Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

20
„Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007- 2013” Investeşte în oameni! Universitatea de Vest “Vasile Goldiş” din Arad Conducător de doctorat, Prof. univ. dr. Doctorand, AUREL ARDELEAN BLAGA (ORODAN) MARIA - Arad- 2013 TEZĂ DE DOCTORAT STUDIUL EFECTELOR RADIAŢIILOR DE TIP UV- B ASUPRA EVOLUŢIEI UNOR PROCESE MORFOLOGICE ŞI BIOCHIMICE, LA HIBRIZI DE ZEA MAYS L., - IMPLICAŢII SOCIO- ECONOMICE

Transcript of Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

Page 1: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

„Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007- 2013”

Investeşte în oameni!

Universitatea de Vest “Vasile Goldiş” din Arad

Conducător de doctorat,

Prof. univ. dr.

Doctorand,

AUREL ARDELEAN

BLAGA (ORODAN) MARIA

- Arad-

2013

TEZĂ DE DOCTORAT

STUDIUL EFECTELOR RADIAŢIILOR DE TIP UV-

B ASUPRA EVOLUŢIEI UNOR PROCESE

MORFOLOGICE ŞI BIOCHIMICE, LA HIBRIZI DE

ZEA MAYS L., - IMPLICAŢII SOCIO-

ECONOMICE

Page 2: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

2

CUPRINS

PREFAŢĂ

CAPITOLUL 1. CONSIDERAŢII GENERALE

1.1. IMPORTANŢA LUMINII ÎN CREŞTEREA ŞI DEZVOLTAREA

PLANTELOR

1.1.1. Reacţiile plantelor în funcţie de calitatea luminii

1.2. UNDELE ŞI RADIAŢIILE ELECTROMAGNETICE, SPECTRUL

ELECTROMAGNETIC

1.2.1. Mărimi fizice care descriu fenomenul de propagare a undelor

electromagnetice (lungimea de undă, perioada, frecvenţa)

1.2.2. Clasificarea undelor şi a radiaţiilor electromagnetice. Spectrul

electromagnetic

1.2.3. Energia radiaţiilor electromagnetice şi interacţiunea lor cu material

1.2.4. Interacţiunea radiaţiilor neionizante cu materia

1.2.4.1. Transferul energiei undelor electromagnetice către molecule.

1.2.4.2. Transferul energiei undelor electromagnetice către electronii periferici ai

atomilor şi moleculelor, Ee.

1.2.4.3. Transferul energiei undelor electromagnetice către molecule, având drept

rezultat creşterea reactivităţii chimice a acestora ori producerea unor

reacţii fotochimice.

1.3. INFLUENŢA EXERCITATĂ DE CĂTRE RADIAŢIILE ULTRAVIOLETE

(UV), DE DIFERITE LUNGIMI DE UNDĂ, ASUPRA PLANTELOR

1.3.1. Efectul mutagen al radiaţiilor UV

1.3.2. Impactul şi efectele induse de ozon asupra plantelor

1.3.3. Efecte şi modificări fiziologice şi celulare produse plantelor de acţiunea

radiaţiilor UV

1.3.4. Radiaţiile UV-B şi mecanismele de protecţie a plantelor împotriva acestora

1.4. CĂILE DE MORFOGENEZĂ LA PLANTE, RESPECTIV GENERAREA DE

CALUS (CALUSOGENEZA) ŞI ORGANOGENEZA (EMBRIOGENEZA,

CAULOGENEZA, RIZOGENEZA, FILOGENEZA) LA VITROCULTURILE

VEGETALE

1.4.1. Culturile in vitro: definiţie, caracterizare

1.4.2. Calusogeneza şi cultura de calus

1.4.3. Rizogeneza in vitro

1.4.4. Caulogeneza in vitro

Page 3: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

3

1.4.5. Scurt istoric al cercetărilor efectuate asupra gramineelor iradiate cu

radiații ultraviolete (UV)

1.4.6. Biotehnologia vegetală, ecobioeconomia și siguranţa alimentelor, efectul

radiațiilor - implicaţiile socio-economice

CAPITOLUL 2. CERCETĂRI PROPRII

2.1. INTRODUCERE

2.2. SCOPUL CERCETĂRILOR EFECTUATE ÎN CADRUL TEZEI DE

DOCTORAT

2.2.1. Obiectivele cercetărilor efectuate în cadrul tezei de doctorat

2.3. MATERIALE ŞI METODELE DE LUCRU UTILIZATE ÎN PREZENTA TEZĂ

DE DOCTORAT

2.3.1. Materialul vegetal utilizat în experimente – explante şi cariopse de Zea mays

L., hibrizii Helga şi ZP471

2.3.1.1. Încadrarea taxonomică a speciei Zea mays L. (porumb)

