STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc...

32
32 UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII COALA DOCTORALĂ Ing. MIHAI ŞUTEU STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTELE SUINELOR DOMESTICE (REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT) Conducători ştiinţifici: Prof. univ. dr. AUGUSTIN VLAIC Prof. univ. dr. ROBERT RENAVILLE CLUJ-NAPOCA 2011 UNIVERSITÉ DE LIÈGE GEMBLOUX AGRO-BIO TECH UNITÉ DE BIOLOGIE ANIMALE ET MICROBIENNE

Transcript of STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc...

Page 1: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

32

UNIVERSITATEA DE �TIIN�E AGRICOLE �I MEDICINĂ

VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE �I BIOTEHNOLOGII

�COALA DOCTORALĂ

Ing. MIHAI ŞUTEU

STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE

PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTELE SUINELOR

DOMESTICE

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

Conducători ştiinţifici:

Prof. univ. dr. AUGUSTIN VLAIC

Prof. univ. dr. ROBERT RENAVILLE

CLUJ-NAPOCA2011

UNIVERSITÉ DE LIÈGE

GEMBLOUX AGRO-BIO TECH

UNITÉ DE BIOLOGIE ANIMALE ET MICROBIENNE

Page 2: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

33

CUPRINS

SCOPUL, OBIECTIVELE ŞI IMPORTANŢA CERCETĂRILOR.......................

CAP. 1. STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PRIVIND PROTEINELE

MAJORE DIN LAPTE LA SPECIA SUINĂ…...................................................….

1.1. STUDIUL PROTEINELOR CE ALCĂTUIESC FRACŢIUNEA CAZEINICĂ...

1.1.1. Studiul polimorfismelor αS1-cazeinei porcine...........................................

1.1.2. Studiul polimorfismelor αS2-cazeinei porcine...........................................

1.1.3. Studiul polimorfismelor β-cazeinei porcine..............................................

1.1.4. Studiul polimorfismelor κ-cazeinei porcine..............................................

1.2. STUDIUL PROTEINELOR DIN LACTOSERUM...............................................

1.2.1 Studiul polimorfismelor α-lactalbuminei porcine.....................................

1.2.2. Studiul polimorfismelor β-lactoglobulinei porcine...................................

1.2.3. Studiul polimorfismelor WAP....................................................................

CAP. 2. STUDIUL POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN LAPTE, LA

SPECIA SUINĂ, LA NIVEL DE PROTEINĂ..........................................................

2.1. MATERIALE ŞI METODE....................................................................................

2.2. REZULTATE ŞI DISCUŢII...................................................................................

2.3. CONCLUZII ...........................................................................................................

CAP. 3. POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.647A>G….....................

3.1. MATERIALE ŞI METODE……............................................................................

3.2. REZULTATE ŞI DISCUŢII...................................................................................

3.3. CONCLUZII ..........................................................................................................

CAP. 4. POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.294T>G...................…..

4.1. MATERIALE ŞI METODE……............................................................................

4.2. REZULTATE ŞI DISCUŢII...................................................................................

4.3. CONCLUZII ..........................................................................................................

CAP. 5. POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.175G>A.........................

5.1. MATERIALE ŞI METODE……............................................................................

5.2. REZULTATE ŞI DISCUŢII...................................................................................

5.3. CONCLUZII ..........................................................................................................

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ..................................................................................

pag.

34

37

38

38

39

40

41

42

42

43

44

45

45

45

48

49

49

50

54

55

55

55

57

58

58

58

61

62

Page 3: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

34

SCOPUL, OBIECTIVELE ŞI IMPORTANŢA CERCETĂRILOR

Polimorfismul biochimic al proteinelor este un fenomen cu o largă răspândire la

toate speciile de animale şi constă în faptul că la indivizii din cadrul aceleaşi specii o

proteină se poate prezenta sub mai multe forme moleculare.

Scopul cercetărilor a fost acela de a identifica şi caracteriza la nivel molecular

principalele polimorfisme ce apar în cazul celor 7 proteine majore din laptele suinelor

domestice. Acest scop prezintă o importan�ă �tiin�ifică deosebită, având în vedere

faptul că pe plan mondial există pu�ine studii similare �i că în România �i Belgia acest

aspect nu a fost niciodată investigat.

Obiecivele şi activităţile metodologice ale cercetării

Obiectivele �i activită�ile metodologice ale cercetării, în concordanţă cu cele

stabilite în Proiectul de cercetare, au fost următoarele:

1. Identificarea principalelor polimorfisme ce apar în cazul proteinelor

majore din lapte la specia suină

Acest obiectiv a vizat în principal identificarea principalelor polimorfisme ale

lacto-proteinelor speciei suine, iar pentru realizarea acestui obiectiv au fost întreprinse

următoarele acţiuni:

Au fost identificate ferme de creştere a porcilor în care să se regăsească animale

crescute în rasă curată (ştiut fiind faptul că în creşterea intensivă a suinelor se folosesc

exclusiv hibrizii);

Au fost recoltate probe de lapte/colostru de la scroafe aflate în lactaţie aparţinând

raselor: Mangaliţa, Bazna, Marele alb, Pietrain şi Duroc;

Identificarea cu ajutorul tehnicii IEF a polimorfismelor genetice, implicit a

indivizilor purtători ai unor variante polimorfe;

Stabilirea structurii genetice în populaţiile analizate.

2. Caracterizarea polimorfismelor identificate, la nivel de ADN

În cadrul acestui obiectiv a fost efectuată caracterizarea la nivel de ADN a

polimorfismelor β-cazeinei porcine. La locusul β-cazeinei a fost identificată o alelă nouă

Page 4: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

35

– alela G (GenBank GU827390.1) precum şi un fenomen de maturare alternativă a ARN-

ului mesager precursor.

Pentru realizarea acestui obiectiv au fost derulate următoarele activităţi:

Extracţia ARN-ului din probele (de la animalele) identificate a fi polimorfe;

Designul unor primeri adecvaţi şi sinteza ADNc pentru probele identificate

polimorfe;

Secvenţierea variantelor identificate;

Alinierea secvenţelor;

Realizarea de hărţi de restricţie teoretice;

Conceperea unor teste de tip PCR-RFLP pentru diferenţierea variantelor

identificate.

3. Testarea influenţei diferitelor variante proteice asupra dinamicii de

creştere a loturilor de purcei în perioada de alăptare

În cadrul acestui obiectiv s-a dorit determinarea influenţelor pe care diferitele

variante proteice o au asupra dinamicii de creştere a loturilor de purcei. În acest sens am

utilizat polimorfismul c.175A>G al β-cazeinei porcine, întrucât acesta are cel mai

semnificativ impact la nivel de proteină.

Pentru realizarea acestui obiectiv s-au avut în vedere următoarele activităţi:

Depistarea unor scroafe care prezintă polimorfisme la locusul CSN2;

Confirmarea polimorfismelor (cu ajutorul testelor PCR – genotipizări bazate pe

protocoalele dezvoltate);

Alegerea scroafelor ce vor constitui loturile experimentale (acestea să aibă un grad

cât mai ridicat de asemănare genetică, să beneficieze de aceleaşi condiţii pe perioada

alăptării, să fie aproximativ de aceeaşi vârstă etc.)

Monitorizarea dinamicii de creştere a loturilor de purcei provenind de la scroafele

aflate în loturile experimentale (de la fătare până la înţărcare);

Centralizarea şi interpretarea statistică a datelor obţinute.

4. Analiza asocierilor dintre genotipul scroafelor la locusul β-cazeinei (CSN2)

şi performanţele reproductive ale acestora

Numeroase studii, prezentate amănun�it în cadrul tezei, au semnalat prezenţa

unor loci cu implicaţii în prolificitate pe perechea de cromozomi 8 de la specia suină

Page 5: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

36

(SSC 8), loci cu implicaţii în determinismul caracterelor cantitative (quantitative trait loci

– QTL). După cunoştiinţele noastre, nu există până la această dată un marker molecular

care să fie folosit în selecţia asistată de markeri la suine, de pe SSC 8, pentru prolificiate.

