care variază de la C10 la C35 (Fan şi Tafuri, 1998).

22

Compostarea

Compostarea este procesul prin care materialele reziduale organice sunt degradate în humus ca produs final. Compostarea implică interacŃiunea unei varietăŃi de microorganisme incluzînd bacterii, protozoare, actinomicete şi ciuperci. În operaŃiunile de compostare, bacteriile mezofile şi termofile sunt principalele responsabile de descompunerea proteinelor, lipidelor şi grăsimilor. Protozoarele consumă aceste categorii de compuşi organici, care constitue o sursă de hrană şi pentru bacterii. AbundenŃa protozoarelor în operaŃiunile de compostare este redusă puternic atunci când temperatura este ridicată în domeniul termofil. Actinomicetele şi ciupercile sunt prevalente în timpul fazelor de compostare mezofilă şi termofilă. Ele sunt considerate a fi responsabile pentru degradarea compuşilor organici complecşi, cum sunt carbohidraŃii şi celuloza (Fan şi Tafuri, 1998). Principiile proceselor de bioremediere a solurilor contaminate cu hidrocarburi

Tehnicile de bioremediere includ un număr de sisteme ori procese care utilizează microorganismele pentru tratarea solurilor şi apelor freatice pentru degradarea ori descompunerea reziduurilor periculoase, inclusiv hidrocarburile petroliere. PopulaŃiile microbiene din siturile contaminate au fost capabile să degradeze hidrocarburi, solvenŃi cloruraŃi, fenoli, PCB (bifenil policloruraŃi) şi diferite pesticide. Şi totuşi, bacteriile nu pot degrada toŃi contaminanŃii, sau îi pot degrada prea lent. Şi unii contaminanŃi degradabili pot să nu fie accesibili pentru microorganisme deoarece, spre exemplu, ei sunt prea strâns legaŃi de particulele solului (Hart, 1996). Citând pe Bouwer, Hart (1996) arată că bioremedierea a fost folosită cu succes pentru controlul contaminării cu hidrocarburi.

Limitele bioremedierii in situ: -procesul poate fi mai lent decât la tehnicile ex situ, -poate fi greu condus -poate ca să nu ofere rezultate bune în solurile argiloase, ori în straturile mai profunde ale

solului, acolo unde oxigenul nu poate fi distribuit prin tratamente de suprafaŃă. Sunt frecvent înregistrate dificultăŃi cu controlul fluxului în zona nesaturată. În plus, în cazul tuturor tehnicilor de remediere in situ, subprodusele intermediare pot fi mai mobile şi periculoase decât componentele originale (Frick şi colab.,1999).

Verstraete şi Top (1999) atrag atenŃia asupra heterogenităŃii solului, sistemul sol prezentând o mare variabilitate spaŃială a proprietăŃilor sale, care induce restricŃii în procesul de bioremediere. ProprietăŃile chimice ce joacă un rol important în procesul de adsorbŃie, cum sunt pH-ul şi conŃinutul de materie organică, prezintă o distribuŃie variabilă ridicată. Această heterogenitate afectează puternic cinetica de adsorbŃie şi echilibrul dintre constituenŃii chimici şi substanŃele xenobiote. Transportul contaminanŃilor reactivi, care sunt adsorbiŃi de argilă, materia organică a solului, etc. este de asemenea afectat de heterogenitatea proprietăŃilor fizice şi chimice ale solului. Este important de notat că datorită modului de formare şi dezvoltare a agregatelor structurale ale solului, unii pori sunt în contact cu dinamica mediului ambiant, dar alŃii sunt inchişi. Microorganismele sunt separate spaŃial şi destul de puŃine. Solul reprezintă un mediu ambiant ostil pentru microorganismele selecŃionate şi introduse de om pentru bioremediere, care niciodată nu îşi poate menŃine numărul şi activitatea celulelor iniŃiale dacă ele nu au un avantaj selectiv.

Metoda de decontaminare in situ a apei freatice şi solului poluate cu hidrocarburi are trei faze succesive şi complementare: decontaminarea hidraulică, drenajul activ cu ajutorul produselor tensioactive şi biodegradarea (Moser, 1997).

• Recuperarea hidraulică este aplicată cu prioritate pentru partea de petrol uşor mobilizabil şi poate extrage până la 26% din petrol.

• Faza a doua, drenajul activ cu ajutorul produselor tensioactive, se compune din două părŃi: una de infiltrare a tensioactivului specific, biodegradabil şi netoxic, şi recuperarea petrolului şi tensioactivului în zona nesaturată cu care ocazie se recuperează circa 12,5 %

23

petrol şi 90% tensioactiv, şi a doua parte ce constă în tratarea lentilelor de petrol din zona de sprijin orizontal prin injecŃia de tensioactiv în profunzime, în vederea favorizării recuperării corpurilor de impregnare restante.