2.3.1.2. Descrierea botanică a porumbului (Zea mays L.)

2.3.1.3. Structura anatomică a cariopselor de porumb (figura 6D)

2.3.1.4. Compoziţia chimică a cariopselor de porumb

2.3.1.5. Cerinţele plantelor de porumb faţă de factorii de vegetaţie

2.3.1.6. Importanţa furajeră a porumbului

2.3.1.7. Hibrizii de porumb

2.3.1.8. Zonele pedoclimatice de cultivare a hibrizilor de porumb

2.3.1.9. Particularităţi ale proceselor fiziologice în plantele de porumb (Zea mays L.)

2.3.2. Metodele şi tehnicile de lucru utilizate de către noi în efectuarea experimentelor

de vitrocultură de porumb (Zea mays L.), hibrizii Helga şi ZP471

2.3.2.1. Spaţiile de lucru utilizate pentru efectuarea experimentelor şi aparatura

utilizată

2.3.2.2. Etapele de prelucrare a materialului vegetal în vederea examinării la

microscopul electronic

2.3.2.2.1. Analiza materialului vegetal la microscopul electronic cu baleiaj

2.3.2.2.2. Evaluarea activităţii enzimelor antioxidante sub acţiunea radiaţiilor UV-B

2.3.2.2.3.1. Activitatea catalazei (CAT)

2.3.2.2.3.2. Activitatea guaiacol peroxidaza (POD)

2.3.2.2.3.3. Activitatea ascorbat peroxidaza (APX)

2.3.2.2.3.4. Activitatea glutation reductazei (GR)

Page 4: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

4

2.3.2.2.3.5. Activitatea glutation-S-transferazei (GST)

2.3.2.2.3.6. Activitatea enzimatică a superoxid-dismutazei (SOD)

2.3.2.3. Vitroculturile vegetale – tehnici utilizate

2.3.2.3.1. Compoziţia mediului de cultură utilizat pentru efectuarea experimentelor

2.3.2.3.2. Particularităţi de metodică

2.3.2.3.2.1. Germinarea în condiții aseptice a cariopselor de porumb (Zea mays L.)

hibrizii Helga şi ZP471, pe mediul de cultură Murashige - Skoog (1962), şi

Linsmaier-Skoog (1965), agarizat, lipsit de regulatori de creștere

2.3.2.3.2.1.1. Obţinerea vitroplantulelor din embrioni scalpaţi din cariopse de

porumb (Zea mays L.) hibrizii Helga şi ZP471, pe mediul de cultură Murashige

- Skoog (1962), şi Linsmaier-Skoog (1965), agarizat suplimentat cu regulatori

de creștere

2.3.2.3.2.1.2. Obţinerea de calus din embrioni scalpaţi din cariopse de porumb

(Zea mays L.) hibrizii Helga şi ZP471, pe mediul de cultură Murashige -

Skoog (1962), şi Linsmaier-Skoog (1965), agarizat suplimentat cu regulatori

de creștere

2.3.2.3.2.2. Aclimatizarea vitoplantulelor în condiţii de laborator, transferate în

ghivece, continuarea iradierii după o schemă prestabilită şi realizarea

analizelor biochimice

2.3.2.3.2.3. Prelucrarea matematică a datelor experimentale

2.4. REZULTATE ŞI DISCUŢII

2.4.1. Iniţierea de vitroculturi de Zea mays, hibrizii Helga şi ZP471 din cariopse

germinate in vitro

2.4.1.1. Obţinerea vitroplantulelor din embrioni scalpați din cariopse

germinate in vitro

2.4.2. Evaluarea activităţii enzimelor antioxidante sub acţiunea radiaţiilor UV-B

2.4.2.1. Efectul tratamentului cu radiaţii de tip UV-B, cu lungimi de undă 280

nm-310 nm, asupra activităţii enzimelor antioxidante, pe parcursul dezvoltării

vitroplantulelor, aclimatizate, şi sub protecţie SMM

2.4.2.2. Efectul tratamentului cu radiaţii UV-B de lungimi de undă 280 nm -310

nm asupra activităţii enzimelor antioxidante în condiţii de temperatură

scăzută

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

Page 5: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

5

PREFAŢĂ

Omul, ca oricare organism viu, nu se află în afara legilor care guvernează viaţa pe

Terra, din contră, el s-a format şi s-a dezvoltat în interacţiune directă cu mediul natural şi cu

societatea din care acesta făcea parte.

Este important ca omul, în activitatea sa economică, să se limiteze strict la nevoile

sale, de asemenea să cunoască care sunt factorii care influenţează echilibrul ecologic şi

modul în care poate fi întreţinută stabilitatea vegetală. Monitorizarea modificărilor nu ne

poate furniza date suficiente referitoare la acomodarea plantelor la aceste schimbări. Doar

experimentele organizate în laboratoare pot elucida o serie de aspecte fiziologice și genetice

dar și măsurile care se impun a fi luate din punct de vedere bioecologic.

Biotehnologia, prin apariţia ei, a produs o adevărată revoluţie în întreg procesul de

proliferare a speciilor vegetale, prin mijloace moderne de lucru, într-un timp scurt putându-se

obţine un număr nelimitat de exemplare, în raport cu posibilităţile de înmulţire a acestora

prin intermediul tehnicilor tradiţionale de propagare a plantelor de interes economic.

În prezenta teză de doctorat am abordat subiectul „Studiul efectelor radiaţiilor de

tip UV-B, asupra evoluţiei unor procese morfologice şi biochimice, la hibrizi de Zea

mays L., - implicaţii socio-economice” deoarece schimbările indirecte cauzate de radiaţiile

ultraviolete - UV-B - cum ar fi impactul produs de ele asupra morfologiei plantelor, a

modului în care nutrienţii sunt distribuiţi în interiorul acestora, în diferite faze de dezvoltare

ale lor, ori a metabolismului acestora (primar sau/şi secundar) pot fi la fel de importante, sau

chiar mai importante, decât efectele negative directe ale radiaţiilor, în special a celor de tip

UV-B. Astfel de modificări pot avea implicaţii importante în menţinerea echilibrului

sistemului ecologic vegetal şi animal, dar şi în pepetuarea unor specii sau genotipuri pe

Terra, ceea ce influenţează, inerent, calitatea vieţii social-economice.

În această lucrare am dorit să evidenţiem particularităţile care guvernează creşterea şi

dezvoltarea plantelor de porumb (Zea mays L.) ce se află sub incidenţa radiaţiilor de tip UV-

B, de diferite lungimi de undă, utilizând ca modele experimentale doi hibrizi cultivaţi

actualmente pe zone agricole extinse, şi anume: Helga şi ZP.

Experienţa în domeniul cercetărilor ştiinţifice, căştigată pe parcursul realizării acestei

teze de doctorat, a stat la baza elaborării mai multor lucrări publicate, sau care se află sub

tipar ce sunt enumerate la sfârşitul lucrării. Informaţiile obţinute de către noi în cursul

cercetărilor întreprinse contribuie la completarea cunoştinţelor despre modificările şi

Page 6: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

6

mutaţiile apărute la nivelul plantelor studiat, eficientizând sau îmbunătăţind şansele de

supravieţuire a plantelor tinere de Zea mays L., la radiaţii UV-B şi temperaturi letale.

