ACADEMIA DE ȘTIINȚE A MOLDOVEI

INSTITUTUL DE GENETICĂ, FIZIOLOGIE ȘI PROTECȚIE A

PLANTELOR

Cu titlu de manuscris

C.Z.U: 633.85:575(043.2)

ŞESTACOVA TATIANA

CONTROLUL GENETICO-MOLECULAR AL REZISTENŢEI FLORII-

SOARELUI (HELIANTHUS ANNUUS L.) LA MANĂ (PLASMOPARA

HALSTEDII F. BERL ET DE TONI)

162.01. – GENETICĂ VEGETALĂ

Teză de doctor în științe biologice

Conducător ştiinţific: Duca Maria, acad., prof. univ.

Autor: Șestacova Tatiana

CHIŞINĂU, 2014

2

© Şestacova Tatiana, 2014

3

CUPRINS

ADNOTĂRI ................................................................................................................................ 5

LISTA ABREVIERILOR ......................................................................................................... 8

INTRODUCERE ..................................................................................................................... 10

1. CONTROLUL GENETICO-MOLECULAR AL REZISTENȚEI PLANTELOR LA

PATOGENI .............................................................................................................................. 16

1.1. Mecanismele genetico-moleculare ale rezistenţei la plante ................................................ 16

1.2. Rolul SRO în rezistenţa plantelor la patogeni .................................................................... 26

1.3. Mana florii-soarelui ............................................................................................................ 29

1.4. Rezistenţa florii-soarelui la mană ....................................................................................... 37

1.5. Concluzii la capitolul 1 ...................................................................................................... 42

2. OBIECTUL ŞI METODELE DE CERCETARE ................................................................ 44

2.1. Obiectul de studiu şi condiţiile de cultivare ........................................................................ 44

2.2. Metode de purificare şi determinare a calităţii şi cantităţii ADN-ului ............................... 45

2.3. Metode de purificare şi determinare a calităţii şi cantităţii ARN-ului ................................ 45

2.4. Metode de evaluare a polimorfismului genetic în baza PCR .............................................. 46

2.5. Evaluarea nivelului de expresie a genelor prin PCR cantitativ........................................... 50

2.6. Determinarea prezenţei peroxidului de hidrogen şi superoxidului prin colorare cu DAB şi

NBT ........................................................................................................................................... 51

2.7. Metode statistice de prelucrare a datelor ............................................................................ 51

2.8. Concluzii la capitolul 2 ....................................................................................................... 51

3. EVALUAREA VARIABILITĂŢII GENETICE ÎN GERMOPLASMA DE FLOREA-

SOARELUI .................................................................................................................................. 53

3.1. Determinarea polimorfismului genetic prin intermediul markerilor moleculari ................ 53

3.2. Screening-ul molecular al genelor de rezistenţă a florii-soarelui la mană .......................... 69

3.3. Concluzii la capitolul 3 ....................................................................................................... 76

4. INVESTIGAREA MECANISMELOR NESPECIFICE DE REZISTENŢĂ ALE

FLORII-SOARELUI LA MANĂ ............................................................................................... 77

4

4.1. Evaluarea virulenţei şi selectarea genelor implicate în răspunsul defensiv ........................ 77

4.2. Studiul expresiei unor transcripţi ai genelor codificatoare de enzime antioxidante ........... 80

4.3. Studiul expresiei unor transcripţi implicaţi în rezistența sistemică dobândită (RSD) ........ 98

4.4. Concluzii la capitolul 4 ..................................................................................................... 106

CONCLUZII GENERALE ȘI RECOMANDĂRI ................................................................. 109

BIBLIOGRAFIE ....................................................................................................................... 111

ANEXE ....................................................................................................................................... 132

Anexa 1. Act de implementare a rezultatelor științifice în instruire ....................................... 133

Anexa 2. Act de implementare a rezultatelor științifice în ameliorare .................................... 134

DECLARAȚIA PRIVIND ASUMAREA RĂSPUNDERII ................................................... 135

CV-UL AUTORULUI ............................................................................................................... 136

5

ADNOTARE

Șestacova Tatiana “Controlul genetico-molecular al rezistenţei florii-soarelui (Helianthus

annuus L.) la mană (Plasmopara halstedii F. Berl et de Toni)”, teză de doctor în științe biologice,

Chişinău, 2014. Teza include introducere, patru capitole, concluzii generale şi recomandări, bibliografia

din 299 surse, volumul total de 137 pagini, 15 tabele, 55 figuri. Rezultatele obţinute sunt publicate în 16

lucrări ştiinţifice.

Cuvinte-cheie: Helianthus annuus L., Plasmopara halstedii F. Berl. and de Toni, mecanisme

specifice și nespecifice de rezistență, RSD (rezistența sistemică dobândită), gene Pl, markeri moleculari,

expresia genelor.

Domeniu de studiu: Genetică vegetală.

Scopul prezentei lucrări constă în identificarea potenţialului de rezistenţă la mană în cadrul

resurselor genetice de floarea-soarelui din RM şi elucidarea unor procese cheie în mecanismul de control

genetico-molecular al rezistenţei florii-soarelui la P. halstedii F. Berl et de Toni.

Obiectivele de cercetare: studiul profilurilor genetice ale genotipurilor investigate privind

identificarea polimorfismului asociat cu rezistenţa și amprentarea cu ajutorul markerilor SSR; stabilirea

potențialului de rezistența specifică a resurselor genetice prin efectuarea screening-ului molecular al

genelor Pl1 și Pl6; evaluarea răspunsului defensiv realizat de inducerea schimbărilor în statutul redox prin

determinarea calitativă a peroxidului şi superoxidului; analiza expresiei genelor ce codifică enzimele

antioxidante implicate în metabolismul superoxidului, peroxidului și glutationului; studiul pattern-urilor

de expresie a genelor implicate în mecanismele de semnalizare celulară, reglare a activităţii

transcripţionale şi realizare RSD.

Noutatea şi originalitatea ştiinţifică. Pentru prima dată a fost evaluat potențialul de rezistență la

mană a germoplasmei autohtone de floarea-soarelui, fiind identificate 36 de genotipuri, care conţin gena

Pl1, 37 - gena Pl6 şi 24 de genotipuri care conţin genele Pl1 şi Pl6.

Studiile genetico-moleculare au evidenţiat aspecte noi privind mecanismele de rezistență a florii-

soarelui la mană, inclusiv: expresia diferenţiată a genelor implicate în menţinerea homeostaziei oxido-

reducătoare în funcţie de gradul de infectare; participarea factorului de transcripție Why1 în asigurarea

răspunsului florii-soarelui la atacul P. halstedii.

Problema ştiinţifică importantă soluţionată constă în fundamentarea cunoștințelor existente

despre mecanismele genetico-moleculare ale rezistenței plantelor la patogeni și evidențierea genotipurilor

de floarea-soarelui cu un potențial de rezistență la mană, în vederea facilitării utilizări acestora în

programe de ameliorare.

Semnificaţia teoretică. Rezultatele prezentate aprofundează cunoștințele despre: asocierea

markerilor SSR (ORS70 și ORS224) cu caractere economice valoroase – rezistența la mană; prezența

genelor de rezistență la mana în germoplasma florii-soarelui; participarea SRO în asigurarea răspunsului

la atacul patogenilor; mecanismele de menținere a statutului redox în condițiile stresului biotic;

mecanismul de declanșare RSD dependent sau independent de NPR1.

Valoarea aplicativă a lucrării. Prin PCR cu primeri specifici au fost puse în evidenţă 24

genotipuri, ce posedă genele de rezistenţă la mană, Pl1 şi Pl6, care pot fi utilizate în programe de

ameliorare şi selecţia formelor rezistente de floarea-soarelui. Cu ajutorul markerilor SSR au fost

genotipate 10 linii de floarea-soarelui care fac parte din colecţia de resurse genetice din RM.

Implementarea rezultatelor ştiinţifice. Datele obținute în lucrare servesc în calitate de material

ştiinţifico-didactic în predarea cursului de Fitopatologie. 24 de genotipuri, care conțin genele de rezistență

Pl1 și Pl6, au fost recomandați pentru utilizarea în programele de ameliorare pentru rezistență la mană.

Șapte markeri SSR sunt recomandați pentru amprentatarea liniilor parentale de floarea-soarelui. Primerii

elaboraţi pentru determinarea pattern-urilor de expresie ale genelor implicați în RSD sunt utilizaţi în

laboratorul Genomică, CBM, UnAȘM.

6

АННОТАЦИЯ

Шестакова Татьяна «Молекулярно-генетический контроль устойчивости

подсолнечника (Helianthus annuus L.) к ложной мучнистой росе (Plasmopara halstedii F. Berl

et de Toni)», диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук, Кишинэу,

2014. Работа включает введение, четыре главы, общие выводы и рекомендации, библиографию из

299 источников, 137 страниц общего объема, 15 таблиц, 55 рисунков. Полученные результаты

отражены в 16 научных публикациях.

Ключевые слова: Helianthus annuus L., Plasmopara halstedii F. Berl et de Toni,

специфические и неспецифические механизмы устойчивости, приобретенная системная

устойчивость, Pl гены, молекулярные маркеры, экспрессия генов.

Область исследований: Генетика растений.

Целью данной работы является выявление потенциала устойчивости и некоторых ключевых

процессов в механизме молекулярно-генетического контроля устойчивости подсолнечника к

ложной мучнистой росе (ЛМР).

Задачи исследования: анализ генетических профилей исследуемых генотипов с целью

выявления полиморфизма ассоциируемого с устойчивостью к ЛМР и генотипирование с помощью

микросателлитных маркеров; определение потенциала специфической устойчивости, используя

молекулярный скрининг генов Pl1 и Pl6; изучение защитной реакции, обусловленной

изменениями редокс-статуса с помощью качественного определения пероксида и супероксида;

оценка экспрессии генов, кодирующих антиоксидантные ферменты; изучение паттернов

экспрессии генов, ответственных за передачу сигнала, регуляцию транскрипции и реализацию

приобретённой системной устойчивости.

Новизна и научная оригинальность. Впервые была проведена оценка потенциала

устойчивости местной гермоплазмы подсолнечника к ЛМР и были выявлены 36 генотипов,

содержащих ген Pl1, 37 – ген Pl6 и 24 генотипа, обладающие обоими генами. Молекулярно-

генетические исследования выявили новые аспекты механизмов устойчивости подсолнечника к

ЛМР, включая: дифференциальную экспрессию генов в зависимости от степени инфицирования;

участие фактора транскрипции Why1 в обеспечении ответа подсолнечника на атаку ЛМР.

Решенная научная проблема состоит в расширении существующих знаний о молекулярно-

генетических механизмах устойчивости растений к патогенам и выявлении генотипов

подсолнечника с высоким потенциалом устойчивости к ЛМР для ускорения использования

последних в селекционных программах.

Теоретическая значимость. Полученные результаты расширяют базу знаний об

ассоциации микросателлитных маркеров (ORS70 и ORS224) с экономически важными

признаками; о присутствии генов устойчивости к ЛМР в гермоплазме подсолнечника; об участии

АФК в ответной реакции на атаку; о механизмах поддержания редокс-статуса под влиянием

биотического стресса; о зависимом и независимом от NPR1 механизме системной устойчивости.

Прикладная ценность работы. ПЦР выявил 24 генотипа, которые обладают двумя генами

устойчивости к ЛМР Pl1 и Pl6 и могут быть использованы в селекции. С помощью

микросателлитных маркеров были генотипированы 10 линий подсолнечника, которые являются

частью коллекции генетических ресурсов РМ.

Внедрение научных достижений. Результаты, описанные в работе, служат в качестве

научно-методического пособия в процессе преподавания курса Фитопатологии. 24 генотипа,

содержащие гены устойчивости Pl1 и Pl6, были рекомендованы для использования в селекции на

устойчивость к ЛМР. Семь микросателлитных маркеров рекомендуются для генотипирования

родительских линий подсолнечника. Разработанные праймеры используются в лаборатории

Геномики, УЦМБ, УнАНМ.

7

ABSTRACT

Șestacova Tatiana – “Molecular and genetic control of sunflower (Helianthus annuus L.)

resistance to downy mildew (Plasmopara halstedii F. Berl et de Toni)”, PhD thesis in Biological

Sciences, Chişinău, 2014. The thesis include introduction, four chapters, general conclusions and

recommendations, 299 references, a total volume of 137 pages, 15 tables, 55 figures. Obtained results

were published in 16 scientific papers.

Key words: Helanthus annuus L., Plasmopara halstedii F. Berl et de Toni, specific and non-

specific resistance mechanisms, SAR (systemic acquired resistance), Pl genes, molecular markers, gene

expression.

Direction of investigation: 162.01. – Plant genetics.

Research goal. The aim of this study was to determine resistance potential among genetic

resources of RM and some key processes within molecular mechanisms of genetic control of sunflower

downy mildew (DM) resistance.

Objectives: genetic profiles study among investigated genotypes for genetic polymorphism

identification in resistance context and fingerprinting using SSR markers; establishment of specific

resistance potential using molecular of Pl1 and Pl6 downy mildew resistance genes; evaluation of

defensive response ensured by modification in redox state through qualitative determination of peroxide

and superoxide; expression level establishment and analysis for genes encoding antioxidant enzymes

from superoxide, peroxide, gluthation metabolism; study of gene expression patterns involved in cell

signaling, regulation of transcription and SAR.

Scientific novelty and originality. For the first time were estimated resistance potential of original

sunflower germplasm through identification of 36 genotypes with Pl1 gene, 37 – with Pl6 gene and 24

containing both genes;

Genetic studies performed at molecular level revealed new apects regarding sunflower DM

resistance mechanism, including: differential expression of genes involved in maintance of oxido-

reduction homeostasis in function of infection degree; involvement of transcription factor Why1 from

Whirly family in insurance of sunflower response to P. halstedii atac.

The most important solved scientific problem was in the foundation of existing knowledge about

genetic and molecular mechanisms of plant resistance to pathogens and highlighting of sunflower

genotypes with high DM resistance potential, in order to facilitate their use in breeding programs.

Theoretical significance. Obtained results extend existing knowledges regarding: association of

SSR markers (ORS70 and ORS224) with economically valuable characters – DM resistance; presence of

DM resistance genes in sunflower germplasm (Pl genes screening); involvement of ROS in defence

response (ROS accumulation in function of infection degree, especially superoxide radical in regions of

conducting tissue); mechanism of redox state maintance in biotic stress condition; SAR triggering

dependent or independent of NPR1 (activation of signaling pathways of TGA and Whirly transcription

factors).

Applicative value of the work. PCR with specific primers revealed 24 genotypes, which possess

two DM resistance genes Pl1 and Pl6, that can be used in sunflower resistance breeding programs.

10 sunflower linies (ORS78, ORS237, ORS349, ORS366, ORS509, ORS811 şi ORS836), which

take part from collection of genetic resources of RM, were genotyped using SSR markers.

Implementation of scientific results. Obtained results serve as scientific and methodological

support for teaching Phytopathology course. 24 genotypes, which contain resistance genes Pl1 and Pl6

were recommended for use in DM resistance breeding programs. Seven SSR markers were recommended

for fingerprinting of sunflower parental linies. Primers developed for gene expression evaluation during

SAR are used in Genomics laboratory, UCMB, UnASM.

8

LISTA ABREVIERILOR

AFLP – Amplified Fragments Length Polymorphism (Polimorfismul Lungimii Fragmentelor

Amplificate)

AJ – acid jasmonic

AS – acid salicilic

ASC – androsterilitate citoplasmatică

BLAST – Basic Local Alignment Search Tool (Instrumentul de Baza de Căutare a Alinierilor

Locale)

CAPS – Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (Secvenţa Clivată Amplificată Polimorf)

CC – coiled coil (elicea dublă)

CTAB – CetylTrimethylAmmoniumBromide

DAB – 3,3'-Diaminobenzidină

DAMD – Directed Amplification of Minisatellite-region DNA (amplificare direcționată a

regiunii minisatelit de ADN)

EST– Expressed Sequence Tags (Secvențe expresate marcate)

ET – etilenă

GPX – glutation peroxidaza

HR – Hypersensitive response (Răspuns de hipersensibilitate)

ISSR – Inter-Simple Sequence Repeat (Amplificarea secvenţelor repetetive inter-simple)

LRR – Leucine Reach Repeats (repetări bogate în leucină)

MAMP – microbe-associated molecular pattern (pattern-urile moleculare asociate cu microbi)

MOPS – acid 3-(N-morfolino)propansulfonic

NBS – Nucleotide Binding Site (site-ul de legare a nucleotidelor)

NBT – Nitro blue tetrazolium chloride (clorură de nitro tetrazoliu albastru)

NCBI – National Center for Biotechnology Information (Centrul Național pentru Informații

Biotehnologice)

PAA – polyacrylamide (poliacrilamidă)

PAL – fenilalanin amonia-liaza

pb – perechi de baze

PIC – Polymorphic Information Content (conținutul informației polimorfe)

PR – Pathogenesis Related (asociate cu patogeneză)

PVP – polivinilpirolidonă

RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA (ADN Polimorf Amplificat Arbitrar)

9

RFLP – Restriction Fragments Length Polymorphism (Polimorfismul Lungimii Fragmentelor de

Restricţie)

RGA – Resistance Gene Analogs (analoguri genelor de resistență)

RGC – Resistance Gene Candidate (gene candidate de rezistență)

RSD - Rezistenţă Sistemică Dobândită

SAMPL – Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci (Amplificarea Selectivă

Locilor Microsateliți Polimorfe)

SCAR – Sequence Characterized Amplified Regions (Regiunile Amplificate cu Secvența

Caracterizată)

SRN – Specii Reactive de Nitrogen

SRO – Specii Reactive de Oxigen

SSH – Suppression Substraction Hybridization (hibridare substractivă)

SSR – Simple Sequence Repeat (Repetări de Secvențe Simple = microsateliți)

STMS – microsateliţi ai secvenţelor ţintă

STS – Sequence Tagged Sites (Site-uri cu Secvențe Marcate)

TAE – Tris-acetat-EDTA

TBE – Tris-borat-EDTA

TIR – receptor Toll/interleukin-1

UPGMA – Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (Metoda de Grupare a

Perechilor Neponderate în baza Mediilor Aritmetice)

VNTR – Variable Number of Tandem Repeats (Număr Variabil de Repetări în Tandem)

10

INTRODUCERE

Actualitatea şi importanţa problemei abordate

Floarea-soarelui este una dintre principalele culturi agricole din Republica Moldova, care

ocupă anual suprafața de 250 000 - 290 000 ha, amplasându-se pe locul trei după porumb şi grîu

[297].

Având în vedere extinderea excesivă a suprafețelor și susceptibilitatea înaltă la un şir de

boli, care cauzează pierderi economice considerabile [201] şi rolul florii-soarelui în acumularea

unor agenţi patogeni şi insecte dăunătoare, este necesar de a obține și cultiva hibrizi rezistenți.

Astfel, studiul mecanismelor de rezistență devine o direcție prioritară în cercetările acestei culturi

[5, 273].

Mana florii-soarelui, cauzată de agentul patogen Plasmopara halstedii F. Berl et de Toni

este una din cele mai devastatoare boli în toată lumea [201, 218]. Incidenţa manei florii-soarelui

într-un cîmp agricol poate varia, de la urme pînă la cca 50% sau chiar 95%. În Europa, începînd

cu anul 1941, cînd a fost observată pentru prima dată, boala s-a răspîndit rapid, fiind

consdiderată în anul 1977 o "boală majoră" în toate ţările producătoare de floarea-soarelui din

această parte a lumii. Majoritatea plantelor sistemic infectate mor prematur sau pot produce un

număr foarte mic de seminţe viabile. Răspîndirea bolii variază considerabil în funcţie de

condiţiile de creştere, în special nivelul de umiditate şi curenţii atmosferici [12, 218].

Principala sursă de infecţie cu P. halstedii sunt seminţele şi solul infectat cu oospori (sporii

de rezistenţă), capabili să supravieţuiască timp de 8-10 ani, ceea ce sporeşte dificultatea

eliminarii integrale a bolii odată ce a fost identificată [12, 13, 79].

În practica agricolă se obţin şi se comercializează numeroşi hibrizi de floarea-soarelui

rezistenţi la mană, însă apariţia noilor rase patogene pun sub semnul întrebării cultivarea cu

succes a acestora în anumite regiuni [115]. Pentru a opri răspândirea bolii sunt utilizate fungicide

cu proprietăţi sistemice de lungă durată, de exemplu, metalaxilul sau compuşi similari [272].

Însă metoda cea mai eficientă de combatere a patogenului este obţinerea hibrizilor rezistenţi [5,

115, 273]. Apariţia noilor rase patogene pune sub semnul întrebării cultivarea cu succes a

hibrizilor rezistenţi în anumite regiuni şi apare necesitatea de căutare şi combinare a noilor surse

de rezistenţă cu cele existente [5, 79, 115, 272, 273].

Interacţiunea dintre floarea-soarelui şi P. halstedii poate fi descrisă ca o relaţie tipică genă-

pentru-genă unde patotipurile patogenului au caracter de virulenţă diferit şi pot întâlni genotipuri

de floarea-soarelui cu sau fără genă/gene de rezistenţă efective împotriva lor. Cu toate că

genetica rezistenţei florii-soarelui la P. halstedii are o istorie de cercetare lungă şi o serie de gene

11

Pl sunt identificate şi încorporate în soiurile rezistente la mana, au rămas multe întrebări

nerezolvate, elucidarea cărora va permite controlul eficient al acestei boli devastatoare pe termen

îndelungat. Actualmente, cercetătorii din diferite ţări lucrează pentru a înţelege mai bine

mecanismul, precum şi baza genetico-moleculară a rezistenţei, selectând gene sau clustere de

gene noi care conferă rezistenţă şi genotipuri de interes cu ajutorul markerilor moleculari în

programe de ameliorare şi încercând să descopere modalităţi alternative de asigurare a rezistenţei

la floarea-soarelui [258, 269, 273].

Genele Pl (de la denumirea speciei Plasmopara) asigură rezistenţa florii-soarelui la una

sau mai multe rase ale patogenului. Facilitarea procesului de ameliorare pentru rezistenţa florii-

soarelui la mana poate fi realizată prin aplicarea tehnicilor selecţiei asistate de markeri, care

permit selectarea rapidă a liniilor parentale cu gene de rezistenţă pentru introgresia acestora în

forme hibride [5, 115, 273].

Pînă în prezent se cunosc 36 rase ale patogenului şi au fost descrise 18 gene (Pl) de

rezistenţă faţă de acest pathogen [114, 177]. Unele surse de rezistenţa au fost studiate şi

caracterizate din punct de vedere genetic, însă doar un număr limitat de loci (Pl1, Pl2, Pl5, Pl6,

Pl7, Pl8 ş.a.) a fost asociat cu markeri moleculari [184]. Astfel, pentru selecţia asistată de

markeri sunt recomandaţi markerii CAPS pentru gena Pl1 [104], SCAR pentru gena Pl2 [50],

markeri STS pentru locusul Pl5/Pl8 [207], markerii STS şi CAPS pentru gena Pl6 [49, 202] etc.

Reieşind din cele expuse conchidem că studiul diferitor aspecte ale rezistenței (specifică,

nespecifică şi sistemică) şi a componenţilor esenţiali, ce asigură răspunsul imun la plante, poate

contribui la elucidarea mecanismelor fundamentale de rezistență și facilitarea procesului de

ameliorare a culturilor agricole.

Scopul prezentei lucrări constă în identificarea potenţialului de rezistenţă la mană în cadrul

resurselor genetice de floarea-soarelui din RM şi elucidarea unor procese cheie în mecanismul de

control genetico-molecular al rezistenţei florii-soarelui la P. halstedii F. Berl et de Toni.

Obiectivele de cercetare:

studiul profilurilor genetice ale genotipurilor investigate privind identificarea

polimorfismului asociat cu rezistenţa și amprentarea cu ajutorul markerilor SSR;

stabilirea potențialului de rezistență specifică a resurselor genetice prin efectuarea

screening-ului molecular al genelor Pl1 și Pl6;

evaluarea răspunsului defensiv realizat de inducerea schimbărilor în statutul redox

prin determinarea calitativă a peroxidului şi superoxidului;

12

analiza expresiei genelor, ce codifică enzimele antioxidante implicate în

metabolismul superoxidului, peroxidului și glutationului;

studiul pattern-urilor de expresie a genelor implicate în mecanismele de semnalizare

celulară, reglarea activităţii transcripţionale şi realizarea rezistenței sistemice

dobândite (RSD).

Noutatea şi originalitatea ştiinţifică. Pentru prima dată a fost evaluat potențialul de

rezistență la mană a germoplasmei autohtone de floarea-soarelui, fiind identificate 36 de

genotipuri, care conţin gena Pl1, 37 - gena Pl6 şi 24 de genotipuri care conţin genele Pl1 şi Pl6.

Studiile genetico-moleculare au evidenţiat aspecte noi privind mecanismele de rezistență a

florii-soarelui la mană, inclusiv:

expresia diferenţiată a genelor implicate în menţinerea homeostaziei oxido-reducătoare

superoxid dismutazele (SOD), catalazele (CATA), ascorbat peroxidazele (APX), oxidaza

alternativă (AOX), peroxiredoxina (PRX), glutation sintetaza (GSS), glutation-S-transferaza

(GST), glutation peroxidaza (GPX) – în funcţie de gradul de infectare;

participarea factorului de transcripției Why1 din familia Whirly, implicat în calea de

semnalizare a acidului salicilic (AS) și în asigurarea răspunsului florii-soarelui la atacul P.

halstedii.

Problema ştiinţifică importantă soluţionată constă în fundamentarea cunoștințelor

existente despre mecanismele genetico-moleculare ale rezistenței plantelor la patogeni și

evidențierea genotipurilor de floarea-soarelui cu un potențial de rezistență la mană, în vederea

facilitării utilizări acestora în programe de ameliorare.

Semnificaţia teoretică. Rezultatele prezentate aprofundează cunoștințele despre:

asocierea markerilor SSR (ORS70 și ORS224) cu caractere economice valoroase, în special,

rezistența la mană;

prezența genelor de rezistență la mană în germoplasma florii-soarelui (screening-ul genelor

Pl);

participarea speciilor reactive ale oxigenului (SRO) în asigurarea răspunsului la atacul

patogenilor (acumularea SRO în dependență de gradul de atac, în special, a radicalului

superoxid în regiunele țesuturilor conducătoare);

mecanismele de menținere a statutului redox în condițiile stresului biotic;

13

mecanismul de declanșare a RSD dependent sau independent de NPR1 (prin activarea

căilor de semnalizare a factorilor de transcripție TGA sau Whirly).

Valoarea aplicativă a lucrării. Prin PCR cu primeri specifici au fost puse în evidenţă 24

genotipuri, care posedă genele de rezistenţă la mană Pl1 şi Pl6, și pot fi utilizate în programele

de ameliorare ale formelor rezistente de floarea-soarelui.

Cu ajutorul markerilor SSR au fost genotipate 10 linii (Drofa ASC, Xenia ASC, LC 40

ASC, LC 38 ASC, LC SW 391A ASC, Drofa Rf, LC Raus Rf, LC 637 Rf, LC 7 Rf și LC 39 Rf)

de floarea-soarelui, care fac parte din colecţia de resurse genetice ale RM.

Markerii microsateliţi testaţi sunt utilizaţi pentru genotiparea liniilor, soiurilor, hibrizilor de

floarea-soarelui de origine autohtonă, estimarea purităţii materialului semincer, stabilirea

gradului de hibridare a seminţelor, evidențierea autenticității genotipurilor.

Aprobarea rezultatelor științifice. Rezultatele expuse în teză au fost prezentate şi

discutate în cadrul lucrărilor: Simpozionului ştiinţific cu participare internațională ”Horticultura

– știinţă, calitate, diversitate, armonie” (Iaşi, 26-28 mai 2011); Conferinţei ştiinţifice în

memoriam academicianului Anatolie Jacotă (Chişinău, IGFP, 21 iunie 2011); The 4th

International Conference for young scientists ”Molecular biology: Advances and Perspectives”

(Kiev, IMBG, 14-17 September 2011); Simpozionului Ştiinţific Internaţional ”Rezervaţia Codrii

– 40 de ani” (Lozova, 29-30 septembrie 2011); 16-ой Международной Пущинской школы-

конференции молодых ученых ”Биология – наука ХХI века” (Пущино, 16-21 апреля 2012);

Всероссийской молодежной конференции ”Актуальные проблемы химии и биологии”

(Пущино, 30 июля – 3 августа 2012); III International Vavilov Conference ”N. I. Vavilov’s

Ideas in the Modern World” (Sankt-Petersburg, 5-9 november 2012); IX International Scientific

Conference for students and PhD students ”Youth and progress of biology” (Lviv, 16 – 19 April

2013); 17-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых

«Биология – наука ХХI века» (Пущино, 21-26 апреля 2013); ”European Biotechnology

Congress” (Bratislava, 16 – 18 May 2013); al III-lea Simpozion Naţional ”Biotehnologii

avansate – realizări şi perspective” (Chişinău, 24-25 octombrie 2013); International Plant

Breeding Congress (Antalya, Turkey, 10-14 November 2013).

Cercetările expuse în lucrare au fost realizate în cadrul proiectului internaţional bilateral cu

Republica Belarus ”Amprentarea genotipurilor de floarea-soarelui şi stabilirea gradului de

hibridare a seminţelor prin utilizarea marcherilor moleculari” (10.820.04.14/BA, 2010-2011);

instituţional ”Aspecte funcţionale şi genetico-moleculare ale genomului la floarea-soarelui

14

(Helianthus annuus L.)” (11.817.04.19F, 2011-2014) şi proiectului independent pentru tineri

cercetători ”Expresia genelor implicate în răspunsul defensiv al florii-soarelui la mana

(Plasmopara halstedii F. Berl et de Toni)” (13.819.14.12A, 2013-2014).

Sumarul compartimentelor tezei

Lucrarea cuprinde: adnotare prezentată în limbile – română, rusă şi engleză, lista

abrevierilor, introducere, patru capitole, concluzii generale şi recomandări practice, bibliografie,

declaraţia privind asumarea răspunderii şi CV.

În introducere se argumentează actualitatea şi importanţa problemei abordate; sunt

formulate scopul şi obiectivele tezei; sunt expuse noutatea ştiinţifică a rezultatelor obţinute,

importanţa teoretică şi valoarea aplicativă a lucrării, aprobarea rezultatelor şi este inclus sumarul

compartimentelor tezei.

Capitolul 1 ”Controlul genetico-molecular al rezistenței plantelor la patogeni” include o

sinteză a datelor recente din literatura de specialitate privind diferite tipuri de rezistenţă existente

(specifică, nespecifică, sistemică dobândită), mecanismele genetico-moleculare ale rezistenţei la

plante, rolul SRO în răspunsul defensiv al plantelor la atacul patogenilor, particularităţile manei

florii-soarelui, aspectele interacţiunii florii-soarelui cu mana, genele specifice de rezistenţă la

mană şi mecanismele nespecifice de rezistenţă. O atenţie deosebită a fost acordată procesului de

declanşare şi realizare a rezistenţei sistemice dobândite şi rolului SRO, care participă în

asigurarea răspunsului defensiv practic în cadrul tuturor tipurilor de rezistenţă. Cunoaşterea

aprofundată a rezistenţei specifice şi nespecifice a florii-soarelui la mană va contribui la

facilitarea elaborării strategiilor noi de monitorizare şi control a bolii respective.

Capitolul 2 ”Obiectul şi metodele de cercetare” conţine descrierea metodologiei utilizate

pentru realizarea studiului, obiectului de studiu şi condiţiilor de cultivare. Pentru evidenţierea

polimorfismului genetic al materialului investigat şi genotiparea liniilor parentale valoroase au

fost utilizaţi markeri microsateliţi. Prezenţa genelor, care asigură rezistenţa specifică la mană a

fost demonstrată cu ajutorul marekrilor CAPS şi STS. Estimarea nivelului de expresie a genelor

a fost realizată prin PCR cantitativ precedat de transcripţie inversă, utilizînd ARN, extras din

plante cu nivel diferit de infectare.

Capitolul 3 ”Evaluarea variabilităţii genetice în germoplasma de floarea-soarelui”

cuprinde datele obţinute în urma analizei SSR a genotipurilor investigate. Investigarea

profilurilor generate de primeri incluşi în studiu, în special ORS70 şi ORS224, a permis de a

evidenţia unele benzi asociate cu rezistenţa şi susceptibilitatea la mana. Zece linii parentale

valoroase din punct de vedere economic au fost genotipate cu ajutorul a şapte markeri

15

microsateliţi, caracterizaţi printr-un nivel înalt de polimorfism şi claritatea profilurilor generate.

De asemenea, capitolul include datele privind analiza clusteriană a genotipurilor investigate cu

scopul clasificării acestora în baza distanţelor genetice. În concluziile capitolului se rezumă

valoarea aplicativă a rezultatelor obţinute şi perspectivele utilizării markerilor selectaţi pentru

studiu.

În subcapitolul ”Screening-ul molecular al genelor de rezistenţă a florii-soarelui la mană”

sunt prezentate rezultatele privind prezenţa sau absenţa genelor de rezistenţă la mana Pl1 şi Pl6,

obţinute cu ajutorul markerilor moleculari linkaţi cu genele respective. Astfel, au fost puşi în

evidenţă 24 genotipuri, care conţin ambele gene de rezistenţă. Rezultatele obţinute prezintă un

interes deosebit pentru amelioratori, oferind informaţii valoroase despre germoplasma de floarea-

soarelui autohtonă, asfel, contribuind la facilitarea procesului de amelioarare a acestei culturi. În

concluzii la capitol se menţionează că genele de rezistenţă la mană preponderent au fost prezente

la genotipurile paterne (Rf) şi hibrizii F1.

Capitolul 4 ”Investigarea mecanismelor nespecifice de rezistenţă ale florii-soarelui la

mană” conţine datele despre nivelul de expresie a genelor codificătoare de enzime antioxidante

implicate în metabolismul peroxidului, superoxidului şi glutationului şi celor asociate cu RSD.

De asemenea, în capitolul 4 sunt prezentate rezultatele colorării cu DAB şi NBT pentru

detectarea peroxidului şi superoxidului în plantele infectate şi control, care demonstrează că

infectarea cu mană acţionează preponderent în direcţia sintezei radicalului superoxid. În capitol

este expusă descrierea detaliată a pattern-urilor de expresie a genelor superoxid dismutazelor,

catalazelor, ascorbat peroxidazelor ş.a., care sunt dependente atât de genotip cît şi de gradul de

atac cu mană. Analiza expresiei unor factori de transcripţie (Why1, TGA2 ş.a.) şi a proteinelor

implicate în semnalizarea celulară aduc contribuţii noi în elucidarea fenomenului de rezistenţă

sistemică dobândită.

16

1. CONTROLUL GENETICO-MOLECULAR AL REZISTENȚEI PLANTELOR

LA PATOGENI

Controlul bolilor la plante este un obiectiv major al ameliorării, programelor de

monitorizare a patologiilor şi chimiei agricole. Plantele posedă mecanisme de apărare

constitutive, existente, reprezentate de barierele mecanice (peretele celular, cuticula, etc) sau

compuşi secundari antimicrobieni pre-existenţi – fitoanticipine, şi induse, determinate de atacul

patogenilor, cum ar fi fortificarea peretelui celular sau inducerea sintezei fitoalexinelor,

substanţelor fenolice ş.a. Reacţia de răspuns a plantelor se manifestă prin procese biochimice şi

fiziologice similare, indiferent de tipul rezistenţei, însă inducerea acesteia este diferită.

1.1. Mecanismele genetico-moleculare ale rezistenţei la plante

Pe parcursul evoluţiei plantele au dezvoltat mecanisme complexe de recunoaştere şi

răspuns la infecții provocate de un număr mare de agenți patogeni [154]. Sunt descrise cîteva

tipuri de rezistenţă: specifică, nespecifică, sistemică dobândită ş.a.

Rezistenţa specifică este determinată de interacţiunea între genele R (Resistance) ale

plantei şi genele Avr (Avirulence) ale patogenului [98]. Recunoaşterea efectorilor patogenului

declanşează activarea unor cascade de semnalizare, care asigură răspunsul de apărare [98, 154,

166].

Rezistenţa nespecifică sau cantitativă este determinată de efectul cumulativ al genelor de

rezistenţă minore şi de condiţiile de mediu [91].

Rezistenţa sistemică dobândită (RSD; Systemic Acquired Resistance – SAR) este asociată

cu inducerea expresiei genelor codificatoare de proteine asociate cu patogeneza (Pathogenesis-

Related – PR) şi are efect durabil la un spectru larg de patogeni [91, 111].

Actualmente se observă o tendinţă clară de unificare a conceptelor în descrierea

diverselor tipuri de rezistenţă, întrucît mecanismele defensive sunt similare, dar se activează în

mod diferit în dependenţă de tipul rezistenţei [129].

1.1.1. Rezistenţa specifică

Unul dintre obiectivele de bază în controlul bolilor la plante este obţinerea soiurilor,

hibrizilor şi varietăţilor cu gene de rezistenţă majore. Acest tip de rezistenţă este uşor de obţinut

prin ameliorare și de menținut la un nivel înalt până ce nu se dezvoltă rase de agenţi patogeni

mai agresivi. În cazul cînd se identifică o altă genă, care determină rezistenţă la rasele noi ale

patogenului, aceasta poate fi introdusă în alte genotipuri de perspectivă. Astfel, amelioratorul

17

aplică principiul ipotezei “genă-pentru-genă” (gene-for-gene hypothesis), propusă de Flor

(1956), ca cea mai simplă explicaţie a rezultatelor unor studii, privind moştenirea patogenităţii la

rugina inului Melampsora lini. Pentru fiecare genă de rezistenţă (gena R) la gazdă există o genă

corespunzătoare la parazit care condiţionează patogenitatea acestuia (gena Avr). Fiecare genă a

unui membru al sistemului gazdă-parazit poate fi identificată doar de către omologul său în alt

membru al sistemului [98].

Gena de rezistenţă implicată are, în general, un efect fenotipic puternic, dar restrâns şi,

astfel, selectiv în modul ei de a reacţiona împotriva genelor de virulenţă din populaţia

parazitului. Deci rezistenţa specifică operează doar împotriva anumitor rase ale patogenului.

Acest tip de rezistenţă mai este numit şi rezistenţă verticală [263] sau rezistenţă diferenţială [21].

Alte denumiri similare sunt: rezistenţa monogenică, oligogenică, majoră, specifică. Această

rezistenţă reţine declanşarea unei epifitii şi oferă un mecanism de apărare împotriva raselor

specifice ale patogenului. Neajunsul ei este posibila răspândire a raselor specifice ale

patogenului, dacă o anumită formă-gazdă se extinde în cultură [5].

Identificarea mai multor gene R, şi în majoritatea cazurilor, a proteinelor efectori

corespunzătoare, a accelerat cercetarea bazelor moleculare rezistenţei de tipul „genă-pentru-

genă” [62, 165].

Majoritatea proteinelor R, care sunt activate în timpul recunoaşterii efectorului, se referă

la cele cinci clase de bază, formate în primul rând prin combinarea unui număr limitat de motive

structurale [166].

Clasa 1 constă doar dintr-un singur membru, gena Pto de la tomate, care are o regiune

catalitică kinazei serină/treonină şi un motiv de miristoilare la capătul N-terminal [158, 164].

Clasa 2 cuprinde un număr mare de proteine, care au o regiune de repetări bogate în

leucină “leucine-rich repeats” (LRR), un site presupus de legare a nucleotidelor “nucleotide

binding site” (NBS sau NB), şi la capătul N-terminal “leucine-zipper” (LZ) sau alte secvenţe cu

structura elicei duble “coiled-coil” (CC) [166].

Clasa 3 este similară cu clasa 2, dar în loc de secvenţa CC aceste proteine au o regiune la

capătul N-terminal similară cu proteinele receptorilor Toll şi Interleucină 1 (IL-1R), care este,

prin urmare, menţionată ca regiune TIR. Proteinele R din primele trei clase se caracterizează prin

lipsa domenelor transmembranare (TM) şi toate sunt localizate intracelular [166].

Proteinele Cf de la tomate formează clasa 4. Acestea se caracterizează prin lipsa site-ului

NBS, deşi au domenul transmembranar (TM), repetarea LRR extracelulară şi o coadă mică

posibil cu localizare citoplasmatică fără motive evidente [81, 128, 166].