• Faza a treia biodegradarea constă în reabilitarea prin biodegradare a hidrocarburilor reziduale. Tehnica folosită are în vedere optimizarea aportului de elemente nutritive şi de oxigen .

Factori care afectează biodegradarea solurilor poluate cu hidrocarburi

Biodegradarea produselor petroliere în sol este influenŃată de proprietăŃile fizice şi chimice ale produselor petroliere şi solului, gradul de poluare, condiŃiile climatice şi prezenŃa populaŃiilor microbiene în sol. Densitatea populatiilor microbiene.

Microorganismele capabile să degradeze hidrocarburile sunt distribuite peste tot în natură. În soluri, pentru degradarea hidrocarburilor, sunt importante atât ciupercile cât şi bacteriile.

Paşii biochimici importanŃi în fragmentarea hidrocarburilor petroliere sunt oxidarea alcanilor cu catene drepte sau ramificate şi desfacerea nucleelor aromatice prin activităŃi enzimatice. Nici o plantă sau animal superior nu sunt cunoscute ca având astfel de posibilităŃi şi relativ puŃine microorganisme posedă sistemul enzimatic necesar pentru a realiza aceşti paşi cruciali (Dineen şi colab.,1989).

Tipurile actuale şi abundenŃa microorganismelor depind de condiŃiile climatice, vegetaŃie, sol şi tipul de contaminanŃi la care organismele au fost expuse. Biodegradarea rapidă a hidrocarburilor petroliere cere prezenŃa unui nivel optim de bacterii în sol.

Densitatea nativă a populaŃiei bacteriene în sol poate fi estimată prin tehnicile de numărare a microbilor care măsoară unităŃile de colonii formate pentru consumarea petrolului sau prin respirometrie, care măsoară nivelul de bioxid de carbon eliberat. S-a sugerat că de la 106 la 108 unităŃi formatoare de colonii pe gramul de sol uscat vor asigura degradarea dorită a hidrocarburilor petroliere. Totuşi, numai densitatea microbiană nu este un indicator direct al activităŃii bacteriene ori al vitezei de degradare (Fan şi Tafuri, 1998).

Orizonturile de suprafaŃă ale solurilor, unde există oxigen şi elemente nutritive în concentraŃii adecvate, conŃin aproximativ 107-109 microorganisme/g de sol. Dintre acestea, numai aproximativ 0,1-1 % sunt microorganisme care pot degrada petrolul. După contactul cu hidrocarburile petroliere, solurile se ajustează din punct de vedere microbiologic, astfel încât numărul de bacterii capabile de biodegradare creşte de la 106 la 108 (Dineen, 1989).

Uneori, hidrocarburile persistă chiar în medii care conŃin specii capabile de biodegradare, deoarece organismele nu au acces la compuşii pe care ar putea să-i metabolizeze. Inaccesibilitatea organismelor poate fi rezultatul nemiscibilităŃii hidrocarburilor cu apa sau adsorbŃiei lor pe sol. Hidrocarburile sunt puternic adsorbite pe sol, ceea ce le reduce toxicitatea efectivă dar le limitează viteza de biodegradare.

În cadrul tehnologiei de bioremediere, un rol esenŃial îl au lucrările solului, care au nu numai rolul de a pregăti patul germinativ şi de întreŃinere a culturilor, ci mai ales pe cel de aerare a solului, de creştere a capacităŃii de reŃinere a apei, de reglare a regimului aerohidric, de rupere a peliculei de petrol care împiedică schimbul de gaze între sol şi atmosferă, de diluŃie a poluantului prin amestecarea cu sol nepoluat şi reducerea în acest fel a concentraŃiei poluantului în zona de dezvoltare a sistemului radicular, de creştere a suprafeŃelor de contact dintre sol şi poluant şi deci de creştere a suprafeŃei de atac de către microorganisme, de aerare forŃată în momentul efectuării lucrărilor, etc.

Microorganismele din mediul ambiant pot distruge compuşii organici prin degradarea lor la compuşi anorganici. Trei procese de transformare pot apare:

1. detoxifierea, incluzând mineralizarea (spre exemplu, conversia completă a compuşilor organici in compuşi anorganici cu ajutorul microorganismelor) şi co-metabolismul (spre exemplu, conversia compuşilor organici in alŃi ompuşi organici);

24

2. activarea, care implică transformarea microbiană a compuşilor organici în compuşi toxici ori produse persistente în mediul ambiant natural; şi

3. difuzia, un proces care produce un produs netoxic care difuzează prin procesele de activare (Fan si Tafuri, 1998). Reactia solului.

Umiditatea şi pH-ul solului sunt factori care participă la selecŃia microorganismelor active în procesul de bioremediere. Activitatea aerobă necesită valori pH între 6 şi 8. Comparativ cu reacŃia acidă, reacŃia slab alcalină asigură viteze mai mari de biodegradare a hidrocarburilor.