Capitolul 1 din prezenta teză de doctorat, cuprinde partea de Considerații generale în

care sunt detaliate aspecte referitoare la importanţa luminii în creşterea şi dezvoltarea

plantelor, influenţa exercitată de către radiaţiile ultraviolete (UV), de diferite lungimi de undă,

asupra plantelor, scurt istoric al cercetărilor efectuate asupra gramineelor iradiate cu radiații

ultraviolete (UV), biotehnologia vegetală, ecobioeconomia și siguranţa alimentelor, efectul

radiațiilor - implicaţiile socio-economice.

Capitolul 2 este structurat pe următoarele părți componente : Scopul cercetărilor

efectuate, în care sunt prezentate obiectivele al prezentei lucrări de doctorat, respectiv,

obţinerea vitroplantulelor din embrioni scalpaţi de la cariopse de porumb (Zea mays L.)

hibrizii Helga şi ZP471, in vitro, pe medii artificiale, cu o balanţă hormonală variată,

iradierea vitroplantulelor obţinute, cu radiaţii de tip UV-B şi biometrizarea parametrilor de

creştere in vitro, în regim de iradiere comparativ cu biometrizarea parametrilor

vitroplantulelor neiradiate, aclimatizarea vitroplantulelor obţinute din cariopse, dar şi

evaluarea activităţii enzimelor antioxidante sub acţiunea radiaţiilor de tip UV-B: activitatea

catalazei (CAT), activitatea guaiacol peroxidazei (POD), activitatea ascorbat peroxidazei

(APX), activitatea glutation reductazei (GR), activitatea glutation-S-transferazei (GST),

activitatea superoxid-dismutazei (SOD).

Page 7: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

7

2.1. INTRODUCERE

Radiaţiile ultraviolete (UV) sunt un factor de stres important pentru plante, care

poate duce la alterarea sistemului genetic şi a structurii membranelor celulare, precum şi a o

serie de procese metabolice. Dintre acestea, UV-B-ul exercită un efect mult mai distructiv

asupra plantelor, datorită faptului că macromoleculele de ADN (acid dezoxiribonucleic) sau

de proteine au o absorbţie puternică a razelor solare la lungimi de undă 280-320 nm.

Din cauza scăderii nivelului de ozon atmosferic influenţa negativă exercitată de către

razele UV-B a devenit tot mai pronunţată. Această situaţie a impus reconsiderarea eforturilor

ştiinţifice pentru o mai bună înţelegere a efectului radiaţiei UV asupra plantelor şi a altor

organisme.

Sistemele biologice sunt, în general, vulnerabile la radiaţii cu lungimi de undă

cuprinse între 280 nm-320 nm. Creşterea expunerii la UV-B este îngrijoratoare pentru toate

organismele, dar în special pentru plante, mai ales din cauza cerinţelor acestora pentru

lumină şi a inabilităţii lor de a se deplasa.

O serie de studii au arătat faptul că, plantele răspund cu variabilitate ridicată la

acţiunea UV-B-ului (Musil şi colab. , 2002; Cona şi colab., 2006).

Pentru o mai bună înţelegere a semnificaţiei modificărilor induse de creşterea

nivelului de radiaţii UV-B este necesară concentrarea eforturilor ştiinţifice în direcţia

cercetării aspectelor principale referitoare la creşterea plantelor, precum şi la nivelul unor

parametri biochimici sub acţiunea iluminării plantulelor cu radiaţii UV-B, reacţii care s-ar

putea să fie regăsite şi la plantele aflate în câmp.

Având în vedere aspectele menţionate în literatura de specialitate, datele

experimentale efectuate la doi hibrizi de porumb, repectiv Helga şi ZP471 aduc dovezi noi

în ceea ce priveşte modificările morfologice şi biochimice ce au loc la nivel celular, în

condiţii de expunere îndelungată a acestora la UV-B.

2.2. SCOPUL CERCETĂRILOR EFECTUATE ÎN CADRUL TEZEI DE

DOCTORAT

În cadrul experimentelor efectuate în prezenta teză de doctorat ne-am propus să

urmărim reacţia plantulelor a doi hibrizi de porumb (Zea mays L.), Helga şi ZP 471, în urma

iradierii acestora cu raze ultraviolete, tip UV-B, cu lungimea de undă de 287 nm, exemplare

care au fost, sau nu, expuse unor astfel de tratamente, respectiv care au fost menţinute ca

loturi de referinţă (martor sau control), sau ce au fost etalate – de repetate ori - la asemenea

Page 8: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

8

iradieri; materialul vegetal vitrocultivat şi iradiat, in vitro fiind amplasat pe mediu de cultură

complex, după 30 zile plantulele au fost transferate ex vitro şi ele au suferit sau nu, reiradieri

repetate (vezi tabelul 3 schema de organizare a experimentelor cu UV-B).

După iradiere, în funcţie de tratamentul aplicat, la nivelul materialului vegetal

vitrocultivat, sau a plantulelor aclimatizate la regimul de viaţă ex vitro, iradiate sau nu, s-au

efectuat fie măsurători biometrice privind creşterea organelor plantulelor, sau a plantulei

întregi, ori s-au făcut determinări privind activitatea unor enzime, cum sunt catalaza,

glutation reducataza, ascorbat peroxidaza, guiacal peroxidaza, glutation-S- transferaza şi

superoxid dismutaza, dar şi în ceea ce priveşte conţinutul frunzuliţelor lor în pigmenţi

asimilatori, în funcţie de iradierea, sau nu, a plantulelor cu radiaţii UV-B.

În paralel, au fost dublate unele variante experimentale supuse iradierii cu UV-B, în

condiţiile în care la nivelul solului cu care au fost umplute ghivecele în care au fost

amplasate exvitroplantulele provenite din vitrocultură, s-a procedat la înnobilarea solului (de

tip Campo Sana) cu sulfat metionină sau S- metilmetionină, compus abreviat cu iniţialele:

SMM, o substanţă considerată ca fiind o vitamină, vitamina U, un osmoprotector şi reparator

celular, în condiţiile iradierii plantelor cu raze UV-B. În toate condiţiile experimentale s-au

organizat şi loturi martor (control), ce nu au fost supuse tratamentelor cu radiaţii UV.