În acest scop am folosit abordarea „genelor candidat”, pornind de la premisa ca locusul

CSN2 este de asemenea situat pe SSC 8. Astfel, s-a dorit ca prin studiul asocierilor dintre

genotipul scroafelor la locusul β-cazeinei şi performanţele acestora de reproducţie să

evidenţiem existenţa unor eventuale grupuri de linkage, care să permită ulterior

identificarea unor QTL-uri cu implicaţii în prolificitate pe baza genotipurilor β-cazeinei.

Activităţi desfăşurate:

Genotipizarea unui număr de 150 de scroafe, pentru locusul CSN2 (recoltare de

sânge, extracţie de ADN, amplificare, migrare, restricţie enzimatică, migrare,

centralizarea genotipurilor);

Centralizarea şi prelucrarea performanţelor înregistrate pentru caracterele urmărite

şi interpretarea statistică a rezultatelor.

Importanţa cercetării rezidă în faptul că rezultatele obţinute privind studiul

polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din laptele suinelor domestice vor

contribui substanţial la îmbogăţirea patrimoniului ştiinţific mondial în domeniu.

Cercetările efectuate, aferente tezei de doctorat, au evidenţiat faptul că dintre cele şapte

proteine majore din laptele suinelor domestice, β-cazeina prezintă cel mai pronunţat

polimorfism în cadrul raselor analizate, atât în România, cât �i în Belgia.

Studiul asocierilor dintre genotipul scoafelor la locusul β-cazeinei �i

performan�ele acestora de produc�ie/reproduc�ie sunt elemente de noutate absolută,

fiind primele studii de acest gen la specia suină.

Trebuie avut în vedere că cercetările efectuate la alte specii (capră, vacă, oaie,

iepuroaică) au relevat diferenţe semnificative determinate de genotip, astfel încât multe

gene codificatoare ale lacto-proteinelor sunt actualmente utilizate în selecţie. Este deci,

posibil ca aceste rezultate să îşi găsească o aplicabilitate practică în selecţia astistată de

markeri (MAS).

Page 6: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

37

CAPITOLUL I

STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PRIVIND PROTEINELE

MAJORE DIN LAPTE LA SPECIA SUINĂ

Proteinele din lapte se împart în două mari grupe: fracţiunea cazeinică şi proteinele

din lactoserum. Prima grupă este alcătuită din cazeine şi anume: αS1-, αS2-, β- şi κ-cazeina.

Proteinele din lactoserum sunt reprezentate la majoritatea speciilor de către α-

lactalbumină şi β-lactoglobulină. Destul de recent (1998) la specia suină a fost

descoperită o a treia proteină majoră din lactoserum şi anume WAP (whey acidic proteic

proteina acidă din ser).

Primul polimorfism al unei proteine din lapte a fost evidenţiat la bovine în anul

1955, de către Aschaffenburg şi Drewry, fiind descrise două variante polimorfe ale β-

lactoglobulinei, denumite A, respectiv B

Polimorfismele proteinelor din lapte au fost intens studiate la specii cum ar fi:

ovinele, bovinele sau caprinele. Este de ajuns să menţionez că doar la locusul αS1-

cazeinei, la specia caprină, sunt cunoscute 18 variante alelice.

În România, printe primele studii ce au vizat polimorfismele genetice ale

proteinelor din lapte, au fost efectuate în cadrul disciplinei de Genetică şi ameliorarea

animalelor, a Facultăţii de Zootehnie şi Biotehnologii, din cadrul USAMV Cluj-Napoca,

studii axate pe polimorfismul κ-cazeinei bovine (Vlaic �i colab., 2001).

Pe baza datelor pe care le avem la dispoziţie se poate afirma că tematica

polimorfismelor proteinelor din lapte la specia suină nu a fost abordată pe plan naţional.

Pe plan internaţional polimorfisme ale proteinelor din lapte la specia suină au

fost evidenţiate începând cu anii ’60.

Abordând această tematică, cele mai notabile rezultate au fost obţinute de

colectivul condus de către prof. dr. Jason Lee Alexander, din Statele Unite ale Americii,

care la începutul anilor ’90 a secvenţiat pentru prima oară toate genele, care codifică

proteinele majore din lapte.

Page 7: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

38

1.1. STUDIUL PROTEINELOR CE ALCĂTUIESC FRACŢIUNEA CAZEINICĂ

Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită dintr-un grup de 4

fosfoproteine sintetizate de către epiteliul glandei mamare în lacta�ie: αS1-cazeina, αS2-

cazeina, β-cazeina şi κ-cazeina. Acestea sunt cele mai semnificative proteine din lapte, la

specia suină având o pondere de peste 60% din totalul proteinelor din lapte (Aimutis �i

colab., 1981). Indiferent de specie cazeinele sunt caracterizate printr-o solubilitate

limitată (precipită) în intervalul de pH: 4 – 5.

În lapte, cazeinele (denumire generică a celor patru proteine ce alcătuiesc această

fracţiune) se prezintă sub forma unor micelii. Miceliile de cazeină sunt agregate coloidale

formate din cazeine şi fosfat de calciu. Au fost identificate sub această formă în laptele

tuturor speciilor investigate. Având rol de proteine de transport, miceliile transformă

laptele într-un lichid cu vâscozitate scăzută permiţând astfel transportul unor cantităţi

ridicate de calciu şi fosfor. Aceste minerale la concentraţiile la care se găsesc, în absenţa

cazeinelor, ar precipita în interiorul glandei mamare (Horne �i colab., 2002).

În cazul speciei suine, aceste proteine sunt codificate de gene autosomale

codominante situate pe perechea de cromozomi 8 (Archibald �i colab., 1994).

1.1.1. Studiul polimorfismelor αS1-cazeinei porcine

Fără peptida semnal (15 AA) αS1-cazeina porcină, are în componenţa sa un număr

de 191 AA, fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 22576,03 Da şi un punct

izoelectric pI=5,88 (Şuteu şi colab., 2009).

La nivel de proteină, Erhardt în 1989, folosind cromatografia cu schimb de ioni,

a izolat o proteină pe care a denumit-o αS1-cazeina porcină, dar poziţia acestei proteine la

migrarea electroforetică folosind tehnica UREA-PAGE sugerează faptul că nu ar fi vorba

despre cazeina αS1, întrucât prezintă un profil de migrare mai lent decât β-cazeina porcină

(Gallagher �i colab., 1996).

La nivel de ADN primii care au determinat întreaga secvenţă a cADN-ului αS1-

cazeinei porcine au fost Alexander şi Beattie (1992a). Aceştia au calculat pe baza

Page 8: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

39

compoziţiei în aminoacizi (191), sub formă nefosforilată, o masă moleculară de 24273

Da.

La nivelul acestei gene, Alexander şi Beattie (1992a), menţionează că ar exista un

polimorfism de lungime, unele clonele folosite în vederea secvenţierii fiind caracterizate

prin lipsa regiunii Gly93 – Gln112, respectiv Glu107 – Gln112.

De asemenea, la acest locus, Archibald �i colab. (1994) folosind enzima TaqI,

semnalează existenţa unui polimorfism. În urma analizelor PRC-RFLP folosind enzima

menţionată anterior, au rezultat doi produşi de restricţie: ~ 8,7 kb �i ~ 7,7 kb.

Denumirea locusului: CSN1S1.

1.1.2. Studiul polimorfismelor αS2-cazeinei porcine

Fără peptida semnal (15 AA), αS2-cazeina porcină, are în componenţa sa un

număr de 220 AA, fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 25866 Da şi un punct

izoelectric pI=5,78 (Şuteu şi colab., 2009).

La nivel de proteină a fost izolată pentru prima oară în anul 1984 de către

Cerning-Beroard, cu ajutorul cromatografiei de afinitate, acesta relatând faptul că

varianta porcină ar conţine 200 – 201 AA (cu 6 – 7 mai puţini decât αS2-cazeina bovină).