Solurile acide vor fi amendate cu carbonat de calciu (piatră de var) sau cu carbonat de calciu şi magneziu (dolomită) pentru creşterea pH-ului, asigurându-se astfel şi o sursă de cationi. Solurile alcaline vor fi amendate cu compuşi acidifianŃi, cum ar fi sulfatul de aluminiu, pentru a-i coborî pH-ul până în domeniul dorit (Fan şi Tafuri,1998). ConcentraŃia elementelor nutritive.

În plus faŃă de sursa de carbon organic şi oxigen, bacteriile aerobe cer elemente nutritive pentru a-şi susŃine creşterea şi activitatea metabolică. Solul supus bioremedierii poate fi tratat cu macroelemente cum sunt azotul, fosforul, calciul, magneziul, şi microelemente cum sunt fierul, cobaltul, nichelul şi borul (Fun şi Tafuri, 1998). Nivelele de azot şi fosfor cerute pentru creştere sunt estimate pe baza necesarului biomasei bacteriene şi concentraŃiei de hidrocarburi. În determinarea raporturilor carbon:azot:fosfor (C:N:P) şi conŃinutului de apă, raportul C:N:P de 300:10:1 pare a fi adecvat, deoarece aproximativ o treime din hidrocarburi sunt convertite în masă celulară şi două treimi în bioxid de carbon (Fan şi Tafuri, 1998). Continutul de apă al solului.

Pentru a supravieŃui, microorganismele au nevoie de apă; prea multă apă poate limita fluxul de aer prin sol, reducând astfel oxigenul accesibil. Domeniul optim al conŃinutului de apă (20-40 procente de greutate sau 40-80 procente din capacitatea de câmp) pentru un loc dat va depinde de tipul de sol, permeabilitate şi saturaŃia în contaminanŃi (Fan şi Tafuri, 1998).

Cap. 2. Extractia biologica a metalelor grele 2.1 Metode biologice pentru determinarea gradului de toxicitate a solurilor

Poluarea apei şi solului cu o multitudine de agenŃi poluanŃi, de la nutrienŃi şi pesticide până la metale grele şi produse petroliere, proveniŃi din industrie şi din agricultură, afectează grav sănătatea oamenilor şi distrug ecosisteme întregi. Conform celui de-al 6-lea Program de acŃiune în domeniul mediului al Uniunii Europene, solul este identificat ca o resursă neregenerabilă, supusă presiunilor antropice şi ca urmare sunt definite obiectivele de protejare a solului ca sistem natural în general şi în special împotriva eroziunii şi poluării. LegislaŃia în domeniul solului diferă pe cuprinsul Europei. Analiza riscurilor determinate de prezenŃa poluanŃilor în sol şi transferul acestora în cadrul reŃelelor trofice este un domeniu aflat în prezent într-o accelerată evoluŃie. În vederea caracterizării riscurilor determinate de prezenŃa poluanŃilor în sol este imperios necesară existenŃa efectuării determinarilor de ecotoxicologie. InformaŃiile generate de laboratoare de profil pot avea un impact deosebit în selectarea tehnologiilor de remediere (fizico-chimice şi biologice).

Pe baza datelor obŃinute se pot fundamenta modele ale transferului şi transformării poluanŃilor în mediul edafic, precum şi interacŃiunile solului cu mediul hidric (ape de suprafaŃă şi subterane), atmosferic şi biotic (Raport RESOLMET, 32161/2008).

Problema efectuării unor determinări rapide, ieftine care să stabilească gradul de risc al reziduurilor solide este de mare actualitate. Determinările chimice sunt necesare pentru compararea

25

concentraŃiilor substanŃelor cheie periculoase care se găsesc în reziduurile solide cu valorile limită din legislaŃia română şi cu cele propuse de Uniunea Europeană.

Clasificarea deşeurilor şi depozitarea acestora, in conformitate cu Directiva 1999/31/EC ("Directiva Landfill") - Anexa II- si Decizia 2003/33/EC, impun următoarele tipuri de testări:

Nivel 1. Caracterizare primară; Nivel 2. Teste de verificare a conformităŃii. Nivel 3. Verificări on-site. Dintre Directivele Europene aflate strânsă legătură bioremedierea pot fi amintite:

• HG nr. 128/2002 modificată şi completată prin HG nr. 268/31.03.2005, care a introdus noi limitări (care le anulează pe cele din Anexa nr. 3 a Ordinului MAPPM nr. 462) privind incinerarea deşeurilor care reprezintă transpunerea Directivei 2000/76/CE;

• HG nr. 95 /2005 Surse staŃionare majore de metale grele pot fi: • incinerare reziduuri, inclusiv co-incinerarea; • procese metalurgice termice, producŃia de aluminiu şi alte metale neferoase, fier sau oŃel; • instalaŃii de ardere care produc energie şi care folosesc combustibil solid; • arderi casnice; • procese de producŃie chimică specifică, producând intermediari şi produse secundare. OrganizaŃia InternaŃională de Standardizare (ISO) trasează liniile directo