Spectrometria de Masa

Introducere

1

SPECTROMETRIA DE MAS

2

Introducere

CUPRINS CAPITOLUL 1 Introducere 1.1. Principii fundamentale 1.2. Utilizarea spectroscopiei de mas n chimia organic 1.3. Scurt istoric i perspective CAPITOLUL 2 Aparatura 2.1. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.2.1. 2.2.2.2. 2.2.2.3. 2.2.3. 2.2.3.1. 2.2.3.2. 2.2.4. 2.2.5. 2.2.6. 2.2.7. 2.2.8. 2.2.9. 2.3. 2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.3.4. 2.3.4.1. 2.3.4.2. 2.3.4.3. 2.3.5. 2.3.6. 2.3.7. 2.4. 2.4. 2.5. Introducerea probei Surse de ioni i tehnici de ionizare Ionizare prin impact electronic (Electronic Impact, EI) Ionizarea chimic (Chemical Ionization, CI) Ionizarea chimic prin transfer de sarcin Formarea de aduci Ionizarea chimic prin desorbie (Desorption Chemical Ionization, DCI) Ionizarea prin bombardament cu ioni sau cu atomi rapizi Spectrometria de mas a ionilor secundari (Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS) Ionizarea prin bombardare cu atomi rapizi (Fast Atom Bombardment, FAB) Ionizarea cu laser (Laser Ionization Mass Analysis, LIMA) MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Ionizarea cu termospray (TSP) Ionizarea cu electrospray (ES sau ESI) Ionizarea la presiune atmosferic (Atmospheric Pressure Ionization, API Ionizarea cu surse cu plasm cuplat inductiv (Inductively Coupled Plasma, ICI) Analizoare Clasificarea spectrometrelor de mas Analizorul magnetic Analizorul electrostatic Spectrometre de mas cu dubl focalizare Dispersie i rezoluie Focalizarea de direcie Focalizarea n energie Analizorul cu timp de zbor (time-of-flight, TOF) Analizoare quadripolare Rezonana ciclotronic Detectoare Sisteme de nregistrare Prelucrarea datelor 5 6 6 7 11 12 13 13 13 13 15 15 15 17 18 18 19 20 21 22 22 22 23 23 24 24 26 28 30 30 1 3 3

CAPITOLUL 3 CUPLAJE NTRE TEHNICILE CROMATOGRAFICE I SPECTROMETRIA DE MAS 3.1. Cuplajul gaz-cromatograf-spectrometru de mas (GC/MS) 32 3.2. Cuplajul HPLC - spectrometru de mas (HPLC/MS) 33 3.2.1. Cuplaj cu interfa moving belt 33

Introducere

3

3.2.3. Cuplaj cu interfa Particle Beam (PB) 3.2.4. Cuplaj cu interfa Thermospray (TSP) 3.2.5. Ionizarea chimic la presiune atmosferic (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) 3.2.6. Interfeele tip Electrospray (ESI) i Ionspray (ISP) 3.2.7. Moduri de achiziie a datelor cromatografice CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE MAS N TANDEM (MS/MS) CAPITOLUL 5 SPECTRUL DE MAS Introducere Informaii analitice Determinarea formulei moleculare cu aparate de nalt rezoluie Determinarea formulei moleculare cu aparate de rezoluie joas. Abundene izotopice Ionul molecular Structura ionului molecular Identificarea ionului molecular Regula azotului Ioni metastabili Procese de fragmentare Generaliti Potenial de ionizare i potenial de apariie Simboluri utilizate n spectrometria de mas Ioni cu numr par i impar de electroni Molecule i fragmente neutre cu mas mic Stabilirea numrului de cicluri sau a nesaturrii Scindri simple Scindri cu rearanjare Fragmentarea retro-Diels-Alder Rearanjarea McLafferty Factori ce influeneaz procesele de fragmentare Reguli generale ce se pot aplica proceselor de fragmentare Spectrometria de mas a ionilor negativi

34 35 35 36 37 38 40 41 42 42 45 45 45 47 47 48 48 50 50 51 53 53 54 56 56 58 60 61 62

5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.5.1. 5.5.2. 5.5.3. 5.6. 5.7. 5.7.1. 5.7.2. 5.7.3. 5.7.4. 5.7.5. 5.7.6. 5.7.7. 5.7.7. 5.7.7.1. 5.7.7.2. 5.7.8. 5.7.9. 5.8.

CAPITOLUL 6 PROCESE DE FRAGMENTARE ASOCIATE CU PRINCIPALELE CLASE DE COMPUI ORGANICI 6.1. Hidrocarburi 6.1.1. Hidrocarburi saturate aciclice 6.1.2. Cicloalcani 6.2. Alchene i alchine 6.3. Hidrocarburi aromatice 6.4. Derivai halogenai 6.4.1. Derivai halogenai alifatici 6.4.2. Derivai halogenai aromatici 6.5. Compui oxigenai 6.5.1. Compui hidroxilici 6.5.1.1. Alcooli 6.5.1.2. Fenoli 6.5.2. Eteri

64 64 66 67 68 69 69 72 73 73 73 76 77

4

Introducere

6.5.2.1. 6.5.2.2. 6.6. 6.6.1. 6.6.1.1. 6.6.1.2. 6.6.1.3. 6.6.2. 6.6.3. 6.6.3.1. 6.6.3.2. 6.7. 6.7.1. 6.7.1.1. 6.7.1.2. 6.7.2 6.8. 6.8.1. 6.8.1.1. 6.8.1.2. 6.8.2. 6.8.2.1. 6.8.2.2. 6.9. 6.9.1. 6.9.1.1. 6.9.1.2. 6.9.2. 6.9.2.1. 6.9.2.2. 6.9.2.3. 6.9.2.4. 6.9.3. 6.9.3.1. 6.9.3.2. 6.9.4. 6.9.4.1. 6.9.4.2. 6.9.5. 6.9.6. 6.10.

Eteri alifatici Eteri aromatici Compui cu azot Amine Amine alifatice Amine cicloalifatice Sruri cuaternare de amoniu Amine aromatice Nitroderivai Nitroderivai alifatici Nitroderivai aromatici Compui cu sulf Compui alifatici Tioli Tioeteri, tiocetali Disulfuri Compui carbonilici Aldehide Aldehide alifatice Aldehide aromatice Cetone Cetone alifatice Cetone aromatice Acizi carboxilici i derivai funcionali Acizi carboxilici Acizi carboxilici alifatici Acizi carboxilici aromatici Esteri Esteri alifatici Esteri ai acizilor aromatici Esteri ai alcoolilor aromatici i ai fenolilor Lactone Amide Amide alifatice Amide aromatice Nitrili Nitrili alifatici Nitrili aromatici Anhidride Cloruri acide Compui heterociclici aromatici CAPITOLUL 7 SPECTROMETRIA DE MAS A BIOMOLECULELOR Peptide i proteine Punerea n eviden a mutaiilor Identificarea i localizarea modificrilor post-traducionale Verificarea structurii i a puritii peptidelor i proteinelor sintetice Stabilirea structurii Influena poziiei i a deocalizrii sarcinii Strategii i exemple de determinarea secvenei Spectrometria de mas a oligonucleotidelor

77 79 79 79 79 81 81 81 83 83 83 83 84 84 85 85 86 86 86 86 87 87 88 89 89 89 90 91 91 92 92 93 93 93 94 94 94 95 95 95 96

7.1. 7.1.1. 7.1.2. 7.1.3. 7.1.4. 7.1.5. 7.1.6. 7.2.

98 100 100 100 101 104 104 106

Introducere

5

7.3. 7.4. 7.5. 7.6.

Oligozaharide Acizi grai Grsimi Sruri biliare CAPITOLUL 8 PROBLEME

108 113 115 117 120 143 199 205 207 213 215 216 217 218

ANEXE Anexa nr. 1. Masele i rapoartele abundenelor izotopice pentru diferite combinaii de C, H, N i O Anexa nr. 2. Izotopii elementelor chimice aranjate n ordine alfabetic Anexa nr. 3. Abundenele izotopice pentru diverse combinaii ntre atomi de clor i brom Anexa nr. 4. Fragmente ionice caracteristice pentru compuii organici uzuali Anexa nr. 5. Fragmente neutre ce nsoesc fragmentrile compuilor organici n spectrometrul de mas Anexa nr. 6. Constante fizice fundamentale SEMNIFICAIA PRINCIPALELOR PRESCURTRI UTILIZATE N TEXT INDEX ALFABETIC BIBLIOGRAFIE

6

Introducere

CAPITOLUL 1 INTRODUCERE Spectrometria de mas este cea mai sensibil metod de analiz structural. Ea difer fundamental de celelalte tehnici spectrale uzuale (rezonana magnetic nuclear, spectrometria n infrarou, n ultraviolet etc) prin faptul c nu implic utilizarea radiaiilor electromagnetice. Spectrometria de mas este inclus n tehnicile spectroscopice deoarece reprezentarea distribuiei unor mase funcie de abundenele relative este analog cu reprezentarea intensitii unor radiaii funcie de lungimea de und. Spre deosebire de celelalte tehnici spectrale, spectrometria de mas transform chimic proba care devine astfel nerecuperabil. 1.1. Principii fundamentale Spectrometria de mas este o metod fizic utilizat, n special, pentru analiza substanelor organice ce const, n esen, n ionizarea substanei investigate, urmat de separarea ionilor obinui n funcie de raportul dintre mas i sarcin. Spectrul de mas reprezint nregistrarea maselor i a abundenelor relative ale ionilor obinui. Spectrul de mas este o caracteristic a fiecrui compus, iar identificarea ionilor rezultai n cursul fragmentrii permite, de multe ori, stabilirea complet a formulei structurale. n cel mai simplu spectrometru de mas (figura 1.1), moleculele organice aflate n faz de vapori sunt bombardate cu un fascicul de electroni, avnd energia cuprins ntre 10-70 eV, pentru a fi transformate n ioni pozitivi cu energie nalt:M + e - M + + 2e

Datorit coninutului energetic ridicat, ionul , denumit ion molecular sau ion-printe, va suferi, n continuare, procese complexe de fragmentare, ce vor conduce la formarea de fragmente ionice i neutre:

+ + M = m1 + m2

+ + s a= mu1 + m2 M

Dintre acestea, spectrometrul de mas analizeaz numai fragmentele ionice. Deoarece ionii au de parcurs o distan considerabil pn la colector, pentru a se evita ciocnirile dintre particulele pozitive sau dintre acestea i molecule neionizate, incinta aparatului este meninut la o presiune foarte joas ( 10-6 - 10-7 mm Hg).

Introducere

7

Figura 1.1. Schema de principiu a unui spectrometru de mas: 1. rezervor de vapori; 2. frit; 3. catod; 4. anod; 5. zon de accelerare; 6. fante de focalizare; 7. tubul analizorului; 8. magnet; 9. detector; 10. amplificator; 11. nregistrator.

Ionii formai n sursa de ioni sunt accelerai sub aciunea unei diferene de potenial, realizat ntre doi electrozi, i ajung apoi la analizor care are rolul de a-i separa n funcie de raportul mas/sarcin, dup deviere ntr-un cmp magnetic variabil. n acest mod ia natere un curent de ioni de la camera de ionizare spre detector, curent proporional cu numrul de ioni care l-a generat. Dup detectare-amplificare acest curent este nregistrat de ctre nregistrator, care furnizeaz astfel spectrul de mas. Elementele principale ale unui spectrometru de mas sunt prezentate n figura 1.2.