În faza de început a experimentului, au fost efectuate unele cercetări referitoare la

analizarea consecinţelor asupra creşterii organelor plantulelor celor doi hibrizi de porumb,

iradiaţi cu raze UV-A, care după cum s-a văzut în capitolul „Consideraţii generale” a

prezentei teze de doctorat – sunt mai nocive decât radiaţiile UV-B, cu care ocazie am

procedat la examinarea ultrastructurii embrionilor iradiaţi, sau nu, cu UV- A (320-400 nm),

la microscopul electronic cu baleaj.

2.2.1. Obiectivele cercetărilor efectuate în cadrul tezei de doctorat

Pentru identificarea şi caracterizarea modificărilor ce au loc sub acţiunea radiaţiilor

UV-B, şi pornind de la ceea ce ne-am propus, de la obiectivele stabilite şi scopul cercetărilor,

toate acestea ne-au permis să investigăm, în mod punctual, următoarele aspecte:

1. cum inflenţează radiaţiile UV-B procesele de regenerare şi de creştere in vitro, a

plantulelor, dar şi in vivo, respectiv aclimatizarea la viaţa în mediul septic, plantate fiind în

sol, în ghivece, şi menţinute în camera de creştere;

2. care sunt modificările biochimice şi rolul sistemului enzimatic şi non-enzimatic de apărare

a celulelor plantulelor în condiţii de iradiere a lor cu lumină UV-B in vitro fiind, sau ex

Page 9: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

9

vitro, de diferite lungimi de undă, dar şi privind potenţialul rol al S-metilmetioninei în

protecţia enzimatică a acestora;

3. corelarea rolului pe care îl au regulatorii de creştere din mediul de cultură şi nutrienţii de

care dispun plantulele regenerate din fitoinoculi sub influenţa radiaţiilor UV.

2.3. MATERIALE ŞI METODELE DE LUCRU UTILIZATE ÎN PREZENTA TEZĂ

DE DOCTORAT

2.3.1. Materialul vegetal utilizat în experimente – explante din cariopse de Zea

mays L., hibrizii Helga şi ZP471

Selectarea corectă a materialului biologic, în vederea iniţierii de vitroculturi vegetale,

reprezintă un factor decisiv, din punctul de vedere al calităţilor naturale pe care le deţin

celulele viitorilor fitoinoculi, în marcarea unei reactivităţi pozitive a acestora la regimul de

vitrocultură şi la tratamentele aplicate, întrucât procedurile de asepsizare pot afecta profund

vitalitatea şi capacitatea regenerativă a celulelor sau a ţesuturilor cultivate in vitro.

Experimentele de iradiere cu UV, a vitroplantulelor obţinute din embrioni scalpaţi,

din cariopse de porumb, hibrizii Helga şi ZP471, au fost efectuate in vitro şi ex vitro(Tab. 3),

– parte din ele - la Arad, iar o altă parte în laboratorul de Fiziologia plantelor al Institutului

de Biologie Celulară din Szeged.

Lămpile, sursă de radiaţii ultraviolete, sub formă de tuburi, de tip Philips TL 40W/12

UV Narrowband, au deţinut o putere de 100W, şi au emis radiaţii cu lungimi de undă până

la cca. 315 nm, intensitate luminoasă fiind de 7 W/m2.

Radiaţii de tip UV-B Narrow Band (după http://www.homephototherapy.com/nbc-

narrowband.htm).

După 5 zile de la inocularea cariopselor şi creşterea embrionilor in vitro în regim

fotoperiodic de 8h întuneric/24h şi intensitate luminoasă de 1700 lucşi, emisă de tuburi

Page 10: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

10

fluorescente albe, şi la o temperatură de 21ºC ± 2ºC, fază în care s-au demarat procesele de

creştere, respectiv: imbibiţie, trecerea de la activitatea fiziologică latentă, la un metabolism

intens activ, s-a procedat la scalparea embrionilor din cariopse vezi (Fig 11 poziţia 5),

embrioni pe care i-am transferat pe aceleaşi tipuri de medii de cultură (Murashige-Skoog sau

Linsmaier-Skoog) suplimentate, sau nu, cu regulatorii de creştere amintiţi anterior,

respectând aceleaşi concentraţii, în funcţie de scopul urmărit.

În urma acestui experiment s-au obţinut vitroplantule pe ambele categorii de medii de

cultură. În schimb calusulul a fost generat pe mediul de cultură Murashige-Skoog (1962)

suplimentat cu 3mg/l de 2,4-D.

După iniţierea de vitroculturi de porumb din cei doi hibrizi, din embrioni scalpaţi de

la cei doi hibrizi din cariopse aflate în a 5-a zi de germinaţie (figura 11, poziţia 5) s-au

constituit 2 categorii de loturi experimentale: prima categorie, conţinând variante martor, ce

provenea din cariopse neiradiate, crescute pe medii lipsite de regulatori de creştere şi o a

doua categorie conţinând explante embrionare ce proveneau de la cariopse iradiate in vitro

fiind, regimul de iradiere coresponzând la: 280 nm – 310 nm.

Explantele de tip embrionar, au fost biometrizate la 7 zile, la 14 zile şi la a- 30 a zi de

la inocularea lor in vitro, urmărindu-se oranogeneza şi creșterea la nivelul acestora.