În cele din urmă, clasa 5 include proteina Xa21 de la orez, care are pe lîngă o repetare

18

LRR extracelulară şi un domen TM, o regiune citoplasmatică caracteristică kinazei

serină/treonină [237]. Unele proteine R nu se încadrează în aceste cinci clase [166].

Există şi alte clasificări ale genelor R [124, 266]. Astfel, Gerben van Ooijen şi

colaboratorii evidenţiază patru clase caracteristice proteinelor R: clasa CNL (CC-NB-LRR

proteine, analogul clasei 2), TNL (TIR-NB-LRR proteine, analogul clasei 3), RLP (Receptor-

Like Proteins, analogul clasei 4) şi RLK (Receptor-Like Kinases, analogul clasei 5) şi alte

proteine, care nu se includ în clasele respective [266] (Figura 1.1).

Fig. 1.1. Reprezentare schematică ai membrilor tipici din cele patru clase ale proteinelor R

Sunt indicate domenele proteice şi localizarea lor prezumptivă [266].

În anul 2007 au fost identificate şi clonate mai mult de 55 gene R, care asigură rezistenţă

specifică la diferite plante mono- şi dicotelidonate [266]. Numărul acestora creşte continuu.

Utilizarea sistemelor model plantă-patogen a contribuit în mare măsură la clonarea şi

caracterizarea genelor R. Majoritatea genelor R au fost izolate la Arabidopsis, care este o specie

model. Multe gene R, au fost izolate la speciile din familia Solanaceae (tomatul, cartof, ardei şi

tutun) şi la orz, orez şi in. Importanţa utilizării unei game largi de specii de plante pentru studiul

genelor R este evidentă deoarece, până în prezent, nu există nici o genă R la Arabidopsis clonată,

care se încadrează în clasele 1, 4 şi 5. Cu toate acestea, genele omoloage pentru fiecare dintre

aceste gene sunt prezente la Arabidopsis şi este posibil că ele între ele vor funcţiona ca gene ale

rezistenţei. De exemplu, FLS2 de la Arabidopsis, nu este o proteina R, deşi are o similaritate cu

Xa21 şi joacă un rol în recunoaşterea flagelinei bacteriene [109].

19

A existat o tendinţă clară spre identificarea şi descrierea genelor R la specii dicotiledonate

şi doar câteva gene R au fost clonate din cele monocotiledonate (Xa21, Rpg1, seria Mla) [52,

117, 237, 293]. Analiza bazelor de date EST (Expressed Sequence Taggs) la plante a relevat că

plantele monocotiledonate nu au proteine similare cu TIR-NBS-LRR [168, 196] şi acest lucru

sugerează că ar putea exista unele diferenţe fundamentale în mecanismele de rezistenţă între

speciile di- şi monocotiledonate.

Mai mult ca atât, loci ce corespund genelor R au fost, de asemenea, studiaţi pe scară

largă. În aceste studii genetice, locii ce conferă rezistenţă unui soi de plante la rasa specifică a

patogenului au demonstrat distribuţie particulară în cadrul genomului. Pentru locii respectivi sunt

cunoscute două tipuri de organizare genomică: variaţie alelică şi tandemurile cromozomiale şi

clustere de gene strâns linkate Această distribuţie a locilor R în genomurile vegetale pune în

evidenţă două probleme importante: originea acestui tip de organizare a genelor şi distribuirea

lor, precum şi evoluţia locilor R [171].

Genetica clasică demonstrează tendinţa genelor de rezistenţă spre clusterizare/grupare în

cadrul genomului. Primele studii preponderent au fost focusate pe un singur patogen, însă

apariţia hărţilor genetice complexe bazate pe markeri moleculari a permis cartarea genelor

multiple de rezistenţă. Locusul R poate să prezinte o singură genă cu mai multe variante alelice.

Exemple de acest tip de loci sunt locusul L la in (13 alele) şi RPM1 la Arabidopsis (2 alele). Cel

mai des, genele R sunt organizate în clustere şi arată un nivel variabil de recombinare între

genele din componenţa lor. Genele dintr-un singur cluster pot determina rezistenţa la patogeni

foarte diferiţi [166, 171, 266].

În modelul genă-pentru-genă, interacţiunea între părţile sistemului are loc după modelul

receptor-ligand. Se presupune că proteinele R acţionează în calitate de receptori, care recunosc

proteinele Avr ale patogenului, formând un complex R-Avr pentru activarea diferitelor

răspunsuri defensive (Figura 1.2) [98, 154].

Actualmente, sunt cunoscute două mecanisme alternative, ce explică modul de acţiune în

acest model: interacţiune directă şi indirectă. Interacţiunea directă sugerează că efectorul

patogenului Avr interacţionează direct pentru declanşarea semnalizării în cadrul rezistenţei

mediate de gene R. De exemplu, a fost demonstrat că gena R de la orez Pita interacţionează

direct cu AVR-Pita de la Magnaporthe grisea, însă în cazul alelei genei Pi-ta asociate cu

susceptibilitatea, interacţiunea lipseşte [127].

O asemenea interacţiune directă, specifică de alelă este cunoscută pentru alelele L la in,

care corespund genelor Avr a ruginii inului [83].

20

Totodată, majoritatea datelor pun în evidenţă modelul indirect, numit și “ipoteza de

gardă” (“guard hypothesis”) [25, 129, 261, 262]. În acest model proteina R joacă rolul unui

“supraveghetor” (“guardee”), care monitorizează modificarea proteinelor gazdei după legarea

cu efectorul Avr corespunzător. Pentru prima dată acest model a fost aplicat în explicarea

semnalizării de apărare asigurate de AvrPto/AvrPtoB-Pto-Prf [261]. În conformitate cu acest

model, Prf reprezintă o genă R, care codifică proteina LZ-NBS-LRR ce determină activitatea

Pto, o parte componentă a complexului R-Avr şi ţinta AvrPto [129].

Fig. 1.2. Mecanisme de interacţiune a genelor R cu genele Avr

(a) La plante lipsesc genele R, proteina Avr se leagă cu ţinta de virulenţă (virulence Target (VT)). Cînd plantele

dispun de gene R, însă nu sunt atacate de patogeni, proteina R apare în celulele gazdă în configuraţie inactivă. Cînd

proteina Avr este introdusă în celulele patogenului, proteina R este activată prin două modele pentru asigurarea

transferului semnalului de rezistenţă: proteina Avr interacţionează cu proteina R direct, declanşînd răspunsul de

rezistenţă (b), sau indirect prin intermediul proteinei-gazdă (host protein, HP), precum, şi a unui chaperon molecular

(MC), formând complexul R-Avr şi inducând rezistenţa (c) [154].

Un alt exemplu ce denotă “ipoteza de gardă”, este ghidarea activităţii proteinelor RPM1

şi RPS2, care interacţionează cu trei efectori diferiţi de tip III AvrRpm1/AvrB şi AvrRpt2 de la

Pseudomonas syringae [159, 160].

21

1.1.2. Rezistenţa nespecifică. Mecanisme de rezistenţă a plantelor la stresul biotic

Rezistenţa nespecifică implică un sistem de protecţie direct, care întârzie ciclul sau

capacitatea de reproducere a unui patogen. Specia gazdă încearcă să se protejeze prin

dezvoltarea de bariere împotriva invaziei şi a capacităţii patogenului de a creşte, de a se extinde

şi reproduce. Rezistenţa nespecifică este, în general, un sistem de protecţie complex -

morfologic, histologic şi metabolic - dependent de condiţiile de mediu şi de cele ontogenetice.

Complexitatea ei oferă siguranţă şi durabilitate, dar implică dificultăţi de manipulare, evaluare,

acumulare şi transfer. Întrucât rezistenţa nespecifică operează împotriva tuturor raselor sau

izolatelor patogenului, nu există interacţiuni varietate x rasă ca în cazul rezistenţei specifice [5,

153].

Rezistenţa nespecifică este considerată rezistenţă de tip orizontal [263] sau uniformă [21],

fiind denumită şi poligenică, multigenică, generală, parţială sau rezistenţă de câmp. O astfel de

rezistenţă are o durată mai lungă, fiind mai greu de învins de rasele noi ale patogenului.

Rezistenţa orizontală sau uniformă este controlată poligenic de gene nespecializate, implicând

numeroşi factori pe care gazda rezistentă îi opune pătrunderii parazitului, răspândirii,

multiplicării şi reproducerii lui în ţesuturile gazdă [5, 153].

Mecanismele constitutive sau de apărare pasivă includ barierele morfologice,

structurale şi chimice, fiind primul obstacol, care trebuie să fie depăşit de patogen. Un exemplu

bine recunoscut de bariere morfologice este dimensiunea osteolelor stomatelor [136]. Astfel, unii

fungi, ce produc rugina la plante, posedă mecanisme de detectare fină a dimensiunilor osteolelor

plantelor susceptibile. Astfel, atunci când hifele găsesc o osteolă de dimensiune corespunzătoare,

acestea sunt programate să fie supuse unui proces de dezvoltare, care rezultă în formarea de

structuri invazive, ce pătrund în stomate şi încep colonizarea interiorului frunzei [120].

Barierele structurale, cum ar fi ceara, cutina, suberina, lignina, celuloza, caloza şi

proteinele peretelui celular, des sunt fortificate rapid în timpul procesului infecţios. Totodată,

plantele constitutive produc o multitudine de metaboliţi secundari şi proteine antifungice,

majoritatea cărora acţionează ca compuşi antimicrobieni în timpul apărării împotriva

microorganismelor. Acestea includ fenoli de diferită structură, saponine, terpenoizi şi steroizi.

Unii compuşi constituitivi posedă acţiune toxică, în timp ce alţii apar ca conjugate, cum ar fi

glicozidele care nu sunt toxice în sine, dar îşi capătă toxicitatea în urma distrugerii conjugatului.

De exemplu, la invazia patogenului glicozidele plantelor sunt adesea hidrolizate de glicozidaze

vacuolare, eliberând agliconii care pot fi destul de toxici, nu numai pentru fitopatogen, dar şi

pentru celulele plantelor localizate în vecinătate [136, 289].

22

Mecanismele de rezistenţă induse sau active includ sisteme, care necesită consum de

energie pentru recunoaşterea specifică a patogenului, care în cele din urmă, determină

producerea proteinelor sau a metaboliţilor antagonişti invadatorului [136]. Ele sunt considerate al

doilea obstacol la invazia patogenului. Mecanismele de apărare induse au mai multe avantaje,

cum ar fi reducerea costurilor biosintetice de apărare sau evitarea faptului că alte organisme pot

exploata apărarea în beneficiul propriu [61, 134, 288].

Răspunsurile de apărare induse sau active includ stresul oxidativ, moartea locală a

celulelor, acumularea fitoalexinelor, sinteza proteinelor PR (pathogenesis-related) şi altor

proteine, care participă la fortificarea peretelui celular, cum ar fi glicoproteinele bogate în

hidroxiprolină, creşterea nivelului de transcripţie a genelor pentru enzimele implicate în fluxul de

carbon de la metabolismul primar la cel secundar, cum ar fi peroxidazele, lipooxigenazele,

superoxiddismutazele şi fenilalanin-amonia-liaza (PAL), o enzimă-cheie în biosinteza

compuşilor fenolici cu activitate antimicrobiană [180].

Mecanismele de apărare induse sunt declanşate sistematic la plante în răspunsul la

infecţii. În primul rând, în calitate de răspuns local apare o necroză limitată în spaţiu, frecvent

indusă fie de moartea celulelor cauzată de acţiunea agentului patogen într-o interacţiune

compatibilă sau de moartea celulelor vegetale endogene după recunoaşterea agentului patogen de

către gazdă, într-o interacţiune incompatibilă – răspuns hipersensibil (RH) [161]. RH

reprezintă apoptoza indusă de agentul patogen, rapidă şi localizată în locul de infecţie, prin care

celulele plantei reacţionează la atacul patogenului prin moartea programată a celulelor, ce

include scurgeri de electroliţi din citoplasmă şi stresul oxidativ [180, 231]. Ca rezultat, patogenul

rămâne limitat la leziunile necrotice lîngă site-ul de infecţie.

Cunoştinţele despre transducerea semnalelor în RH sunt încă incomplete, dar mai multe

gene de interes au fost deja identificate, inclusiv proteinkinazele şi fosfatazele, genele

calmodulinei şi altele cu funcţii biochimice necunoscute, care activează în cele din urmă

transcripţia genelor răspunsului defensiv. Rezistenţa dobândită, localizată într-un inel de celule

în jurul leziunilor necrotice asigură insensibilitatea completă acestora la infecţiile ulterioare [44,

101].

Timp de câteva ore după apatiţia necrozei localizate, planta începe a expresa un set de

gene de apărare atât la nivel local, la punctul de infecţie, cît şi sistemic, în alte organe ale plantei

[26, 264]. Astfel, RH local de multe ori declanşează un semnal sistemic, care transformă

rezistenţa nespecifică la nivelul plantei întregi, în rezistenţa sistemică dobândită (RSD), care

conferă protecţie sporită de lungă durată împotriva infectării ulterioare de un spectru larg de

agenţi patogeni [91, 217, 236, 242].

23

Spre deosebire de RH, dezvoltarea RSD este lentă şi treptată. În acest răspuns defensiv

sistemic, semnalul se extinde de la locul interacţiunii plantă-patogen şi este mediat de un set de

molecule endogene de semnalizare defensivă, care au fost identificate ca mesageri la plante,

inclusiv acidul salicilic (AS), acidul jasmonic (AJ), etilena (ET), oxidul de azot (NO) sau speciile

reactive ale oxigenului (SRO) [34, 38, 179].

Mesagerii respectivi interacţionează cu proteinele specifice, care sunt implicate în

activarea transcripţiei genelor de răspuns la patogen (pathogen-responsive genes). Aceste gene

RSD sunt considerate a fi responsabile de rezistenţa sporită a ţesuturilor non-infectate, secundare

ale plantelor la infecţiile ulterioare de către acelaşi patogen sau chiar agenţi patogeni

independenţi [161, 179, 289].

1.1.3. Rezistenţa sistemică dobândită

RSD este activată în multe specii de plante de către agenţii patogeni ce cauzează necroza,

în calitate de parte componentă a RH sau ca un simptom al bolii. Rezistenţa conferită este de

lungă durată, uneori, pentru durata de viaţă a plantelor, precum şi eficientă împotriva unui

spectru larg de agenţi patogeni – virusuri, bacterii, fungi şi oomicete [217, 242].

La nivel molecular RSD se caracterizează prin creşterea expresiei unui număr mare de

gene PR în ţesuturi la nivel local şi sistemic [264, 265].

Posibil RSD mai curînd este rezultatul efectelor acţiunii mai multor proteine PR, decât a

unei singure proteine specifice. Totodată, rolul lor în stabilirea RSD nu este clar, deşi genele PR

servesc în calitate de markeri moleculari utili pentru depistarea RSD [91].

NON - EXPRESSOR OF PATHOGENESIS-RELATED1 (NPR1), de asemenea cunoscut

ca NON-IMMUNITY1 (NIM) este reglatorul pozitiv central în semnalizarea RSD [82, 99].

Proteina NPR1 conţine repetarea ankirin şi domenul BTB/POZ [55], şi funcţionează după AS.

Acumularea de AS induce schimbările potenţialului redox celular, declanşând reducerea NPR1

din oligomeri citozolici, ce au legături disulfurice, în monomerii activi, care sunt transportaţi

spre nucleu, unde interacţionează cu factori de transcripţie TGA [75, 181]. Interacţiunea

respectivă stimulează legarea factorilor TGA cu elementele AS-răspunzătoare în promotorii

genelor PR şi reprogramarea transcripţională ulterioară, astfel contribuind la stabilirea RSD. Spre

exemplu, expresia excesivă NPR1 în orez (sau ortologului acesteia în orez – NH1) asigură

rezistenţă sporită la bacteria fitopatogenă Xanthomonas oryzae pv.oryzae, ce denotă faptul că

funcţia NPR1 pare să fie conservată între plantele mono- şi dicotiledonate [60]. Dintre factorii de

transcripţie TGA, anume TGA2, TGA5 şi TGA6 joacă un rol important în inducerea RSD [91].

24

Rolul NPR1 nu este limitat numai la RSD, NPR1 de asemenea reglează interrelaţiile în

semnalizarea AS şi AJ, funcţionînd ca un reglator-cheie în integrarea şi declanşarea răspunsurilor

sistemice dependente de natura patogenului. Semnalizarea în cadrul rezistenţei sistemice induse

(ISR/Induced Systemic Resistance) dependentă de NPR1 nu necesită localizarea nucleară a NPR1

activată de potenţialul redox [238], AJ şi AIA (acidul indolilacetic), fiind semnalul de inducere

[241]. Alte ţinte posibile sunt factorii de transcripţie WRKY, ce se leagă cu W-box ale genelor

PR, precum ar fi reglatorul pozitiv al semnalizării AS – WRKY70 [150]. Totodată, ţintele NPR1

pot fi reglatori negativi a semnalizării AS, precum mitogen-activated protein (MAP) kinase 4

(MAPK4), ce reglează negativ răspunsul de apărare mediat de AS şi pozitiv acela de AJ [204].

Nu toate răspunsurile mediate de RSD sunt dependente de NPR1. Factorul de transcripţie

Whirly (AtWHY1) de la Arabidopsis funcţionează în calitate de factor dependent de AS şi

independent de NPR1. AtWHY1 se leagă de domene PB boxes, care sunt supra-reprezentate în

transcripţi asociaţi cu inductor RSD [76, 162]. Nu este clar de ce AtWhy1 şi AtWhy2 sunt

localizate în cloroplaste şi mitocondrii [145], ceea ce necesită studii ulterioare.

Se consideră că semnalul mobil al RSD derivă din metabolismul lipidelor şi este de

natură lipidică [229]. Elucidarea rolului fundamental al biosintezei lipidelor în RSD a fost

reflectată datorită studiilor mutanţilor recesivi steroyl-acyl carrier protein desaturase la

Arabidopsis ssi2 (suppressor of SA-insensitivity 2) şi supresorul npr1-5 [131]. Plantele ssi2 sunt

incapabile să convertească acidul stearic în acid oleic. Acest deficit de oleat activează moartea

spontană a celulelor şi duce la reacţia RSD constitutivă şi la o susceptibilitate sporită la

patogenul necrotrof Botrytis cinerea [186].

Spre deosebire de acestea, activitatea supresorului ssi2 – sfd1 (suppressor of fatty acid

desaturase 1) este compromisă în RSD, şi multe dintre defectele de creştere a plantelor asociate

cu ssi2 sunt atenuate [185, 187]. SFD1 codifică dihidroxiaceton fosfat reductaza, care formează

scheletul din glicerol-3-fosfat al glicerolipidelor. Proteina SFD1 este necesară atât pentru

acumularea AS după atacul patogenului la nivel local şi la distanţă, ca urmare rezistenţa bazală

rămâne neafectată în mutanţii sfd1, sugerând că SFD1 funcţionează în generarea, translocarea

şi/sau percepţia unui semnal mobil RSD [111].

ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1 (EDS1), PHYTOALEXIN DEFICIENT 4

(PAD4) şi SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 101 (SAG101) sunt trei reglatori ai răspunsului

de apărare, care au omologie cu acil-transferazele. EDS1, PAD4 și SAG101 interacţionează

direct în combinaţii diferite pentru dirijarea imunităţii bazale şi a unor interacţiuni genă-pentru-

genă [96, 279]. EDS1 acţionează în amonte de explozia oxidativă şi este necesar pentru sinteza

AS în fenotipurile expressor of pathogenesis-related gene – scpr1 şi cpr6 cu RSD constitutivă.

25

De asemenea, se presupune că EDS1 contribuie la stabilirea şi păstrarea RSD. Blocarea creşterii

bacteriilor indusă de RSD dispare în cazul background-ului eds1 şi pad4, chiar şi atunci când

recunoaşterea combinaţiei AVR-genă R este independentă de EDS1 [111, 279].

Fig. 1.3. Secvenţa de evenimente de la recunoaşterea agentului patogen până la inducerea

expresiei genelor de apărare [91]

Multe procese, ce contribuie la RSD sunt necesare în ambele ţesuturi locale şi sistemice şi

contribuie la rezistenţa bazală. Acestea includ sinteza AS, modificări în starea redox şi inducerea

expresiei genelor de apărare. Recunoaşterea patogenului invadator declanşează schimbări în

ţesutul local, întrucât în ţesuturile sistemice acestea sunt induse de percepţia unui semnal

sistemic. Există dovezi pentru feedback-ul negativ şi pozitiv al semnalizării AS şi interrelaţiile

între diferite căi de semnalizare, ce complică înţelegerea răspunsului de apărare la plante. Rolul

central în răspunsul de apărare este asigurat de proteina NPR1, însă există numeroase rezultate

care pun în evidență existenţa căii de semnalizare independentă de NPR1, ce induce expresia

genelor de apărare [91, 111] (Figura 1.3).

O înţelegere mai bună a căiilor de semnalizare RSD va duce cu siguranţă la apariţia noilor

metode ecologice de protecţie a culturilor agricole [91, 111].

26

1.2. Rolul SRO în rezistenţa plantelor la patogeni

Speciile reactive ale oxigenului (SRO): superoxidul, peroxidul de hidrogen şi oxidul nitric

sunt produse pentru asigurarea diverselor mecanisme de rezistenţă la plante.

SRO produc nu numai efecte directe antimicrobiene [203], dar, de asemenea, participă în

semnalizarea celulară asociată cu inducerea expresiei genelor răspunsului defensiv [74],

răspunsului de hipersensibilitate [148, 251], formarea legăturilor dintre proteine în cadrul

peretelui celular [51], sinteza fitoalexinelor [28, 66, 78, 192, 193, 205], depunerea calozei [66,

192, 193] şi rezistenţa sistemică dobândită [24, 148].

Producerea varietăţilor de SRO, inclusiv radicalului superoxid (O2-

), peroxidului de

hidrogen (H2O2), radicalului hidroxil (OH-) şi oxidului nitric (NO) este asociată cu procesele

metabolice normale ale celulelor plantelor. În condiţii de stres, celulele plantelor sunt capabile să

producă o “explozie” de SRO, care este în primul rând constituită din H2O2. Producerea SRO

este printre primele evenimente care apar la plante în timpul recunoaşterii patogenului. SRO,

fiind molecule ce au în componenţa sa oxigen şi sunt reactive din punct de vedere chimic, pot

reacţiona cu proteine, ADN şi lipidele membranare, astfel, contribuind la reducerea fotosintezei,

creşterea scurgerii de electroliţi, accelerarea senescenţei şi moartea celulelor [230]. Nivelurile

crescute de SRO induc biosinteza moleculelor antioxidante, inclusiv ascorbaţi, poliamine şi

glutation [42, 63]. Stresul oxidativ induce creşterea activităţii enzimelor antioxidante, cum ar fi

superoxiddismutaza (SOD), catalaza şi glutation-S-transferaza [27, 42, 176].

În baza studiilor cu ajutorul inhibitorilor selectivi activităţii enzimatice, precum sunt

azidul de sodiu şi DPI (diphenylene iodonium), explozia oxidativă este dependentă de activitatea

NADPH-oxidazelor în unele specii sau peroxidazelor în altele. Cu toate acestea, în cazul unor

specii, cum ar fi lucerna şi floarea-soarelui, explozia oxidativă pare a fi dependentă de ambele

mecanisme [211, 247].

“Explozia” oxidativă dependentă de NADPH oxidaza a fost descrisă pentru prima dată ca

un sistem omolog oxidazei NADPH superoxid-generatoare din fagocitele mamiferilor, gp91phox

.

La Arabidopsis este codificată de o familie din zece gene, omoloage cu RBO (ATRBOH –

Arabidopsis thaliana Respiratory Burst Oxidase Homolog) [255]. Mecanismul de activare

NADPH oxidazei nu este pe deplin înţeles, însă legarea cu ionii de calciu (Ca2+) şi fosforilarea

par a fi importante pentru asigurarea activităţii complete [137, 175, 243].

Datele proteomice au arătat site-urile induse de fosforilare, în RBOHD (Respiratory

Burst Oxidase Homolog D) din culturile celulare de la Arabidopsis tratate cu MAMP (Microbe-

Associated Molecular Pattern) Flg22 bacteriană [191]. Aplicarea ionoforului de calciu

ionomicină şi inhibitorului protein-fosfatazei caliculin A au sugerat că legarea şi fosforilarea

27

Ca2+

declanşează sinergic activitatea enzimatică superoxid-generatoare a RBOHD [194]. Cu

toate acestea, recent s-a demonstrat că fosforilarea proteinelor precede legarea Ca2+

în procesul

respectiv [138]. Un alt mecanism de activare este interacţiunea cu omologii Rac2 a plantelor,

care pot acţiona în calitate de reglatori – pozitivi sau negativi [256].

Studiile transcripţilor RBOHD şi RBOHF inactivate complet la plantele transgenice de

Arabidopsis au demonstrat că ambii sunt necesari pentru o explozie oxidativă deplină în timpul

interacţiunii incompatibile plantei-gazdă cu P. syringae pv. tomato DC3000 (avrRpm1) sau

patogenului din clasa oomicetelor Peronospora parasitica [255]. Mai mult ca atât, liniile cu

genele rbohd şi rbohf inactivate sunt mai susceptibile la acţiunea bacteriei fitopatogene P.

syringae pv. tomato DC3000 [59, 66]. Există, de asemenea, dovezi că oxidazele NADPH la

plante mediază alte interacţiuni biotice, cum ar fi formarea nodurilor simbiotice în Medicago

trunculata [163]. S-a propus că proteinele RBOH au funcţii antagoniste acelor ale acidului

salicilic în RH, determinând limitarea răspândirii apoptozei în ţesuturile din jurul site-ului de

infecţie [192, 193].

Există mai multe tipuri de peroxidaze, care au a fost caracterizate în diferite organisme,

clasa a III-a cuprinde un subset mic din acestea, care este responsabil de sinteza SRO.

Peroxidazele din clasa a III-a sunt implicate în reacţii redox, în care H2O2 şi alţi hidroperoxizi

sunt de obicei utilizaţi ca substrat. Cu toate acestea, enzimele respective pot genera H2O2 în

condiţii specifice şi furnizează reducători puternici [39, 90, 281].

După recunoaşterea şi interacţiunea unui MAMP cu receptorul gazdei (PRR) are loc

schimbarea permeabilităţii membranei celulare, ceea ce duce la influxul Ca2+, şi efluxul ionilor

de potasiu (K+) şi clor (Cl

-), ce precede “explozia” oxidativă [43, 58, 221].

Creşterea concentraţiei de Ca2+

citosolic este, de asemenea, implicată în inducerea

expresiei genelor PR şi producţia fitoalexinelor [43]. Totodată, utilizarea modulatorilor activităţii

cAMP-ului şi proteinelor G sugerează că adenilil-ciclazele şi proteinele G sunt implicate în

etapele incipiente ale transducerii semnalului [41, 58, 67, 110].

SRO îndeplinesc funcţii diverse în răspunsul defensiv. SRO dirijează instalarea

răspunsului defensiv şi RH, şi ca urmare recunoaşterea agentului patogen [148]. Analiza liniilor

mutante şi a celor antisens asigură dovezi genetice, ce denotă funcţia Rboh-NADPH oxidazelor

în răspunsul defensiv [232, 255, 284].

Liniile mutante cu peroxidaza inactivată prin construcţii antisens arată susceptibilitatea

sporită faţă de patogeni. Astfel, se consideră că peroxidazele peretelui celular servesc în calitate

de sursă primară a SRO apoplastice, iar NADPH-oxidaza poate amplifica semnalul iniţial [41].

Aceste consideraţii sunt susţinute de faptul, că expresia ATRBOHD este stimulată de H2O2 [73].

28

SRO contribuie la activarea răspunsului de apărare prin inducerea modificarilor în

expresia genelor [143, 149]. Rapiditatea producerii acestora şi potenţialul de difuzie liberă a

H2O2 prin membrane sugerează că SRO pot exercita această funcţie, fie direct, prin intermediul

reglării redox a factorilor de transcripţie sau indirect, prin interacţiunea cu alte componente de

semnalizare cum ar fi cascade de fosforilare [141, 181]. În plus, SRO, în asociere cu AS,

mediază stabilirea RSD [91, 253] (Figura 1.4).

Schimbările în statutul redox declanşează oligomerizarea şi mişcarea spre nucleu a

NPR1, reglatorului major al răspunsurilor transcripţionale dependente de AS. Odată ajungînd în

nucleu, NPR1 interactionează cu factorii de transcripţie TGA pentru inducerea expresiei genelor

de apărare [75, 181]. “Microexplozii” de SRO şi “micro” RH au fost observate în ţesuturile

sistemice neinfectate în paralel cu activarea RSD şi aceste răspunsuri sunt blocate de inhibitorii

NADPH-oxidazei [24].

Fig. 1.4. Funcţiile diferite ale SRO asociate cu activarea răspunsului de apărare la plante

Săgeţile subţiri indică evenimentele de semnalizare, care includ producţia SRO în apoplast şi în interiorul celulei

vegetale. Săgeata dublă indică interrelaţia între ROS în aceste compartimente. Săgeţile groase indică funcţiile

acestor SRO în legătură cu activarea răspunsului de apărare la plante [253].

Toate acestea sugerează, că SRO apoplastice, produse de NADPH-oxidazele şi

peroxidazele peretelui celular, mediază activarea răspunsurilor de apărare sistemice. Mai mult ca

atât, un studiu recent arată că SRO, produse de ATRBOHD, mediază un semnal propagativ

rapid, transmis pe distanţă mare, de la celulă la celulă, care apare ca răspuns la diverşi stimuli,

29

sugerând că SRO ar putea avea un rol general în asigurarea comunicării pe distanţe lungi nu

numai în cazul răspunsului la atacul agenţiilor patogeni, dar, de asemenea, ca răspuns la atacul

altor dăunători, rănire şi alte condiţii de stres [172].

Există o corelaţie între “explozie” oxidativă apoplastică şi RH, acesta fiind un proces

activ şi reglat genetic, similar cu apoptoza la animale [147].

În RH şi răspunsul de apărare există o interacţiune puternică între SRO şi alte molecule

de semnalizare şi fitohormoni, ceea ce ar putea explica varietatea funcţiilor de semnalizare, care

le posedă SRO în diferite procese şi căi metabolice. AS este implicat în răspunsurile de apărare

faţă de patogenii biotrofici, la nivel local şi sistemic [91]. H2O2 şi patogenul dirijează acumularea

AS şi prin urmare majorează producerea SRO stimulată de AS.

Acumularea AS poate, de asemenea, regla spre diminuare sisteme de detoxificare a SRO,

ce contribuie în mod indirect la creşterea nivelului total al SRO [140, 283]. Cu toate acestea,

SRO şi AS au o acţiune antagonistă reciprocă în reglarea negativă a răspândirii morţii celulare

[254], indicând faptul că SRO pot determina funcţii diverse în diferite contexte celulare şi în

raport cu alte semnale de reglare.

Semnalizarea SRO a fost, de asemenea, asociată cu reglarea hormonală prin intermediul

AS, AJ şi ET în cazul interacţiunilor cu patogeni necrotrofi şi insecte [108].

Totodată, SRO joacă un rol deosebit şi în interacţiunea cu alţi hormoni. Factorii de

transcripţie DELLA, asociați cu procesele de creştere şi dezvoltare reglate de giberelină, sunt, de

asemenea, implicaţi în răspunsul de apărare, probabil prin modularea funcţiilor AJ şi AS în cazul

patogenilor necro- şi biotrofici [22, 188]. Factorii de transcripţie DELLA ar putea efectua această

funcţie prin modularea producerii SRO şi detoxificarea acestora [22].

1.3. Mana florii-soarelui

Mana este o boală majoră în toate regiunile lumii, unde se cultivă floarea-soarelui [218].

Patogenul respectiv se răspîndeşte prin sol, aer şi seminţe, producînd daunele la mai mult de 50

% din plante în cîmpuri infectate şi ducînd la pierderi ale recoltei de până la 80 % [177].

În Europa, începând cu anul 1941, cînd a fost observată pentru prima dată, boala s-a

răspândit rapid, fiind consderată în anul 1977 o "boală majoră" în toate ţările producătoare de

floarea-soarelui din această parte a lumii. Plantele sistemic infectate mor preponderent prematur

sau pot produce un număr foarte mic de seminţe viabile. Răspîndirea bolii variază considerabil în

funcţie de condiţiile de creştere, în special nivelul de umiditate şi curenţii atmosferici [12, 14,

218].

Principala sursă de infecţie cu P. halstedii sunt seminţele şi solul infectat cu oospori

30

(sporii de rezistenţă), capabili să supravieţuiască timp de 8-10 ani, ceea ce sporeşte dificultatea

eliminarii integrale a bolii odată ce a fost identificată [3, 14, 79].

În practica agricolă se obţin şi se comercializează numeroşi hibrizi de floarea-soarelui

rezistenţi la mană, însă apariţia noilor rase a patogenului pun sub semnul întrebării cultivarea cu

succes a acestora în anumite regiuni [115].

1.3.1. Ciclul vital, condiţii de răspândire și simptomatica a manei florii-soarelui

Mana florii-soarelui cauzată de P. halstedii, similar altor specii taxonomic apropiate,

precum P. viticola la viţa-de-vie, Peronospora tabacina la tutun, Pseudoperonospora cubensis

la castravete, Phytophthora infestans la cartof [113] are un ciclu vital complex (Figura 1.5).

Fig. 1.5. Etapele ciclului vital ontogenetic la P. halstedii [195]

Oosporii germinează timp de 3-12 ore dând naştere la un singur sporangiu [71, 190], în

care are loc diferenţierea zoosporilor şi eliminarea lor ulterioară. În prezenţa apei libere,

zoosporii se răspîndesc rapid şi dacă în apropiere se află ţesutul plantei-gazdă (rădăcină, perişori

absorbanţi, tulpină sau mai puţin frecvent frunze) se fixează, formînd un site de infecţie, se

închistează apoi germinează. Penetrarea în planta-gazdă se produce direct prin epidermă [276].

În cazul combinaţiei compatibile gazdă-patogen, patogenul creşte şi colonizează sistemic spre

apexul plantelor. Miceliul poate fi prezent în toate ţesuturile vegetale, cu excepţia meristemelor

[190].

31

În condiţii favorabile, sporulaţia asexuată are loc prin intermediul sporangioforilor cu

sporangii (Figura 1.6A şi B), care ies prin stomate sau alte orificii ale ţesutului invadat. Oosporii

sunt, de asemenea, produşi în părţile infectate ale plantelor, în special în rădăcină şi tulpină

[274].

Fig. 1.6. Sporangiofori (A) şi sporangii (B) P. halstedii ( × 640) [1]

Oosporii P. halstedii servesc în calitate de inoculul primar pentru plantulele tinere de

floarea-soarelui. Mana poate fi răspândită de vînt prin intermediul sporangiilor, provocând

infecţii secundare, de obicei locale, semnalate pe partea aeriană a plantelor, sau chiar de

seminţele produse de plante infectate, care servesc drept sursă de răspândire a miceliului şi/sau

oosporilor agentului patogen. Se consideră că răspîndirea sporangiilor prin intermediul vântului

în iniţierea bolii este de obicei scăzută. Cu toate acestea, infecţia secundară poate constitui un

factor important în răspândirea bolii în anumite regiuni, în condiţiile favorabile de mediu. Mai

mult ca atât, infecţia secundară produsă de sporangi se manifestă latent. Astfel de plante nu

reprezintă simptome evidente de boală în timpul sezonului, produc seminţe, care transportă

patogenul [3, 14, 218].

Cazurile de provocare a bolii de către seminţe infectate sunt extrem de rare şi rezultă într-

un procent foarte mic de plante infectate sistemic. În schimb, oosporii din sol transmişi de la o

cultură de floarea-soarelui anterioră sau chiar de la floarea-soarelui sălbatică sunt sursele de atac

sever de mană în câmp [3, 12, 14, 79].

Umiditatea şi temperatura sunt factorii de mediu decisivi care afectează dezvoltarea şi

răspândirea infecţiei. Zoosporii, provenind fie din sporulaţia sexuată fie din cea asexuată,

necesită apă liberă pentru păstrarea viabilităţii şi deplasarea spre site-urile infecţiei. Astfel, ploile

32

sau irigarea intensă poate fi o condiţie favorabilă pentru iniţierea infecţiei primare, în special în

perioade critice, în primele 2-3 săptămâni după semănat [142, 294]. Vârsta plantei şi ţesutul

gazdă, au, de asemenea, o importanţă deosebită în determinarea sensibilităţii florii-soarelui la

infecţii sistemice provocate de P. halstedii [218]. Cu cât mai devreme infecţia apare în sezon, cu

atît mai severă va fi manifestarea bolii.

Simptomatica manei florii-soarelui. P. halstedii poate induce trei tipuri de infecţie

(sistemică, locală şi latentă), în funcţie de vîrsta ţesutului, volumul inoculului, condiţiile de

mediu (umiditate şi temperatură) şi de tipul soiului [239].

Plantele sistemic infectate stagnează în creştere, au frunze de culoare verde deschisă sau

cu pătare clorotică, care se intinde de-a lungul nervurilor principale şi a limbului foliar (Figura

1.7A şi 1.8A). Producţia de biomasă a părţilor vegetative şi generative ale plantei se reduce

semnificativ [240]. Frunzele tinere ale plantelor grav afectate devin adesea clorotice în

întregime, deformate în partea de jos, sunt rigide şi groase (Figura 1.7B).

Fig. 1.7. Diversitatea simptomelor produse de mana P. halstedii la floarea-soarelui

A – plante cultivate în cîmp, cloroza frunzelor, nanism, calatidiu orizontal. B – cloroza frunzelor la plantule în faza

de două perechi de frunze. C – Sporulaţia la suprafaţa cotiledoanelor inoculate în condiţii artificiale cu P. halstedii.

D – Sporulaţia pe tulpina plantulei la nivelul solului observată în seră [79].

În condiţii de umeditate sporită se observă creşterea pufului alb - sporangiofori şi

sporangiile patogenului, care se dezvoltă pe partea inferioară a frunzelor. Poziţionarea acestora

corespunde strict zonelor clorotice pe suprafaţa superioară a frunzelor. Având în vedere scurtarea

33

internodurilor, floarea-soarelui infectată sistemic de mană are adesea un aspect fenotipic

asemănător cu varza [14, 79].

Calatidiile plantelor de floarea-soarelui infectate au dimensiuni reduse, sunt întoarse în

sus (calatidiu orizontal), sunt lipsite sau au un număr limitat de seminţe cu viabilitate mică.

Sistemul radicular al florii-soarelui atacat de mană este slab dezvoltat, cu o micşorare în

formarea rădăcinelor secundare şi de o culoare maro-închis pe suprafaţa lor. Alte simptome

asociate cu infecţii sistemice, mai rar întîlnite, includ ofilirea şi mucegăirea plantulelor,

decolorarea tulpinilor şi/sau calatidiului, alteraţii la nivelul inflorescenţei, răsucirea, deformarea

frunzelor (Figura 1.8C) şi formarea cecidiilor bazale [14, 79, 218]. Mai mult ca atît, infecţiile

sistemice produse de mană pot fi localizate în rădăcină şi pe ţesuturile bazale ale tulpinii la unele

combinaţii de gazdă-patogen în anumite condiţii [157, 271]. În condiţii umede, astfel de infecţii

sunt caracterizate prin sporulaţie albă pe frunze cotiledonale şi tulpini (Figura 1.7C şi D).

Infecţia locală a frunzelor apare frecvent, dar de obicei nu atrage prea multă atenţie. Ca

rezultat, pe frunze apar pete de culoare verde-deschisă, mici, unghiulare, delimitate de nervuri. În

condiţii de umiditate relativ ridicată, pe suprafaţa inferioară a frunzelor se dezvoltă puf

(sporulaţie) [1, 218] (Figura 1.8B).

Fig. 1.8. Simptomele produse de mana P. halstedii în condiţii de cîmp

A – plantă sănătoasă şi plantă infectată de mana, stagnată în creştere; B – dezvoltarea sporulaţiei pe partea inferioară

a frunzelor; C – cloroza şi deformarea frunzelor [1].