Figura 1.2. Schema bloc a unui spectrometru de mas

n figura 1.3. este prezentat spectrul de mas, n form normalizat, al 2-metilpentanului. Spectrul evideniaz o serie de caracteristici ale substanei investigate, dintre care cele mai importante sunt: a. masa molecular este 86 u.a.m; b. picul cel mai intens apare la m/e 43; aceasta arat c scindarea preferenial are loc ntre C2-C3, cu formarea celor mai stabili ioni; c. picurile de la m/e 15, 29, 57, 71 indic fragmente rezultate din scindarea, direct sau indirect, a ionului molecular i care corespund unor ioni CH 3+, C2H5+, C4H9+, respectiv C5H11+. Analiza detaliat a zeci de mii de spectre a permis formularea unor legi semi-empirice referitoare la fragmentrile prefereniale suferite de moleculele organice. Aplicarea detaliat a acestor reguli la elucidarea structurii compuilor organici va fi discutat n capitolul 5.7.

8

Introducere

Figura 1.3. Spectrul de mas al 2-metilpentanului

1.2. Utilizarea spectroscopiei de mas n chimia organic Chimia organic poate utiliza spectrometria de mas pentru elucidarea urmtoarelor aspecte principale:1. determinarea masei moleculare. Este cea mai utilizat facilitate oferit de ctre spectrometria

de mas. Posibilitatea determinrii masei moleculare se bazeaz pe procesul primar de formare a ionului molecular prin expulzarea unui electron din molecula investigat. Ionul astfel format va avea, practic, aceeai mas molecular cu molecula din care provine. Din acest motiv, identificarea ionului molecular reprezint o etap cheie n interpretarea unui spectru de mas; 2. determinarea formulei moleculare. Formula molecular a unui ion poate fi determinat direct dac este posibil msurarea cu o precizie de cel puin patru zecimale a masei moleculare. Aceasta precizie necesit aparate cu o rezoluie mai mare de 104 (spectrometre de mas de nalt rezoluie). Rezoluia necesar determinrii directe a formulei moleculare crete rapid odat cu creterea masei i a numrului de elemente prezente n molecul; 3. elucidarea structurii moleculelor. Stabilirea formulei structurale poate fi realizat, n unele cazuri, n urma interpretrii fragmentrilor suferite de ctre ionul molecular. Atribuirea structural poate fi fcut i prin compararea datelor spectrale cu cele existente n bibliotecile de spectre de mas; 4. stabilirea marcajelor izotopice. Spectrometria de mas este metoda standard pentru analiza rezultatelor experimentelor de marcare izotopic, experimente de o importan deosebit pentru evidenierea proceselor chimice ce au loc n organismele vii. Determinarea extrem de precis a abundenelor izotopice prezint o importan deosebit pentru geo-tiine i arheologie. Astfel, posibilitatea de a determina un raport 14C/12C = 1/1015 a permis datarea unui eantion de 40.000 de ani cu o precizie de 1 %. Spectrometria de mas permite stabilirea cu uurin a prezenei izotopilor i a poziiei acestora n molecul. 1.3. Scurt istoric i perspective 1886: E. Goldstein descoper ionii pozitivi; 1898: W. Wien face primele analize prin deflexie magnetic; 1912: J.J. Thomson (premiul Nobel n 1906) nregistrez primele spectre de mas ale O2, N2, CO, CO2, COCl2. A observat ioni negativi i ioni cu sarcini multiple. A descoperit ionii metastabili. A descoperit (1922) izotopii 20 i 22 ai neonului; 1918: A.J. Dempster construiete primul spectrometru de mas cu focalizare de direcie (magnet n form de sector); 1919: F.W. Aston (premiul Nobel, 1922) construiete primul spectrometru de mas cu focalizare de vitez. A msurat defectul de mas (1923);

Introducere

9

1930: 1934: 1942: 1948: 1953: 1957: 1958: 1966: 1967: 1972: 1975: 1980: 1981: 1982: 1985: 1988:

R. Conrad utilizeaz spectrometria de mas n chimia organic; W.R. Smythe, L.H. Rumbaug i S.S. West realizeaz prima separare preparativ a izotopilor; firma Consolidated Engeneering Corporation produce primul aparat comercial pentru Atlantic Refinery Company; A.E. Cameron descoper analiza prin msurarea timpilor de zbor ale ionilor (TOF); W. Paul (premiul Nobel, 1989) i H.S. Steinwedel descriu analizorul quadripolar i capcana de ioni; firma Kratos comercializeaz primul spectrometru cu dubl focalizare dup ce J. Beynon a artat importana analitic a determinrii exacte a maselor; apar primele spectrometre de mas cuplate la gaz-cromatograf; M.S.B. Munson i F.H. Field descoper ionizarea chimic; utilizarea primelor sisteme de tratare computerizat a datelor; J. Beynon descrie descompunerea ionilor metastabili; apar primele aparate de rutin GC/MS cu coloane capilare; H.L. Vestal descoper termospray-ul; M. Barber descrie ionizarea prin bombardament cu atomi rapizi, FAB; primul spectru complet al insulinei (5750 u.a.m.); F.H. Hillenkamp descoper Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI); primele spectre ale proteinelor cu mase mai mari de 20.000 u.a.m.

Progresele tehnicilor experimentale i perfecionarea instrumentelor au condus la creteri spectaculoase ale rezoluiei i sensibilitii: An 1913: 1918: 1919: 1937: 1991: Rezoluie, m/ m 13 100 130 2.000 2*108 Autor J.J. Thomson A.J. Dempster F.W. Aston F.W. Aston A.G. Marshall

Studiile efectuate de ctre Strategic Directions International (Los Angeles, California, SUA) prevd creterea spectaculoas a vnzrilor de spectrometre de mas n urmtorii 5 ani. n anul 1995 vnzrile de spectrometre de mas au totalizat 1,1 miliarde de dolari, comparativ cu anul 1991 cnd vnzrile au fost de numai 597 milioane de dolari. Raportul indic, de asemenea, apariia de noi tipuri de instrumente i tehnici; se ateapt ca spectrometrele cu timp-de-zbor s joace un rol din ce n ce mai mare n biotehnologie. Supravegherea factorilor de mediu va necesita utilizarea spectrometrelor de mas transportabile. Aceste date relev, o dat n plus, importana major pe care o are spectrometria de mas n prezent.

10

Cuplaje ntre tehnicile cromatografice i spectrometria de mas

CAPITOLUL 2 APARATURA Dup cum s-a precizat n capitolul 1.1, un spectrometru de mas conine cinci seciuni principale: 1. seciunea de introducere a probei; 2. seciunea de ionizare i accelerare; 3. seciunea de separare a ionilor; 4. seciunea de colectare-detectare; 5. seciunea de amplificare-nregistrare. 2.1. Introducerea probei Spectrometrul de mas analizeaz ioni aflai n faz gazoas. Modul de introducere a probei n aparat depinde esenial de modul de ionizare i de proprietile fizico-chimice ale substanei de analizat. n acest subcapitol vor fi prezentate, n principal, numai aspectele legate de introducerea probei n cazurile n care ionizarea se realizeaz prin impact electronic. n cazul celorlalte tehnici de ionizare, modul de introducere a probei rezult din tehnica general de lucru. La introducerea probei n spectrometru de mas trebuie s se in seama de urmtoarele aspecte: puritatea probei. Deoarece spectrometria de mas este o metod de analiz deosebit de sensibil, puritatea probei trebuie s fie extrem de mare. Prezena unor impuriti, chiar n cantitate mic, poate afecta foarte mult interpretarea spectrului, mai ales atunci cnd volatilitatea impuritii este mult mai mare dect a substanei analizate (n cazul extrem se nregistreaz numai spectrul impuritii); volatilitatea probei. Iniial, una dintre dificultile majore ntlnite la nregistrarea spectrelor de mas era determinat de necesitatea ca substana de analizat s fie adus n stare de vapori. Compuii organici stabili i care prezint presiuni de vapori moderate la temperaturi de pn la 300 0C, la presiunea de circa 10-5 mm Hg din aparat, sunt introdui indirect (aa-numita introducere indirect), prin intermediul unei camere de vaporizare din care vaporii difuzeaz lent, printr-o frit, n camera de ionizare. Probele cu presiuni de vapori sczute (n general solidele) precum i cele care se descompun, se introduc direct n camera de ionizare (introducere direct). Volatilizarea lor se realizeaz n urma unei nclziri controlate. Substanele cu volatilitate extrem de sczut (cum ar fi aminoacizii,


11

zaharurile etc) pot fi analizate dup derivatizare (transformare chimic n derivai mai puin polari). Tehnicile moderne de ionizare au permis i nregistrarea spectrelor unor compui tradiional nevolatili: polimeri, peptide i proteine etc; cantitatea de prob. Dei, n principiu, aceasta depinde de modul de introducere a probei, de tipul de aparat, de timpul necesar nregistrrii spectrului etc., cantitatea necesar nu depete 1 mg, fiind mult mai mic dect cantitile necesitate de celelalte tehnici spectrale. Aparatele moderne au permis nregistrarea de spectre de mas prin utilizarea unor cantiti de substan de ordinul a 10-12 g. Utilizarea unor cantiti extrem de mici de subsatn este extrem de avantajoas, printre altele, i datorit faptului c proba este nerecuperabil (spectrul de mas este ultimul tip de nregistrare spectral atunci cnd se dispune de cantiti limitate de substan).

2.2. Surse de ioni i tehnici de ionizare Sursa de ioni (denumit frecvent i camer de ionizare) are rolul de a realiza ionizarea substanelor ce urmeaz a fi analizate i reprezint una dintre cele mai importante componente a spectrometrului de mas. Principalele tipuri de surse de ioni sunt clasificate, funcie de modul de realizare a ionizrii, dup cum urmeaz: surse de ionizare prin bombardament electronic (impact electronic, electronic impact, EI); surse de ionizare prin coliziunea probei cu ioni furnizai de surs (ionizare chimic, chemical ionization, CI); surse de ionizare prin bombardament cu un fascicul de ioni sau molecule neutre (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry, LSIMS i Fast Atom Bombardment, FAB); surse de ionizare cu ajutorul laserului (Laser Ionization Mass Analysis, LIMA i Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI); ionizare prin dispersarea unor soluii sub form de picturi fine (termospray, TSP i electrospray, ESI);

2.2.1. Ionizarea prin impact electronic (Electronic Impact, EI) Sursa de ionizare prin impact electronic este una din cele mai utilizate surse n spectrometria de mas organic. Sursa este format dintr-un filament nclzit (catod) ce emite electroni. Electronii produi sunt accelerai spre un anod, intrnd n coliziune, n drumul lor, cu moleculele probei aflate n stare de vapori. n figura 2.1. este reprezentat schematic o surs de ionizare prin impact electronic. Fiecrui electron emis de ctre surs i este asociat o und a crei lungime de und, , este dat de relaia: = h/mv. Pentru o energie cinetic de 20 eV, = 0,27 nm, iar pentru valoarea de 70 eV, = 0,14 nm. Cnd aceast lungime de und este de acelai ordin de mrime cu lungimea legturilor chimice, unda este perturbat i devine o und compus. Dac una dintre frecvene are o energie h ce corespunde unei tranziii din molecul, poate avea loc un transfer de energie. Dac aceast cantitate de energie este suficient, poate avea loc expulzarea unui electron. n figura 2.2. sunt prezentate curbele tipice de variaie a

12


numrului de ioni produi de un curent electronic dat, la o presiune constant a probei, funcie de potenialul

Figura 2.1. Surs de ionizare prin impact electronic

de accelerare a electronilor (deci de energia lor cinetic). La valori sczute ale potenialului, energia fasciculului electronic este inferioar energiei de ionizare a moleculei. La valori ridicate ale potenialului, lungimea de und asociat este prea mic i moleculele devin transparente fa de electroni. Dup cum rezult din figura 2.2, pentru moleculele organice maximul este situat n jurul valorii de 70 eV.