Page 11: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

11

TABELUL 3. REGIMUL DE APLICARE A TRATAMENTELOR LA

PLANTULELE DE PORUMB (ZEA MAYS) CU RADIAŢII UV –B -

SCHEMA EXPERIMENTALĂ IN VITRO EX VITRO

Iradierea materialului vegetal

vitrocultivat cu radiaţii de tip UV-B

Momentul

biometrizării

lungimii

tulpinițelor,

frunzulițelor, şi

a rădăcinițelor

Regim de iradiere a

tratamentelor la plantulele

crescute în mediul septic, în

ghivece

Mmentul

analizei

activităţii

enzimatice

Variante de

tratament

Regimul de

aplicare a

tratamentelor Variante de

tratament

Regimul de

aplicare a

tratamentelor

În 1-a săptămână -

s-au aplicat 3

tratamente cu UV-

B, de diferite

lungimi de undă:

280 nm, 285 nm,

287 nm, 290 nm,

310 nm

Luni-15

minute

a -7 – a zi de la

iniţierea

tratamentelor

cu UV-B, şi a-

3-a zi de la

aplicarea

ultimei iradieri

-număr

tratamente

aplicate

insumate: 3

În 1-a

săptămână s-

au aplicat 4

tratamente cu

UV-B, de

diferite

lungimi de

undă: 280 nm,

285 nm, 287

nm, 290 nm,

310 nm

Luni-15

minute

1 – a

analiză s-a

făcut după

4 zile de

iradiere, şi

2 zile

pauză,

deci, în a

7-a zi,

după

iniţierea

iradierii

Marţi -pauză Marţi -15

minute

Miercuri-15

minute

Miercuri-15

minute

Joi- pauză Joi-15

minute

Vineri-15

minute

Vineri-pauză

Sâmbătă-

duminică

pauză

Sâmbătă -

pauză

Duminică -

pauză

În a-2-a săptămână

- s-au aplicat 3

tratamente cu UV-

B, de diferite

lungimi de undă:

280 nm, 285 nm,

287 nm, 290 nm,

310 nm

Luni-15

minute

a-14 – a zi de

la iniţierea

tratamentelor

cu UV-B;

-număr

tratamente

aplicate

insumate: 6

În a-2-a

săptămână - s-

au aplicat 4

tratamente cu

UV-B, de

diferite

lungimi de

undă: 280 nm,

285 nm, 287

nm, 290 nm,

310 nm

Luni– 15

minute

2- a

analiză, s-a

făcut după

8 zile de

iradiere, şi

3 zile

pauză deci,

în a 14-a

zi, după

iniţierea

iradierii

după15

zile

Marţi -pauză Marţi -15

minute

Miercuri-15

minute

Miercuri -

15minute

Joi- pauză Joi -15

minute

Vineri-15

minute

Vineri - pauză

Sâmbătă-

duminică

pauză

Sâmbătă -

pauză

Duminică-

pauză

În a- 3-a

săptămână - s-au

aplicat 3

tratamente cu UV-

B, de diferite

lungimi de undă:

280 nm, 285 nm,

287 nm, 290 nm,

310 nm

Luni-15

minute

a-30 -a zi de la

iniţierea

tratamentelor

cu UV-B;

-număr

tratamente

aplicate

insumate: 9

În a- 3-a

săptămână - s-

au aplicat 3

tratamente cu

UV-B, de

diferite

lungimi de

undă: 280 nm,

285 nm, 287

nm, 290 nm,

310 nm

Luni - 15

minute

3- a

analiză, s-a

făcut după

11 zile de

iradiere, şi

4 zile

pauză

după

iniţierea

iradierii

după 30

zile

Page 12: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

12

2.3.1.1. Încadrarea taxonomică a speciei Zea mays L. (porumb)

Din punct de vedere sistematic, porumbul poate fi încadrat astfel:

Supraîncrengătura : TRACHEOPHYTA (CORMOPHYTA)

Încrengătura: SPERMATOPHYTA

Subîncrengătura: ANGYOSPERMOPHYTINA

Clasa: LILIOPSIDA (MONOCOTYLEDONEAE)

Ordinul: POALES

Familia: POACEAE

Genul: ZEA

Specia: ZEA MAYS L.

2.4. REZULTATE ŞI DISCUŢII

Într-o primă parte a experimentului am monitorizat parametrii de creştere, respectiv

înălţimea vitroplantulelor, a lungimii frunzuliţei celei mai mari, a rădăciniţei embrionare

celei mai mari, în condiţii de iradiere cu radiaţii de tip UV-B, de lungimi de undă cuprinse

între 280-310 nm, dar şi pentru vitroplantulele considerate de noi martor, adică nesupuse

iradierii. De asemenea, au fost biometrizaţi aceeaşi parametrii funcţie de mediul de cultură

utilizat, respectiv Murashige-Skoog (1962) şi sau Linsmaier-Skoog, coroborat cu iradierea

cu radiaţii de tip UV-B.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

7 ZILE 14 ZILE 30 ZILE

control Helga

Helga

control ZP471

ZP471

Înă

lţim

ea

med

ie v

itro

pla

ntu

lei

(cm

)-

va

ria

nta

3,

pe m

ed

iul

de c

ult

ură

LS

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

7 ZILE 14 ZILE 30 ZILE

control Helga

Helga

control ZP471

ZP471

**

***

Înă

lţim

ea m

edie

vit

rop

lan

tule

i (c

m)-

va

ria

nta

3,

pe

med

iul

MS

Rezultatele evaluărilor biometrice a înălţimii vitroplantulelor obţinute din cariopsele de

porumb hibrizii Helga, şi ZP471, în cea de a - 7 zi, 14 a - zi şi 30 - zecea zi de la

amplasarea embrionilor pe medii aseptice de bază Murashige - Skoog (1962) şi /sau

Linsmaier-Skoog (1965), nesupuse iradierii.

Page 13: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

13

Astfel, în urma biometrizărilor efectuate la 7, 14 şi 30 de zile de la inocularea

embrionilor scalpaţi, pe medii de cultură, de tip MS şi/sau, LS, putem afirma că în fiecare

variantă V1, V2, V3, şi / sau V01, V02, V03, vitroplantulele au crescut în înălţime, cea mai

proeminentă creştere fiind înregistrată pe varianta V3, respectiv V03, la 30 zile, unde valoarea

a atins un spor de 370% faţă de martor, pe ambele medii de cultură. Însă ceea ce diferenţiază

comportamentul celor doi hibrizi, în condiţii egale de experiment, este numărul de

vitroplantule generat, care este mai mare la hibridul Helga.