Într-o etapă ulterioară, ţesutul plantei gazdă se necrotizează lăsând leziuni maronii de

frunze. Pentru o perioadă lungă de timp a fost ignorat faptul că infecţiile locale pot provoca

infecţii sistemice, creşterea patogenului prin peţioli în tulpină [218]. Astfel, observaţiile făcute în

Germania, în anul 1999, au demonstrat că patogenul a reuşit să invadeze peţiolul şi să ducă la

34

propagarea infecţiei sistemice în părţile superioare a plantelor la 8% de plante cu infecţii locale

[239].

Infecţia latentă decurge fără simptome şi plantele afectate nu pot fi recunoscute prin

analiza aspectului exterior. Aceasta poate apărea în partea subterană a plantelor, care sunt

capabile să controleze invadarea patogenului prin stoparea extinderii infecţiei de la rădăcini şi

hipocotil în epicotil sau de la infecţiile întârziate în timpul stadiului de înflorire, când creşterea

părţilor vegetative s-a terminat şi, prin urmare, simptomele sunt invizibile. Primul tip este tipic

pentru unele genotipuri de floarea-soarelui aşa-numite rezistente (care permit uneori sporulaţia

pe hipocotil şi cotiledoane [257]. Cel de-al doilea – duce la contaminarea seminţelor şi, ca

urmare, sistemului de reglare fitohormonală, poate fi recunoscut prin descompunerea întârziată

de clorofilă şi inhibarea reacţiei gravitropice a calatidiului în timpul îmbătrânirii [239]. Trebuie

de remarcat faptul că în ambele cazuri, agentul patogen rămâne viabil şi este capabil să finalizeze

ciclul vital prin reproducerea sexuată, formând oospori [14, 118].

În Republica Moldova studiile manei florii-soarelui și efectelor produse de această boală

au fost efectuate începînd cu anii 1950 studiate de către mai mulți cercetători: Vronschih M.,

Colesnic F. de la Institutul de Cercetări pentru Culturile de Cîmp “Selecția” [8, 11, 12, 13]; dr.

hab. Popușoi I. [15, 16], dr. Grinberg Ș. de la Institutul de Fiziologie și Biochimie ș.a. [9].

Una dintre cele mai ample și discriptive lucrări a fost efectuată de către Grinberg Ș. sub

conducerea dr. hab. Popușoi I. în laboratorul de Micologie și Virusologie, Institutului de

Fiziologie și Biochimie a Plantelor în anii 1965-1969. Scopul cercetărilor a constat în studiu

simptomelor și formelor de manifestare a bolii în regiunea de Sud a Moldovei, morfologiei și

biologiei agentului patogen, influenței factorilor de mediu asupra dezvoltării manei, elaborarea

metodicii de prognosticare și măsurilor de combatere a bolii, stabilirea pierderilor cantitative și

calitative de recoltă cauzate de patogen în condițiile sudului Republicii Moldova. Lucrările

autorului, de asemenea, oferă recomandările utile pentru producerea seminței de floarea-soarelui:

asolamente de 5-6 ani, densitatea de semănare a plantelor 40-45 mii plante/ hectar, plantarea

semințelor la adîncimea mică, utilizarea metodelor agrotehnice pentru strîngerea resturilor

plantelor etc. [9, 15, 16].

De către autor au fost investigate cinci forme de manifestare a bolii și elaborată o scară de

estimare a rezistenței florii-soarelui. A fost depistat că dezvoltarea difuză a miceliului apare în

cazul formelor 1, 2 și 5 de dezvoltare a bolii, dar locală are loc în cazul formelor 3 și 4. Agentul

patogen iernează sub forma de oospori în resturile vegetale și sol. Infectare primară cu oospori

are loc în perioada de la începutul germinării semințelor până la faza de 3-4 frunze adevărate și

provoacă forma 1 și 2 de manifestare a bolii [9, 15, 16].

35

Cercetările efectuate au relevat că în condițiile Republicii Moldova infectare în masă

(epifitiu) are loc în cazul coincidenței a trei factori: perioada de susceptibilitate a plantei,

prezența sursei de infecție și factorilor de mediu favorabili [9, 12, 13, 15, 16].

1.3.2. Diversitatea raselor de mană

Mana P. halstedii prezintă variaţii considerabile a nivelului de virulenţă în cazul infectării

liniilor de floarea-soarelui. Actualmente, sunt izolate şi cunoscute în lume 36 rase ale

patogenului [114].

Tabelul 1.1. Rasele principale ale manii identificate în lume şi reacţia liniilor diferenţiatoare

[116, 257].

D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9

Rasa HA304 RHA265 RHA274 PMI3 PM17 803.1 HAR4 QHP1 HA335

100 S R R R R R R R R

300 S S R R R R R R R

304 S S R R R R R R S

307 S S R R R R S S S

314 S S R S R R R R S

330 S S R S S R R R R

334 S S R S S R R R S

700 S S S R R R R R R

703 S S S R R R S S R

704 S S S R R R R R S

707 S S S R R R S S S

710 S S S S R R R R R

714 S S S S R R R R S

717 S S S S R R S S S

730 S S S S S R R R R

770 S S S S S S R R R

774 S S S S S S R R S

Pentru caracterizarea profilului virulenţei tulpinilor manei, fitopatologii şi geneticienii

utilizează linii diferenţiatoare, care conţin genele majore asociate cu rezistenţa dominantă.

Reacţia genotipurilor în teste pe lăstari [257] asigură posibilitatea de a grupa izolate în funcţie de

patotip (toate tulpinele cu un pattern de virulenţă comun). Pentru simplificarea procedurii de

identificare a raselor [116] a fost propusă utilizarea sistemului nomenclator definit de Limpert şi

Muller în 1994 [151]. Acest nomenclator, aprobat în anul 2000, a deschis posibilitatea de

determinare a virulenţei tulpinilor manei în baza a nouă linii diferenţiatoare grupate în trei seturi

(Tabelul 1.1) [257].

Astfel, dacă primul diferenţiator este sensibil, contribuie cu „1" la codul respectiv, iar

36

dacă a doua linie este sensibilă, contribuie cu „2". Dacă a treia linie dintr-un set este sensibilă, ea

contribuie cu „4", deoarece valoarea „3" ar rezulta, de asemenea, când prima şi a doua linie sunt

sensibile. În cazul, cînd toate trei linii dintr-un set sunt sensibile, codul de virulenţă pentru acesta

devine „7". Dacă toţi cei 9 diferenţiatori sunt sensibili, codul izolatei respective va fi „777".

Avantajul acestui sistem este determinat de faptul că, doar cei 9 diferenţiatori şi ordinea lor în

cele trei seturi trebuie memorate, iar formula de virulenţă rezultată este formată doar din trei

cifre [5, 257].

Această clasificare este utilă din punct de vedere practic, însă nu este adaptată pentru

relevarea variaţiilor genetice minore sau prezenţei raselor minore în izolate. Totodată, se fac

investigaţii privind clasificarea genetică a raselor cunoscute. [273].

Prin tehnicile moleculare aplicate la etapa timpurie a studiului diversităţii genetice a

patogenului, precum sunt RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) [45], RAPD

(Random Amplified Polymorphic DNA) [46, 214] şi ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) [125]

s-a reuşit identificarea diversităţii genetice între probele investigate, dar au fost diferenţiate

populaţiile doar la nivel intraspecific [273].

O încercare de a caracteriza variabilitatea moleculară a manii a fost făcută de Roeckel-

Drevet şi colaboratorii în 2003, analizînd prin tehnica RAPD cu 21 primeri 77 izolate din 12 ţări

de pe patru continente. Rezultatele acestui studiu au constituit primul raport privind diversitatea

genetică a patogenului evaluat la nivel internaţional. Analiza statistică a demonstrat că nu există

o corelaţie între gruparea izolatelor şi rasa sau originea geografică a acestora, fapt care poate fi

explicat prin apariţia lor recentă determinată de efectul de „strangulare a populaţiei” [214, 216].

Numeroase investigaţii privind caracterizarea genetică a raselor manii se desfăşoară în

Franţa. Astfel, Giresse şi colaboratorii în 2007 au elaborat 12 markeri SNP (Single-Nucleotide

Polymorphism), care pot fi aplicaţi pentru genotiparea fină a izolatelor din leziunile cu sporulaţie

[107]. Utilizând combinaţiile acestor markeri Delmotte şi colaboratorii în 2008 au analizat 24

izolate individuale, care includ 14 rase întâlnite în Franţa. Datele obţinute au demonstrat o

corelaţie puternică între structura genetică şi fenotipică a populaţiilor studiate, indicând faptul că

cele 14 rase sunt încadrate în trei grupe distincte. Fiecare grup include una din cele trei rase

majore din Franţa 100, 703 şi 710. De asemenea, nivelul scăzut de heterozigoţie denotă faptul că

P. halstedii este o specie homotalică [72]. Cu toate acestea, cercetările respective pun în evidenţă

doar structura genetică a populaţiilor patogenului şi nu furnizează nici o informaţie funcţională

privind profilurile patogenetice [72, 273].

Astfel, în Franţa de la începutul anilor 1960 pînă la sfîrşitul anilor 1980, a fost identificată

37

doar rasa 100 (cunoscută şi ca rasa 1 sau rasa Europeană). În 1988-1989, au fost descoperite

două rase noi: rasa 703 şi 710 [69]. Toţi hibrizii comerciali utilizaţi în acea perioadă au

manifestat susceptibilitate faţă de rasele 703 şi 710. Începînd cu 1995, în Franţa au fost

identificate 11 rase : 300 şi 700 (în 1995), 304 (în 2000), 314 (în 2001), 307, 704 şi 714 (în

2002), 334, 707 şi 717 (în 2004) şi 730 (în 2005) [72, 258].

În ultimii ani în România au fost identificate în cultura florii-soarelu cinci rase noi ale

patogenului P. halstedii, acesta dezvoltându-se într-o perioadă relativ scurtă (10-20 ani). Noile

rase sunt prezente în diferite zone din sudul, vestul şi estul ţarii [2].

Evoluţia rapidă a populaţiilor de P. halstedii în ultimii zece ani [114] indică asupra

necesităţii de optimizare a nomenclaturii actuale.

1.4. Rezistenţa florii-soarelui la mană

Genul Helianthus face parte din familia botanică Asteraceae, subfamilia Asteroideae, tribul

Heliantheae, subtribul Helianthineae [199]. Clasificarea contemporană Heliantheae este în

prezent susținută de date care sugereaza ca genul Phoebanthus este înrudit cu Helianthus [223,

224] și că aceste două genuri sunt înrudite cu o altă ramură care cuprinde genurile Pappobolus

(considerat anterior Helianthus din America de Sud), Simsia, Tithonia și unele specii din

Viguiera [223, 224]. Genul este nativ regiunile cu clima moderată a Americii de Nord și conține

14 specii anuale și 37 perene [222].

Numărul de cromozomi de bază n = 17 este characteristic genului Helianthus care

cuprinde mai multe specii poliploide: diploide (2n = 2x = 34), tetraploide (2n = 4x = 68) și

hexaploide (2n = 6x = 102). Cele 14 specii anuale sunt diploide, și cele 37 de specii perene

includ 27 diploizi, 4 tetraploizi, 6 hexaploizi, și 4 specii cu ploidie diferită. H. ciliaris și H.

strumosus au cît forme tetraploide atît și forme hexaploide, în timp ce H. decapetalus și H.

smithii includ formele diploide și tetraploide. Originea și relațiile dintre speciile hibride

poliploide din genul Helianthus au fost mult timp de interes și rămân în mare parte nerezolvate,

în special pentru plante perene privind natura auto- sau aloploidă acestora [252].

Specii sălbatice de floarea-soarelui reprezintă o sursă valoroasă de gene de rezistență

pentru mai mulți patogeni de floarea-soarelui de cultură. H. petiolaris și H. praecox sunt

principalele surse de gene de rezistență față de ofilire produsă de Verticillium [121]. Aceste

specii și H. argophyllus sunt, de asemenea, principalele surse de gene de rezistenta față de mană

(P. halstedii) și rugină (Puccinia helianthi). Gene de rezistență pentru acești agenți patogeni apar

frecvent în specii anuale sălbatice [206, 246].

38

Genele de rezistență pentru alte boli – fomoza tulpinilor (Phoma macdonaldii), fomopsisul

(Phomopsis helianthi), alternarioza (Alternaria helianthi), putregaiul alb (Sclerotinia

sclerotiorum), se găsesc frecvent în specii perene de floarea-soarelui: H. maximiliani , H.

pauciflorus , H. hirsutus , H. resinosus , H. mollis , H. tuberosus ș.a. [122].

Interacţiunea dintre floarea-soarelui şi P. halstedii poate fi descrisă ca o relaţie tipică genă-

pentru-genă unde patotipurile patogenului au caracter de virulenţă diferit şi pot întâlni genotipuri

de floarea-soarelui cu sau fără genă/gene de rezistenţă efective împotriva lor. Cu toate că

genetica rezistenţei florii-soarelui la P. halstedii are o istorie de cercetare lungă şi o serie de gene

Pl sunt identificate şi încorporate în soiurile rezistente la mană, au rămas multe întrebări

nerezolvate, elucidarea cărora va permite controlul eficient al acestei boli devastatoare pe termen

îndelungat. Actualmente, cercetătorii din diferite ţări lucrează pentru a înţelege mai bine

mecanismul, precum şi baza genetico-moleculară a rezistenţei, selectând gene sau clustere de

gene noi care conferă rezistenţă şi genotipuri de interes cu ajutorul markerilor moleculari în

programe de ameliorare, încercînd să descopere modalităţi alternative de asigurare a rezistenţei

la floarea-soarelui [259, 269, 273].

1.4.1. Genele de rezistenţă şi markerii moleculari asociaţi cu rezistenţa la mană

Ameliorarea pentru rezistenţă la mană a fost iniţiată la VNIIMK-Krasnodar, prin

încrucişarea topinamburului (H. tuberosus var. purpurellus) ca formă maternă, cu soiul VNIIMK

8931 [17, 18, 19]. Cu toate dificultăţile referitoare la menţinerea rezistenţei în generaţiile

avansate de back-cross, s-au obţinut unele forme hibride rezistente, care au stat la baza creării

unor soiuri de floarea-soarelui cu conţinut ridicat de ulei. Astfel, soiurile Novinka şi Progress,

obţinute de G.V. Pustovoit şi colaboratorii în 1976 prin încrucişarea interspecifică, conţin o genă

dominantă de rezistenţă la mană, provenită de la H. tuberosus [19].

Toate genele de rezistenţă identificate până în prezent sunt gene simple, dominante, fiind

specifice pentru determinarea diferitelor rase de mană [6, 7]. Genele de rezistenţă la mană pot fi

uşor transferate în genotipurile sensibile, dar valoroase din punct de vedere agronomic, pentru

crearea de linii izogenice sau surse noi de germoplasmă. Transferarea se face prin metoda back-

cross, linia iniţială fiind folosită întotdeauna ca formă maternă. După fiecare generaţie de back-

cross se fac testări artificiale cu inocul de la izolatele raselor pentru care se face selecţia. Genele

Pl pot fi transferate în genotipul uneia din liniile parentale care formează hibrizii simpli de

floarea-soarelui, de preferinţă linia maternă androsterilă, realizându-se astfel hibrizi rezistenţi la

atacul P. halstedii [5, 273].

39

În anii 90 au fost depuse eforturi considerabile pentru determinarea localizării genelor de

rezistenţă în cadrul genomului florii-soarelui şi de a aplica cunoştinţe respective în ameliorare

[273]. Actualmente, sunt cunoscute mai mult de 18 gene de rezistenţă majore Pl, dintre care zece

au fost cartate. Unsprezece gene Pl au fost localizate pe hărţi de linkaj cu ajutorul markerilor

moleculari [31, 40, 48, 50, 70, 92, 104, 105, 155, 182, 184, 202, 207, 209, 213, 270].

Similar cu alte gene de rezistenţă la plante, genele Pl de la floarea-soarelui sunt aranjate în

clustere în cadrul grupelor de linkaj. Două clustere majore sunt localizate în grupul de linkaj 8 şi

13 pe harta publică a markerilor microsateliţi. Un cluster ce conţine Pl1, Pl2, Pl6, Pl7 şi Pl15 a fost

cartat în grupul de linkaj 8 al hărţii de linkaj SSR (Simple Sequence Repeat), elaborate de Yu şi

colaboratorii în 2003 [40, 48, 70, 105, 182, 208, 213, 233, 270, 286]. Cel de al doilea cluster

major, care conţine Pl5 şi Pl8 a fost localizat în grupul de linkaj 13 al hărţii de linkaj SSR,

elaborată de Yu şi colaboratorii în 2003 [40, 207, 286]. În grupul de linkaj 1 al hărţii genetice

elaborată de Tang şi colaboratorii în 2003 [248, 249] de asemenea au fost localizate gene Pl,

inclusiv PlArg de la H. argophyllus ARG-1575-2 şi Pl13 de la HA-R5, la fel ca şi Pl14 de la 29004,

linia de la Advanta Semillas S.A.I.C [31, 92, 184, 207]. Gena PlArg este localizată în acest grup

de linkaj, însă într-o regiune diferită de genele Pl13 şi Pl14. Pentru genele din grupul de linkaj 1

nu este clar dacă acestea sunt gene singulare sau sunt organizate în clustere care asigură

rezistenţă faţă de mai multe rase a patogenului [184, 278].

Markerii strîns linkaţi cu genele Pl au fost elaboraţi în cazul mai multor gene. Cartarea

moleculară a genelor Pl1, Pl2 şi Pl6 a relevat localizarea în vecinătate acestor trei gene [182, 217,

270]. Vear şi colaboratorii în 1997 au arătat că locusul Pl6 este compus din cel puţin 2 gene strîns

linkate, prezentînd astfel un locus complex. Posibil că locusul Pl2 este o parte a locusului

complex Pl6 sau reprezintă un cluster de gene separat [270].

Brahm şi colaboratorii în 2000 au identificat nouă markeri RAPD şi doi markeri AFLP

(Amplified Fragments Length Polymorphism) pentru locusul Pl2, care de asemenea pot fi aplicaţi

în selecţia privind locusul Pl6. Markerii RAPD OPAA14750 şi OPAC20831 şi markerul AFLP

E35M48-3 sunt linkaţi cu gena Pl2 la o distanţă de 2 cM [50].

Markerul CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) pentru locusul Ha-4W2,

linkat cu gena Pl1 a fost elaborat de către Gedil şi coautorii în 2001. Liniile sensibile la mană

(HA89 şi HA372) nu dispuneau de un fragment de 276 pb obţinut în urma restricţiei cu enzima

Tsp509I, care a fost prezent la liniile rezistente la P. helianthi (HA370, 335, 336, 337, 338 şi

339). Deşi markerii genetici pentru Ha-4W2 pot fi utilizaţi în procesul de selecţie asistată de

markeri, gena (RGC – Resistance Gene Candidate) detectată de markerul CAPS a fost exclusă ca

o genă candidat pentru Pl1 [104]. Alţi markeri linkaţi cu gena Pl1 sunt ORS1043 şi ORS166 la

40

distanţa de 3.4 cM [233]. Markerul ORS166 de asemenea a fost linkat cu locusul Pl15 la o

distanţă de 3.4 cM [70].

Secvenţierea a 13 markeri STS (Sequenced Tagged Sites) aflaţi la distanţa genetică de 0.0–

1.4 cM de la locusul Pl6 a pus în evidenţă existenţa genelor de rezistenţă conservative din clasa

toll-interleukin1 receptor-nucleotide binding site-leucine rich repeat (TIR-NBS-LRR) [48]. De

asemenea, au fost elaboraţi 14 markeri STS în cadrul locusului Pl5/Pl8, care asigură rezistenţă la

un spectru larg de rase P. halstedii. Aceşti markeri au fost obţinuţi în urma clonării şi cartării a

două gene de rezistenţă analoage (RGA) din clasa CC-NBC-LRR. Locusul Pl5/Pl8 aparţine

grupului de linkaj 6 [207].

Pankovic şi colaboratorii în 2007 au elaborat doi markeri CAPS, care segregă cu gena Pl6

[202]. Recent, Mulpuri şi coautorii (2009) [184] au stabilit poziţia genei Pl13 în grupa de linkaj 1,

flancată de markerul SSR dominant ORS1008 pe de o parte, la o distanţă de 0,9 cM şi ORS 965-

1 pe de altă parte la o distanţă de 5,8 cM. Aceşti markeri strîns linkaţi cu gena Pl13 sunt

recomandaţi de către autori pentru selecţia genotipurilor rezistente în cadrul programelor de

ameliorare a florii-soarelui. De asemenea, autorii au elaborat 6 perechi de primeri de tip STS în

baza markerilor RFLP, dintre care una STS10D6 a generat un profil polimorf între genotipurile

rezistente şi sensibile şi poate fi utilizată în calitate de marker molecular codominant pentru gena

Pl13.

Până în prezent, au fost descrişi markeri SSR şi EST-SSR (Expressed Sequence Tags-

Simple Sequence Repeats) linkaţi cu gena PlArg şi NBS-LRR, care codifică gene candidate de

rezistenţă RGC flancate cu genele PlArg, Pl8 şi Pl14 [31, 278]. Aceşti markeri vor facilita procesul

de selecţie asistată de markeri şi piramidizarea genelor de rezistenţă, care este considerată una

din cele mai eficiente metode de sporire a rezistenţei plantelor de cultură [167, 170].

1.4.2. Mecanisme genetico-moleculare și nespecifice de rezistență a florii-soarelui cu mană

Infectarea florii-soarelui cu mana, de regulă, are loc la nivelul părţii subterane a plantei

prin penetrarea directă în ţesutul rădăcinilor şi hipocotililor, creând infecţie sistemică. Delanoe în

1972 [71] a demonstrat că rădăcinele secretă stimuli chimici, care atrag zoosporii şi facilitează

penetrarea reuşită a patogenului. Spre regret lipsesc date concrete despre natura chimică a

stimulilor respectivi şi particularităţile de acţiune în cazul interacţiunilor compatibile şi

incompatibile [273].

Evenimentele, ce au loc după penetrarea patogenului variază în funcţie de tipul

interacţiunii gazdă-patogen şi de tipul rezistenţei. Planta-gazdă poate stopa dezvoltarea

patogenului aproape de locul penetrării. Se consideră că, rezistenţa este asociată cu moartea

41

intensivă a celulelor plantei gazdă, asigurând astfel RH. Mecanismul genetic al acestui fenomen

nu este bine cunoscut [183, 273].

Actualmente, Herbette și colaboratorii (2003) [119] au demonstrat implicarea enzimelor

glutation-peroxidaza GPXha-1 şi GPXha-2 în răspunsul hipersensibil al florii-soarelui. Expresia

genelor care codifică aceste enzime este reglată de componentele stresului de semnalizare, aşa ca

fitohormonii asociaţi cu stresul (acidul abscizic, acidul jasmonic şi acidul salicilic), SRO, oxidul

nitric şi protein-fosfotazele şi/sau kinazele. Investigaţiile efectuate privind ambele gene GPX şi

două gene care codifică superoxid-dismutaza Cu/Zn (Cu/Zn-SOD), a permis cercetătorilor să

demonstreze că enzimele studiate sunt implicate în procese fiziologice diferite.

Radwan și colaboratorii (2005) [210], utilizând PCR în timp real (RT-PCR) a arătat că

rezistenţa este asociată cu activarea genei similare cu hsr203J (hsr203J-like), care reprezintă

markerul molecular al răspunsului hipersensibil la tutun. Activarea acestei gene se observă, în

special, în cadrul incompatibilităţii fiziologice şi coincide cu moartea celulelor din hipocotil.

Reacţia este specifică pentru ţesut şi nu se manifestă în frunze.

Studiile recente privind rolul speciilor reactive ale oxigenului şi azotului (SRO şi SRN) la

genotipurile de floarea-soarelui susceptibile şi rezistente la mană prin microscopia electronică

confocală şi analiza biochimică au arătat că patogenul induce stresul azotic la genotipurile

susceptibile. Cercetătorii au analizat următorii parametrii: producerea radicalului superoxid,

conţinutul peroxidului, activitatea şi localizarea nitiric oxid sintetazei dependente de L-arginină

şi S-nitrozoglutation reductazei [57].

În ultimii ani se observă tendinţa de a face cercetări pe scară largă la nivelul genomului,

transcriptomului şi proteomului. Astfel, Bouzidi şi colaboratorii în 2007 [48] pentru a înţelege

mecanismul patogenităţii au realizat prima încercare de investigare a transcriptomului P.

halstedii. Pentru identificarea genelor expresate de P. halstedii în timpul infectării plantulelor de

floarea-soarelui a fost utilizată metoda de hibridare substractivă (suppression substraction

hybridization (SSH)). Utilizarea acestei metode şi secvenţierii randomizate a clonelor a permis

identificarea a 602 secvenţe expresate (Expressed Sequence Tags, EST-uri), care corespund cu

230 seturi de secvenţe unice. Pentru determinarea originii secvenţelor unice, au fost elaboraţi

primeri, care amplifică fragmentele genelor din izolate genomice atît din sporangiile patogenului,

cît şi de la floarea-soarelui. Doar 145 de EST-uri non-redundante au corespuns cu 373 de EST-uri

derivate de la genele P. halstedii expresate în timpul infecţiei. Un set de 87 de secvenţe non-

redundante a arătat coincidenţa cu secvenţele depozitate în bazele de date publice. Cu toate

acestea, mai mult de 7 % din EST-uri sunt unicale pentru P. halstedii, nu au nici un omolog în

bazele de date publice.

42

Actualmente, studiile privind transcriptomul patogenului au fost efectuate de Falah As-sadi

şi colaboratorii în 2011 [30] prin aplicarea pirosecvenţierii 454 pentru două probe de floarea-

soarelui infectate cu mană (linii consangvinizate XRQ şi PSC8 infectate cu rasa 710, care

manifestă interacţiune compatibilă şi respectiv incompatibilă). A fost creat un portal

bioinformatic pentru analiza minuţioasă a datelor obţinute. Utilizând filtrarea in silico au fost

selectate 405 clustere specifice a oomicetelor şi 172 nespecifice. Un subset din aceste clustere a

fost verificat prin amplificare PCR şi 86% din clusterele testate au fost validate. Prin aplicarea

instrumentului bioinformatic PSI-BLAST au fost detectate 12 efectori RXLR şi CRN.

Utilizând secvenţele corespunzătoare de la patru rase (100, 304, 703 şi 710), au fost

detectate 22 de SNP-uri. Astfel a fost pus în evidenţă un număr mare de gene, expresate în timpul

interacţiunii compatibile şi incompatibile dintre H. annuus şi P. halstedii. Pentru prima dată s-a

demonstrat că, mecanismul infectării cu mana este asociat cu prezenţa efectorilor RXLR şi CRN,

fiind similar cu cel cunoscut pentru alte oomicete. SNP-urile descoperite în cadrul secvenţelor

efectorilor CRN au fost utilizate pentru determinarea distanţelor genetice între patru rase de P.

halstedii [30].

În calitate de alternativă în amelioarea rezistenţei specifice a florii-soarelui la mană poate fi

rezistenţa cantitativă, nespecifică, care nu depinde de interacţiunea gazdă-patogen. Aceste idei au

fost dezvoltate de către Vear şi colaboratorii în 2006 [269] în studii pe scară largă timp de trei

ani. Un nivel semnificativ de rezistenţă parţială a fost arătat pentru liniile florii-soarelui, care nu

posedă genele Pl eficiente pentru patotipurile prezente. Acest tip de rezistenţă apare indiferent de

virulenţa patogenului, iar ereditatea acestuia este sub control aditiv. Rezistenţa cantitativă a fost

studiată şi de către Serre şi colaboratorii în 2008 [226] în condiţii de seră, care a pus în evidenţă

importanţa vârstei plantei şi interacţiunea cu mediul în timpul răspunsului gazdei. De asemenea,

cercetătorii italieni Baldini şi colaboratorii în 2006 [35] au demonstrat posibilitatea obţinerii

hibrizilor de floarea-soarelui cu rezistenţă parţială faţă de mană însă cu conţinut înalt de ulei.

Recent, Tourvieille de Laboruhe şi colaboratorii (2009) [259] au sugerat importanţa

identificării formelor cu rezistenţă nespecifică la mană şi includerea lor în practica agricolă.

1.5. Concluzii la capitolul 1

Plantele manifestă o susceptibilitate înaltă faţă de mai multe organisme fitopatogene,

inclusiv bacterii, fungi, virusuri şi nematode, ce cauzează pierderi semnificative de recoltă în

întreaga lume. Plantele nu dispun de un sistem imunitar similar cu cel al animalelor, însă au

dezvoltat un set de mecanisme defensive atât structurale cât şi funcţionale.

43

Aşadar, elucidarea bazelor controlului genetico-molecular al rezistenţei florii-soarelui H.

annuus L. la mana P. halstedii F. Berl. and de Toni poate fi realizată prin soluţionarea

următoarelor obiective:

studiul profilurilor genetice ale genotipurilor investigate privind identificarea

polimorfismului asociat cu rezistenţa și amprentarea cu ajutorul markerilor SSR;

stabilirea potențialului de rezistență specifică a resurselor genetice prin efectuarea

screening-ului molecular al genelor Pl1 și Pl6;

evaluarea răspunsului defensiv realizat de inducerea schimbărilor în statutul redox

prin determinarea calitativă a peroxidului şi superoxidului;

analiza expresiei genelor, ce codifică enzimele antioxidante implicate în

metabolismul superoxidului, peroxidului, glutationului;

studiul pattern-urilor de expresie a genelor implicate în mecanismele de

semnalizare celulară, reglarea activităţii transcripţionale şi realizarea RSD.

44

2. OBIECTUL ŞI METODELE DE CERCETARE

Cercetările în scopul stabilirii particularităţilor controlului genetico-molecular al

rezistenţei florii-soarelui la mană au fost efectuate în laboratorul Genomică, Centrul universitar

Biologie Moleculară, Universitatea Academiei de Ştiinţe, pe parcursul anilor 2010-2013.

2.1. Obiectul de studiu şi condiţiile de cultivare

Obiectul de studiu. Analizele moleculare s-au efectuat pentru 75 genotipuri de floarea-

soarelui din colecţia companiei AMG-Agroselect Comerţ. Acestea au inclus 10 linii paterne Rf

(LC Raus; LC 637; LC 7; LC 39; LC 583; LC 43; LC 41; LC Cium; Drofa; LC 044), 18 linii

materne cu androsterilitate citoplasmatică (LC 40; LC SW 38; LC 391A; LC 075/1; Drofa; LC

42; Xenia; LC 075/2; ASC 1 – ASC 4; ASC 6 – ASC 11), 14 hibrizi F1 experimentali şi

comerciali (LC 40 ASC x LC Raus Rf; Drofa ASC x LC Raus Rf; Drofa ASC x LC 637 Rf;

Drofa ASC x LC 7 Rf; LC SW 38 ASC x LC 637 Rf; LC SW 38 ASC x LC 4 Rf; Drofa ASC x

LC 39 Rf; Xenia ASC x LC 39 Rf; LC 40 ASC x Xenia Rf; Xenia F1; Favorit F1; Olea F1; Oxana

F1; Drofa F1), trei perechi de linii isogene (după gena orfH522) (20A şi 20B; 393A şi 393B;

058A şi 058B) şi 27 liniil de perspectivă (FS1-FS27).

Condiiţiile de cultivare. În funcţie de cercetările efectuate plantele au fost crescute în

condiţii diferite şi materialul a fost colectat în mai multe faze ontogenetice (Tabelul 2.1).

Tabelul 2.1. Condiţiile de cultivare şi faza ontogenetică a plantelor investigate

Analize de

laborator Condiţiile de cultivare

Faza ontogenetică de

colectare a

materialului biologic

[225]

Extragerea ADN-ului În condiţii de laborator în vase cu nisip. Până la etapa de două

frunze adevărate (V-

2).

Extragerea ARN-

ului, determinarea

calitativă O2- şi H2O2

Cîmpul experimental IGFPP în anul 2011, unde

a avut loc infectarea naturală cu mana florii-

soarelui. A fost utilizată metoda parcelelor

randomizate în blocuri (distanţa de semănat de

70 x 35 cm).

Formarea butonului

floral (R-1).

45

Materialul biologic a fost colectat, îngheţat imediat în azot lichid şi păstrat la - 80°C până

la extragerea acizilor nucleici.

Condiţiile climaterice. Vara anului 2011 în Republica Moldova a fost caldă şi izolat cu

deficit de precipitaţii. Temperatura medie a aerului pentru acest sezon a constituit în teritoriu

+20,1..+22,2ºС.

Cantitatea de precipitaţii căzută în acest sezon pe 60% din teritoriu a fost în fond aproape

de normă şi a constituit 170-235 mm, doar izolat (SM Rîbniţa, Bravicea, Tiraspol, PAM

Sîngerei, Căuşeni) suma lor a atins 250-360 mm (140-150% din normă).

Precipitaţiile în timpul verii au căzut neuniform. Cea mai mare cantitate de precipitaţii s-a

semnalat în luna iunie – în fond 100-200 mm, sau 120-280% din norma lunară.

La situaţia din 28 iunie 2011, rezervele de umezeală productivă pe terenurile cu floarea-

soarelui în stratul de sol cu grosimea de 0,5 m au constituit 60-110 mm (120-210% din normă),

în stratul de sol cu grosimea de 1 m – 90-190 mm (80-190% din normă) [299].

2.2. Metode de purificare şi determinare a calităţii şi cantităţii ADN-ului

Izolarea ADN-ului s-a efectuat cu CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) utilizînd

protocolul standart [84] cu unele modificări. Tamponul de extragere a conţinut 0,1 M Tris-HCl

pH 8,0; 1,4 M NaCl; 0,02 M Na2-EDTA; CTAB 2 %; PVP 2 %; acid ascorbic 0,1 % (w/v) şi 0,1

% β-mercaptoetanol (v/v). Incubarea a decurs la temperatura de 60-65°C timp de 1-1,5 ore.

Etapele ulteriorare de extragere au constat dintr-un şir de centrifugări cu solvenţi organici

diferiţi: cloroform:alcool isoamilic (24:1) pentru separarea fazei apoase cu ADN, alcool

isopropilic pentru precipitarea ADN-ului şi alcool etilic 70 % pentru purificarea precipitatului

obţinut). Solubilizarea finală a ADN-ului s-a efectuat în 40-60 µl apă lipsită de nucleaze

(Nuclease-free water (Fermentas)).

Conţinutul şi puritatea probelor au fost estimate prin electroforeză şi măsurare

spectrofotometrică, utilizând spectrofotometrul T60 UV-VIS Spectrophotometer (PG

Instruments limited). Raportul λ260/λ280 a fost în limita valorilor 1,6 – 2,0, iar conţinutul ADN

în probă a variat între 250-750 ng/µl. Electroforeza s-a realizat în gel de agaroză cu concentraţia

de 1 % la tensiunea de 120-140 V, în prezenţa bromurei de etidium cu concentraţia de 0,5

mg/ml (2 µl la 100 ml gel) şi soluţie tampon de migrare 1x TAE (Tris-acetat-EDTA).

2.3. Metode de purificare şi determinare a calităţii şi cantităţii ARN-ului

Probele de ARN au fost extrase din trei plante diferite. Ulterior probele extrase au fost

amestecate într-o singură probă (bulked sample). Izolarea ARN-ului s-a efectuat cu TRI Reagent

46

(Ambion, Applied Biosystems) conform recomandărilor producătorului.

Pentru determinarea calităţii şi cantităţii probelor de ARN extras s-a utilizat metoda

spectrofotometrică la 260, 280 şi 230 nm, electroforeza în gel de agaroză în condiţii denaturante

şi RNA 6000 Nano kit pentru Agilent 2000 Boanalyzer.

Determinarea calităţii ARN-ului s-a realizat prin electroforeză în gel de agaroză de 1,4%,

în prezenţa aldehidei formice, utilizând în continuare soluţie de migrare 1X MOPS (soluţie stock

autoclavată 10X MOPS: 400 mM MOPS, 100 mM acetat de sodiu şi 10 mM EDTA-Na2).

Înnainte de electroforeză probele au fost denaturate la 70°C timp de 5 min. Masa moleculară a

fragmentelor s-a determinat în baza markerului RiboRuler High Range RNA Ladder, Ready-to-

Use (Fermentas). Colorarea gelului s-a făcut la UV în prezenţa bromurei de etidium [112].

2.4. Metode de evaluare a polimorfismului genetic în baza PCR

Tehnicile moleculare de analiză a polimorfismului ADN au evoluat în funcţie de scopul

urmărit de cercetător şi tendinţele de automatizare a analizelor. Aşa tehnici ca: RAPD, RFLP,

SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions), STS, AFLP etc., devin din ce în ce mai pe

larg utilizate de diferite laboratoare. Tehnicile cele mai avansate în selecţia asistată de marcheri

pentru anumite caractere de interes implică o serie de metode cu utilizarea enzimelor de

restricţie, amplificare sau mixte:

- utilizarea enzimelor de restricţie (RFLP - polimorfismul lungimii fragmentelor de

restricţie; VNTR - număr variabil de repetări în tandem);

- tehnici de amplificare cu primeri arbitrari sau semiarbitrari sau cu profiluri

multilocus (RAPD - ADN polimorf amplificat arbitrar; AFLP - polimorfismul

lungimii fragmentelor amplificate; DAMD - regiuni minisatelit de ADN; SAMPL -

folosirea microsateliţilor împreună cu AFLP etc.);

- tehnici PCR cu site-uri ţintă (CAPS - secvenţă amplificată polimorf urmată de

digestie; STMS - microsateliţi ai secvenţelor ţintă, etc.).

2.4.1. Analiza SSR

A. Analiza SSR cu ajutorul primerilor nemarcați fluorescent

Pentru efectuarea analizei SSR au fost selectaţi 14 perechi de primeri SSR din seria ORS

(Tabelul 2.2), dintre care 3 perechi (ORS333, ORS795 şi ORS882) sunt asociate şi recomandate

în calitate de markeri moleculari pentru gena R2 de rezistenţă a florii-soarelui la rugină.

Caracteristicele primerilor utilizaţi în experienţă sunt prezentate in Tabelul 2.2.

47

Tabelul 2.2. Caracteristica primerilor utilizaţi în studiu

Pentru amplificare cu primeri respectivi s-au utilizat următoarele condiţii de amplificare:

tampon 1x, dNTP 200 μM, MgCl2 2,5 mM, 0,5 U DreamTaq DNA Polimerase (Fermentas), 0,4

μM de fiecare primer, ADN 50 ng. Reacţia s-a realizat în volum de 10 μl.

Pentru amplificare s-a folosit următorul program Touch-Down PCR: 94° C – 3 min; 8

cicluri la 94° C – 30 sec, 62° C↓ 55° C – 30 sec (-1° C/ciclu), 72° C – 45 sec; 30 de cicluri – 94°

C – 30 sec, 54° C – 30 sec, 72° C – 45 sec; 72° C – 5 min.

Vizualizarea rezultatelor amplificării s-a efectuat în gel de PAA de 6 % în soluţie tampon

TBE (Tris-borat EDTA) în condiţii nedenaturante.