Figura 2.2. Variaia numrului de ioni produi n spectrometrul de mas funcie de energia electronilor

n medie, n condiiile standard de presiune din spectrometrul de mas ( 2x10-5 mm Hg), se produce un ion la o mie de molecule intrate n surs. Curentul ionic total produs n urma impactului electronic este de ordinul a 10-6 A. 2.2.2. Ionizarea chimic (Chemical Ionization, CI) Datorit energiei nalte a electronilor utilizai pentru ionizarea prin impact electronic, ionul molecular produs prin expulzarea unui electron poate s sufere fragmentri. Din acest motiv, n multe situaii, picul ionului molecular este foarte puin intens sau absent, ceea ce produce dificulti n determinarea masei moleculare. Avantajul utilizrii surselor de ionizare chimic const n obinerea unui spectru n care picul ionului molecular este uor de identificat.


13

n principiu, ionizarea chimic implic producerea de ioni ai substanei de analizat n urma coliziunii, ntr-o zon limitat a sursei, dintre moleculele probei i un gaz, ionizat n prealabil prin impact electronic, prezent n interiorul sursei. Pentru ca aceste coliziuni s poat avea loc este necesar ca presiunea din interiorul sursei s aib o valoare de circa 0,5 mm Hg (circa 60 Pa), situaie n care drumul liber mediu al unei molecule este de numai cteva zeci de milimetri. Deoarece orice coliziune produce devierea ionului de pe traiectorie, urmat de descrcare pe pereii aparatului, majoritatea spectrometrelor de mas lucreaz n condiiile unui vid naintat. Pe de alt parte, coliziunile dintre ioni i molecule pot provoca reacii chimice care, dac nu sunt controlate, complic inutil spectrul. Conform teoriei cinetice a gazelor, drumul liber mediu se determin cu relaia:L= 1 2 n 2unde n = p / kT

(n este numrul de molecule pe cm3 iar diametrul de coliziune, n cm, adic suma razelor moleculelor care intr n coliziune). n condiiile ntlnite n spectrometrul de mas ( 3,8.10-10 m, T 300 K), drumul liber mediu al unei molecule, L (cm), se calculeaz cu formula: L = 0,66/p, unde p este presiunea din aparat, exprimat n pascali. n aparatele care utilizeaz surse de ionizare prin impact electronic, acest parcurs liber mediu trebuie s fie cel puin de ordinul metrilor, ceea ce conduce la valori ale presiunii de maximum 10-5 mm Hg. n tabelul 2.1 sunt prezentai factorii de transformare ntre diversele uniti de presiune. Tabelul 2.1. Uniti de presiune (simbolul utilizat este prezentat n paranteze) 1 pascal (Pa) = 1 newton / m2 1 bar = 106 dyne / cm2 = 105 Pa 1 milibar (mbar) = 10-3 bari =102 Pa 1 microbar ( bar) = 10-6 bari = 10-1 Pa 1 nanobar (nbar) = 10-9 bari = 10-4 Pa 1 atmosfer (atm) = 1,013 bari = 101.325 Pa 1 torr = 1 mm Hg = 1,333 mbari = 133,3 Pa Realizarea practic a acestei cerine se poate face, de exemplu, prin introducerea n interiorul sursei a unui cub cu latura de circa 1 cm, prevzut cu orificii pentru trecerea electronilor, pentru admisia gazului ionizant, pentru introducerea probei i pentru trecerea ionilor formai spre analizor. Presiunea din interiorul acestei incinte se menine la valoarea optim prin introducerea de gaz ionizant. n figura 2.3 este prezentat o camer de ionizare capabil s lucreze att n varianta EI ct i n varianta CI. Deoarece raportul dintre moleculele gazului ionizant i moleculele probei este foarte mare (circa 103), un electron intrat n incint va ioniza preferenial, prin impact electronic, numai moleculele gazului ionizant. Ionul astfel format va intra, la rndul su, n coliziune cu alte molecule de gaz ionizant, formnd, printr-o serie de reacii, o plasm de ionizare. Ionii substanei de analizat se vor forma prin reacii chimice cu ionii acestei plasme (transfer de proton, extragere de ion hidrur, adiii, transfer de sarcin etc). Aceast plasm va conine i electroni cu energie joas (electroni termici) rezultai n urma scderii vitezei electronilor

14


utilizai la ionizarea gazului sau produi n reaciile de ionizare. Aceti electroni leni pot s adiioneze la molecule formnd ioni negativi. Fa de ionizarea prin impact electronic, principalele avantaje ale ionizrii chimice sunt urmtoarele:

Figura 2.3. Camer de ionizare combinat EI/CI. Prin coborrea cutiei 10 se trece de la varianta EI la varianta CI. 1. buton de comutare CI/EI; 2. ntreruptor; 3. intrare gaz ionizant; 4. tub capilar flexibil; 5. diafragm; 6. filament emitor de electroni; 7. orificiu de trecere a ionilor formai; 8. orificiu de trecere a electronilor ionizani; 9. orificiu pentru introducerea probei. 1. determinarea masei moleculare este mult mai uoar deoarece abundenele ionilor

M+, M+1 sau M-1 sunt mult mai mari; 2. procesele de fragmentare sunt mult mai simple (datorit, n special, faptului c ionul format din molecula de analizat nu mai este un radical-cation); 3. realizarea mult mai uoar a tandemului GC-MS n condiiile n care metanul poate fi utilizat att ca gaz purttor ct i ca gaz ionizant. Principale substane utilizate drept gaze ionizante sunt: a. metan. n cazul utilizrii metanului drept gaz ionizant, reacia primar la impact electronic este cea de formare a unui radical-cation:+ CH 4 + e CH 4 + 2 e

Ionul astfel format sufer dou tipuri principale de transformri: a. reacii de fragmentare:+ + CH 4 CH 3 + H + + CH 4 CH 2 + H 2

b. reacii ioni molecule:+ + CH 4 + CH 4 CH 5 + CH 3


15

Au loc i reacii la care particip ionii formai n urma transformrilor suferite de CH4+ :+ + CH 3 + CH 4 C 2 H 5 + H 2 + + C2H 3 + CH 4 C3H 5 + H 2

C +2 +HC 4 H C2 H 3+ + H 2 + H + + C 2 H 5 + CH 4 C 3 H 5 + 2 H 2

Dup cum este de ateptat, abundenele tuturor acestor ioni depind de presiunea din aparat. n figura 2.4. este prezentat spectrul de mas al plasmei de ionizare a metanului obinut la 20 Pa.

Figura 2.4. Spectrul de mas al plasmei de ionizare a metanului (20 Pa)

Ionii obinui n urma acestor reacii pot reaciona cu moleculele probei prin mai multe tipuri de reacii: a. transfer de proton prin reacii de tip acido-bazic:+ M + CH5 MH + + CH 4

b. extragere de ion hidrur (cnd specia analizat este o hidrocarbur saturat):+ RH + CH 5 R + + CH 4 + H 2

c. formare de aduci de tip ioni - molecule (n cazul n care proba este format din molecule polare):+ M + CH 3 (M + CH 3 ) +

Ionii de tipul (M+H)+, (M-H)+ i (M+CH3)+, ce apar n cazul ionizrii chimice, sunt denumii ioni quasi-moleculari sau pseudo-moleculari. Ei permit determinarea valorii masei moleculare. Deorece formarea lor este un proces chimic, aceti ioni nu conin excesul mare de energie ce apare la ionizarea prin impact electronic; din acest motiv, procesele de fragmentare sunt mult mai puin numereroase i analiza spectrului este mai simpl; b. izobutan. Ionul molecular al izobutanului se fragmenteaz astfel:

n spectrul de mas al plasmei de ionizare a izobutanului, obinut la 20 Pa (figura 2.5), se observ i un ion de mas 39, corespunznd formulei C3H3+; acesta poate s fie ionul ciclopropeniliu ce prezint structur aromatic. i n acest caz, ionii formai reacioneaz n special prin transfer de proton ctre prob. Cu molecule polare se observ formarea de aduci ce apar la m/e M+57 i M+39. Deoarece

16


cationul ter-butil este relativ stabil, izobutanul prezint o eficien sczut n ionizarea hidrocarburilor. Din acest motiv, izobutanul poate fi folosit pentru identificarea selectiv a unor compui n prezena hidrocarburilor saturate. c. amoniac. Radicalul-cation format prin impact electronic reacioneaz cu o molecul de amoniac:+ + NH 3 + NH 3 NH4 + NH 2

Figura 2.5. Spectrul de mas al plasmei de ionizare a izobutanului (20 Pa)

n spectrul plasmei de ionizare (figura 2.6.) se observ i un ion de mas 35, format prin asocierea ionului amoniu cu o molecul de amoniac:+ NH 4 + NH 3 (NH 4 + NH 3 ) +

Modul de ionizare depinde de natura probei. Moleculele bazice (i n special aminele) ionizez prin transfer de proton:+ + R NH 2 + NH 4 R NH 3 + NH 3

Figura 2.6. Spectrul de mas al plasmei de ionizare a amoniacului (20 Pa)

Moleculele polare i cele ce pot forma legturi de hidrogen (dar care sunt puin sau deloc bazice) formeaz aduci. n cazurile intermediare se observ cei doi ioni quasimoleculari (M+1)+ i (M+18)+. Substanele ce nu corespund criteriilor de mai sus (cum ar fi hidrocarburile saturate, eterii, nitroderivaii etc) nu pot fi ionizate eficient. Coninutul energetic al ionilor formai prin ionizarea prin impact electronic a metanului, izobutanului i amoniacului descrete n ordinea: CH5+> (CH3)3C+ > NH4+ Astfel, prin alegerea gazului se poate controla tendina ionilor MH+, formai prin ionizare chimic, de a se fragmenta. De exemplu, la ionizarea cu metan, di-octilftalatul are ca pic de baz MH+ ; ionii-fragmente de la m/e 113 i 149 reprezint ntre 30-60 % din abundena picului de baz. La utilizarea izobutanului ca gaz ionizant, picul MH+ este intens iar cele dou picuri de fragmentare reprezint aproximativ 5 % din picul de baz.