Comparativ, înălţimea vitroplantulei, în cazul în care acesteia i s-a aplicat tratamentul

cu radiaţii de tip UV-B, de lungimi de undă de 280-310 nm, se evidenţiază de asemenea o

creştere, dar mai ales în cazul lungimii de undă de 287 nm, şi mai ales în cazul utilizării

mediului de cultură MS, completat cu regulatori de creştere, reflectată în talia tulpinţei celei

mai mari de 4,1cm, comparativ cu mediul de cultură LS, unde talia tulpiniţei ajunge la 4 cm,

nesemnificativ mai mică, aproximativ cu 0,1cm.

0

1

2

3

4

5

6

280nm 285nm 287nm 295nm 310nm

CONTROL HELGA HELGA ZP471 CONTROL ZP471

Lu

ng

ime

a m

ed

ie a

tu

lpin

ițe

lor

(cm

),

vit

rop

lan

tule

lor

de

po

rum

b h

ibri

zii

Helg

a

şi Z

P4

71 p

e m

ed

iul

de

cu

ltu

ră M

B-M

S,V

3

– 3

0 z

ile

0

1

2

3

4

5

6

280nm 285nm 287nm 295nm 310nm

CONTROL HELGA HELGA ZP471 CONTROL ZP471

Lu

ng

imea m

ed

ie a

tu

lpin

ițe

lor

(cm

),

vit

rop

lan

tule

lor

de

po

rum

b h

ibri

zii

He

lga

şi Z

P4

71

pe

me

diu

l d

e c

ult

ură

LS

-

V 3

- 3

0 z

ile

Rezultatele evaluărilor biometrice a înălţimii tulpinițelor vitroplantulelor obţinute din din

cariopsele de porumb hibrizii Helga, şi ZP471, în cea de a -30 zi, de la amplasarea

embrionilor pe medii aseptice de bază Murashige - Skoog (1962); şi /sau Linsmaier-Skoog

(1965), supusă iradierii cu radiaţii de tip UV-B.

Există o diferenţă în comportamentul ambilor hibrizi pentru celelalte lungimi de

undă: la 285 nm, lungimea frunzuliţelor atât pentru Helga cât şi pentru ZP471, este identică

de 2,9 cm, dar se remarcă o inhibiţie în ceea ce priveşte creşterea frunzuliţelor la 310 nm, în

valoare de 2,60 cm, 92,86% pentru Helga, şi 2,5 cm, 82,29%, pentru hibridul ZP471. Reiese

influenţa şi efectul iradierii cu radiaţii de tip UV-B, funcţie de lungimi de undă fapt relatat în

diferenţa taliei frunzuliţelor.

Page 14: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

14

2,5

2,55

2,6

2,65

2,7

2,75

2,8

2,85

2,9

2,95

3

280nm 285nm 287nm 295nm 310nm

CONTROL HELGA HELGA CONTROL ZP471 ZP471

Cre

şte

rea l

un

gim

ii f

run

zu

liţe

lor

pen

tru

hib

rid

ul H

elg

a și Z

P471 la -

30 z

ile (

cm

)

vari

an

ta V

3, p

e m

ed

iul M

S

2,5

2,55

2,6

2,65

2,7

2,75

2,8

2,85

2,9

2,95

280nm 285nm 287nm 295nm 310nm

CONTROL HELGA HELGA CONTROL ZP471 ZP471

Cre

şte

rea l

un

gim

ii f

run

zu

liţe

lor

pen

tru

hib

rid

ul H

elg

a și Z

P471 la -

30 z

ile (

cm

)

vari

an

ta V

3, p

e m

ed

iul L

S

Rezultatele evaluărilor biometrice privind creşterea frunzuliţelor vitroplantulelor de porumb

hibrizii Helga şi ZP471 în cea de a - 30 - zecea zi pe mediul de cultură de bază Murashige -

Skoog (1962) și Lindsmaier-Skoog (1965 sub efectul iradierii cu radiaţii de tip UV-B, cu

lungimi de undă cuprinse între 280 nm -310 nm.

Comparativ, se poate remarca superioritatea mediului de cultură MB-MS, faţă de

mediul de cultură LS, atât în ceea ce priveşte talia frunzuliţelor dar şi a numărului de plantule

generate în varianta V3, unde numărul de plantule generate este de 5 pentru hibridul Helga pe

mediul de cultură MS, faţă de V03 pe mediul de cultură LS, în condiţii egale de tratament.

În cea de a doua parte a lucrării au fost examinate efectele produse de anumite

tratamente administrate vitroculturilor obţinute din embrionii scalpaţi de la cariopsele celor

doi hibrizi de porumb, cu radiaţii UV-B, de diferite lungimi de undă, asupra plantulelor

transferate fiind ex vitro şi aclimatizate la regimul de viaţă în mediul septic, precum şi

urmărirea modificării unor parametrii biochimici, la nivelul acestora, respectiv a determinării

activităţii catalazei, a superoxiddismutazei, a peroxidazei, a ascorbat peroxidzei, a glutation

S transferazei.

S-a urmărit modificărea unor parametrii biochimici, la nivelul frunzelor plantulelor

de porumb în vârstă de 18-21 zile de la iniţierea aclimatizării, la stresul indus de radiaţiile de

tip UV-B, de diferite lungimi de undă, (cu preponderenţă la 287 nm, cu atât mai mult cu cât,

această undă are efecte asupra plantulelor de porumb), precum, şi rolul protector special dat

de S-metilmetionina (SMM), în condiţiile de stres, provocate de radiaţiile UV-B, (care oferă

plantelor studiate de noi capacitatea de a elabora răspusuri adaptative inductibile în condiţii

de stres oxidativ).