B. Analiza SSR cu ajutorul primerilor marcați fluorescent cu Cy5

Reacţia SSR-PCR a fost realizată într-un volum final de 10 µl într-o placă de 96-godeuri

Denumirea

markerului L, pb Tipul de repetare

Secvenţa nucleotidică

sens

Secvenţa nucleotidică

antisens Tm

ORS70 126 (CTT)9 GACCCTGGTCACC

GAAGTTA

ATCTGAAATCGGA

CAAGATTCA 55

ORS123 147 (TC)17 GAAAACCCATGCA

GGCATAC

ACATCCATCACAG

TCCATTTTG 51

ORS135 184 (AC)4N1(CA)7 CAAAATGGAGAA

CAAAGCTCCC

TATTGCCGGTCCG

ACATCGA 51

ORS216

174

(CT)12N7(TC)4N2

(TC)6

CTTCCTCCACCCT

CAAGCG

TCCCTAATGTACC

ACCACCATC 54

ORS224 136 (GA)8N2(GA)13 AACCAAAGCGCTG

AAGAAATC

TGGACTAACTACC

AGAAGCTAC 54

ORS261 199 (GGT)3N18(CG)4 CTGTTCCGTTCGT

CAGAAACTC

AGCGAAAGGATC

GAGAATCATC 52

ORS495 152 (GT)14 GCGATCTGAGGTT

GACTCGT

CCAGGATTAGGTA

GCTTAGTTCG 54

ORS523 167 (AC)9 GGATGAAAGATAT

GACCTGGATG

TCGAGAAAGAAA

GAGAGAGTGTGA 57

ORS610 144 (AG)14 AGGAAGCGAAAC

GAGGAAGT

TTGTGACCTTCTC

CCTGCTC 57

ORS733 194 (AG)21 TATGAGTTGGCAA

GGGCTTC

GGACTCCAACGAG

AGAATCAGT 57

ORS799 143 (CT)13 TCCAGCAAGTCAG

CAACAAC

ACTCCCTCCCATT

CTCGTCT 57

ORS333 467 (GT)13 CGGTTAAGATGGT

TCAGTTGG

ATATTAAGTTTTG

GTTTTAGCCAGAA 57

ORS 795 296 (CT)17GG(CA)10 CGCTAGTTACACC

GCAGATG

TGTCCACAGGTTG

AAGATCG 57

ORS 882 173 (GT)14 AAACCGGCATGTA

AGATATTCG

ATCGGGAGCAGA

AGAAGAGTATG 59

48

în amplificatorul MyCyclerTM

Thermal Cycler (Bio-Rad). Amestecul de reacţie a avut

următoarea componenţă: 1 µl de ADN, 1 µl de tampon 10x cu (NH4)2SO4, 0,8 µl de MgCl2 25

mM, 1 µl dNTP 2,5 mM, 0,6 µM de fiecare primer (forward şi reverse) (Tabelul 2.3), şi 1,25 U

de Taq ADN polimeraza (Диалат). Reacţia de amplificare a fost realizată utilizînd următorul

program Touch Down PCR: 94°C timp de 2 min; 1 ciclu la 94°C – 30 s, 63°C – 30 s, si 72°C –

45 s; 5 cicluri la 94°C – 30 s, 62°C – 30 s, – 1°C/ciclu şi 72°C – 45 s; urmând 30 cicluri la 94°C

– 30 s, 56°C – 30 s şi 72°C – 45 s, elongare finală la 72°C – 5 min.

Tabelul 2.3. Caracteristica primerilor utilizaţi în studiu

Profilul amplificării cu primeri marcaţi cu colorant fluorescent Cy5 a fost analizat în

secvenţiatorul ALFexpress™ II DNA Analysis System (Amersham Bioscience) prin

electroforeză în gel denaturant de poliacrilamida de 6,0 % la o tensiune de 400 V timp de 2 h. În

calitate de agent denaturant s-a folosit uree. Rezultatele obţinute în urma electroforezei în

secvenţiator au fost vizualizate prin intermediul soft-ului special în calitate de gel şi de curbă.

În baza datelor obţinute în urma analizei SSR au fost construite dendrograme cu ajutorul

Denumirea

markerului

L,

pb

Tipul de

repetare Secvenţa nucleotidică sens

Secvenţa nucleotidică

antisens Tm

ORS78 161 (AAG)10 GTTCGTCGAGTACATTTTG

C

TTTCCCTCTGGAAAGTTG

TCA 55

ORS237 200/

192 (GTT)22

CAAGGTCTGTCTACATCCC

ACC

GCTGTAAAGCCTGCATAT

CCTC 53

ORS243 170 (GGT)7 GGGATGACGTGCGTTTGG ACCACCATTTCTACCGTT

TCTC 52

ORS349 263 (AC)20 CCCTAACCAATATGCTCCC

ATT

TGGATAAACGAGTGAAT

GGTGT 58

ORS366 207 (AC)23 AACCAACTGAGCATTCTTG

TGA

GCGCTAGGTTAAAGAGG

ACAAA 58

ORS432 163 (AC)11 TGGACCAGTCGTAATCTTT

GC

AAACGCATGCAAATGAG

GAT 58

ORS509 198 (AT)8(G

T)17 CAACGAAAAGACAGAATC

GAAA

CCGGGAATTTTACAAGGT

GA 58

ORS546 205 (CT)17 CATGAACATCGCCAATTC

AG

TGCAAGGAACCATCAGA

ATC 58

ORS595 135 (AG)23 TGATGGTAATGCATCGGG

TA

CACACCATCCCTTGTAAA

ATCA 58

ORS656 196 (CT)15 TCGTGGTAAGGGAAGACA

ACA

ACGGACGTAGAGTGGTG

GAG 58

ORS811 156 (CACT

CT)12 CCTTCTCCTCAATCTTTGG

CTA

AGGAATGAAATGGGTGT

GTGT 58

ORS815 179 (CTT)8 GGAAAGCAGCAATGGTTC

ATAA

CACCAAGTGCAAACCCTA

GAAA 59

ORS836 201 (GT)20 CACGAAATCGTTCCATTAT

TATGTT

GCAAGATAGTTTGATCAG

GTAGCAA 59

49

soft-ului Treecon (http://bioinformatics.psb.ugent.be/software/details/3) [296]. Estimarea

distanţei genetice a fost efectuată în baza formulelor propuse de Nei şi Li în 1979 [189].

Clusterizarea s-a efectuat, utilizînd metoda UPGMA (Unweighted Pairwise Group Method with

Arithmetic mean).

Pentru evidenţierea polimorfismului generat de fiecare marker s-a utilizat indicele PIC

(Polymorphic Information Content) calculat după Anderson și colaboratorii [25]:

, unde pi – frecvenţa benzii i şi n numărul de benzi depistate. (2.1)

2.4.2. Screening-ul molecular al genei Pl1 prin tehnica CAPS

Utilizarea markerilor CAPS include două etape: amplificarea cu primeri specifici şi

restricţia ampliconului obţinut.

Amplificarea s-a realizat în volum de 20 μl a mediului de reacţie: tampon 1x, dNTP 200

μM, MgCl2 2,5 mM, 1,0 U DreamTaq DNA Polymerase (Fermentas), 0,3 μM de fiecare primer

(sens ATG CGG AAA TCT CTC ACC şi antisens GAC AGC CTC GTC TTGTGA) şi 50 ng

ADN.

Pentru reacţia PCR s-a folosit programul: 95° C - 3 min; 40 de cicluri la 94° C - 30 sec,

53° C - 30 sec, 72° C - 45 sec; 72° C - 3 min şi GeneAmp® PCR System 9700 (Applied

Biosystems).

Restricţia produsului de amplificare cu enzima TasI (Tsp509I) (Fermentas) a fost

efectuată conform recomandărilor producătorului timp de 2 ore la temperatura de 65° C.

Vizualizarea produşilor de amplificare s-a realizat în gel de agaroză de 1 % în soluţie

tampon TAE şi a fragmentelor restricţionate în gel de poliacrilamidă de 8 % în soluţie tampon

TBE. Lungimea fragmentelor s-a stabilit în baza markerului de masă moleculară GeneRulerTM

100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas).

2.4.3. Screening-ul molecular al genei Pl6 utilizând markerul STS

Amplificarea s-a realizat în volum de 20 μl a mediului de reacţie: tampon 1x, 200 μM

dNTP, 2,5 mM MgCl2, 1,0 U DreamTaq DNA Polymerase (Fermentas), 0,4 μM fiecare primer

(sens GTTTGTGGATCATCTCTATGCG şi antisens TGCTTCTTCCTTCTATCTCACTC).

Pentru reacţia PCR s-a folosit programul: 95° C – 3 min; 35 de cicluri 95° C– 20 sec, 59° C – 30

sec, 72° C – 2 min; 72° C – 3 min şi GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems).

n

i

ipPIC1

21

50

Vizualizarea produşilor de amplificare s-a realizat în gel de agaroză de 1 % în soluţie

tampon TAE. Lungimea fragmentelor s-a stabilit în baza markerului de masă moleculară

GeneRulerTM

100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas).

2.5. Evaluarea nivelului de expresie a genelor prin PCR cantitativ

Metodologia real-time PCR utilizată astăzi reprezintă una din cele mai performante

strategii de cuantificare a acizilor nucleici. Comparativ cu alte metode, PCR-ul cantitativ se

caracterizează prin precizia înaltă a cuantificării și incidenţa redusă a erorilor şi a rezultatelor fals

pozitive. De asemnea, amplificarea şi detecţia sunt combinate într-o singură analiză (sistem

închis), astfel, riscul de contaminare este minimal [23, 54].

2.5.1. RT-PCR

ARN-ul total (0,6 μg) a fost tratat cu ADNaza RQ1 RNase-Free DNase (Promega) 30

min la 37°C. ARN-ul tratat cu ADNază a fost utilizat în sinteza primei catene de ADNc folosind

RevertAid Reverse Transcriptase (Fermentas). Alinierea primerilor Oligo(dT)18 şi random

hexamer (Fermentas) s-a efectuat timp de 5 minute la 75°C. În etapa de transcriere inversă s-a

utilizat mixul preparat conform recomandărilor producătorului. Revers transcripţia a fost

efectuată la 25°C 10 min şi 42°C 60 min.

2.5.2. Analiza PCR în timp real

Expresia genelor studiate a fost estimată utilizînd PCR cantitativ în timp real în

amplificator cu detecţia automată a fluorescenţei DT-96 (DNA technology, Rusia).

Primerii utilizați au fost elaborați în baza secvențelor transcripților cercetați sau EST-

urilor similari cu genele omoloage la alte specii de plante stocate în baza de date NCBI. Pentru

elaborarea primerilor a fost utilizat programul Primer3Web v. 3.0.0.

(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/input.htm) [295], iar verificarea acestora privind

prezenţa structurilor secundare s-a efectuat prin OligoAnalyzer 3.1

(http://eu.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/) [298].

Amplificarea s-a realizat în volum de 25 µl, utilizînd Maxima SYBR Green/ROX PCR

Master Mix (Fermentas) şi următorul program: 95°C – 10 min; 5 cicluri la 95°C – 15 s, 64°C –

20 s; 40 cicluri 95°C – 15 s, 60°C – 40 s. Detectarea fluorescenței s-a realizat în decursul

elongării. Lipsa amplificării produselor nespecifice și formării a primerilor dimerizați a fost

confirmată prin analiza curbelor de topire și electroforeză în gel de 1,4 % agaroză. Pentru fiecare

probă de ARN reacția a fost montată în trei repetări analitice.

51

În calitate de genă de referință s-a utilizat gena actinei a florii-soarelui (numărul de acces

în baza de date NCBI: AF282624.1). Expresia relativă a genelor față de actină a fost calculată

după Livak și Schmittgen (2001) [156]:

2-∆Ct

, unde ∆Ct = Ct,gena – Ct,actina. (2.2)

2.6. Determinarea prezenţei peroxidului de hidrogen şi superoxidului prin colorare cu

DAB şi NBT

Detectarea vizuală a peroxidului de hidrogen în frunze s-a efectuat cu 3,3-

diaminobenzidină (DAB). Din limbul foliar detaşat de la plantă au fost tăiate discuri Ø 0,8 cm,

care s-au infiltrat în vid 2 min cu soluţie de 1mg/ml DAB, pH 3,8. Incubarea s-a efectuat timp de

8 ore în întuneric, la 25ºC. Apoi frunzele și discuri au fost fierte la baia de apă în soluţie de acid

acetic:glicerol:etanol (1:1:3) timp de 5-10 min pentru decolare, care a avut loc cu excepţia

zonelor brune, unde a decurs reacţia între peroxidul de hidrogen şi DAB [292].

Detectarea vizuală a superoxidului în frunze s-a efectuat cu nitro blue tetrazolium (NBT).

Din limbul foliar detaşat de la plantă au fost tăiate discuri Ø 0,8 cm. Infiltrarea cu soluţie de 1

mg/ml NBT în 10 mM tampon potasiu-fosfat pH 7,8 cu 10 mM azid de sodiu NaN3 a avut loc în

vid timp de 2 min. Apoi probele s-au incubat timp de 2 oră în întuneric, la 25ºC. Pentru

decolorare frunzele şi discurile au fost fierte la baia de apă în soluţie de acid

acetic:glicerol:etanol (1:1:3) timp de 5-10 min. Decolorarea a avut loc pe toata suprafaţa

frunzelor sau discurilor analizate cu excepţia zonelor albastre, în care a decurs reacţia între

superoxid şi NBT [47].

2.7. Metode statistice de prelucrare a datelor

Datele obţinute în cadrul estimării expresiei diferitor gene asociate cu rezistenţa au fost

supuse prelucrării statistice [10] prin calcularea următorilor parametri: media aritmetică x,

varianța s2, abaterea medie pătratică s, coeficientul de variație V, eroarea mediei sx .

2.8. Concluzii la capitolul 2

Pentru studiu au fost selectate 75 de genotipuri valoroase pentru ameliorarea florii-

soarelui, oferite de compania AMG-Agroselect Comerț. Pentru efectuarea studiului au fost

utilizate următoarele metode: extragerea şi purificarea acizilor nucleici [84], PCR și variantele

acestuia, electroforeza în gel de agaroză și PAA în condiţii denaturante și nedenaturante, digestia

enzimatică, transcripția inversă, PCR cantitativ, metode statistice de prelucrare a datelor și soft-

uri specializate pentru elaborarea și validarea primerilor, construirea dendrogramelor.

52

Polimorfismul genetic și amprentarea unor linii valoroase de floarea-soarelui s-a realizat prin

analiza SSR a acestora. Potenţialul de rezistență la mană a genotipurilor investigate a fost estimat

prin efectuarea screening-ului cu markeri moleculari CAPS și STS. Estimarea expresiei genelor

s-a efectuat utilizînd ARN extras din plantele de floarea-soarelui cultivate în cîmp şi infectate de

mana.

Strategia cercetărilor efectuate în teză este prezentată în figura 2.1.

Fig. 2.1. Metodologia utilizată în studiul controlului genetico-molecular al rezistenţei florii-

soarelui la mană

53

3. EVALUAREA VARIABILITĂŢII GENETICE ÎN GERMOPLASMA DE

FLOREA-SOARELUI

Utilizarea markerilor moleculari în caracterizarea şi stabilirea potenţialului de rezistenţă a

genotipurilor poate facilita procesul de ameliorare, oferind informaţii suplimentare despre bazele

genetice ale rezistenţei genotipurilor de interes.

3.1. Determinarea polimorfismului genetic prin intermediul markerilor moleculari

Markerii SSR posedă un nivel foarte înalt de polimorfism, fapt ce permite utilizarea pe larg

pentru amprentarea genomică, cartarea genomului, studiul relaţiilor genetice şi filogenetice,

selecţia asistată de markeri şi genetica populaţiilor [200].

Elaborarea markerilor SSR pentru floarea-soarelui cultivată [248, 285] oferă soluţii privind

problema deficitului de markeri ADN şi obţinerea unor hărţi de referinţă prin sinteza a mai

multor hărţi genetice de linkage elaborate independent de diferiţi cercetători. Prima hartă

genetică complexă a florii-soarelui în baza makerilor SSR a fost elaborată de Tang S. şi coaut. în

2002. Din 1089 markeri SSR descrişi de Tang şi coautori (2002) [248] şi Yu și colaboratorii

(2002) [285], 717 au manifestat polimorfism la liniile consangvinizate de elită şi 408 la RHA280

x RHA801.

În prezent, markerii SSR sunt consideraţi cei mai eficienţi, însă utilizarea acestora rămâne

a fi limitată, reieşind din dificultatea şi etapele îndelungate de elaborare a lor.

3.1.1. Analiza SSR în gel de PAA privind polimorfismul genotipurilor studiate

Analiza SSR pentru 21 de genotipuri de floarea-soarelui a fost efectuată cu 14 perechi de

primeri: ORS70, ORS123, ORS135, ORS216, ORS224, ORS261, ORS333, ORS495, ORS523,

ORS610, ORS733, ORS795, ORS799 şi ORS882.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

350

300

250

200

150

100

350

300

250

200

150

100

Fig. 3.1. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS70 în gel de PAA 6%

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 7-LC

SW 38 ASC x LC 4 Rf, 8-Drofa ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia ASC x LC 39 Rf, 10-Xenia F1, 11-LC 40 ASC x

Xenia Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

54

Perechea de primeri ORS70 a generat 15 alele la genotipurile investigate (118, 129, 139,

149, 163, 173, 180, 189, 193, 202, 203, 216, 235, 245, 253 şi 272 pb), avînd indicele PIC 0,88.

Dintre cele 15 alele, cea cu lungimea de 129 pb a fost prezentă la toate genotipurile analizate,

alte două alele 139 şi 149 pb au fost absente numai la genotipul LC 637 Rf. Cele mai mari

diferenţe între genotipuri s-au observat în regiunea cuprins între 163-272 pb (Figura 3.1).

Pentru markerul ORS123 au fost caracteristice 7 alele (141, 150, 159, 167, 175, 180 şi 189

pb) şi indicele PIC 0,8. Alelele 150, 175 şi 189 pb au fost prezente la toate genotipurile

investigate. Polimorfismul s-a manifestat la nivelul alelelor 141, 159,167 şi 180 pb (Figura 3.2).

Perechea de primeri ORS135 a demonstrat polimorfismul la nivelul benzilor 175, 182, 237

şi 314 pb, banda de 314 pb a fost caracteristică doar pentru forma hibridă LC SW 38 ASC x LC

637 Rf. Benzile 192, 215 şi 225 pb au fost prezente la toate genotipurile. În general, markerul

350

300

250

200

150

100

350

300

250

200

150

100

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Fig. 3.3. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS135 în gel de PAA de 6 %

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 7-LC

SW 38 ASC x LC 4 Rf, 8-Drofa ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia ASC x LC 39 Rf, 10-Xenia F1, 11-LC 40 ASC x

Xenia Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

ig. 3.2. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS123 în gel de PAA 6 %

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 7-LC

SW 38 ASC x LC 4 Rf, 8-Drofa ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia ASC x LC 39 Rf, 10-Xenia F1, 11-LC 40 ASC x

Xenia Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

350

300

250

200

150

100

350

300

250

200

150

100

55

ORS135 s-a caracterizat prin prezenţa a 7 alele (175, 182, 192, 215, 225, 237 şi 314 pb) şi

valoarea indicelui PIC 0,82 (Figura 3.3).

Markerul ORS216 a generat 3 alele de 136, 172 şi 181 pb, indicele PIC a constituit 0,67.

Alelele 172 şi 181 au fost absente numai la genotipurile Drofa F1 şi LC 391A ASC; alela de 136

pb a fost prezentă la toate genotipurile analizate (Figura 3.4).

În analiza profilurilor generate de perechea de primeri ORS216, benzile minore nu s-au

luat în consideraţie.

Pentru markerul ORS224 a fost caracteristică prezenţa a 15 alele (106, 131, 137, 147, 151,

156, 166, 176, 185, 199, 220, 233, 298, 316 şi 376 pb) şi indicele PIC a constituit 0,87.

Lungimea alelor a fost cuprinsă între 106 şi 376 pb (Figura 3.5).

200

150

100

200

150

100

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Fig. 3.4. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS216 în gel de PAA 6%

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 7-LC

SW 38 ASC x LC 4 Rf, 8-Drofa ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia ASC x LC 39 Rf, 10-Xenia F1, 11-LC 40 ASC x

Xenia Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

Fig. 3.5. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS224 în gel de PAA 6 %

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 7-LC

SW 38 ASC x LC 4 Rf, 8-Drofa ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia ASC x LC 39 Rf, 10-Xenia F1, 11-LC 40 ASC x

Xenia Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

350

300

250

200

150

100

350

300

250

200

150

100

56

Markerul ORS261 s-a caracterizat prin prezenţa a 5 alele (186, 192, 240, 255 şi 272 pb) şi

indicele PIC 0,75. Alelele 255 şi 272 pb au fost caracteristice numai pentru 3 genotipuri dintre

cele 21 analizate: Drofa ASC x LC 7 Rf, LC 7 Rf şi LC Raus Rf (Figura 3.6).

Pentru microsatelitul ORS333 au fost detectate 6 alele, dintre care 4 (150, 161, 174 şi 197

pb) au fost prezente la toate genotipurile analizate şi polimorfismul s-a observat numai la nivelul

benzilor de 410 şi 422 pb (Figura 3.7) [89].

Pentru markerul ORS495 au fost detectate 14 alele (76, 112, 136, 145, 150, 158, 169, 183,

193, 206, 217, 227, 249 şi 273 pb) şi indicele PIC a constituit 0,92; fiind valoarea cea mai mare a

indicelui PIC. Însă, profilurile generate au fost destul de încărcate, fapt care crează dificultăţi în

analiza gelurilor (Figura 3.8).

350

300

250

200

350

300

250

200

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Fig. 3.6. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS261 în gel de PAA 6 %

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 7-LC

SW 38 ASC x LC 4 Rf, 8-Drofa ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia ASC x LC 39 Rf, 10-Xenia F1, 11-LC 40 ASC x

Xenia Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

450

400

350

300

250

200

150

100

450

400

350

300

250

200

150

100

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Fig. 3.7. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS333 în gel de PAA 6 %

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 4 Rf, 7-Drofa

ASC x LC 39 Rf, 8-Xenia ASC x LC 39 Rf, 9- Xenia F1, 10- LC 40 ASC x Xenia Rf, 11-LC SW 38 ASC x LC

637 Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

57

Perechea de primeri ORS523 a generat 10 alele (139, 158, 164, 171, 178, 187, 197, 222,

233 şi 245pb), avînd valoarea indicelui PIC 0,89. Alelele 171 şi 178 pb au fost prezente la toate

genotipurile (Figura 3.9).

Markerul ORS610 s-a caracterizat prin prezenţa a 8 alele (144, 152, 168, 181, 192, 203,

213 şi 287 pb) şi indicele PIC 0,83. Alelele 152, 168 şi 181 pb au fost prezente la toate

genotipurile analizate (Figura 3.10).

350

300

250

200

150

100

350

300

250

200

150

100

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Fig. 3.9. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS523 în gel de PAA 6 %

M –markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 7-LC

SW 38 ASC x LC 4 Rf, 8-Drofa ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia ASC x LC 39 Rf, 10-Xenia F1, 11-LC 40 ASC x

Xenia Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

350

300

250

200

150

100

350

300

250

200

150

100

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Fig. 3.8. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS495 în gel de PAA 6 %

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 7-LC

SW 38 ASC x LC 4 Rf, 8-Drofa ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia ASC x LC 39 Rf, 10-Xenia F1, 11-LC 40 ASC x

Xenia Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

58

Perechea de primeri ORS733 a generat 14 alele (155, 164, 187, 197, 208, 220, 232, 240,

251, 266, 277, 288 şi 307 pb), având valoarea indicelui PIC 0,9. Benzile cu lungimea 187, 197,

208 şi 220 au fost prezente la toate genotipurile investigate (Figura 3.11).

Markerul ORS795 s-a caracterizat doar prin prezenţa unei alele cu lungimea de aprox. 300

pb, care era detectată la 11 genotipuri (Drofa F1, Drofa ASC x LC Raus Rf, Drofa ASC x LC 637

Rf, LC SW 38 ASC x LC 4 Rf, Drofa ASC x LC 39 Rf, LC 40 ASC x Xenia Rf, Drofa ASC, LC

40 ASC, LC SW 38 ASC, LC 391A ASC şi LC 637 Rf) (Figura 3.12) [89].

Fig. 3.10. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS610 în gel de PAA 6 %

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 7-LC

SW 38 ASC x LC 4 Rf, 8-Drofa ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia ASC x LC 39 Rf, 10-Xenia F1, 11-LC 40 ASC x

Xenia Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

350

300

250

200

150

100

350

300

250

200

150

100

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Fig. 3.11. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS733 în gel de PAA 6 %

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 7-LC

SW 38 ASC x LC 4 Rf, 8-Xenia ASC x LC 39 Rf , 9- Drofa ASC x LC 39 Rf, 10-Xenia F1, 11-LC 40 ASC x

Xenia Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

350

300

250

200

150

100

59

Markerul ORS799 s-a caracterizat prin prezenţa a 11 alele (142, 148, 157, 164, 167, 173,

185, 197, 204, 249 şi 298 pb), valoarea indicelui PIC fiind de 0,88. Polimorfismul s-a manifestat

la nivelul alelelor de la 167 pb şi mai mult. Alele 142, 148, 157 şi 164 au fost prezente la toate

genotipurile studiate (Figura 3.13).

Markerul ORS882 a fost monomorf, deoarece a generat profiluri similare la toate

genotipuri investigate. Pentru ORS882 a fost detectate 6 alele (107, 162, 177, 194, 230 şi 240 pb)

(Figura 3.14) [89].

Din numărul total de 14 perechi de primeri SSR selectaţi, 92,86 % din ei (13 perechi) au

demonstrat polimorfism. Numai o pereche de primeri ORS882 a generat un profil uniform pentru

toate genotipurile investigate, astfel, fiind monomorf.

Fig. 3.13. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS799 în gel de PAA 6 %

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 7-LC

SW 38 ASC x LC 4 Rf, 8-Drofa ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia ASC x LC 39 Rf, 10-Xenia F1, 11-LC 40 ASC x

Xenia Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

350

300

250

200

150

100

350

300

250

200

150

100

350

300

250

350

300

250

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M - 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Fig. 3.12. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS795 în gel de PAA 6 %

M – markerul masei moleculare Step Ladder, 50 bp (Sigma); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC x LC Raus Rf, 3-Drofa

ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38 ASC x LC 4 Rf, 7-Drofa

ASC x LC 39 Rf, 8-Xenia ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia F1, 10-LC 40 ASC x Xenia Rf , 11-LC SW 38 ASC x LC

637 Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-Xenia ASC, 17-Drofa Rf,

18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

60

Dintre 14 markeri incluși în analiză – opt prezintă repetări dinucleotidice, unul –

trinucleotidică şi cinci – repetări complexe.

Markerii utilizaţi au manifestat un nivel diferit de polimorfism. Astfel, valoarea indicelui

PIC, variază de la 0 pentru ORS882 pînă la 0,92 pentru ORS495, în medie constituind 0,76

(Tabelul 3.1 şi Figura 3.15).

Fig. 3.15. Corelarea valorii indicelui PIC şi numărului de alele generate per locus

400

300

200

100

400

300

200

100

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Fig. 3.14. Electroforeza produşilor de amplificare cu primerii ORS882 în gel de PAA 6%

M – markerul masei moleculare GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas); 1-Drofa F1, 2-LC 40 ASC

x LC Raus Rf, 3-Drofa ASC x LC Raus Rf, 4-Drofa ASC x LC 637 Rf, 5-Drofa ASC x LC 7 Rf, 6-LC SW 38

ASC x LC 4 Rf, 7-Drofa ASC x LC 39 Rf, 8-Xenia ASC x LC 39 Rf, 9-Xenia F1, 10- LC 40 ASC x Xenia Rf,

11-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, 12-Drofa ASC, 13-LC 40 ASC, 14-LC SW 38 ASC, 15-LC 391A ASC, 16-

Xenia ASC, 17-Drofa Rf, 18-LC Raus Rf, 19-LC 637 Rf, 20-LC 7 Rf, 21-LC 39 Rf

0,878 0,87

0,915

0,904 0,884

0,811

0,83

0,797

0,818 0,815

0

0,748

0,67

0,726

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Valo

are

a i

nd

icel

ui

PIC

Nu

mă

rul

ale

lor

per

locu

s

Numărul de alele per locus PIC

61

În cadrul cercetărilor efectuate au fost identificate 120 alele SSR. Numărul de alele per

locus a variat între 1 (ORS795) şi 15 (ORS70), cu o valoare medie de 8,6 alele per locus. Cu

excepţia markerului ORS882, s-a observat o corelaţie puternică (valoarea coeficientului de

corelație Spearman 0,89) între numărul de alele per locus şi valoarea indicelui PIC (Figura 3.15).

Tabelul 3.1. Caracteristica locilor microsateliţi investigaţi

Cei 14 perechi de primeri SSR au fost clasificați în grupele de linkage (LG) descrise la

floarea-soarelui [248]. A fost identificat câte un locus pentru LG1, LG4, L8, LG12, LG14,

LG15, şi LG16, câte două loci pentru LG11 şi LG13 şi 3 loci pentru LG9 (Tabelul 3.1).

Locus Repetiţia

Grup

de

linka

ge

Lungimea, pb Numărul alelelor

PIC Conform

literaturii de

specialitate

În genotipurile

analizate

Conform

literaturii de

specialitate

În

genotipurile

analizate

ORS70 (CTT)9 8 125/134/143/

170/176/220

118/129/139/149/163/

173/180/189/193/202/

203/216/235/245/253/

272

6 15 0,88

ORS78 (AAG)10 10 162/168/171/

174

153/159/165/171/181/

193/223/234/241 4 9 0,86

ORS123 (TC)17

12 - 141/150/159/167/175/

180/189 - 7 0,8

ORS135 (AC)4N1

(CA)7 14 183/189

175/182/192/215/225/

237/314 2 7 0,82

ORS216

(CT)12N7

(TC)4N2 (TC)6 15 - 136/172/181 - 2 0,67

ORS224 (GA)8N2

(GA)13 13 -

106/131/137/147/151/

156/166/176/185/199/

220/233/298/316/376

- 15 0,87

ORS261 (GGT)3N18(CG)4

11 - 186/192/240/255/272 - 5 0,75

ORS333 (GT)13 9

141/152/157/

467/471

150/161/174/197/410/

422 5 6 0,82

ORS495

(GT)14

16 135/151/153/

173

76/112/136/145/150/

158/169/183/193/206/

217/227/249/273

4 14 0,92

ORS523 (AC)9 4

145/164/168/

169/171/411

139/158/164/171/178/

187/197/222/233/245 6 10 0,81

ORS610 (AG)14 1 145/148/158

144/152/168/181/192/

203/213/287 3 8 0,83

ORS733

(AG)21

11 196/198/204/

208

155/164/187/197/208/

220/232/240/251/266/

277/288/307

4 13 0,9

ORS795 (CT)17GG(CA)10 9 296/304/x 304/x 2 1 0,73

ORS799

(CT)13

13 141/143/x

142/148/157/164/167/

173/185/197/204/249/

298

2 11 0,88

ORS882 (GT)14 9

159/169/173/

180

107/162/177/194/230/

240 4 6 0,0

62

Analiza datelor obţinute în vederea asocierii polimorfismului generat de markeri

microsateliţi cu rezistenţă la mană a unor linii parentale (LC 40 ASC, LC SW38 ASC, LC 637

Rf, LC 7 Rf, LC 39 Rf şi LC Raus Rf), caracterizate şi prin prezenţa markerilor lincaţi cu genele

Pl1 şi Pl6, a relevat prezenţa unor fragmente specifice acestora.

Astfel, markerul ORS70 a generat fragmentul de 118 pb specific liniilor materne LC 40

ASC, LC SW38 ASC, hibrizilor F1 a acestora şi liniei paterne LC 637 Rf. Genotipurile paterne

LC 637 Rf, LC 7 Rf, LC 39 Rf şi hibrizii F1 a acestora au manifestat un polimorfism în regiunea

180-272 pb. De asemenea, genotipurile respective comparativ cu celelalte genotipuri parentale s-

au caracterizat printr-un număr mai mare de benzi (6-8 comparativ cu 3). Markerul ORS70 este

localizat ca şi genele de rezistenţa Pl1 şi Pl6 în grupul de linkage 8 (Figura 3.1).

Markerul ORS224 este localizat în grupul de linkage 13 ca şi locusul Pl5/Pl8, care

determină rezistenţă la mană. Analiza profilurilor generate de primeri ORS224 a pus în evidenţă

lipsa benzii de 137 pb la liniile parentale, care au manifestat potenţial de rezistenţă la mană. Un

profil deosebit s-a înregistrat în cazul genotipului LC 40 ASC (alelele 185, 199, 233 şi 298 pb).

Spre deosebire de celelalte genotipuri parentale s-a detectat prezenţa benzilor de 131 pb la liniile

LC Raus Rf şi LC 637 Rf şi 147 pb la LC 7 Rf şi LC 39 Rf (Figura 3.5).

Fig. 3.16. Numărul total de alele generat de setul de primeri utilizaţi în experienţă în

funcţie de genotip

Un profil mai abundent, cu un număr mai mare de benzi a fost observat la formele hibride

F1 şi genotipurile paterne Rf. Genotipurile materne s-au caracterizat printr-un număr mai mic de

77

76

74

72

72 71

68

67

67 67

66

65

63

63

63

62

61 57

57

55

50

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Nu

mă

rul

tota

l d

e a

lele

63

bezi, însă setul de markeri selectat a fost suficient pentru demonstrarea polimorfismului acestora.

Au fost evidenţiaţi markeri, care accentuiază preponderent polimorfismul între liniile ASC

(ORS224 şi ORS495) sau Rf (ORS70) (Figura 3.16).

Analiza datelor privind numărul total de alele detectate pentru fiecare genotip a relevat un

număr mai mare de alele şi un grad de polimorfism mai înalt la formele parentale, care posedă un

potenţial de rezistenşă la mană, şi hibrizii F1 a acestora. Astfel, valorile minimale de 50 şi 55

alele au fost caracteristice genotipurilor LC 391A ASC şi Xenia ASC (Figura 3.16).

Efectuarea analizei SSR cu 14 perechi de primeri selectaţi a permis detectarea markerilor,

care pot fi utilizaţi în amprentarea genomică (ORS70, ORS261 şi ORS795), şi celor codominanţi

(ORS70, ORS495 şi ORS610), care pot fi incluşi în cercetările privind stabilirea gradului de

hibridare a seminţelor şi determinarea polimorfismului genetic intraspecific.

3.1.2. Amprentarea genomică a genotipurilor valoroase de floarea-soarelui

Pentru genotipare au fost selectate 21 genotipuri de floarea-soarelui şi utilizaţi 10 markeri

SSR din seria ORS (ORS78, ORS237, ORS243, ORS349, ORS366, ORS509, ORS656,

ORS811, ORS815, ORS836) (Tabelul 3.2).

Tabelul 3.2. Caracteristica locilor microsateliţi investigaţi

Din numărul total de perechi de primeri SSR utilizaţi în cercetare, 90% din ei (ORS78,

ORS237, ORS243, ORS349, ORS366, ORS509, ORS811, ORS815, ORS836) au demonstrat

Locus Repeti

ţia

Grup

de

linka

ge

Lungimea, pb Numărul

alelelor

PIC Conform literaturii de

specialitate

În genotipurile

analizate

Co

nfo

rm

lite

ratu

rii

de

spec

iali

tate

În g

eno

tip

uri

le

an

ali

zate

ORS78 (A) (AAG)1

0 10 162/168/171/174 156/161/165/167 4 4 0,69

ORS237 (B) (GTT)2

2 5 215/212/205/269 195/198/201 4 3 0,59

ORS243 (GGT)7 8 176/179/155 143/147/164/171 3 5 0,67

ORS349 (C) (AC)20 6 - 253/255/263 - 3 0,64

ORS366 (D) (AC)23 4 215/213/211/209/187/185 187/209/211/213 6 4 0,60

ORS509 (E) (AT)8(

GT)17 1 201/199/197/195/181/173 179/193/199 6 3 0,63

ORS656 (CT)15 16 209/207/205/203/201/199 203 6 1 0

ORS811 (F) (CACT

CT)12 17 157/114/113/109 109/113/114/156 4 3 0,59

ORS815 (CTT)8 10 190/181/178 173/178/181/186/190 3 5 0,85

ORS836 (G) (GT)20 2 213/211/205/202/200/198/null 198/201/207 6 3 0,63

64

polimorfism. A fost identificat un număr total de 35 alele SSR, iar numărul de alele per locus a

variat între 1 (ORS656) şi 5 (ORS815), cu o valoare medie de 3,5 alele per locus (Figura 3.17).

Cele 10 perechi de primeri SSR au fost clasificați în grupele de linkage (LG, Linkage Group)

descrise la floarea-soarelui [248]. A fost identificat câte un locus pentru LG1, LG2, LG4, LG5,

LG6, LG8, LG16 şi LG17, câte doi loci pentru LG10 (Tabelul 3.2).

Fig. 3.17. Corelarea valorii indicelui PIC şi numărului de alele generate per locus

Pentru aprecierea diferenţelor dintre markeri se utilizează indicele PIC, calculat după

Anderson şi coautori, 1993 [25]. Astfel, valoarea medie a parametrului PIC a fost de 0,59, cea

mai mare de 0,85 pentru ORS815 şi cea mai joasă de 0,59 pentru ORS237. Analiza comparativă

a numărului alelelor per locus şi valorii indicelui PIC a pus în evidenţă o corelaţie puternică

(valoarea coeficientului de corelație Spearman 0,75) între valorile respective (Figura 3.17).

Analiza profilurilor generate a permis selectarea a şapte markeri (ORS78, ORS237,

ORS349, ORS366, ORS509, ORS811 şi ORS836) pentru amprentarea liniilor parentale incluse

în studiu [88]. Combinarea acestor markeri crează profile distincte pentru fiecare genotip.

Estimarea lungimii alelelor obţinute permite elaborarea formulelor pentru fiecare genotip

(Tabelul 3.3).

0,67

0,85

0,69

0,6 0,59

0,64 0,63 0,59

0,63

0 0

1

2

3

4

5

6

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

ORS243 ORS815 ORS78 ORS366 ORS237 ORS349 ORS509 ORS811 ORS836 ORS656

Numărul alelelor per locus

Val

oar

ea i

ndic

elui

PIC

PIC Numărul alelelor

65

Tabelul 3.3. Rezultatele amprentării liniilor parentale valoroase cultivate în Republica

Moldova

Genotip Formula genotipului

Drofa ASC A165B198C253D187E199F109G207

Xenia ASC A161B195C253D209E199F156G201

LC 40 ASC A161B201C263D187E193F113G198

LC 38 ASC A165B201C263D187/213E193F113G198

LC SW 391A ASC A165B201C263D213E193F113G198

Drofa Rf A165B195/201C253D211E193F114/156G198

LC Raus Rf A156/165B201C255D187/209E193F156G207

LC 637 Rf A156B201C255D187E179F113G207

LC 7 Rf A167B201C255D187E179F156G207

LC 39 Rf A156B201C255/263D187/209E193F113/156G201/207

Analiza SSR efectuată a relevat starea homo- sau heterozigotă a locilor studiaţi în

genotipurile analizate. De exemplu, perechea de primeri ORS811 în cazul genotipului Drofa Rf

generează 2 alele de 114 şi 156 pb (starea heterozigotă a locusului), însă în alte genotipuri

posedă numai o alelă – 156 pb la LC Raus Rf şi 113 pb la LC 637 Rf (starea homozigotă a

locusului) (Figura 3.18).

Fig. 3.18. Reprezentarea grafică a rezultatelor pentru genotipurile Drofa Rf (1), LC Raus Rf (2)

și LC 637 Rf (3) obţinută cu primeri ORS811 analizată în ALFwin Fragment Analyser v. 1.02

66

Genotipul LC 39 Rf a demostrat prezenţa a patru loci din cei şapte studiaţi în stare

heterozigotă, ceea ce poate fi explicat prin heterogenitatea genotipului respectiv, duplicaţia

locilor microsateliţi sau impuritatea genetică a materialului.

Markerii testaţi pot fi utilizaţi cu succes în genotiparea liniilor de floarea-soarelui

cultivate în Republica Moldova.

3.1.3. Analiza clusteriană a genotipurilor de floarea-soarelui în baza secvenţelor

microsatelite

Distanţa genetică (DG) dintre diferite genotipuri reprezintă un criteriu de estimare a

variabilităţii şi un indice efectiv în selectarea formelor parentale pentru obţinerea hibrizilor înalt

productivi, întrucât DG corelează pozitiv şi puternic cu performanţa hibridă [85, 173]. Însă,

există şi lucrări în care se demonstrează corelarea joasă dintre distanţa genetică şi productivitatea

seminţelor la hibrizi [291].

Clasificarea genotipurilor analizate în baza polimorfismului secvenţelor microsatelite a

demonstrat că cele 21 genotipuri s-au clasat în 7 grupuri distincte (Figura 3.19).

Primul grup este format din genotipurile paterne LC Raus Rf, LC 39 Rf şi hibrizii lor:

Drofa ASC x LC 39 Rf, Xenia ASC x LC 39 Rf, LC 40 ASC x LC Raus Rf. Deşi, în

Fig. 3.19. Dendrograma de repartiţie a genotipurilor de floarea-soarelui în baza

secvenţelor microsatelite

67

combinaţiile hibride s-au utilizat diferite genotipuri materne, determinismul genetic este, în

special, influențat de factorul patern.

Al doilea şi al treilea grup sunt formate din genotipurile paterne a hibrizilor şi hibridul

corespunzător: genotipul patern LC 637 Rf şi hibridul lui LC SW38 ASC x LC 637 Rf şi,

respectiv, genotipul LC 7 Rf şi hibridul Drofa ASC x LC 7 Rf.