17

2.2.2.1. Ionizarea chimic prin transfer de sarcin Gazele rare, oxidul de carbon i alte gaze cu potenial de ionizare ridicat reacionez prin transfer de sarcin:Xe + e Xe + + 2 e + Xe + M M + + Xe

Ca i n cazul ionizrii prin impact electronic, se obine un radical-cation care are ns un coninut energetic mult mai sczut. Din acest motiv, ionul molecular va da mai puine fragmentri. 2.2.2.2. Formarea de aduci n plasma rezultat n urma ionizrii chimice, toi ionii se pot asocia cu molecule polare, cu formare de aduci. Procesul este similar unei solvatri n faz gazoas i este favorizat de posibilitatea angajrii de legturi de hidrogen. Pentru ca un astfel de aduct s fie stabil, este necesar ca excesul su de energie s fie eliminat prin ciocnire cu un alt treilea partener. Frecvent, n spectrele produilor ionizai chimic apar ioni rezultai prin asocierea unei molecule de gaz ionizant cu un ion quasi-molecular MH + sau cu un fragment F+, a unui ion quasi-molecular MH+ cu o molecul neutr etc. n principiu, orice ion din plasma de ionizare poate s se asocieze fie cu o molecul a probei, fie cu o molecul a gazului ionizant:MH + + M (2M + H) + F + + M (F + M) +

Aceste asociaii sunt utilizate, adesea, pentru a pune n eviden un amestec sau pentru a determina masele moleculare ale componenilor unui amestec. Astfel, un amestec a dou specii M i N poate da asociaii precum (MH+N)+, (F+N)+ cu (F+M)+ etc. Din acest motiv, este ntotdeauna util s se examineze picurile ce apar la valori m/e superioare ionului molecular al unei substane presupus pure. Dac exist picuri care nu pot fi explicate raional, este vorba probabil de un amestec. n interpretarea rezultatelor trebuie ns stabilit dac amestecul este determinat de prezena mai multor specii introduse nainte de vaporizare sau a aprut n urma unor transformri chimice dup vaporizare. n figura 2.7. este prezentat spectrul de ionizare chimic a unei substane pure. n spectru se pot evidenia picuri provenite din fragmentarea ionului quasi-molecular (m/e 176, 228, 272, 284) ct i picurile rezultate n urma unor procese de asociere a ionului quasimolecular cu ionii gazului ionizant (m/e 327+57), cu fragmente (m/e 327+176, 327+228, 327+284) sau chiar de asociere cu molecule ale probei (m/e 2x327+1). Figura 2.8. prezint spectrul unui amestec de substane rezultat prin eliminarea de acid cianhidric i ap din moleculele probei. n consecin, apar doi ioni quasi-moleculari ce se pot asocia n diverse moduri.

18


Figura 2.7. Spectru de ionizare chimic (gaz ionizant: izobutan)

Figura 2.8. Spectru de ionizare chimic (gaz ionizant: izobutan)

2.2.2.3. Ionizarea chimic prin desorbie (Desorption Chemical Ionization, DCI) Comparativ cu tehnica ionizrii prin impact electronic, ionizarea prin desorbie este o metod blnd de ionizare. Principalul ei avantaj const ns n faptul c permite analizarea probelor solide sau a soluiilor. n principiu, metoda const n depunerea probei, prin evaporarea unui solvent, pe un filament de tungsten sau de reniu, a crui temperatur poate fi controlat. n prezena plasmei de ionizare chimic au loc fenomene de desorbie, ceea ce permite nregistrarea spectrului la temperaturi considerabil mai joase (uneori cu peste 150 0C) dect cele utilizate n tehnicile uzuale de ionizare. Aspectul spectrului se schimb, n general, cu variaia temperaturii. Spectrul este un rezultat al suprapunerii mai multor fenomene, dintre care cele mai importante sunt: evaporarea probei urmat de ionizare rapid, ionizarea direct pe filament, desorbia direct a ionilor, piroliz urmat de ionizare etc. Metoda permite, de obicei, detectarea precis a ionului quasi-molecular. 2.2.3. Ionizarea prin bombardament cu ioni sau cu atomi rapizi


19

Ionizarea are loc prin focalizarea unui fascicul de ioni sau molecule neutre asupra probei i se realizeaz prin dou tehnici de baz. 2.2.3.1. Spectrometria de mas a ionilor secundari (Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS) Tehnica se aplic n special solidelor i este n mod deosebit util n studiul suprafeelor. n general, metoda nu poate fi aplicat substanelor organice deoarece acestea acumuleaz sarcini care deviaz fasciculul incident de ioni. SIMS implic generarea unui fascicul de ioni, cum ar fi Ar+ , Ne+ , Xe+ i direcionarea acestuia asupra moleculei analizate. Energia acestor ioni este transferat moleculelor probei care va ioniza, formnd aanumiii ioni secundari. 2.2.3.2. Ionizarea prin bombardare cu atomi rapizi (Fast Atom Bombardment, FAB) Metoda const n bombardarea moleculelor probei, dizolvate ntr-un solvent greu volatil, cu un fascicul de atomi neutri ce are rolul de a expulza ioni i molecule din soluie. Fasciculul de atomi neutri este format din atomi de argon sau xenon, ce posed o energie ridicat. Radiaia este obinut prin ionizarea iniial a atomilor, prin impact electronic, la radical-cationi, Xe+ :Xe + e Xe + + 2 e

Radical-cationii formai sunt accelerai sub un potenial de 6-10 keV pentru a forma radical-cationi de energie nalt (Xe)+ , care sunt apoi trecui prin xenon. n cursul acestei treceri, (Xe)+ primesc electroni de la atomii de xenon, transformndu-se n atomi de xenon cu energie nalt:X e X e+ accelerare +

Xe + Xe Xe + Xe+

+

Ionii care rmn n fascicul sunt apoi eliminai prin trecerea printre doi electrozi. Atomii neutri formai, ce posed o mare cantitate de energie, lovesc soluia probei, provocnd o und de oc ce va expulza ioni i molecule. Ionii probei vor fi apoi accelerai i trimii spre analizor. n figura 2.9. este prezentat schema unei surse de ionizare prin FAB.

Figura 2.9. Schema sursei de ionizare prin bombardament cu electroni rapizi (FAB): 1. zona de ionizare a argonului; 2. lentile de accelerare i focalizare; 3. zona de formare a atomilor neutri rapizi; 4. electrozi pentru deionizare; 5. proba dizolvat ntr-o pictur de glicerin; 6. accelerator de ioni; 7. electrozi de focalizare a fasciculului ionic; 8. spre analizor.

20


Cel mai utilizat solvent n tehnica FAB este glicerina. Alturi de aceasta se mai utilizeaz tioglicerina, alcoolul m-nitrobenzilic i, la analiza ionilor negativi, tri-etanolamina Aceast tehnic nu produce ioni; ea se mulumete s expulzeze n faza gazoas ionii pre-existeni n soluie. n acest mod se minimizeaz excitarea vibraional a moleculelor, ceea ce se reflect n procese de fragmentare extrem de sumare. Un alt avantaj l reprezint obinerea de fascicule de ioni ce pot fi meninute timp de 20-30 de minute, spre deosebire de tehnicile convenionale unde semnalul dureaz cteva secunde. De obicei, ionul molecular nu apare ca atare; sunt ns uor de identificat aduci de tipul (M+H)+. Ali aduci rezult prin asocierea cu diverse impuriti din sruri sau n urma adugrii de NaCl sau KCl: (M+Na)+ sau (M+K)+. Apar, de asemenea, aduci prin asociere cu moleculele solventului nevolatil (acetia pot fi ns eliminai cu uurin la interpretarea spectrului). Sursa de ionizare prin FAB poate genera ioni moleculari ai unor molecule foarte polare i nevolatile cum ar fi, de exemplu, cele ale peptidelor i proteinelor. Pot fi determinate mase moleculare de pn la 10.000 u.a.m. Cea mai important trstur este ns aceea c metoda permite stabilirea secvenei aminoacizilor din modul de fragmentare a ionului molecular. n figura 2.10a este prezentat spectrul FAB al unui amestec de peptide ce evideniaz picurile pseudo-moleculare (M+H)+. Figura 2.10b prezint spectrul MS/MS al ionului de mas 872, spectru care permite stabilirea secvenei de lan.


21

Figura 2.10. a. Spectrul FAB al unui amestec de peptide; b. Spectrul MS/MS al ionului de mas 872, utilizat pentru stabilirea secvenei de lan

2.2.4. Ionizarea cu laser (Laser Ionization Mass Analysis, LIMA) Desorbia laser (Laser Desorption, LD) este o metod eficace pentru producerea ionilor gazoi. Ionizarea are loc cu ajutorul unor impulsuri ce furnizeaz ntre 106 108 watt/cm2 i care sunt focalizate pe o suprafa de circa 10-3 10-4 cm2 pe care se afl proba, de obicei n stare solid. Aceste impulsuri provoac expulzarea unor cantiti infime de substan sub form de ioni i molecule neutre, care pot reaciona n continuare ntre ele n faza gazoas de deasupra suprafeei probei. Ionizarea poate fi amplificat n continuare prin utilizarea unui al doilea laser sau prin impact electronic. Aceast tehnic este utilizat pentru studiul suprafeelor i n analiza compoziiilor locale ale probelor, cum ar fi, de exemplu, incluziunile n minerale sau a organitelor din celule. Metoda permite o ionizare selectiv funcie de valoarea lungimii de und. Deoarece semnalul furnizat are o durat foarte scurt sunt necesare analizoare foarte rapide (cu detecie simultan sau cu timp de zbor).

2.2.5. MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) n aceast tehnic de ionizare substana de analizat se amestec cu o soluie ce conine compui organici cu molecul mic, numii matrice, i care prezint o absorbie puternic la lungimea de und a laserului utilizat. Iradierea amestecului cu ajutorul laserului va conduce la creterea coninutului energetic al fazei lichide prin excitarea moleculelor din matrice. Drept consecin, are loc un transfer de proton ntre matricea fotoexcitat i substana analizat, urmat de fenomene de desorbie a ionilor formai. Procesul de ionizare este schematizat n figura 2.11.

22


Figura 2.11. Schema de principiu a ionizrii cu laser asistat matriceal (MALDI)

Principalele avantaje prezentate de ctre aceast metod sunt urmtoarele: 1. aflat ntr-un mare exces, matricea izoleaz moleculele probei, limitnd apariia de agregate ce ar mpiedica formarea ionilor moleculari; 2. folosirea matricei elimin necesitatea modificrii lungimii de und a laserului funcie de natura probei; 3. pot fi desorbite i ionizate proteine cu mase moleculare de pn la 300.000 u.a.m; 4. sensibilitatea determinrii este foarte mare (de exemplu, o matrice din acid nicotinic permite detectarea unor cantiti de ordinul picomolilor dintr-o protein). n figura 2.12 este pezentat spectrul MALDI al unui anticorp monoclonal ce prezint o mas molecular de circa 150.000 u.a.m.2.2.6.

Ionizarea cu termospray (TSP)

Tehnica termospray-iului presupune pomparea unei soluii ce conine o sare i proba de analizat ntr-un capilar din oel nclzit prin trecerea unui curent electric i proiectarea acesteia cu o vitez supersonic ntr-o camer vidat. Se formeaz un jet ce conine picturi foarte fine, formate din ionii i moleculele probei i solvent. nclzirea n timpul vaporizrii este absolut necesar pentru evitarea congelrii picturilor. Ionii formai sunt separai i accelerai spre analizor.

Cuplaje ntre tehnicile cromatografice i spectrometria de mas Figura 2.12 Spectrul MALDI al unui anticorp monoclonal

23

2.2.7. Ionizarea cu electrospray (ES sau ESI) Electrospray-ul se obine prin aplicarea, la presiune atmosferic, a unui cmp electric puternic asupra unui lichid ce trece, cu un debit sczut (de obicei 1 10 l/min) printr-un tub capilar. Cmpul electric se obine prin aplicarea unei diferene de potenial de +3 6 kV ntre capilar i un electrod, separai de o distan de 0,3 2 cm (figura 2.13). Acest cmp provoac acumularea de sarcini la suprafaa lichidului situat la captul capilarului, acumulare ce determin formarea unui jet de picturi fine ncrcate electric. Evaporarea solventului coninut de aceste picturi va provoca micorarea lor pn n momentul n care forele de repulsie coulumbiene vor egala valoarea forelor de coeziune. n acest moment, picturile vor suferi un ir de scindri ce vor conduce la picturi din ce n ce mai mici, pn n momentul n care cmpul electric de la suprafaa lor va deveni suficient de puternic pentru a provoca desorbia ionilor. Dac molecula conine mai multe zone ionizabile, ionii astfel produi sunt purttori ai unui numr mare de sarcini.

