STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac...

48
UNIVERSITATEA “ALEXANDRU I. CUZA” IAŞI FACULTATEA DE FIZICĂ STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI MEMBRANELOR PE MODELE NATURALE SI ARTIFICIALE, PRIN METODE SPECTRALE Rezumatul tezei de doctorat CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: PROF. UNIV. DR. DANA ORTANSA DOROHOI DOCTORAND, Ion Hurjui 2013

Transcript of STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac...

Page 1: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

UNIVERSITATEA “ALEXANDRU I. CUZA” IAŞI

FACULTATEA DE FIZICĂ

STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI

AI MEMBRANELOR PE MODELE

NATURALE SI ARTIFICIALE, PRIN

METODE SPECTRALE

Rezumatul tezei de doctorat

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC:

PROF. UNIV. DR. DANA ORTANSA DOROHOI

DOCTORAND,

Ion Hurjui

2013

Page 2: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

În atenţia:

.................................................................................................................

Vă facem cunoscut că în data de 5 iulie 2013, ora 11:00, în Amfiteatrul IV 13,

domnul Hurjui Ion va susţine, în şedinţă publică, teza de doctorat cu titlul:

"Studiul unor parametri biofizici ai membranelor pe modele naturale şi

artificiale, prin metode spectrale"

în vederea obţinerii titlului ştiinţific de doctor în domeniul fundamental Ştiinţe

Exacte - Fizică.

Comisia de doctorat are următoarea componenţă:

Preşedinte: Prof. univ. dr. Diana Mardare

Director al Şcolii Doctorale, Facultatea de Fizică Universitatea „Alexandru Ioan Cuza”, Iaşi

Conducător ştiinţific: Prof. univ. dr. Dana Ortansa Dorohoi

Facultatea de Fizică Universitatea „Alexandru Ioan Cuza”, Iaşi

Referenţi: Prof. univ. dr. Simion Aştilean

Universitatea “Babeş- Bolyai ”, Cluj Napoca

Prof. univ. dr. Dorina Creangă

Universitatea „Alexandru Ioan Cuza”, Iaşi Prof. univ. dr. Livia Vicenţa Gheorghieş

Universitatea “Dunărea de Jos”, Galaţi

Vă invităm pe această cale să participaţi la şedinţa publică de susţinere a tezei.

Page 3: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

C U P R I N S U L T E Z E I

CAP. I. Membrane naturale şi artificiale 8

I. 1. Modelul mozaicului fluid 8

Proprietăţi biochimice ale lipidelor membranare 1 4

I. 2. Parametrii biofizici ai membranelor 2 4

CAP. II. Principalele metode de studiu ale parametrilor biofizici ai membranelor 3 2

II. 1.B. 1. Spectrometria electronică de absorbţie şi emisie 3 7

Spectrometria FT-IR şi Raman 5 3

CAP. III. Influenţa temperaturii, concentraţiei şi a câmpurilor electromagnetice asupra

gradului de ordonare al structurilor de tip membranar

6 5

III. 1. Influenţa temperaturii asupra unor structuri de tip membranar 6 5

III. 2 Studiul tranziţiilor de fază termotropice în cristale lichide 7 6

III. 3 Studiul influenţei câmpurilor electromagnetice de înaltă frecvenţă şi microunde asupra

bistraturilor de DPPC, prin metode de simulare structurală

8 1

CAP. IV. 1,6-difenil-1,3,5,-hexatriena (dph) - marker fluorescent utilizat în evaluarea

fluidităţii structurilor de tip membranar

1 0 9

IV. 2. Influenţa solventului asupra spectrelor electronice de absorbţie şi emisie ale DPH 1 2 7

IV.3. Evaluarea HyperChem a DPH 1 3 5

IV.4. Efectul solvenţilor asupra SEA ale DPH 1 3 8

Spectre electronice de fluorescenţă ale DPH în soluţii 1 4 5

IV. 5. Caracteristici remarcabile ale spectrelor electronice ale DPH în funcţie de natura

solventului

1 4 9

CAP.V. Interacţiunea probelor fluorescente (DPH) cu membranele fosfolipidice nesaturate -

studiu de dinamică moleculară

1 6 2

CAP. VI. Contribuţii la optimizarea reacţiilor de obţinere a unor compuşi cu acţiune

tuberculostatică (derivaţi ai tiosemicarbazidei) sau antitumorală (derivaţi ai L-glutaminei)

1 7 8

VI. A.1. Reacţia de obţinere a derivaţilor 1-acil- 4-aril-tiosemicarbazidei (II-VII) 1 8 1

VI. A.2. Caracterizarea spectrală a disubstituienţilor tiosemicarbazidici 1 8 1

VI. A.3. Rezultate obţinute în urma procesului de optimizare 1 8 4

VI. A.4. Testarea activitaţii tuberculostatice 1 8 4

VI. B.1. Reacţia de obţinere a derivaţilor (I-IV) ai N-[p-(R)-benzoil]-L-glutaminei 1 8 7

VI. B.2. Caracterizarea spectrală a derivaţilor glutaminei 1 8 9

VI. B.3. Rezultate obţinute în urma procesului de optimizare 1 9 0

VI. B.4. Testarea activităţii derivaţilor L-glutaminei asupra enzimelor digestive 1 9 7

CAP. VII. Concluzii finale 2 0 2

ANEXA

Page 4: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

1

Introducere

Tema tezei de doctorat: „Studiul unor parametri biofizici ai membranelor pe modele

naturale şi artificiale, prin metode spectrale” a fost aleasă datorită importanţei deosebite pe

care o prezintă cunoaşterea proprietăţilor fizico-chimice ale structurilor de tip membranar în

organizarea şi funcţionarea acestora.

Teza este structurată pe şase capitole, în care sunt prezentate noţiuni teoretice şi

contribuţiile proprii ce constau în rezultatele obţinute experimental şi teoretic.

Primul capitol intitulat „Membrane naturale şi artificiale” prezintă argumentele structurale şi

funcţionale ce susţin modelul mozaicului fluid al membranei, utilizat şi în prezent.

În cel de-al doilea capitol numit „Principalele metode de studiu ale parametrilor biofizici ai

membranelor” sunt prezentate succint metodele de studiu ale ordonării moleculelor

constituente ale membranelor si cele de evaluare a dinamicii lor, insistând asupra principiilor

metodelor spectrale (spectrometria în IR cu transformată Fourier, spectrometrie UV-vis de

absorbţie şi emisie) utilizate în obţinerea datelor experimentale conţinute în teză.

Capitolul al treilea „Influenţa temperaturii, concentraţiei şi a câmpurilor

electromagnetice asupra gradului de ordonare al structurilor de tip membranar” este la

rândul său, structurat în trei subcapitole: primul este axat pe utilizarea spectrometriei FTIR

pentru atribuirea centrilor activi din structura poliamidei 6 anionice (Nylon 6) în vederea

utilizării acestui polimer ca substrat pentru substanţe cu proprietăţi biocidale. S-a urmărit

efectul temperaturii asupra benzilor de absorbţie ale grupărilor amidice. Modificările spectrale

apărute au fost corelate cu morfologia de suprafaţă a polimerului, determinată folosind SEM.

Scopul studiului din cel de-al doilea subcapitol este evidenţierea influenţei temperaturii asupra

echilibrului între fazele de ordine şi dezordine ale esterulului poli-(fenil-metacrilic) al acidului

cetiloxibenzoic (PPMAECOBA) în tetraclorometan (TCM) prin tehnica FTIR. Au fost

determinate coordonatele tranziţiei principale de fază ale cristalului lichid liotropic. În cel de-

al treilea studiu am reconstruit, prin metode de simulare, modul de organizare al structurii

multilamelare a dipalmitoilfosfatidilcolinei (DPPC) în scopul stabilirii influenţei unor factori

interni şi externi (concentraţiile constituenţilor în soluţie, ionii tampon, temperatura,

câmpurile electromagnetice) asupra acesteia.

Scopul celui de-al patrulea capitol „1,6-difenil-1,3,5,-hexatriena (DPH) - marker

fluorescent utilizat în evaluarea fluidităţii structurilor de tip membranar” este de a analiza

interacţiunile intermoleculare ale DPH cu un număr mare de solvenţi pe baza spectrelor

electronice de absorbţie şi emisie ale soluţiilor ternare de tip DPH + THF + solvent, pentru a

obţine informaţii cu privire la comportamentul acestui marker fluorescent, utilizat ca senzor în

evaluarea fluidităţii membranelor. Datele spectrale au fost corelate cu proprietăţile structurale

şi electro-optice rezultate din calculele de mecanică cuantică. Sunt prezentate rezultatele

simularii dinamicii moleculare ale amestecului DPH+THF în apă şi etanol, pentru obţinere de

informaţii privind structurarea unui solvent în jurul moleculei de DPH, în prezenţa de THF.

Capitolul V intitulat „Interacţiunea probelor fluorescente (DPH) cu membranele

fosfolipidice” are drept obiectiv aducerea de noi date privind localizarea şi orientarea

preferenţială a moleculei de DPH în bistratul puternic nesaturat format din DOPC, utilizând

simulări de dinamică moleculară (MD).

Scopului studiului prezentat în capitolul VI a fost optimizarea reacţiilor şi stabilirea

randamentului maxim (folosind un experiment de tip 32 factorial) pentru reacţiile de obţinere

a unor tiosemicarbazide şi derivaţi glutaminici - noi compuşi cu acţiune farmacologică.

Lucrarea se încheie prin sublinierea contribuţiilor proprii şi a celor mai importante

concluzii la care am ajuns ca urmare a studiilor experimentale şi teoretice efectuate. În anexa

este prezentată activitatea ştiinţifică: 6 articole publicate în reviste ştiinţifice cotate ISI, o

lucrare acceptată spre publicare, o lucrare aflată într-un avansat proces de analiză, 2 lucrări în

reviste cotate B+ şi alte 2 în reviste recunoscute CNCSIS, de categorie C şi D.

Page 5: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

2

CAP. I. MEMBRANE NATURALE ŞI ARTIFICIALE

I. 1. MODELUL MOZAICULUI FLUID

Modelul de organizare a moleculelor membranare elaborat de Singer şi Nicholson în

1972 şi denumit modelul mozaicului fluid a devenit în prezent acceptat de întreaga comunitate

ştiinţifică deoarece [1]:

- Există numeroase date experimentale structurale şi funcţionale care susţin ipoteza

celor doi cercetători.

- Modelul permite explicarea majorităţii funcţiilor membranare şi imaginarea unor

noi tipuri de interacţiuni între molecule.

După cum este deja bine cunoscut, imaginea actuală a membranei celulare este cea a

unui bistrat fosfolipidic, între care se găsesc şi molecule de colesterol, iar din loc în loc sunt

inserate proteine. Proteinele pot fi integrale sau periferice şi pot avea diferite funcţii: enzime,

transportori, canale, pompe, receptori, etc [2]. Moleculele sunt libere să prezinte mişcări în

planul membranei (deci membrana are un caracter fluid) datorită faptului că între componente

se stabilesc forţe de interacţiune fizice (atracţii/respingeri electrostatice, forţe de tip Van der

Waals, interacţiuni hidrofobe) şi nu apar legături chimice puternice (ex.: legături covalente).

În continuare sunt prezentate tehnicile structurale şi funcţionale ce au permis acumularea de

dovezi în sprijinul modelului mozaicului fluid.

I. 1. A. PROPRIETĂŢI BIOCHIMICE ALE LIPIDELOR MEMBRANARE

Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli.

Ele reprezintă aproximativ 50% din componenţii membranari, restul fiind reprezentat de

proteine. Există o serie de membrane mai active metabolic (ex.: membrana mitocondrială

internă) care au un conţinut mai mare de proteine (peste 70%), în timp ce unele membrane

specializate (ex.: mielina, cu rol izolator faţa de trecerea impulsului nervos) sunt formate

predominant din lipide (peste 75%). În cadrul unui anumit tip de membrană, proporţia

cantitativă fosfolipide : colesterol : glicolipide este 75 : 25 : 5. De remarcat este distribuţia

asimetrică a diferitelor tipuri de lipide între cele două monostraturi ale membranei. Datorită

celor două regiuni care apar în aceste molecule – capul polar şi regiunea hidrofobă a lanţurilor

de acizi graşi – fosfolipidele au proprietatea de a se autoorganiza în prezenţa apei: capetele

polare se vor dispune la exterior, în contact cu moleculele de apă, iar zonele hidrofobe vor

veni în contact unele cu altele, realizând clasica distribuţie în bistrat [3]. Aceste proprietăţi

stau la baza obţinerii membranelor artificiale (lipozomi, straturi bilipidice plane).

I. 1. B. PROPRIETĂŢI BIOFIZICE ALE LIPIDELOR MEMBRANARE

Acestea sunt determinate de caracterul amfifil al fosfolipidelor care face ca partile polare să

rămână în contact cu apa intra- şi extracelulară, iar lanţurile hidrocarbonate să se plaseze spre

interior, departe de interacţiunile nefavorabile energetic cu moleculele de apă.

Caracteristicile interfeţei lipide-apă stau la originea proprietăţilor funcţionale numite

“de contact” ale membranelor (activarea enzimelor, fenomene de recunoaştere etc.). De

cealaltă parte, regiunile hidrocarbonate nepolare contribuie la proprietăţile de suport şi de

barieră, dar şi de “fluiditate”, care contribuie la reglarea funcţiilor membranelor. Structura şi

caracteristicile interfeţei depind de ionizarea grupărilor polare şi de starea lor de hidratare.

Tranziţii de fază în sisteme de fosfolipide: sistemele de fosfolipide îşi pot modifica

starea de organizare prin variaţia temperaturii. Astfel, fosfolipidele anhidre realizează un

fenomen de topire, trecând dintr-o stare de gel în care moleculele sunt foarte puţin mobile şi

dispuse ordonat, într-o stare de cristal lichid, caracterizat printr-o mobilitate mare şi o aranjare

dezordonată a moleculelor. Această proprietate este denumită mezomorfism termotropic.

Datorită faptului că principalul mod de organizare al fosfolipidelor la nivelul membranelor

biologice este faza lamelară, cea mai studiată tranziţie de fază este în prezent trecerea din

faza de gel în faza de cristal lichid. Ea a primit denumirea de tranziţie principală de fază şi a

fost studiată atât din punct de vedere experimental, cât şi teoretic, mai ales pe sisteme model

Page 6: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

3

de fosfolipide. Alegerea unui sistem model format dintr-un singur tip de fosfolipid sau din cel

mult 2-3 componente este absolut necesară pentru a înţelege fenomenele care au loc în

decursul tranziţiei principale de fază, deoarece membranele biologice sunt sisteme mult prea

complexe, alcătuite din numeroase tipuri de fosfolipide şi proteine. În cazul membranelor

model (lipozomi multilamelari) alcătuite dintr-un singur tip de fosfolipid, s-a constatat

experimental că tranziţia are loc într-un interval extrem de îngust de temperatură.

Pentru diferite tipuri de fosfatidilcoline, studiile calorimetrice au arătat că temperatura

la care are loc tranziţia de fază este cu atât mai mare cu cât lungimea lanţului de acizi graşi

saturaţi este mai mare [4, 5]. Explicaţia acestui fenomen ar consta în faptul că faza de gel

implică o orientare ordonată a lanţului de acizi graşi la temperatură scăzută, deoarece

mişcarea de agitaţie termică este foarte redusă. În acest caz, lanţurile sunt dispuse în aşa

numita conformaţie all-trans. Creşterea temperaturii duce la creşterea mişcării de agitaţie

termică. Astfel, creşte posibilitatea apariţiei unor rotaţii gauche ale atomilor de carbon

implicaţi într-o legătură simplă; aceste rotaţii gauche necesită o energie de aprox. 0,5

kcal/mol. Rezultă în acest mod o dispunere dezordonată a lanţurilor de acizi graşi, care

caracterizează starea de cristal lichid [4].

Tehnicile de măsurare a anizotropiei fluorescenţei permite de asemenea evaluarea

stării de gel şi a stării de cristal lichid prin calcularea unui parametru de anizotropie

II IIr (I I ) /(I 2I ) , a cărui valoare scade cu creşterea temperaturii.

I. 2. PARAMETRII BIOFIZICI AI MEMBRANELOR

I. 2.1.A. DINAMICĂ ŞI ORDINE MOLECULARĂ LA NIVELUL BIOMEMBRANELOR

Starea de cristal lichid arată faptul că, în membrane, moleculele sunt poziţionate într-

o manieră relativ ordonată, asemănător cu dispunerea atomilor într-un cristal. Ordinea este

menţinută de interacţiunile dintre constituenţi (hidrofile şi hidrofobe) şi de interacţiunile cu

moleculele din mediu (predominant hidrofile). Ele au posibilitatea de a realiza mişcări, ce pot

fi grupate în două mari categorii: mişcări intramoleculare si mişcări de deplasare [2, 6].

Toate aceste mişcări ale componentelor membranare sunt posibile deoarece la baza

organizării lor stau forţe de interacţiune de natură fizică: legături Van der Waals, interacţiuni

hidrofobe, electrostatice, legături de hidrogen şi nu legături chimice puternice (covalente).

Ca urmare a mişcărilor descrise, membrana capătă caractere specifice stării lichide.

I. 2. 1. B. CONCEPTELE BIOFIZICE DE ORDINE, FLUIDITATE, MICROVISCOZITATE

Mişcările componentelor intramembranare pot fi evaluate folosind o serie de tehnici

fizice-biofizice care permit măsurarea mai multor parametri. Astfel, se pot defini: un

parametru de ordine S - un parametru statistic descriptiv, care se exprimă sub forma unui

raport între organizarea spaţială teoretică maximă şi organizarea reală a unui sistem. Pentru o

moleculă de lipid, se poate considera un segment al lanţului hidrocarbonat încadrat într-un

sistem de coordonate tridimensional. Unghiul dintre aceste axe locale (1, 2, 3) şi axa de

referinţă din laborator, 0z (considerată normală la suprafaţa bistratului) este notat cu . Se

poate defini un parametru de ordine S [7, 8]:

132

1 2 iS cos , i = 1, 2, 3

Fig. 13 Tipuri de mişcări

posibile ale constituenţilor

membranari

Page 7: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

4

În acest caz, termenul i23cos reprezintă media în timp a fluctuaţiilor de direcţie ale

coordonatei i. Parametrul de ordine poate fi determinat prin: spectrometrie RMN, RES [9],

depolarizarea în timp a fluorescenţei [10], metode de simulare a dinamicii moleculare [11].

Fluiditatea reprezină o proprietate globală a membranelor celulare, care este

consecinţa legăturilor slabe dintre moleculele componente ale membranei (interacţiuni

hidrofile-hidrofobe) ce permit mişcări permanente ale moleculelor, în condiţiile în care se

păstrează o ordonare a acestora (ordine în două dimensiuni ce determină starea de cristal

lichid a membranei). Inversul fluidităţii se numeşte microvâscozitate a biomembranelor,

având în mod normal valoarea de circa 10-3

Ns/m2, adică de circa 100 de ori mai mare decât a

apei, care este de 0,1Ns/m2 (0,1 Ns/m

2 = 1 poise) [6, 12].

I. 2. 2. PARAMETRI CARE INFLUENŢEAZĂ FLUIDITATEA MEMBRANARĂ.

Factorii fizici ce influentează fluiditatea membranară sunt: temperatura, stresul osmotic si

potenţialul transmembranar. Pricipalii factori chimici care influenţează fluiditatea

membranară sunt: gradul de nesaturare şi lungimea lanţurilor hidrocarbonate [2, 6], raportul

colesterol/ fosfolipide [2, 6]; raportul sfingomielină/ fosfatidilcolina (SM/PC) [6, 13, 14];

raportul proteine/ lipide [3, 15-18].

CAP. II. PRINCIPALELE METODE DE STUDIU ALE PARAMETRILOR

BIOFIZICI AI MEMBRANELOR

Gruparea metodelor de studiu a biomembranelor trebuie făcută plecând de la modelul

acceptat în prezent cu privire la organizarea tridimensională a acestor structuri – modelul

mozaicului fluid [2]. Acesta presupune pe de o parte o anumită ordonare a moleculelor

componente ale unei membrane (ex.: dispunerea fosfolipidelor în dublu strat), dar fără ca

această dipunere să fie strict rigidă, fiind permise diferite mişcări, deci o anumită dinamică a

componentelor. Pentru punerea lor în evidenţă sunt necesare tehnici care se bazează pe

fenomene fizice care se produc pe aceeaşi scală de timp (ps-s) sau de distanţă (Å-m) cu

mişcările moleculelor.