Page 15: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

15

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

Ziua 1 Ziua 4 Ziua 7

Control

Helga

ZP471

Monitorizarea activităţii enzimatice, (absorbanței), (A[U/mg]unități/proteină), a enzimei ascorbat-

peroxidaza (APX), pe parcursul dezvoltării plantulelor de porumb hibrizii Helga şi ZP471,

aclimatizate, sub efectul iradierii cu radiații de tip UV-B de lungime de undă de 287 nm, coroborat

cu acţiunea protectivă a S- sulfatmetil – metioninei SMM, în prima zi, în a - 4 - a zi şi a - 7 - a zi după

iradiere.

Analiza comparativă a activităţii enzimatice a APX-ului, în frunzele celor doi

hibrizi cu potenţial diferit de rezistenţă la stres ne-a aratat că în condiţii optime şi naturale de

creştere şi dezvoltare pentru hibridul sensibil, nivelul acţiunii enzimelor, este mult mai

redus, faţă de planta control. Are loc o creştere în cea de a patra zi, la hibridul tolerant

Helga, comparativ cu hibridul ZP471. (Tabelul 31, Fig. 68).

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Ziua 1 Ziua 4 Ziua 7

Control

Helga

ZP471

Monitorizarea activităţii enzimatice, (absorbanței), (A[U/mg]unități/proteină), a enzimei catalaza

(CAT), pe parcursul dezvoltării plantulelor de porumb hibrizii Helga şi ZP471, aclimatizate, sub

efectul iradierii cu radiații de tip UV-B de lungime de undă de 287 nm, coroborat cu acţiunea

protectivă a S- sulfatmetil – metioninei SMM, în prima zi, în a - 4 - a zi şi a - 7 - a zi după iradiere.

Activitatea enzimei CAT prezintă o tendinţă de scădere uşoară, cu aproximativ

0,97%, doar în condiţiile de iradiere cu radiaţii de tip UV-B, la lungime de undă de 287 nm,

Page 16: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

16

faţă de control, iar în condiţii de tratament cu sulfat-metilmetionină, activitatea acestei

enzime creşte, ajungând la valori semnificative în ziua a-4-a de tratament, cu un spor de

15,95 %, pentru hibridul Helga, şi 13,95 % pentru hibridul ZP471.

Din datele experimentale reiese gradul de toleranţă a hibridului Helga, faţă de

hibridul ZP471 (Tabelul 32, Fig. 69). Sub efectul tratamentului cu lungime de undă UV-B

creşterea activităţii CAT a fost semnificativă la plantele tratate, şi considerată normală în

condiţiile în care activitatea enzimei POD, prezintă o uşoară scădere pe parcursul zilelor

analizate (Tabelul 30, 32, Fig. 67, 69).

În urma iradierii UV-B cu lungime de undă 287 nm, GR, s-a activat în aceeaşi măsură

atât la plantele control, însă în urma tratamentului SMM activitatea ei a crescut în continuare

şi în ziua a şaptea, şi astfel depăşind în mod semnificativ rezultatele obţinute la plantele

control.

Sub efectul tratamentului cu lungime de undă UV-B creşterea activităţii GR

comparativ între control şi lot tratat pentru plantele de porumb a fost semnificativă în ziua a-

4-a, în cazul ambilor hibrizi, dar cu valori procentuale diferite (Tabelul 34, Fig. 71).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

Ziua 1 Ziua 4 Ziua 7

Control

Helga

ZP471

Variaţia activităţii enzimatice, (absorbanței), (A[U/mg]unități/proteină), a glutation reductaza (GR),

pe parcursul dezvoltării plantulelor de porumb hibrizii Helga şi ZP471,, aclimatizate, sub efectul

iradierii cu radiații de tip UV-B de lungime de undă de 287 nm, coroborat cu acţiunea protectivă a S-

sulfatmetil – metioninei SMM, în prima zi, în a - 4 - a zi şi a - 7 - a zi după iradiere.

În urma iradierii UV-B cu lungime de undă 287 nm, GR, s-a activat în aceeaşi măsură

atât la plantele control, însă în urma tratamentului SMM activitatea ei a crescut în continuare

şi în ziua a şaptea, şi astfel depăşind în mod semnificativ rezultatele obţinute la plantele

control.

Sub efectul tratamentului cu lungime de undă UV-B creşterea activităţii GR

comparativ între control şi lot tratat pentru plantele de porumb a fost semnificativă în ziua a-

4-a, în cazul ambilor hibrizi, dar cu valori procentuale diferite (Tabelul 34, Fig. 71).

Page 17: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

17

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

1 zi 4 zile 7 zile

Control

Helga

ZP471

P <0,016

Monitorizarea activităţii enzimatice, (absorbanței), A[U/mg]unități/proteină), a enzimei

guaiacol peroxidaza (POD), pe parcursul dezvoltării plantulelor de porumb hibrizii Helga şi

ZP471, aclimatizate, sub efectul iradierii cu radiații de tip UV-B de lungime de undă de 287

nm, coroborat cu acţiunea protectivă a S- sulfatmetil – metioninei SMM, în prima zi, în a -

4 - a zi şi a - 7 - a zi după iradiere.

Pe baza rezultatelor obţinute şi analizate, putem concluziona, că, toate enzimele

antioxidante şi non-oxidante, studiate s-au activat la lungimea de undă 287 nm, deşi fiecare

într-o măsură şi un ritm diferit. Activitatea GR, GST şi CAT a atins maximul din a patra zi

de tratament, cu diferenţe în ceea ce privesc valorile atinse functie de hibridul studiat.

Astfel, activitatea GR şi a POD într-o măsură mai importantă, a crescut de 2 ori, în a

patra zi, în comparaţie GST-ul unde creşterea a fost de 1,5 ori comparativ cu controlul.

Iradierea UV-B a scăzut semnificativ activitatea enzimei guaiacol peroxidazei (POD)

la ambele genotipuri.

În cazul CAT din ziua a 4-a de tratament s-a observat o tendinţa de scădere a

acumulării acesteia în frunze, în timp ce GR şi GST au rămas active până în ultima zi de

tratament. Activitatea APX a crescut într-o mare măsură, şi datorită activării sub acţiunea

lungimii de undă în a 4-a zi a atins punctul maxim, acumularea acesteia, fiind extrem de

importantă în eliminarea radicalilor liberi.