Clusterul patru include genotipul matern Drofa ASC şi majoritatea hibrizilor lui: Drofa F1

şi Drofa ASC x LC Raus Rf, Drofa ASC x LC 637 Rf. În grupa întîi a fost clasificat unicul

genotip hibrid obţinut cu utilizarea formei parentale LC 39 Rf. În ce priveşte genotipul Drofa Rf

a fost poziţionat în clusterul al cincilea.

Al şaselea grup include 3 genotipuri materne LC 391A ASC, LC SW 38 ASC, LC 40 ASC

şi 2 hibrizi LC 40 ASC x Xenia Rf, LC SW 38 ASC x LC 4 Rf. Ultimul grup constă din

genotipul Xenia ASC şi hibridul lui Xenia F1, care se caracterizează prin asemănare înaltă.

Totodată, se observă că un alt hibrid în care forma ASC Xenia a servit ca formă maternă, este

clasificat în primul cluster, relevând influenţa comparativ mai puternică a genotipului patern LC

39 Rf în formarea hibridului dat.

Astfel, clusterizarea a demonstrat similaritatea preponderentă a hibrizilor cu forma maternă

sau paternă, caracterizând într-o anumită măsură capacitatea combinativă a genotipurilor

parentale.

Totodată, pentru a estima diversitatea dintre genotipurile parentale, s-a realizat analiza

clusteriană separată a acestora. În urma acestei analize au fost obţinute două dendrograme pentru

forme parentale (Figura 3.20) şi cele hibride (Figura 3.21).

Fig. 3.20. Dendrograma de repartiţie a genotipurilor parentale de floarea-soarelui în baza

secvenţelor microsatelite

68

Din dendrograma respectivă (Figura 3.20) se observă, că genotipurile materne şi paterne

pot fi distinse clar, cu excepţia genotipului Xenia ASC, care s-a clasificat separat de celelalte

genotipuri formând al treilea cluster. Astfel, pot fi puse în evidenţă patru clustere. Primul, format

din genotipurile materne - LC 40 ASC, LC SW 38 ASC, LC 391A ASC; al doilea din

genotipurile Drofa ASC şi Drofa Rf. Ultimul cluster include doar genotipurile paterne: LC Raus

Rf, LC 39 Rf, LC 637 Rf şi LC 7 Rf.

Clusterizarea a pus în evidenţă diferenţele clare între formele paterne şi cele materne, cu

excepţia formelor parentale ale hibridului Drofa F1, care au format un cluster comun. Analiza

dendrogramei privind repartizarea genotipurilor cu potenţial de rezistenţă a demonstrat că

acestea au avut tendinţă de a forma clustere separate (primul şi ultimul cluster) de cele fără

potenţial de rezistenţă.

Analizând dendrograma obţinută la hibrizi (Figura 3.21) se constată 7 clustere, 5 dintre

care reprezintă un singur genotip. Acestea sunt: LC SW38 ASC x LC 637 Rf, LC 40 ASC x

Xenia Rf, Drofa F1, LC SW 38 ASC x LC 4 Rf şi Xenia F1. Cel mai mare cluster include patru

genotipuri LC 40 ASC x LC Raus Rf, Xenia ASC x LC 39 Rf şi Drofa ASC x LC Raus Rf,

Drofa ASC x LC 39 Rf. Toate formele hibride au fost obţinute cu utilizarea genotipului patern

LC 39 Rf şi LC Raus Rf. Încă o grupă comună este formată din doi hibrizi ai formei Drofa ASC

cu liniile paterne LC 637 Rf şi LC 7 Rf.

Fig. 3.21. Dendrograma de repartiţie a genotipurilor hibride de floarea-soarelui în baza

secvenţelor microsatelite

69

Sinteza rezultatelor evidenţiază capacitatea relativ înaltă de distincţie a genotipurilor în

baza locilor SSR, fapt demonstrat prin gruparea generală a tuturor genotipurilor analizate, dar şi

clusterizarea separată a genotipurilor parentale și hibride. Similaritatea profilurilor demonstrează

natura influenţei genotipului matern sau patern şi moştenirea profilurilor respective de către

hibrid [87].

Analiza de repartiţie a genotipurilor de floarea-soarelui în baza secvenţelor microsatelite

demonstrează posibilitatea aplicării markerilor selectaţi în amprentarea genotipurilor şi estimarea

gradului de hibridare a formelor hibride.

3.2. Screening-ul molecular al genelor de rezistenţă a florii-soarelui la mană

Rezistenţa florii-soarelui la mană este în mare măsură determinată de interacţiunele de

tipul „genă-pentru-genă”, astfel fiind o rezistenţa specifică. Genele de rezistenţa la mană Pl sunt

gene majore, dominante, care în cadrul genomului pot fi organizate în clustere sau reprezenta

gene singulare [184].

Evoluţia şi apariţia raselor noi de mană datorită variabilităţii patogenului şi presiunii de

selecție necesită utilizarea genotipurilor rezistente şi prelucrarea seminţelor cu fungicide, fapt ce

contribuie la căutarea noilor surse de rezistenţă. Totodată, una din cele mai eficiente metode de

control şi combatere a patogenului este considerată obţinerea genotipurilor ce posedă rezistenţă

specifică, asigurată de genele Pl. În anul 2007 au fost cunoscute 36 rase ale patogenului şi

descrise 18 gene Pl [114, 177]. Unele surse de rezistenţă au fost studiate şi caracterizate din

punct de vedere genetic, însă numai unii loci (Pl1, Pl2, Pl5, Pl6, Pl7, Pl8 ş.a.) au fost asociați cu

markeri moleculari [184].

Utilizarea markerilor moleculari la caracterizarea şi stabilirea potenţialului de rezistenţă a

genotipurilor poate contribui la facilitarea procesului de ameliorare pentru rezistenţă, oferind

informaţii suplimentare despre bazele genetice ale rezistenţei genotipurilor de interes.

3.2.1. Screening-ul molecular al genei Pl1

Gena Pl1 este prima gena de rezistenţă la mană, notată de către Vrânceanu (1970) Pl1,

prezenţa căreia a fost pentru prima dată demonstrată în linia consangvinizată AD-66 obţinută la

Fundulea [5, 6].

Actualmente, pentru identificarea prezenţei genei Pl1 sunt disponibili mai mulţi markeri

moleculari: CAPS pentru locusul Ha-4W2 linkat cu gena Pl1 [104] şi SSR ORS1043 şi ORS166

la distanţa de 3.4 cM [233].

70

Pentru determinarea prezenţei genei Pl1 în genotipurile investigate a fost utlizat markerul

CAPS linkat cu gena Pl1.

Markerul CAPS linkat cu gena Pl1 (Figura 3.22), a fost elaborat de către Gedil şi

coautorii în 2001. Liniile sensibile la mană (HA89 şi HA372) nu dispuneau de un fragment de

276 pb obţinut în urma restricţiei cu enzima Tsp509I, care a fost prezent la liniile rezistente la P.

halstedii (HA370, 335, 336, 337, 338 şi 339). Deşi markerii genetici pentru locusul Ha-4W2 pot

fi utilizaţi în procesul de selecţie asistată de markeri, gena candidat (RGC – Resistance Gene

Candidate) detectată de markerul CAPS a fost exclusă în calitate de genă candidat pentru Pl1

[104].

Fig. 3.22. Harta genetică pentru grupul de linkage 8 a florii-soarelui (Helianthus annuus L.)

elaborată în urma analizei descendenţilor HA370 × HA372 F2

Harta include locusul Pl1 de rezistenţă la rasa 100 (rasa 1) de mană şi markeri RFLP, sau CAPS pentru gene

candidate de rezistenţă (loci cu prefixul HR), şi cartate anterior markeri RFLP (loci cu prefixul ZVG şi UB) [104].

Aplicarea markerului dat în screeening-ul molecular al rezistenţei la 74 genotipuri de

floarea-soarelui a demonstrat prezenţa fragmentului de 363 pb după amplificare (Figura 3.23),

ceea ce coincide cu datele obţinute anterior de către Gedil şi coautorii (2001).

Fig. 3.23. Vizualizarea produsului de amplificare a locusului Ha-4W2 cu primeri specifici (363

pb)

M – marker; A – genotipuri F1, Rf, ASC şi FS

71

Restricţia ulterioară a ampliconului cu enzima TasI (Tsp509I) a generat fragmente de 88

pb, 93 pb, 188 pb şi 276 pb (Figura 3.24), rezultate care corespund cu datele obţinute de către alţi

cercetători [104]. Astfel, combinaţia de trei fragmente 88, 93 şi 188 pb a fost asociată de către

Gedil şi colaboratorii cu susceptibilitatea la rasa 100 de mana florii-soarelui şi prezenţa a patru

fragmente 88, 93, 188 şi 276 pb cu rezistenţă. Liniile susceptibile s-au caracterizat prin lipsa

fragmentului de 276 pb, fiindu-i atribuită semnificaţia de marker dominant [104].

Fig. 3.24. Restricţia produsului de amplificare a locusului Ha-4W2 cu Tas509I [4]

S – susceptibil; R – rezistent

În cadrul cercetărilor noastre, după restricţie enzimatică, fragmentul de 276 pb a fost

stabilit doar pentru 36 din cele 74 genotipuri studiate, indicând astfel rezistenţa acestora la mană

(Tabelul 3.4; Figura 3.24, 3.25).

Ampliconul de 276 pb, care indică rezistenţa la rasa 100 a manei, a fost identificat la 13

hibrizi F1 comerciali şi experimentali incluşi în analiză. Doar în cazul hibridului Drofa F1 nu s-

a detectat prezenţa acestui fragment. Ampliconul aşteptat a fost pus în evidenţă la opt dintre zece

genotipuri paterne (Rf) şi la patru (LC 40; LC SW 38; LC 391; LC 075/1) dintre cele 18 linii cu

androsterilitate citoplasmatică. În cazul celor trei perechi de linii isogene (după gena orfH522)

fragmentul de 276 pb nu s-a constatat. La liniile de perspectivă prezenţa acestuia a fost

identificată în 11 din cele 27 genotipuri analizate (Tabelul 3.4, Figura 3.25).

Astfel, aproximativ 93,33 % dintre hibrizii F1, 80,0 % dintre liniile Rf, 22,22 % dintre

liniile ASC şi 40,74 % dintre liniile de perspectivă analizate posedă fragmentul asociat cu gena

Pl1 de rezistenţă la mană. Hibrizii F1 şi liniile paterne Rf au manifestat un potenţial de rezistenţă

mai înalt decât liniile materne.

Datele obţinute pot fi utile la etapa incipientă de selectare a liniilor parentale în ameliorarea

florii-soarelui pentru rezistenţă, oferind posibilitatea de aplicare a piramidizării genelor pentru

obţinerea hibrizilor rezistenţi la mană.

72

Fig. 3.25. Analiza CAPS a ampliconilor obţinuţi cu primeri specifici pentru locusul Ha-4W2

lincat cu gena Pl1 [4]

M- marker; 1-LC 40 ASC x LC Raus Rf; 2-Drofa F1; 3-Drofa ASC x LC Raus Rf; 4-Drofa ASC x LC 637 Rf; 5-

Drofa ASC x LC 7 Rf; 6-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf; 7-LC SW 38 ASC x LC 4 Rf; 8-Drofa ASC x LC 39 Rf; 9-

Xenia ASC x LC 39 Rf; 10- Xenia F1; 11-LC 40 ASC x Xenia Rf; 12-Favorit F1; 13-Olea F1; 14-Oxana F1; 15-Drofa

Rf; 16-LC Raus Rf; 17-LC 637 Rf; 18-LC 7 Rf; 19-LC 39 Rf; 20-LC 583 Rf; 21-LC 044 Rf; 22-LC 43 Rf; 23-LC

41 Rf; 24-LC Cium Rf; 25-LC 42 ASC; 26- Drofa ASC; 27-LC 40 ASC; 28-LC SW 38 ASC; 29-LC 391A ASC;

30-Xenia ASC; 31-LC 075/1 ASC; 32-LC 075/2 ASC; 33-36 - ASC 1 – ASC 4; 37-42 - ASC 6 – ASC 11; 43-20A;

44-20B; 45-393A; 46-058A; 47-058B; 48-74 – FS1-FS27; 75-393B.

73

Tabelul 3.4. Repartizarea genotipurilor în funcţie de prezenţa şi absenţa markerului asociat cu

gena de rezistenţă Pl1

Genotipuri Rezistente Susceptibile

Hibrizi F1

(13R/1S)

LC 40 ASC x LC Raus Rf, Drofa ASC x LC Raus

Rf, Drofa ASC x LC 637 Rf, Drofa ASC x LC 7 Rf,

LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, LC SW 38 ASC x LC

4 Rf, Drofa ASC x LC 39 Rf, Xenia ASC x LC 39

Rf, Xenia F1, LC 40 ASC x Xenia Rf, Favorit F1,

Olea F1, Oxana F1

Drofa F1

Linii Rf

(8R/2S)

LC Raus Rf, LC 637 Rf, LC 7 Rf, LC 39 Rf, LC

583 Rf, LC 43 Rf, LC 41 Rf, LC Cium Rf

Drofa Rf, LC 044 Rf

Linii ASC

(4R/14S)

LC 40 ASC, LC SW 38 ASC, LC 391A ASC, LC

075/1 ASC;

Drofa ASC, LC 42 ASC, Xenia

ASC, LC 075/2 ASC, ASC 1,

ASC 2, ASC 3, ASC 4, ASC 6,

ASC 7, ASC 8, ASC 9, ASC

10, ASC 11;

Linii isogene

(6S)

20A, 20B, 393A, 393B, 058A,

058B;

Linii de

perspectivă

(11R/16S)

FS 9, FS 11, FS 12, FS 14 – FS 18, FS 21, FS 25, FS

26.

FS1-FS 8, FS10, FS 13, FS 19,

FS 20, FS 22 – FS 24, FS 27.

36 genotipuri 39 genotipuri

Total 75 genotipuri

Screening-ul genei Pl1 prin utilizarea markerului molecular CAPS a demonstrat prezenţa

fragmentului asociat cu rezistenţa la 36 genotipuri din 75 incluse în cercetare. Datele respective

pot fi utilizate de către amelioratori pentru selectarea formelor parentale de perspectivă în

ameliorarea florii-soarelui pentru rezistenţă la mană [4].

3.2.2. Screening-ul molecular al genei Pl6

Gena Pl6 este una din genele specifice de rezistenţă a florii-soarelui la mană, ce conferă

rezistenţă la unele rase de mană 100, 300, 700, 703, 710 [49] şi 730 [202]. Locusul Pl6 ar trebui

să conţină cel puţin 11 gene strâns linkate fiecare asigurînd rezistenţa la rase diferite de mană.

Bouzidi şi colaboratorii au făcut design-ul a 13 markeri STS, care acoperă distanţa 3 cM şi

centrate pe locusul Pl6 [49].

În 2007 Pankovic şi colaboratorii în urma analiziei liniilor isogene rezistente şi

susceptibile şi familiilor de descendenţi F3 acestora au transformat markerul HAP3 în marker

CAPS, care poate fi utilizat în selecţia asistată de markeri a genotipurilor rezistente de floarea-

soarelui. De asemenea, a fost demostrată asocierea markerilor respectivi cu rezistenţa la rasa 730

de mană, astfel, a fost constatat faptul că gena Pl6 asigură rezistenţă şi la rasa respectivă [202].

74

Fig. 3.26. Electroforegramele ampliconilor obținuți cu primeri HAP3 specifici secvenţelor

candidate pentru gena de rezistenţă Pl6

M- marker; 1- Drofa ASC; 2-LC 40 ASC; 3-LC SW 38 ASC; 4-LC 391A ASC; 5-Xenia ASC; 6-LC 075/1 ASC; 7-

LC 075/2 ASC; 8-11 - ASC 1 – ASC 4; 12-17 - ASC 6 – ASC 11; 18-Drofa F1; 19-LC 40 ASC x LC Raus Rf; 20-

Drofa ASC x LC Raus Rf; 21-Drofa ASC x LC 637 Rf; 22-Drofa ASC x LC 7 Rf; 23-LC SW 38 ASC x LC 637 Rf;

24-LC SW 38 ASC x LC 4 Rf; 25-Drofa ASC x LC 39 Rf; 26-Xenia ASC x LC 39 Rf; 27- Xenia F1; 28-LC 40 ASC

x Xenia Rf; 29-Favorit F1; 30-Olea F1; 31-Oxana F1; 32-Drofa Rf; 33-LC Raus Rf; 34-LC 637 Rf; 35-LC 7 Rf; 36-

LC 39 Rf; 37-LC 583 Rf; 38-LC 044 Rf; 39-LC 43 Rf; 40-LC 41 Rf; 41-LC Cium Rf; 42- LC 42 ASC; 43-20A; 44-

20B; 45-393A; 46-393B; 47-058A; 48-058B; 49-75 – FS1-FS27.

Pentru screening-ul molecular al genotipurilor de floarea-soarelui a fost selectată

perechea de primeri HAP3, care generează în urma amplificării fragmentele: 1720, 1330, 1060 şi

940 pb determinate după markerul de masă moleculară în gel de electroforeză [202] sau 1811,

1406, 1119 şi 988 pb [49] determinate în urma secvenţierii. Trei fragmente (R1 1720 pb, R2

1060 pb, R3 940 pb după Pancovic și coautori, 2007 [202] şi Ha-NBS 11 - 1811 pb, Ha-NBS 13

- 1119 pb, Ha-NBS 14 - 988 pb după Bouzidi și coautori, 2002 [49] au fost caracteristice pentru

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 M 43 44

45 46 47 48 M 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58

M 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

M 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31

1517 1200

1000

1517

1200

1000

1517

1200

1000

1517

1200

1000

1517

1200

1000

75

linia parentală rezistentă şi un fragment a fost comun pentru ambii părinţi (S1 1330 pb sau Ha-

NBS 12 1406 pb respectiv). Autorii denotă că fragmentele asociate cu susceptibilitatea par să fie

similare.

Studiul efectuat a demonstrat prezenţa fragmentelor asociate cu rezistenţa la 37 de

genotipuri din cele 75 analizate. Ampliconi, care indică rezistenţă asigurată de gena Pl6, au fost

puşi în evidenţă la toate zece linii paterne şi la opt linii materne cu ASC (LC 40; LC SW 38; LC

42; LC 075/1; ASC 2; ASC 4; ASC 7; ASC 8) din cele 18 analizate. Din 14 hibrizi F1 incluşi în

investigaţie doar trei (LC 40 ASC x LC Raus Rf; LC SW 38 ASC x LC 4 Rf; LC 40 ASC x

Xenia Rf) s-au caracterizat prin prezenţa fragmentului asociat cu susceptibilitatea în gel. În cazul

celor şase linii isogene (după gena orfH522) s-a constatat doar prezenţa fragmentului asociat cu

susceptibilitatea. Analiza profilului de amplificare caracteristic liniilor de perspectivă a pus în

evidenţa ampliconi asociaţi cu rezistenţa în opt genotipuri (FS1; FS7-10; FS12; FS17; FS26) din

cele 27 investigate (Tabelul 3.5, Figura 3.26).

Tabelul 3.5. Repartizarea genotipurilor în funcţie de prezenţa sau absenţa markerilor asociați cu

gena de rezistenţă Pl6

Genotipuri Rezistente Susceptibile

Hibrizi F1 (11R/3S)

Drofa F1, Drofa ASC x LC Raus Rf, Drofa

ASC x LC 637 Rf, Drofa ASC x LC 7 Rf, LC

SW 38 ASC x LC 637 Rf, Drofa ASC x LC 39

Rf, Xenia ASC x LC 39 Rf, Xenia F1, Favorit

F1, Olea F1, Oxana F1;

LC 40 ASC x LC Raus Rf,

LC SW 38 ASC x LC 4 Rf,

LC 40 ASC x Xenia Rf;

Linii Rf (10R)

Drofa Rf, LC Raus Rf, LC 637 Rf, LC 7 Rf,

LC 39 Rf, LC 583 Rf, LC 43 Rf, LC 41 Rf, LC

Cium Rf, LC 044 Rf;

Linii ASC (8R/10S)

LC 40 ASC, LC SW 38 ASC, LC 42 ASC, LC

075/1 ASC, ASC 2, ASC 4, ASC 7, ASC 8;

Drofa ASC, LC 391A ASC,

Xenia ASC, LC 075/2 ASC,

ASC 1, ASC 3, ASC 6, ASC

9, ASC 10, ASC 11;

Linii isogene (6S) 20A, 20B, 393A, 393B,

058A, 058B;

Linii de perspectivă

(8R/19S)

FS 1, FS 7 – FS 10, FS 12, FS 17, FS 26.

FS2-FS 6, FS11, FS 13 – FS

16, FS 18 – FS 25, FS 27.

37 genotipuri 38 genotipuri

Total 75 genotipuri

Astfel, 78,57 % dintre hibrizii F1, 100,0 % dintre liniile Rf, 44,44 % dintre liniile ASC şi

29,63 % dintre liniile de perspectivă analizate posedă fragmente asociate cu rezistenţa la unele

76

rase de mană determinată de gena Pl6. Ca şi în cazul screening-ului genei Pl1 hibrizii F1 şi liniile

paterne Rf au manifestat un potenţial de rezistenţă mai înalt decât liniile materne, cele izogene şi

de perspectivă.

3.3. Concluzii la capitolul 3

Analiza a 21 genotipuri privind polimorfismul genetic al acestora a pus în evidenţă benzi,

care pot fi asociate cu rezistenţa unor genotipuri la mană. Astfel, makerul ORS70 a generat un

profil mai bogat în cazul genotipurilor, care au manifestat potenţial de rezistenţă. Unele dintre

aceste linii parentale s-au caracterizat prin prezenţa benzii de 118 pb. Alt marker – ORS224, de

asemenea, a pus în evidenţă benzi specifice (131/147 pb) formelor parentale rezistente la mană.

Cu ajutorul a şapte markeri au fost genotipate zece linii parentale valoroase din punct de

vedere al ameliorării. Datele obţinute pot fi utilizate pentru protejarea drepturilor de autor şi

stabilirea gradului de puritate a liniilor respective.

Generalizarea datelor privind prezenţa a două gene de rezistenţă la rase diferite de mană a

pus în evidenţă că în total 24 de genotipuri posedă markeri lincaţi cu ambele gene. Din aceste

genotipuri fac parte 10 hibrizi F1 (Drofa ASC x LC Raus Rf, Drofa ASC x LC 637 Rf, Drofa

ASC x LC 7 Rf, LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, Drofa ASC x LC 39 Rf, Xenia ASC x LC 39 Rf,

Xenia F1, Favorit F1, Olea F1, Oxana F1), trei linii materne (LC 40 ASC, LC SW 38 ASC, LC

075/1 ASC), opt linii paterne (LC Raus Rf, LC 637 Rf, LC 7 Rf, LC 39 Rf, LC 583 Rf, LC 43

Rf, LC 41 Rf, LC Cium Rf) şi trei linii de perspectivă (FS12, FS17 şi FS26).

77

4. INVESTIGAREA MECANISMELOR NESPECIFICE DE REZISTENŢĂ ALE

FLORII-SOARELUI LA MANĂ

Nu există un model universal sau o succesiune de evenimente care descrie cu exactitate

dinamica rezistenței plantelor la patogeni, întrucât răspunsurile defensive sunt foarte complexe și

cunoștințele despre acestea sunt acumulate în baza a câteva interacțiuni studiate [68].

Aproape fiecare interacțiune gazdă-parazit este unică și depinde în mare măsură de modul

de activare, localizare, timpul și magnitudinea influenței fiecărui component al răspunsului de

apărare. După cum sa menționat anterior, rezistența este rareori absolută, astfel planta este

considerată rezistentă sau sensibilă în dependență de suma mai multor răspunsuri individuale.

Plasticitatea metabolică a plantelor permite adaptarea lor rapidă la condiții variabile de

stres. Plantele în timpul stresului redirecționează metabolismul lor primar spre sinteza

compușilor, care asigură răspunsul defensiv – SRO, fitoalexinele, proteinele PR ș.a.

4.1. Evaluarea virulenţei şi selectarea genelor implicate în răspunsul defensiv

În răspunsul plantei la diferiţi stimuli abiotici şi biotici are loc modificarea activităţii

funcţionale a diferitor grupe de gene, inducerea sau represia cărora depinde de însuşirile

agentului patogen – afinitate, agresivitate și virulență sau patogenitate.

4.1.1. Estimarea gradului de atac al genotipurilor de floarea-soarelui

Estimarea gradului de atac cu mană a fost efectuată pentru probe colectate de la hibridul

Drofa F1 şi formele lui parentale şi o pereche de linii izogene (393A şi 393 B) după gena

orfH522 infectate spontan în condiţii de cîmp.

Datele fenotipice au arătat că în condiţii de cîmp cel mai înalt grad de atac s-a constatat

la genotipul matern Drofa ASC şi liniile izogene analizate, mediu pentru hibridul Drofa F1 şi cel

mai slab a fost atacat genotipul patern Drofa Rf (Figura 4.1).

De asemenea, pentru confirmarea prezenţei şi gradului de infectare cu P. halstedii a fost

estimată cantitatea transcripţilor genei TEF, care codifică factorul de elongare a transcripţiei la

patogen şi poate servi în calitate de marker al infectării [210] (Figura 4.2).

78

Fig. 4.1. Aspectul fenotipic al plantelor atacate de mana P. halstedii

A –Drofa Rf infectat slab; B – 393A infectat mediu; C – Drofa ASC infectat sistemic; D- Drofa F1 control

Valorile activității transcripționale au variat de la 76,48 și 87,67 un.c. în cazul genotipului

Drofa ASC infectat puternic și mediu până la 0,008 un.c. în cazul plantelor din grupul control ale

formei paterne Drofa Rf. În lipsa infecției, în cazul tuturor genotipurilor studiate activitatea

transcripțională a genei nu a fost detectată. Expresia cea mai înaltă a fost remarcată la plantele

infectate sistemic şi mediu a genotipurilor cu grad de atac înalt (Figura 4.2).

Fig. 4.2. Activitatea transcripţională a genei factorului de elongare a transcripţiei TEF de la P.

halstedii (în unităţi convenţionale)

Astfel, analiza rezultatelor obţinute privind activitatea transcripțională a genei respective

a corespuns cu datele fenotipice şi a demonstrat, că în plantele atacate mai puternic se

acumulează o cantitate mai mare de transcripți ai genei TEF.

0

20

40

60

80

100

120

puternic mediu slab neinfectat control

Drofa F1 Drofa ASC Drofa Rf 393A 393B

79

4.1.2. Clasificarea funcțională a genelor implicate în răspunsul defensiv la infectare

cu P. halstedii

Din numeroasele grupe funcţionale de factori ereditari, cunoscuţi ca modulatori ai reacţiei

de răspuns la stresul biotic şi abiotic, ne-am propus să studiem o serie de gene responsabile de

două mecanisme principale de rezistență – reglarea potențialului redox şi rezistența sistemică

dobândită.

Utilizând informațiile din portalul NCBI şi instrumentele bioinformatice disponibile au

fost selectate 14 gene (Mn-SOD II, Mn-SOD I, CuZn-SOD II, CuZn-SOD I, CATA1, CATA2,

CATA3, CATA4, GPX, PAL, NPR1, defensina, PR5, GST) și 8 EST-uri cu grad înalt de omologie

cu genele care participă în răspunsul la stresul biotic la diferite specii de plante.

Analiza bioinformatică a EST-urilor prin BLASTx a arătat că gradul de acoperire a

secvențelor căutate în cazul grupului de secvențe selectate a variat de la 50 % (APX3) până la 95

% (TGA5). Gradul de omologie a fost cuprins între 73 % (Why1) și 87 % (AOXIA) (Tabel 4.1).

Tabel 4.1. Lista EST-urilor incluse în analiză

Denumirea

genei la

Arabidopsis

după care a

fost selectat

EST

EST (Expressed

Sequence Tags)

Nr. de acces

GenBank

Nr. de acces al

secvenței

omoloage

Secvența

omoloagă din

baza de date

Val

oar

ea E

Gra

du

l d

e ac

op

erir

e

a secvenței căutate

Gra

du

l d

e o

mo

log

ie

APX1 QHJ20E24.yg.ab1 BU032190.1 NP_195226.1 L-ascorbate

peroxidase

5e-

123 91% 80%

APX3 DH0AC027ZF05FM1 CD849992.1 NP_172267.1 L-ascorbate

peroxidase 1 3e-25 50% 84%

AOXIA CCFT3158.b1_K21.ab1 GE502151.1 NP_188876.1 alternative

oxidase 1A

2e-

140 87% 87%

PRXIIF CCFU1199.b1_M11.ab1 GE515985 NP_566268.1 peroxiredoxin-

2F 7e-95 82% 74%

GSS2 DH0ANA3ZD01FM1 CX946030.1 CAA58318.1 glutathione

synthetase 6e-72 60% 72%

TGA2 CCFU2042.b1_D07.ab1 GE516848.1 NP_196312.1 transcription

factor TGA2 2e-98 82% 75%

TGA5 CCFT8591.b1_N11.ab1 GE512673.1 NP_566415.3 transcription

factor TGA6 2e-92 95% 74%

Why1 CCFS537.b1_B15.ab1 GE491965.1 NP_001077872.1

single-

stranded

DNA-binding

protein

WHY3

2e-

104 71% 73%

Am constatat că APX1, APX3, AOXIA, PRXIIF, GSS2 contribuie la menținerea statutului

redox, iar TGA2, TGA5 și Why1 reprezintă factori de transcripție, asociați cu mecanismul de

80

rezistenţă sistemică dobândită.

Astfel a fost demonstrat că genele şi o mare parte a secvențelor selectate pentru studiu

sunt implicate în menținerea homeostaziei oxido-reducătoare și RSD.

4.2. Studiul expresiei unor transcripţi ai genelor codificatoare de enzime antioxidante

Speciile reactive de oxigen (SRO) determină răspunsul defensiv al plantelor și constituie

prima linie de aparăre față de atacul patogenilor, caracterizându-se în același timp prin

citotoxicitate atît față de celulele fitoparaziților cît și a plantelor-gazdă [29, 175, 243, 254].

Plantele au o reţea voluminoasă de căi metabolice de producere şi eliminare/detoxifiere a SRO,

esenţiale pentru menţinerea nivelului SRO şi reglarea semnalelor [32, 174, 175]. Această reţea

este formată din peste 150 de gene, care codifică proteine SRO-producătoare, cum ar fi NADPH

oxidazele şi enzimele SRO-neutralizante, precum sunt superoxid dismutazele (SOD), catalazele

(CAT), ascorbat peroxidazele (APX) ș.a. [174].

4.2.1. Determinarea calitativă a speciilor reactive de oxigen

Speciile reactive de oxigen joacă un rol cheie în metabolismul celular, fiind molecule de

semnalizare, care reglează nu doar creșterea şi dezvoltarea plantelor, dar şi căile de apărare

împotriva patogenilor şi factorilor de stres abiotic.

Analiza calitativă a peroxidului de hidrogen (H2O2) şi superoxidului (O2-) a fost efectuată

prin colorarea cu DAB şi NBT a frunzelor sănătoase, care au servit drept control (Figura 4.3, A,

D), frunzelor infectate, clorotice, fără miceliu aerian a patogenului pe suprafaţa inferioară a

frunzelor (Figura 4.3, B, E) şi infectate complet cu miceliu aerian pe suprafaţa inferioară a

frunzelor (Figura 4.3, C, F).

La plantele control nu s-a depistat acumularea superoxidului, colorarea fiind vizibilă

numai local (Figura 4.3A, puncte albastre pe frunză). În frunzele infectate mediu au fost

observate suprafeţe mai mari, în care se acumula O2- (Figura 4.3B). În cazul frunzelor infectate

sistemic, practic toată suprafaţa limbului foliar a fost colorată cu NBT, indicând prezenţa

superoxidului în cantităţi mari în toată frunza (Figura 4.3C) [20].

Colorarea frunzelor cu DAB pentru determinarea semicantitativă a peroxidului de

hidrogen a demonstrat diferenţe nesemnificative între frunzele infectate şi control (Figura 4.3D-

F).

81

Astfel, s-a constatat că infecţia, produsă de mana P. halstedii acţionează mai mult în

direcţia sintezei radicalului superoxid decât a peroxidului de hidrogen [20].

Fig. 4.4. Colorarea discurilor din frunzele genotipului Drofa ASC cu NBT pentru identificarea

superoxidului (x64)

A – control; B – infectat slab; C – regiuni ale frunzelor neinfectate de la plante infectate slab; D – infectat sistemic

(sporulaţia pe suprafaţa inferioară a frunzelor).

A B C D E F

Fig. 4.3. Colorarea frunzelor genotipului Drofa ASC cu NBT (A-C) şi DAB (D-F)

pentru identificarea superoxidului şi peroxidului de hidrogen

A, D – control; B, E – frunze infectate, clorotice, fără miceliu aerian al patogenului pe suprafaţa inferioară a frunzelor; C, F – infectate complet cu miceliu aerian pe suprafaţa inferioară a frunzelor.

A

B

C

D

Frunza inferioară Frunza superioară

82

Efectuarea colorării similare pentru discuri tăiate din frunze superioare şi inferioare

colectate de pe plante infectate slab (leziuni locale pe frunze) şi cele infectate sistemic a arătat o

coincidenţă cu rezultatele obţinute pentru frunze întregi (Figura 4.4 şi 4.5). Discurile respective

au fost analizate la microscop la mărirea x64.

În cazul determinării superoxidului la plantele control s-a detectat un nivel mai înalt de

superoxid în frunzele inferioare comparativ cu cele superioare. La plantele, care au demonstrat

un nivel de infectare slab, avînd numai leziuni locale pe frunze, precum şi la cele infectate

sistemic nivelul superoxidului a fost mai înalt în frunzele superioare infectate (Figura 4.4).

Acumularea peroxidului de hidrogen la plantele control s-a observat preponderent în

regiunile nervurilor, deci ţesutului conducător (Figura 4.5).

Fig. 4.5. Colorarea discurilor din frunzele genotipului Drofa ASC cu DAB pentru identificarea

peroxidului (x64).

A – control; B – infectat slab; C – regiuni ale frunzelor neinfectate de la plante infectate slab; D – infectat sistemic

(sporulaţia pe suprafaţa inferioară a frunzelor).

La plantele slab infectate atît în frunzele inferioare cît şi cele superioare s-a observat

prezenţa peroxidului în cantităţi mai mari comparativ cu controlul. În cazul infectării sistemice a

plantelor acumularea locală a peroxidului se manifestă doar în frunzele superioare (Figura 4.5).

A

B

C

D

Frunza inferioară Frunza superioară

83

De asemenea, la plantele infectate a avut loc acumularea superoxidului şi peroxidului în

ţesuturile conducătoare, ceea ce indică implicarea moleculelor respective în semnalizarea

celulară (Figura 4.4 şi 4.5).

4.2.2. Expresia genelor implicate în metabolismul superoxidului (O2-)

Superoxidul (O2-) este produs în orice compartiment, unde sunt prezente lanţurile

transportatoare de electroni, însă activarea O2 poate apărea în diferite organite celulare [94],

inclusiv în mitocondrii, cloroplaste, microzomi, glioxizomi, peroxizomi, apoplast şi citozol.

Toate compartimentele celulare sunt site-uri posibile de formare a superoxidului, însă

cloroplastele, mitocondriile şi peroxizomii sunt considerați cei mai importanți generatori [100].

În timpul interacțiunii gazdă-parazit, producerea și acumularea superoxidului reprezintă un

mecanism de apărare, care asigură crearea condițiilor nefavorabile creșterii și dezvoltării

fitopatogenilor [174], ceea ce a fost demonstrat pentru mai multe specii de plante: Arabidopsis și

orez [143], tutun [64], floarea-soarelui [210].

În celulele vii superoxid dismutazele (SOD; CE 1.15.1.1) constitue prima linie de apărare

faţă de SRO, asigurând dismutarea superoxidului în compuși mai puțin toxici – oxigenul și

peroxidul de hidrogen.

În baza cofactorului prezent în enzimă, SOD sunt repartizate în trei grupe, acestea fiind

localizate în diferite compartimente celulare. FeSOD sunt localizate în cloroplaste, MnSOD – în

mitocondrii, Cu/ZnSOD – în cloroplaste şi citozol. Secvenţa aminoacidică a acestor trei tipuri de

SOD sugerează că MnSOD şi FeSOD sunt mai vechi din punct de vedere evolutiv şi, probabil,

enzimele respective au apărut de la o enzimă ancestrală comună. Evoluţia Cu/ZnSOD a decurs

separat în eucariote, deoarece acestea nu manifestă similaritate la nivel de secvenţă cu MnSOD şi

FeSOD [132, 235].

Tabelul 4.2. Activitatea transcripțională a genelor SOD în funcție de genotip

Denumirea

genei

Expresia relativă a genei în unități convenționale

Drofa F1,

x ± tsx

Drofa ASC,

x ± tsx

Drofa Rf,

x ± tsx

393A,

x ± tsx

393B,

x ± t sx

Mn-SOD II 1,324 ± 0,118 1,416 ± 0,119 0,805 ± 0,069 3,320 ± 0,313 3,499 ± 0,279

Mn-SOD I 0,086 ± 0,010 0,007 ± 0,0002 0,061 ± 0,005 0,155 ± 0,004 0,068 ± 0,003

CuZn-SOD I 12,307 ± 0,888 2,890 ± 0,231 3,686 ± 0,350 7,537 ± 0,607 10,510 ± 0,924

CuZn-SOD II 1,242 ± 0,126 0,796 ± 0,065 0,905 ± 0,074 1,295 ± 0,010 2,353 ± 0,221

Valoarea tsx este calculată pentru α=0,05; n=3

84

Studiul expresiei pentru patru gene a superoxid dismutazelor: Mn-SOD II, Mn-SOD I,

CuZn-SOD II şi CuZn-SOD I a pus în evidenţă faptul că la toate genotipurile studiate nivelul de

expresie cel mai înalt a prezentat CuZn-SOD I (de la 2,89 un.c. la Drofa ASC până la 12,31 un.c.

la Drofa F1), dar valorile cele mai mici ale nivelului de expresie au fost caracteristice pentru Mn-

SOD I (de la 0,007 un.c. la Drofa ASC până la 0,155 un.c. la 393A). Expresia genelor Mn-SOD

II și CuZn-SOD II a variat între 0,81 un.c. la Drofa Rf și 3,49 un.c. la 393B și 0,80 un.c la Drofa

ASC și 2,35 un.c. la 393B respectiv (Tabelul 4.2, Figura 4.6).

Fig. 4.6. Activitatea transcripţională a genelor SOD sub influența infectării cu mană

A – Mn-SOD II, B – Mn-SOD I, C – CuZn-SOD I, D – CuZn-SOD II (în unităţi convenţionale); 1- infectat puternic,

2- mediu, 3- slab, 4- țesut neinfectat de la plantă infectată slab, 5- control.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

1 2 3 4 5

0

5

10

15

20

25

30

35

1 2 3 4 50

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5

A B

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

1 2 3 4 5

C D

85

-8

-6

-4

-2

0

2

4

1 2 3 4

Activitatea transcripțională a genelor SOD a variat în funcție de genotip. Astfel, genotipul

Drofa ASC s-a caracterizat prin valori minimale ale expresiei celor patru gene SOD cu excepția

genei Mn-SOD II; liniile izogene 393A și B și hibridul Drofa F1 au demonstrat un nivel înalt de

expresie a SOD comparativ cu celelalte genotipuri.

Datele analizelor cantitative obţinute, relevă că cea mai mare concentraţie de transcripţi ai

genei Mn-SOD II s-a acumulat în probele control ale liniilor izogene. S-a atestat inducerea

expresiei în frunzele non-simptomatice şi infectate ale plantelor infectate slab la genotipul Drofa

Rf: valorile respective au depăşit valoarea control de 1,96 şi respectiv 2,3 ori. Nivelul expresiei

pentru probele cu gradul de atac similar celorlalte genotipuri a fost aproape egal cu valoarea

probei martor. La toate genotipurile incluse în studiu, cu excepţia genotipului Drofa Rf și Drofa

F1, a fost observată scăderea concentraţiei transcripţilor genei Mn-SOD II corelată cu creşterea

gradului de infectare. Astfel, valorile minimale ale expresiei au fost constatate pentru plantele

infectate sistemic (Figura 4.6A).