Metode spectrale de evaluare a dinamicii moleculelor membranare

Spectrometria electronică de absorbţie (SEA). La absorbţia radiaţiei electromagnetice de

către molecule, aceasta interacţionează prin componenta sa electrică. Pentru ca radiaţia să

poată fi absorbită, ea trebuie să aibă energia egală cu diferenţa între două niveluri energetice

ale moleculei şi în plus, tranziţia moleculară trebuie să fie însoţită de o modificare a poziţiei

momentului de dipol. O teorie clasică a influenţei mediului asupra frecvenţei tranziţiilor

electronice ce se datorează interacţiunilor dipolare între molecula solvită şi moleculele

solventului a fost elaborată de către N. G. Bakhshiev [19, 20]. Această teorie ţine cont de

modificările caracteristicilor electrice ale moleculelor unei substanţe la trecerea ei din starea

gazoasă în starea lichidă şi consideră că momentele dipolare permanente ale moleculei în

starea fundamentală şi starea excitată nu sunt paralele. Se consideră că în soluţii, interacţiunile

intermoleculare pot fi clasificate în interacţiuni de orientare, interacţiuni de inducţie,

interacţiuni dinamice şi interacţiuni de dispersie. Energiile corespunzătoare sunt exprimate

prin intermediul momentului dipolar al moleculei în starea respectivă şi prin intensitatea

câmpului local determinat de prezenţa moleculelor solventului. În subcapitolul IV.2 este

extinsă teoria privind influenţa solventului asupra spectrelor electronice de absorbţie.

Spectrometria electronică de fluorescenţa (SEF) se bazeaza pe fenomenul prin care

anumite molecule emit radiaţii cu o lungime de undă mai mare decât cea absorbită. Pentru ca

o moleculă să absoarbă o radiaţie electromagnetică, este necesar ca această radiaţie să aibă o

anumită energie (sau lungime de undă), iar momentul dipolar al moleculei să fie paralel cu

vectorul electric al câmpului electromagnetic.

Page 8: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

5

Pentru determinări de polarizare şi anizotropie a fluorescenţei este necesară lumina vertical

polarizata (vectorul electric este paralel cu axa 0z) pentru excitare şi măsurarea intensităţii

fluorescenţei emise cu un polarizor orientat paralel şi apoi perpendicular pe primul [21].

Anizotropia unei surse de lumină este definită ca raportul dintre intensitatea componentei

polarizate şi intensitatea totală. Dacă lumina este polarizată după direcţia 0z, ea este simetrică

după 0x şi 0y, deci Ix = Iy. Excitarea unui fluorofor cu lumină polarizată este de asemenea

polarizată, ca urmare a fenomenului de fotoselecţie a moleculelor orientate paralel cu direcţia

de polarizare a luminii incidente. Lumina emisă poate fi depolarizată printr-o serie de

fenomene, dintre care unul din cele mai importante se datorează difuziunii rotaţionale a

fluoroforului. Măsurătorile de polarizare sau de anizotropie estimează unghiul cu care se

roteşte molecula pe durata timpului de viaţă al stării excitate. Mişcările efectuate de fluorofor

depind de vâscozitatea solventului, de dimensiunile şi forma moleculei fluorescente. În

consecinţă, modificările vâscozităţii determină modificări ale anizotropiei fluorescenţei.

Aceste proprietăţi ale fluoroforilor sunt aplicate în cadrul tehnicilor de determinare a

microvâscozităţii (sau inversul ei – fluidităţii) membranelor celulare.

Spectrometria în infraroșu cu transformată Fourier (FT-IR) Energia totală a unei molecule constă din contribuţiile energiilor de vibraţie, rotaţie,

spin electronic şi electromagnetic. Ea este aproximată ca sumă a acestor contribuţii, orice

interacţiune fiind considerată ca o perturbare. Separarea mişcării electronice de cea nucleară

este cunoscută sub denumirea de aproximaţia Born-Oppenheimer şi depinde de diferenţa de

masă dintre electroni şi nuclee. Deoarece primii sunt mult mai uşori, ei au viteze relativ mari,

de aceea se presupune că nucleele au poziţii fixe. Oscilaţii nucleare mici (comparativ cu

distanţa interatomică) au loc într-o distribuţie medie a electronilor. Variaţia energiei acestor

vibraţii nucleare, în urma interacţiunii cu radiaţia la frecvenţe corespunzătoare, este originea

spectrelor de vibraţie [22]. O radiaţie care trece printr-un material este absorbită numai dacă

frecvenţele acesteia corespund cu modurile normale de vibraţie (tranziţii permise în infraroşu)

[23]. Absorbţia radiaţiilor este determinată de apariţia sau variaţia momentului dipolar al

moleculei în timpul tranziţiei dintre nivelurile energetice. Moleculele heteronucleare îşi

modifică momentul de dipol, în timp ce moleculele homonucleare (exemplu: O2) sunt inactive

în spectroscopia IR, datorită simetriei moleculare. Există însă posibilitatea investigării

moleculelor homonucleare prin dispersie Raman a radiaţiilor IR, aceasta măsurând variaţia de

polarizabilitate moleculară [24, 25]. Nivelurile de energie de vibraţie pot fi calculate utilizând

analiza coordonatelor normale, cu ajutorul căreia s-au stabilit factorii ce influenţează

spectrele, şi anume: tăria legăturii, masa atomică, geometria şi interacţiunea cu legăturile

chimice învecinate.

Modurile normale de vibraţie şi analiza coordonatelor normale

Într-o moleculă, poziţiile relative ale atomilor variază în permanenţă, existând un

număr mare de moduri de vibraţie si de rotaţie în jurul legăturilor din moleculă. Pot exista

foarte multe moduri de vibraţie chiar pentru molecule simple, dar ele pot fi reduse - prin

însumare (sau diferenţă) - la un număr mai mic şi vor fi denumite moduri normale de vibraţie

ale anumitor atomi. Numărul de moduri normale de vibraţie ale unei molecule depinde de

numărul de atomi pe care-l conţine şi, deci, de gradele de libertate [26, 27]. Vibraţiile

fundamentale se împart în: vibraţii de valenţă sau de alungire (se modifică distanţa

interatomică în direcţia legăturii) şi vibraţii de deformare unghiulară (se modifică unghiul

de legătură). Există patru tipuri de astfel de vibraţii, şi anume: de forfecare, de rotaţie, de

balansare (oscilaţie, intercalată), de torsiune.

Spectrometria de reflexie totală atenuată cu transformată Fourier (FTIR-ATR) este una

dintre cele mai puternice metode utilizate pentru înregistrarea de spectre în infraroşu ale

membranelor biologice [28]. Această metodă permite obţinerea de informaţii asupra orientării

diferitelor părţi ale moleculelor. Structura secundară a majorităţii proteinelor poate fi

Page 9: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

6

clarificată prin spectrometria în infraroşu [22]. Conformaţia moleculelor poate fi studiată în

funcţie de temperatură, presiune şi pH, precum şi în prezenţa unor liganzi specifici. O

posibilitate a studiului IR în cazul membranelor artificiale este acela referitor la tranziţiile de

fază şi modificările de conformaţie ale bistratului lipidic. Banda de absorbţie pentru alungirea

simetrică a grupării CH2 care se găseşte în jurul valorii de 2850 cm-1

poate fi o probă a valorii

gradului de ordine sau dezordine, cu creşterea acestei valori odată cu creşterea dezordinii. Se

poate monitoriza modul în care mediul şi compoziţia membranei influenţează proprietăţile

bistratului (influenţa lipidelor nesaturate, proporţia de colesterol, pH-ul, cationii sau

temperatura). Absorbţia ce apare în cazul legăturii C=O (vibraţii de întindere) ne oferă

informaţii despre gradul de hidratare al membranei (implicare în realizarea de legături de H).

Studiile pentru mixuri de lipide pot oferi informaţii despre tranziţiile de fază

(organizarea în domenii membranare) şi comportamentul termotropic al fiecărei faze. Lipidele

predeuterate sunt preferate pentru astfel de studii, ceea ce duce la scăderea numărului de undă

a grupării CH2 cu aproximativ 800 cm-1

de la banda normală (2950-2850 cm-1

) ajungând la

2000-2200 cm-1

[29].

CAP. III. INFLUENŢA TEMPERATURII ŞI CONCENTRAŢIEI ASUPRA GRADULUI DE

ORDONARE AL STRUCTURILOR DE TIP MEMBRANAR

Datorită structurii primare (legăturile polipeptidice formate de AA) şi modalităţilor de

organizare conformaţională (spaţială) caracteristice proteinelor, acestea pot fi considerate

polimeri naturali. Între forma nativă (activă biologic) si forma denaturată a proteinelor există

diferenţe majore (modificări ale structurilor secundare, terţiare şi cuaternare). Pentru unele

proteine nedenaturate banda corespunzătoare amidei I este simetrică şi are un maxim în

apropiere de 1650 cm-1

(corespunzător structurii helix). În cazul, proteinelor denaturate

aceasta prezintă deplasări spre intervalul 1620-1640 cm-1

, datorită creşterii ponderii

structurilor -pliat şi în apropiere de 1680 cm-1

, corespunzând structurii dezordonate.

Spectroscopia FT-IR oferă o cale foarte bună spre caracterizarea structurală şi morfologică a

filmelor poliamidice. Scopul studiului s-a axat pe utilizarea tehnicii de spectrometrie FTIR

pentru atribuirea centrilor activi din structura poliamidei 6 anionice (Nylon 6) folosită ca

substrat pentru materiale cu proprietăţi biocidale.

Materiale şi metode

Poliamida 6 a fost preparată folosind deschiderea prin polimerizare a inelului anionic

al -caprolactam conform datelor din literatură. Filmele de polimeri au fost obţinute prin

tratare cu soluţie de acid formic poliamidic (10%). Compuşii cu greutate moleculară mică au

fost indepărtaţi prin extracţie Soxhlet. Spectrele IR (FTIR) au fost inregistrate cu un

spectrometru Jasco FT/IR-670 utilizând intervalul de 400-4000 cm-1

, o rezoluţie de 4 cm-1

şi

o co-adiţie de 100 scanări. Influenţa temperaturii asupra benzii de absorbţie amidice A (3294-

3305 cm-1

), amidice I (1645-1650 cm-1

) şi amidice II (1536-1547 cm-1

), a fost urmărită cu

ajutorul Fourier Self Decumvolution folosind Jasco Spectra Manager Software (Jasco Corp)

[30] în intervalul 20-180 C. Morfologia de suprafaţă a filmelor poliamidice 6 a fost

determinată folosind SEM ( TESLA BS 300). Imaginile SEM au fost marite de 1500-3000 ori

folosind o diferenţă de potenţial de 6kV. Filmul polimeric a fost fixat pe un suport metalic cu

grafit coloidal şi acoperit cu două straturi de Ag prin vaporizare catodică la o diferenţă de

potenţial de 1.4 kV.

Rezultate şi discuţii

Polimerizarea anionică a fost aleasă deoarece este un proces mai rapid ajungând la o

conversie de echilibru în doar câteva minute, comparativ cu polimerizarea hidrolitică clasică.

Page 10: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

7

Fig. 1 a,b Spectre FTIR caracteristice ale poliamidei 6 [31]

Elementul structural esenţial al poliamidei 6, grupul amidic secundar (CO-NH) este o unitate

vibraţională complexă în intervalul IR şi implică vibraţii de întindere şi deformare. Pentru a

studia influenţa diferiţilor factori asupra structurii poliamidei 6 este foarte importantă

identificarea benzilor de absorbţie caracteristice. Între grupările amidice scundare (NHCO) se

formează legături puternice de hidrogen în poliamida 6. A fost identificată o relaţie directă

între aranjarea legăturilor de hidrogen şi modurile vibraţionale respective atribuite în IR

comparativ cu spectre ale Nylon 6 date în literatură [32-34]. Poliamida 6 posedă trei benzi

intense de absorbţie în IR la aproximativ 3294 cm-1

(amida A, vibraţia de întindere NH = N-

H), 1645 cm-1

(amida I, =C=O) şi 1545 cm-1

(amida II, deformaţia =N-H) (Figura 1 a,b), care

pot fi influenţate de interacţiunea legăturilor de hidrogen. Ultimele două benzi amidice rezultă

din cuplarea electronică a modurilor C=O şi C=N, cuplarea mecanică a C=N în plan şi a

modului δNH. Aceasta înseamnă că la frecvenţa cea mai joasă a amidei I, apare cea mai

puternică legătură de hidrogen ce implică banda amidică C=O şi cea mai mică densitate

electronică de-a lungul C=O. Pe de altă parte maximul benzii amidice II se deplasează spre

frecvenţe mari când hidrogenul se leagă puternic. De asemenea cele trei forme cristaline

predominante ale poliamidei 6, pot fi distinse la temperatura camerei, prin analiza spectrelor

lor în IR. Câteva benzi caracteristice asociate cu formele mezomorfe [35], -cristaline şi γ-

cristaline, ale filmelor polimerice sunt înregistrate în Tabelul I.

Tabel I Atribuirea benzilor în poliamida 6 [31]

Numere de

undă

(cm-1

)

Forma Atribuire

Numere de

undă

(cm-1

)

Forma Atribuire

1170 mezomorfă (m) CH2 -răsucire 1645 - Cristalină Amida I

1199 - Cristalină CH2 2864 - Cristalină CH2 întindere

sim.

1264 , - Cristalină CH2 -forfecare 2934 - Cristalină CH2 întindere

asim.

1462 - Cristalină CH2 - forfecare 3071 - Cristalină Asoc. N - H

1476 - Cristalină CH2 - forfecare 3294 - Cristalină N – H

întindere

1545 , - Cristalină Amida II 3303 - Cristalină N – H

întindere

Page 11: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

8

Fig. 2.a (stanga) Deplasări spectrale ale maximelor de absorbţie ale poly(ε-caprolactam) în timpul procesului de

încălzire. Deplasările ale structurii -crys corespund mişcărilor de forfecare ale grupării CH2 [31].

Fig. 2.b (dreapta) Spectrul FTIR al Poliamidei în funcţie de temperatură. O intensă bandă de absorbţie apare la

170 şi 180 °C.

Banda corespunzătoare legăturii de hidrogen N-H cu vibraţia de întindere la 3307 cm-1

în faza

γ a poliamidei, este mai slabă decât cea asociată fazei deoarece legătura de hidrogen N-H

este modificată. Alte benzi atribuite grupurilor amidice şi secvenţelor etilenice au fost după

cum urmează: 3083 cm-1

(întinderea NH), 2934 şi 2868 cm-1

(întindere CH2 asimetrică şi

simetrică), 1305 cm-1

(balansarea CH2), 1265 cm-1

(îndoire N-H şi întindere CN), 1170 cm-1

(mişcarea vibraţională a scheletului CO-NH). Benzile 929 şi 1201 cm-1

au fost atribuite fazei

-cristaline, în timp ce banda 973 cm-1

a fost atribuită fazei γ-cristaline. Este cunoscut că sub

influenţa căldurii majoritatea compuşilor de nailon prezintă o tranziţie cristal-cristal. Spectrul

IR luat ca funcţie de temperatură pentru poliamida 6 în regiunea frecvenţelor 1433-1504 cm-1

şi 777-805 cm-1

sunt reprezentate în Figura 2-a,b. În urma tratamentului termic a apărut o

nouă bandă la 795 cm-1

iar în intervalul 1433-1500 cm-1

s-a observat o creştere a

absorbanţelor (Figura 2a). Acest lucru indică o mişcare conformaţională datorată creşterii

temperaturii asociată cu modificări în interiorul cristalului [36, 37]. Nu este clară originea

maximului de la 795 cm-1

(Figura 2b), prezent în spectru la 170-180 C, şi nu poate fi atribuită

benzii de balansare CH2.

Fig. 6 a,b Imagini tipice ale filmului poliamidic 6. Imaginile au fost mărite de 1500 respectiv 3000 de ori. Din

aceste figuri rezultă faptul că structura polimerului include ambele regiuni, amorfă şi cristalină

1485cm-1

180°C

1470 cm-1

40°C

Page 12: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

9

Concluzii

Spectrul FTIR al poliamidei 6 anionice a ilustrat benzi caracteristice ale grupurilor

NH-CO, formelor şi γ-cristaline ale polimerului şi prezenţa legăturilor intermoleculare de

hidrogen. Tratamentul termic influenţează poziţia şi intensitatea benzilor de absorbţie ale

poliamidei 6 datorită modificării cristalinităţii sale. Aceste observaţii sunt utile pentru

caracterizarea poliamidelor ca suport pentru materiale biocide. Centrul activ NH este

important pentru ataşarea compuşilor bioactivi în lanţul poliamidic prin tratarea suprafeţei sau

prin modificări chimice ale polimerului.

III. 2 Studiul tranziţiilor de fază termotropice în cristale lichide

Lipidele amfifile prezintă un comportament denumit termotrop, care se explică prin

diferenţa mare de energie de interacţiune dintre lanţurile hidrocarbonate, pe de o parte, şi

capetele polare, pe de altă parte. Când temperatura creşte, interacţiunile dintre lanţuri se rup

înaintea celor dintre capetele polare. De fapt, nu există o unică trecere din starea „solidă” în

cea lichidă, ci un interval mai larg de tranziţie.

Fosfolipidele se pot organiza diferit în funcţie de cantitatea de apă din sistem

(mezomorfism liotropic). Deasemenea îşi pot modifica starea de organizare şi prin creşterea

temperaturii, trecând dintr-o stare de gel în care moleculele sunt foarte puţin mobile şi dispuse

ordonat, într-o stare de cristal lichid, care se caracterizează printr-o mobilitate mare şi o

aranjare dezordonată a moleculelor (mezomorfism termotropic). Trebuie de remarcat că şi

fazele liotropice prezintă un mezomorfism termotropic, astfel încât o anumită fază obţinută

depinde atât de cantitatea de apă din sistem, cât şi de temperatură. [38, 39].

Şi unii polimeri, cum ar fi esterul Poli-(fenil-metacrilic) al acidului cetiloxibenzoic

(PPMAECOBA) în tetraclorometan (TCM) prezintă aceleaşi proprietăţi. Influenţa

temperaturii asupra echilibrului între fazele de ordine şi dezordine ale (PPMAECOBA) în

tetraclorometan (TCM) poate fi evidenţiată prin analiza spectrelor FTIR ale lanţurilor alchil

din compuşii amfiliofilici.

Mezofaza liotropică apare prin solvirea unui mesogen amfiliofilic într-un lichid care

nu solvă compusul amfifilic în condiţii adecvate de concentraţie şi temperatură [40, 41].

Echilibrul între faza de ordine şi dezordine în cristale lichide liotropice este influenţat de

temperatură. Mişcarea termică coroborată cu prezenţa impurităţilor poate determina tranziţii

între de gel şi faza cristalină lichidă. Faza de gel este caracterizată de un grad înalt de ordine,

în timp ce în faza cristalină lichidă lanţurile laterale lungi ar putea fi dezordonate secvenţial.

Esterul Poli-(fenil-metacrilic) acidului cetiloxibenzoic (PPMAECOBA) în

tetraclorometan (TCM) este un cristal lichid liotropic polimeric prin lanţurile sale secundare,

pentru o concentraţie a polimerului de aproximativ 10-2

g/cm3

[33, 34, 42]. Acest cristal lichid

liotropic este constituit de către interacţiuni dipolare colective între lanţuri polimerice

secundare lungi [37]. Particularităţile structurale chimice ale radicalilor catenelor lungi

secundare, conţinând un grup atomic capabil să formeze un cristal, determină un timp de

relaxare crescut. Acest timp depăşeşte cu cinci sau şase ordine de mărime valorile

corespunzătoare polimerilor cu catena flexibilă [37]. Proprietăţile anizotropice ale

PPMAECOBA în TCM sunt determinate de supraordonarea moleculară a catenelor laterale

ale macromoleculelor.

Apariţia organizării supramoleculare, în amestecul de PPMAECOBA cu TCM se datorează în

Fig.7 Formula chimică a

PPMAECOBA

Page 13: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

10

mare parte interacţiunilor dipolare dintre grupările laterale, nu doar la nivelul unei molecule ci

mai ales, la nivelul tuturor moleculelor. Direcţia catenei principale nu este determinată de

forţele interne, astfel încât acestea formează „ghemuri” din care ies catenele laterale orientate

prin forţe dipolare.

Aceste sisteme sunt similare cu cele formate în modelele membranare sau în

membranele biologice [23, 43-45]. Ele sunt influenţate de temperatura. Agitaţia termică poate

dezorganiza alinierea catenelor laterale prin interacţiuni colective. Gradul de ordine este

influenţat de asemenea de impurităţi.

Materiale şi metode

Cristalul lichid liotropic este păstrat într-o celulă specială de CaCl2 (Figura 8) [23, 37]

care poate fi încălzită până la 70 °C. Influenţa temperaturii asupra gradului de ordine este

evidenţiată de vibraţiile de valenţă ale grupării CH2 din intervalul 2800-3000 cm-1

al spectrului

FTIR. Peretele intern al celulei a fost acoperit cu un strat de orientare moleculară obţinut

dintr-o soluţie de 5% lecitină în apă. Distanţele dintre feţele laterale ale celulei au fost de 12

µm grosime. Aşadar, stratul de lichid prezintă o anizotropie intrinsecă dată de orientarea prin

interacţiuni colective şi de o orientare suplimentară indusă de stratul de lecitină.