De asemenea acest studiu a consemnat faptul că αS2-cazeina porcină prezintă un conţinut

mai sărac în Thr, Leu, Tyr şi Arg şi mai ridicat în Ser, Glx, Ile şi His decât varianta

bovină (Gallagher �i colab., 1996). Greutatea moleculară a acesteia, în cazul în care ar

avea ataşate 15 sau 16 grupări fosfat a fost calculată ca fiind în jurul valorii de 24500 Da.

La nivel de ADN primii care au determinat întreaga secvenţă a cADN-ului αS2-

cazeinei porcine au fost Alexander şi Beattie (1992). Aceştia au raportat o lungime a

cADN-ului de 1093 pb. Pentru această proteină, pe baza compoziţiei în aminoacizi (220

AA) au calculat, sub formă nefosforilată, o masă moleculară de 29744 Da.

Se remarcă faptul că există unele neconcordanţe între secvenţa proteinei publicată

în articol şi cea descărcată în baza de date GenBank în poziţiile 126, 128 – 139, 141 –

142 şi 145.

Page 9: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

40

La locusul αS2-cazeinei, în urma unor teste PCR-RFLP, la nivel de ADNc, a fost

detectat un polimorfism de tip BamHI, în urma digestiei enzimatice rezultând produşi de

~ 15,6 kb, respectiv ~ 12,1 kb (Archibald �i colab., 1994).

Denumirea locusului: CSN1S2.

1.1.3. Studiul polimorfismelor β-cazeinei porcine

Fără peptida semnal (15 AA), β-cazeina porcină, are în componenţa sa un număr

de 217 AA, fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 24377,32 Da şi un punct

izoelectric pI=5,77 (Şuteu şi colab., 2009).

La nivel de proteină, β-cazeina porcină a fost izolată pentru prima oară în anul

1969 de către Woychik şi Wondolowski, fără a fi caracterizată (Gallagher şi colab.,

1996).

Secvenţa completă a acestei proteine a fost obţinută pe baza secvenţei cADN-ului

(Alexander �i Beattie, 1992b).

β-cazeina porcină conţine nivele mai ridicate de Ala, Leu şi Lys decât în cazul β-

cazeinei bovine. Varianta întâlnită la specia suină nu conţine Trp şi Cys. Proteina descrisă

de Alexander �i Beattie (1992b) prezintă 6 posibile situsuri de fosforilare şi o masă

moleculară de 24397 Da, în formă nefosforilată.

Primul polimorfism în cazul β-cazeinei porcine a fost depistat de către Glasnak

(1966, 1968), acesta identificând β1-cazeinaB, β1-cazeinac şi β2-cazeina. În 1969, Gerrits

identifică un polimorfism în ceea ce el numea la vremea respectivă cazeina3, identificând

două variante pe care le denumeşte A, respectiv B. Ulterior s-a dovedit faptul că

variantele A şi B ale lui Gerrits corespund variantelor β1-cazeinaB, respectiv β1-cazeinac

identificate de către Glasnak (Gallagher şi colab., 1996, Şuteu şi colab., 2009).

Ulterior, în 1987 şi 1989, o echipă de cercetători germani, condusă de G. Erhardt,

întâlnesc din nou un polimorfism al β-cazeinei porcine, numind cele două variante A şi B

(Gallagher şi colab., 1996). În anul 1992, Ng-Kwai-Hang şi Groschclaude (citaţi de către

Gallagher şi colab., 1996) conchid că variantele A şi B ale lui Erhardt sunt probabil

aceleaşi cu variantele A şi B ale lui Gerrits, precum şi cu variantele B şi C ale lui

Glasnak.

Page 10: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

41

La nivel de ADN şi această genă a fost pentru prima oară secvenţiată tot de către

Alexander şi Beattie (1992b). Aceştia au raportat o lungime a cADN-ului de 1100 pb,

excluzând terminaţia poliA. Pentru această proteină, pe baza compoziţiei în aminoacizi

(217) au calculat, sub formă nefosforilată, o masă moleculară de 24397 Da.

Archibald şi colab. (1994) semnalează la locusul β-cazeinei porcine, în urma unor

analize PCR-RFLP, un polimorfism de tip SacI, în urma digestiei rezultând fragmente de

~ 16 kb, respectiv ~14,4 kb.

Denumirea locusului: CSN2.

1.1.4.Studiul polimorfismelor κ-cazeinei porcine

Fără peptida semnal (21 AA), κ-cazeina porcină, con�ine 167 AA, fiind

caracterizată printr-o masă moleculară de 18877,46 Da şi un punct izoelectric pI=8,68

(Şuteu şi colab., 2009).

La nivel de proteină aceasta a fost pentru prima oară izolată de către Woychik şi

Wondolowski, în anul 1969 (Gallagher şi colab.,1996).

Cerning-Beroard (1984) a izolat şi caracterizat κ-cazeina porcină, afirmând că

aceasta prezintă o compoziţie în aminoacizi similară cu cea a κ-cazeinei bovine, cu toate

că proteina porcină conţine aproximativ 177 AA comparativ cu ce bovină care conţine

169 (Mercier şi colab., 1976).

O altă variantă a acestei proteine este cea derivată din secvenţa cADN-ului κ-

cazeinei porcine (Levine şi colab., 1992). Aceasta conţine cu 10 AA mai puţin decât cea

descrisă de Cerning-Beroard (1984).

La nivel de ADN primii care au determinat întreaga secvenţă a cADN-ului κ-

cazeinei porcine au fost Levine şi colab. (1992). Aceştia au raportat o lungime a cADN-

ului de 851 pb. Pentru proteina matură, pe baza compoziţiei în aminoacizi (167) au

calculat, sub formă nefosforilată, o masă moleculară de 18689 Da.

La acest locus, Archibald (1994) arată faptul că ar putea exista un polimorfism de

tip EcoRI,, dar menţionează că fragmentele obţinute au avut o intensitate scăzută.

Denumirea locusului: CSN3.

Page 11: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

42

1.2. STUDIUL PROTEINELOR DIN LACTOSERUM

Proteinele din lactoserum, denumite şi „proteine serice” sunt reprezentate la majoritatea

speciilor de două proteine majore şi anume: α-lactalbumină şi β-lactoglobulină. Relativ

recent (1998) la specia suină a fost identificată o a treia proteină majoră aparţinând

acestei categorii, mai exact: proteina acidă din ser whey acidic protein (WAP).

Proteinele din lactoserum se caracterizează prin faptul că acestea sunt solubile (nu

precipită) în prezenţă unui pH acid (4 -5).

1.2.1. Studiul polimorfismelor α-lactalbuminei porcine

Fără peptida semnal (19 AA), α-lactalbumina porcină, are în componenţa sa un

număr de 122 AA, fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 14155,14 Da şi un

punct izoelectric pI=4,68 (Şuteu şi colab., 2009).

La nivel de proteină, α-lactalbumina porcină a fost pentru prima oară izolată de

către Karlsson, în anul 1966, dar nu a fost caracterizată (Gallagher şi colab., 1996).

Schmidt şi Ebner (1971) izolează α-lactalbumina porcină, şi afirmă că aceasta

conţine 118 AA, având o masă moleculară de 14218 Da. Folosind electroforeza în gel de

amidon Schmidt şi Ebner (1972) pun în evidenţă prezenţa a două variante ale acestei

proteine, pe care le denumesc (în funcţie de profilul de migrare) „rapidă”, respectiv

„lentă”.

Bell şi colab. (1981) pun în evidenţă existenţa a două variante genetice ale acestei

proteine, pe care le denumesc A, respectiv B.

La nivel de ADN, secvenţa cADN-ului α-lactalbuminei porcine a fost determinată

de către Das Gupta şi colab. (1992). Aceştia raportează o similaritate de 83,1% între

varianta porcină şi cea bovină la nivel de secvenţă nucleotidică, respectiv 75,2% în ceea

ce priveşte secvenţa de aminoacizi.

