Spectrometrie (1)

19
UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu Spectrometria de absorbtie moleculara in UV-VIS

description

biofizica

Transcript of Spectrometrie (1)

Page 1: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Spectrometria de absorbtie

moleculara in UV-VIS

Page 2: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Radiatia electromagnetica (luminoasa)

𝒄 =𝝀

𝑻= 𝝀𝝂

𝝀~𝟏

𝝂

Unde: l = lungimea de unda, n = frecventa, T = perioada

Page 3: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Spectru – toate valorile pe care le poate lua o marime

fizica

Continuu – poate lua orice valoare

Discret – poate lua

numai anumite valori

Spectre

Page 4: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Spectrul electromagnetic

ln

chhE

h = 6,62 * 10-34 J*s (const. lui Planck)

Page 5: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Spectrometrie/Spectroscopie

SPECTROMETRIE – pentru

determinarea unei cantitati

(analiza cantitativa)

SPECTROSCOPIE – pentru

determinarea naturii

substantei (analiza calitativa)

Spectru de absorbtie moleculara in IR

Spectru de absorbtie moleculara in UV-VIS

Page 6: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Clasificarea tehnicilior spectroscopice/spectrometrice

Spectroscopie atomica Spectroscopie moleculara

Spectrometrie de absorbtie atomica

Spectrometrie de emisie atomica

Spectrometrie de fluorescenta atomica

Necesita atomizarea probei

Spectre de linii (discrete)

Spectroscopie de absorbtie moleculara in IR

Spectrometrie de absorbtie moleculara in

UV-VIS

Spectrometrie de fluorescenta moleculara

In general spectrele contin benzi

spectrale

Spectrometrie de fluorescenta de raze X

Spectrometrie de masa

Spectroscopie Raman

Spectroscopie RMN

Spectroscopie de rezonanta electronica

de spin (RES)

Page 7: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Interactia unei molecule cu energia EM –

absorbtie/emisie

o O molecula va absorbi radiatia electromagnetica, trecand intr-o

stare excitata :

M + hn → M**

o Molecula nu va ramane in starea excitata M* sau M**, ea va

reveni la starea fundamentala M fie prin procese neradiative, fie

prin procese radiative (emisie). In cazul din urma, n’ ≤ n

M** → M* (fara emisie de lumina)

M* → + hn’

Page 8: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Nivelurile energetice ale unei molecule

Energia totala a unei molecule – suma energiilor: electronica, de vibratie, de rotatie

DE = DEel + DEvib + DEr

DEel > DEvib >DEr

Domeniu EM Tranzitii

Microunde Rotationale

Infrarosu Vibrationale + Rotationale

Ultraviolet si vizibil Electronice + Vibrationale +

Rotationale

Page 9: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Absorbtia energiei de catre molecule

Diferitele grupari functionale din molecule

(cromofori) absorb energie la anumite lungimi de

unda. Cand in molecula e un sistem de legaturi

duble conjugate – absorbtie la energii mai mici

(lungimi de unda mai mari).

In functie de lungimea de unda la care o

substanta absoarbe, ea va aparea ochiului ca

fiind colorata in culoarea sa complementara

(radiatia neabsorbita fiind reflectata).

Substanta va fi colorata in culoarea opusa pe

roata fata de culoarea absorbita. Substanta alba

– absorbtie nesemnificativa in VIS; substanta

neagra – absorbtie puternica in tot domeniul VIS.

Ex : absorbtie la 420 nm (in albastru) → culoare

galbena

Page 10: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Legea Lambert-Beer

Exprima legatura intre intensitatea luminii absorbite si concentratia solutiei.

cl

oII 10

I0 – intensitatea luminii incidente

I – intensitatea luminii transmise

– coeficient de absorbtie molara

(caracteristica a substantei)

c – concentratia substantei din cuva

l – lungimea cuvei

O substanta absoarbe diferit in functie de lungimea de unda :

= f (l)

Page 11: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Marimi folosite in spectrofotometrie

Transmitanta

cl

I

IT 10

0

10010100%0

cl

I

IT

Dependenta neliniara fata de concentratie – mai greu de lucrat. Se prefera

obtinerea unei dependente liniare.