Spectrul FTIR a fost înregistrat cu un dispozitiv FTIR BOMEM BM 157. S-a folosit

un dispozitiv de monitorizare a temperaturii Unicam Specac Temperature Controller [46].

Spectrele FTIR au fost în medie de la 100 scanări. Influenţa solventului a fost eliminată prin

extracţia benzilor IR corespunzătoare acestuia din spectrul FTIR al cristalului lichid liotropic.

În Tabelul IV sunt redate deplasările spectrale în intervalul 2800-3000 cm-1

pentru intervale

diferite de temperatură [47].

Fig. 9. Spectrul FT-IR

corespunzător vibraţiilor

de întindere ale lanţurilor

alchil ale PPMAECOBA

Fig. 8. Celula utilizată pentru cristalul lichid;

1-Fascicul IR,

2-CaCl2 ,

3-orientarea stratului de lecitină,

4-spaţiatoare,

5-stratul de cristal lichid

Page 14: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

11

Tabel IV. Deplasările spectrale ale vibraţiilor de întindere simetrice şi asimetrice (în cm-1) ale grupării CH2 în

funcţie variaţia temperaturii (°C)

Valorile cu indice 0, reprezintă valorile iniţiale.. Indicii s şi as se referă la vibraţiile de

valenţă simetrice şi asimetrice în grupările CH2. Din Tabelul IV rezultă o creştere a

deplasărilor spectrale cu temperatura, pentru benzile FTIR atribuite vibraţiilor de valenţă

simetrice şi asimetrice. În Figura 10 sunt reprezentate dependenţa numerelor de undă

corespunzătoare vibraţiilor de valenţă simetrice, iar în Figura 11 cu vibraţiile de valenţă

asimetrice de variaţia temperaturii. Pentru 15 ºC deplasarea spectrală este aproape nulă. Un

număr de undă de undă mare apare la 20 ºC aşa cum se observă în Figura 10 şi 11. Tranziţia

este foarte rapidă iar numărul de undă devine aproape constant.

Fig. 10. (stanga) Deplasările spectrale ale vibraţiei simetrice ale ale grupării CH2 vs. temperatură

Fig. 11. (dreapta) Deplasările spectrale ale vibraţiei asimetrice ale grupării CH2 vs. temperatură

Rezultate şi discuţii

Din Tabelul IV, Figura 10 şi Figura 11 rezultă că se înregistrează o tranziţie principală

de fază prin creşterea temperaturii. Această tranziţie de la faza de gel la cea de cristal lichid

apare în intervalul de temperatură corespunzător unui salt al numărului de undă în graficele

din Figura 10 şi Figura 11. Coordonatele mijlocului saltului pentru numărul de undă în Figura

10 şi 11 determină coordonatele tranziţiei principale de fază:

Din Figura 10 şi 11 reiese faptul că tranziţia principală de fază are loc la 45,7 ºC. Se produce

o creştere a dezordinii în lanţurile secundare lungi. Valorile tranziţiei principale de fază sunt:

;C.tm 745 ;cm.m,s172870 1082942 cm.m,as .

Concluzii

Temperatura poate dezorganiza stratul cristalin lichid realizat de PPMAECOBA în

TCM. Spectrometria FT-IR oferă posibilitatea de a determina coordonatele tranziţiei

principale de fază ale cristalului lichid liotropic. Pentru cristalul lichid liotropic

(PPMAECOBA) în tetraclorometan (TCM) a fost evidenţiată o tranziţie principală de fază la

45,7 ºC.

Page 15: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

12

III. 3 Studiul influenţei câmpurilor electromagnetice de înaltă frecvenţă şi microunde

asupra bistraturilor de dipalmitoilfosfatidilcolină (DPPC). Controlul

parametric al permitivităţii electrice pentru faza Lα a DPPC, evidenţiată prin

metode de simulare.

În acest studiu [48] am realizat o simulare pentru determinarea componentelor

tensorului permitivitate electrică al dipalmitoilfosfatidilcolinei (DPPC) hidratate în fază de

cristal lichid (LC), Lα. Comportamentul complex al bistraturilor ordonate smectic în structura

multilamelară a acestui lipid biologic a fost analizat prin metode de simulare structurală

folosindu-se programul HFFS (high frequency structural simulator, program de simulare

structurală 3D, tehnologie Ansoft - reproduce structura 3D la nivel micoscopic şi îi testează

comportarea în câmpuri electromagnetice de înaltă frecvență şi microunde).

Rezultatele obţinute ilustrează o variaţie semnificativă a valorilor permitivităţii relative

paralel εr║ (30 - 96) de-a lungul structurii multistrat, atât în interiorul cât şi în afara

bistraturilor. Studiul materialului prin simulare ne oferă posibilitatea modificării diverşilor

parametri fizici şi geometrici la nivelul structurii (concentraţiile constituenţilor în soluţie, ionii

tampon, temperatura) prin care se pot controla variaţiile permitivităţii electrice la scară

microscopică şi implicit permitivitatea efectivă a cristalului lichid la scară macroscopică.

Factorul temperatură se impune ca un factor foarte important care trebuie considerat

pentru determinarea valorilor corecte ale permitivităţii electrice, datorită faptului că în

intervalul de temperatură între 21 şi 42 °C au loc mai multe transformări de fază în DPPC, de

la gel la cristal lichid, fiecare fază prezentând ordine internă diferită şi parametri caracteristici.

Metoda de simulare dezvoltată de noi ne-a permis modificarea parametrilor de control

la nivelul structurii şi precum şi monitorizarea efectelor cu o precizie satisfăcătoare (mai puţin

de 4 % eroare relativă la determinarea parametrilor fizici caracteristici structurii).

Printre parametrii fizici caracteristici structurii moleculare consideraţi la simulare enumerăm:

masa molară de 734.038862 g/mol; polarizabilitatea moleculară: 82.39 a.u. = 13.584·10-40

C·m2/V, aria suprafeţei polare: 121 Å

2, aria suprafeţei accesibile pentru solvent (aria de

solvatare): 1403.77 Å2; momentul dipolar efectiv ale DPPC: 1.564 · 10

-30 C·m (DPPC se

prezintă ca un dipol vertical negativ datorat poziţionării relative a unui grup fosfat încărcat

negativ şi a grupului trimetilamoniu încărcat pozitiv); lungimea legăturii OH: rOH = 0.9572 Å;

unghiul legăturii HOH: θHOH = 104.52° [49-51].

În cadrul simulărilor, modelul de difuzie anizotropic rotaţional care descrie reorientarea

moleculelor sau a segmentelor moleculare în bistraturile de lipid a fost înlocuit cu un model

colectiv pentru reorientări moleculare lente în bistraturi, în concordanţă cu rezultatele

prezentate în literatură [54, 55]. Au fost urmărite în detaliu modificările structurale ale

membranei ce survin odată cu varierea temperaturii, lucrând la presiune atmosferică normală.

Odată cu creşterea temperaturii, membrana bistratificată de DPPC suferă trei tipuri de

modificări structurale: subtranziţia din faza de subgel (faza Lc) în faza de gel lamelar (faza Lβ')

la 21.2 °C (datorată scăderii gradului de ordonare a lanţurilor alcanice şi hidratării capurilor

polare), pre-tranziţia spre faza de gel - bistrat în formă de undă, dezordonat (ripple gel phase -

Fig. 21 Structura moleculară a

dipalmitoilfosfatidilcolinei

(C40H80NO8P).

(polar head = cap polar; 2 tails (alkane

chains) = 2 cozi (lanţuri alcanice)

Page 16: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

13

faza Pβ') la 34.3 °C, şi în final tranziţia principală de fază către structura de cristal lichid

(Figura 22) (faza Lα) la Tm = 42.0 °C [52, 53]:

LPLL CCC

c 000 423.342.21 '' .

Cu ajutorul metodei de simulare, au fost reprezentate atât fazele "ordonate" (Lc, Lβ',

Pβ'), care se transformă din una în alta, cât şi faza "dezordonată" Lα. În cazul tranziţiei

principale de fază au fost considerate: ΔH = 7.4 ± 0.4 kcal/mol; ΔG(H2O) = 6.57 ± 0.3

kcal/mol; Ea = 50.34 ± 5.46 kcal/mol. Simularea efectuată a scos în evidenţă un fapt

important şi anume faptul că diferite faze pot coexista, iar pentru comportarea complexă a

structurii cu temperatura este specifică o diagramă de fază. Ca un extradomeniu pe diagrama

de fază, trebuie menţionat că în condiţii speciale poate apare o structură interdigitată, care nu

este o structură bistrat, formată într-un domeniu de temperatură finit, la presiuni înalte de

peste ca. 1000 atm [52].

Faza care captează cel mai mult atenţia în cazul soluţiilor apoase de DPPC este faza de cristal

lichid, care prezintă o organizare şi o dinamică interesante. Ca şi mecanism, apa poate

pătrunde adânc în interiorul bistraturilor de lipid, aproape până la capătul lanţurilor alifatice

[54]. Moleculele de apă penetrează prin vecinătatea grupului N(CH3)3 aparţinând capului

polar şi pot forma legături de hidrogen cu oxigenul carbonil prezent în interiorul bistratului

[61, 62]. Efectul pătrunderii apei în interiorul bistratului este creşterea gradului de dezordine

al cozilor (lanţurilor alcanice) în faza Lα a DPPC (la temperaturi mai mari decât Tm), cu cozile

lipidice mişcându-se aleator. Odată cu creşterea temperaturii, gradul de întrepătrundere al

lanţurilor alchil din cele două monostraturi vecine creşte, dar structura de bistrat se păstrează.

În final (peste Tm şi în stare staţionară) a fost găsită experimental o ordonare internă

care aminteşte de un cristal lichid smectic [55] şi care a fost reprodusă în studiul de faţă cu

ajutorul metodei noastre de simulare, structură în care distanţa dintre straturile duble de

molecule aglomerate este relativ constantă (Figura 23). Substanţele tampon şi aditivii, cum ar

fi Na2HPO4, sau NaCl, ionii de Ca [50, 55], etc., pot ajuta la controlul acestei distanţe în

scopul obţinerii de structuri CL cu diferiţi parametri macroscopici.

Permitivitatea electrică a membranei de lipid în exces de apă poate fi exprimată în

formă tensorială, considerând formula pentru inducţia electrică în interiorul structurii de

cristal lichid:

Fig. 23 Structura de cristal lichid

lamelar a DPPC-ului cu exces de apă

(plus aditivi).

Fig. 22 Transformările de fază

induse de temperatură în

membrana bistratificată de DPPC

în prezenţa excesului de apă.

(ripple gel = gel dezordonat,

bistrat în formă de undă - „val”)

Page 17: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

14

ED II

II

r

r

r

00

00

00

, cu "j' IIIIII rrr , "' rrr j (1)

Mărimile IIr şi r reprezintă permitivităţile paralelă, respectiv transversală, calculate în

cazul în care direcţia de propagare a câmpului de test este paralelă, respectiv perpendiculară

pe axele moleculare lungi, de-a lungul cărora se defineşte versorul n . Componentele

tensorului permitivitate au fost calculate pe baza unui algoritm fizic conceput în cazul

probelor de cristal lichid expuse câmpului de microunde al unei antene horn. Modul de

expunere al probelor şi setarea câmpului de test au fost stabilite cu ajutorul programului

HFFS.

Algoritmul fizic folosit implică calcularea variaţiilor densităţii de energie la

propagarea câmpului de test prin probele materiale. A fost folosită teorema Poynting în formă

integrală:

V VPoynting dVEJAdSdVw

t (2)

unde HES Poynting reprezintă vectorul Poynting, w reprezintă densitatea de energie, w =

we + wm; J este densitatea de curent şi V este suprafaţa care include volumul probei V.

Variaţia densităţii de energie, dwe, este legată de componentele tensorului susceptibilitate

electrică:

dEEEdEPdEdw eee 00 (3)

Pentru determinarea susceptibilităţii au fost calculate variaţiile dwe la trecerea câmpului prin

probe, folosindu-se datele furnizate de simulatorul 3D (HFSS).

III. 3. c. Rezultate obţinute pentru permitivitatea cristalelor lichide

Am considerat un sistem bistraturi - apă stabil, cu un raport molecular apă/DPPC de

40:1, la presiune atmosferică normală. Odată cu creşterea temperaturii, sistemul trece prin mai

multe faze şi evoluează către un sistem multilamelar. O celulă de test include 10 bistraturi cu

128 x 2 lipide per bistrat (128 per strat din componenţa bistratului). Aria proiectată a

membranei A = L x×L y ("umbra" lăsată de membrană când cade lumina pe aceasta)

corespunde unei arii per lipid de 64.3 Å2; volumele lipidelor sunt de ca. (12 ± 1)·10

2 Å

3/lipid,

valori apropiate de cele considerate în determinările experimentale raportate în literatură [56].

Sub influenţa creşterii temperaturii, începând cu valori situate sub temperatura primei

transformări de fază, lanţurile alcanice ordonate, întinse, înclinate la 33°, încep să se

distanţeze şi să se încovoaie, capurile moleculare polare pierd puţin din ordinea lor planară

regulată, în timp ce moleculele de apă încep să penetreze adânc straturile de molecule

aglomerate. Se formează legături de hidrogen apă - apă sau cap fosfolipidic - apă, grupurile

−PO2- şi −CO fiind capabile să formeze legături de hidrogen cu moleculele de apă [50]. În

jurul tranziţiei principale de fază au loc rearanjări structurale majore în bistraturi, ca şi cum

lanţurile hidrocarbonice ar începe să se "topească".

Determinarea permitivităţilor IIr , r a fost realizată prin simulări pentru membrana

de DPPC hidratată în fază Lα. A fost considerată o constantă de periodicitate lamelară în apă

pură dl ≈ 65 Å (Figura 23). A fost luat în consideraţie faptul că dispersia multilamelară a

DPPC-ului în fază de cristal lichid (care descrie reorientarea segmentelor sau a moleculelor în

bistraturile lipidice) depinde de temperatură şi frecvenţă [57]. Temperatura operaţională în

cazul membranei pentru care au fost reprezentate grafic rezultatele a fost de 49 ºC, situată

Page 18: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

15

peste Tm (temperatura principalei tranziţii de fază spre faza Lα). Rezultatele au fost obţinute

pentru câmpuri aplicate cu frecvenţe în domeniul:0.915-2.45 - 5.8 GHz. Valorile permitivităţii

relative, calculate pentru un câmp aplicat E care se propagă paralel cu axa lungă a dipolilor

moleculari, evoluează de-a lungul direcţiei de propagare trecând prin maximile specifice

corespunzătoare regiunilor capurilor polare ale moleculelor, scăzând apoi către valorile mai

mici, corespunzătoare miezurilor bistraturilor cu lanţurile hidrocarbonice (alcanice) şi scăzând

în continuare către valorile minime din zona apoasă dintre bistraturi. Datorită excesului de

hidratare, lanţurile alchil au suficient spaţiu şi libertate de mişcare, pentru a permite dipolilor

moleculari paraleli cu axele moleculare lungi să se alinieze după direcţia câmpului aplicat. Un

capăt dipolar este relativ stabil şi blocat în zona capurilor polare aglomerate, zonă în care

permitivitatea paralelă este ridicată, în timp ce celălalt capăt al dipolilor este relativ liber să se

mişte în miezul hidratat rarefiat (cu permitivitate scăzută) şi este orientat de către câmp.

Metoda de simulare a pus în evidenţă înaltul grad de neuniformitate al valorilor permitivităţii

paralele, determinate de-a lungul structurii multilamelare, valori urmărite pe direcţie

perpendiculară pe bistraturile de DPPC în soluţie apoasă (Oz).

Fig. 24 (stânga) Variaţia componentei paralele a lui r pentru faza Lα de cristal lichid a DPPC-ului în soluţie

apoasă, raport molecular 1:40, reprezentată pe direcţie perpendiculară pe bistraturi (fo = 2.45 GHz, T =

49 ºC). Valorile permitivităţii raporate în literatură pentru zona capurilor polare, în miezurile

hidrocarbonice ale bistraturilor, respectiv în mediul apos intermediar au fost indicate prin linii roşii.

Fig. 25 (dreapta) Variaţia componentei transversale a lui r pentru faza Lα de cristal lichid a DPPC-ului în soluţie

apoasă, raport molecular 1:40, reprezentată pe direcţie paralelă cu bistraturile (fo = 2.45 GHz, T = 49

°C). Au fost considerate pentru reprezentare trei planuri xOy: la nivelul capurilor moleculare polare (B-

B), în miezul hidrocarbonic din interiorul bistratului (A-A), respectiv în mediul apos intermediar (C-C).

Fiecare subgrup molecular prezintă o puternică individualitate (capurile polare,

lanţurile alcanice), iar tranziţia valorilor parametrilor de material corespunzători este abruptă.

Maximele permitivităţii corespunzătoare zonelor cu capuri polare ale moleculelor de DPPC

evidenţiază proprietăţi de bun izolator în zonele respective, zone care se comportă ca o barieră

de conductivitate a membranei apoase. Acesta poate constitui un efect de interes pentru

aplicaţii în domeniul nanotehnologiilor. Zonele relativ extinse de permitivitate scăzută

corespunzătoare miezurilor hidrocarbonice din interiorul bistraturilor de lipid indică faptul că

proprietăţile dielectrice nu sunt atât de bune în interiorul bistraturilor. Permitivitatea electrică

Page 19: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

16

din mediul apos din zonele dintre bistraturi scade chiar mai mult faţă de valorile mici din

interiorul bistraturilor; zona apoasă neutră fiind mai uşor polarizabilă şi aflându-se sub

influenţa interacţiunii bistraturilor vecine (valorile permitivităţii nu sunt cele din apa pură).

Fig. 26 Dispersia cu frecvenţa a permitivităţii electrice pentru faza Lα de cristal lichid a DPPC-ului în soluţie

apoasă, raport molecular 1:40, pentru trei frecvenţe de operare ISM: 0.915; 2.45 şi 5.8 GHz . Au fost

reprezentate benzile de fluctuaţie ale permitivităţii transversale în diverse plane xOy (a se vedea Figura

25) la frecvenţele ISM [48].

Procesul de autostructurare a membranei în apă este condiţionat de o concentraţie de

prag a apei în agentul tensioactiv pulmonar pe bază de DPPC. La valori mai mari ale acestei

concentraţii structura de tip bistraturi poate să dispară. Metoda de simulare ne-a indicat că

moleculele de apă trebuie să fie într-un raport de 30:1 până la 100:1 faţă de moleculele de

DPPC, în soluţiile de fosfolipid în care lipozomii sau bistraturile pot să apară în mod spontan.

Rezultatele obţinute prin simulare sunt confirmate de rezultatele experimentale [50]. Prin

simulare am găsit de asemenea că la un raport molecular de peste 120:1 (apă:DPPC), apa în

exces începe să rupă bistratul şi are loc defragmentarea acestora. În acelaşi timp, a fost

determinată o valoare de prag a raportului molecular apă: DPPC de cca. 82:1, care a fost

găsită ca fiind critică pentru ca structura să prezinte ordonare de cristal lichid cu periodicitate

lamelară relativ constantă.

CAP. IV. 1,6-DIFENIL-1,3,5,-HEXATRIENA (DPH) - MARKER FLUORESCENT

UTILIZAT ÎN EVALUAREA FLUIDITĂŢII STRUCTURILOR DE TIP

MEMBRANAR

Cea mai utilizată moleculă pentru studii de polarizare a fluorescenţei este 1,6-DIFENIL-

1,3,5,-HEXATRIENA (DPH). A fost si prima moleculă utilizată de Shinitzky şi Barenholz

(1974, 1978) pentru punerea la punct a teoriei şi principiului tehnicii de polarizare a

fluorescenţei aplicată la descrierea fluidităţii/microvâscozităţii membranelor.

Molecula este o hidrocarbură de tip polienă, cu duble legături în configuraţie all-trans

(care este de altfel şi configuraţia în care molecula este fluorescentă), cu formă alungită de

bastonaş, având lungimea de 13 Å. DPH se încorporează spontan în bistratul lipidic, având un

coeficient de partiţie lipide/apă mare (1,3x106).

Fig. 2. Structura 1,6-difenil-1,3,5-hexatrienei (DPH) construită cu GAMESS-US code at HF/6-31G* level.

Page 20: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

17

Studiul influenţei naturii solventului asupra SEA ale DPH

DPH [58] este o polienă nepolară, dar polarizabilă cu o structură alungită, care poate fi

uşor obţinută şi purificată. DPH prezintă spectre electronice intense de absorbţie şi emisie

[24-27]. Spectrele de fluorescenţă ale polienelor ne pot oferi informaţii legate de fluiditatea

membranei din cauza schimbării importante în randamentul fluorescenţei în prezenţa

moleculelor de apă, în comparaţie cu alţi solvenţi [59, 60]. Schimbările din intensitatea

fluorescenţei unor molecule (cum ar fi DPH) pot oferi informaţii despre fluiditatea membranei

sau despre concentraţiile micelare critice în sisteme coloidale [61, 62].