Bleck şi colab. (1995) identifică în cadrul acestei gene un polimorfism cauzat de o

mutaţie punctiformă şi descarcă în GenBank cele două secvenţe: L31944, respectiv

L31945.

Denumirea locusului: LALBA.

Page 12: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

43

1.2.2. Studiul polimorfismelor β-lactoglobulinei porcine

Fără peptida semnal β-lactoglobulina porcină (18 AA), are în componenţa sa un

număr de 160 AA fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 18877,46 Da şi un

punct izoelectric pI=4,60 (Şuteu şi colab., 2009).

La nivel de proteină, conform celor enunţate de Gallagher şi colab. (1996),

această proteină a fost pentru prima oară izolată de către Karlsson în anul 1966.

Primul polimorfism al acestei proteine a fost identificat de către Kalan şi colab.

(1967, 1968), două variante fiind descrise (β-LG A şi β-LG B). În 1969, Kraeling şi

Gerrits, folosind electroforeza verticală în gel de poliacrilamidă, de asemenea identifică

un polimorfism în fracţiunea serică a laptelui speciei suine, denumind variantele

identificate: Whey1A, respectiv Whey1

B. Ulterior dovedindu-se că era vorba despre

acelaşi polimorfism (Kalan şi colab., 1971). De asemenea Kemmer identifică în anul

1969 două variante ale β-lactoglobulinei porcine, dar acestea nu sunt caracterizate

(Gallagher şi colab., 1996).

Bell şi colab. (1970) raportează izolarea β-lactoglobulinelor A şi B, însă nici

acestea nu sunt caracterizate. Ulterior, Bell şi colab. (1981) identifică o a treia variantă

polimorfă a β-LG porcine, pe care o denumesc C.

Folosind focalizarea izoelectrică, Conti şi colab. (1986) identifică 3 variante ale β-

lactoglobulinei, având punctele izoelectrice 4,4; 4,65 şi 4,9, pe care le denumesc β-LG 1,

β-LG 2, respectiv β-LG 3.

La nivel de ADN, această genă a fost secvenţiată de către Alexander şi Beattie

(1992c). Aceştia afirmă că întreaga lungime a cADN-ului β-lactoglobulinei porcine este

de 768 pb, iar aceasta codifică o proteină matură conţinând 160 AA, cu o masă

moleculară de 17811 Da.

Alexander şi Beattie (1992c) semnalează în cazul uneia din cele cinci clone

secvenţiate prezenţa unui codon în plus. Acest codon (AAA) aflat în regiunea 318 – 325

codifică aminoacidul lizină şi este considerat de către autori ca fiind dovada unui

polimorfism genetic la acest locus.

Denumirea locusului: LGB.

Page 13: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

44

1.2.3. Studiul polimorfismelor proteinei acide din ser (WAP)

Proteina acidă din ser (WAP), a fost descoperită relativ recent (1998), motiv

pentru care ea nu a fost atât de intens studiată. Cu toate acestea numeroşi autori au relatat

prezenţa unei aşa-numite „proteină nouă din ser”, dar în majoritatea cazurilor aceasta ori

a fost confundată cu alte proteine, ori nu a fost caracterizată (Gallagher şi colab., 1996).

La nivel de proteină, WAP, fără peptida semnal, are în componenţa sa un număr

de 113 AA, fiind caracterizată printr-o masă moleculară de 22985,86 Da şi un punct

izoelectric pI=5,04 (Şuteu şi colab., 2009). Peptida semnal are o lungime de 19 AA.

Această proteină, cunoscută ca fiind principala proteină din lactoserum la: şoarece,

şobolan, iepure şi cămilă, a fost pentru prima oară izolată şi caracterizată de către

Simpson şi colab. (1998) în cazul speciei suine.

Masa moleculară a WAP în cazul speciei suine în SDS PAGE s-a dovedit a fi

considerabil mai mare decât valoarea de 11,7 kDa calculată pe baza compoziţiei în AA,

ceea ce denotă faptul că această proteină ar fi glicozilată (Simpson şi colab., 1998).

La nivel de ADN, gena WAP a fost clonată şi caracterizată de către Sylvie Rival

şi colab. (2001). Aceasta are o lungime 2087 pb, având în componenţă un număr de 4

exoni. Întreaga secvenţă a genei WAP de la specia suină poate fi accesată în GenBank cu

ajutorul numărului de identificare: AF320306. Cu ajutorul tehnicii FISH, gena WAP, a

fost localizată în regiunea telomerică a perechii de cromozomi 18 (Sylvie Rival şi colab.,

2001).

Page 14: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

45

CAPITOLUL II

STUDIUL POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN LAPTE LA

SPECIA SUINĂ, LA NIVEL DE PROTEINĂ

2.1. MATERIALE �I METODE

Un număr de douăzeci�icinci de probe de lapte, respectiv colostru, provenite de la

diferite rase au fost analizate cu ajutorul tehnicii IEF, descrisă în detaliu de către Şuteu şi

colab., (2009).

2.2. REZULTATE �I DISCU�II

Întrucât această tehnică nu a mai fost utilizată pentru studierea polimorfismelor

lacto-proteinelor la specia suină, interpretarea benzilor rezultate în urma migrărilor IEF

este destul de dificil de realizat. Pentru aceasta au fost calculate punctele izoelectrice (pI)

pentru toate cele 7 proteine (Tab. 1). Acestea au fost calculate pe baza compoziţiei

aminoacide a proteinelor, cu ajutorul programului de pe pagina de Internet

www.uniprot.org. Trebuie menţionat faptul că aceste puncte izoelectrice aparţin

proteinelor în formă nefosforilată.

Tabelul 1.

Caracterizarea proteinelor majore din lapte la specia suină (fără peptida semnal)

ProteinaNumărul de aminoacizi

(AA)Punct izoelectric

(pI)Masa moleculară

(Da)

S1-CN 191 5,88 22576,03S2-CN 220 5,78 25866,00β-CN 217 5,77 24377,32κ-CN 167 8,68 18877,46-LA 122 4,68 14155,14β-LG 160 4,60 17863,51WAP 113 5,04 11985,86

Page 15: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

46

Pe baza acestor puncte izoelectrice am determinat următoarea succesiune a

proteinelor în gelurile IEF: β-LG; -LA; WAP; β-CN; S2-CN; S1-CN; κ-CN. Utilizând

condi�iile actuale de migrare (pH=4,2-7), variantele κ-cazeinei nu pot fi vizualizate,

aceasta având pI=8,68 (Tab. 1).

Analiza profilelor electroforetice a probelor de colostru a scos în evidenţă

existenţa unui polimorfism în cazul indivizilor aparţinând rasei Marele alb. Având în

vedere regiunea din gel în care au fost observate profile electroforetice diferite şi ţinând

seama de punctele izoelectrice ale lacto-proteinelor speciei suine am concluzionat că este

vorba despre un polimorfism al β-cazeinei (Şuteu şi colab., 2009). Variantele proteice

care au prezentat profile electroforetice diferite, aparţinând β-cazeinei, au fost denumite

A, respectiv B. Fiind vorba despre markeri genetici codominanţi cele două variante au

generat trei genotipuri: AA, AB, respectiv BB. Proteina cu o mobilitate electroforetică

mai ridicată (care a migrat mai mult) a fost denumită varianta A, în timp ce varianta B

este cea care a migrat mai aproape de capătul anodic al gelului.

Polimorfisme ale β-cazeinei porcine au mai fost raportate (Glasnak, 1966; Gerrits,

1969; Erhardt �i colab., 1987, 1989, cita�i de către Gallagher �i colab., 1996), dar

având în vedere faptul că tehnicile folosite în detecţie au fost diferite nu putem compara

cele două variante (A şi B) cu cele descrise anterior, motiv pentru care este necesară

caracterizarea acestui polimorfism la nivel de ADN.