Figura 2.13 Schema sursei tip electrospray

Un exemplu de spectru de mas la care ionizarea s-a realizat prin tehnica ESI este prezentat n figura 2.14. Datorit formrii de aduci cu ionii de sodiu, potasiu sau amoniu, ionizarea cu electrospray poate fi aplicat i moleculelor ce nu posed zone ionizabile.

24


Figura 2.14. Spectrul ESI al lyzozimului . Pe picuri este indicat valoarea masei i numrul de sarcini

Spectrele de mas ESI corespund, n general, unei distribuii statistice de picuri consecutive, ce caracterizeaz ionii moleculari rezultai prin protonri multiple, (M+zH)z+. Obinerea unor ioni cu sarcini multiple are ca avantaj creterea sensibilitii i posibilitatea analizrii unor molecule cu mas molecular foarte ridicat cu ajutorul unor analizoare ce prezint valori mici ale masei nominale (dup cum se tie, spectrometrele de mas nu msoar masa unui ion, ci raportul dintre mas i sarcin). Lucrul la presiune atmosferic mrete eficacitatea ionizrii de 103 104 ori. Deoarece compartimentul analizorului trebuie meninut la o presiune foarte joas, de circa 10-5 mm Hg, compartimentul sursei i cel al analizorului au fost separate de un orificiu cu diametru foarte mic (10 m), utilizndu-se n acelai timp pompe de vid de mare capacitate. Aceast tehnic a permis determinarea unor mase moleculare cu valori mai mari de 130.000 u.a.m. n cuplaj cu un aparat HPLC, tehnica ESI permite obinerea succesiv a spectrelor unor amestecuri complexe. 2.2.8. Ionizarea la presiune atmosferic (Atmospheric Pressure Ionization, API) Dac ionizarea probei se poate realiza la presiune atmosferic, eficacitatea producerii ionilor este de 103-104 ori mai mare dect n cazul ionizrii prin impact electronic la presiune redus. Deorece analizorul lucreaz la vid naintat (10-5 mm Hg), legtura ntre sursa de ioni i acest compartiment se realizeaz prin intermediul unui orificiu cu diametru extrem de mic (10 m), orificiu care limiteaz pierderile de presiune. Se utilizeaz, de asemenea, pompe de vid de mare capacitate.2.2.9.

Ionizarea cu surse cu plasm cuplat inductiv (Inductively Coupled Plasma, ICP)

Plasma cuplat inductiv este o surs ce permite analiza rapid i simultan a elementelor metalice. Metoda este extrem de precis i sensibil. Aceast surs este format dintr-o flacr n care se introduce proba dizolvat sub forma unui aerosol. Plasma format este nconjurat de ctre o bobin. Curentul alternativ al bobinei genereaz un cmp magnetic longitudinal care imprim o traiectorie circular ionilor. Interaciunile sunt optime dac frecvenele sunt egale i dac impedana generatorului i a plasmei sunt adaptate. Drept consecin, are loc o nclzire a plasmei la temperaturi ce pot atinge 10.000 K. Din acest


25

motiv procentul de ionizare este practic de 100 %. n figura 2.15 este prezentat schematic sursa cu plasm cuplat inductiv.

Figura 2.15 Sursa cu plasm cuplat inductiv 2.3. Analizoare

Ionii produi de ctre sursa de ioni sunt dirijai ctre analizor, care, pentru a permite identificarea lor, are rolul s-i separe funcie de raportul mas/sarcin. Tipul de analizor utilizat depinde, n multe cazuri, de sursa de ioni folosit. n prezent, au devenit din ce n ce mai rspndite aparatele care utilizeaz mai multe tipuri de analizoare. Aceste aparate permit, de exemplu, selectarea i nregistrarea spectrului de mas a unui singur ion, izolat dintre cei rezultai la fragmentarea unei substane. Principalele caliti ale unui analizor sunt legate de: limita de detecie - reprezint valoarea limit msurabil a raportului m/e; transmisia - este dat de raportul ntre numrul de ioni ce ajung la detector i cel produs de ctre surs; rezoluia - reprezint capacitatea detectorului de a distinge ntre doi ioni de mase vecine. Rezoluia unui spectrometru de mas este una dintre cele mai importante caracteristici. Astfel, pentru stabilirea formulei moleculare posibile cu ajutorul intensitii picurilor izotopice este necesar ca picurile adiacente s fie net separate. Arbitrar, se consider c rezoluia este corespunztoare dac "valea" dintre dou picuri adiacente nu reprezint mai mult de 10 % din intensitatea picului mai proeminent. Pentru a determina rezoluia unui instrument, se aleg dou picuri adiacente de intensitate aproximativ egal, ntre care exist o vale ce nu depete 10 % din intensitatea picului mai proeminent (figura 2.16). Rezoluia (R) este definit de relaia:R= Mn Mn Mm

unde Mn i Mn sunt numerele de mas ale celor dou picuri i Mn = Mm+1 Funcie de puterea de rezoluie exist dou tipuri de spectrometre de mas: a. spectrometre de rezoluie joas - pot fi definite ca aparate capabile s detecteze ioni ale cror mase difer cu cel puin o unitate de mas (aparate cu rezoluie unitar - unit resolution), valoarea maxim a raportului m/e ce poate fi msurat fiind de circa 2000.

26


Un asemenea aparat este capabil, de exemplu, s separe un ion de mas 2.000 de unul cu mas 1999: [R = 2.000/(2.000-1.999) = 2000];

.Figura 2.16. Determinarea rezoluiei unui spectrometru de mas. 2. spectrometre de nalt rezoluie - sunt aparate capabile s separe doi ioni a cror mas

difer cel puin prin 0,05 u.a.m. Un asemenea aparat este, de exemplu, capabil s separe un ion de mas 500 de unul cu masa 499,5 [R = 500/(500-499,5) = 10.000]. 2.3.1. Clasificarea spectrometrelor de mas Spectrometrele de mas utilizate pentru determinarea structurii compuilor organici sunt clasificate funcie de metoda de separare a ionilor utilizat de ctre analizorul de mas. Analizoarele de mas realizeaz separarea particulelor cu sarcin (ale ionilor) pe baza raportului mas/sarcin sau a unor proprieti ce depind de acest raport. n prezent sunt utilizate patru tipuri principale de analizoare de mas bazate pe: 1. cmpuri magnetice i electrice; 2. timp de zbor; 3. filtre quadripolare; 4. rezonan ciclotronic. n tabelul 2.1. sunt prezentate principalele caracteristici ale celor mai utilizate tipuri de analizoare. Tabelul 2.2. Principalele caracteristici ale analizoarelor de masMetoda de separare cmp magnetic quadripoli timp de zbor rezonan ciclotronic Mrimea investigat moment filtru pentru m/e timp frecven Ecuaia fundamental 2.3. 2.6 2.9 Domeniul de msurare >104 >103 >104 >104 Rezoluia la 1.000 u.a.m. 105 105 105 106

2.3.2. Analizorul magnetic ntr-un analizor magnetic ionii sunt separai pe baza valorilor raportului m/e, dup devierea ntr-un cmp magnetic ce acioneaz perpendicular pe direcia de deplasare a ionilor (figura. 2.17).


27

La ieirea din sursa de ioni, un ion de mas m i sarcin e, ce se deplaseaz cu viteza v, sub aciunea unei diferene de potenial V, va ndeplini condiia de egalitate a energiei cinetice cu cea potenial (2.1.):

Figura 2.17 Sensul forei centripete (FM) ce acionez asupra ionuluiEc =

(2.1.) Ionul ptrunde apoi n cmpul magnetic al analizorului, ce acioneaz perpendicular pe direcia sa de deplasare, fiind supus unei micri circulare n care fora centrifug, mv2/r (r este raza de curbur a tubului aparatului) egaleaz fora centripet exercitat de ctre magnet, Bev (2.2.):mv 2 = Bev r

2eV mv 2 = eV sau v 2 = m 2

sau

v=

Ber m

(2.2.)

Din combinarea ecuaiilor 2.1. i 2.2. rezult:2eV e 2 B2 r 2 = m m2

sau

m B2 r 2 = e 2V

(2.3.)

Ecuaia 2.3. este relaia fundamental ce explic funcionarea spectrometrului de mas cu o singur focalizare. Ecuaia arat dependena raportului m/e de trei parametri: r - raza tubului analizorului; B - intensitatea cmpului magnetic; V - potenialul accelerator. ntruct r este o constant de aparat iar B este, la rndul su, meninut constant n cele mai multe dintre aparate, rezult c separarea ionilor funcie de raportul m/e se realizeaz prin baleiajul potenialului accelerator: la poteniale acceleratoare mari are loc separarea ionilor mai uori, pe cnd la poteniale mici are loc separarea ionilor mai grei. Ecuaia 2.3. indic i faptul c spectrometrele de mas nu sunt capabile s discearn ntre un ion de mas m+ i unul de mas (2m)2+ deoarece:m 2m B 2 r 2 = = e 2e 2V

(2.4.)

n analizorul magnetic, ionii formai de ctre surs sunt deviai de ctre cmpul magnetic i focalizai pe detector. Focalizarea produs de cmpul magnetic se numete focalizare de direcie iar aparatele construite pe acest principiu se numesc spectrometre de mas cu o singur focalizare. Unghiul de deviere a fasciculului de ioni n aparatele cu o singur focalizare poate s varieze n limite largi. n cele mai multe dintre aparate, devierea fasciculului de ioni se face sub unghiuri de 1800, 900 sau 600. Cea mai avantajoas este focalizarea realizat n sectoare

28


magnetice aflate sub unghiuri de 600, deoarece att sursa ct i detectorul sunt distanate de magnetul ce produce cmpul focalizator. 2.3.3. Analizorul electrostatic Analizorul electrostatic separ ionii formai n camera de ionizare cu ajutorul unui cmp electric longitudinal care accelereaz numai particulele ncrcate pozitiv. Acestea vor poseda, independent de masa lor, o energie cinetic, Ecin proporional cu sarcina elementar i diferena de potenial, V. n acest mod toi ionii vor poseda aceeai energie cinetic (ioni izocinetici) corespunznd ns la mase i viteze diferite: 2 m1 v12 m2 v 2 E cin = eV = = =...... (2.5.) 2 2 n realitate, ionii ce prsesc seciunea de accelerare nu sunt riguros izocinetici deoarece la viteza dobndit aici se adun vectorial viteza cu care particula a intrat n zona de accelerare. Analizorul electrostatic are tocmai rolul de a mri puterea de rezoluie a spectrometrelor de mas prin focalizarea ionilor cu acelai raport m/e, dar care posed energii cinetice diferite i nu pot fi focalizai pe detector ntr-un punct, cum ar fi ideal. Focalizarea ionilor ce au un anumit raport m/e poate fi realizat prin trecerea fasciculului ionic printr-un cmp electrostatic radial, de intensitate E, perpendicular pe direcia de deplasare. Traiectoria ionului n cmpul electrostatic radial este dat de ecuaia (2.6.): 2V (2.6.)r= E