Structura moleculei DPH permite orientarea acesteia de-a lungul lanţurilor de

hidrocarburi ale fosfolipidelor din membranele biologice. În această poziţie, DPH este

fluorescentă, însă aproape de capul hidrofil fosfolipidic fluorescenţa DPH este redusă.

Anularea fluorescenţei DPH în apă şi, de asemenea, sensibilitatea sa la mediu (în special la

natura solventului), recomandă DPH ca senzor pentru alinierea lanţurilor de acizi graşi. În

absorbţie DPH prezintă două benzi electronice [63], în intervalele de 220-240 nm şi 330-380

nm numite B-band şi respectiv, A-band. Maximele vibronice ale A-band DPH sunt

asemănătoare cu cele observate la derivaţii de stilben [64]. Rezultate suplimentare în ceea ce

priveşte influenţa solventului asupra SEA ar putea îmbogăţi datele experimentale şi ar

contribui la obţinerea de informaţii în plus cu privire la fenomenele care determină stingerea

fluorescenţei DPH în diferiți solvenţi (apă, metanol, diclormetan), şi, de asemenea, în ceea ce

priveşte interacţiunile intermoleculare ale DPH în soluţii.

Scopul acestui studiu este de a analiza interacţiunile intermoleculare ale DPH cu un

număr mare de solvenţi pe baza spectrelor de absorbţie electronică ale soluţiilor ternare de tip

DPH + THF + solvent. Totodată, o analiză de mecanică cuantică a proprietăţilor structurale şi

electro-optice ale DPH realizate cu HyperChem 8.0.6 a fost corelată cu datele spectrale.

Toţi cei 34 de solvenţii utilizaţi au fost de puritate spectroscopică şi, prin urmare, nu

au necesitat purificare suplimentară. Solvenţii au fost testaţi şi confirmaţi prin spectroscopie

de absorbţie la lungimile de undă de interes. Soluţia stoc de DPH 1mM în THF fost pregătită

şi păstrată la temperatura de 2°C la întuneric. 150 µL de soluţie stoc DPH a fost adaugată în

1850 µL a fiecărui solvent într-o cuvă de cuarţ cu ajutorul unor micropipete calibrate şi proba

a fost omogenizată. În acest fel, fiecare soluţie ternară conţine DPH + THF şi unul dintre cei

34 de solvenți utilizați. Protocolul pentru obţinerea soluţiilor ternare este frecvent folosit [65,

66], în procedura de marcare a membrane celulare prin măsurători fluorescente. Prezenţa de

THF, în procent de aproximativ 7,5% în soluţiile studiate nu influenţează într-o mare măsură

valorile indicelui de refracţie. De exemplu: pentru Clorbenzen n = 1,511 şi pentru Clorbenzen

+ 7,5% THF n = 1,518; pentru Metanol n = 1,328 şi pentru metanol + 7,5% THF, n = 1,334.

IV. 2. b. 3. Calcule de mecanică cuantică

După parametrizarea şi construcţia moleculei DPH, optimizarea geometriei moleculare a fost

realizată cu ajutorul unui gradient RMS = 0,01 kcal / (mol Å) şi algoritmul Polak Ribiere.

Tabel III (stanga) Parametrii moleculari ai DPH calculaţi cu programul HyperChem 8.0.6.

Tabel IV (dreapta) Parametrii energetiici ai DPH calculaţi cu HyperChem 8.0.6.

În acest context, unele proprietăţi fizico-chimice ale moleculei DPH au fost stabilite

cu HyperChem 8.0.6 [67]. Astfel au fost calculate: momentul dipolar, polarizabilitatea,

Page 21: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

18

energiile celui mai de jos orbital molecular neocupat (LUMO) şi celui mai înalt ocupat orbital

molecular (HOMO), tăria chimică (eV), indicele electrofil (eV), caracteristicile

energetice. O mică diferenţă ELUMO - EHOMO indică o structură moleculară cu polarizabilitate

apreciabilă şi valori mici ale energie de excitaţie [68-70]. Aceste proprietăţi moleculare sunt

corelate cu reactivitatea şi activitatea biologică a unei structuri chimice (unele dintre aceste

valori sunt incluse în ecuaţii MLR- Multiple Linear Regression, legate de activitatea

biologică).Valorile energetice din Tabelul IV indică un potenţial de ionizare relativ scăzut şi

afinitate electronică a moleculei de DPH. Orbitalii HOMO (Figura 10) şi LUMO (Figura 11)

în HyperChem arată redistribuirea sarcinii electronice, urmată de o torsiune moleculara [71],

evidenţiată, de asemenea şi în alte lucrări [71, 72]. Distribuţia electronică în orbitalii HOMO

şi LUMO demonstrează posibilitatea unei torsiuni moleculare, inducând posibilitatea unei

tranziţii între stările excitate S1 S2, care ar putea determina stingerea fluorescenţei.

IV. 2. c. 2. Efectul solvenţilor asupra spectrelor electronice de absorbţie (SEA) ale DPH

În spectrul de absorbţie UV-Vis al DPH apar două benzi [63]:

- banda A a DPH constă din trei componente de vibraţie şi doi umeri observaţi la 330-

380nm.

- banda B a DPH este observată la 220-240 nm.

Numerele de undă ale maximelor vibronice ale benzii A depind de natura solventului aşa cum

rezultă din Figura 13.

Fig. 13 SEA al benzii A pentru DPH în solvenţi diferiţi (Tabelul VII.)

Un studiu preliminar [73] a arătat că deplasările spectrale nu depind de permitivitatea

electrică a solventului; acest fapt ar putea fi explicat prin valoarea foarte mică a momentului

de dipol electric (calculat prin HyperChem 8.0.6; D0004.0 ).

Fig. 10 Orbitalii HOMO Fig.11 Orbitalii LUMO

Page 22: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

19

Dependenţa 3,2,1;1 icmi de funcţia de dispersie a solventului nf este ilustrată în

Figura 15 a:

Tabel VII Numerele de undă )cm(,,1

321 în maximele benzilor vibronice de absorbţie ale DPH in diferiţi

solvenţi (n – indice de refracţie, ε – permitivitate electrică) [73].

No. Solvent n ε ν1 (cm-1

) ν2 (cm-1

) ν3 (cm-1

)

1 n-Hexan 1.375 1.89 27064 28490 29940

2 n-Heptan 1.387 1.92 26954 28409 29851

3 Ciclohexan 1.426 2.02 26810 28249 29762

4 1,4 Dioxan 1.422 2.22 26596 28090 29499

5 Carbon Tetraclorid 1.407 2.24 26525 27933 29586

6 Benzen 1.501 2.28 26110 27548 29762

7 Clorobenzen 1.525 5.6 26316 27778 29155

8 Toluen 1.497 2.34 26455 27933 29326

9 Cloroform 1.446 4.86 26525 28011 29412

10 Diclorometan 1.424 9.08 26596 28090 29412

11 Dicloroetan 1.445 10.42 26560 28011 29499

12 Tricloretilen 1.478 3.38 26490 27972 29499

13 o - Xylen 1.494 2.28 26420 27894 29369

14 m - Xylen 1.497 2.37 26490 27972 29412

15 Tetrahidrofuran THF 1.404 7.52 26667 28169 29499

16 Acetona 1.359 20.7 26954 28409 29762

17 Metil Etil Cetona 1.379 18 27064 28329 29499

18 Etil acetat 1.372 6.2 26882 28409 29851

19 Etanol 1.361 24.55 26954 28409 29851

20 Metanol 1.328 33 27100 28571 29851

21 Glicerol 1.475 42.5 26385 27855 29326

22 Octanol 1.430 9.8 26667 28169 29499

23 1 - Propanol 1.386 20.33 26954 28490 30030

24 2 - Propanol 1.377 18.3 27027 28490 29851

25 n - Butanol 1.399 17.51 26810 28289 29718

26 iso - Butanol 1.396 17.93 26918 28289 29806

27 Acid Acetic 1.372 6.15 26954 28409 29851

28 Acid Propionic 1.394 3.34 26846 28329 29586

29 Dimetil sulfoxid DMSO 1.479 54 26247 27778 29155

30 Dimetilformamida DMF 1.430 37.6 26525 28011 29412

31 Piridina 1.510 12.3 26247 27701 29070

32 Apa 1.332 81 26455 27894 29455

33 Acetonitril 1.344 37.5 27027 28409 29940

34 Eter etilic 1.353 4.34 27064 28490 29985

În figura 16 a sunt ilustrate dependenţele liniare dintre valorile calculate şi cele măsurate ale

frecvenţelor în maximele benzilor vibronice ale DPH [73]. Rezultă o foarte bună corelare

(după prima bisectoare a figurilor) dintre valorile calculate şi cele experimentale.

Fig. 15a )cm( 11

vs. nf pentru

benzile vibronice din regiunea

26240 - 27070 cm−1

a spectrului

de absorbţie al DPH. Solvenţii

corespunzători poziţiilor 5, 6, 29

şi 32 din Tabelul VII au fost

eliminaţi din cauza abaterii

punctelor corespunzătoare lor în

reprezentarea 1 vs. nf .

Page 23: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

20

Acest studiu demonstrează faptul că momentul de dipol al DPH nu este modificat prin

excitare, dar polarizabilitatea electrică creşte cu valori apropiate în cele trei benzi vibronice.

IV. 3. Spectre electronice de fluorescenţă ale DPH în soluţii

Urmând acelaşi protocol de preparare a probelor am urmărit influenţa naturii solventului în

spectrele de fluorescenţă ale DPH.

IV. 3. a. Materiale şi metode

Pentru prepararea soluţiilor ternare am utilizat o soluţie stoc conţinând DPH şi THF în

aceleaşi proporţii ca în şi cazul protocolului de lucru folosit la înregistrarea spectrelor

electronice de absorbţie. Spectrele de excitaţie şi fluorescenţă au fost inregistrate cu un

spectrofluorometru Horiba Fluoromax 4 (Horiba Jobin Yvon) în cuve de cuarţ de 10 mm.

Lungimea de undă de excitare a fost 350 nm (1.7 nm bandpass), iar spectrul de emisie a fost

înregistrat în domeniul 365 - 600 nm. Spectrele au fost înregistrate la temperatura camerei.

Datele au fost prelucrate cu FluorEssence® (Scientific, 2009)

şi Portable Origin software.

IV. 3. b. Rezultate şi discuţii

Spectrele electronice ale DPH sunt prezentate în Figurile 17a şi 17b pentru absorbţie,

repectiv fluorescenţă. În Figurile 18 a,b şi c este evidenţiată dependenţa numerelor de undă

ale maximului de absorbţie (a), fluorescenţă (b) şi cele corespunzătoare traziţiei electronice

pure de funcţia de dispersie. În cazul spectrelor de absorbţie dependenţa este liniară, deoarece

în soluţiile DPH predomină interacţiunile de dispersie (Figura 18 a). Abateri mari de la o

dependenţă liniară au fost evidenţiate (Figura 18 b) pentru spectrele de emisie, în care

deplasările spectrale sunt mai puţin sensible la natura solventului.

Fig. 18 . Numerele de undă ale

celor mai intense benzi de

absorbţie vs. f(n);

Fig. 16a 1calc cu relaţia (22)

vs. 1exp pentru prima bandă

vibronică a DPH

Page 24: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

21

Fig 17a) SEA ale DPH şi b) spectre de fluorescenţă ale DPH în câţiva solvenţi din Tabelul X

Tabel X Numerele de undă ale maximurilor de absorbţie, fluorescenţă şi ale tranziţiei electronice 0-0 ale DPH în

diferiţi solvenţi

No. Solvent n ε νa (cm

-1) νfl (cm

-1) ν00 (cm

-1)

1 Metanol 1,328 33 28571 23641 26106

2 Apă bidistilată 1,332 81 27894 23202 25548

3 Eter etilic 1,353 4,34 28490 23474 25982

4 Acetonă 1,359 20,7 28409 23529 25969

5 Etanol 1,361 24,55 28409 23529 25969

6 Acetat de etil 1,372 6,2 28409 23529 25969

7 n-Hexan 1,375 1,89 28490 23474 25982

8 1 - Propanol 1,386 20,33 28490 23810 26150

9 Acid Propionic 1,394 3,34 28329 23529 25929

10 iso - Butanol 1,396 17,93 28329 23529 25929

11 Tetrahidrofuran 1,404 7,52 28169 24155 26162

12 Diclormetan 1,424 9,1 28090 24096 26093

13 Dicloretan 1,445 10,42 28011 23310 25661

14 Acetil Acetonă 1,452 25 27548 23256 25402

15 Tricloretilenă 1,478 3,38 27972 24096 26034

16 Dimetil sulfoxid 1,479 54 27778 23310 25544

17 o - Xilen 1,494 2,28 27894 23310 25602

18 Toluen 1,497 2,34 27933 23310 25621

19 m - Xilen 1,497 2,37 27972 23364 25668

20 Benzen 1,501 2,28 27548 23310 25429

În apă, aspectul spectrului de fluorescenţă se modifică în comparaţie cu spectrul celorlalţi

solvenţi, iar punctul corespunzător (2) este un punct aberant.

IV. 4. Concluzii

1. Numerele de undă în maximele benzilor vibronice ale DPH depind de natura

solventului prin funcţia de dispersie. Acest fapt arată că forţele de orientare-inducţie şi

polarizare sunt mai mici decât cele dispersive în soluţiile cu DPH.

2. Din dependenţa deplasării spectrale de funcţia de dispersie, a fost estimată

polarizabilitatea electrică în starea excitată a DPH. Datele din Tabelul IX reflectă faptul că

polarizabilitatea electrică a molecule de DPH creşte prin excitare.

3. Numerele de undă în maximele benzilor vibronice ale DPH nu depind de natura

solventului în special în cazul solvenţilor

Page 25: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

22

4. Numerele de undă corespunzătoare tranziţiei 0-0 depind numai de funcţia de

dispersie a solvenţilor.

În aceste studii a fost relevată prevalenţa forţelor de dispersie în soluţiile ternare ale DPH.

IV. 5. CARACTERISTICI REMARCABILE ALE SPECTRELOR ELECTRONICE ALE

DPH ÎN FUNCŢIE DE NATURA SOLVENTULUI

Unele soluţii standard de DPH realizate prin utilizarea protocolului pentru urmărirea

fluidităţii membranei celulare au fost analizate în scopul de a explica deplasarea remarcabilă

observată în spectrele electronice (absorbţie şi fluorescenţă) în diferiţi solvenţi. Rezultatele au

fost corelate cu cele obţinute în simulări de dinamică moleculară în soluţii multicomponente

în care au fost evidenţiate regiuni micelare în jurul moleculelor de DPH [74].

În solvenţi aprotici, DPH prezintă un spectru electronic intens şi structurat, atât în absorbţie

cât şi în fluorescenţă. În unii solvenţi, spectrele de absorbţie şi de emisie ale DPH posedă

simetrie în oglindă, păstrându-se structura vibronică. În diclormetan (DCM), benzile de

fluorescenţă au simetrie de oglindă cu cele de absorbţie [75]. În apă şi tetrahidrofuran (THF)

şi DCM structura vibronică a spectrelor electronice dispare. Există solvenţi în care se menţine

structura vibronică, dar simetria în oglindă este perturbată datorită modificărilor ce apar în

componentele de vibraţie [76]. Din aceste motive, polarizarea fluorescenţei poate evidenţia

orientarea moleculelor de DPH de-a lungul lanţurilor acil a fosfolipidelor [77, 78] şi

localizarea acestora în bistraturile membranelor celulare şi artificiale [77, 79-81].

Structura DPH în stare electronică fundamentală este ilustrată în Figura 19a.

Momentul de dipol al conformaţiei all-trans este nul. Deci, această moleculă prezintă doar

niveluri simetrice g(gerade) şi asimetrice u(ungerade) pentru toate stările electronice.

Fig. 19 a) conformerul DPH all-trans, b) rotamerul Cs al DPH - [74]

Deoarece DPH este puţin solubilă în apă, în protocoalele de marcare fluorescentă ale

membranelor biologice este utilizat ca solvent THF. Şi alţi solvenţi pot solva DPH, devenind

astfel utilizabilă în studiile membranare. Tinând cont că spectrele de absorbţie şi de

fluorescenţă ale DPH sunt influenţate de natura solventului, poate prezenta interes găsirea

unor alternative pentru realizarea soluţiilor stoc ale DPH, cu utilizare ulterioară în tehnicile de

marcare fluorescentă a membranelor. In acest studiu sunt prezentate caracteristicile unor

soluţii stoc ale DPH. Prepararea acestor soluţii s-a făcut în două etape: iniţial s-a dizolvat

DPH în THF şi apoi, soluţia stoc obţinută a fost amestecată cu diferiţi solvenţi (apă, etanol,

DCM, benzen şi acetonă).

Pentru a înţelege modul în care solvenţii influenţează spectrele de absorbţie/emisie ale

DPH, am realizat un studiu de dinamică moleculară. Simulările de dinamică moleculară au

urmărit comportamentul amestecului DPH + THF în apă şi în etanol. Datele obţinute au fost

analizate în vederea studierii modului de structurare a solventului în jurul moleculei de

difenilhexatrienă.

Detalii referitoare la simularile de dinamică moleculară

Metodele şi abordările computaţionale utilizate în studiul de faţă constau în simulări

de dinamică moleculară ale amestecului DPH + THF dizolvat atât în apă (WAT) cât şi în

etanol (ETH). Sistemele conţinând DPH+THF+WAT şi DPH+THF+ETH au fost obţinute,

după cum urmează: printr-o faţetă laterală a celulelor de simulare preechilibrate conţinând apă

şi etanol, au fost adăugate câte o moleculă DPH şi 150 molecule THF. Pentru a reflecta în

Page 26: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

23

mod corespunzător concentraţiile utilizate în experimentele de marcare fluorescentă a

biomembranelor, doar o singură moleculă de DPH a fost adăugată în celula de simulare care

conţine solventul. Pentru a îmbunătăţi eficienţa statistică, intervalul de timp utilizat în

simulare a fost de ordinul zecilor de nanosecunde. Sistemele astfel obţinute au fost simulate

pentru 10 ns pentru a asigura amestecarea componentelor, în acelaşi timp monitorizând

variaţia de timp a energiilor de interacţiune între perechile de constituenţi. Când aceste energii

rămân constante în timp, sistemul poate fi considerat ca fiind echilibrat. Apoi alte 10 ns de

simulare au fost efectuate în fiecare caz, ceea ce s-a luat în considerare când s-au făcut

prelucrările ulterioare de date. Simulările au fost efectuate cu software ul GROMACS 4.5 [82]

utilizând un sistem de calcul Dell PowerEdge 1950 cluster cu 64 de nuclee.

IV. 5. c. Rezultate şi discuţii

Spectrele de absorbţie şi fluorescenţă ale soluţiilor DPH+THF+solvent în etanol, apă,

diclormetan, benzen şi acetonă şi ale soluţiilor DPH+THF sunt prezentate în Fig. 21a - f.

Fig. 21 Spectrele electronice de absorbţie (SEA) şi spectrele electronice de fluorescenţă (SEF) pentru: a) DPH +

THF; b) DPH + THF + WAT; c) DPH + THF + ETH; d) DPH + THF + DCM; e) DPH + THF + benzen;

f) DPH + THF + acetonă [74].

Page 27: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

24

În Fig. 21 a sunt ilustrate spectrele electronice de absorbţie (SEA) şi de fluorescenţă

(SEF) ale soluţiei binare DPH + THF [74]. Nu pot fi observate structura vibronică şi simetria

de oglindă. Spectrele electronice ale DPH+THF+WAT pentru soluţiile cu conţinut mare de

apă sunt asemănătoare cu cele obţinute în THF (Fig. 21a, b). Pierderea structurii vibronice,

dar păstrarea simetriei de oglindă poate fi observată în Fig. 21d, unde sunt prezentate

spectrele electronice ale soluţiei DPH+THF+DCM. În spectrele electronice ale soluţiilor

ternare de tipul DPH+THF+solvent (etanol, benzen şi acetonă) pot fi observate modificările

apărute în structura vibronică. Spectrele de fluorescenţă ale ultimelor trei soluţii prezintă o

lărgire a benzilor spectrale comparativ cu spectrele de absorbţie (Fig. 21 c, e, f), observându-

se în aceste cazuri pierderea simetriei de oglindă. Datorită solubilităţii scăzute a DPH în apă

[83], o practică comună este dizolvarea ei iniţială în THF (înainte de utilizarea sa ca o

fluorofor în mediu biologic apos) [84, 85]. În consecinţă, THF rămâne în sistem şi poate

interacţiona cu DPH într-o manieră dependentă de solvent.

Atingerea echilibrului a fost evaluată urmărind convergenţa către o valoare constantă a

energiilor de interacţiune între perechile de constituenţi ale sistemelor. Figurile 22 prezintă

evoluţia în timp a energiilor de interacţiune electrostatice şi van der Waals între THF-WAT

(Figura 22 a) şi respectiv THF-ETH (Figura 22 b).