Analiza pattern-ului de expresie a genei Mn-SOD II în funcție de genotip a pus în

evidență creșterea concentrației de transcripți ai genei respective numai la genotipul Drofa F1 și

formele lui parentale, la plantele infectate slab și țesuturile neinfectate a acestora. Liniile izogene

s-au caracterizat prin diminuarea expresiei genei respective corelată cu gradul de infectare, însă

acestea au demonstrat valori maximale ale expresiei în cazul plantelor din grupul control (Figura

4.7).

Fig. 4.7. Modificarea activității transcripționale experiență/control (fold change) a genei

Mn-SOD II, ori

1- infectat puternic/control, 2- mediu/control, 3- slab/control, 4- țesut neinfectat de la plantă infectată

slab/control

86

Gena Mn-SOD I s-a caracterizat prin expresie slabă. La forma paternă Drofa Rf s-a

observat inducerea expresiei enzimei respective în plantele infectate. Astfel, valorile maximale a

concentraţiei transcripţilor Mn-SOD I au fost stabilite în frunzele non-simptomatice şi infectate

(cu 4,5 şi 3,4 mai sporită decît control respectiv) de la plantele atacate slab ale genotipului Drofa

Rf. Genotipul matern şi liniile izogene s-au caracterizat prin creşterea expresiei genei respective

în părţile neinfectate ale plantelor slab infectate (în cazul genotipului Drofa ASC de 2,12 ori mai

mari decât la grupul control). Valorile minimale ale expresiei au fost stabilite în plantele

infectate sistemic (la linia 393A cu 75,95 ori mai mici decât controlul). La forma hibridă Drofa

F1 nivelul de expresie a fost mai mic decât cela observat la martor de 10,1 și 11,66 ori în plante

infectate slab și părțile neinfectate acestora, respectiv (Figura 4.6B).

Ca și la alte specii de plante, la floarea-soarelui genele Mn-SOD sunt specifice

mitocondriilor și se caracterizează prin grad de expresie cu mult mai mic comparativ cu CuZn-

SOD. Datele obținute de alți autori [95] privind influența infectării cu mană asupra expresiei Mn-

SOD, arată că expresia Mn-SOD a crescut în cazul genei Mn-SOD I și a fost diminuată în cazul

genei Mn-SOD II. Gena Mn-SOD I este considerată cea mai sensibilă în celulă la condițiile

fluctuante de mediu, astfel, funcționând ca un senzor potențial, care avertizează despre apariția

unor condiții stresogene, care pot afecta expresia altor gene SOD [95, 178].

Genele Mn-SOD studiate în condiții de infectare naturală în cîmp au manifestat creșterea

expresiei în cazul infectării slabe cu mană. Cea mai accentuată intensificarea activității

transcripționale a fost observată în cazul genotipului Drofa Rf, care de asemenea s-a caracterizat

prin prezența genei Pl6 și nu a manifestat semne de infectare medie și sistemică în cîmp.

Gena CuZn-SOD I a prezentat cele mai înalte niveluri de expresie, comparativ cu alte

gene ale SOD. Nivelul de expresie a variat în funcție de gradul de atac cu mană. Creşterea

semnificativă a concentraţiei transcripţilor la toate genotipurile studiate s-a observat în cazul

părților neinfectate a plantelor infectate slab, constituind valorile de 10,45 şi 6,13 mai mari decît

controlul pentru genotipurile Drofa ASC şi respectiv Rf (Figura 4.6C).

Concentraţia transcripţilor genei CuZn-SOD II, spre deosebire de celelalte SOD a

demonstrat valoarea maximală în cazul frunzelor neinfectate a plantelor infectate slab la

genotipul 393B. Sporirea concentraţiei transcripţilor, sau valorile apropiate celor control au fost

demonstrate în toate probele studiate cu excepția genotipului Drofa F1 și liniei 393B infectate

slab și liniilor izogene infectate sistemic. Din genotipurile infectate puternic, doar Drofa ASC a

manifestat creşterea concentraţiei transcripţilor de 3,12 ori faţă de control (Figura 4.6D).

La fel ca și în cercetările altor autori [95], pentru genele CuZn-SOD studiate au fost

caracteristice valori ale expresiei mai înalte decât pentru Mn-SOD (în special Mn-SOD I).

87

Valorile maximale ale expresiei s-au constatat pentru gena CuZn-SOD I, localizată în

cloroplaste, spre deosebire de datele altor autori, care au constat valori maximale pentru CuZn-

SOD II citozolică. Reprogramarea sintezei SOD în direcția acumulării SOD cloroplastice, poate

fi explicată prin faptul că la stadiile mai avansate a infecției apare fenomenul de cloroză, cauzat

de distrugerea cloroplastelor, astfel, sinteza CuZn-SOD I fiind un mecanism de protejare a

cloroplastelor împotriva stresului oxidativ.

Analiza comparativă a influenței stresului abiotic asupra sistemului antioxidant

cloroplastic și citozolic (în special activității enzimelor implicate în ciclul ascorbat-glutation)

efectuată de către Zhang și coautori (1996) [290] a demonstrat că la floarea-soarelui principala

cale de detoxificare a H2O2 este cea cloroplastică. Datele respective susțin ipoteza că sporirea

semnificativă a activității CuZn-SOD I reprezintă un fenomen de protejare a cloroplastelor față

de stresul oxidativ.

Studiul expresiei genelor enzimelor antioxidante – superoxid dismutazelor a relevat, că în

majoritatea cazurilor expresia SOD este indusă în condiţii de stres biotic – infectare cu mană,

însă nivelul de expresie a acestora diferă în funcţie de genotip şi gradul de infecţie. Astfel, în

probele izolate din plantele slab infectate, în special părţile neinfectate a acestora, s-a observat

inducerea expresiei SOD cea mai pronunţată, însă cele infectate puternic și mediu s-au

caracterizat prin diminuarea expresiei. Cantitatea sporită a transcripţilor genelor SOD în părţile

neinfectate a plantelor slab infectate poate fi explicată prin participarea acestora în procese, care

limitează răspîndirea infecţiei. Astfel, SOD sunt asociate cu nivelurile ridicate a superoxidului,

avînd funcţii de detoxificare.

4.2.3. Expresia genelor implicate în metabolismul peroxidului de hidrogen (H2O2)

Peroxidul de hidrogen (H2O2) este una din cele mai stabile SRO și mai puţin reactive

comparativ cu radicalii liberi ai oxigenului. Cu toate acestea, H2O2 poate oxida direct proteinele,

acţionând de exemplu la nivelul grupărilor tiol.

Peroxidul de hidrogen participă în răspunsul defensiv al plantelor, însă având unele efecte

citotoxice este eliminat cu ajutorul sistemului enzimelor antioxidante (catalazele, enzimele

implicate în metabolismul ascorbatului şi glutationului).

Expresia genelor catalazelor

În timp ce studiile genomice şi post-genomice au aratat că statututl redox al plantelor este

controlat de o reţea genetică complexă, datele disponibile evidenţiază că catalaza este printre

cele mai importante enzime antioxidante [68]. Speciile de plante analizate până în prezent conţin

trei gene ale catalazelor. Studiile comparative ale profiluruilor de expresie a genelor şi modelelor

88

în baza mutanţilor sugerează că proteinele codificate au roluri specifice în determinarea

acumulării de H2O2 produs prin diverse căi metabolice [169].

La floarea-soarelui sunt identificate opt izoforme ale catalazelor CAT1-CAT8 [93], care

sunt clasificate în două grupe: CAT1-CAT5, care sunt formate din patru subunități 55 și 59 kDa

în raport diferit și CAT6-CAT8, care sunt formate din subunitățile 55 kDa cu sarcină diferită.

Subunitățile respective reprezintă produsul final al activității cel puțin a patru gene (CATA1 –

CATA4): CATA1 (numărul de acces GenBank L28740 [139]) și CATA2 (numărul de acces

GenBank AF243517), ce codifică catalazele matricei peroxizomilor, CATA3 și CATA4 (numărul

de acces GenBank AF243518 și AF243519, respectiv), ce codifică catalazele din incluziunele

cristaline ale peroxizomilor. Activitatea catalazelor este esențială pentru eliminarea peroxidului

de hidrogen toxic în diferite condiții de stres și evitarea apariției defectelor asociate cu stresul

oxidativ [33, 280].

Analiza expresiei genelor catalazelor în condiții normale a relevat că valorile maximale

au fost atestate pentru gena CATA1 (de la 9,35 un.c. la linia 393B până la 58,98 un.c. la linia

393B), dar cele minimale au fost stabilite pentru CATA2 (de la 0,002 un.c. la Drofa Rf până la

0,0163 un.c. la 393A) (Tabelul 4.3; Figura 4.8).

Cu excepția genei CATA3 valorile maximale ale expresiei au fost observate la linia sterilă

393A, dar cele minimale la linia 393B (cu excepția genei CATA2) (Tabelul 5.3).

Tabelul 4.3. Activitatea transcripțională a genelor catalazelor în funcție de genotip

Denumirea

genei

Expresia relativă a genei în unități convenționale

Drofa F1,

x ± tsx

Drofa ASC,

x ± tsx

Drofa Rf,

x ± tsx

393A,

x ± tsx

393B,

x ± t sx

CATA1 29,124 ± 2,322 51,918 ± 4,146 21,367 ± 2,034 58,984 ± 4,7 9,351 ± 0,777

CATA2 0,0061 ± 0,0005 0,003 ± 0,0001 0,002 ± 0,00003 0,0163 ± 0,0006 0,0101 ± 0,0008

CATA3 1,112 ± 0,053 0,222 ± 0,018 2,336 ± 0,138 0,017 ± 0,0008 0,012 ± 0,001

CATA4 0,117 ± 0,010 0,249 ± 0,022 0,288 ± 0,025 0,295 ± 0,0005 0,094 ± 0,0014

Valoarea tsx este calculată pentru α=0,05; n=3

Gena CATA1 s-a caracterizat prin scăderea expresiei în cazul plantelor infectate puternic,

mediu și părților neinfectate ale plantelor infectate slab și creșterea expresiei în cazul

genotipurilor fertile infectate slab. Valorile minimale s-au detectat la linia androsterilă 393A la

plante infectate sistemic şi mediu, fiind de 12,67 şi 6,84 ori mai mici decât la control. Sporirea

expresiei genei CATA1 a depășit valorile grupului control în probele extrase din plantele slab

infectate a genotipurilor fertile – Drofa F1 şi forma lui paternă şi 393B cu 1,77; 1,65 și 2,34 ori.

89

Valoarea maximă în părţile slab infectate a genotipului 393B a depăşit controlul de 2,34 ori

(Figura 4.8A).

Astfel, gena CATA1 s-a caracterizat prin valori de expresie mai înalte în probele control a

genotipurilor sterile şi inducerea expresiei acesteia a avut loc numai în cazul genotipurilor fertile

infectate slab (Figura 4.8A).

Fig. 4.8. Activitatea transcripţională a genelor catalazelor sub influența infectării cu mană

A – CATA1, B – CATA2, C – CATA3, D – CATA4 (în unităţi convenţionale); 1- infectat puternic, 2- mediu, 3-

slab, 4- țesut neinfectat de la plantă infectată slab, 5- control.

Analiza datelor cantitative obţinute a pus în evidenţă că dintre patru gene a catalazelor

incluse în studiu, CATA2 a avut valorile minimale ale expresiei. La fel ca şi CATA1, CATA2 s-a

caracterizat preponderent prin scăderea cantităţii transcriptului la plantele infectate cu grad de

atac diferit. Numai în cazul probelor prelevate din ţesuturile neinfectate a plantelor slab infectate

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

1 2 3 4 5

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4 5

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0,018

0,02

1 2 3 4 5

A B

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

1 2 3 4 5

C D

90

a genotipurilor Drofa Rf şi 393B s-a observat sporirea cantităţii cu 1,97 şi respectiv 1,3 ori faţă

de control (Figura 4.8B).

Astfel, genele CATA1 şi CATA2 s-au caracterizat prin diminuarea expresiei la plantele ce

au manifestat gradul de atac sistemic şi mediu. Sporirea expresiei genelor respective a fost

observată numai în cazul unor linii fertile atacate slab în special în părțile neinfectate a acestora.

Analiza valorilor concentraţiei transcripţilor genei CATA3 a pus în evidenţă sporirea

acesteia în plantele infectate, cu excepţia plantelor slab infectate şi părţilor neinfectate a plantelor

slab infectate a genotipului Drofa F1 și liniei 393B (Figura 4.8C).

Astfel, valorile minimale ale expresiei genei CATA3 s-au observat în ţesuturile

neinfectate şi infectate a plantelor infectate slab ale hibridului Drofa F1, fiind aproximativ de 9,6

şi 3,4 ori mai mici decât a grupului control. Cea mai semnificativă creştere a concentraţiei

transcripţilor a fost atestată la genotipul matern Drofa ASC infectat sistemic şi a fost de 7,27 ori

mai mare decît la control. Genotipul patern Drofa Rf, care a manifestat în cîmp gradul de atac cel

mai mic, s-a caracterizat prin schimbarea nesemnificativă a expresiei genei CATA3 în cazul

infecţiei, însă acesta a demonstrat valori maximale a concentrației transcripților în toate cazurile

studiate (Figura 4.8C).

Rezultatele analizei expresiei genei CATA4 au demonstrat creşterea valorilor

concentraţiei transcripţilor acestei gene în plantele cu infecţie sistemică şi celor mediu infectate.

Astfel, valorile maximale au fost depistate la plantele infectate mediu şi sistemic ale liniei 393B

şi au constituit creşterea cu 16,14 şi respectiv 11,75 ori comparativ cu valorile grupului control

(Figura 4.8D).

Cea mai pronunţată diminuare a expresiei a fost atestată în ţesuturile non-simptomatice a

plantelor slab infectate ale genotipului Drofa ASC (de 9,2 ori mai mică decît controlul).

Generalizând datele obţinute privind expresia catalazelor s-a atestat creşterea expresiei

genelor CATA1 şi CATA2 la plantele infectate slab şi CATA3 şi CATA4 la acelea infectate

sistemic şi mediu. Astfel, sporirea expresiei genelor CATA1 şi CATA2 poate fi asociată cu fazele

incipiente de infectare, iar CATA3 şi CATA4 cu fazele mai avansate (Figura 4.8A-D).

Schimbarea pattern-urilor de expresie a catalazelor sub influența factorilor biotici (atacul

P. halstedii) denotă participarea activă a acestora în răspunsul defensiv al florii-soarelui la stresul

biotic. Studiile recente arată că reglarea potențialului redox în peroxisomi este asigurată de mai

multe clase de enzime, inclusiv și catalazele, și joacă un rol cheie în mecanismele specifice de

apărare față de atacul patogenilor [141, 153, 212, 245].

91

Intensificarea expresiei CATA3 și CATA4 duce la scăderea concentrației H2O2, observată

prin colorarea frunzelor cu DAB (Figura 4.3 și 4.5), astfel, asigurând declanșarea mecanismelor

de apărare, care diferă de cele induse la fazele timpurii de infectare.

Expresia altor gene implicate în metabolismul peroxidului

Un sistem major de detoxifiere a peroxidului de hidrogen la plante este ciclul ascorbat-

glutation, în care, enzima ascorbat peroxidaza (APX) catalizează conversia H2O2 în H2O și O2,

folosind ascorbat ca un donor specific de electroni. Diferite izoforme ale APX sunt prezente în

organitele celulare, cum ar fi cloroplaste, mitocondrii, peroxizomi şi în citosol. Expresia genelor

APX este reglată ca răspuns la stresul biotic şi abiotic, precum şi în procesele de dezvoltare a

plantelor [56].

APX și rolul lor în răspunsul plantelor la stres biotic și abiotic au fost bine studiate la

nivel molecular și fiziologic la mai multe specii de plante: Arabidopsis, spanac, tutun, bostan

tomate ș.a. [56], însă la floarea-soarelui cercetările APX au fost limitate și preponderent axate pe

studiul izoformelor acestora și activității lor enzimatice [290].

Opt tipuri de APX au fost descrise la Arabidopsis: trei cu localizarea citozolică (APX1,

APX2, APX6), două cu cloroplastică (sAPX stromale, tAPX tilacoide), și trei izoforme

microzomale (APX3, APX4, APX5) [126, 146, 197, 219]. Izoenzimele microzomale sunt

implicate în detoxifierea H2O2 produsă de β-oxidarea acizilor grași (mai ales în timpul germinării

semințelor) și fotorespirație [53, 282], APX cloroplastice protejează aparatul fotosintetic de

oxidare, în timp ce enzimele citozolice APX au o funcție mai generală, funcția de protecție la

stres și sunt activate în cazul diverselor tipuri de stres, cum ar fi ozonul, dioxidul de sulf, exces

de lumină, căldură și metale grele [102, 135, 146, 197, 268]. Prin urmare, fiecare din

izoenzimele APX joacă un rol fiziologic specific [198].

În condițiile normale valori maximale ale expresiei au fost stabilite pentru gena APX1 (de

la 2,1 un. c. la Drofa Rf până la 6,22 un. c. la Drofa F1), iar cele minimale au fost demonstrate

pentru gena PRXIIF (de la 0,0004 un. c. la Drofa ASC până la 0,0107 un.c. la linia sterilă 393A).

De asemenea, genele APX1 și AOXIA s-au caracterizat prin valori maximale ale concentrației de

transcripți în cazul genotipului Drofa F1, iar APX3 și PRXIIF – în cazul liniei 393A (Tabelul 4.4;

Figura 4.10).

92

Tabelul 4.4. Activitatea transcripțională a altor gene implicate în metabolismul

peroxidului în funcție de genotip

Denumirea

genei

Expresia relativă a genei în unități convenționale

Drofa F1,

x ± tsx

Drofa ASC,

x ± tsx

Drofa Rf,

x ± tsx

393A,

x ± tsx

393B,

x ± t sx

APX1 6,222 ± 0,499 6,188 ± 0,532 2,095 ± 0,167 3,254 ± 0,286 3,686 ± 0,350

APX3 2,221 ± 0,184 1,237 ± 0,135 0,808 ± 0,074 2,646 ± 0,116 1,613 ± 0,132

AOXIA 5,797 ± 0,510 4,260 ± 0,348 1,900 ± 6,8*10-16

3,287 ± 0,263 2,890 ± 0,231

PRXIIF 0,0020 ± 0,0002 0,0004 ±

4,7*10-6

0,0015 ±

6,6*10-19

0,0107 ± 0,001 0,0079 ± 0,0014

Valoarea tsx este calculată pentru α=0,05; n=3

Analiza datelor cantitative a expresiei genei APX1 a demonstrat creşterea concentraţiei de

transcripţi la plantele infectate slab a formelor parentale ale hibridului Drofa F1 şi liniilor

izogene. Astfel, la genotipul patern Drofa Rf s-au atestat valori maximale ale expresiei

comparativ cu grupul control – de 3,18 şi 2,48 mai mari în plantele infectate slab şi respectiv în

părţile neinfectate a acestora. În cazul plantelor infectate sistemic şi mediu la toate genotipurile

s-a depistat diminuarea expresiei genei APX1. Astfel, la forma maternă Drofa ASC concentraţia

transcripţilor în plantele infectate mediu a fost de 2,42 ori mai mică decât în control (Figura 4.9;

4.10A).

Fig. 4.9. Modificarea activității transcripționale experiență/control (fold change) a genei

APX1, ori

1- infectat puternic/control, 2- mediu/control, 3- slab/control, 4- țesut neinfectat de la plantă infectată

slab/control

-3,00

-2,00

-1,00

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

1 2 3 4

93

Datele obţinute au relevat că expresia genei APX1 poate fi asociată cu rezistenţa florii-

soarelui la mană. Creşeterea semnificativă a nivelului de expresiei a fost atestată la genotipul

Drofa Rf, caracterizat prin gradul maximal de rezistenţă în cîmp și prezența genei Pl6.

Fig. 4.10. Activitatea transcripţională a altor gene cu activitate peroxidazică sub influența

infectării cu mană

A – APX1, B – APX3, C – AOX1A, D – PRXIIF (în unităţi convenţionale); 1- infectat puternic, 2- mediu, 3-

slab, 4- țesut neinfectat de la plantă infectată slab, 5- control.

Estimarea concentraţiei transcripţilor genei APX3 a relevat creşterea acesteia în plantele

infectate slab a formelor parentale ale hibridului Drofa F1, în special în ţesuturile neinfectate.

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

1 2 3 4 5

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 50

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5

A B

C D

94

Astfel, la genotipul Drofa Rf în părţile neinfectate a plantelor infectate slab s-a observat creşterea

expresiei cu 2,22 ori comparativ cu grupul control. La plantele infectate sistemic şi mediu s-a

atestat micşorarea concentraţiei transcripţilor. Cea mai semnificativă schimbare a fost observată

la linia 393A şi a fost 9,95 ori mai mică comparativ cu grupul control (Figura 4.10B).

Datele obţinute indică diminuarea expresiei genelor APX1 și APX3 la floarea-soarelui în

cazul infecţiilor sistemice produse de mană, deși creșterea concentrației transcripților acestor

gene la genotipul Drofa Rf, afectat cel mai slab cu mană, indică implicația posibilă a acestora în

menținerea statului redox și asigurarea rezistenței nespecifice.

Oxidaza alternativă (AOX) este o enzimă, care face parte din lanțul transportator de

electroni a mitocondriilor diferitor organisme [234], codificată de o familie mică de gene

nucleare [130]. Funcția biologică a AOX constă în asigurarea căilor alternative de respirație

(calea citocromului c) în condiții de stres biotic sau abiotic [267].

Importanța AOX1A a fost elucidată cu ajutorul studiului mutanților la Arabidopsis, care

au manifestat susceptibilitate înaltă la factorii de stres abiotic – lumina și seceta [106].

Concentraţia transcripţilor genei oxidazei alternative AOX1A a fost diminuată în cazul

infectării cu mană. Astfel, efectul inhibitor asupra transcripţiei a fost atestat în cazul plantelor

infectate puternic, în special liniilor izogene, fiind de 21,8 (linia 393A) şi 19 ori (linia 393B) mai

mic decît în plantele control. O creştere nesemnificativă a concentraţiei transcripţilor s-a observat

în cazul infectării slabe a liniilor parentale ale formei hibride Drofa F1 (Figura 4.10C).

Astfel, ipoteza despre asigurarea respirației pe cale alternativă [267] prin intermediul

AOX1A în timpul infectării cu mană nu a fost confirmată, fiind necesare investigații suplimentare

pentru un studiu deplin al activității trascripționale a enzimei respective la floarea-soarelui.

Peroxiredoxinele (Prx) sunt peroxidazele tiolice, care posedă cel puţin un rest de cisteină

la capătul N-terminal şi reacţionează cu substratele peroxidice [133]. Pe lîngă activitatea de

reducere a peroxidului, proteinele Prx detoxifică alchil hidroperoxide şi peroxinitrite, însă există

diferenţe semnificative în specificitatea faţă de substrat şi proprietăţile cinetice ale acestora [80].

Datele experimentale pun în evidenţă funcţiile multiple peroxiredoxinelor la plante: antioxidante,

reglare a semnalizării celulare, sensorul redox [80, 287].

Se cunoaște că PrxIIF de la Arabidopsis determină toleranța la stresul abiotic indus de

cadmiu [220], salinitate și frig [36, 97, 103]. În reducerea AtPrxIIF participă glutationul,

tioredoxina-o (Trx-o) mitocondrială și glutarredoxina (GRX) [37, 97].

95

Fig. 4.11. Modificarea activității transcripționale experiență/control (fold change) a genei

PRXIIF, ori

1- infectat puternic/control, 2- mediu/control, 3- slab/control, 4- țesut neinfectat de la plantă infectată slab/control

Analiza expresiei genei peroxiredoxinei II de la floarea-soarelui a pus în evidenţă

concentraţia relativ mică a transcripţilor acestei gene. Creşterea expresiei PRXIIF a fost

observată în cazul infectării cu mană, valorile maximale de 2,62 ori mai mari decît la grupul

control fiind atestate pentru plantele infectate puternic a liniei izogene 393B (Figura 4.10D).

La plantele infectate slab s-a atestat creșterea expresiei față de grupul control de 1,94;

1,33 și 1,16 ori la genotipurile Drofa ASC, Drofa Rf și respectiv 393A. Genotipul Drofa F1 s-a

caracterizat prin diminuarea expresiei la plantele cu diferit grad de infectare (Figura 4.11).

Datele obținute privind expresia genelor implicate în metabolismul peroxidului au

demonstrat că în dependență de gradul de atac, în detoxificarea peroxidului de hidrogen participă

diferite enzime. Astfel, la plantele infectate slab a fost observată intensificarea expresiei genelor

APX1, APX3, CATA1, CATA2, însă cele infectate mediu și sistemic s-au caracterizat printr-o

concentrație sporită a transcripților genei CATA3, CATA4 și PRXIIF. Analiza expresiei

catalazelor a pus în evidență faptul că procesul de dismutare a H2O2 la plantele infectate slab este

asigurat de toate patru tipuri de catalaze analizate (în funcție de genotip pot predomina diferite

tipuri de catalaze), însă la plantele infectate sistemic s-a observat creșterea expresiei CATA3 și

CATA4.

-5,00

-4,00

-3,00

-2,00

-1,00

0,00

1,00

2,00

3,00

1 2 3 4

96

4.2.4. Expresia genelor implicate în metabolismul glutationului

Glutationul (GSH) reprezintă un compus tiolic non-proteic, care conform datelor din

literatura de specialitate are un rol important în răspunsul de apărare a plantelor la stresul biotic

[287].

Rolul glutationului și a unor enzime implicate în metabolismul acestuia (glutation-S-

transferaza (GST) şi glutation peroxidaza (GPX)) în condiții de stres biotic și abiotic la floarea-

soarelui a fost studiat de către mai mulți autori [210, 215]. Astfel, a fost propusă ipoteza conform

căreia GPX joacă un rol cheie în răspunsul defensiv al florii-soarelui la factorii de stres, deoarece

capacitatea de reducere a H2O2 depășește cea a APX și CAT. De asemenea, a fost demonstrat că

unele din GPX la floarea-soarelui se caracterizează prin expresia constitutivă (GPXha-2), deși

expresia altora (GPXha-1) este indusă în condiții de stres (infectare cu mană, rănire) [215].

Cercetările lui Radwan și colaboratorilor (2005) [210] au pus în evidența acumularea

rapidă a transcripților genei GST la plantele de floarea-soarelui rezistente la mană, chiar și în

țesuturile neinfectate ale acestora. Astfel, a fost indicată participarea activă a enzimei date în

răspunsul sistemic la infectare cu mană, asigurată de transducerea semnalelor de la părțile

infectate a plantelor la cele neinfectate.

De asemenea gena GST este considerată un marker al stresului oxidativ la mai multe

specii de plante [86].

Tabelul 4.5. Activitatea transcripțională a genelor implicate în metabolismul glutationului în

funcție de genotip

Denumirea

genei

Expresia relativă a genei în unități convenționale

Drofa F1,

x ± tsx

Drofa ASC,

x ± tsx

Drofa Rf,

x ± tsx

393A,

x ± tsx

393B,

x ± t sx

GSS2 0,072 ± 0,006 0,123 ± 0,012 0,044 ± 0,04 0,097 ± 0,009 0,142 ± 0,012

GST 1,867 ± 0,143 1,613 ± 0,132 1,827 ± 0,158 2,258 ± 0,129 1,556 ± 0,127

GPX 0,099 ± 0,015 0,106 ± 0,016 0,102 ± 0,009 0,054 ± 0,005 0,070 ± 0,006

Valoarea tsx este calculată pentru α=0,05; n=3

Analiza activității transcripționale a genelor implicate în metabolismul glutationului a pus

în evidență valorile maximale ale expresiei în cazul genei GST (de la 1,556 un.c. la 393B până la

2,258 un.c. la 393A) (Tabelul 4.5).

Estimarea concentraţiei transcripţilor genei GSS2 a pus în evidenţă expresia diferenţiată a

acesteia în funcţie de genotip şi nivelul de infectare. Astfel, linia 393B s-a caracterizat prin

inhibarea expresiei GSS2, care a corelat cu gradul de atac, fiind de 3 ori mai mică decît în grupul

97

control (minimală) la plantele infectate puternic. La celelalte genotipuri s-a atestat creşterea

activităţii transcripţionale a GSS2 cu excepţia plantelor infectate puternic ale liniei 393A, mediu

hibridului Drofa F1 şi slab a liniei materne Drofa ASC (Figura 4.12A).

Creșterea maximală a concentraţiei transcripţilor s-a observat în plantele infectate slab a

hibridului Drofa F1, fiind aproximativ de 3 ori mai ridicată decît în plantele control. Sporirea

expresiei GSS2 în părţile neinfectate a plantelor slab infectate poate fi asociată cu implicarea

acesteia în răspunsul defensiv la stadiile incipiente ale infectării, aceasta fiind activată prin

semnale sistemice (Figura 5.15A).

Fig. 4.12. Activitatea transcripţională a genelor implicate în metabolismul glutationului sub

influența infectării cu mană:

A – GSS2, B – GST, C – GPX (în unităţi convenţionale); 1- infectat puternic, 2- mediu, 3- slab, 4- țesut

neinfectat de la plantă infectată slab, 5- control.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

1 2 3 4 5

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5

A B

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

1 2 3 4 5

C

98

Gena GST s-a caracterizat prin creşterea activităţii transcripţionale în special în plantele

infectate puternic şi mediu la toate genotipurile investigate şi infectate slab a liniilor parentale

combinaţiei hibride Drofa F1. Creşterea cea mai semnificativă s-a atestat la genotipul matern

Drofa ASC infectat mediu şi a fost de aproximativ de 3 ori mai mare decît la plantele control ale

acestui genotip. În cazul plantelor infectate puternic s-a observat o diminuare a expresiei

comparativ cu cele afectate mediu, însă concentraţia transcripţilor a depăşit valorile controlului

(Figura 4.12B).

Expresia genei GPX a fost influenţată de infectarea cu mană în direcţia inhibării, însă în

unele cazuri s-a observat şi o creştere nesemnificativă. Astfel, creşterea maximală a concentraţiei

transcripţilor de 1,95 ori mai mare decît în grupul control a fost atestată la genotipul Drofa ASC

(Figura 4.12C). De asemenea, a fost observată creșterea expresiei genei GPX în genotipurile

393A la plantele infectate mediu și slab (cu 1,29 și 1,43 ori mai decât valorile grupului control)

și Drofa ASC infectat puternic (cu 1,17 ori mai mari decât valorile grupului control).

Astfel, analiza expresiei genelor implicate în metabolismul glutationului a relevat că

infectarea cu mană a avut efecte diferite asupra expresiei: GSS2 a manifestat expresie diferențiată

și inducerea a fost asociată cu stadiile precoce ale infecției (plante infectate slab), GST s-a

expresat în cantități mai mari în plantele infectate sistemic și mediu și GPX a fost inhibată sau nu

și-a schimbat semnificativ valorile expresiei. Creșterea expresiei genei GST în cazul infectării cu

mană poate fi explicată prin faptul că aceasta catalizează reacţiile de detoxificare prin conjugarea

formei reduse a glutationului cu mai multe substrate toxice și participă activ în răspunsurile

sistemice ale plantelor la stresul biotic [86, 210].

4.3. Studiul expresiei unor transcripţi implicaţi în rezistența sistemică dobândită (RSD)

La plante rezistența sistemică dobândită este activată de agenţi patogeni şi este

determinată de apariţia necrozelor ca parte componentă a hipersensibilităţii (HR) sau ca simptom

specific al bolii. Acest tip de rezistenţă este eficient împotriva unui spectru larg de agenţi

patogeni (virusuri, bacterii, fungi, oomicete etc) fiind de lungă durată, uneori, chiar pentru

întreagă durată de viaţă a plantelor. RSD se caracterizează prin creşterea expresiei la nivel local

şi sistemic a unui număr mare de gene asociate cu patogeneză Pathogenesis-related (PR), care

servesc în calitate de markeri moleculari utili pentru depistarea RSD.

4.3.1. Expresia genelor implicate în calea de semnalizare a acidului salicilic (AS)

NPR1 este reglator pozitiv central al semnalizării celulare în RSD. AS activează NPR1 și

forma activă a NPR1 interacționează cu factorii de transcripție TGA, care se leagă de elementele

99

SA-raspunzătoare din promotorii genelor PR, astfel inducînd o reprogramare și contribuind la

stabilirea RSD [60, 75, 111, 181]. De asemenea, NPR1 participă în limitarea creșterii patogenilor

în site-ul de infecție [111].

Analiza expresiei genelor implicate în RSD a relevat faptul că valorile maximale ale

expresiei au fost stabilite pentru gena PAL (de la 1,416 un.c. la genotipul matern Drofa ASC

până la 6,044 un.c. la linia 393B), dar valorile minimale ale expresiei au fost remarcate pentru

gena PR5 (de la 0,009 un.c. la genotipul Drofa ASC până la 0,061 un.c. la genotipul 393B)

(Tabelul 4.6).

Tabelul 4.6. Activitatea transcripțională a genelor implicate în RSD în funcție de genotip

Denumirea

genei

Expresia genei în unități convenționale

Drofa F1,

x ± tsx

Drofa ASC,

x ± tsx

Drofa Rf,

x ± tsx

393A,

x ± tsx

393B,

x ± t sx

NPR1 0,101 ± 0,01 0,041 ± 0,003 0,070 ± 0,006 0,051 ± 0,004 0,036 ± 0,003

TGA2 0,187 ± 0,023 0,126 ± 0,012 0,123 ± 0,010 0,145 ± 0,003 0,102 ± 0,009

TGA5 0,100 ± 0,005 0,132 ± 0,011 0,104 ± 0,009 0,149 ± 0,013 0,095 ± 0,009

Why1 0,040 ± 0,004 0,025 ± 0,002 0,020 ± 0,002 0,079 ± 0,007 0,108 ± 0,007

PR5 0,051 ± 0,004 0,009 ± 0,0007 0,048 ± 0,004 0,032 ± 0,003 0,061 ± 0,005

PDF 0,996 ± 0,178 1,101 ± 0,088 1,183 ± 0,100 1,556 ± 0,127 1,556 ± 0,127

PAL 2,471 ± 0,063 1,416 ± 0,119 1,900 ± 6,75*10-16

3,084 ± 0,247 6,044 ± 0,373

Valoarea tsx este calculată pentru α=0,05; n=3

A fost stabilită legătura dintre nivelul de expresie a unor transcripți implicați în RSD și

genotip. Astfel, genotipul 393B s-a caracterizat prin valori maximale ale expresiei genelor Why1

(0,108 un.c.), PR5 (0,061 un.c.), defensina (1,556 un.c.), PAL (6,044 un.c.); Drofa F1 a

demonstrat activitate transcripțională maximală în cazul genelor NPR1 (0,036 un.c.), TGA2

(0,102 un.c.). Gena TGA5 a manifestat o expresie maximală (0,095 un.c.) în cazul liniei 393A

(Tabelul 4.6).

Estimarea expresiei genei NPR1 a pus în evidența diminuarea sau valorile aproximativ

egale ale concentrației transcripților genei respective în părțile neinfectate ale plantelor slab

infectate comparativ cu grupul control. Creșterea expresiei s-a atestat la plantele infectate mediu,

puternic la toate genotipurile investigate și cele infectate slab a genotipurilor Drofa ASC și 393B.

Creșterea maximală a avut loc în cazul plantelor infectate sistemic a genotipului Drofa ASC și a

depașit de 5,56 ori valorile grupului control [227] (Figura 4.13A).

100

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

1 2 3 4 5

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

1 2 3 4 50

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

1 2 3 4 5

Fig. 4.13. Activitatea transcripţională a genelor implicate în declanșarea și realizarea RSD sub

influența infectării cu mană

A – NPR1, B – TGA2, C – TGA5, D – Why1 (în unităţi convenţionale); 1- infectat puternic, 2- mediu, 3- slab,

4- țesut neinfectat de la plantă infectată slab, 5- control.

Rezultatele obținute demonstrează că creșterea expresiei genei NPR1 este într-o corelare

pozitivă cu gradul de atac și declanșarea RSD are loc cînd gradul de atac este mai mare.

Familia de factori de transcripție (FT) TGA de tip ”leucine zipper” participă în inducerea

RSD. TGA2, TGA5 și TGA6 sunt factori esențiali pentru declanșarea RSD [91].

Estimarea concentrației transcripților genei factorului de transcripție TGA2 a relevat

diminuarea expresiei genei respective în majoritatea cazurilor sau valori aproximativ egale cu

cele ale grupului control. Cea mai pronunțată diminuare a expresiei a fost atestată în părțile

neinfectate a plantelor infectate slab în cazul tuturor genotipurilor investigate (Figura 4.13B).

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

1 2 3 4 5

A B

C D

101

Creșterea concentrației transcripților TGA2 a fost observată numai la genotipul Drofa F1

infectat slab și Drofa ASC infectat mediu cu 1,11 și respectiv 1,25 ori. Astfel, expresia genei

TGA2 este diminuată, în special în părțile neinfectate ale plantelor infectate slab (Figura 4.14).

Fig. 4.14. Modificarea activității transcripționale experiență/control (fold change) a genei TGA2,

ori

1- infectat puternic/control, 2- mediu/control, 3- slab/control, 4- țesut neinfectat de la plantă infectată slab/control

Expresia genei factorului de transcripţie TGA5 a fost influenţată de infecţia cu mană

preponderent în direcţia diminuării în părțile neinfectate a plantelor infectate slab și creșterii la

plantele infectate mediu. Astfel, la plantele infectate slab şi părţile neinfectate ale acestora s-a

observat o descreştere în expresie practic în cazul tuturor genotipurilor analizate cu excepţia

hibridului Drofa F1 şi liniei 393B. În cazul plantelor atacate mediu s-a observat creşterea

nesemnificativă a nivelului de expresie a acestei gene, valorile maximale fiind atestate la

genotipul Drofa F1 (de 1,73 ori mai mari decît în grupul control). Plantele infectate puternic s-au

caracterizat prin scăderea expresiei genei TGA5 cu excepția genotipului 393B (cu 1,53 ori mai

mari decât la control) (Figura 4.13C).

Datele obţinute privind activitatea transcriptională a genelor FT TGA sugerează că

acestea au o implicaţie slabă în RSD în cazul genotipurilor investigate la stadiile timpurii de

infecţie, deși joacă un rol important în semnalizarea celulară la stadiile mai avansate.

De asemenea, a fost determinată activitatea transcripţională a factorului de transcripţie

Why1, care este implicat în asigurarea şi declanşarea RSD, însă activarea acestuia este

independentă de NPR1 [91, 111, 242].

Creșterea expresiei Why1 are loc în părţile neinfectate ale plantelor infectate slab a tuturor

genotipurilor studiate cu excepţia genotipului Drofa F1, care s-a caracterizat prin valori ale

-3,00

-2,50

-2,00

-1,50

-1,00

-0,50

0,00

0,50

1,00

1,50

1 2 3 4

102

expresiei aproximativ egale cu acelea ale grupului control. Astfel, valorile maximale au fost

atestate în părţile neinfectate ale plantelor infectate slab ale genotipului Drofa Rf şi au fost de

aproximativ 9,5 ori mari decît în grupul control. La fel a fost observată inducerea expresiei în

cazul plantelor infectate slab ale genotipurilor parentale Drofa Rf şi Drofa ASC (cu 2,35 și 1,63

mai mari decât control). Diminuarea expresiei Why1 a fost observată în cazul plantelor infectate

puternic, mediu și slab a liniilor izogene 393A şi 393B (Figura 4.15 și 4.13D).

Fig. 4.15. Modificarea activității transcripționale experiență/control (fold change) a genei

Why1, ori

1- infectat puternic/control, 2- mediu/control, 3- slab/control, 4- țesut neinfectat de la plantă infectată

slab/control

Analiza activităţii transcripţionale FT din familia TGA şi Whirly (Why) asociaţi cu RSD

a relevat că infectarea cu mană activează factorul Why1 în plantele infectate slab, în special cele

rezistente (genotipul Drofa Rf). Astfel, este evidenţiat faptul că stabilirea RSD în părţile

neinfectate ale plantelor este independentă de NPR1. Creșterea expresiei FT din familia TGA a

fost observată la stadiile mai avansate ale infecției – plante infectate mediu, activarea Why1 fiind

cu mult mai rapidă, deoarece expresia acestui FT este indusă direct de AS, însă factorii TGA

sunt activați de NPR1 [76, 77].