Astfel, n analizorul electrostatic toi ionii monovaleni ce posed energii cinetice identice vor avea traiectorii identice, ale cror raze de curbur vor crete cu scderea energiei cinetice. Prin utilizarea unei fante foarte nguste se poate selecta un fascicul de ioni, riguros izocinetic, compus ns din ioni cu mase i viteze foarte diferite (focalizare de vitez). 2.3.4. Spectrometre de mas cu dubl focalizare 2.3.4.1. Dispersie i rezoluie Dup cum rezult din definiie, rezoluia unui spectrometru de mas depinde de calitatea semnalului furnizat de analizor. Cu ct acest semnal este mai larg, cu att separarea picurilor va fi mai dificil de realizat. Scderea rezoluiei este determinat, n principal, de trei factori:1. dispersia energetic. Faptul c ionii intrai n analizor nu posed aceeai energie cinetic

conduce la dispersarea traiectoriilor n cmp (figura 2.18a);

a

b

Figura 2.18. Dispersia ionilor n analizor: a. dispersie energetic; b. dispersie angular


29

2. dispersia unghiular. Dac ionii ce intr n analizor au traiectorii divergente, aceast divergen se poate amplifica n cmp (figura 2.18b); 3. mrimea fantei de intrare. Intrarea ionilor n analizor se face printr-o fant a crei lrgime are o influen direct asupra calitii semnalului. 2.3.4.2. Focalizarea de direcie Dup cum rezult din figura 2.17, un ion care intr n cmpul magnetic dup o traiectorie perpendicular pe cmp va descrie o traiectorie circular. Un al doilea ion, care intr pe o traiectorie ce face un unghi cu cea precedent, va descrie o traiectorie circular de raz egal i va prsi sectorul pe o direcie convergent cu prima (figura 2.19a). n consecin, prin alegerea unei geometrii adecvate a cmpului magnetic, se poate realiza o focalizare de direcie a fasciculului ce ptrunde n analizor. n acelai timp, ionul care intr ntr-un cmp electric urmnd o traiectorie perpendicular pe cmp va descrie o traiectorie circular. Un alt ion, ce va intra dup o traiectorie mai inclinat, va rmne mai mult timp n cmp i va iei pe o traiectorie convergent cu prima. Optimizarea geometriei va produce, de asemenea, o focalizare de direcie (figura 2.19b).

a

b

Figura 2.19 Focalizare de direcie: a. n sector magnetic; b. n sector electric

2.3.4.3. Focalizarea n energie Simultan cu focalizarea de direcie, sectoarele magnetic i electric realizeaz o dispersie n energie (figura 2.20). Prin combinarea a dou analizoare ce realizeaz aceeai dispersie energetic i montarea lor invers (figura 2.21), dispersia de energie a primului va fi anulat de convergena celui de-al doilea. n principiu, puterea de rezoluie a spectrometrelor cu focalizare de direcie crete cu raza de curbur a analizorului magnetic i cu valoarea potenialului de accelerare a ionului. Din raiuni practice, aceti doi parametri nu pot fi amplificai att ct ar fi necesar, astfel nct puterea de rezoluie la aparatele de acest tip nu depete 10.000. Prin cuplarea unui analizor magnetic cu unul electrostatic se poate mri puterea de rezoluie la circa 60.000 - 70.000.

30

Cuplaje ntre tehnicile cromatografice i spectrometria de mas b Figura 2.20. Dispersie de energie: a. n sector magnetic; b. n sector electric a

Figura 2.21. Combinarea unui sector electric cu unul magnetic (rotit corespunztor) pentru realizarea dublei focalizri (elctrice i magnetice)

O asemenea rezoluie face posibil determinarea masei moleculare a unui ion cu o precizie de peste patru zecimale, ceea ce permite determinarea direct a formulei moleculare. Aparatele de acest tip se numesc spectrometre de mas cu dubl focalizare sau spectrometre de mas de nalt rezoluie (High Resolution Mass Spectrometer, HRMS). n figura 2.22. este prezentat schema unui spectrometru de mas cu dubl focalizare.

Figura 2.22. Schema unui spectrometru de mas cu dubl focalizare.

2.3.5. Analizorul cu timp de zbor (time-of-flight, TOF) Analizorul cu timp de zbor difereniaz ionii pozitivi prin msurarea timpilor necesari ca acetia s traverseze un tub de zbor cu lungimea de circa 1 m. Principiul metodei timpilor de zbor este extrem de simplu. Un fascicul de ioni, generat de o surs pulsatorie (pentru a se evita sosirea simultan la detector a ionilor ce au rapoarte m/e diferite), este accelerat sub un potenial cunoscut, V, i se msoar timpul t necesar pentru ca acetia s ajung la un detector aflat la o distan d. Deoarece toi ionii sunt supui aceluiai potenial, V, vitezele v trebuie s fie invers proporionale cu rdcinile ptrate ale maselor, m. Astfel, timpul de zbor depinde de raportul m/e conform ecuaiei (2.7.).mv 2 = eV sau v = 22eV sau m

t2 =

m d2 e 2V

(2.7.)

2.3.6. Analizoare quadripolare


31

Quadripolul este un analizor care utilizeaz stabilitatea traiectoriilor pentru a separa ionii funcie de raportul m/e. Aparatele ce utilizeaz analizoare quaripolare sunt de dou tipuri: a. filtre de mas quadripolare (Quadrupole Mass Filter) Analizoarele quadripolare sunt formate din patru bare (poli) avnd o seciune hiperbolic, alimentate cu curent continuu i supuse unui cmp de radiofrecven oscilant (barele aflate fa n fa au ncrcri opuse). Ionii vor parcurge analizorul cu o vitez constant, ntr-o direcie paralel cu polii (axa z), realiznd ns micri complexe (oscilaii) pe direciile x i y. Un anumit ion poate s parcurg quadripolul fr a se descrca pe poli numai n condiiile n care aceast oscilaie este stabil. Pentru un ion cu un anumit raport m/e, stabilitatea oscilaiei depinde de valorile frecvenei de oscilaie i ale tensiunii curentului continuu i a sursei de radiofrecven. Rezult c, pentru un anumit set de condiii, numai ionii cu o singur valoare m/e vor putea s strbat quadripolul ce acioneaz astfel ca un filtru de mas. Toi ceilai ioni vor avea oscilaii instabile i se vor descrca pe poli. nregistrarea tuturor ionilor se face prin modificarea simultan a tensiunilor sursei de radiofrecvene i a curentului continuu, raportul lor i frecvena oscilatorului rmnnd ns constante. Parametrii tipici de lucru presupun tensiuni ale sursei de radiofrecven de cteva mii de voli la frecvene de ordinul a 106 Hz. n figura 2.23. este prezentat schema de principiu a unui spectrometru de mas cu analizor quadripolar.

Figura 2.23. Schema de principiu a unui spectrometru de mas cu analizor quadripolar.

Instrumentele de acest tip prezint ofer avantajul unui control precis al cmpului electric (mult mai uor de modificat dect cel magnetic). n mod obinuit, valoarea maxim a maselor ce pot fi determinate cu acest tip de aparat este de circa 4.000 u.a.m, la o rezoluie de ordinul 3.000, care nu este, evident, suficient pentru determinarea direct a formulei moleculare (sunt aparate de rezoluie joas). b. detectorul quadripolar tip capcan de ioni (Quadrupole Ion Storage, Ion Trap) Analizorul este format dintr-un electrod circular, de form toroidal, acoperit de dou calote sferice ce nchid incinta (capcana) n care sunt produi ionii prin impact electronic sau prin ionizare chimic. La acest tip de aparate nu exist surs separat de ioni. Principial, aceast capcan ionic este similar unui quadripol circular. Suprapunerea de tensiuni continue i alternative permite realizarea unui tip de quadripol tridimensional, n care ionii sunt reinui pe o traiectorie ce formeaz un fel de opt tridimensional. Pe cnd n filtrul

32


quadripolar se regleaz potenialul astfel nct numai ionii de o anumit mas s traverseze barele, n cazul capcanei ionice, ioni de diferite mase sunt prezeni n acelai timp n analizor i se ncearc expulzarea lor selectiv, funcie de mas, pentru a se obine spectrul. n scopul meninerii ionilor pe traiectorii cu raz mic, n aparat se introduce un gaz inert (de obicei heliu), valoarea presiunii remanente fiind de circa 10-3 mm Hg. n figura 2.24 este prezentat spectrometrul cu capcan de ioni.

Figura 2.24. Spectrometru tip capcan de ioni: sus - vedere general, jos: trapa de ioni (detaliu)

Aparatele comerciale de acest tip lucreaz, n general, la radiofrecvene de circa 1 MHz i tensiuni maxime de circa 7.500 V. n aceste condiii, valoarea maxim a maselor determinate este de circa 650 u.a.m., n condiiile unei sensibiliti ridicate. Obinuit, proba se introduce prin racordare la un gaz-cromatograf. Aparatul este simplu i relativ ieftin. 2.3.7. Rezonana ciclotronic Dup cum se tie, ntr-un cmp magnetic traiectoria unui ion devine curb. Dac viteza este sczut i cmpul intens, raza de curbur devine foarte mic i ionul este silit s urmeze o traiectorie circular: acesta este principiul ciclotronului. Principiile rezonanei ciclotronice a ionilor deriv din considerarea forelor ce acioneaz asupra ionilor supui influenei unor cmpuri magnetice i electrice. Un ion de mas m i vitez v, aflat ntr-un plan perpendicular pe un cmp magnetic de intensitate B, este supus unei fore Bev perpendicular att pe direcia cmpului magnetic ct i pe cea a deplasrii (ecuaia 2.8):Bev = mv mv 2 sau eB = r r

(2.8)


33

Ionul descrie o traiectorie circular 2 r, ntr-un plan perpendicular pe cmpul magnetic, cu o frecven dat de relaia 2.9.:=

n aceste condiii, viteza angular, , este dat de relaia (2.10): (2.10.) Rezult c viteza angular depinde numai de raportul (e/m)B (este independent de viteza ionilor). Totui, pentru un anumit ion, raza traiectoriei crete proporional cu viteza. Dac raza devine prea mare, ionul este expulzat din aparat. n practic, ionii sunt injectai ntr-o cutie cubic avnd laturile de civa centimetri (figura 2.25), aflat ntr-un cmp magnetic de civa tesla (de obicei 3 T). ntr-un astfel de cmp, frecvena ciclotronic este de 1,72 MHz pentru o mas de 28 u.a.m. i de 12,03 kHz pentru o mas de 4000 u.a.m. Valoarea maxim a cmpului magnetic utilizat a fost de maximum 7 T (1993). = 2 =v e = B r m

v 2r

(2.9.)