Fig. 22 a,b Evoluţia în timp a energiilor de interacţiune electrostatică (Coul-SR) şi van der Waals (LJ-SR) în

cursul echilibrării, între: a) THF-WAT şi b) THF-ETH [74].

Se poate observa că pentru ambele sisteme se atinge o valoare constantă în intervalul

de timp de 10 ns ales pentru echilibrare. Amestecul etanolului cu moleculele de THF este

destul de rapid, atingerea echilibrului realizându-se în mai puţin de 1 ns. Pe de altă parte,

atingerea echilibrului în cazul apei este mai lentă - până la 4 ns - care exprimă, aşa cum va

deveni evident din inspecţia vizuală a traiectoriilor, un proces de organizare structurală a THF

în jurul DPH. Acest lucru este susţinut şi de diferenţele mici de energie ale interacţiunilor

electrostatice şi van der Waals dintre THF - WAT, comparativ cu THF - ETH. Având în

vedere că interacţiunile van der Waals au rază de acţiune limitată comparativ cu cele

electrostatice, această diferenţă mică poate fi explicată prin faptul că moleculele de THF au

tendinţa de a veni în contact unele cu celelalte, în principal în apă. În etanol, THF fiind

dizolvat complet, componenta van der Waals devine dominantă.

Examinarea vizuală a traiectoriilor de dinamică moleculară a arătat, că în cazul

sistemului DPH + THF + WAT moleculele de THF formează spontan un agregat în jurul

moleculei de DPH, obstrucţionând într-o anumită măsură interacţiunea directă cu apa. O mică

parte dintre moleculele de THF este dispersată în apă, neintrând în contact cu DPH (Fig. 23a).

Dimpotrivă, în cazul sistemului DPH +THF+ETH, moleculele de THF sunt complet dizolvate

în etanol fără să prezinte o aparentă structuralizare în jurul moleculelor de DPH (Fig. 23b)

Rezultatele obţinute în simulările de dinamică moleculară sunt în concordanţă cu

spectrele electronice din Fig. 21 a, b şi c.

Page 28: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

25

Fig. 23. Configuraţii instantanee ale sistemelor (a) DPH+THF+WAT şi (b) DPH+THF+ETH la sfârşitul celor 10

ns de simulare [74]. Pentru o bună vizualizare a moleculei de DPH şi pentru o apreciere directă a

modului de distribuţie a componentelor conţinute (apă, etanol şi tetrahidrofuran), celulele de simulare

au fost reprezentate şi în secţiune. (a) - imaginea de sus prezintă celula de simulare cu jumătate din

moleculele de apă eliminate şi rotită pentru a evidenţia agregatul format de THF. (b) - în cazul

sistemului DPH+THF+ETH moleculele de etanol nu au fost reprezentate pentru a releva distribuţia

moleculelor de THF.

Agregatele formate de THF în jurul moleculei de DPH, explică asemănările dintre

spectrele electronice obţinute în cazul soluţiilor formate de DPH cu THF şi în soluţiile DPH +

THF + WAT, la concentraţii mari de apă. Etanolul dispersează moleculele de THF,

determinând pătrunderea moleculelor de ETH în prima sferă de solvatare a DPH (Fig. 23b),

fapt ce are drept consecinţă modificarea spectrelor electronice ale DPH.

IV. 5. d. Concluzii

Măsurătorile spectrale şi simulările de dinamică moleculară au evidenţiat apariţia unor

fenomene de agregare în soluţiile DPH + THF + WAT cu formarea de micele în jurul

moleculelor de DPH. În spectrele electronice ale DPH, simetria de oglindă şi structura

vibronică sunt puternic influenţate de natura solventului. Datele obţinute în acest studiu

sugerează că soluţiile multicomponent de tipul DPH + THF + apă, frecvent utilizate în

protocoalele de marcare fluorescentă ale membranelor biologice, nu sunt omogene.

CAP.V. INTERACŢIUNEA PROBELOR FLUORESCENTE (DPH) CU MEMBRANELE

FOSFOLIPIDICE NESATURATE: STUDIU DE DINAMICĂ MOLECULARĂ

V. 1. Introducere. Obiectivul studiului.

Comportamentul moleculelor DPH inserate în membrane reflectă îndeaproape

proprietăţile mediului local, ca microvîscozitatea şi gradul de ordonare a lanţurilor alchil [86].

Prin urmare, pentru o interpretare riguroasă a datelor experimentale, este necesară cunoaşterea

localizării preferenţiale a acestei probe fluorescente.

După cunoştinţele noastre nu s-a mai realizat nici un studiu de simulare privind

localizarea DPH în interiorul bistraturilor fosfolipidice dinesaturate. Acest lucru este oarecum

neaşteptat având în vedere că majoritatea tipurilor de fosfolipide ce alcătuiesc membranele

biologice sunt sn-1-saturate, sn-2-nesaturate. Lipidele cu ambele lanţuri alchil nesaturate

constituie componente principale în majoritatea membranelor celulare.

Page 29: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

26

Obiectivul acestui studiu a fost de a aduce noi date privind localizarea şi orientarea

preferenţială a moleculei de DPH în bistratul puternic nesaturat format din DOPC, utilizând

simulări de dinamică moleculară (MD).

V. 2. Detalii referitoare la simularile de dinamică moleculară

Au fost efectuate simulări de dinamică moleculară pe două sisteme membranare.

Primul a fost compus dintr-un bistrat complet hidratat de DOPC pur şi al doilea compus dintr-

un bistrat DOPC în care au fost introduse 7 molecule de DPH. Simularea bistratului DOPC

pur a fost realizată pentru comparaţie. Numărul de molecule DPH în sistemul fluorofor /

membrană a fost ales pentru a reflecta condiţiile experimentale care plasează de obicei

raportul DPH / lipide în interiorul unui interval de la 1:500 la 1:100 [87, 88]. Acest studiu este

destinat unui regim de concentraţie mare şi, astfel, a fost stabilită o concentraţie a DPH de

2,43 mol% (7:288) aproape de limita superioară. Pentru a îmbunătăţi eficienţa statistică

limitată de timpul de simulare, a fost ales un raport mare DPH / lipide [86]. După o etapă de

echilibrare de 20 de ns, bistratul pur de DOPC a fost simulat pentru încă 50 ns şi această din

urmă simulare a fost cea luată în considerare atunci când am realizat prelucrările ulterioare de

date. Sistemul DPH + DOPC a fost simulat pentru încă 250 ns pentru a asigura o evaluare

statistică eficientă a mişcărilor de difuzie şi de tip flip-flop ale DPH în interiorul bistratului.

V. 3. Rezultate şi discuţii

Datele rezultate din simulările de dinamică moleculară, au fost analizate având în

vedere următorii parametrii: aria per lipid în prezenţa şi absenţa DPH, profilele de densitate,

parametrii de ordine şi funcţia de distribuţie orientaţională a DPH.

Fig. 2 Reprezentarea bidimensională a energiei libere în planul (z, θ) care dă dependenţa unghiului format de axa

moleculară lungă a DPH, definită ca linia care uneşte centrele de masă ale celor două cicluri benzenice,

şi normala la bistrat a fost obţinută din distribuţia stărilor sistemului în planul (z, θ) [11].

Iniţial, densitatea de stări (histograma stărilor) a fost calculată şi apoi transformată în

conformitate cu formula Boltzmann în variaţii de energie liberă Gibbs:

(1)

în care ΔG este diferenţa de energie liberă Gibbs, kB este constanta Boltzmann, T este

temperatura absolută Pi, j este frecvenţa corespunzătoare intervalului i, j în planul (z, θ) şi

Pmax este frecvenţa maximă pe întregul domeniu al variabilelor z şi θ.

În timpul simulării s-a evaluat aria per lipid (AL) pentru a verifica atingerea stării de echilibru

şi pentru a urmări efectul produs de adăugarea de DPH asupra expansiunii laterale a

membranei (Figura 3).

Page 30: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

27

Fig. 3 Evoluţia ariei per lipid în decursul simulărilor de dinamică moleculară pentru DOPC şi DPH+DOPC [11].

Se poate observa din Figura 3 că aria per lipid nu variază esenţial pe durata simulării,

oscilând în jurul unor valori comparabile pentru ambele sisteme DOPC pur şi DPH+DOPC.

Evaluarea statistică a datelor oferă pentru AL valorile 76,0 Å2/lipid (σ = 1.05, σ este abaterea

standard) pentru DOPC pur şi 76,2 Å2/lipid (σ = 1.2) pentru sistemele DPH + DOPC. Aceste

valori au fost obţinute în simulările la 37 °C (310K) şi se corelează bine cu aria per lipid

determinată experimental, care creşte odată cu temperatura de la 72,4 Å2/lipid la 30 °C la 75,5

Å2/lipid la 45 °C [89]. Abaterea faţă de experiment este sub 3% pentru sistemul DOPC pur,

considerând că AL variază liniar cu temperatura între 30 °C şi 45 °C.

Adăugarea de DPH nu induce alte variaţii vizibile ale ariei/lipid sugerând că efectul

fluoroforului asupra gradului de ordonare ale lanţurilor alchil este minimă la concentraţia

folosită în simulare. Este posibil ca DPH să ocupe cu uşurinţă golurile tranzitorii formate între

lanţurile alchil steric incapabile să se organizeze local datorită prezenţei celor două legături

duble ale DOPC în conformaţia "cis", şi datorită dezordonării inerente a lipidelor nesaturate la

temperatura de simulare de 37 °C, care este cu mult peste temperatura de tranziţie din faza de

gel a DOPC la cristal lichid (-20°C) [90].

Profilul densităţii de masă pentru mai multe componente diferite din bistratul modelat

sunt prezentate în Figura 4. S-a ales pentru DPH reprezentarea funcţiei de distribuţie a

probabilităţii pentru centrul de masă şi nu profilul densităţii masice, datorită dependenţei

acestuia din urmă de orientarea preferenţială a acestei molecule în interiorul bistratului [11].

Maximul densităţii de masă a DOPC se află la 1,27 nm faţă de centrul bistratului. Grupurile

atomice C = C şi COO ale DOPC prezintă densităţi de masă maxime la 0,53 nm şi respectiv

1,34 nm. Maximul probabilitaţii funcţiei P(z) pentru centrul de masă al DPH se află situat la

Fig. 4 Profilul densităţii de masă de-a

lungul normalei la bistratul

fosfolipidic pentru DOPC, apă

şi unele componente

importante ale moleculelor

fosfolipidice. Probabilitatea

funcţiei de distribuţie P(z) a

centrului de masă al

moleculelor DPH relativ la

normala la bistrat si profilurile

de densitate; „z” reprezintă

distanţa faţă de centrul

bistratului .

Page 31: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

28

0,94 nm faţă de jumătatea distanţei dintre grupurile atomice C = C şi COO ale DOPC. Acest

fapt este în concordanţă cu rezultatele experimentale ale lui Kaiser şi London [91] obţinute în

studii de stingere a fluorescenţei ale DPH, care plasează centrul moleculei DPH în intervalul

0,6 şi 1,2 nm faţă de centrul bistratului, în funcţie de metoda de analiză folosită.

Chiar dacă maximum pentru P(z) este situat la o anumită distanţă de centrul

bistratului, probabilitatea de a găsi fluoroforul în spaţiul dintre cele monostraturi ale

membranei este semnificativă. Din Figura 4 rezultă că moleculele de apă pot penetra adânc

bistratul până la nivelul grupării COO, unde pot interacţiona cu moleculele de DPH. De

asemenea, este clar din aceste curbe că DPH ajunge rareori în preajma capetelor polare ale

fosfolipidelor. Orientarea axei moleculare lungi a DPH este un alt parametru important care

poate fi legat de experimentele de fluorescenţă. Acest aspect a fost monitorizat în cursul

simulării şi analizat în cele ce urmează.

Densitatea de probabilitate P(θ) pentru unghiul de înclinare dintre axa lungă a DPH şi

normala la bistrat a fost obţinută din histograma corespunzătoare unghiului θ calculată pe

întreaga durată a simulării şi mediată pe toate moleculele de DPH. Curba obţinută a fost

normalizată utilizând condiţia:

(2)

Două maxime sunt evidente în Figura 5a: unul secundar slab definit la 45º şi celălalt

principal la 90º. Densitatea de probabilitate P (θ) este frecvent exprimată prin funcţia de

distribuţie orientaţională f (θ) prin relaţia:

(3)

Fig. 5 a) Densitatea de probabilitate P(θ) obţinută din simulările de dinamică moleculară şi b) funcţia de

distribuţie orientaţională f(θ) dedusă din ecuaţia (3). În b) datele de simulare (simboluri cerc deschis) au fost

aproximate prin curbe de regresie de tip polinoame Legendre f2(θ), f4(θ), ..., f10(θ) (ecuaţia 4), utilizând modelul

brownian de difuzie rotaţională.

Pentru a compara rezultatele de simulare cu datele experimentale de anizotropie a

fluorescenţei disponibile pentru DOPC, a fost aplicat modelul brownian de difuziune

rotaţională (BRD) [86, 92-95]. S-a urmărit obţinerea parametrilor de ordine <P2> şi <P4>.

Funcţia de distribuţie orientaţională f(θ) a fost calculată din relaţia sa cu P(θ) (relaţia 3).

Datele obţinute din simulare au fost aproximate printr-un proces de regresie neliniară cu

polinoame de tip Legendre de diferite ordine:

Page 32: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

29

(4)

unde k şi n sunt pare. Au fost folosite seriile cu n = 2, 4, ..., 10 termeni, care dau o acurateţe

ce creşte treptat (Figura 5b).

Parametrii de ordine determinaţi <P2> şi <P4> sunt prezentaţi în Tabelul II şi

comparaţi cu valorile experimentale din literatura de specialitate [96].

Tabel II Parametrii de ordine <P2> şi <P4> calculaţi la diferite niveluri de aproximare în urma regresiei cu

polinoame Legendre a funcţiei de distribuţie orientaţională obţinută din procesul de simulare f(θ).

f4(θ) f6(θ) f8(θ) f10(θ) Experimental [96]

<P2> 0.005 0.004 0.003 0.004 0.0

<P4> 0.126 0.153 0.150 0.151 0.15

Se poate observa o corespondenţă bună între predicţia dată de simulare şi experiment.

Aceasta sugerează faptul că orientarea moleculelor DPH în interiorul bistratului de DOPC în

timpul simulării poate reproduce îndeaproape comportamentul real al fluoroforului într-o

membrană nesaturată de DOPC.

Trei bazine, notate cu "P", "S" şi "M", pot fi identificate în acest grafic [11], fiecare

corespunzând unei stări preferenţiale ale DPH în interiorul regiunii lanţurilor alchil. Cel mai

populat dintre ele, "P", este definit de minimul global de energie liberă şi se caracterizează

printr-un unghi de înclinare θ ≈ 90°. Profunzimea medie a centrului de masă a DPH pentru

această populaţie este de aproximativ 1,2 nm de la centrul bistratului, în apropierea şi sub

maximul densităţii grupărilor COO fosfolipidice. O altă populaţie mai puţin reprezentată dar

importantă, este situată în centrul bistratului şi a fost notată cu "M" în Figura 6. Caracteristica

sa specifică este distribuţia largă în evantai a unghiului de înclinare într-un interval cuprins

între aproximativ 20° şi 90°. Unghiul de înclinare la z = 0 a fost găsit a avea valoarea cea mai

probabilă de θ ≈ 50° (simbolul "*" pe suprafaţa de energie liberă).

Cu toate acestea, în centrul bistratului diferenţele de energie liberă în interiorul

domeniului de mai sus depăşesc rareori 1,3 kJ / mol (valoarea fiind extrasă din datele

numerice ale suprafeţei energiei libere) care, la temperaturi normale este sub energia de

agitaţie termică (1 RT = 2,5 kJ / mol; R este constanta universală a gazelor; T este

Fig. 6 Relaţia dintre distanţa de la centrul bistratului

(z) şi unghiul de înclinare θ a DPH în

membrana DOPC, exprimată sub formă de

hartă a energiei libere Gibbs în subspaţiul

definit de (z, θ). Deasupra graficului s-a

reprezentat una dintre foiţele bistratului

pentru o localizare vizuală mai facilă a

minimelor de energie liberă în corelaţie cu

diferitele regiuni ale membranei. (a)

reprezintă intervalul ocupat de regiunea

capului lipidic polar, definită ca lăţimea

curbei de distribuţie a densităţii masice

însumate pentru atomii de fosfor ‘P’ şi azot

‘N’ la jumătate din valoarea maximă (vezi

Figura 4); săgeţile în partea superioară a

figurii marchează maximele profilelor de

densitate pentru grupările C = C şi COO ale

DOPC.

Page 33: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

30

temperatura absolută). Astfel, unghiul de orientare a DPH prezintă variaţii cu diferenţe mici

de probabilitate în intervalul 20° şi 90°. O uşoară preferinţă pentru valoarea de 50° în mijlocul

bistratului şi nu de 90° (paralelă cu planul membranei), indică faptul că interacţiunile van der

Waals sunt suficient de puternice pentru a „menţine” moleculele DPH în apropierea lanţurilor

alchil, având efect opus fenomenelor entropice care ar favoriza partiţionarea în regiunea cu

cel mai mare volum liber. Acest comportament a fost de asemenea observat în studiile de

simulare ale membranelor saturate de DPPC marcate cu DPH [86].

Implicaţiile care ar putea rezulta din datele prezentate mai sus sunt, în principal că

moleculele DPH care sunt orientate paralel cu membrana explorează cu precădere regiunea

lanţurilor alchil în apropierea grupărilor COO ale fosfolipidelor, şi mai puţin centrul

bistratului (deşi ele pot fi încă prezente la acest nivel, dar în cantităţi mai mici). Această

ipoteză trebuie să fie luată în considerare atunci când se interpretează datele experimentale de

fluorescentă a DPH în membranele nesaturate.

Un alt aspect de importanţă practică este faptul că în regiunea apropiată grupărilor

COO ale DOPC, moleculele de DPH pot intra în contact cu apa, care poate pătrunde mai

adânc în stratul hidrofob al lanţurilor alchil în lipidele nesaturate, datorită conformaţiei lor

mai puţin ordonate. Apa este prezentă la această adâncime în interiorul bistratului arătând o

densitate de aproape zece ori mai mică decât în faza volumică, fapt dovedit de profilurile de

densitate din Fig. 4. Preferinţa DPH pentru această regiune poate constitui o explicaţie pentru

stingerea fluorescenţei observată experimental ca fiind mai intensă odată cu creşterea gradului

de nesaturare al fosfolipidelor [96].

Un bazin secundar, notat cu "S" în Fig. 6, poate fi observat în graficul bidimensional

FEL. Aceast minim secundar corespunde unei populaţii de DPH situată la aproximativ 0,8 nm

de la centrul bistratului imediat deasupra legăturii duble C = C. În această regiune unghiul de

înclinare θ în raport cu normala la membrană are o valoare preferenţială de θ ≈ 40 ° şi poate fi

corelată cu profilul P (θ), ca o contribuţie la maximul "S" din Figura 5a. Acest bazin poate fi

asociat cu populaţia de molecule de DPH paralele cu normala bistratului, orientare întâlnită de

obicei când DPH se inseră în membrane lipidice saturate. În cazul acestora din urmă unghiul θ

este de aproximativ 25° [86] datorită lanţurilor alchil mai ordonate ale acestor fosfolipide.

V. 4. Concluzii

Scopul acestui studiu a fost de a descrie interacţiunea probei fluorescente de DPH cu

membranele fosfolipidice nesaturate (DOPC) folosind simulări de dinamică moleculară.

Deşi există în literatură numeroase informaţii provenite din studii de simulare şi

referitoare la interacţiunea DPH cu membrane lipidice saturate [97], în ceea ce priveşte

interacţia cu membranele înalt nesaturate datele sunt încă contradictorii şi supuse dezbaterilor.

Simulările de dinamică moleculară pot aduce lămuriri în special asupra localizării şi orientării

DPH în interiorul matricei lipidice cu rezoluţie spaţială şi temporală imposibil de atins în

tehnicile experimentale curente. Parametrii calculaţi ai bistratului cum ar fi aria/lipid şi în

cazul bistratului cu fluorofor (DOPC+DPH) parametrii de ordine P2 şi P4 au prezentat o bună

concordanţă cu valorile experimentale cunoscute care validează modelele folosite aici. O

populaţie reprezentativă de molecule DPH a fost localizată în regiunea lanţurilor alchil a

bistratului imediat sub interfaţa DOPC/APĂ, având un unghi de înclinare de aproximativ 90

grade faţă de normala bistratului. Acest lucru poate da o explicaţie pentru stingerea

fluorescenţei observată pentru membrane lipidice nesaturate.

Concluziile care se desprind din acest studiu de simulare sunt folositoare pentru

interpretarea datelor experimentale de anizotropie a fluorescenţei şi pentru studii viitoare de

modelare moleculară.