Figura 1 prezintă profilul de migrare al probelor de lapte provenite de la indivizi

din rasele Mangaliţa, Bazna, respectiv Marele alb (probele de colostru – folosite ca probe

de referinţă). Analizând acest gel se poate observa că polimorfismul β-CN, descris

anterior, este întâlnit şi la rasele autohtone luate în studiu, fiind identificate ambele

variante proteice la ambele rase.

De asemenea, în Figura 1, poate fi observat şi cel de-al doilea polimorfism al

lacto-proteinelor speciei suine identificat utilizând această tehnică. Este vorba de un

polimorfism al β-lactoglobulinei, proteină care la toţi indivizii (exceptând 2 indivizi din

rasa Mangaliţa) a focalizat într-un singur punct, rezultând o singură bandă. A fost

denumită β-LG A variantă proteică majoritară. Caracterizarea la nivel molecular (prin

secvenţierea ADNc a genei codificatoare) a acestor două variante proteice şi compararea

cu secvenţele existente în bazele de date consacrate va permite atribuirea unor denumiri

Page 16: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

47

finale acestor proteine. Varianta B este caracterizată de un profil de migrare mai catodic,

comparativ cu varianta A. Deocamdată a fost identificată doar la indivizi aparţinând rasei

Mangaliţa (Tab. 3) şi doar în combinaţie cu varianta A (în stare heterozigotă). În cazul în

care această variantă, pe baza unor studii mai ample, se dovedeşte a fi întâlnită doar la

rasa Mangaliţa, atunci β-LG B va putea fi testată/utilizată ca marker genetic de

apartenenţă la rasă sau pentru trasabilitatea produselor fabricate din carne provenită de la

animale din această rasă.

Figura 1. Profil IEF comparativ al unor probe de lapte, respectiv colostru provenind de la

specia suină. Câmpurile1 şi 2 rasa Mangaliţa, câmpurile 3 şi 4 rasa Bazna,

câmpurile 5, 6 şi 7 rasa Marele alb, probe de referinţă (original).

În ceea ce priveşte αS1-CN, αS2-CN, α-LA şi WAP, acestea, în cazul indivizilor

analizaţi, sunt monomorfe. Genotipurile identificate, la locii β-CN şi β-LG sunt

prezentate în Tabelul 2, respectiv Tabelul 3.

β-LG B

β-CN A

β-CN B

AB

β-LG A

Page 17: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

48

Tabelul 2.

Numărul genotipurilor observate la locusul β-cazeinei porcine

RasaNumărul de

probeGenotipuri observate la locusul β-CN

AA AB BBMarele alb 13 6 4 3Pietrain 3 3 - -Duroc 4 4 - -Mangaliţa 3 1 2 -Bazna 2 - 1 1

Tabelul 3.

Numărul genotipurilor observate la locusul β-lactoglobulinei porcine

RasaNumărul de

probe Genotipuri observate la locusul β-LG

AA AB BBMarele alb 13 13 - -Pietrain 3 3 - -Duroc 4 4 - -Mangaliţa 3 1 2 -Bazna 2 2 - -

2.3. CONCLUZII

1. Utilizând tehnica IEF, a fost identificat un polimorfism al β-cazeinei porcine,

fiind identificate două variante care au fost denumite β-CN A, respectiv β-CN B. Rasele

Pietrain şi Duroc prezintă doar varianta β-CN A, în timp ce la rasele Marele alb,

Mangaliţa şi Bazna au fost identificate ambele variante.

2. În cazul β-lactoglobulinei porcine a fost detectată o nouă variantă polimorfă,

denumită provizoriu β-LG B. Studiile viitoare vor duce la o caracterizare completă şi o la

denumire finală a acestei variante. Deocamdată prezenţa acestei variante a fost semnalată

doar la rasa Mangaliţa.

3. În ceea ce priveşte αS1-CN, αS2-CN, α-LA şi WAP, acestea, în cazul indivizilor

analizaţi, sunt monomorfe.

Page 18: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

49

CAPITOLUL III

POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.647A>G

3.1. MATERIALE �I METODE

Colectarea probelor de lapte Extracţia ARN s-a făcut, în cazul indivizilor

purtători ai unor variante diferite ale β-cazeine porcine, folosind aceleaşi probe de lapte

ca şi în cazul focalizării izoelectrice.

Colectarea probelor de sânge Au fost colectate un număr de 31 de probe de

sânge de la indivizi aparţinând raselor Bazna (12 cap.) şi Mangaliţa (19 cap.) din cadrul

S.C.D.A. Turda, în vederea extracţiei de ADN.

În cazul raselor Marele alb, Landrace �i Pietrain probe de sânge ne-au fost puse la

dispozi�ie de către Prof. Nadine Buys (KU Leuven), extrac�ia de ADN fiind realizată în

cadrul laboratorului PROGENUS.

Extracţia ARN-ului din lapte

În vederea secvenţierii cADN-ului β-cazeinei porcine, a fost extras ARN-ul de la

indivizii identificaţi a fi purtători ai unor variante diferite ale acestei proteine (AA, AB,

BB). Extracţia ARN-ului a fost efectuată folosind reactivul PureZOL (BioRad).

Obţinerea şi secvenţierea cADN-ului β-cazeinei porcine

Pentru obţinerea cADN-ului, a fost efectuată reverstranscripţia probelor de ARN

extrase, utilizând kit-ul RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit

(Fermentas), respectând instrucţiunile producătorului.

Pentru obţinerea cADN-ului β-cazeinei porcine, 2 μl de ADNc total au fost

amplificaţi utilizând kit-ul de amplificare GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega) şi

perechea de primeri BCZP-F şi BCZP-R. Primerii au fost creaţi cu ajutorul programului

Fermentas REviewer (http://www.fermentas.com) utilizând ca secvenţă de referinţă

secvenţa lui Alexander şi Beattie (1992), GenBank X54974, aceştia având următoarele

secvenţe:

BCZP-F 5'-3': GCA AGA GCG AAG GAA GAA CT

BCZP-R 5'-3': CAA AAG TGA GGA GAG GGC AT

Page 19: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

50

3.2. REZULTATE �I DISCU�II

Pentru a caracteriza la nivel molecular variantele polimorfe ale β-cazeinei porcine

(identificate cu ajutorul IEF) a fost extras ARN-ul din probe de lapte provenite de la trei

indivizi cu următoarele genotipuri: AA, AB şi BB. Probele de ARN au fost

reverstranscriptate, iar cADN-ul total a fost amplificat cu ajutorul perechii de primeri

BCZP F şi R. Probele astfel ob�inute au fost secven�iate folosind aceea�i pereche de

primeri (Fig. 2).

Figura 2. Cromatogramele de secvenţiere ale cADN-ului β-cazeinei porcine provenind

de la trei indivizi purtători ai unor variante genetice diferite ale acestei gene. Evenimentul

mutaţional este marcat printr-o căsuţă (original).

Secvenţierea cADN-ului β-cazeinei porcine a confirmat polimorfismul identificat

la acest locus (Şuteu şi colab., 2009).

În Figura 2 poate fi observată porţiunea din cromatogramele de secvenţiere unde

se găseşte substituţia la nivel nucleotidic ce a cauzat apariţia a două variante proteice.

Această substituţie a avut loc în poziţia 647 a cADN-ului, dar pe cromatograme apare în

poziţia 578 întrucât primerul forward se ataşează în interiorul cADN-ului, după porţiunea

codificatoare a peptidei semnal.

BB-IEF201Q

AB-IEF201QR

AA-IEF201R

Page 20: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

51

După cum se poate observa (Fig. 2) în cazul genotipului BB în poziţia 647 a

cADN-ului se găseşte o adenină, care în cazul genotipului AA a fost substituită de către o

guanină (c.647A>G). În cazul individului heterozigot se pot observa două peak-uri

suprapuse, unul de culoare verde şi unul de culoare neagră, ceea ce denotă faptul că în

această poziţie este prezentă atât guanina specifică varintei A cât şi adenina specifică

variantei B.