Absorbanta

clI

ITA )log()log( 0

clA lO alta forma a legii

Lambert-Beer

Page 12: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Aplicatie – analiza fluidelor biologice

• Fluidele biologice contin un numar mare de substante dizolvate

• Spectrofotometria nu poate fi utilizata pentru a da informatii

calitative despre substantele dizolvate in absenta unei separari

prealabile

• Separarea substantelor chimice – obtinuta prin cromatografie

• Detectia e asigurata prin spectrofotometrie (de obicei prin

masurarea la o lungime de unda fixa) – rezulta o cromatograma

(absorbanta in functie de timpul pe care substanta il petrece in

coloana cromatografica)

Page 13: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

1. SURSA DE RADIATII

2. MONOCROMATOR – selecteaza radiatia de o singura lungime de unda

3. COMPARTIMENT PENTRU PROBA

4. DETECTOR

5. COMPUTER

o Detectorul masoara intensitatea radiatiei transmise. Pentru a putea

masura absorbanta e nevoie de si de intensitatea radiatiei incidente.

o Trebuie masurata intensitatea luminii ce trece printr-o solutie cat mai

asemanatoare cu cea pe care o analizam, dar care nu contine

substanta de interes – solutie blank.

Spectrofotometrul de absorbtie

Page 14: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Schema dublu fascicul permite o analiza mult mai rapida, fara a mai fi

nevoie sa schimbam proba cu blank de fiecare data cand schimbam

lungimea de unda. Dezavantaj – pret mai mare.

Monofascicul

Dublu fascicul

Spectrofotometrul monofascicul/dublu fascicul

Page 15: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Parte experimentala

1. Trasarea spectrului de absorbtie pentru o solutie de colorant

alimentar Sunset Yellow (E110) in intervalul 400 – 700 nm prin

citirea absorbantei din 20 in 20 nm

2. Alegerea lungimii de unda la care absorbanta este maxima (lmax)

3. Masurarea absorbantei la aceasta lungime de unda pentru solutii

de Sunset Yellow de concentratie cunoscuta (3, 5, 10, 20, 30, 40

mM)

4. Trasarea dreptei de calibrare/etalonare A = f (c) si gasirea

parametrilor dreptei

5. Masurarea absorbantei unei solutii de Sunset Yellow de

concentratie necunoscuta la lmax

6. Aflarea concentratiei necunoscute prin interpolare pe dreapta de

calibrare

Page 16: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Mod de lucru

1. Se porneste spectrofotometrul si se asteapta pana cand pe

ecran e afisata absorbanta.

2. Se selecteaza lungimea de unda la care se doreste citirea

absorbantei.

3. Deoarece spectrofotometrul din laborator este monofascicul, este

necesara aducerea absorbantei la 0 de fiecare data cand se

schimba lungimea de unda. Pentru aceasta se introduce o

cuva cu solventul probei (apa) si se apasa pe butonul ZERO.

4. Se introduce in spectrofotometru cuva cu solutia de interes si se

citeste absorbanta.

Page 17: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Trasarea spectrului Sunset Yellow (E110)

Spectrul de absorbtie al Sunset Yellow se obtine prin reprezentarea A = f (l)

Gasirea maximului de absorbtie in

intervalul ales

Page 18: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Trasarea dreptei de calibrare

c (mM) A (… nm)

3

5

X

X = ?

Parametrii dreptei y = a + bx se obtin cu

Excel / Origin sau cu ecuatiile :

N

xbya

xxN

yxxyNb

22

Ax

Almax

c (mM)

Page 19: Spectrometrie (1)

UMFCD - Biofizica Spectrometrie - Dr. Octavian Călinescu

Observatii

1. Folosim pentru determinari cantitative numai absorbanta masurata

la o lungime de unda unde avem un maxim.

2. Legea Lambert-Beer e valabila cand se folosesc concentratii

molare sau normale.

3. Absorbanta este aditiva. Daca in solutie ar mai exista o alta specie

care sa absoarba la aceeasi lungime de unda ca si colorantul

nostru, absorbanta ar fi suma absorbantelor individuale date de

cele doua componente.

4. Metoda spectrofotometrica e sensibila pana la concentratii de ~ 1

ppm (1 mg/mL)