Page 34: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

31

CAP. VI. CONTRIBUŢII LA OPTIMIZAREA REACŢIILOR DE OBŢINERE A UNOR

COMPUŞI : A. cu activitate tuberculostatică (Tiosemicarbazide); B. cu acţiune antitumorală

(derivaţi Glutaminici)

Obiectivele Studiului

Optimizarea reacţiilor şi stabilirea randamentului maxim pentru reacţiile de obţinere a

patru noi 1,4-disubstituienţi tiosemicarbazidici şi a derivaţilor N-[p-(R)-benzoil]-L-

glutaminici (I-IV). Structura chimică a compuşilor obţinuţi a fost analizată prin metode

spectrale (FTIR, 1H-RMN,

13C-RMN, SM) şi chimice.

Procese de optimizare - experiment „32

factorial”

Atunci când sunt preparaţi compuşii tiosemicarbazidici (II-VII) şi derivaţii N-[p-(R)-

benzoil]-L-glutaminici (I-IV), timpul de reacţie şi temperatura sunt factori care influenţează

major randamentul reacţiei. În aceste condiţii randamentul reacţiei a fost considerat ca fiind

indicator de optimizare, iar timpul de reacţie X1 = T (exprimat în ore pentru reacţiile de

obţinere ale compuşilor tiosemicarbazidici respectiv minute, pentru reacţiiile de obţinere ale

derivaţilor glutaminici) şi temperatura X2 = T (exprimată în oC) au fost considerate variabile

relevante. Trei valori ale fiecărui sistem de variabile au fost considerate într-un experiment 32

factorial [98-102] cu scopul de a determina cele mai bune condiţii de desfăşurare ale reacţiilor

studiate. În titlul experimentului factorial, 3 este numărul nivelelor de variaţie pentru fiecare

variabilă relevantă a sistemului iar 2 reprezintă numărul variabilelor relevante luate în

considerare în aceste studii. Programul factorial permite evitarea unor experimente laborioase

şi de durată pentru determinarea coeficienţilor de modelare a0, ai (i=1,2) şi aij (i, j=1,2) , din

relaţia (1), numiţi în general coeficienţi de regresie. Relaţia (1) trebuie aplicată fiecărui

compus studiat ţinând cont de datele experimentale:

21122222

211122110 xxaxaxaxaxaa (1)

Pentru a obţine termenii pătratici ortogonali randamentul reacţiei în cele 9N experimente a

fost mediat:

N

N

ii

1

(2)

Folosind relaţia (1), condiţiile de ortogonalitate şi valorile coeficienţilor de regresie

0a , ;a i,i 21,i,i şi ;a j,i 21,j,i , media randamentelor reacţiilor poate fi scrisă ca [98, 101]:

221103

2aaa (3)

Din (1) şi (3), obţinem:

3

2

3

2 2222

211121122211 xaxaxxaxaxa (4)

În relaţia (1), 1x şi 2x sunt variabile adimensionale pentru timpul de reacţie (i = 1) şi

pentru temperatura reacţiei (i = 2). Ele sunt definite prin:

2,1

i

X

XXx

i

iii (5)

Variabilele adimensionale pot fi convertite în variabile reale folosind relaţia:

2,1 iXxXX iiii (6)

În relaţiile (2) and (3), au fost făcute următoarele notaţii:

Page 35: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

32

2

minmax iii

XXX

(7)

pentru mijlocul domeniului variabilelor, şi

minmax2 iii XXX (8)

pentru lungimea domeniului de variaţie.

Variabilele adimensionale 1x 2x sunt în general definite pentru a facilita optimizarea.

Pentru variabilele reale ale sistemului, tX 1 şi TX 2 , care pot lua valori în intervalul:

max1min11 , XXX şi max2min22 , XXX , (9)

variabilele relevante adimensionale 1x şi 2x prezintă valori limită corespondente:

2,1;1; minmin

min

ix

X

XXx i

i

iii (10)

2,1;1; maxmax

max

ix

X

XXx i

i

iii (11)

După determinarea experimentală a masei, mexp, randamentul reacţiei poate fi aproximat

folosind relaţia (12):

.

.exp

calcm

m (12)

În (12) mcalc este masa calculată a compusului corespondent pentru aceeaşi cantitate a

precursorului iniţial ca în experiment.

Coeficienţii de regresie a0, ai( i=1,2) şi aij(i, j=1,2) pot fi evaluaţi prin metoda celor

mai mici pătrate [98, 101, 103]. Valorile coeficienţilor de regresie pot indica gradul influenţei

parametrului corespunzător, iar semnul lor indică o creştere (+) sau descreştere (-) a

randamentului reacţiei determinat de către parametrul corespunzător (sau de influenţa

conjugată a doi parametri).

VI. A. 3. Rezultate obţinute în urma procesului de optimizare al reacţiilor de obţinere

ale derivaţilor tiosemicarbazidici

Valoarea medie a randamentului reacţiei în centrul domeniului de variaţie a fost

calculată cu formula (2) şi este prezentată pe ultima coloană a Tabelului III.

Tabel III Randamentul reacţiei in centrul domeniului de variaţie, media randamentului; abaterea medie pătratică

şi precizia.

Compusul 1 2 3 S P

II 81.16 81.75 81.50 0.0026 0.017 81.47

III 86.90 87.05 87.20 0.0225 0.050 87.05

IV 79.01 79.50 79.20 0.0025 0.017 79.24

V 80.50 80.69 80.92 0.0623 0.083 80.70

VI 79.56 79.80 79.98 0.0444 0.070 79.78

VII 80.10 80.15 80.80 0.1325 0.121 80.35

Page 36: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

33

Fig.6 a),b) Reprezentarea tridimensională a randamentelor reacţiilor de obţinere a compuşilor a) IV şi b) VII, vs.

variabilele adimensionale timp şi temperatură [104].

Tabel V Valorile extreme ale variabilelor adimensionale relevante şi radamentele reacţiilor

Compusul x1extrem x2extrem ηextrem

II 0.116 0.084 81.482

III 0.186 0.117 87.127

IV 0.027 -0.029 78.962

V 0.084 -0.077 80.569

VI 0.010 -0.021 79.810

VII 0.003 0.029 80.081

Cea mai mare valoare pentru randamentul reacţiei a fost obţinută pentru compusul IV, cel mai

activ din punct de vedere al acţiunii tuberculostatice.

VI. A. 5. Concluzii

A fost folosit experimentul 32 factorial în studii pentru obţinerea celor mai eficiente

condiţii de reacţie pentru compuşii II-VI urmăriţi în această lucrare. Cea mai mare valoare a

randamentului reacţiei s-a obţinut pentru compusul IV care este cel mai activ împotriva

Mycobacterium tuberculosis [104]. Putem concluziona că substanţele chimice prezentate în

acest studiu sunt precursori promiţători pentru medicaţia antituberculoasă.

VI. B. 3. Rezultate obţinute în urma procesului de optimizare al reacţiilor de obţinere

ale derivaţilor N-[p-(R)-benzoil]-L-glutaminici (I-IV)

Tabel XIII. Valorile extreme ale randamentului reacţiei );( ,2,1 ee xx şi coordonatele adimensionale

corespunzătoare );( ,2,1 ee xx

Compusul ex ,1 ex ,2 );( ,2,1 ee xx

I 0.1 -0.02 57.46

II 0.04 0 79.58

III 0.06 0.09 59.29

IV 0.06 0 76.13

a) b)

Page 37: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

34

Dependenţa randamentului reacţiei de variabilele adimensionale este ilustrată în

Figurile 10 a) şi b) pentru compuşii II şi IV (pentru care s-au obţinut cele mai mari valori ale

randamentului) [105].

VI. B. 5. Concluzii

Unele studii preliminare relevat influenţa temperaturii şi a timpului de reacţie asupra

randamentului reacţiei pentru obţinerea compuşilor I-IV. Folosind procesele de optimizare am

obţinut compuşii studiaţi cu un randament convenabil. Acest studiu poate fi de folos în

obţinerea derivaţilor biologic activi ai N-[p-(R)-benzoil]-L-glutaminei în cele mai bune

condiţii. Studiul biologic a demonstrat faptul că derivaţii I-IV nu influenţează activitatea

lipazei şi amilazei. Tripsina este uşor influenţată în activitatea sa. Compuşii I-IV nu prezintă o

influenţă negativă asupra activităţii enzimelor testate. Prin urmare, face posibilă administrarea

lor pe cale orală. Importanţa farmacologică a compuşilor studiaţi impune stabilirea condiţiilor

optime pentru sinteza lor în procesul de microproducţie.

VII. Concluzii generale

Contribuţii proprii. Elemente de originalitate.

Rezultatele obţinute în teza de doctorat suţin faptul că metodele spectrale şi metodele de

simulare reprezintă instrumente complexe de analiză la nivel molecular şi submolecular, ce

pot oferi informaţii cu sensibilitate crescută asupra parametrilor fizici şi biofizici caracteristici

structurilor de tip membranar.

Cap. III. Influenţa temperaturii şi concentraţiei asupra gradului de ordonare al

structurilor de tip membranar

III. 1. Influenţa temperaturii asupra unor structuri de tip membranar

Scopul studiului prezentat în subcapitolul III.1 s-a axat pe utilizarea tehnicii de

spectrometrie FTIR pentru atribuirea centrilor activi din structura poliamidei 6 anionice

(Nylon 6) în vederea utilizării acestui polimer ca substrat pentru substanţe cu proprietăţi

biocidale. Datorită structurii primare (legăturile polipeptidice formate de AA) şi modalităţilor

de organizare conformaţională (spaţială) caracteristice proteinelor, acestea pot fi considerate

polimeri naturali.

a) b)

Page 38: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

35

­ Am urmărit influenţa temperaturii asupra benzilor de absorbţie a amidei A, amidei I şi

amidei II în intervalul 20-180C. Aceste trei benzi intense de absorbţie în IR ale poliamidei

6 sunt influenţate de interacţiunea legăturilor de hidrogen.

­ Am identificat o relaţie directă între aranjarea legăturilor de hidrogen şi modurile

vibraţionale respective atribuite în IR comparativ cu spectre ale Nylon 6 date în literatură.

La frecvenţa cea mai joasă a amidei I, apare cea mai puternică legătură de hidrogen ce

implică banda amidică C=O şi cea mai mică densitate electronică de-a lungul C=O.

Maximul benzii amidice II se deplasează spre frecvenţe mari când hidrogenul se leagă

puternic.

­ Am fost evidenţiate benzile caracteristice care sunt asociate cu formele mezomorfe - şi γ-

cristaline ale filmelor polimerice. Banda corespunzătoare legăturii de hidrogen N-H cu

vibraţia de întindere la 3307 cm-1

în faza γ a poliamidei, este mai slabă decât cea asociată

fazei deoarece legătura de hidrogen N-H este modificată.

­ În urma tratamentului termic a apărut o nouă bandă la 795 cm-1

iar în intervalul 1433-1500

cm-1

s-a observat o creştere a absorbanţelor. Acest fapt indică o mişcare conformaţională

datorată creşterii temperaturii asociată cu modificări în interiorul polimerului.

­ Am corelat modificările apărute în spectrele FTIR cu morfologia de suprafaţă a filmelor

poliamidice 6, determinată folosind SEM. Imaginile SEM confirmă faptul că structura

polimerului include atât regiuni amorfe cât şi cristaline.

­ Nu am putut stabili originea maximului de la 795 cm-1

prezent în spectrul FTIR la 170-180 C, dar acesta nu poate fi atribuit benzii de balansare CH2.

­ Spectrul FTIR a ilustrat benzi caracteristice ale grupurilor NH-CO şi ale formelor şi γ-

cristaline ale polimerului.

­ Tratamentul termic influenţează poziţia şi intensitatea benzilor de absorbţie ale poliamidei

6 datorită modificării cristalinităţii sale.

­ Rezultatele obţinute sunt utile pentru caracterizarea poliamidelor ca suport pentru materiale

biocide. Centrul activ NH este important pentru ataşarea compuşilor bioactivi în lanţul

poliamidic prin tratarea suprafeţei sau prin modificări chimice ale polimerului.

III. 2 Studiul tranziţiilor de fază termotropice în cristale lichide

Obiectivul studiului din subcapitolul III.2 a fost evidenţierea influenţei temperaturii

asupra echilibrului între fazele de ordine şi dezordine ale esterului poli-(fenil-metacrilic) al

acidului cetiloxibenzoic (PPMAECOBA) în tetraclorometan (TCM) prin analiza spectrelor

FTIR ale lanţurilor alchil din compuşii amfiliofilici.

­ Au fost determinate proprietăţile anizotropice ale PPMAECOBA în TCM care depind de

supraordonarea moleculară a catenelor laterale ale macromoleculelor.

­ Apariţia organizării supramoleculare, în amestecul de PPMAECOBA cu TCM se datorează

în mare parte interacţiunilor dipolare dintre grupările laterale. Direcţia catenei principale

nu este determinată de forţele interne, astfel încât acestea formează „ghemuri” din care ies

catenele laterale orientate prin forţe dipolare. Agitaţia termică poate dezorganiza alinierea

catenelor laterale prin interacţiuni colective. Aceste sisteme sunt similare cu cele formate

în modelele membranare sau în membranele biologice.

­ Influenţa temperaturii asupra gradului de ordine a fost evidenţiată de vibraţiile de valenţă

ale grupării CH2 din intervalul 2800-3000 cm-1

al spectrului FTIR.

­ Pentru cristalul lichid liotropic PPMAECOBA în TCM a fost evidenţiată o tranziţie

principală de fază însoţită de o creştere a dezordinii în lanţurile secundare lungi.

­ Au fost stabilite valorile corespunzătoare tranziţiei principale de fază.

­ Spectrometria FT-IR oferă posibilitatea de a determina coordonatele tranziţiei principale de

fază ale cristalului lichid liotropic.

Page 39: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

36

III. 3 Studiul influenţei concentraţiei şi a câmpurilor electromagnetice asupra

bistraturilor de dipalmitoilfosfatidilcolină (DPPC).

În acest subcapitol am dezvoltat şi utilizat o nouă strategie de simulare structurală, prin

reproducerea structurii interne a DPPC la nivel macroscopic, luând în considerare

interacţiunile dintre microcomponente şi cele cu câmpurile interne şi externe (de test). În

cadrul acestui studiu dinamic, am reconstruit modul de organizare al structurii care parcurge

mai multe transformări de fază odată cu creşterea temperaturii (18 - 52 °C), în scopul stabilirii

influenţei diverşilor parametri interni şi externi.

­ Prin simulare (utilizând programul HFFS) am determinat componentele tensorului

permitivitate electrică al dipalmitoilfosfatidilcolinei (DPPC) hidratate în fază de cristal

lichid.

­ Am analizat comportamentul complex în câmpuri electromagnetice de înaltă frecvenţă (ÎF)

şi microunde al bistraturilor ordonate smectic ale acestui lipid biologic.

­ Studiul materialului prin simulare a oferit posibilitatea modificării diverşilor parametri

fizici şi geometrici la nivelul structurii (concentraţiile constituenţilor în soluţie, ionii

tampon, temperatura) prin care putem controla variaţiile permitivităţii electrice la scară

microscopică şi implicit permitivitatea efectivă a cristalului lichid biologic la scară

macroscopică.

­ Temperatura influenţează permitivitatea electrică, deorece în intervalul de temperatură 21

şi 42 °C au loc mai multe transformări de fază în DPPC, fiecare fază prezentând ordine

internă diferită.

­ Procesul de autostructurare al membranei în apă este condiţionat de o concentraţie de prag

a apei în DPPC. La valori mai mari ale acestei concentraţii structura de tip bistraturi poate

să dispară. La un raport molecular de peste 120:1 (apă:DPPC), apa în exces are ca efect

ruperea bistratului.

­ Faza de cristal lichid a soluţiei de DPPC în apă, întâlnită la temperaturi de peste 42 °C şi

pentru un raport molecular apă/DPPC de ca. 30:1 - 100:1, prezintă o structură

multilamelară relativ periodică care aminteşte de un cristal lichid smectic, dar unul atipic.

­ Valoarea de prag a raportului molecular apă/ DPPC pentru ca structura să prezinte

ordonare de cristal lichid cu periodicitate lamelară relativ constantă este de 82:1.

­ Metoda de simulare a pus în evidenţă înaltul grad de neuniformitate al valorilor

permitivităţii paralele, determinate de-a lungul structurii multilamelare, valori urmărite pe

direcţie perpendiculară pe bistraturile de DPPC în soluţie apoasă (Oz). Fiecare subgrup

molecular prezintă o puternică individualitate (capurile polare, lanţurile alcanice), iar

tranziţia valorilor parametrilor de material corespunzători este abruptă. Maximele

permitivităţii corespunzătoare zonelor cu capuri polare ale moleculelor de DPPC

evidenţiază proprietăţi de bun izolator în zonele respective, zone care se comportă ca o

barieră de conductivitate a membranei apoase. Zonele relativ extinse de permitivitate

scăzută corespunzătoare miezurilor hidrocarbonice din interiorul bistraturilor de lipid

indică faptul că proprietăţile dielectrice nu sunt atât de bune în interiorul bistraturilor.

­ Permitivitatea transversală, calculată după o direcţie paralelă cu bistraturile, prezintă

fluctuaţii aleatorii în jurul unei valori medii caracteristice pentru fiecare plan paralel cu

bistraturile. Fluctuaţiile sunt mai puternice în zona din mijlocul miezurilor hidrocarbonice

din interiorul bistraturilor, acolo unde "dezordinea" cozilor alcanice este mai pronunţată.

­ Posibilitatea modificării simultane a parametrilor interni şi externi, recomandă metoda de

simulare pentru analiza în timp real a structurilor de tip membranar.

­ Rezultatele obţinute permit stabilirea unor direcţii de studiu viitoare, privind ordonarea

structurală a DPPC în timpul tranziţiilor de fază şi anizotropia dinamică (datorată mişcării

cozilor hidrocarbonice), folosind metoda de simulare pusă la punct în acest studiu.

Page 40: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

37

Cap. IV. 1,6-difenil-1,3,5,-hexatriena (DPH) - marker fluorescent utilizat în evaluarea

fluidităţii structurilor de tip membranar

Studiul influenţei naturii solventului asupra SEA ale DPH

Scopul acestui studiu este de a analiza interacţiunile intermoleculare ale DPH cu un

număr mare de solvenţi pe baza spectrelor de absorbţie electronică ale soluţiilor ternare de tip

DPH + THF + solvent. Structura moleculei de 1,6-difenil-1,3,5,-hexatrienă (DPH) permite

orientarea acesteia de-a lungul lanţurilor de hidrocarburi ale fosfolipidelor din membranele

biologice. În această poziţie, DPH este fluorescentă, însă aproape de capul hidrofil

fosfolipidic fluorescenţa DPH este redusă. Anularea fluorescenţei DPH în apă şi sensibilitatea

sa la mediu (în special la natura solventului), recomandă DPH ca senzor pentru alinierea

lanţurilor de acizi graşi.

Am utilizat programul HyperChem pentru:

- construcţia moleculei DPH, parametrizarea şi optimizarea geometriei moleculare;

- calculul parametrilor moleculari şi electro-optici ai DPH (momentul dipolar,

polarizabilitatea, energiile celui mai de jos orbital molecular neocupat (LUMO) şi celui

mai înalt ocupat orbital molecular (HOMO), tăria chimică (eV), indicele electrofil

(eV), caracteristicile energetice)

Din aceasta analiză a rezultat că:

- DPH este o moleculă nepolară, dar cu o valoare apreciabilă a polarizabilităţii în starea

electronică fundamentală;

- parametrii moleculari indică un potenţial de ionizare relativ scăzut a DPH;

- distribuţia electronică în orbitalii HOMO şi LUMO demonstrează posibilitatea unei

torsiuni moleculare, inducând posibilitatea unei tranziţii între stările excitate S1 şi S2, care

ar putea determina stingerea fluorescenţei.

Calculele de mecanică cuantică ale proprietăţilor structurale şi electro-optice ale DPH

realizate cu HyperChem 8.0.6 au fost corelate cu datele spectrale.

Am înregistrat SEA şi am stabilit numerele de undă în maximele benzilor vibronice de

absorbţie ale DPH în 34 de solvenţi. Din analiza datelor obţinute rezultă că:

­ numerele de undă ale maximelor vibronice ale benzii A ale DPH depind de natura

solventului producând deplasari spectrale;

­ deplasările spectrale nu depind de permitivitatea electrică a solventului; acest fapt fiind

explicat prin valoarea foarte mică a momentului de dipol electric şi dovedeşte că, prin

excitaţie, momentul de dipol electric al DPH nu se modifică semnificativ;

­ polarizabilitatea moleculară este crescută de excitaţie şi scade odată cu numărul de

vibraţii ale nivelului electronic excitat.

Din reprezentările grafice ale frecvenţelor în maximele benzilor vibronice ale DPH a rezultat

o foarte bună corelare (după prima bisectoare a figurilor) între valorile calculate şi cele

experimentale.

Spectre electronice de fluorescenţă (SEF) ale DPH în soluţii

Urmând acelaşi protocol de preparare a probelor am urmărit influenţa naturii

solventului în spectrele de fluorescenţă ale DPH.