Substituţia A/G din poziţia 647 a cADN-ului modifică aminoacidul din poziţia 201

a proteinei mature, astfel codonul CAA codifică glutamina (Q), în timp ce codonul CGA

codifică arginina (R).

Rezultatele secvenţierii sunt în perfectă concordanţă cu rezultatele obţinte în urma

migrării IEF. Astfel, aminoacidul arginină (R) din poziţia 201 face ca proteina matură să

aibă un punct izoelectric pI=5,99 – fapt ce este reliefat la nivelul IEF printr-un profil de

migrare mai catodic (varianta A). Pe de altă parte, dacă în poziţia 201 a proteinei mature

se regăseşte aminoacidul glutamină (Q), punctul izoelectric al proteinei devine pI=5,77 –

conferind proteinei (varianta B) un profil de migrare mai anodic comparativ cu varianta

A. Desigur, profilul de migrare IEF al β-cazeinei porcine în cazul indivizilor heterozigoţi

este caracterizat prin apariţia a două benzi.

Pentru a facilita discuţiile referitoare la aceste două variante, în continuare ele vor

fi denumite în funcţie de aminoacidul din poziţia 201 – cea care le diferenţiază (201R,

respectiv 201Q – Tab. 4).

Tabelul 4.

Denumirea finală a variantelor β-cazeinei porcine

Denumirea finală a

genotipurilor β-cazeinei

Caracterizarea variantelorDenumirea variantelor la migrarea

IEF

Nucleotida din

poziţia 647 a cADN-ului

Aminoacidul din poziţia 201 a

proteinei mature

Punctul izoelectric al

proteinei mature

201R AA GG Arginină (R) 5,99201Q BB AA Glutamină (Q) 5,77

201QR AB AGGlutamină/Arginină

Q/R5,77/5,99

Page 21: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

52

În ceea ce priveşte mutaţia punctiformă din poziţia 647 a cADN-ului (substituţia

A/G), analizând secvenţele cunoscute până la această dată, observăm că la majoritatea lor

în această poziţie a fost identificată prin secvenţiere adenina (GenBank NM_214434,

X54974, EU025876, EU213063), în timp ce doar două secvenţe aflate în GenBank

semnalează prezenţa guaninei (EU242520, GU827390). Întrucât secvenţe similare (în

ceea ce priveşte poziţia 647 a cADN-ului β-cazeinei porcine) cu cele obţinute de către noi

în urma secvenţierii existau deja în GenBank, am decis să nu le depozităm în această

bază de date.

Protocol PCR – RFLP pentru evidenţierea polimorfismului Q201R

Prin efectuarea unor alinieri de secvenţe s-a constat că la nivelul genei, nucleotida

din poziţia 647 a cADN-ului face parte din exonul 6. Acesta este cel mai mare exon al

genei codificatoare a β-cazeinei la specia suină, având o lungime de 519 pb.

Amplificarea probelor de ADN extras din sânge s-a făcut cu ajutorul perechii de

primeri E6BP F şi R. Aceştia sunt complementari unor regiuni din intronii ce flanchează

exonul 6, fragmentul rezultat în urma amplificării având o lungime de 1216pb (Fig. 3).

Figura 3. Profilul electroforetic a trei probe de ADN provenite de la specia suină

amplificate cu primerii E6BP F şi R. Câmpul 1: GeneRuller 1 kb DNA Ladder

(Fermentas), câmpul 2: individ 201QR, câmpul 3: individ 201Q, câmpul 4: individ 201R,

câmpul 5: control negativ. Original.

Page 22: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

53

Restricţia produşilor de amplificare a fost realizată cu ajtorul enzimei StyI

(Fermentas, FastDigest). În cazul alelei 201Q prezenţa unei adenine în poziţia 473 a

exonului 6 (647 din cADN) crează un situs suplimentar de restricţie pentru enzima mai

sus menţionată. Conform hărţii teoretice de restricţie a fragmentului amplificat, în urma

digestiei cu enzima StyI, rezultă următoarele fragmente:

201Q: 679pb + 434pb + 85pb + 18pb;

201R: 1113pb + 85pb + 18pb;

201QR: 1113pb + 679pb + 434pb + 85pb + 18pb.

Figura 4. Profilele de migrare aparţinând celor trei genotipuri de la acest locus;

consecutiv restricţiei produşilor de amplificare cu enzima StyI (Fermentas FastDigest).

Câmpul 1: produs nerestrictat, câmpul 2: AmpliSize Molecular Ruler 50-2,000 bp Ladder

(BioRad), câmpul 3: 201QR, câmpul 4: 201R, câmpul 5: 201Q (original).

Migrarea probelor de ADN amplificate cu ajutorul primerilor E6BP F şi R şi

restrictate cu enzima StyI, confirmă substituţia A/G identificată prin secvenţierea cADN-

ului β-cazeinei porcine (Fig. 2), confirmând de asemenea veridicitatea hărţii de restricţie

teoretice. Trebuie menţionat că fragmentul de 18 pb, datorită dimensiunii sale reduse, nu

poate fi vizualizat. Astfel cele prezentate anterior se constituie într-un protocol de

genotipizare adecvat evidenţierii polimorfismului Q201R din cadrul β-cazeinei porcine.

Page 23: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

54

Genotipizările efectuate până în prezent, utilizând protocolul descris anterior, au

condus la obţinerea următoarelor rezultate:

Tabelul 5.

Structura genetică a popula�iilor analizate, la locusul β-cazeinei,

privind polimorfismul Q201R (c.647A>G)

RASA N

Numărul de indivizi apar�inând fiecărui

genotip

Frecven�ele genotipurilor

Frecven�ele genelor

201Q 201QR 201R P201Q H201QR Q201R p201Q q201R

Landrace 41 0 3 38 0 0.07 0.93 0.035 0.965Pietrain 40 0 0 40 0 0 1 0 1Large White 36 2 17 17 0.06 0.47 0.47 0.295 0.705Landrace (CRA–W) 26 0 0 26 0 0 1 0 1Mangali�a 13 0 3 10 0 0.23 0.77 0.115 0.885Bazna 11 1 8 2 0.09 0.73 0.18 0.445 0.545

3.3. CONCLUZII

1. Perechea de primerii BCZP F şi BCZP R, a căror design a fost realizat în cadrul

echipei de cercetare, sunt adecvaţi amplificării şi secvenţierii cADN-ului β-cazeinei

porcine.

2. Prin secvenţierea cADN-ului β-cazeinei porcine a fost caracterizat polimorfismul

acestei proteine identificat cu ajutorul IEF. Astfel, o substituţie A/G în poziţia 647 a

cADN-ului (473 a exonului 6) face ca în poziţia 201 a proteinei mature să fie introdusă o

glutamină (în cazul existenţie unei guanine) sau o arginină (în cazul existenţei unei

adenine). Aminoacidul din această poziţie modifică punctul izoelectric al proteinei

mature, fenomen ce a stat la baza apariţiei unor profile diferite de migrare IEF. Acest

polimorfism a fost denumit „Q201R”.

3. Perechea de primeri E6BP F şi R amplifică cu succes exonul 6 al genei CSN2,

unde se regăseşte la nivel de ADN SNP-ul descris la punctul anterior. Deoarece adenina

din poziţia 473 a exonului 6 (647 din cADN) crează un situs suplimentar de restricţie

pentru enzima StyI, a putut fi pus la punct un protocol de genotipizare având la bază

Page 24: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

55

această enzimă, ce poate face diferenţa la nivel alelic între variantele 201Q, 201R,

respectiv poate evidenţia genotipul 201QR.

CAPITOLUL IV

POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.294T>G

4.1. MATERIALE �I METODE

Materialele �i metodele utilizate pentru caracterizarea acestui polimorfism sunt

identice cu cele amintite în capitolul anterior.