Figura 2.25. Schema unui aparat cu rezonan ionic ciclotronic

Relaia dintre frecven i mas arat c determinarea masei se reduce, n astfel de aparate, la determinarea frecvenei. Aceasta se poate face, n principiu, prin dou metode: a. rezonana ionilor n ciclotron (Ion Cyclotron Resonance, ICR) Iradierea cu o und electro-magnetic de frecven egal cu cea a unui ion aflat n ciclotron provoac absorbia la rezonan. Energia astfel transferat ionului contribuie la creterea energiei sale cinetice, ceea ce antreneaz o cretere a razei traiectoriei. Cantitatea de energie absorbit poate fi msurat, aa cum se face i n metodele spectroscopice clasice: UV, IR, RMN. n urma creterii razei traiectoriei, ionii aflai la rezonan ajung s fie colectai de ctre un detector i se msoar curentul rezultat, curent ce este proporional cu numrul de ioni; b. rezonana ciclotronic a ionilor cu transformat Fourier (Fourier Transform - Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR) Tehnica const n excitarea simultan a tuturor ionilor prezeni n ciclotron, cu o gam larg de frecvene, ntr-un timp de ordinul microsecundelor. n urma excitrii are loc punerea

34


ionilor n faz, ceea ce permite transformarea undei complexe, detectat n funcie de timp, ntr-o relaie intensitate funcie de frecven, prin intermediul transformatei Fourier. (Principiul transformatei Fourier este urmtorul: un semnal care msoar intensitatea n funcie de timp este format prin suprapunerea mai multor frecvene, fiecare avnd intensitatea sa. Transformata Fourier permite separarea frecvenelor i a intensitilor corespunztoare). Ca i n cazul altor tehnici ce utilizeaz transformata Fourier, rezoluia obinut va depinde de timpul de observaie, care depinde, la rndul su, de descreterea semnalului (determinat de fenomenele de relaxare). n acest caz, scderea intensitii semnalului este determinat, n principal, de scderea vitezei ionilor n urma ciocnirilor cu ioni sau molecule. Din acest motiv, pentru a se ajunge la rezoluii ridicate, este necesar nregistrarea spectrului n condiiile unui vid naintat (circa 10-9 mm Hg). Dei FT-MS permite, n principiu, determinarea unei game nelimitate de mase, cu rezoluii ridicate, n practic, valorile m/e msurate nu depesc 2.000 u.a.m. Rezoluia este extrem de mare la mase mici (depete 150.000), dar scade rapid cu creterea masei ionului (este maximum 10.000 la m/e 10.000). n plus, utilizarea transformatei Fourier necesit prelucrarea unui flux considerabil de date, ce mai era nc superior n 1992 cu un ordin de mrime posibilitilor de calcul ale mini-ordinatoarelor. Din aceste motive, utilizarea FT-MS este nc limitat. 2.4. Detectoare Dup traversarea analizorului de mas, fasciculul de ioni trebuie detectat i transformat ntr-un semnal utilizabil. n acest scop exist diferite tipuri de detectoare, capabile s transforme un curent ionic slab ( 10-9 A) ntr-un curent electric. Acesta trebuie apoi amplificat i nregistrat. Primele spectrometre de mas au utilizat ca detectoare plci fotografice i cilindri Faraday ce au permis msurarea direct a sarcinilor sosite la detector. n prezent se utilizeaz detectoarele multiplicatoare de electroni sau de fotoni i detectoarele cu microcanale ce permit creterea intensitii semnalului detectat. Aceste ultime detectoare prezint o sensibilitate extrem de ridicat (pot detecta chiar i prezena unui singur ion sosit la detector); utilizarea lor este limitat ns numai la analizele calitative deorece curentul format n urma emisiei de electroni secundari nu este strict proporional cu numrul de ioni sosit la detector. a. plci fotografice. Plcile fotografice au fost utilizate de ctre primele spectrometre de mas i se pretau i pentru msurtori de nalt rezoluie. Plcile sunt plasate dup analizor, iar spectrele apar sub form de linii ce prezint grade de negru diferite, ce se coreleaz cu intensitatea ionilor respectivi. b. cilindri Faraday. Acest tip de detector este format dintr-un cilindru alungit n care ptrund ionii. Acetia se ciocnesc de perei i se descarc. Curentul este apoi amplificat i msurat de ctre un electrometru. Diferite dispozitive previn sau suprim emisiile de electroni secundari. c. detectoare multiplicatoare de electroni. Detectoarele multiplicatoare de electroni utilizate n prezent sunt tuburi de sticl dopat cu plumb, avnd form de corn, i care prezint intense emisii secundare de electroni i o rezisten electric uniform (figura 2.26.). ntre cele dou extremiti ale tubului este aplicat o tensiune. Fiecare particul care lovete suprafaa intern a detectorului provoac o emisie secundar de electoni, ce sunt accelerai de


35

ctre cmpul interior; electronii ajung s loveasc din nou peretele interior, provocnd o nou emisie, mai intens. Procesul se repet de cteva ori, n final rezultnd un semnal amplificat ce este detectat de ctre o plac colectoare aflat la ieirea din tub. Detectorul este plasat ntrun dispozitiv ce mai conine dou dinode de conversie, una pentru ioni pozitivi, aflat la un

Figura 2.26. Detector de ioni (pozitivi sau negativi) cu dinode de conversie i multiplicator de electroni potenial negativ, iar cealalt pentru ioni negativi, aflat la un potenial pozitiv. Un ion ce ajunge la dinoda de conversie produce o emisie de electroni, ce sunt apoi amplificai de ctre multiplicatorul de electroni. n ansamblu, un amplificator de electroni transform un fascicul ionic ntr-un fascicul electronic amplificat, printr-un efect tip cascad, cu un factor de conversie cuprins ntre 105 i 107. Factorul de conversie dintre curentul ionic i curentul electronic depinde de natura (mas, sarcin i structur) i vitezele ionilor detectai. Din acest motiv, acest tip de detectori este mai puin precis dect cilindrii Faraday; sensibilitatea lor superioar permite ns realizarea unor baleiaje rapide. d. detectoare cu microcanale (array detectors). Detectorul cu microcanale este format dintr-o plac strbtut de canale cilindrice paralele (figura 2.27).

a

b

Figura 2.27 Detector cu microcanale: a. seciune transversal; b. multiplicarea electronilor ntr-un canal Fiecare canal poate avea un diametru cuprins ntre 4 i 25 m, distanele dintre axele canalelor fiind ntre 6 i 32 m. Faa de intrare a ionilor este meninut la o tensiune negativ de circa 1 kV n raport cu cea de ieire. Multiplicarea electronilor se realizeaz prin acoperirea suprafeei fiecrui canal cu un material semiconductor ce emite electroni secundari. Evitarea accelerrii ionilor pozitivi spre faa de intrare a plcii se realizeaz prin practicarea de canale curbe n plac sau prin asocierea mai multor plci, astfel nct canalele asociate s formeze trasee n form de V sau Z. Efectele de avalan dintr-un canal pot s amplifice numrul de

36


electroni de pn la 108 ori. La ieirea din fiecare canal, un anod metalic primete fluxul de electroni secundari i semnal este dirijat spre un electrometru. Geometria plcii este analog celei a unei plci fotografice: ioni cu diferite valori m/e sosesc n zone diferite ale plcii i pot fi detectai simultan n cursul baleiajului cmpului magnetic al analizorului. e. detectoare multiplicatoare de fotoni. Acest tip de detector este format din dou dinode de conversie, un ecran fosforescent i un fotomultiplicator (figura 2. 28).

Figura 2.28. Multiplicator de fotoni Dispozitivul permite detectarea ionilor pozitivi sau negativi. n cazul detectrii ionilor pozitivi, ionii sunt accelerai spre dinoda aflat la un potenial negativ, n timp ce, n cazul decelrii ionilor negativi, ionii sunt accelerai spre dinoda pozitiv. Electronii secundari emii de aceste dinode sunt apoi accelerai spre ecranul fosforescent unde sunt convertii n fotoni. Fotonii rezultai sunt detectai de fotomultiplicator. Valoarea factorului de amplificare este de ordinul 104-105. 2.4. Sisteme de nregistrare Sistemul de nregistrare a unui spectrometru de mas trebuie s ndeplineasc dou cerine fundamentale: a. rapiditate. Rspunsul nregistratorului fa de semnalele primite de la sistemul de amplificare trebuie s fie extrem de rapid, astfel nct s poat fi posibil scanarea ctorva sute de picuri pe secund (o substan cu masa molecular 300 poate prezenta ntre 150 i 300 de picuri); b. sensibilitate. Aparatul trebuie s fie capabil s nregistreze intensiti ale unor picuri care difer ntre ele cu un factor mai mare de 10 3. Aceast problem a fost rezolvat prin utilizarea unei serii de 3-5 galvanometre cu oglind cu sensibiliti diferite (de obicei sensibilitile galvanometrelor sunt n raport 1:3:10:30:100). 2.5. Prelucrarea datelor


37

Semanlul analogic furnizat de ctre detector este transformat n semnal digital cu ajutorul unui ADC (analog-to-digital convertor) iar datele sunt stocate n memoria unui computer. Computerul asociat unui spectrometru de mas nregistreaz datele provenind de la aparat i le transform, dup caz, n valori de mas, intensiti ale picurilor, curent ionic total, potenial de accelerare etc. Datele spectrale sunt prezentate n diverse forme: list a fragmentelor ionice, spectru de mas normalizat etc. Computerul asociat spectrometrului de mas poate facilita, de asemenea, interpretarea spectrului ajutnd la calculul compoziiei posibile a unor ioni de mas dat, calculnd i comparnd abundenele izotopice pentru o formul dat cu datele experimentale sau comparnd spectrele obinute cu cele existente n biblioteca de spectre (exist numeroase biblioteci de spectre de mas, coninnd spectrele a peste 100.000 de compui).

38


CAPITOLUL 3 CUPLAJE NTRE TEHNICILE CROMATOGRAFICE I SPECTROMETRIA DE MAS Analiza amestecurilor complexe poate fi realizat prin cuplarea unui cromatograf de gaze sau de lichide cu un spectrometru de mas. Principalul avantaj l reprezint posibilitatea identificrii directe a substanelor separate. 3.1. Cuplajul gaz-cromatograf-spectrometru de mas (GC/MS) Realizarea cuplajului este facilitat de faptul c substana organic se afl deja n faz gazoas. n cazul utilizrii coloanelor cu umplutur, debitul de gaz purttor este de aproximativ 20 30 cm3/min, ceea ce afecteaz major valoarea presiunii din spectrometru (trebuie inut cont de faptul c un 1 cm3 de gaz aflat la presiune atmosferic ocup un volum de 107 cm3 la presiunea de 10-4 mm Hg; n consecin, pompa de vid trebuie s asigure un debit de evacuare de 150 l/s pentru a ndeprta 1 cm3 de gaz purttor). Pentru ndeprtarea celei mai mari pri din gazul purttor sunt utilizate mai multe tipuri de interfee, a cror funcionare se bazeaz pe viteza superioar de difuzie a eluentului (de obicei heliu) comparativ cu moleculele probei. O astfel de interfa GC/MS este prezentat n figura 3.1.

Figura 3.1. Interfa CG/MS tip jet. Efluentul provenit de la gaz-cromatograf este ejectat, printr-un orificiu foarte fin ntr-o camer vidat; din jetul astfel format are loc difuzia preferenial a moleculelor gazului purttor, mai uoare dect moleculele probei. Un al doilea orificiu, coaxial cu primul i aflat la o distan de circa 1 mm de acesta, face legtura cu spectrometrul de mas: aproximativ 90 % din heliu i 40 % din prob nu trec prin al doilea orificiu, astfel nct n aparat ajunge o prob considerabil mbogit. Coloanele cromatografice capilare pot fi racordate direct la spectrometrul de mas


39

deoarece debitele la ieire au valori de numai 1 5 cm3/min. 3.2. Cuplajul HPLC - spectrometru de mas (HPLC/MS) Cuplarea cromatografelor de lichide este mai dificil de realizat deoarece spectrometrele de mas analizeaz ioni aflai n faz gazoas iar cromatografia de lichide se utilizeaz, n special, pentru substanele nevolatile, ce nu pot fi analizate prin gazcromatografie. Problema este complicat suplimentar de necesitatea ndeprtrii eluentului nainte de intrarea n spectrometrul de mas (de exemplu, un debit de alimentare de 0,1 cm 3/min. soluie apoas implic eliminarea unui debit de 21.000 litri/s vapori pentru a se putea menine n aparat vidul necesar). Pentru rezolvarea acestor probleme se utilizeaz diverse dispozitive ce se bazeaz pe:a. evaporarea selectiv a eluentului nainte de intrarea n camera de ionizare a

spectrometrului (interfee de tip moving belt sau Particle Beam);b. reducerea debitului de alimentare a interfeei, n aa fel nct lichidul s poat fi

introdus direct; se utilizeaz interfee de tip Direct Liquid Introduction (DLI) sau Continuous Flow FAB (CF-FAB);c. introducerea ntregului debit de ieire din cromatograf; se utilizeaz interfee tip

thermospray (TSP), ionspray (ISP) sau Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI). Introducerea ntregii cantiti de eluat n spectrometrul de mas are drept consecin creterea sensibilitii de detecie. 3.2.1. Cuplaj cu interfa moving belt Eluatul provenit de la coloana cromatografic este depus pe o curea mobil (moving belt) fabricat dintr-un material poliamidic rezistent la temperaturi de circa 400 0C i inert din punct de vedere chimic (figura 3.2). Cureaua ptrunde ntr-o prim camer vidat, nclzit cu radiaii infraroii, unde are loc evaporarea celei mai mari pri din solventul provenit de la coloana cromatografic. Cureaua ptrunde apoi n surs unde este nclzit brusc pentru a avea loc evaporarea substanei investigate (exist variante constructive ce permit i alte tipuri de ionizare: DCI, FAB etc).