Am înregistrat SEA şi SEF stabilind numerele de undă ale maximurilor de absorbţie,

fluorescenţă şi ale tranziţiei electronice 0-0 ale DPH în 20 de solvenţi diferiţi. În cazul

spectrelor de absorbţie dependenţa este liniară, deoarece în soluţiile DPH predomină

interacţiunile de dispersie. Abateri mari de la o dependenţă liniară au fost evidenţiate pentru

spectrele de emisie, în care deplasările spectrale sunt mai puţin sensible la natura solventului.

- Numerele de undă în maximele benzilor vibronice ale DPH depind de natura solventului

prin funcţia de dispersie. Acest fapt arată că forţele de orientare-inducţie şi polarizare sunt

mai mici decât cele dispersive în soluţiile cu DPH.

Page 41: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

38

- Din dependenţa deplasării spectrale de funcţia de dispersie, a fost estimată

polarizabilitatea electrică în starea excitată a DPH. Rezultă faptul că polarizabilitatea

electrică a molecule de DPH creşte prin excitare.

- Numerele de undă corespunzătoare tranziţiei 0-0 depind numai de funcţia de dispersie a

solvenţilor.

În aceste studii a fost relevată prevalenţa forţelor de dispersie în soluţiile ternare ale DPH.

Caracteristici remarcabile ale spectrelor electronice ale DPH în funcţie de natura

solventului

În acest subcapitol sunt prezentate caracteristicile unor soluţii standard de DPH

realizate prin utilizarea protocolului pentru urmărirea fluidităţii membranei celulare. Acestea

au fost analizate în scopul de a explica deplasarea remarcabilă observată în spectrele

electronice (absorbţie şi fluorescenţă) ale DPH în diferiţi solvenţi. Soluţiile ternare DPH +

THF + solvent, au fost evaluate spectroscopic (absorbţie şi fluorescenţă) şi pot constitui

alternative în experimentele de marcare fluorescentă ale membranelor. Simulările de dinamică

moleculară ale amestecului DPH + THF în apă şi în etanol au fost efectuate cu scopul de a

obţine imagini la scală atomică, referitoare la modul de structurare a solventului în jurul

moleculei de DPH, în prezenţa de THF.

Rezultatele obţinute permit desprinderea următoarelor concluzii:

- În cazul sistemului DPH + THF + apă moleculele de THF formează spontan un agregat în

jurul moleculei de DPH, obstrucţionând interacţiunea directă cu apa. O mică parte dintre

moleculele de THF este dispersată în apă, neintrând în contact cu DPH.

- Agregatele formate de THF în jurul moleculei de DPH, explică asemănările dintre

spectrele electronice obţinute în cazul soluţiilor formate de DPH cu THF şi în soluţiile

DPH + THF + apă, la concentraţii mari de apă.

- Etanolul dispersează moleculele de THF, determinând pătrunderea moleculelor de ETH în

prima sferă de solvatare a DPH, fapt ce are drept consecinţă modificarea spectrelor

electronice ale DPH.

- În spectrele electronice ale DPH, simetria de oglindă şi structura vibronică sunt puternic

influenţate de natura solventului.

- Datele obţinute în acest subcapitol sugerează că soluţiile multicomponent de tipul DPH +

THF + apă, frecvent utilizate în protocoalele de marcare fluorescentă ale membranelor

biologice, nu sunt omogene.

Cap.V. Interacţiunea probelor fluorescente (DPH) cu membranele fosfolipidice

Obiectivul acestui studiu a fost de a aduce noi date privind localizarea şi orientarea

preferenţială a moleculei de DPH în bistratul puternic nesaturat format din DOPC, utilizând

simulări de dinamică moleculară (MD). După cunoştinţele noastre nu s-a mai realizat nici un

studiu de simulare privind localizarea DPH în interiorul bistraturilor fosfolipidice binesaturate.

Acest lucru este oarecum neaşteptat având în vedere că majoritatea tipurilor de fosfolipide ce

alcătuiesc membranele biologice sunt sn-1-saturate, sn-2-nesaturate. Comportamentul

moleculelor DPH inserate în membrane reflectă îndeaproape proprietăţile mediului local, ca

microvîscozitatea şi gradul de ordonare a lanţurilor alchil. Datele rezultate din simulările de

dinamică moleculară, au fost analizate având în vedere următorii parametrii: aria per lipid în

prezenţa şi absenţa DPH, profilele de densitate, parametrii de ordine şi funcţia de distribuţie

orientaţională a DPH. În timpul simulării am evaluat aria per lipid (AL) pentru a verifica

atingerea stării de echilibru şi pentru a urmări efectul produs de adăugarea de DPH asupra

expansiunii laterale a membranei. Rezultatele obţinute susţin următoarele concluzii:

- Evaluarea statistică a AL pentru DOPC pur şi pentru sistemele DPH + DOPC şi se

corelează bine cu aria per lipid determinată experimental. Abaterea faţă de experiment

este sub 3% pentru sistemul DOPC pur.

Page 42: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

39

- Adăugarea de DPH nu induce alte variaţii vizibile ale ariei per lipid sugerând că efectul

fluoroforului asupra gradului de ordonare ale lanţurilor alchil este minimă la concentraţia

folosită în simulare.

- Am ales pentru DPH reprezentarea probabilităţii funcţiei de distribuţie pentru centrul de

masă şi nu profilul densităţii masice, datorită dependenţei acestuia din urmă de orientarea

preferenţială a acestei molecule în interiorul bistratului.

- Din reprezentarile P(z) rezultă că moleculele de apă pot penetra adânc bistratul până la

nivelul grupării COO, unde pot interacţiona cu moleculele de DPH şi că DPH ajunge

rareori în preajma capetelor polare ale fosfolipidelor.

- Corespondenţa bună între predicţia dată de simulare şi experiment, sugerează faptul că

orientarea moleculelor de DPH în timpul simulării reproduce comportamentul real al

acestora într-o membrană nesaturată de DOPC şi validează modelele folosite.

- Rezultatele prezentate aici susţin dependenţa orientării DPH în funcţie de regiunea

specifică a lanţurilor alchil explorată de fluorofor.

- Moleculele de DPH care sunt orientate paralel cu membrana explorează cu precădere

regiunea lanţurilor alchil în apropierea grupărilor COO ale fosfolipidelor, şi mai puţin

centrul bistratului (deşi ele pot fi încă prezente la acest nivel, dar în cantităţi mai mici).

- O populaţie reprezentativă de molecule DPH a fost localizată în regiunea lanţurilor alchil

a bistratului imediat sub interfaţa DOPC/apă, având un unghi de înclinare de aproximativ

90 grade faţă de normala bistratului. Acest lucru poate da o explicaţie pentru stingerea

fluorescenţei observată pentru membrane lipidice nesaturate.

Concluziile care se desprind din acest studiu de simulare sunt folositoare pentru

interpretarea datelor experimentale de anizotropie a fluorescenţei şi pentru studii viitoare de

modelare moleculară.

CAP. VI. Contribuţii la optimizarea reacţiilor de obţinere a unor compuşi:

A. cu activitate tuberculostatică (Tiosemicarbazide)

În cadrul experimentelor s-a constatat faptul că randamentul reacţiilor de obţinere a

compuşilor depinde de durata reacţiei şi de temperatura la care are loc aceasta.

- În modelul model matematic ales a fost propusă o dependenţă a randamentului reacţiei de

variabilele adimensionale.

- Au fost stabilite dependenţele randamentului reacţiilor studiate ca funcţie de durata şi

temperatura reacţiilor.

- Au fost reprezentate graficele tridimensionale ale randamentului în funcţie de cei doi

parametri semnificativi: durata reacţiei şi temperatura.

- Cea mai mare valoare a randamentului reacţiei s-a obţinut pentru compusul IV care este

cel mai activ împotriva Mycobacterium tuberculosis. Putem concluziona că substanţele

analizate în acest subcapitol sunt precursori promiţători pentru medicaţia

antituberculoasă.

B. cu acţiune antitumorală (derivaţi Glutaminici)

- Cele mai mari valori ale randamentului reacţiei s-au obţinut pentru compuşii II şi IV.

- A fost studiată influenţa derivaţilor glutaminici I-IV asupra enzimelor digestive tripsina,

lipaza şi amilaza în cazul administrării lor pe cale orală.

- Studiul biologic a demonstrat faptul că derivaţii I-IV nu influenţează activitatea lipazei şi

amilazei. Tripsina este uşor influenţată în activitatea sa.

- Compuşii I-IV nu prezintă o influenţă negativă asupra activităţii enzimelor testate. Prin

urmare, face posibilă administrarea lor pe cale orală. Importanţa farmacologică a

compuşilor studiaţi impune stabilirea condiţiilor optime pentru sinteza lor în procesul de

microproducţie.

Page 43: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

Bibliografie selectivă

1. Singer, S.J., Nicolson, G.L., The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 1972.

175(4023): p. 720-31.

2. Engelman, D.M., Membranes are more mosaic than fluid. Nature, 2005. 438(7068): p. 578-80.

3. Marrink, S.J., de Vries, A.H., Tieleman, D.P., Lipids on the move: simulations of membrane pores,

domains, stalks and curves. Biochim Biophys Acta, 2009. 1788(1): p. 149-68.

4. Nagle, J.F., Theory of lipid monolayer and bilayer chain-melting phase transitions. Faraday Discuss Chem

Soc, 1986(81): p. 151-62.

5. Sun, W.J., Tristram-Nagle, S., Suter, R.M., Nagle, J.F., Structure of the ripple phase in lecithin bilayers.

Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(14): p. 7008-12.

6. Rusu, V., Baran, T., Brănişteanu, D.D., Biomembrane şi patologie. Vol. I 1988, Bucureşti: Ed. Medicală.

27-62, 144-175, 176-178, 402-407.

7. Marguet, D., Lenne, P.F., Rigneault, H., He, H.T., Dynamics in the plasma membrane: how to combine

fluidity and order. EMBO J, 2006. 25(15): p. 3446-57.

8. Lenaz, G., Fato, R., Baracca, A., Solaini, G., Parenti Castelli, G., Rabbi, A., Dynamics of biological

membranes. Ann Ist Super Sanita, 1988. 24(1): p. 9-21.

9. Mainali, L., Feix, J.B., Hyde, J.S., Subczynski, W.K., Membrane fluidity profiles as deduced by

saturation-recovery EPR measurements of spin-lattice relaxation times of spin labels. Journal of Magnetic

Resonance, 2011. 212(2): p. 418-425.

10. Sorensen, E.B., Fluorescence Polarization to Evaluate the Fluidity of Natural and Reconstituted

Membranes, in Fluorescence Studies on Biological Membranes, H.J. Hilderson, Editor. 1988, Springer

US. p. 159-191.

11. Hurjui, I., Neamțu, A., Dorohoi, D.O., The interaction of fluorescent DPH probes with unsaturated

phospholipid membranes: A molecular dynamics study. Journal of Molecular Structure, 2013. 1044(0): p.

134-139.

12. Eisinger, J., Membrane Fluidity and Diffusive Transport, in Fluorescent Biomolecules, D. Jameson, and G.

Reinhart, Editors. 1989, Springer US. p. 151-171.

13. de Almeida, R.F.M., Fedorov, A., Prieto, M., Sphingomyelin/Phosphatidylcholine/Cholesterol Phase

Diagram: Boundaries and Composition of Lipid Rafts. Biophysical Journal, 2003. 85(4): p. 2406-2416.

14. Lonnfors, M., Doux, J.P.F., Killian, J.A., Nyholm, T.K.M., Slotte, P., Sterols Have Higher Affinity for

Sphingomyelin than for Phosphatidylcholine Bilayers even at Equal Acyl-Chain Order. Biophysical

Journal, 2011. 100(11): p. 2633-2641.

15. Feigenson, G.W., Phase diagrams and lipid domains in multicomponent lipid bilayer mixtures.

Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 2009. 1788(1): p. 47-52.

16. Marguet, D., Lenne, P.F., Rigneault, H., He, H.T., Dynamics in the plasma membrane: how to combine

fluidity and order. Embo Journal, 2006. 25(15): p. 3446-3457.

17. Visser, N.V., Hink, M.A., Borst, J.W., van der Krogt, G.N.M., Visser, A.J.W.G., Circular dichroism

spectroscopy of fluorescent proteins. Febs Letters, 2002. 521(1-3): p. 31-35.

18. Marrink, S.J., Lindahl, E., Edholm, O., Mark, A.E., Simulation of the spontaneous aggregation of

phospholipids into bilayers. Journal of the American Chemical Society, 2001. 123(35): p. 8638-8639.

19. Bakhshiev, N., Opt. i Spektroskopiya 10, 717 (1961). Opt. Spectry, 1961. 10: p. 379.

20. Bakhshiev, N., Universal intermolecular interactions and their effect on the position of the electronic

spectra of molecules in two-component solutions. VII. Theory (general case of an isotropic solution).

Optics and Spectroscopy, 1964. 16: p. 446.

21. Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy: CD-ROM. 2006, Springer.

22. Siebert, F., Hildebrandt, P., Introduction, in Vibrational Spectroscopy in Life Science. 2007, Wiley-VCH

Verlag GmbH & Co. KGaA. p. 1-10.

23. Dorohoi, D.O., Elemente de Fizică şi Biofizică. 2003, Iaşi: Ed. Tehnică, Știinţifică şi Didactică.

24. Schaeberle, M.D., Levin, I.W., Lewis, E.N., in Infrared and raman spectroscopy of biological materials,

H.-U. Gremlich, and B. Yan, Editors. 2001, Marcel Dekker: New York; Basel. p. 231.

25. Dorohoi, D., Optica: teorie, experimente, probleme rezolvate. Editura Ștefan Procopiu, Iași, 1995: p. 97-

120.

26. Jackson, M., Mantsch, H.H., Medical Science Applications of IR, in Encyclopedia of Spectroscopy and

Spectrometry, C.L. Editor-in-Chief: John, Editor. 1999, Elsevier: Oxford. p. 1271-1281.

27. Steele, D., Theory of vibrational spectroscopy. 1971: Saunders.

28. Durig, J.R., Chemical, biological and industrial applications of infrared spectroscopy. 1985, New York:

John Wiley and Sons.

29. Valiyaveetil, F.I., Zhou, Y., MacKinnon, R., Lipids in the structure, folding, and function of the KcsA K+

channel. Biochemistry, 2002. 41(35): p. 10771-7.

Page 44: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

30. http://www.jascoinc.com/products/spectroscopy/ft-ir-spectrometers/ft-ir-670-series.

31. Rusu, E., Dorohoi, D., Rusu, G., Hurjui, I., Poly(ε-caprolactam) as support for some biocidal polymers. I.

Structural characterization by FT-IR spectroscopy. Mater. Plast., 2005. 42: p. 252-257.

32. Danielsson, I., Lyotropic Mesomorphism, in Lyotropic Liquid Crystals. 1976, American Chemical Society.

p. 13-27.

33. Dorohoi, D.O., Nasta, L., Cotleţ, M., Frunză, S., Tonitza, O., An. Univ. "Al. I. Cuza" Iaşi s. Chimie, 1999.

VII(nr. 1).

34. Dorohoi, D., Postolache, M., Postolache, M., Birefringence dispersion of poly (phenyl methacrylic) ester

of cetyloxybenzoic acid in tetrachloromethane, determined from channeled spectra. Journal of

Macromolecular Science, Part B, 2001. 40(2): p. 239-249.

35. Larsson, K., Lundstrom, I., Liquid Crystalline Phases in Biological Model Systems, in Lyotropic Liquid

Crystals. 1976, American Chemical Society. p. 43-70.

36. Ganicz, T., Stańczyk, W., Side-chain Liquid Crystal Polymers (SCLCP): Methods and Materials. An

Overview. Materials, 2009. 2(1): p. 95-128.

37. McArdle, C.B., Side chain liquid crystal polymers. Vol. XIV. 1989, Glasgow, New York: Blackie:

Chapman and Hall.

38. Jacobson, K., Dietrich, C., Looking at lipid rafts? Trends Cell Biol, 1999. 9(3): p. 87-91.

39. Mouritsen, O.G., Theoretical models of phospholipid phase transitions. Chem Phys Lipids, 1991. 57(2-3):

p. 179-94.

40. Friberg, S., Lyotropic Liquid Crystals, Copyright, Advances in Chemistry Series,, in Lyotropic Liquid

Crystals, F. Gould Robert, Editor. 1976, American Chemical Society.

41. Winsor, P.A., Liquid crystals and Plastic Crystals, G.W. Gray, P.A. Winsor, and E. Horwood, Editors.

1974: Chichester. p. 199-221.

42. Bata, L., Liquid Crystal Conference of Socialist, C., Advances in liquid crystal research and applications :

proceedings. 1981, Oxford; New York; Paris; Budapest: Pergamon press ; Akademiai Kiado.

43. Mărgineanu, D.G., Biofizică. 1985, Bucureşti: Editura Ştiinţifică şi Enciclopedică.

44. Tonnelat, J., Biophysique. 1974, Paris: Masson.

45. Stan, C., Cristescu, C.P., Severcan, F., Dorohoi, D., Rev. Roum. Chim., 2004. 49(9): p. 777-782.

46. Severcan, F., Dorohoi, D.O., Creangă, D., Ultrasound Propagation Through Biological Tissues. Studia

Universitatis Babeş-Bolyai, Physica, 2001. 1(Special Issue): p. 169-175.

47. Roşu, L., Albu, R., Necula, A.M., Hurjui, I., Dorohoi, D., Order-disorder in lyotropic liquid cristals

induced by temperature. Revista Ştiinţifica "V. Adamachi", “Al. I. Cuza” University, 2005(iunie 2005): p.

120 - 123.

48. Ionescu, D., Dorohoi, D.O., Hurjui, I., Parametrical Control of the electrical permittivity for the Lα phase

of the Dipalmitoylphosphatidylcholine, determined by simulation methods, . Digest Journal of

Nanomaterials and Biostructures, 2013. 8(2): p. 691 - 698.

49. Hallinen, K.M., Tristram-Nagle, S., Nagle, J.F., Volumetric stability of lipid bilayers. Phys Chem Chem

Phys, 2012. 14(44): p. 15452-7.

50. Korkmaz, F., Severcan, F., Aflori, M., Dorohoi, D.O., Temperature influence on the

dipalmitoylphosphatidylcholyne - Model membranes studied by FTIR,. Digest Journal of Nanomaterials

and Biostructures, 2008. 3: p. 55-61.

51. Leekumjorn, S., Sum, A.K., Molecular studies of the gel to liquid-crystalline phase transition for fully

hydrated DPPC and DPPE bilayers. Biochim Biophys Acta, 2007. 1768(2): p. 354-65.

52. Izumikawa, T., Nambu, Y., Fujishige, K., Goto, M., Tamai, N., Matsuki, H., Kaneshina, S., Volume

behaviour of dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membrane: Pressure perturbation calorimetry and

densitometry. Journal of Physics: Conference Series, 2010. 215(1): p. 012163.

53. Severcan, F., Agheorghiesei, C., Dorohoi, D.O., Temperature dependence of the phospholipids bilayers

stability, studied by FTIR spectroscopy. Revista de Chimie (Bucharest), 2008. 59: p. 356-359.

54. Pandey, P.R., Roy, S., Headgroup mediated water insertion into the DPPC bilayer: a molecular dynamics

study. J Phys Chem B, 2011. 115(12): p. 3155-63.

55. Schneck, E., Generic and Specific Roles of Saccharides at Cell and Bacteria Surfaces. 2011:

Springerverlag Berlin Heidelberg.

56. Sonne, J., Jensen, M.O., Hansen, F.Y., Hemmingsen, L., Peters, G.H., Reparameterization of all-atom

dipalmitoylphosphatidylcholine lipid parameters enables simulation of fluid bilayers at zero tension.

Biophys J, 2007. 92(12): p. 4157-67.

57. Carrozzino, J.M., Drug partitioning and solvation environments in lipid bilayers, dissertation, in

Chemistry. 2004, North Carolina State University.

58. Cehelnik, E.D., Cundall, R.B., Lockwood, J.R., Palmer, T.F., Solvent and temperature effects on the

fluorescence of all-trans-1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene. Journal of Physical Chemistry, 1975. 79(14): p.

1369-1376.

Page 45: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

59. Bachilo, S.M., Bachilo, E.V., Gillbro, T., Spectral shape of diphenylpolyene fluorescence and mixing of

the S1 and S2 states. Chemical Physics, 1998. 229(1): p. 75-91.

60. Pistolis, G., Malliaris, A., Effect of substituents on the spectroscopic properties of all-trans-1,6-diphenyl-

1,3,5-hexatriene. Chemical Physics, 1998. 226(1-2): p. 83-99.

61. Parasassi, T., De Stasio, G., Rusch, R.M., Gratton, E., A photophysical model for diphenylhexatriene

fluorescence decay in solvents and in phospholipid vesicles. Biophysical Journal, 1991. 59(2 I): p. 466-

475.