Pentru dezvoltarea protocolului de genotipizare au fost utiliza�i aceea�i primeri

(întrucât �i substitu�ia c.294T>G este localizată în exonul 6), dar restric�ia a fost

realizată cu ajutorul enzimei HpaII.

4.2. REZULTATE �I DISCU�II

Pe parcursul experimentelor efectuate în vederea caracterizării polimorfismului

Q201R al β-cazeinei porcine (capitolul anterior), în urma alinierii secvenţelor aferente

cADN-ului acestei gene, a fost identificată o alelă nouă la acest locus. Ca şi în situaţia

precedentă, cADN-ul a fost obţinut prin amplificarea cADN-ului total cu primerii BCZP

F şi R.

Fiind vorba despre o alelă necunoscută până la acea dată, secvenţa acesteia a fost

descărcată în baza de date GenBank, primind numărul de identificare GU827390.

Analizând cromatogramele de secven�iere (Fig. 5) putem constata că acestea sunt

identice, singura diferenţă dintre ele fiind nucleotida încadrată într-o căsuţă. La nivel de

ADNc această mutaţie punctiformă a avut loc în poziţia 294, poziţie în care toate

secvenţele β-cazeinei porcine existente la această dată în GenBank prezintă o timină

(Tab. 6). Tocmai guanina din poziţia 294, ce diferenţiază noua alelă de restul secvenţelor

întâlnite în GenBank, ne-a determinat să o denumim „alela G”.

Page 25: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

56

Figura 5. Cromatograma de secvenţiere aparţinând alelei G a β-cazeinei porcine (partea

superioară) comparativ cu o alelă normală (partea inferioară). Evenimentul mutaţional

este marcat printr-o căsuţă (original).

Substituţia T/G, întâlnită în poziţia 294 a cADN-ului alelei G (c.294T>G), este de

fapt o „mutaţie silent” întrucât, atât codonul CCT, cât şi codonul CCG, codifică

aminoacidul prolină (P). Cu toate acestea, ţinând cont de toate mutaţiile întâlnite în cazul

acestei alele (Tab. 6), proteina obţinută pe baza translaţiei teoretice a secvenţei

nucleotidice este una distinctă, neexistând similarităţi de 100% la alinierea secvenţei

aminoacide cu orice altă secvenţă a β-cazeinei porcine cunoscută până la această dată.

Tabelul 6.

Centralizare a alinierilor de secvenţe pentru β-cazeina porcină

Secvenţa(GenBank Acc. No.)

Poziţia din cADN147 175 294 433 435 443 468 590 647

GU827390 T A G G T G C G GNM_214434 T A T G T T T G AX54974 T A T G T T T G AEU24520 A G T A T G C G GEU025876 T A T G T T T G AEU213063 T A T G C T T A A

Page 26: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

57

Pornind de la mutaţia punctiformă din poziţia 249 a cADN-ului (la nivel de ADN

– nucleotida 120 a exonului 6), pe baza faptului că guanina din poziţia menţionată crează

un situs de restricţie pentru endonucleaza HpaII, a fost pus la punct un protocol de

genotipizare adecvat evidenţierii alelei G a β-cazeinei porcine (detaliat de către Şuteu şi

colab., 2010, 2011a).

Genotipizările efectuate până la această dată indică faptul că alela G nu este strict

limitată la rasa Mangaliţa (în cadrul căreia a fost descoperită), astfel:

Tabelul 7.

Structura genetică a popula�iilor analizate, la locusul β-cazeinei,

privind polimorfismul c.294T>G

RASA N

Numărul de indivizi apar�inând fiecărui

genotip

Frecven�ele genotipurilor

Frecven�ele genelor

TT TG GG PTT HTG QGG pT qG

Landrace 40 27 11 2 0.675 0.275 0.05 0.8125 0.1875Pietrain 38 11 19 8 0.29 0,5 0.21 0.54 0.46Large White 32 20 12 0 0.625 0.375 0 0.8125 0.1875Landrace (CRA–W) 26 17 9 0 0.65 0.35 0 0.825 0.175Mangalita 15 5 10 0 0.33 0.67 0 0.67 0.33

4.3. CONCLUZII

1) Experimentele ce au vizat caracterizarea polimorfismului Q201R al β-cazeinei

porcine, în speţă secvenţierea cADN-ului acestei gene, au permis identificarea unei noi

alele la acest locus, caracterizată prin prezenţa unei guanine în poziţia 294 a cADN-ului.

Această nouă alelă a fost denumită alela „G”, iar secvenţa ei se a fost descărcată în baza

de date GenBank, primind numărul de identificare GU827390.

2) Proteina dedusă prin translaţia teoretică a secvenţei nucleotidice a alelei G a β-

cazeinei porcine este de asemenea unică: ADE60010 (NCBI Protein, EBI), D5LG68

(UniProt). Deşi mutaţia care diferenţiază alela G de celelalte secvenţe ale β-cazeinei

porcine este o mutaţie silent (nu modifică aminoacidul), luată în întregime proteina

codificată de către alela G nu prezintă similaritate de 100% cu niciuna dintre secvenţele

aminoacide cunoscute până la această dată.

Page 27: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

58

CAPITOLUL V

POLIMORFISMUL β-CAZEINEI PORCINE c.175G>A

5.1. MATERIALE �I METODE

Reactivii �i metodele utilizate în cadrul acestui capitol sunt identice cu cele

amintite anterior.

Consecutiv migrării în gel de agaroză a produ�ilor PCR rezulta�i în urma

amplificării cADN-ului β-cazeinei porcine, pe lângă fragmentul a�teptat, având o lngime

de 693 pb, a putut fi vizualizat �i un fragment mai scurt (174 bp). Ini�ial am privit acest

fragment ca produs de amplificare nespecific, dar deoarece acesta a persitat �i după

modificarea parametrilor amplificării (cre�terea temperaturii de aliniere a primerilor,

scăderea concentra�iei primerilor) am decis să îl secven�iem. Pentru aceasta a fost

necesară decuparea acestuia din gel �i reamplificarea. Purificarea acestui fragment din

gel a fost realizată cu ajutorul kit-ului Zymoclean Gel DNA Recovery Kit.

5.2. REZULTATE �I DISCU�II

Probele de ARN total extrase din celulele somatice recuperate din lapte au fost

reverstranscriptate, ulterior fiind amplificate cu ajutorul perechii de primeri BCZP F �i

R, primeri specifici β-cazeinei porcine. Ace�ti primeri au fost crea�i pornind de la

secven�a lui Alexander �i Beattie (1992) – X54974. Consecutiv migrării în gel de

agaroză a probelor astfel ob�inute, pe lângă fragmentul a�teptat de 693 pb, un al doilea

produs de amplificare, mult mai scurt (174 pb) a putut fi vizualizat (Fig. 6, câmpul3).

Fragmentul de 174 pb (Fig. 6, câmpul 3) a fost purificat, reamplificat �i

secven�iat cu aceea�i primeri (BCZP F �i R). Secven�ierea fragmentului de 174 pb a

demonstrat că acesta este o variantă a β-cazeinei porcine căreia îi lipse�te exonul 6 (519

nt).

Page 28: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

59

693 pb

174 pb

Secven�a acestei noi variante transcrip�ionale a β-cazeinei porcine a fost

descărcată în baza de date GenBank primind identificatorul HM114445.

Figura 6. Profilul de migrare al cADN-ului β-cazeinei porcine ob�inut prin amplificarea

probelor de cADN total cu primerii BCZP F �i R. L: 50 bp DNA Ladder (Fermentas).

Câmpul 1: cADN-ul unei scroafe care prezintă fenomenul de splicing alternativ. Câmpul

2: cADN al β-cazeinei porcine matural normal. Câmpul 3: fragmentul de 174 pb decupat

�i purificat din gel �i reamplificat. NC: control negativ. Original.