4.3.2. Expresia genelor implicate în realizarea răspunsului defensiv

Proteinele PR5 reprezintă o familie de proteine, expresia cărora este indusă la mai multe

plante de atacul diferitor agenți patogeni și care manifestă un nivel de similaritate înalt cu

taumatina. A fost arătat că acumularea acestor proteine corelează cu dezvoltatrea RSD la plante.

Astfel, protenele PR5 sunt considerate drept markeri RSD [123, 152, 260, 277].

-6,00

-4,00

-2,00

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

1 2 3 4

103

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 2 3 4 5

Fig. 4.16. Activitatea transcripţională a genelor implicate în răspunsul defensiv sub influența

infectării cu mană

A – PR5, B – defensina, C – PAL (în unităţi convenţionale); 1- infectat puternic, 2- mediu, 3- slab, 4- țesut

neinfectat de la plantă infectată slab, 5- control.

Evaluarea concentrației transcripților genei PR5 a demonstrat o creștere semnificativă a

expresiei în cazul plantelor infectate puternic și mediu a tuturor genotipurilor investigate. Astfel,

cea mai pronunțată sporire a expresiei s-a observat la genotipul Drofa ASC infectat puternic (de

32,67 ori mai mare decât la grupul control). De asemenea, o creștere de 2 ori comparativ cu

grupul control s-a înregistrat la forma maternă Drofa ASC infectată slab. În părțile neinfectate a

plantelor infectate a fost observată creșterea concentrației transcripților cu excepția genotipului

Drofa F1, care s-a caracterizat prin diminuarea expresiei cu 8,5 ori comparativ cu plantele din

grupul control (Figura 4.16A).

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1 2 3 4 50

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1 2 3 4 5

A B

C

104

Astfel, gena PR5 manifestă sporirea actvității transcripționale în cazul infectării

puternice, mediu și participă în protejarea țesuturilor neinfectate față de răspândirea infecției

(Figura 4.17).

Fig. 4.17. Modificarea activității transcripționale experiență/control (fold change) a genei

PR5, ori

1- infectat puternic/control, 2- mediu/control, 3- slab/control, 4- țesut neinfectat de la plantă infectată

slab/control

Infectarea cu mană a dirijat expresia genei PR5 în direcția creșterii, ce corespunde cu date

despre corelarea pozitivă a acumulării PR5 și dezvoltarea RSD [123].

Defensinele plantelor sunt peptide mici, înalt stabile, bogate în cisteină, care constituie o

parte a imunității înnăscute la plante direcționate spre asigurarea apărării față de patogeni

fungici. Activitatea biologică a defensinelor nu se limitează numai la cea antifungică, acestea de

asemenea posedă activitate antibacterială, inhibitoare de proteaze și amilaza insectelor. Plantele

transgenice, care supraexpresează defensinele sunt puternic rezistente la patogeni fungici [250].

De asemenea, defensina este considerată marker al răspunsului defensiv mediat de AJ

[244].

Spre deosebire de PR5, activitatea transcripțională a genei defensinei s-a caracterizat prin

inhibare în părțile neinfectate a plantelor infectate slab și prin inducere în cazul plantelor slab

infectate a tuturor genotipurilor studiate și a celor infectate puternic și mediu a genotipurilor

Drofa ASC și F1. Totuși, inhibarea cea mai pronunțată a expresiei defensinei a fost observată în

cazul liniilor izogene 393A și 393B infectate puternic – de 38 și 97,5 ori mai mică decât în

plantele grupului control (Figura 5.19B). Genotipul Drofa ASC s-a caracterizat prin valori

maximale a expresiei, care au depășit cele ale grupului control de 3,73 ori în cazul plantelor slab

-20,00

-10,00

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

1 2 3 4

105

infectate, de 12,8 în cazul gradului de atac mediu și de 1,56 ori în cazul celor infectate puternic

(Figura 4.18).

Fig. 4.18. Modificarea activității transcripționale experiență/control (fold change) a genei

defensinei, ori

1- infectat puternic/control, 2- mediu/control, 3- slab/control, 4- țesut neinfectat de la plantă infectată slab/control

Rezultatele obținute pun în evidență faptul că expresia genei defensinei are loc la stadiile

incepiente ale infecției și numai în țesuturile invadate de patogen, astfel, numai în cazul

contactului cu patogen se manifestă creșterea expresiei genei defensinei.

Analiza comparativă a expresiei genelor PR5 și defensinei a demonstrat creșterea

concentrației transcripților genelor: PR5 în plantele infectate sistemic, mediu și părțile

neinfectate plantelor infectate slab și defensinei în cele infectate slab, care posibil poate fi

explicat prin activarea genelor respective în cadrul diferitor căi de semnalizare. Astfel, la stadiile

timpurii ale infecției răspunsul imun este asigurat de gena defensinei, activată de AJ, dar la

stadiile tardive și în țesuturile sănătoase (distanțate de la site-ul de infecție) acesta este mediat de

PR5, activată prin calea AS [123, 244].

Fenilalanin amonia liaza (PAL, EC 4.3.1.24) participă activ în procesul de fortficare a

peretelui celular și formare a ligninei, catalizînd reacția de deaminare a fenilalaninei cu formare a

acidului cinamic. PAL asigură formarea precursorilor ligninei și unor alte derivate din

metabolismul secundar al fenilpropanoidului (fitoalexinele de natură izoflavonoidă la legume,

AS ș.a.), care de asemenea sunt implicate în rezistență [277].

Analiza rezultatelor obținute privind expresia genei PAL a demonstrat că aceasta a avut o

expresie diferențiată în funcție de genotip și gradul de atac. O creștere pronunțată a expresiei a

-120,00

-100,00

-80,00

-60,00

-40,00

-20,00

0,00

20,00

1 2 3 4

106

fost observată la genotipurile Drofa ASC, Drofa F1 și 393A infectate mediu – de 3,75; 2,74 și 1,2

ori respectiv mai mare decît la grupul control (Figura 5.19C). Genotipurile infectate puternic, de

asemenea, s-au caracterizat prin sporirea expresiei genei PAL cu 3,88 ori în cazul liniei Drofa

ASC; 1,43 și 1,25 în cazul liniilor izogene 393A și 393B. În cazul plantelor infectate slab s-a

observat o creștere a concentrației transcripților la hibridul Drofa F1 și formele lui parentale

(Figura 4.19).

Fig. 4.19. Modificarea activității transcripționale experiență/control (fold change) a genei

PAL, ori

1- infectat puternic/control, 2- mediu/control, 3- slab/control, 4- țesut neinfectat de la plantă infectată

slab/control

Analiza datelor obținute privind expresia genelor implicate în RSD a relevat că aceasta a

fost diferită în funcție de genotip și gradul de infectare a acestuia. Astfel, au fost puse în evidență

gene, care s-au caracterizat prin creșterea expresiei la plantele atacate sistemic sau mediu (NPR1,

PR5 etc.) și infectate slab (defensina, Why1 etc.).

4.4. Concluzii la capitolul 4

Analiza calitativă a prezenței superoxidului și peroxidului a constatat că infecţia, produsă

de mana P. halstedii mai mult acţionează în direcţia sintezei radicalului superoxid comparativ cu

peroxidul de hidrogen. A fost demonstrată acumularea superoxidului şi peroxidului în ţesuturile

conducătoare, ce indică implicarea moleculelor respective în semnalizarea celulară.

Evaluarea gradului de atac la nivel fenotipic și prin analize moleculare a relevat corelarea

datelor moleculare privind expresia genei factorului de elongare a transcripției de la P. halstedii

și celor fenotipice.

-3,00

-2,00

-1,00

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

1 2 3 4

107

Analiza expresiei genelor implicate în metabolismul superoxidului, peroxidului și

glutationului și celor asociați cu RSD a relevat că acțiunea infectării cu mană asupra expresiei

genelor stuidate depinde în mare măsură de gradul de atac și genotipul studiat. Astfel, au fost

evidențiate gene, expresia cărora se induce la plante infectate sistemic și mediu (GST, PAL, PR5,

PRXIIF, NPR1 etc.) și slab (SOD, defensina, Why1 etc.). Unele gene studiate nu au manifestat

schimbări semnificative în expresie – GSS2, GPX, TGA2, TGA5 etc., altele s-au caracterizat prin

diminuarea expresiei – AOXIA, catalazele CAT1 și CAT3, APX3 etc.

În baza datelor obținute și a celor din literatura de specialitate [91, 111, 129, 253] a fost

elaborată o schemă ipotetică, care descrie unele elemente de bază în declanşarea şi realizarea

răspunsului defensiv al florii-soarelui la mană în cadrul rezistenţei nespecifice şi celei sistemice

(Figura 4.20).

Rezistența florii-soarelui față de mană este determinată de activitatea genelor de

rezistență specifică (gene Pl) și nespecifică. Analiza expresiei genelor de rezistență nespecifică la

genotipul Drofa Rf (rezistent), caracterizat prin prezența genelor de rezistența Pl1 și Pl6, a pus în

evidență faptul că în cazul genotipurilor rezistente expresia genelor răspunsului defensiv are loc

cu mult mai repede și în cantități mai mari [210, 228], decât în cazul genotipurilor susceptibile.

Genelor de rezistență Pl le este atribuită funcția de recunoaștere rapidă a patogenului și

participare în declanșarea răspunsului defensiv.

În cazul infectării cu mană reacția de răspuns este realizată prin schimbarea statutului

redox, sinteza proteinelor asociate cu patogeneza, activarea FT asociați cu RSD etc. Astfel, a fost

demonstrat că una din căile de apărare față de mană o prezintă stresul oxidativ, creat prin

acumularea superoxidului și peroxidului de hidrogen. SRO, fiind citotoxice nu numai pentru

patogen, dar și pentru planta-gazdă, induc expresia genelor enzimelor antioxidante, care asigură

detoxificarea. A fost stabilit că la floarea-soarelui infectată cu mană un rol deosedit în procesul

de detoxificare SRO și menținere a statutului redox este atribuit: MnSOD I mitocondriale,

CuZnSOD I cloroplastice, GST, APX1, CATA1 la plantele infectate slab și CATA3, CATA4,

PRXIIF la plantele infectate sistemic și mediu (Figura 4.20).

Un alt mecanism evaluat în cadrul cercetărilor efectuate este declanșarea și realizarea

RSD. A fost estimată posibilitatea declanșarii RSD pe calea dependentă sau independentă de

NPR1. Astfel, a fost relevat că la plantele infectate sistemic și mediu crește expresia genei NPR1

și FT TGA, însă la cele infectate slab se observă creșterea expresiei genei FT Why1,

independente de NPR1 și activate nemijlocit de AS (Figura 4.20).

108

Fig. 4.20. Model ipotetic a mecanismelor asociate cu rezistența florii-soarelui la mană

Cu culoare gri sunt indicate gene, expresia cărora se induce în stadiile mai avansate a infectării cu mană

Spre deosebire de datele obținute anterior de către alți autori [210, 215] privind expresia

unor gene indusă de stresul biotic, unele din genele respective s-au caracterizat prin diminuarea

expresiei în cazul infectării cu mană: CATA2, APX3, AOXIA, GPX.

În concluzie remarcăm, că în rezultatul infectării florii-soarelui cu mană se activează un

șir de mecanisme de apărare generale, care în funcție de potențialul de rezistență al plantei-gazdă

diferă semnificativ. Elucidarea aspectelor genetice a rezistenței la mană precum și mecanismelor

fundamentale de apărare va contribui esențial la facilitarea procesului de obținere hibrizilor

rezistenți.

109

CONCLUZII GENERALE ȘI RECOMANDĂRI

Concluzii

1. Analiza SSR cu 14 perechi de primeri a permis identificarea a 13 perechi care au manifestat

un nivel înalt de polimorfism (valoarea indicelui PIC a variat de la 0,67 pentru ORS216

până la 0,92 pentru ORS495, în medie constituind 0,76) și un număr total de 120 alele. Au

fost stabilite asocierile între banda de 118 pb, generată cu ajutorul markerului ORS70, și

benzile 131 pb și 147 pb, generate de markerul ORS224 cu rezistenţă la mană. Markerii cu

moștenirea codominantă (ORS70, ORS495 şi ORS610) pot fi incluşi în cercetările axate pe

stabilirea gradului de hibridare a seminţelor și purității materialului semincer.

2. A fost obţinută amprenta genetică a florii-soarelui cu şapte markeri SSR (ORS78, ORS237,

ORS349, ORS366, ORS509, ORS811 și ORS836) la zece linii parentale (Drofa Rf, LC

Raus Rf, LC 637 Rf, LC 7 Rf, LC 39 Rf, Drofa ASC, Xenia ASC, LC 40 ASC, LC 38 ASC,

LC SW 391A ASC) valoroase pentru ameliorare.

3. Au fost identificate 24 de genotipuri, care posedă markeri lincaţi cu ambele gene de

rezistență la mană Pl1 și Pl6, inclusiv 10 hibrizi F1 (Drofa ASC x LC Raus Rf, Drofa ASC x

LC 637 Rf, Drofa ASC x LC 7 Rf, LC SW 38 ASC x LC 637 Rf, Drofa ASC x LC 39 Rf,

Xenia ASC x LC 39 Rf, Xenia F1, Favorit F1, Olea F1, Oxana F1), trei linii materne (LC 40

ASC, LC SW 38 ASC, LC 075/1 ASC), opt linii paterne (LC Raus Rf, LC 637 Rf, LC 7 Rf,

LC 39 Rf, LC 583 Rf, LC 43 Rf, LC 41 Rf, LC Cium Rf) şi trei linii de perspectivă (FS12,

FS17 şi FS26).

4. S-a constatat că răspunsul defensiv al plantelor la atacul manei este asigurat de modificări în

statutul redox celular, care este determinat de sinteza și acumularea O2- și H2O2. S-a

demonstrat prezența acestor SRO în țesuturile conducătoare ale plantelor infectate, date care

relevă rolul de semnalizare a acestora și acumularea accentuată a radicalului superoxid

comparativ cu peroxidul de hidrogen.

5. A fost stabilită expresia diferențiată a genelor, care codifică enzimele antioxidante în funcție

de gradul de atac cu mană. S-a relevat:

creșterea expresiei genelor MnSOD I, CuZn-SOD I, CATA1, APX1, defensina și Why1

la plantele slab infectate;

110

creșterea expresiei genelor, CATA3, CATA4, PRXIIF, GST, NPR1 și PR5 la cele

infectate mediu și puternic;

diminuarea sau schimbări nesemnificative ale expresiei genelor CATA2, APX3, AOXIA,

GPX și MnSOD II față de control.

6. Au fost determinate modificările în pattern-ul de expresie a genelor codificătoare de enzime

antioxidante, cauzate de creșterea expresiei la plantele infectate slab (Mn-SOD I

mitocondriale, CuZn-SOD I cloroplastice, CATA1, GST, APX1), puternic și mediu (CATA3,

CATA4, PRXIIF) sau diminuarea (Mn-SOD II, CATA2, APX3, GPX) concentrației relative a

transcripților, asigură eficientizarea proceselor fiziologice de detoxificare/eliminare a SRO,

utilizând resurse energetice minimale. Totodată, a fost evidențiată implicarea genelor Mn-

SODI, CATA1 și APX1 în detoxificarea SRO prin stabilirea creșterii nivelului de expresie a

acestora la plantele rezistente şi slab infectate.

7. A fost demonstrată creșterea activității transcripționale a genelor NPR1, PR5, PAL

evidențiată la plantele infectate puternic și mediu, precum şi a defensinei, Why1 – la plantele

infectate slab și părțile neinfectate ale acestora și implicarea lor în mecanismele RSD.

Creșterea expresiei genei, care codifică pentru factorul de transcripție Why1, la plantele

infectate slab a sugerat că stabilirea RSD în părţile neinfectate a plantelor este independentă

de NPR1.

Recomandări practice

1. Markerii microsateliți testați în lucrare (ORS78, ORS261, ORS795 ș.a.) pot fi utilizați în

scopul: amprentării, evidențierii autenticității genotipurilor valoroase, determinării

polimorfismului genetic intraspecific, stabilirii gradului de hibridare a seminţelor şi purității

genetice a materialului semincer.

2. Se recomandă includerea a 24 de genotipuri, care posedă markeri lincaţi cu ambele gene de

rezistență la mană, Pl1 și Pl6, în programe de ameliorare a florii-soarelui pentru rezistență la

mană.

3. Perechile de primeri elaborați pentru determinarea nivelului de expresie a genelor implicate

în RSD se recomandă spre utilizare pentru testarea potențialului de rezistență la mană a

genotipurilor de floarea-soarelui.

111

BIBLIOGRAFIE

1. Duca M., Port A., Şestacova T. Particularităţi morfo-fiziologice şi genetico-moleculare ale

interacţiunii Helianthus annuus L. – Plasmopara halstedii F. Berl et de Toni. În: Buletinul

Academiei de Ştiinţe a Moldovei. Ştiinţele Vieţii. 2012, Nr. 3 (317), p. 23-35.

2. Joiţa-Păcureanu M., Cană L., Stanciu D. Evoluţia relaţiei parazit - plantă gazdă in sistemul

Plasmopara halstedii F. Berl. and de Toni – Helianthus annuus L., în România. În: An.

I.N.C.D.A. Fundulea, 2010, vol. LXXVIII, nr. 2, p. 129-134.

3. Pârvu M. Ghid practic de fitopatologie. Cluj-Napoca: Cluj University Press, 2010. 386 p.

4. Şestacova Tatiana. Utilizarea markerilor moleculari în evaluarea potenţialului de

rezistenţă a florii-soarelui la mana. În: Buletinul Academiei de Ştiinţe a Moldovei. Ştiinţele

Vieţii, 2013, nr. 1 (319), p. 96-101.

5. Vrânceanu A. Floarea-soarelui hibridă. Bucureşti: Ceres, 2000. 520 p.

6. Vrânceanu V., Stoenescu F. Ereditatea imunității la mana a florii-soarelui. În: Rum Cercet

Pentru Cereale Plante Teh Fundulea An Ser C, 1971, vol. 37, p. 209-217.

7. Vrânceanu V., Stoenescu F. Imunitate la mana florii-soarelui, conditionata monogenic. În:

Probleme Agric., 1970, vol. 22, p. 34-40.

8. Вронских М.Д., Колесник Ф.П. Борьба с вредителями и болезнями. В:

Подсолнечник. Кишинев: Картя молдoвеняскэ, 1980, с. 74-97.

9. Гринберг Ш.М. Ложная мучнистая роса подсолнечника в пути снижения ее

вредоносности в южной зоне Молдавской ССР. Автореферат диссертации на соискание

ученой степени кандидата с/х наук. Кишинев, 1970. 25 с.

10. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. Москва: Колос, 1979. 414 с.

11. Колесник Ф.П. Некоторые агротехнические приемы снижения вредосносности

ложной мучнистой росы подсолнечника. В: Защита полевых культур от вредителей и

болезней. Кишинев, 1975. С.71-75.

12. Колесник Ф.П., Павличенко В.А. Изучение влияния климатических условий на

образование ооспор возбудителя ложной мучнистой росы подсолнечника . В:

«Достижение науки - производству», Кишинев: Картя молдовеняскэ, 1973, с. 135-139.

13. Молдован М.Я., Колесник Ф.П. Враг номер один (ложномучнистая роса

подсолнечника в Молдавии и борьба с ней). В: Зерновые и масличные культуры, 1966, №

12, с. 12-13.

14. Пересыпкин В.Ф. Сельско-хозяйственная фитопатология. Москва: Агропромиздат,

1989. 528 с.

112

15. Попушой И.С., Гринберг Ш.М. Ложная мучнистая роса подсолнечника в Молдавии

и меры борьбы с ней. Кишинев: РИО АН МССР, 1971. 16 с.

16. Попушой И.С., Гринберг Ш.М. Прогноз развития ЛМР подсолнечника (Plasmopara

helianthi Novot. helianthi). В: Известия Академии наук Молдавской ССР, 1975, с. 83-84.

17. Пустовойт В.С. Селекция, семеноводство и некоторые вопросы агротехники

подсолнечника. Москва: Колос, 1966. 368 с.

18. Пустовойт Г.В. Селекция подсолнечника на групповой иммунитет методом

межвидовой гибридизации. В: Масличные и эфиромасличные культуры. Москва, 1963, с.

75-92.

19. Пустовойт Г.В., Илатовский В.П., Слюсарь Э.Л. Результаты и перспективы селекции

подсолнечника на групповой иммунитет методом межвидовой гибридизации. В: С.-х.

биол., 1976, т.11(4), с.600-611.

20. Шестакова Т. А., Порт А. И., Дука М. В. Изучение накопления активных форм

кислорода у растений подсолнечника, инфицированных ложной мучнистой росой.

Сборник тезисов 16-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых

ученых «Биология – наука ХХI века». Пущино, 2012, c. 485-486.

21. Abdalla M. and Hermsen J. A two-loci system of gametophytic incompatibility in Solanum

phureja and S. stenotomum. In: Euphytica, 1971, vol. 20, p. 345-350.

22. Achard P. et al. Plant DELLAs restrain growth and promote survival of adversity by

reducing the levels of reactive oxygen species. In: Curr Biol, 2008, vol. 18, p. 656-660.

23. Alary R. et al. Comparison of simplex and duplex real-time PCR for the quantification of

GMO in maize and soybean. In: Food Control, 2002, vol. 13, p. 235-244.

24. Alvarez M.E. et al. Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in

the establishment of plant immunity. In: Cell, 1998, vol. 92, p. 773-784.

25. Anderson J.A. et al. Optimizing parental selection for genetic linkage maps. In: Genome,

1993, vol. 36(1), p.181-186.

26. Antoniw J. et al. The presence of pathogenesis-related proteins in callus of Xanthi-nc

tobacco. In: Phytophathol. Z., 1980, vol. 101, p. 179-184.

27. Apel K., Hirt H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal

transduction. In: Annu Rev Plant Biol, 2004, vol. 55, p. 373-399.

28. Apostol I., Heinstein P.F., Low P.S. Rapid stimulation of an oxidative burst during

elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction. In: Plant Physiol, 1989,

vol. 90, p. 109-116.

113

29. Asada K. Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and their

functions. In: Plant Physiol, 2006, vol. 141, p. 391-396.

30. As-sadi F. et al. Transcriptomic analysis of the interaction between Helianthus annuus and

its obligate parasite Plasmopara halstedii shows single nucleotide polymorphisms in CRN

sequences. In: BMC Genomics, 2011, vol. 12:498.

31. Bachlava E. et al. Downy mildew (Pl8 and Pl14) and rust (Radv) resistance genes reside in

close proximity to tandemly duplicated clusters of non-TIR-like NBS-LRR-encoding genes on

sunflower chromosomes 1 and 13. In: TAG, 2011, vol. 122, p. 1211-1221.

32. Bailey-Serres J., Mittler R. The roles of reactive oxygen species in plant cells. In: Plant

Phys., 2006, vol. 141, p. 311.

33. Bailly C. et al. Catalase activity and expression in developing sunflower seeds as related to

drying. In: J Exp Bot., 2004, vol. 55(396), p. 475-483.

34. Baker B. et al. Signaling in plant-microbe interactions. In: Science, 1997, vol. 276, p. 726-

733.

35. Baldini M. et al. Main factors influencing downy mildew (Plasmopara halstedii) infection

in high-oleic sunflower hybrids in Northern Italy. In: Crop Protection, 2006, vol. 27, p. 590-599.

36. Barranco-Medina S. et al. Biochemical and molecular characterization of the mitochondrial

peroxiredoxin PsPrxIIF from Pisum sativum. In: Plant Physiol and Biochem, 2007, vol. 45, p.

29–39.

37. Barranco-Medina S. et al. Hexameric oligomerization of mitochondrial peroxiredoxin

PrxIIF and formation of an ultrahigh affinity complex with its electron donor thioredoxin Trx-o.

In: J Exp Bot., 2008, vol. 59(12), p. 3259-3269.

38. Beckers G.J. and Spoel S.H. Fine-tuning plant defence signalling: salicylate versus

jasmonate. In: Plant Biol. (Stuttg), 2006, vol. 8, p. 1-10.

39. Berglund G.I. et al. The catalytic pathway of horseradish peroxidase at high resolution. In:

Nature, 2002, vol. 417, p. 463-468.

40. Bert P.F. et al. Identification of a second linkage group carrying genes controlling

resistance to downy mildew (Plasmopara halstedii) in sunflower (Helianthus annuus L.). In:

TAG, 2001, vol. 103, p. 992-997.

41. Bindschedler L. et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis

required for pathogen resistance. In: Plant J, 2006, vol. 47, p. 851-863.

42. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen

deprivation stress: a review. In: Ann Bot, 2003, vol. 91, p. 179-194.

114

43. Blume B. et al. Receptor-mediated increase in cytoplasmic free calcium required for

activation of pathogen defense in parsley. In: Plant Cell, 2000, vol. 12, p. 1425-1440.

44. Bonas U. and Lahaye T. Plant disease resistance triggered by pathogen-derived molecules:

refined models of specific recognition. In: Curr. Opin. Microbiol., 2002, vol. 5, p. 44-50.

45. Borovkov A. Y. and McClean P. E. A tandemly repeated sequence from the Plasmopara

halstedii genome. In: Gene, 1993, vol. 123, p. 127-130.

46. Borovkova I. G. et al. Restriction fragment length polymorphisms and RAPD markers in

DNA of Plasmopara halstedii, the downy mildew fungus of sunflower. In: Proceedings of the

13th International Sunflower Conference, Pisa, Italy, 1992, p. 1420-1425.

47. Bournonville C.F., Díaz-Ricci J.C. Quantitative determination of superoxide in plant

leaves using a modified NBT staining method. In: Phytochem Anal. 2011, vol. 122(3), p. 268-

271.

48. Bouzidi M.F. et al. Expressed Sequence Tags from the oomycete Plasmopara halstedii, an

obligate parasite of the sunflower. In: BMC Microbiology, 2007, vol. 7:110.

49. Bouzidi M.F. et al. Molecular analysis of a major locus for resistance to downy mildew in

sunflower with specific PCR-based markers. In: TAG, 2002, vol. 104, p. 592-600.

50. Brahm L., Röcher T., Friedt W. PCR-based markers facilitating marker assisted selection

in sunflower for resistance to downy mildew. In: Crop Sci., 2000, vol. 40, p. 676-682.

51. Brown I. et al. Localization of components of the oxidative cross-linking of glycoproteins

and of callose synthesis in papillae formed during the interaction between non-pathogenic strains

of Xanthomonas campestris and French bean mesophyll cells. In: Plant J 1998, vol. 15, p. 333-

343.

52. Brueggeman R. et al. The barley stem rust-resistance gene Rpg1 is a novel disease-

resistance gene with homology to receptor kinases. In: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, vol.

99, p. 9328-9333.

53. Bunkelmann J.R., Trelease R.N. Ascorbate peroxidase: a prominent membrane protein in

oilseed glyoxysomes. In: Plant Physiol, 1996, vol. 110, p. 589-598.

54. Cankar K. et al. Critical points of DNA quantification by real-time PCR – effects of DNA

extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. In:

BMC Biotechnology, 2006, vol. 6, p. 37-52.

55. Cao H. et al. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance

encodes a novel protein containing ankyrin repeats. In: Cell, 1997, vol. 88, p. 57-63.

56. Caverzan A. et al. Plant responses to stresses: Role of ascorbate peroxidase in the

antioxidant protection. In: Genet Mol Biol., 2012, vol. 35(4 suppl), p. 1011-1019.

115

57. Chaki M. et al. Involvement of reactive nitrogen and oxygen species (RNS and ROS) in

sunflower-mildew interaction. In: Plant & Cell Physiology, 2009, vol. 50, p. 665-679.

58. Chandra S., Stennis M., Low P.S. Measurement of Ca2+

fluxes during elicitation of the

oxidative burst in aequorin-transformed tobacco cells. In: J Biol Chem, 1997, vol. 272, p. 28274-

28280.

59. Chaouch S., Queval G., Noctor G. AtRbohF is a crucial modulator of defence-associated

metabolism and a key actor in the interplay between intracellular oxidative stress and

pathogenesis responses in Arabidopsis. In: Plant J, 2012, vol. 69, p. 613-627.

60. Chern M. et al. Overexpression of a rice NPR1 homolog leads to constitutive activation of

defense response and hypersensitivity to light. In: Mol Plant Microbe Interact, 2005, vol. 18, p.

511-520.

61. Cipollini D., Purrington C.B. and Bergelson J. Costs of induced responses in plants. In:

Basic Appl. Ecol., 2003, vol. 4, p. 79-89.

62. Cohn J., Sessa G., Martin G.B. Innate immunity in plants. In: Curr. Opin. Immunol., 2001,

vol. 13, p. 55-62.

63. Conklin P.L., Last R.L. Differential accumulation of antioxidant mRNAs in Arabidopsis

thaliana exposed to ozone. In: Plant Physiol, 1995, vol. 109, p. 203-212.

64. Cvetkovska M., Vanlerberghe G.C. Coordination of a mitochondrial superoxide burst

during the hypersensitive response to bacterial pathogen in Nicotiana tabacum. In: Plant Cell

Environ., 2012, vol. 35(6), p. 1121-1136.

65. Dangl J. L. and Jones J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to

infection. In: Nature, 2001, vol. 411, p. 826-833.

66. Daudi A. et al. The apoplastic oxidative burst peroxidase in Arabidopsis is a major

component of pattern-triggered immunity. In: Plant Cell, 2012, vol. 24(1), p. 275-287.

67. Davies D.R. et al. Production of reactive oxygen species in Arabidopsis thaliana cell

suspension cultures in response to an elicitor from Fusarium oxysporum: implications for basal

resistance. In: J Exp Bot, 2006, vol. 57, p. 1817-1827.

68. de Gara L., de Pintoa M.C., Tommasi F. The antioxidant systems vis-à-vis reactive oxygen

species during plant-pathogen interaction. In: Plant Physiol and Biochem, 2003, vol. 41(10), p.

863–870.

69. de Guenin M. C. Mildew on sunflower: a newly reappeared disease. In: Phytoma, 1990, p.

26‐30.

116

70. de Romano A.B. et al. A new gene for resistance to downy mildew in sunflower. In: Proc.

Int. Symposium “Sunflower breeding on resistance to diseases”. Krasnodar, Russia, 2010, p.

141-146.

71. Delanoë D. Biologie et épidémiologie du mildiou du tournesol (Plasmopara helianthi

Novot.). In: CETIOM Informations Techniques, 1972, vol. 29, p. 1-49.

72. Delmotte F. et al. Single nucleotide polymorphisms reveal multiple introductions into

France of Plasmopara halstedii, the plant pathogen causing sunflower downy mildew. In:

Infection, Genetics and Evolution, 2008, vol. 8, p. 534-540.

73. Desikan R. et al. Harpin and hydrogen peroxide both initiate programmed cell death but

have differential effects on defence gene expression in Arabidopsis suspension cultures. In:

Biochem J, 1998, vol. 330, p. 115-120.

74. Desikan R., Neill S.J., Hancock J.T. Hydrogen peroxide-induced gene expression in

Arabidopsis thaliana. In: Free Radic Biol Med, 2000, vol. 28, p. 773-778.

75. Despres C. et al. The Arabidopsis NPR1 disease resistance protein is a novel cofactor that

confers redox regulation of DNA binding activity to the basic domain/leucine zipper

transcription factor TGA1. In: Plant Cell, 2003, vol. 15, p. 2181-2191.

76. Desveaux D. et al. A ‘whirly’ transcription factor is required for salicylic acid-dependent

disease resistance in Arabidopsis. In: Dev Cell, 2004, vol. 6, p. 229-240.

77. Desveaux D., Maréchal A., Brisson N. Whirly transcription factors: defense gene

regulation and beyond. In: Trends Plant Sci, 2005, vol. 10(2), p. 95-102.

78. Devlin W.S., Gustine D.L. Involvement of the oxidative burst in phytoalexin accumulation

and the hypersensitive reaction. In: Plant Physiol, 1992, vol. 100, p. 1189-1195.

79. Diagnostics - Diagnostic: Plasmopara halstedii. In: Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 2008,

vol. 38, p. 343-348.

80. Dietz K.J. et al. The function of peroxiredoxins in plant organelle redox metabolism. In: J

Exp Bot, 2006, vol. 57, p. 1697-1709.

81. Dixon M.S. et al. The tomato Cf-2 disease resistance locus comprises two functional genes

encoding leucine-rich repeat proteins. In: Cell, 1996, vol. 84, p. 451-459.

82. Dong X. NPR1, all things considered. In: Curr Opin Plant Biol, 2004, vol. 7, p. 547-552.

83. Doods P.N. et al. Direct protein interaction underlies gene-for gene specificity and

coevolution of the flax resistance genes and flax rust avirulence genes. In: Proc Nat Acad Sci

USA, 2006, vol. 103, p. 8888-8893.

84. Doyle J., Doyle J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. In: Focus, 1990, vol. 12, p.13–

15.

117

85. Dua R.P., Yadava T.P. Genetics of seed yield and its components in sunflower (Helianthus

annuus L.). In: Proc. 11th Intern. Sunfl. Conf. Mar del Plata, Argentina, 1985, vol. II, p. 627-

632.

86. Dubreuil-Maurizi C., Poinssot B. Role of glutathione in plant signaling under biotic stress.

In: Plant Signal Behav., 2012, vol. 7(2), p. 210-212.

87. Duca M. et al. Clustering analysis of sunflower genotypes cultivated in Moldova on the

basis of microsatellite sequences. În: Lucrări ştiinţifice, seria Horticultura. Ed. “Ion Ionescu de la

Brad”, Iaşi, 2011, vol. 54, nr. 2, p. 55-60.

88. Duca M. et al. Microsatellite marker application in sunflower (Helianthus annuus L.)

fingerprinting. In: Biotechnology & Biotechnological Equipment, 2013, vol. 27, nr 3, p. 3772-

3775.

89. Duca M., Port A., Şestacova T. Screening of the R2 rust resistance gene in different

sunflower genotypes using SSR markers. În: Buletinul Academiei de Şiinţe a Moldovei, Ştiinţe

ale Vieţii. 2011, nr. 2 (314), p. 106-110.

90. Dunford B. Kinetics of peroxides reactions: horseradish, barley, Corpinus cinereus, lignin

and manganese. In: Welinder K.G.et al. (eds) Plant peroxidases: biochemistry and physiology.

University of Geneva, Geneva, 1993, p. 113-124.

91. Durrant W.E., Dong X. Systemic acquired resistance. In: Annu Rev Phytopathol, 2004,

vol. 42, p. 185-209.

92. Dußle C.M. et al. PlArg from Helianthus argophyllus is unlinked to other known downy

mildew resistance genes in sunflower. In: TAG, 2004, vol. 109, p. 1083-1086.

93. Eising R., Trelease R.N., Ni W. Biogenesis of catalase in glyoxysomes and leaf-type

peroxisomes of sunflower cotyledons. In: Arch Bioch and Biophys, 1990, vol. 278, p. 258-264.

94. Elstner E.F. Mechanisms of oxygen activation in different compartments of plant cells. In:

Pell EJ, Steffen KL, eds. Active oxygen/oxidative stress and plant metabolism. Rockville, MD:

American Society of Plant Physiologists, 1991, p. 13–25.

95. Fernández-Ocaña A. et al. Functional analysis of superoxide dismutases (SODs) in

sunflower under biotic and abiotic stress conditions. Identification of two new genes of

mitochondrial Mn-SOD. In: J Plant Physiol., 2011, vol. 168(11), p. 1303-1308.

96. Feys B.J. et al. Arabidopsis SENESCENCE-ASSOCIATED GENE101 stabilizes and

signals within a enhanced disease susceptibility1 complex in plant innate immunity. In: Plant

Cell, 2005, vol. 17, p. 2601-2613.

118

97. Finkemeier I. et al. The mitochondrial type II peroxiredoxin F is essential for redox

homeostasis and root growth of Arabidopsis thaliana under stress. In: J Biol Chem, 2005, vol.

280, p. 12168-12180.

98. Flor H. The current status of the gene-for-gene concept. In: Annu Rev Phytopathol, 1971,

vol. 9, p. 275-296.

99. Fobert P.R., Despres C. Redox control of systemic acquired resistance. In: Curr Opin Plant

Biol, 2005, vol. 8, p. 378-382.

100. Fridovich I. Superoxide dismutases. In: Adv Enz and Rel Areas Mol Biol, 1986, vol. 58, p.

61-97.

101. Fritig B., Heitz T. and Legrand M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. In:

Curr. Opin. Immunol., 1998, vol. 10, p. 16-22.

102. Fryer M.J. et al. Control of Ascorbate Peroxidase 2 expression by hydrogen peroxide and

leaf water status during excess light stress reveals a functional organisation of Arabidopsis

leaves. In: Plant J, 2003, vol. 33, p. 691-705.

103. Gama F. et al. The mitochondrial type II peroxiredoxin from poplar. In: Physiology

Plantarum, 2007, vol. 129, p. 196-206.

104. Gedil M.A. et al. Candidate disease resistance genes in sunflower cloned using conserved

nucleotide binding site motifs: genetic mapping and linkage to downy mildew resistance gene

Pl1. In: Genome, 2001, vol. 44, p. 205-212.

105. Gentzbittel L. et al. Cloning of molecular markers for disease resistance in sunflower

Helianthus annuus L. In: TAG, 1998, vol. 96, p. 519-525.

106. Giraud E. et al. The absence of ALTERNATIVE OXIDASE1a in Arabidopsis results in

acute sensitivity to combined light and drought stress. In: Plant Physiol., 2008, vol. 147(2), p.

595-610.

107. Giresse X., de Labrouhe D. T. and Richard-Cervera S. Twelve polymorphic expressed

sequence tags-derived markers for Plasmopara halstedii, the causal agent of sunflower downy

mildew. In: Mol Ecol Notes, 2007, vol. 7, p. 1363-1365.

108. Glazebrook J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic

pathogens. In: Annu Rev Phytopathol, 2005, vol. 43, p. 205-227.

109. Gomez-Gomez L., Boller T. FLS2: an LRR receptor-like kinase involved in the perception

of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. In: Mol. Cell, 2000, vol. 5, p. 1003-1011.

110. Grant J.J., Loake G.J. Role of reactive oxygen intermediates and cognate redox signaling

in disease. In: Plant Physiol, 2000, vol. 124, p. 21-29.

119

111. Grant M. and Lamb C. Systemic immunity. In: Curr Opin in Plant Biol, 2006, vol. 9, p.

414-420.

112. Green M. R. and Sambrook J. Molecular cloning: A laboratory manual. New-York: CSH

Press, 2012, 3 v., 2028 p.

113. Grenville-Briggs L. J. et al. Elevated amino acid biosynthesis in Phytophthora infestans

during appressorium formation and potato infection. In: Fungal Genet. Biol., 2005, vol. 42, p.

244-256.

114. Gulya T. J. Distribution of Plasmopara halstedii races from sunflower around the world.

In: Advances in Downy Mildew Research, Palacky University and JOLA Publishers, 2007, vol.

3, p. 121-134.

115. Gulya T.J. et al. New races of the sunflower downy mildew pathogen (Plasmopara

halstedii) in Europe and North and South America. In: J. Phytopath., 1991, vol. 132, p. 303-311.

116. Gulya T.J. et al. Proposal for standardized nomenclature and identification of races of

Plasmopara halstedii (sunflower downy mildew). In: Proceedings of the ISA Symposium III,

Sunflower Downy Mildew, Fargo, ND, USA, 1998, p. 130-136.

117. Halterman D. et al. The MLA6 coiled-coil, NBS-LRR protein confers AvrMla6-dependent

resistance specificity to Blumeria graminis f. sp. hordei in barley and wheat. In: Plant J., 2001,

vol. 25, p. 335-348.

118. Heller A., Rozynek B. and Spring O. Cytological and physiological reasons for the latent

type of infection in sunflower caused by Plasmopara halstedii. In: J. Phytopath., 1997, vol. 145,

p. 441-445.

119. Herbette S. et al. Transcripts of sunflower antioxidant scavangers of the SOD and GPX

families accumulate differentially in response to downy mildew infection, phytohormones,

reactive oxygen species, nitric oxyde, protein kinase and phosphatase. In: Physiologia Plantarum,

2003, vol. 119, p. 418-428.