62. Saldanha, C., Santos, N.C., Martins-Silva, J., Fluorescent probes DPH, TMA-DPH and C17-HC induce

erythrocyte exovesiculation. Journal of Membrane Biology, 2002. 190(1): p. 75-82.

63. Dupuy, B., Montagu, M., Spectral properties of a fluorescent probe, all-trans-1,6-diphenyl-1,3,5-

hexatriene. Solvent and temperature effects. Analyst, 1997. 122(8): p. 783-786.

64. Dyck, R.H., McClure, D.S., J. Chem. Phys., 1962. 36: p. 2325-2326.

65. Shinitzky, M., Membrane Fluidity and Cellular Functions, Physiology of Membrane Fluidity. Physiology

of Membrane Fluidity, ed. M. Shinitzky. 1984, Boca Raton: CRC Press. 1-184.

66. Shinitzky, M., Inbar, M., Difference in microviscosity induced by different cholesterol levels in the surface

membrane lipid layer of normal lymphocytes and malignant lymphoma cells. Journal of Molecular

Biology, 1974. 85(4): p. 603-615.

67. Hyperchem 8.0.6., in Molecular Visualization and Simulation Program Package. 2007, Hypercube Inc.:

Gainesville.

68. Pérez, P., Domingo, L.R., Aurell, M.J., Contreras, R., Quantitative characterization of the global

electrophilicity pattern of some reagents involved in 1,3-dipolar cycloaddition reactions. Tetrahedron,

2003. 59(17): p. 3117-3125.

69. Van Vlaardingen, P.L.A., Steinhoff, W.J., De Voogt, P., Admiraal, W.A., Property-toxicity relationships

of azaarenes to the green alga Scenedesmus acuminatus. Environmental Toxicology and Chemistry, 1996.

15(11): p. 2035-2042.

70. Winfield, L.L., Inniss, T.R., Smith, D.M., Structure activity relationship of antiproliferative agents using

multiple linear regression. Chemical Biology and Drug Design, 2009. 74(3): p. 309-316.

71. Schlick, T., Molecular modeling and simulation, An Interdisciplinary Guide. Molecular Modeling and

Simulation: An Interdisciplinary Guide. 2002, New York Springer-Verlag.

72. Holtje, H.D., Sippl, W., Rognan, D., Folkers, G., Molecular modeling,. Molecular Modeling. 2003,

Dussedorf-Zurich, New York,: John Wiley - VCH Gmbh and Co.

73. Hurjui, I., Ivan, L.-M., Dorohoi, D.O., Solvent influence on the electronic absorption spectra (EAS) of

1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH). Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular

Spectroscopy, 2013. 102: p. 219-225.

74. Hurjui, I., Neamţu, A., Harabagiu, V., Dorohoi, D.O., Hurjui, L., Striking features of DPH spectra as

function of solvent nature in Revista de Chimie (Bucharest) - accepted paper. 2013. p. xxx-xx.

75. Vijan, L.E., Rev. Chim. (Bucuresti), 2009. Nr. 9: p. 921.

76. Hurjui, I., Ivan, L.M., Dorohoi, D.O., Solvent influence on the electronic absorption spectra (EAS) of 1,6-

diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH). Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2013. 102: p. 219-25.

77. Plasek, J., Jarolim, P., Interaction of the fluorescent probe 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene with

biomembranes. Gen Physiol Biophys, 1987. 6(5): p. 425-37.

78. Wang, S., Beechem, J.M., Gratton, E., Glaser, M., Orientational distribution of 1,6-diphenyl-1,3,5-

hexatriene in phospholipid vesicles as determined by global analysis of frequency domain fluorimetry

data. Biochemistry, 1991. 30(22): p. 5565-5572.

79. Shinitzky, M., Barenholz, Y., Fluidity parameters of lipid regions determined by fluorescence

polarization. Biochim Biophys Acta, 1978. 515(4): p. 367-94.

80. Thulborn, K.R., Tilley, L.M., Sawyer, W.H., Treloar, F.E., The use of n-(9-anthroyloxy) fatty acids to

determine fluidity and polarity gradients in phospholipid bilayers. Biochim Biophys Acta, 1979. 558(2): p.

166-78.

81. van Hoeven, R.P., van Blitterswijk, W.J., Emmelot, P., Fluorescence polarization measurements on

normal and tumour cells and their corresponding plasma membranes. Biochim Biophys Acta, 1979.

551(1): p. 44-54.

82. Hess, B., Kutzner, C., van der Spoel, D., Lindahl, E., GROMACS 4: Algorithms for Highly Efficient,

Load-Balanced, and Scalable Molecular Simulation. Journal of Chemical Theory and Computation, 2008.

4(3): p. 435-447.

83. Lakowicz, J.R., ed. Quenching of Fluorescence. 3 ed. Principles of Fluorescence Spectroscopy, ed. J.R.

Lakowicz. 2006, Springer US. p. 301.

84. Pap, E.H., ter Horst, J.J., van Hoek, A., Visser, A.J., Fluorescence dynamics of diphenyl-1,3,5-hexatriene-

labeled phospholipids in bilayer membranes. Biophys Chem, 1994. 48(3): p. 337-51.

Page 46: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

85. Johnson, S.M., Nicolau, C., The distribution of 1,6 diphenyl hexatriene fluorescence in normal human

lymphocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1977. 76(3): p. 869-874.

86. Repáková, J., Capková, P., Holopainen, J.M., Vattulainen, I., Distribution, orientation, and dynamics of

DPH probes in DPPC bilayer. The Journal of Physical Chemistry B, 2004. 108(35): p. 13438-13448.

87. Holopainen, J.M., Subramanian, M., Kinnunen, P.K., Sphingomyelinase induces lipid microdomain

formation in a fluid phosphatidylcholine/sphingomyelin membrane. Biochemistry, 1998. 37(50): p. 17562-

17570.

88. Troup, G.M., Wrenn, S.P., Apel-Paz, M., Doncel, G.F., Vanderlick, T.K., A time-resolved fluorescence

diphenylhexatriene (DPH) anisotropy characterization of a series of model lipid constructs for the sperm

plasma membrane. Industrial & engineering chemistry research, 2006. 45(21): p. 6939-6945.

89. Pan, J., Tristram-Nagle, S., Kučerka, N., Nagle, J.F., Temperature dependence of structure, bending

rigidity, and bilayer interactions of dioleoylphosphatidylcholine bilayers. Biophysical Journal, 2008.

94(1): p. 117-124.

90. Silvius, J.R., Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications

by membrane proteins. Lipid-protein interactions, ed. P.C. Jost, and O.H. Griffith. Vol. 2. 1982, New

York: John Wiley and Sons.

91. Kaiser, R.D., London, E., Location of diphenylhexatriene (DPH) and its derivatives within membranes:

comparison of different fluorescence quenching analyses of membrane depth. Biochemistry, 1998. 37(22):

p. 8180-8190.

92. Lentz, B.R., Use of fluorescent probes to monitor molecular order and motions within liposome bilayers.

Chemistry and Physics of Lipids, 1993. 64(1): p. 99-116.

93. Mitchell, D.C., Litman, B.J., Molecular order and dynamics in bilayers consisting of highly

polyunsaturated phospholipids. Biophysical Journal, 1998. 74(2): p. 879-891.

94. Pink, D.A., Perturbing probes and the study of lipid-protein bilayer membranes. Chemistry and Physics of

Lipids, 1989. 50(3): p. 213-236.

95. van der Heide, U.A., Levine, Y.K., A computer simulation study of the relation between lipid and probe

behaviour in bilayer systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1994. 1195(1): p. 1-

10.

96. Muller, J.M., van Ginkel, G., van Faassen, E.E., Effect of lipid molecular structure and gramicidin A on

the core of lipid vesicle bilayers. A time-resolved fluorescence depolarization study. Biochemistry, 1996.

35(2): p. 488-497.

97. Hurjui, I., Dorohoi, D.O., Solvent Influence on the electronic spectra of 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene in

ternary solutions, in 31st European Congress on Molecular Spectroscopy, K. Nagy-Pora, V. Chiş, S.

Aştilean, and O. Cozar, Editors. 26 - 31 August 2012, Publishing House Napoca Star: Cluj-Napoca,

Romania. p. 186.

98. Moise, M., Sunel, V., Dulcescu, M.M., Dorohoi, D.O., Mathematic Modelling to Optimize the Obtaining

Process of New Thiosemicarbazides Derived from N-(P-Nitrobenzoyl)-D,L-Phenylalanine. Rev. Chim.

(Bucharest) 2010. 61(8).

99. Azzouz, A., Leontie, M., Dorohoi, D.O., Gheorghieş, C., Elemente de strategie în design industrial. 1998,

Bacău: Ed. Plumb.

100. Fiksel, J., Fiksel, J.R., Design for environment: creating eco-efficient products and processes. 1996, New

York: McGraw-Hill.

101. Diaconescu, R., Oniscu, C., Cernatescu, C., Ocanu, A., Bibere, C., Vornicu, N., Analiza de sensibilitate şi

modelarea statistică pentru condensarea acizilor R1–6–cloro–7fluoro–1,4–dihidro–4–oxochinolin–3–

carboxilici cu 4–metilpiperidină. Bul. IPI Iaşi, seria Matematică, Mecanică Teoretică, Fizică, fasc. 2,

2009. LV(LIX ): p. 93 -105.

102. Mazilu, C., Radu, D., Rotiu, E., Ionescu, L., Proiectarea optimală şi caracterizarea unei vitroceramici

bioactive utilizată în medicina modernă reparatorie. Rev. Chim. (Bucharest), 2007. 58(1): p. 88-91.

103. Moise, M., Sunel, V., Profire, L., Popa, M., Desbrieres, J., Peptu, C., Synthesis and biological activity of

some new 1,3,4-thiadiazole and 1,2,4-triazole compounds containing a phenylalanine moiety. Molecules,

2009. 14(7): p. 2621-31.

104. Hurjui, I., Cheptea, C., Dascalu, C.F., Hurjui, L., Peptu, C., Şunel, V., Dorohoi, D.O., Optimization

reaction of some 1, 4-disubstituted thiosemicarbazides with tuberculostatic activity. Digest Journal of

Nanomaterials and Biostructures, 2012. 7(4): p. 1447-1756.

105. Grebinişan, D., Burlea, M., Cheptea, C., Lionte, C., Dorohoi, D.O., Şunel, V., Popa, M., Hurjui, I.,

Optimization Reaction for Obtaining some N-[p-(R)-Benzoyl]-L-Glutamine Derivatives with

Pharmaceutical Action. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 2013. 8 (2): p. 777 - 785.

Page 47: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

ANEXA

I. LISTA DE PUBLICAŢII

Lucrări ştiinţifice publicate în reviste cotate ISI:

1. Rusu, E., Dorohoi, D., Rusu, G., Hurjui, I., Poly(ε-caprolactam) as support for some biocidal polymers. I.

Structural characterization by FT-IR spectroscopy. Mater. Plast., 2005. 42: p. 252-257.

2. Hurjui, I., Cheptea, C., Dascălu, C.F., Hurjui, L., Peptu, C., Şunel, V., Dorohoi, D.O., Optimization

reaction of some 1, 4-disubstituted thiosemicarbazides with tuberculostatic activity. Digest Journal of

Nanomaterials and Biostructures, 2012. 7(4): p. 1447-1756.

3. Hurjui, I., Ivan, L.-M., Dorohoi, D.O., Solvent influence on the electronic absorption spectra (EAS) of

1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH). Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular

Spectroscopy, 2013. 102: p. 219-225.

4. Hurjui, I., Neamtu, A., Dorohoi, D.O., The interaction of fluorescent DPH probes with unsaturated

phospholipid membranes: A molecular dynamics study. Journal of Molecular Structure, 2013. 1044(0): p.

134-139.

5. Ionescu, D., Dorohoi, D.O., Hurjui, I., Parametrical Control of the electrical permittivity for the Lα phase

of the Dipalmitoylphosphatidylcholine, determined by simulation methods. Digest Journal of

Nanomaterials and Biostructures, 2013. 8(2): p. 691 - 698.

6. Grebinişan, D., Burlea, M., Cheptea, C., Lionte, C., Dorohoi, D.O., Şunel, V., Popa, M., Hurjui, I.,

Optimization Reaction for Obtaining some N-[p-(R)-Benzoyl]-L-Glutamine Derivatives with

Pharmaceutical Action. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 2013. 8(2): p. 777 - 785.

Lucrări ştiinţifice acceptate spre publicare în reviste ştiinţifice cotate ISI

7. Hurjui, I., Neamţu, A., Harabagiu, V., Dorohoi, D.O., Hurjui, L., Striking features of DPH spectra as

function of solvent nature, Revista de Chimie (Bucharest), 2013. (accepted paper)

Lucrări ştiinţifice trimise spre publicare în reviste ştiinţifice cotate ISI

8. Hurjui, I., Neamţu, A., Dorohoi, D.O., Computational and spectral studies of DPH multicomponent

solutions, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2013.

Lucrări publicate în reviste ştiinţifice categoria B+

1. Ştefănescu, C., Rusu, V., Azoicăi, D., Hurjui, I., 99mTc isonitrils biophysical aspects in pulmonary

tuberculosis. Part II. In vitro evaluation of 99mTc MIBI cellular uptake mechanism. Revista medico-

chirurgicală a Societăţii de Medici şi Naturalişti din Iaşi, 2007. 111(1): p. 210-216.

2. Hurjui, L., Şerban, I.L., Oprişa, C., Tucaliuc, E.S., Hogaş, M.M., Tucaliuc, D., Hurjui, I., Luca, V.,

Şerban, D.N., The importance of EDHF in endothelium-dependent relaxation increases distally in

mesenteric arteries depending upon the contracting agent. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iaşi, 2011.

115(1): p. 168-70.

Lucrări publicate în reviste ştiinţifice din categoria C şi D

1. Roşu, L., Albu, R., Necula, A.M., Hurjui, I., Dorohoi, D., Order-disorder in lyotropic liquid cristals

induced by temperature. Revista Ştiinţifică "V. Adamachi", “Al. I. Cuza” University, 2005. p:120-122.

2. Albu, E., Filip, C., Hurjui, I., Lupaşcu, D., Testarea degranulării mastocitelor peritoneale de şobolan –

posibilă metoda de screening a moleculelor farmacologic active, Revista de Medicină şi Farmacie U.M.F.

Tg Mureş, 2007 (53), p. 185-188.

Page 48: STUDIUL UNOR PARAMETRI BIOFIZICI AI … HURJUI - rezumatul tezei... · Lipidele membranelor fac parte din următoarele categorii: glicerolipide, sfingolipide, steroli. Ele reprezintă

II. PARTICIPĂRI LA CONFERINŢE ŞTIINŢIFICE NAŢIONALE ŞI INTERNAŢIONALE:

1. Hurjui, I., Morar, A., Morar, S., Dorohoi, D.O., Intermolecular interaction in some homogeneous solutions

of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene, poster, 12th National Conference on Biophysics“CNB 2013” – Biophysics

for Health, with International Participation, 13-16 june 2013 Iași, Romania, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat.

Iaşi, 2013. 117(1) supl.: p. 100-01.

2. Hurjui, I., Ivan, L.-M., Dorohoi, D.O., Changes in polarizability of 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH)

excitation in some homogeneous solutions, poster, National Conference of applied physics CNFA 2013, 23-

24 mai, Iași, Romania

3. Hurjui, I., Dorohoi, D.O., Solvent Influence on the electronic spectra of 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene in

ternary solutions, poster, 31st European Congress on Molecular Spectroscopy, K. Nagy-Pora, V. Chiş, S.

Aştilean, and O. Cozar, Editors. 26 - 31 August 2012, Publishing House Napoca Star: Cluj-Napoca,

Romania. p. 186.

4. Hurjui, I., Neamţu, A., Dorohoi, D.O., Concentration influence of fluorescence DPH probe on the structure

and mobility POPC model membranes: a molecular dinamics study, poster, 31st European Congress on

Molecular Spectroscopy, K. Nagy-Pora, V. Chiş, S. Aştilean, and O. Cozar, Editors. 26 - 31 August 2012,

Publishing House Napoca Star: Cluj-Napoca, Romania. p. 187.

5. Hurjui L.L., Şerban, I.L., Hurjui, I., Oprişa, C., Hogaş, M.M., Şerban. D.N. Blood levels of homocysteine,

vitamin B12 and folic acid in patients with type II diabetes mellitus: possible correlation with endothelial

dysfunction, poster, „Advances and Controversies in B-Vitamins and Choline“- 5-8 March 2012-Leipzig-

Germany, abstract, Clin Chem Lab Med. 2012; 50(2), p. A24.

6. Hurjui, L.L., Serban, I.L., Hurjui, I., Oprişa, C., Hogaş, M.M., Serban, D.N., Endothelial dysfunction in

type 2 diabetes may be related to the blood levels of homocysteine, vitamin B12 and folic acid, poster, in

Zilele Medicamentului, Ed. XXI, 2012, abstract, Ed UMF GR. T. POPA, IASI, p. 98, ISSN 1843-1038

7. Hurjui, L.L., Serban, I. L., Hurjui, I., Oprisa, C., Hogas, M.M., Serban, D.N. ,Influence of pravastatin on

endothelium dependent relaxation of rat resistance arteries affected by homocysteine exposure, in The 11th

National Congress of the Romanian Society of Physiological Sciences, XXIst Century Physiology-from

Genotype to Phenotype, Timisoara, 10-12 may 2012, abstract, Fiziologia suppl. p. 50, ISSN 1223-2076

8. Hurjui, L., Şerban, I.L., Oprişa, C., Tucaliuc, E.S., Hogaş, M.M., Hurjui I., Luca, V., Şerban, D.N. The link

of homocysteine to atherosclerotic vascular disease, endothelial dysfunction, lipid peroxidation and

inflammation markers in type 2 diabetic patients, Zilele Medicamentului Ed. A XX-a, abstract, in: Mungiu

OC (ed), Pain and Drug Research, 2011, Ed. UMF „Gr. T. Popa”, Iaşi, p.128.

9. Hurjui, L., Şerban, I.L., Luca, V., Şotropa, M., Neamţu, A., Tiţu, G., Hurjui I., Şerban, D. N., Correlation

between plasma total homocysteine levels with other biochemical parameters in a group of patients with

type 2 diabetes, Zilele Medicamentului Ed. A XIX-a abstract, Pain and Drug Research, 2010, Ed UMF „Gr.

T. Popa”, Iaşi, p. 197.

10. Hurjui, L., Hurjui I., Şerban, I.L., Gheorghiţă, N., Luca, V., Serban, D. N., Progrese privind

hiperhomocisteinemia asociată cu sindromul metabolic, Medicina Modernă, Revista Colegiului Medicilor

din Municipiul Bucureşti, vol.XVI, supl. Nr. 1, p. 201, Zilele Medicamentului Ed. A XVIII-a, Iasi, mai

2009.

11. Hurjui, L., Hurjui, I., Şerban, L.I., Bădescu, M., Iancu, R., Diaconu Sotropa, M., Colev Luca, V., Corelaţii

ale homocisteinei cu alţi parametri serici la pacienţi diagnosticaţi cu diabet zaharat tip II, poster, aVIIa

Conferinţă Naţională a Societăţii Române de Fiziopatologie, Oct. 2009, Oradea, Romania.

12. Hurjui, I., Dorohoi, D., Rusu, V., Antochi, A., Comparative study of FTIR spectra for some acetic acid

derivatives, poster, The 8th

International Conference on Physics of Advanced Materials (ICPAM-8),

Universitatea "Alexandru Ioan Cuza" Iaşi, 4 – 7 iunie 2008.

13. Hurjui, L., Şerban, L.I., Hurjui, I., Ciurea, E., Gheorghiţă, N., Scripcar, L., Luca, V., Mecanisme

moleculare ale hiperhomocisteinemiei asociate aterosclerozei, poster, Zilele Facultăţii de Medicină

Dentară, UMF „Gr. T. Popa”, Iaşi, martie 2008.

14. Hurjui, L., Hurjui, I., Titu, G., Homocisteina – marker si metabolit activ in patologie, poster, Zilele

Spitalului de Recuperare, aprilie 2006, Iaşi.

15. Hurjui, L., Hurjui, I., Frunza, F.G., Titu, G., Colev-Luca, V., Influenţa statusului vitaminelor din grupul B

asupra homocisteinei plasmatice, poster, Ziua Medicamentului, Iaşi, mai 2006.

16. Hurjui, I., Ştefănescu, C., Miron, S., Rusu, V., Fluidity evaluation of the Mycobacterium Tuberculosis wall,

prezentare orală, Sesiune ştiinţifică, Zilele Universităţii de Medicină, UMF „Gr. T. Popa”, Iaşi, nov. 2005.

17. Roşu, L., Albu, R., Necula, A.M., Hurjui, I., Dorohoi, D., Order-disorder in lyotropic liquid cristals

induced by temperature, poster, a XXXIVa Conferinţă Natională “Fizica şi Tehnologiile Educaţionale

Moderne”, Facultatea de Fizică, Universitatea "Alexandru Ioan Cuza" Iaşi, 18-19 mai 2005.