Pentru a elucida mecanismul care a condus la apari�ia acestui fenomen de

maturare alternativă a ARN-ului mesager (splicing alternativ) au fost crea�i o pereche de

primeri complementari unor por�iuni din intronii care flanchează exonul 6 (E6BP F �i

R). Ace�ti primeri au fost folosi�i pentru a amplifica această regiune în cazul unor

scroafe la care fenomenul de splicing alternativ s-a manifestat (Fig. 6, câmpul 1),

respectiv scroafe al căror ARN a fost maturat corespunzător (Fig. 6, câmpul 2).

Secven�ierea acestei por�iuni indică faptul că o muta�ie punctiformă la nivelul

jonc�iunii intron-exon este cea care cauzează apari�ia fenomenului de splicing

alternativ (Fig. 7).

Substitu�ia identificată prin secven�iere (c.175G>A) afectează prima nucleotidă

a exonului 6. În cazul scroafelor la care prima nucleotidă a acestuia este A, ARN-ul

mesager este maturat alternativ, luând astfel na�tere doi transcri�i. Când este prezentă

guanina, ARN-ul mesager este maturat corect.

Muta�ia c.175G>A cauzează, în proteina cu lungime normală (217 AA) o

substitu�ie a aminoacizilor: p.Asp59Asn.

Page 29: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

60

Se remarcă faptul că la to�i indivizii analiza�i fragmentul de 693 pb a fost

prezent într-o cantitate mai ridicată comparativ cu cel de 174 pb, ceea ce denotă că �i în

laptele scroafelor cu genotip AA proteina cu lungimea normală (217 AA) este prezentă

într-o cantitate superioară comparativ cu cea a varinatei de 44 aa.

Figura 7. Probe de ADN amplificate cu primerii E6BP F �i R �i secven�iate cu

primerul sens. Cromatograma de secven�iere de deasupra apar�ine unei scroafe l-a care

nu s-a manifestat fenomenul de splicing alternativ. Cromatograma de dedesubt apar�ine

unei scroafe care a prezentat doi transcri�i ai cADN-ului β-cazeine (a fost prezent

fragmentul de 174 pb – splicing alternativ). Evenimentul muta�ional, prima nucleotidă a

exonului 6 este marcată printr-o căsu�ă (original).

Substitu�ia c.175G>A (Fig. 7) poate fi pusă în eviden�ă prin intermediul unui

PCR–RFLP, deoarece când guanina este prezentă în această pozi�ie aceasta crează un

situs suplimentar de restric�ie pentru enzima PfoI. Acest protocol de genotipizare

(detaliat de către �uteu �i colab., 2011) permite depistarea scroafelor în al căror lapte va

fi prezent acest nou izoform al β-cazeinei porcine.

Varianta β-cazeinei porcine dedusă pe baza transla�iei teoretice a secven�ei

HM114445 are o lungime de doar 44 AA, fa�ă de 217 AA când ARN-ul este maturat

corespunzător. Fenomenul de splicing alternativ �i muta�ia cauzatoare (c.175G>A) au

fost confirmate prin secven�iere la 6 indivizi neînrudi�i, proveni�i din trei rase diferite.

Page 30: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

61

Explica�ia faptului că această substitu�ie cauzează splicingul alternativ rezidă în

faptul că în cazul intronilor mari (în cazul de fa�ă 1206 nt) �i a exonilor mari (în cazul

de fa�ă 519 nt) arhitectura intro/exon joacă un rol crucial în recunoa�terea (de către

ma�inăria spliceosomală) a situsurilor de splicing (Hertel, 2008).

Întrucât rolul biologic al acestei variante noi a β-cazeinei porcine nu este încă

elucidat �i având în vedere că evenimente similare documentate în cazul altor specii au

avut un impact însemnat asupra calită�ii laptelui, este posibil ca β-cazeina (CSN2) să fie

următorul marker în selec�ia suinelor.

Un studiu preliminar, efectuat pe un număr de 26 de scroafe, apar�inând rasei

Landrace, nu a semnalat diferen�e sus�inute statistic asupra dinamicii de cre�tere a

loturilor de purcei proveni�i de la scroafe cu genotipuri diferite (pe parcursul perioadei

de alăptare).

5.3. CONCLUZII

1. Prin secven�iere a fost identificată substitu�ia primei nucleotice a exonului 6 a β-

cazeinei porcine (c.175G>A). În cazul scroafelor care prezintă în această pozi�ie A,

ARN-ul mesager al β-cazeinei este maturat alternativ, fiind prezente în laptele acestora

două variante ale acestei proteine. Prima variantă este cea normală, având o lungime de

217 AA, în timp ce a doua este mult mai scurtă, având în compozi�ia sa doar 44 AA,

întrucât substitu�ia c.175G>A modifică arhitectura intron/exon, iar în cazul prezen�ei

adeninei exonul 6 (519 nt) este înlăturat în timpul maturării ARN-ului mesager precursor

(splicing alternativ).

2. Molecula de ARN matur codificatoare a variantei scurte a β-cazeinei (44 AA) a

fost reverstranscriptată �i secven�iată. Secven�a a fost descărcată în GenBank primind

identificatorul HM114445.

3. Pe baza transla�iei teoretice a secven�elor nucleotidice s-a arătat că muta�ia

c.175G>A determină în cazul variantei normale a β-cazeinei o substitu�ie a

aminoacidului din pozi�ia 59 a proteinei, aspartanul fiind înlocuit de asparagină.

Page 31: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

62

4. Pe baza faptului că G din pozi�ia 175 a cADN-ului crează un situs suplimentar de

restric�ie pentru endonucleaza Pfo I, am dezvoltat un test de tip PCR–RFLP care

permite diferen�ierea la nivel alelic.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Alexander, L. J., C. W. Beattie (1992a) The sequence of porcine αS1 – casein cDNA:

evidence for protein variants generated by altered RNA splicing. Animal

Genetics 23: 283-28.

2. Alexander, L. J., C. W. Beattie (1992b) The sequence of porcine β – casein cDNA.

Animal Genetics 23: 369-371.

3. Alexander, L.J., C. W. Beattie (1992c) Sequence of porcine β-lactoglobulin cDNA.

Animal Genetics 23: 263-265

4. Alexander, L. J., N. A. Das Gupta, C. W. Beattie (1992) The sequence of porcine αS2

– casein cDNA. Animal Genetics 23: 365-367.

5. Archibald, A. L., S. Couperwhite, C. S. Haley, C. W. Beattie, L. J. Alexander (1994)

RFLP and linkage analysis of the porcine casein loci-CASAS1, CASAS2,

CASB AND CASK. Animal Genetics 25: 349-351.

6. Bâlteanu, V. A. (2010) Teză de doctorat. USAMV Cluj-Napoca.

7. Gallagher, D. P., P. F. Cotter, D. M. Mulvihill (1996) Porcine milk protein: a review.

Int. Dairy J. 7: 99–118.

8. Simpson, K. J., P. Bird, D. Shaw, K. Nicholas (1998) Molecular characterization and

hormone-dependent expression of porcine whey acidic protein gene. Jurnal

of Molecular Endocrinology. 20: 27-35.

9. Şuteu, M., A. Vlaic, V. Balteanu, F. Pop (2009) Porcine milk protein polymorphisms

detection by means of isoelectric focusing. Bulletin of UASVM Cluj-Napoca.

Animal Science and Biotechnologies 66 (1-2): 146-151.

10. Şuteu, M., Vlaic A., V.A. Bâlteanu, Wavreille J., Renaville R. (2011b) Evidence of

alternative splicing of porcine β-casein (CSN2). Animal Genetics. doi:

10.1111/j.1365-2052.2011.0281.x.

Page 32: STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR … · studiul proteinelor ce alcĂtuiesc fracŢiunea cazeinicĂ Fracţiunea cazeinică a laptelui, la specia suină, este alcătuită

63

11. Vlaic, A., D. Ciobanu, T. Oroian (2001) Research concerning the associations

between the genotypes at the kappa-casein locus and milk production traits

in cattle. Journal of Agricultural Sciences. 1: 45-48.