Page 18: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

18

CONCLUZII

1. S-a evidenţiat faptul că, procesele de organogeneză la porumb, se diferenţiază în funcţie

de mediile de cultură şi combinaţia regulatorilor de creştere, utilizaţi. Acest fapt este

reflectat în diferenţa taliei vitroplantulelor dezvoltate din cariopse germinate, dintre hibrizii

Helga şi ZP471.

2. Creşterea vitroplantulelor la cei doi hibrizi în condițiile de experimentare impuse este

diferită în cazul celor doi hibrizi, cu diferențieri semnificative la lungimea de undă de

287nm, reflectată în diferenţa taliei frunzuliţei celei mai mari.

3. Comportamentul vitroplantulele obținute din embrioni scalpaţi din cariopse germinate, în

cazul celor doi hibrizi de porumb, Helga şi ZP471, permite să recomandăm utilizarea în

experimentele de regenerare in vitro, coroborat cu iradierea cu radiaţii de tip UV-B, de

lungimi de undă apropiate de lungimea de undă considerată letală, -310nm, a hibridului

Helga, datorită toleranței crescute faţă de UVB.

4. Compararea mediilor de cultură MS şi LS, completaţi cu acelaşi nivel al regulatorilor de

creştere, respectiv BAP şi ANA, în combinaţii sau utilizaţi separat, sub aspectul formării

neoplantulelor, evidenţiază superioritatea mediului MS, în ceea ce privește generarea de

vitroplantule.

5. Balanţa hormonală asociată cu iradierea la 287 nm este capabilă să inducă regenerarea de

plante cu sistem radicular, reflectat în lungimea medie a celei mai mari rădăciniţe.

7. În cazul hibrizilor de porumb, radiaţia UV-B de 287 nm, stimulează sinteza enzimelor

antioxidante, în valori procentuale diferite, dar de maniera protejării plantelor de efectul

negativ al stresului oxidativ.

8. Din rezultatele obţinute, se poate remarca activitatea intensă a enzimelor antioxidante

studiate, dar şi faptul că SMM-ul are efecte împotriva consecinţelor negative ale formelor de

oxigen reactiv, ale stresului oxidativ, prin sistemul antioxidant, la temperatura de 5°C şi

iradierea UV-B considerată pentru porumb deja letală, deşi în proporţii diferite, dar le creşte

activitatea enzimatică.

9. În frunzele tinere (faza frunzei a 3-a) si mature (a 2 a) nivelul înalt al activităţii enzimelor

antioxidante protejează plantele de distrugerea oxidativă. Efectul stresului oxidativ provocat

în urma iradierii cu ultraviolete de tip UV-B, poate fi redus la minim prin creşterea

activităţii enzimelor antioxidante, cu preponderenţă în plantele tinere (faza frunzei a 3-a),

faţă de plantele mature care pot răspunde similar numai la un stres moderat.

Recomandăm utilizarea în cultură a hibridului Helga, în zonele cu exces de UVB

datorită toleranței ridicate manifestate la iradirea de lungă durată.

Page 19: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

19

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Atri, D., Melott, A. L., Thomas, B. C., 2010. Lookup tables to compute high energy

cosmic ray induced atmospheric ionization and changes in atmospheric chemistry.

Journal Cosmology Astrology Physics 05, pp. 8-10.

2. Baier M., Kandlbinder A., Golldack D., Dietz K.J., 2005. Oxidative stress and ozone

perception, signaling and response. Plant.Cell. Environment. 28, p. 1012-1020.

3. Ballaré C.L, Caldwell M.M, Flint S.D, Robinson S.A, Bornman J.F., 2011. Effects of

solar ultraviolet radiation on terrestrial ecosystems. Patterns, mechanisms, and

interactions with climate change. Photochem.and Photobiol. Sciences 10, pp. 226–241.

4. Cachiţă, C.D., 1987. Metode „in vitro” la plantele de cultură. Baze teoretice şi practice.

Editura Ceres. Bucureşti, pp. 134-147.

5. Cachiţă, C.D., Deliu, C., Rákosy-Tican, L., Ardelean, A., 2004. Tratat de biotehnologie

vegetală. Vol. 1, Editura Dacia, Cluj – Napoca.

6. Evans N.H., McAinsh M.R., Hetherington A.M., Knight M.R., 2005. ROS perception in

Arabidopsis thaliana: the ozone –induced calcium response. Plant J., 41, pp. 615-626.

7. Houghton, J.T., Ding Y., Griggs, D.J., Dai, X., Maskell, K., Johnson, C.A., 2001.

Climate change 2001. Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. New

York: Cambridge University Press.

8. Ko, S., Eliot, A.C., Kirsch, J.F., 2004. S-methylmethionine is both a substrate and an

inactivator of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase. Arch. Biochem. Biophys.,

421, pp. 85-90.

9. Kocsy, G., von Ballmoos, P., Riiegsegger, A., Szalai, G., Galiba, G., Brunold, C., 2001.

Increasing the glutathione content in a chilling-sensitive maize genotype using safeners

increased protection against chilling-induced injury. Plant Physiol. 127, pp. 1147-1156.

10. Peykarestan, B., Seify, M., Fadaei, M., S., Abdoli, M., 2012. Ultraviolet irradiation

effects on seed germination and growth, protein content, peroxidase and protease

activity in purslane and thyme. International Journal of Agriculture: Research and

Review. Vol., 2 (1), pp. 12-19.

Page 20: Studiul efectelor radiaţiilor de tip UV-B asupra evoluţiei unor ...

20

B

Titlul programului: „Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013”

Titlul proiectului: „Burse doctorale de pregătire ecoeconomică şi bioeconomică complexă pentru siguranţa şi securitatea alimentelor şi furajelor din ecosisteme antropice”

Editorul Materialului: Doctorand BLAGA (ORODAN) MARIA Data publicării: 2013