120. Hoch H. et al. Signaling for growth orientation and cell differentiation by surface

topography in Uromyces. In: Science, 1987, vol. 235, p. 1659-1662.

121. Hoes J.A., Putt E.D., Enns H. Resistance to Verticillium wilt in collections of wild

Helianthus in North America. In: Phytopath, 1973, vol. 63, p. 1517-1520.

122. Hu J., Seiler G., Kole C. Genetics, Genomics and Breeding of Sunflower, CRC Press, Inc.,

Boca Raton, USA, 2010. 360 p.

123. Hu X., Reddy A.S. Cloning and expression of a PR5-like protein from Arabidopsis:

inhibition of fungal growth by bacterially expressed protein. In: Plant Mol Biol., 1997, vol.

34(6), p. 949-959.

120

124. Hulbert S.H. et al. Resistance gene complexes: Evolution and Utilization. In: Annu Rev

Phytopathol, 2001, vol. 39, p. 285-312.

125. Intelmann F. and Spring O. Analysis of total DNA by minisatellite and simple-sequence

repeat primers for the use of population studies in Plasmopara halstedii. In: Can. J. Microbiol.,

2002, vol. 48, p. 555-559.

126. Jespersen H.M. et al. From sequence analysis of three novel ascorbate peroxidases from

Arabidopsis thaliana to structure, function and evolution of seven types of ascorbate peroxidase.

In: Biochem J, 1997, vol. 326, p. 305-310.

127. Jia Y.L. et al. Direct interaction of resistance gene and avirulence gene products confers

rice blast resistance. In: EMBO J, 2000, vol. 19, p. 4004-4014.

128. Jones D.A. et al. Isolation of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum

by transposon tagging. In: Science, 1994, vol. 266, p. 789-793.

129. Jones J.D.G., Dangl J.L. The plant immune system. In: Nature, 2006, vol. 444, p. 323-329.

130. Juszczuk I.M., Rychter A.M. Alternative oxidase in higher plants. In: Acta Biochim. Pol.,

2003, vol. 50 (4), p. 1257-1271.

131. Kachroo P. et al. A fatty acid desaturase modulates the activation of defense signaling

pathways in plants. In: Proc Natl Acad Sci USA, 2001, vol. 98, p. 9448-9453.

132. Kanematsu S., Asada K. Characteristic amino acid sequences of chloroplast and cytosol

isozymes of CuZn‐superoxide dismutase in spinach, rice and horsetail. In: Plant Cell Phys, 1990,

vol. 31, p. 99–112.

133. Kang S.W., Baines I.C., Rhee S.G. Characterization of a mammalian peroxiredoxin that

contains one conserved cysteine. In: J Biol Chem, 1998, vol. 273, p. 6303-6311.

134. Karban R. and Baldwin I.T. Induced responses to herbivory. Chicago: University of

Chicago Press, 1997. 330 p.

135. Karpinski S. et al. Photosynthetic electron transport regulates the expression of cytosolic

ascorbate peroxidase genes in Arabidopsis during excess light stress. In: Plant Cell, 1997, vol. 9,

p. 627-640.

136. Keen N. Mechanisms of Pest Resistance in Plants. Bethesda, MD: Workshop on

Ecological Effects of Pest Resistance Genes in Managed Ecosystems, 1999.

137. Keller T. et al. A plant homolog of the neutrophil NADPH oxidase gp91phox subunit gene

encodes a plasma membrane protein with Ca2+

binding motifs. In: Plant Cell, 1998, vol. 10, p.

255-266.

138. Kimura S. et al. Protein phosphorylation is a prerequisite for the Ca(2+

)-dependent

activation of Arabidopsis NADPH oxidases and may function as a trigger for the positive

121

feedback regulation of Ca(2+

) and reactive oxygen species. In: Biochim Biophys Acta, 2012, vol.

1823, p. 398-405.

139. Kleff S., Trelease R.N., Eising R. Nucleotide and deduced amino acid sequence of a

putative higher molecular weight precursor for catalase in sunflower cotyledons. In: Biochimica

et Biophysica Acta, 1994, vol. 1224, p. 463-466.

140. Klessig D.F. et al. Nitric oxide and salicylic acid signaling in plant defense. In: Proc Natl

Acad Sci USA, 2000, vol. 97, p. 8849-8855.

141. Koh S. et al. Arabidopsis thaliana subcellular responses to compatible Erysiphe

cichoracearum infections. In: Plant J., 2005, vol. 44, p. 516-529.

142. Kolte S.J. Diseases of annual edible oilseed crops. In: Sunflower, safflower & nigerseed

diseases, CRC Press, Inc., Boca Raton, USA, 1985, vol. 3. 168 p.

143. Kotchoni S., Gachomo E. The reactive oxygen species network pathways: an essential

prerequisite for perception of pathogen attack and the acquired disease resistance in plants. In: J

Biosci, 2006, vol. 31, p. 389-404.

144. Kovtun Y. et al. Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein

kinase cascade in plants. In: Proc Natl Acad Sci USA, 2000, vol. 97, p. 2940-2945.

145. Krause K. et al. DNA-binding proteins of the Whirly family in Arabidopsis thaliana are

targeted to the organelles. In: FEBS Lett, 2005, vol. 579, p. 3707-3712.

146. Kubo A. et al. Cloning and sequencing of a cDNA encoding ascorbate peroxidase from

Arabidopsis thaliana. In: Plant Mol Biol, 1992, vol. 18, p. 691-701.

147. Lam E. Controlled cell death, plant survival and development. In: Nat Rev Mol Cell Biol,

2004, vol. 5, p. 305-315.

148. Lamb C., Dixon R.A. The oxidative burst in plant disease resistance. In: Annu Rev Plant

Phys, 1997, vol. 48, p. 251-275.

149. Levine A. et al. H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease

resistance response. In: Cell, 1994, vol. 79, p. 583-593.

150. Li J., Brader G., Palva E.T. The WRKY70 transcription factor: a node of convergence for

jasmonate-mediated and salicylate-mediated signals in plant defense. In: Plant Cell, 2004, vol.

16, p. 319-331.

151. Limpert E., Müller K. Designation of pathotypes of plant pathogens. In: J. Phytopath.,

1994, vol. 140, p. 346-358.

152. Linthorst H.J.M. Pathogenesis-related proteins of plants. In: CRC Cri Rev Plant Sci, 1991,

vol. 10, p. 123-150.

122

153. Lipka V. et al. Pre- and postinvasion defenses both contribute to nonhost resistance in

Arabidopsis. In: Science, 2005, vol. 310, p. 1180-1183.

154. Liu J.et al. Recent progress in elucidating the structure,function and evolution of disease

resistance genes in plants. In: J Genet Genomics, 2007, vol. 34(9), p. 765-776.

155. Liu Z. et al. Molecular mapping of the Pl16 downy mildew resistance gene from HA-R4 to

facilitate marker-assisted selection in sunflower. In: TAG, 2012, vol. 125, p.121-131.

156. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time

quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. In: Methods, 2001, vol. 25(4), p. 402-

408.

157. Ljubich A., Gulya T.J. Cotyledon-limited systemic downy mildew infection. In:

Proceedings of 1988 Sunflower Research Workshop, Bismarck, USA, National Sunflower

Association, 1988, p. 9.

158. Loh Y.T., Zhou J., Martin G.B. The myristylation motif of Pto is not required for disease

resistance. In: Mol. Plant- Microbe Interact., 1998, vol. 11, p. 572-576.

159. Mackey D. et al. Arabidopsis RIN4 is a target of the type III virulence effector AvrRpt2

and modulates RPS2-mediated resistance. In: Cell, 2003, vol. 112, p. 379-389.

160. Mackey D. et al. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules

and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. In: Cell, 2002, vol. 108, p. 743-

754.

161. Maleck K. and Dietrich R.A. Defense on multiple fronts: how do plants cope with diverse

enemies? In: Trends Plant Sci., 1999, vol. 4, p. 215-219.

162. Maleck K. et al. The transcriptome of Arabidopsis thaliana during systemic acquired

resistance. In: Nat Genet, 2000, vol. 26, p. 403-410.

163. Marino D. et al. A Medicago truncatula NADPH oxidase is involved in symbiotic nodule

functioning. In: New Phytol, 2011, vol. 189, p. 580-592.

164. Martin G.B. et al. Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance

in tomato. In: Science, 1993, vol. 262, p. 1432-1436.

165. Martin G.B. Functional analysis of plant disease resistance genes and their downstream

effectors. In: Curr. Opin. Plant Biol., 1999, vol. 2, p. 273-279.

166. Martin G.B., Bogdanove A.J. and Sessa G. Understanding the functions of plant disease

resistance proteins. In: Annu. Rev. Plant Biol., 2003, vol. 54, p. 23-61.

167. McHale L.K. et al. The genomic architecture of disease resistance in lettuce. In: TAG,

2009, vol. 118, p. 565-580.

123

168. Meyers B.C. et al. Plant disease resistance genes encode members of an ancient and

diverse protein family within the nucleotide-binding superfamily. In: Plant J., 1999, vol. 20, p.

317-332.

169. Mhamdi A., Noctor G., Baker A. Plant catalases: peroxisomal redox guardians. In: Arch

Biochem Biophys., 2012, vol. 525(2), p. 181-194.

170. Michelmore R.W. The impact zone: genomics and breeding for durable disease resistance.

In: Curr. Opin. Plant Biol., 2003, vol. 6, p. 397-404.

171. Michelmore R.W., Meyers B.C. Clusters of resistance genes in plants evolve by divergent

selection and a birth-and-death process. In: Genome Res., 1998, vol. 8, p. 1113-1130.

172. Miller G. et al. The plant NADPH oxidase RBOHD mediates rapid systemic signaling in

response to diverse stimuli. In: Sci Signal, 2009, vol. 2(84), p. ra45.

173. Miller J.F., Hammond J.J., Roath, W.W. Comparison of inbreds vs. single-cross testers and

estimation of genetic effects in sunflower. In: Crop Science, 1980, nr 20, p. 703-706.

174. Mittler R. et al. Reactive oxygen gene network of plants. In: Trends Plant Sci., 2004, vol.

9(10), p. 490-498.

175. Mittler R. et al. ROS signaling: the new wave? In: Trends Plant Sci, 2011, vol. 16, p. 300-

309.

176. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. In: Trends Plant Sci, 2002,

vol. 7, p. 405-410.

177. Molinero-Ruiz M.L., Melero-Vara J.M., Dominguez J. Inheritance of resistance to two

races of sunflower downy mildew (Plasmopara halstedii) in two Helianthus annuus L. lines. In:

Euphytica, 2003, vol. 131, p. 47-51.

178. Møller I.M., Sweetlove L.J. ROS signalling – specificity is required. In: Trends Plant Sci.,

2010, vol. 15(7), p. 370-374.

179. Montesano M., Brader G. and Palva E.T. Pathogen derived elicitors: searching for

receptors in plants. In: Mol. Plant Pathol., 2003, vol. 4, p. 73-79.

180. Montesinos E. Pathogenic plant-microbe interactions. What we know and how we benefit.

In: Int. Microbiol., 2000, vol. 3, p. 69-70.

181. Mou Z., Fan W., Dong X. Inducers of plant systemic acquired resistance regulate NPR1

function through redox changes. In: Cell, 2003, vol. 113, p. 935-944.

182. Mouzeyar S. et al. RFLP and RAPD mapping of the sunflower Pl1 locus for resistance to

Plasmopara halstedii race 1. In: TAG, 1995, vol. 91, p. 733-737.

124

183. Mouzeyar S., Delabrouhe D. T. and Vear F. Histopathological studies of resistance of

sunflower (Helianthus annuus L.) to downy mildew (Plasmopara halstedii). In: J. Phytopath.,

1993, vol. 139, p. 289-297.

184. Mulpuri S. et al. Inheritance and molecular mapping of a downy mildew resistance gene,

Pl13 in cultivated sunflower (Helianthus annuus L.). In: TAG, 2009, vol. 119, p. 795-803.

185. Nandi A. et al. Arabidopsis sfd mutants affect plastidic lipid composition and suppress

dwarfing, cell death, and the enhanced disease resistance phenotypes resulting from the

deficiency of a fatty acid desaturase. In: Plant Cell, 2003, vol. 15, p. 2383-2398.

186. Nandi A. et al. Arabidopsis ssi2-conferred susceptibility to Botrytis cinerea is dependent

on EDS5 and PAD4. In: Mol Plant Microbe Interact, 2005, vol. 18, p. 363-370.

187. Nandi A., Welti R., Shah J. The Arabidopsis thaliana dihydroxyacetone phosphate

reductase gene SUPPRESSSOR OF FATTY ACID DESATURASE DEFICIENCY1 is required

for glycerolipid metabolism and for the activation of systemic acquired resistance. In: Plant Cell,

2004, vol. 16, p. 465-477.

188. Navarro L. et al. DELLAs control plant immune responses by modulating the balance of

jasmonic acid and salicylic acid signaling. In: Curr Biol, 2008, vol. 18, p. 650-655.

189. Nei M., Li W.H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction

endonucleases. In: Proc. Natl. Acad. Sci., 1979, vol. 76, p. 5269–5273.

190. Novotel'nova N.S. Downy mildew of sunflower. In: Nauka, Moscow, Russia, 1966. 150 p.

191. Nühse T.S. et al. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins

reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. In: Plant J, 2007, vol. 51, p.

931-940.

192. O’Brien J. A. et al. Reactive oxygen species and their role in plant defence and cell wall

metabolism. In: Planta, 2012, vol. 236, p. 765-779.

193. O'Brien J.A. et al. A peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in cultured

Arabidopsis cells functions in MAMP-elicited defense. In: Plant Physiol., 2012, vol. 158(4), p.

2013-2027.

194. Ogasawara Y. et al. Synergistic activation of the Arabidopsis NADPH oxidase AtrbohD by

Ca2+ and phosphorylation. In: J Biol Chem, 2008, vol. 283, p. 8885-8892.

195. Oros G. Differential responses of Plasmopara halstedii developmental forms to various

steroid alkaloids. In: Int. J. Life Sci., 2010, vol. 4, p. 1-15.

196. Pan Q., Wendel J., Fluhr R. Divergent evolution of plant NBS-LRR resistance gene

homologues in dicot and cereal genomes. In: J. Mol. Evol., 2000, vol. 50, p. 203-213.

125

197. Panchuk I.I., Volkov R.A., Schoffl F. Heat stress- and heat shock transcription factor-

dependent expression and activity of ascorbate peroxidase in Arabidopsis. In: Plant Physiol,

2002, vol. 129, p. 838-853.

198. Panchuk I.I., Zentgraf U., Volkov R.A. Expression of the Apx gene family during leaf

senescence of Arabidopsis thaliana. In: Planta, 2005, vol. 222(5), p. 926-932.

199. Panero J.L., Funk V.A. Toward a phylogenetic subfamilial classification for the

Compositae (Asteraceae). In: P Biol Soc Wash, 2002, vol. 115, p. 909-922.

200. Paniego N. et al. Microsatellite isolation and characterization in sunflower (Helianthus

annuus L.). In: Genome, 2002, vol. 45(1), p. 34-43.

201. Paniego N. et al. Sunflower. In: Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants.

Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 2007, vol. 2, p. 153-177.

202. Panković T.D. et al. Development of co-dominant amplified polymorphic sequence

markers for resistance of sunflower to downy mildew race 730. In: Plant Breed., 2007, vol. 126,

p. 440-444.

203. Peng M., Kuc J. Peroxidase-generated hydrogen peroxide as a source of antifungal activity

in vitro and on tobacco leaf disks. In: Phytopathology, 1992, vol. 82, p. 696-699.

204. Petersen M. et al. Arabidopsis mapkinase4 negatively regulates systemic acquired

resistance. In: Cell, 2000, vol. 103, p. 1111-1120.

205. Qiu X. et al. Endogenous hydrogen peroxide is a key factor in the yeast extract-induced

activation of biphenyl biosynthesis in cell cultures of Sorbus aucuparia. In: Planta, 2012, vol.

235, p. 217-223.

206. Quresh Z., Jan C.C., Gulya T.J. Resistance of sunflower rust and its inheritance in wild

sunflower species. In: Plant Breed, 1993, vol. 110, p. 297-306.

207. Radwan O. et al. Development of PCR markers for the Pl5/Pl8 locus for resistance to

Plasmopara halstedii in sunflower Helianthus annuus L. from complete CC-NBS-LRR

sequences. In: TAG, 2004, vol. 109, p. 176-185.

208. Radwan O. et al. Genetic diversity and genomic distribution of homologs encoding NBS-

LRR disease resistance proteins in sunflower. In: Mol. Genet. Genomics, 2008, vol. 280, p. 111-

125.

209. Radwan O. et al. Identification of non-TIR-NBS-LRR markers linked to the Pl5/Pl8 locus

for resistance to downy mildew in sunflower. In: TAG, 2003, vol. 106, p. 1438-1446.

210. Radwan O. et al. Resistance of sunflower to the biotrophic oomycete Plasmopara halstedii

is associated with a delayed hypersensitive response within the hypocotyl. In: J. Exp. Botany,

2005, vol. 56, p. 2683-2693.

126

211. Ranieri A. et al. Early production and scavenging of hydrogen peroxide in the apoplast of

sunflower plants exposed to ozone. In: J Exp Bot, 2003, vol. 54, p. 2529-2540.

212. Reumann S. et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel

targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. In: Plant Cell, 2007, vol.

19(10), p. 3170-3193.

213. Roeckel-Drevet P. et al. Colocation of downy mildew (Plasmopara halstedii) resistance

genes in sunflower (Helianthus annuus L.). In: Euphytica, 1996, vol. 91, p. 225-228.

214. Roeckel-Drevet P. et al. Lack of genetic variability in french identified races of

Plasmopara halstedii, the cause of downy mildew in sunflower Helianthus annuus. In: Can. J.

Microbiol., 1997, vol. 43, p. 260-263.

215. Roeckel-Drevet P. et al. Molecular characterization, organ distribution and stress-mediated

induction of two glutathione peroxidase-encoding mRNAs in sunflower (Helianthus annuus). In:

Physiol Plant, 1998, vol. 103, p. 385-394.

216. Roeckel-Drevet P. et al. Molecular variability of sunflower downy mildew, Plasmopara

halstedii, from different continents. In: Can. J. Microbiol., 2003, vol. 49, p. 492-502.

217. Ryals J.A. et al. Systemic acquired resistance. In: Plant Cell, 1996, vol. 8, p. 1809-1819.

218. Sackston W.E. Downy mildew of sunflower. In: The downy mildews (Ed. by Spencer

D.M.), Academic Press, London, UK, 1981, p. 545-575.

219. Santos M. et al. Cytosolic ascorbate peroxidase from Arabidopsis thaliana L. is encoded

by a small multigene family. In: Planta, 1996, vol. 198, p. 64-69.

220. Sarry J.E. et al. The early responses of Arabidopsis thaliana cells to cadmium exposure

explored by protein and metabolite profiling analyses. In: Proteomics, 2006, vol. 6(7), p. 2180-

2198.

221. Scheel D. Resistance response physiology and signal transduction. In: Curr Opin Plant

Biol, 1998, vol. 1, p. 305-310.

222. Schilling E.E. Helianthus. In: Flora of North America Editorial Committee (ed) Flora of

North America North of Mexico. Oxford Univ Press, New York and Oxford, 2006, vol. 21, p.

141-169.

223. Schilling E.E. Phylogeny of Helianthus and related genera. In: Oleagineux Crops Gras,

Lipides 2001, vol. 8, p. 22-25.

224. Schilling E.E., Panero J.L. A revised classification of subtribe Helianthinae (Asteraceae:

Heliantheae). In: I. Basal lineages. Bot J Linn Soc, 2002, vol. 140, p. 65-76.

225. Schneiter A. A. and Miller J. F. Description of Sunflower Growth Stages. In: Crop

Science, 1981, vol. 21, nr. 6, p. 901-903.

127

226. Serre F. et al. Research on a growth chamber test to measure quantitative resistance to

sunflower downy mildew. In: Velasco L. (ed.) Proceedings of the 17th International Sunflower

Conference. Cordoba, Spain, 2008, vol. 1, p. 109-114.

227. Şestacova T. et al. NPR1 expression in sunflower infected with downy mildew. In:

Curr.Opin.Biotech., 2013, Vol. 24, Sup. 1,p. S131–S132.

228. Șestacova T. Particularities of sunflower-downy mildew interaction. Abstract book of

International Plant Breeding Congress. Antalya, Turkey, 2013, p. 288.

229. Shah J. Lipids, lipases, and lipid-modifying enzymes in plant disease resistance. In: Annu

Rev Phytopathol, 2005, vol. 43, p. 229-260.

230. Sharma Y.K., Davis K.R. The effects of ozone on antioxidant responses in plants. In: Free

Radic Biol Med, 1997, vol. 23, p. 480-488.

231. Shirasu K., Schulze-Lefert P. Regulators of cell death in disease resistance. In: Plant Mol

Biol, 2000, vol. 44, p. 371-385.

232. Simon-Plas F., Elmayan T., Blein J-P. The plasma membrane oxidase NtrbohD is

responsible for AOS production in elicited tobacco cells. In: Plant J, 2002, vol. 31, p. 137-148.

233. Slabaugh M.B. et al. Haplotyping and mapping a large cluster of downy mildew resistance

gene candidates in sunflower using multilocus intron fragment length polymorphisms. In: Plant

Biotechnol. J., 2003, vol. 1, p. 167-185.

234. Sluse F.E., Jarmuszkiewicz W. Alternative oxidase in the branched mitochondrial

respiratory network: an overview on structure, function, regulation, and role. In: Braz. J. Med.

Biol. Res., 1998, vol. 31 (6), p. 733-747.

235. Smith M.W., Doolittle R.F. A comparison of evolutionary rates of the two major kinds of

superoxide dismutases. In: J Mol Evol, 1992, vol. 34, p. 175–184.

236. Somssich I.E. Closing another gap in the plant SAR puzzle. In: Cell, 2003, vol. 113, p.

815-816.

237. Song W.Y. et al. A receptor kinase- like protein encoded by the rice disease resistance

gene, Xa21. In: Science, 1995, vol. 270, p. 1804-1806.

238. Spoel S.H. et al. NPR1 modulates cross-talk between salicylate- and jasmonate-dependent

defense pathways through a novel function in the cytosol. In: Plant Cell, 2003, vol. 15, p. 760-

770.

239. Spring O. Non-systemic infections of sunflower with Plasmopara halstedii and their

putative role in the distribution of the pathogen. In: J Plant Dis and Prot, 2001, vol. 108, p. 329-

336.

128

240. Spring O., Benz A. and Faust V. Impact of downy mildew infection on the development

and metabolism of sunflower. In: Zeitung für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, 1991,

vol. 98, p. 597-604.

241. Staswick P.E., Tiryaki I. The oxylipin signal jasmonic acid is activated by an enzyme that

conjugates it to isoleucine in Arabidopsis. In: Plant Cell, 2004, vol. 16, p. 2117-2127.

242. Sticher L., Mauch-Mani B. and Metraux J.P. Systemic acquired resistance. In: Annu. Rev.

Phytopathol., 1997, vol. 35, p. 235-270.

243. Suzuki N. et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. In: Curr Opin

Plant Biol, 2011, vol. 14, p. 691-699.

244. Takahashi H. et al. Antagonistic interactions between the SA and JA signaling pathways in

Arabidopsis modulate expression of defense genes and gene-for-gene resistance to cucumber

mosaic virus. In: Plant Cell Physiol., 2004, vol. 45(6), p. 803-809.

245. Taler D. et al. Plant eR genes that encode photorespiratory enzymes confer resistance

against disease. In: Plant Cell, 2004, vol. 16, p. 172-184.

246. Tan A.S., Jan C.C., Gulya T.J. Inheritance of resistance to race 4 of sunflower downy

mildew in wild sunflower accessions. In: Crop Sci, 1992, vol. 32, p. 949-952.

247. Tang M., Smith C.J. Elicitor induced defence responses in Medicago sativa. In: New

Phytol, 2001, vol. 149, p. 401-418.

248. Tang S. et al. Simple sequence repeat map of the sunflower genome. In: TAG, 2002,

vol.105, p.1124–1136.

249. Tang S., Kishore V.K., Knapp S.J. PCR-multiplexes for a genome-wide framework of

simple sequence repeat marker loci in cultivated sunflower. In: TAG, 2003, vol. 107, p. 6-19.

250. Thomma B.P., Cammue B.P., Thevissen K. Plant defensins. In: Planta, 2002, vol. 216(2),

p. 193-202.

251. Thordal-Christensen H. et al. Subcellular localization of H2O2 in plants. H2O2

accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew

interaction. In: Plant J, 1997, vol. 11, p. 1187-1194.

252. Timme R.E., Simpson B.B., Linder C.R. High-resolution phylogeny for Helianthus

(Asteraceae) using the 18S–26S ribosomal DNA external transcribed spacer. In: Am J Bot 2007,

vol. 94, p. 1837-1852.

253. Torres M. ROS in biotic interactions. In: Physiologia Plantarum, 2010, vol. 138, p. 414-

429.

254. Torres M.A., Dangl J.L. Functions of the respiratory burst oxidase in biotic interactions,

abiotic stress and development. In: Curr Opin Plant Biol, 2005, vol. 8, p. 397-403.

129

255. Torres M.A., Dangl J.L., Jones J.D.G. Arabidopsis gp91phox homologues AtrbohD and

AtrbohF are required for accumulation of reactive oxygen intermediates in the plant defense

response. In: Proc Natl Acad Sci USA, 2002, vol. 99, p. 517-522.

256. Torres M.A., Jones J.D., Dangl J.L. Reactive oxygen species signaling in response to

pathogens. In: Plant Physiol, 2006, vol. 141, p. 373-378.

257. Tourvieille L. D. et al. New nomenclature of races of Plasmopara halstedii (sunflower

downy mildew). In: Proceedings of the 15th International Sunflower Conference. Toulouse,

2000, vol. 2-I, p. 61-65.

258. Tourvieille L. D., Mestries E. and Walser P. Quelles perspectives pour la lutte génétique

vis-a-vis du mildiou du tournesol? In: OCL, 2005, vol. 12(2), p. 85-93.

259. Tourvieille L.D. et al. Nonrace specific resistance to downy mildew (Plasmopara

halstedii) in sunflower (Helianthus annuus). In: Euphytica, 2009, vol. 164, p. 433-444.

260. Uknes S. et al. Acquired resistance in Arabidopsis. In: Plant Cell, 1992, vol. 4, p. 645-656.

261. van der Biezen E.A., Jones J.D.G. Plant disease-resistance proteins and the gene for gene

concept. In: Trends Biochem Sci, 1998, vol. 23, p. 454-456.

262. van der Hoorn R., de Wit P., Joosten M. Balancing selection favors guarding resistance

proteins. In: Trends Plant Sci, 2002, vol. 7, p. 67-71.

263. van der Plank J. E. Disease resistance in plants. Academic Press, 1968. 206 p.

264. van Loon L.C. Pathogenesis-related proteins. In: Plant. Mol. Biol., 1985, vol. 4, p. 111-

116.

265. van Loon L.C., Rep M. and Pieterse C.M. Significance of inducible defense-related

proteins in infected plants. In: Annu. Rev. Phytopathol., 2006, vol. 44, p. 135-162.

266. van Ooijen G. et al. Structure and function of resistance proteins in solanaceous plants. In:

Annu Rev Phytopathol., 2007, vol. 45, p. 43-72.

267. Vanlerberghe G.C., McIntosh L. Alternative oxidase: from gene to function. In: Annu Rev

Plant Physiol Plant Mol Biol, 1997, vol. 48, p. 703-734.

268. Vansuyt G. et al. Iron triggers a rapid induction of ascorbate peroxidase gene expression in

Brassica napus. In: FEBS Lett, 1997, vol. 410, p. 195-200.

269. Vear F. et al. Recent research on downy mildew resistance useful for breeding industrial –

use sunflowers. In: ISA 1st Symposium on Sunflower Industrial Use. Udine, Italy, 2006, p. 1-8.

270. Vear F. et al. The genetics of resistance to five races of downy mildew (Plasmopara

halstedii) in sunflower (Helianthus annuus L.). In: TAG, 1997, vol. 95, p. 584-589.

130

271. Virányi F. and Gulya T. J. Expression of resistance in the Plasmopara halstedii –

sunflower pathosystem. In: ISA Symposium I. Disease Tolerance in Sunflower. Beijing, 1996, p.

14–21.

272. Virányi F. and Oros G. Developmental stage response to fungicides of Plasmopara

halstedii (sunflower downy mildew). In: Mycol. Res., 1991, vol. 95, p. 199-205.

273. Viranyi F. and Spring O. Advances in sunflower downy mildew research. In: Eur. J. Plant

Pathol., 2011, vol. 129, p. 207-220.

274. Virányi F. Factors affecting oospore formation in Plasmopara halstedii. In: Proceedings of

the 12th International Sunflower Conference. Novi Sad, 1988, vol. 2, p. 32-37.

275. Virányi F. Hypersensitive tissue necrosis on Plasmopara-resistant sunflower seedlings. In:

ISA Newsletter, 1980, vol. 4, p. 11-19.

276. Virányi F. Plasmopara halstedii. In: European handbook of plant diseases. Ed. by Smith

I.M et al. Blackwell Sci Pub. Oxford, UK, 1988. p. 228-230.

277. Ward E.R. et al. Coordinate gene activity in response to agents that induce systemic

acquired resistance. In: Plant Cell, 1991, vol. 3, p. 1085-1094.

278. Wieckhorst S. et al. Fine mapping of the sunflower resistance locus PlARG introduced

from the wild species Helianthus argophyllus. In: TAG, 2010, vol. 121, p. 1633-1644.

279. Wiermer M., Feys B.J., Parker J.E. Plant immunity: the EDS1 regulatory node. In: Curr

Opin Plant Biol, 2005, vol. 8, p. 383-389.

280. Willekens H. et al. Catalases in plants. In: Mol Breed, 1995, vol. 1, p. 207-228.

281. Wojtaszek P. Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection. In: Biochem J,

1997, vol. 322, p. 681-692.

282. Yamaguchi K., Mori H., Nishimura M. A novel isoenzyme of ascorbate peroxidase

localized on glyoxysomal and leaf peroxisomal membranes in Pumpkin. In: Plant Cell Physiol,

1995, vol. 36, p. 1157-1162.

283. Yang Y., Qi M., Mei C. Endogenous salicylic acid protects rice plants from oxidative

damage caused by aging as well as biotic and abiotic stress. In: Plant J, 2004, vol. 40, p. 909-

919.

284. Yoshioka H. et al. Nicotiana benthamiana gp91z homologs NbrbohA and NbrbohB

participate in H2O2 accumulation and resistance to Phytophthora infestans. In: Plant Cell, 2003,

vol. 15, p. 706-718.

285. Yu J. et al. Allelic diversity of simple sequence repeat markers among elite inbred lines in

cultivated sunflower. In: Genome, 2002, vol. 45, p.652-660.

131

286. Yu J.K. et al. Towards a saturated molecular genetic linkage map for cultivated sunflower.

In: Crop Sci., 2003, vol. 43, p. 367-387.

287. Yu-Jin Kim et al. Isolation and Characterization of a Type II Peroxiredoxin Gene from

Panax ginseng C. A. Meyer. In: J. Ginseng Res., 2010, vol. 34(4), p. 296-303.

288. Zangerl A.R. Evolution of induced plant responses to herbivores. In: Bas. Appl. Ecol.,

2003, vol. 4, p. 91–103.

289. Zeng L.R. et al. Ubiquitination-mediated protein degradation and modification: an

emerging theme in plant-microbe interactions. In: Cell Res, 2006, vol. 16, p. 413-426.

290. Zhang J., Kirkham M.B. Enzymatic responses of the ascorbate-glutathione cycle to

drought in sorghum and sunflower plants. In: Plant Science, 1996, vol. 113 (2), p. 139-147.

291. Zhang Q. et al. A diallel analysis of heterosis in elite hybrid rice based on RFLPs and

microsatellites. TAG, 1994, vol. 89, p. 185-192.

292. Zhang X. et al. Maize ABP9 enhances tolerance to multiple stresses in transgenic

Arabidopsis by modulating ABA signaling and cellular levels of reactive oxygen species. In:

Plant Mol Biol., 2011, vol. 75(4-5), p. 365-378.

293. Zhou F. et al. Cell-autonomous expression of barley Mla1 confers race-specific resistance

to the powdery mildew fungus via a Rar1–independent signaling pathway. In: Plant Cell, 2001,

vol. 13, p. 337-350.

294. Zimmer D.E., Hoes J.A. Diseases. In: Sunflower science and technology (Ed. by Carter

J.F.), American Society of Agronomy. Madison, USA, 1978, p. 225-262.

295. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/input.htm (vizitat 09.12.2013)

296. http://bioinformatics.psb.ugent.be/software/details/3 (vizitat 01.10.2011)

297. http://statbank.statistica.md/pxweb/Database/EN/16%20AGR/AGR02/AGR02.asp (vizitat

19.08.2013)

298. http://www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/ (vizitat 09.12.2013)

299. http://www.meteo.md/newsait/vara2011.htm (vizitat 09.12.2013)

132

ANEXE

133

Anexa 1. Act de implementare a rezultatelor științifice în instruire

134

Anexa 2. Act de implementare a rezultatelor științifice în ameliorare

135

DECLARAȚIA PRIVIND ASUMAREA RĂSPUNDERII

Subsemnata, declar pe răspundere personală că materialele prezentate în teza de doctorat sunt

rezultatul propriilor cercetări şi realizări ştiinţifice. Conştientizez că, în caz contrar, urmează să

suport consecinţele în conformitate cu legislaţia în vigoare.

Șestacova Tatiana

Semnătura

Data 04.03.2014

136

CURRICULUM VITAE

ŞESTACOVA TATIANA

Date de contact:

str. Titulescu 53, bl. 2, ap. 38,

Chişinău, Republica Moldova, 2032

+37322559221, +37379610435

tatiana.shestacova@gmail.com

Data şi locul naşterii: 03.07.1986, Chişinău, Republica Moldova.

Cetăţenia: MD.

Studii superioare.

2005-2008 – studii de licenţă, Universitatea de Stat din Moldova, Facultatea Biologie şi Pedologie,

specialitatea Biologie. Diploma seria ALII nr. 000008743.

2008-2010 – studii de masterat, Universitatea de Stat din Moldova, Facultatea Biologie şi Pedologie,

specialitatea Genetica Moleculară. Diploma seria AMC nr. 000000487.

2010-2013 – studii de doctorat, IGFPP, specialitatea – /03.00.15 Genetică/ 162.01 – Genetică vegetală.

Stagii: 08.09.2010-01.10.2010 – Stagiu în laboratorul „Ereditate extracromozomială”, Institutul de Genetică şi

Citologie, Academia Naţională de Ştiinţe, Minsk, Republica Belarus.

14 septembrie 2011 – Participarea la Workshop în Bioinformatică din cadrul conferinţei internaţionale

tinerilor cercetători „Molecular Biology: Advances and Perspectives”, Kiev, Ukraina.

15 septembrie 2011 – Participarea la „Improving Diagnoses of Mental Retardation in Children in Central

Eastern Europe and Central Asia through Genetic Characterisation and Bioinformatics/-Statistics

(CHERISH)” Workshop în cadrul conferinţei internaţionale tinerilor cercetători Molecular Biology:

Advances and Perspectives”, Kiev, Ukraina.

24-29 octombrie 2011 – Participarea la Workshop Internaţional din cadrul proiectului „Student Active

Learning In Science (SALIS)”.

17 ianuarie 2012 – Participarea la seminar „Information sources in Biotechnology”, organizat în cadrul

proiectului „Serving Life-science Information for the Next-Generation (SLING)”.

Domeniile de interes ştiinţific:

Biologie şi genetică moleculară, fitopatologie, biologie plantelor, bioinformatica etc.

Activitatea profesională:

10.08.2009 – 31.12.2009 – Universitatea de Stat din Moldova, cercetător ştiinţific stagiar.

august 2009 – decembrie 2011 – UnAȘM, Centrul universitar Biolodie Moleculară, laboratorul

Genomică, cercetător ştiinţific stagiar.

septembrie 2012 – prezent – asistent universitar, UnAȘM.

ianuarie 2012 – prezent – UnAȘM, Centrul Universitar Biologie Moleculară, laboratorul Genomică,

cercetător ştiinţific.

Participări în proiecte ştiinţifice naţionale şi internaţionale.

Proiecte instituţionale:

06.407.026F Cercetarea variabilităţii la unele plante de cultură: aspecte funcţionale şi genetico-

moleculare

11.817.04.19F Aspecte funcţionale şi genetico-moleculare ale genomului la floarea-soarelui (Helianthus

annuus L.)

09.817.04.001A Activitatea funcţională a genomului la plante

Proiecte pentru tineri cercetători:

11.819.09.15A UDaCoT – instrument de colectare a datelor biologice elaborat în cadrul UnAŞM

137

13.819.14.12A Expresia genelor implicate în răspunsul defensiv al florii-soarelui la mana (Plasmopara

halstedii F. Berl et de Toni)”

Proiecte pentru procurarea echipamentului ştiinţific:

11.220.10.05A Investigarea potenţialului de rezistenţă la stresul biotic a diferitor genotipuri de floarea-

soarelui (Helianthus annuus L.)

Proiecte internaţionale:

10.820.04.14/BA Amprentarea genotipurilor de floarea-soarelui şi stabilirea gradului de hibridare a

seminţelor prin utilizarea marcherilor moleculari, bilateral Belorusia

Participări la foruri ştiinţifice (naţionale şi internaţionale):

2011

21 – 22 octombrie, 2010. Congresul IX Naţional cu participare Internaţională a Geneticienilor şi

Amelioratorilor din Republica Moldova. Prezentare orală.

26-28 mai, 2011. 57-lea Simpozion ştiinţific internaţional “Horticultura - Ştiinţă, Calitate, Diversitate şi

Armonie”, organizat de Facultatea de Horticultură din Iaşi. Poster.

21 iunie 2011. Conferinţa ştiinţifică "Genetica si fiziologia rezistentei plantelor" in memoriam

academicianului Anatolie Jacota, Chisinau.

25-27 august, 2011. International Symposium on Broomrape (Orobanche spp.) in Sunflower, UnAŞM,

Chişinău.

14-17 september, 2011. The 4th International Conference for young scientists „Molecular biology:

Advances and Perspectives”, Kiev, Ukraine. Poster.

29-30 septembrie, 2011. Simpozionului Ştiinţific Internaţional „Rezervaţia Codrii – 40 de ani”.

Prezentare orală.

17 noiembrie 2011. Conferinţa ştiinţifică “Structura şi funcţionalitatea sistemelor biologice – diversitate şi

universalitate” in memoriam academicianului Boris Matienco. IGFP, Chişinău.

2012

16-21 aprilie, 2012. 16-ая Международная Пущинская Школы-Конференция Молодых ученых

«Биология – наука ХХI века». Пущино, Россия.

16-19 mai, 2012. Simpozion Ştiinţific Internaţional «Conservarea diversităţii plantelor». Ediţia a II-a,

Chişinău, Republica Moldova.

30 iulie - 3 august, 2012. Всероссийская молодежная конференция «Актуальные проблемы химии и

биологии». Пущино, Россия.

5-9 november 2012, III International Vavilov Conference “N.I. Vavilov’s Ideas in the Modern World”

Sankt-Petersburg, Russia.

2013

16-19 april 2013, IX International scientific conference for students and PhD students “Youth and

Progress of Biology”, Lviv, Ukraine.

21-26 апреля 2013, 17-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых

«Биология – наука ХХI века». Пущино, Россия.

16 - 18 May 2013, ”EUROPEAN BIOTECHNOLOGY CONGRESS”. Bratislava, Slovakia.

24-25 octombrie 2013, al III-lea Simpozion Național “Biotehnologii avansate – realizări și perspective”.

Chișinău, Republica Moldova.

10-14 november 2013, International Plant Breeding Congress. Antalya, Turkey.

Lucrări ştiinţifice şi ştiinţifico-metodice publicate: 1 capitol în carte, 8 articole, 19 teze ale

comunicărilor ştiinţifice.

Cunoaşterea limbilor: limba rusă – limba maternă, limba română – foarte bine, limba engleză –foarte

bine.

Cunoaşterea calculatorului: Microsoft Office, Adobe Photoshop, Internet browsers, e-mail, cunoştinţe

limitate în limbajul de programare C etc.