40


Figura 3.2. Schema unei interfee moving belt 3.2.3. Cuplaj cu interfa Particle Beam (PB) Interfaa Particle Beam (figura 3.3) este un dispozitiv care permite separarea rapid i eficace a solventului provenit de la coloana cromatografic.

Figura 3.3. Interfaa Particle Beam Eluatul este pompat printr-o capilar la un pulverizator din sticl unde, cu ajutorul unui curent de heliu, este transformat ntr-un nor de picturi fine. Aerosolul obinut traverseaz apoi o camer de desolvatare cu perei nclzii n care presiunea este cu puin mai mic dect presiunea atmosferic. n timpul traversrii picturile sufer o desolvatare parial, dnd natere la particule de substan parial solvatate. Camera de desolvatare este legat la un separator cu jet molecular dublu etajat. La nivelul primului etaj, amestecul de heliu, vapori de solvent i de particule sufer o expandare supersonic, formnd un jet de gaz de mare vitez. Deoarece diferena de mas ntre moleculele gazoase i particule este mare, particulele difuzeaz mai repede dinspre centrul jetului spre periferie. Particulele sunt izolate cu ajutorul unui separator, vaporii de solvent i heliul fiind pompai n exterior. Pentru o separare eficient, procesul se reia n cel de-al doilea etaj de pompare. n final, fluxul de particule, format dintr-un fascicul convergent, cu un diametru mai mic de 100 nm, este introdus n sursa spectrometrului de mas.


41

3.2.4. Cuplaj cu interfa Thermospray (TSP) Principiul interfeei tip Thermospray este prezentat n figura 3.4.

Figura 3.4. Interfaa tip Thermospray. a. intrare interfa; b. zon de nclzire; c. camer vidat; d. electrod; e. ieire; f. spectrometru Eluatul provenit de la cromatograf este nclzit brusc n zona b, iar picturile de lichid traverseaz n jet supersonic camera vidat c. Ionii prezeni n soluie sunt accelerai de o diferen de potenial. Ei se desorb de pe picturi, antrennd una sau mai multe molecule de solvent sau de substan dizolvat. Se evit astfel necesitatea de a evapora nainte de ionizare: ionii aflai n faz lichid trec direct n faz de vapori. Picturile i continu traseul cu vitez supersonic spre un orificiu de ieire, e, racordat la pompa de vid. Se evit astfel acumularea unor cantiti mari de vapori ai solventului. Ionii din faza de vapori sunt accelerai spre spectrometru, f, de ctre un electrod, d, alimentat la un potenial pozitiv. Pentru a se evita nghearea picturilor de lichid n timpul detentei n vid, lichidul injectat este nclzit. nclzirea este reglat cu ajutorul unui termocuplu ce determin temperatura jetului n vid.3.2.5.

Ionizarea chimic la presiune atmosferic (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI)

Tehnica APCI realizeaz ionizarea prin reacii ioni - molecule care au loc n faz gazoas, la presiune atmosferic. Principiul surse APCI este descris de figura 3.5. Eluatul cromatografic, cu un debit maxim de 2 cm3/min, este introdus direct ntr-un vaporizator pneumatic unde este transformat ntr-o cea fin cu ajutorul unui jet de aer sau de azot, introdus cu mare vitez. Picturile sunt astfel transportate n lungul unui tub de cuar nclzit, numit camer de desolvatare/vaporizare. Cldura transferat picturilor din aerosol va permite evaporarea fazei mobile i a probei curentul de gaz. Gazul cald (circa 120 oC) i substanele ce prsesc acest tub ajung n regiunea de reacie a sursei, care se afl la presiune atmosferic, i unde sunt ionizate chimic (prin transfer de proton sau de electron). n general, faza mobil evaporat joac rol de gaz ionizant, producnd ioni pseudo-moleculari ( [M+H] + sau [M-H] .

42


Figura 3.5. Sursa APCI Deoarece sursa lucreaz la presiune atmosferic, electroni necesari ionizrii primare nu se obin prin nclzirea unui filament, ci cu ajutorul descrcrilor Corona sau cu emitori de particule . Desolvatarea i evaporarea rapide minimalizeaz considerabil descompunerile termice. Ionii produi la presiune atmosferic ptrund n spectrometrul de mas printr-un mic orificiu. 3.2.6. Interfeele tip Electrospray (ESI) i Ionspray (ISP) Dup cum s-a precizat n capitolul 2, tehnica electrospray-ului (ce cunoate o dezvoltare deosebit n prezent), const n transformarea n spray a unui lichid, provenind dintr-un tub capilar, prin aplicarea unei diferene de potenial de circa 3-6 kV (figura 2.13, pagina 22). Cmpul electric intens contribuie la formarea de picturi fine, ncrcate electric. Mrimea medie a picturilor i ncrcarea lor electric depinde de natura solventului, de debitul fazei lichide i de diferena de potenial aplicat. Aceast interfa necesit utilizarea de coloane cromatografice capilare sau prevzute cu dispozitive de segmentare a debitului (n general nu sunt posibil de prelucrat debite mai mari de 5 l/min) Interfaa tip ionspray (figura 3.6.) accept debite mai mari i produce un spray mai stabil i mai puin dependent de natura fazei lichide.

Figura 3.6. Interfaa tip Ionspray


43

Tehnica ionspray-ului const n pomparea soluiei ce conine proba printr-un vaporizator pneumatic, meninut la tensiune nalt, n aa fel nct s se formeze o cea fin de picturi ncrcate electric, chiar n condiiile utilizrii unor debite ridicate. Deoarece ionii sunt expulzai din picturi printr-un proces ce nu implic un consum energetic semnificativ, fragmentrile sunt puine. ntregul proces are loc la temperatura ambiant. Dei interfaa accept debite de 200 l/min, sensibilitatea cea mai ridicat se realizeaz pentru debite de circa 50 l/min. 3.2.7. Moduri de achiziie a datelor cromatografice Indiferent de tehnica de ionizare, achiziionarea datelor se realizeaz prin trei metode principale: a. baleiaj (scan). Cu aceast metod se nregistreaz, repetat, spectre complete, pe un anume interval de mas. S presupunem c, la semi-nlime, limea picului cromatografic (exprimat n uniti de timp), este de 10 s. Dup cum rezult din figura alturat, pentru a fi siguri c unul din spectrele nregistrate este "din interiorul" picului cromatografic, este necesar s se nregistreze cel puin un spectru la fiecare 5 secunde. S presupunem c baleiajul acoper intervalul de mas dintre 50 i 550 (la rezoluie joas). n aceste condiii, timpul acordat fiecrei uniti de mas este de 0,01 secunde (500 uniti de mas n 5 s). Vor fi nregistrai toi ionii ce vor sosi la detector n acest interval de timp. Cu ct timpul va fi mai lung, cu att sensibilitatea va fi mai bun. Creterea sensibilitii se poate realiza fie prin micorarea intervalului de masa investigat, fie prin creterea timpului de baleiaj. b. detectarea ionilor selecionai (selected ion monitoring, SIM). Se aplic n cazurile n care scopul investigaiei este numai detectarea anumitor molecule ale cror caracteristici spectrale sunt cunoscute. Astfel, dac se alege detectarea unei substane date cu ajutorul a trei fragmente caracteristice, analizorul poate fi programat s treac rapid de la o mas la alt. Creterea de sensibilitate poate fi foarte mare. c. detectarea reaciilor selecionate (selected reaction monitoring, SRM). Permite obinerea unei creteri a sensibilitii i selectivitii n raport cu SIM. Detectarea reaciilor selecionate, bazat pe reaciile de descompunere ale ionilor caracteristici ai substanei de analizat, necesit utilizarea de spectrometre de mas n tandem (v. capitolul 4). Spectrometrul este reglat pentru detectarea unor anumii ioni, rezultai dintr-o reacie de descompunere + caracteristic: de exemplu, primul spectrometru selecioneaz ionul printe m p , caracteristic substanei investigate, n timp ce, cel de-al doilea aparat selecioneaz ionul fragment f f+ , + + rezultat din reacia caracteristic de descompunere: m p f f + m n . Creterea selectivitii este determinat de faptul c reacia de fragmentare implic apariia de ioni foarte caracteristici cu mase diferite.

44

Spectrometria de mas n tandem (MS&MS)

CAPITOLUL 4 SPECTROMETRIA DE MAS N TANDEM (MS/MS) Tehnica MS/MS se refer la o metod n care un prim analizor este utilizat pentru izolarea unui anumit ion, mp+, care va suferi o fragmentare ce va produce ioni i molecule neutre:+ + m p md + mn

Aceste fragmente vor fi analizate de cel de-al doilea spectrometru. Teoretic, nimic nu mpiedic multiplicarea analizorilor folosii (n aceste condiii notaiile folosite sunt: MS/MS/MS.. sau MSn). ns, deoarece semnalul descrete dup fiecare etap din cauza creterii lungimii traseului urmat de ioni, din motive practice, n prezent se pot utiliza maximum 3 sau 4 aparate montate n serie. Exist trei moduri principale de realizare a tehnicilor MS/MS: 1. baleiajul fragmentelor ionice (daughter scan) - const n alegerea unui ion precursor (ion printe) i determinarea tuturor ionilor produi; 2. baleiajul ionilor precursori (parent scan) - const n alegerea unui fragment ionic i determinarea tuturor ionilor precursori; 3. baleiajul fragmentelor neutre scindate (neutral loss scan) - const n alegerea unui fragment neutru i detectarea tuturor fragmentrilor ce provoac apariia lui. Aplicaiile tehnicilor MS/MS sunt multiple i includ studiul mecanismelor de fragmentare, observarea reaciilor ioni-molecule, analiza la sensibiliti i selectiviti nalte, determinarea compoziiilor elementale etc. Un exemplu asupra modului n care spectrometria de mas n tandem poate elucida modurile de fragmentare ale unei molecule este prezentat n figura 4.1. Spectrul din figura 4.1a evideniaz prezena unui fragment intens la m/e 107, ce corespunde ionului M-43. Acesta poate s apar fie prin pierderea unui radical metil, urmat de eliminarea de CO, fie prin pierderea unui fragment C3H7, n una sau mai multe etape. Prin selectarea ionului m/e 135 ca ion precursor (figura 4.1b), se constat c acesta produce fragmentul m/e 107. Rezult c, n prima etap, are loc scindarea unei grupe metil, cu formarea ionului m/e 135. Rmne de stabilit dac pierderea ulterioar a 28 u.a.m. este

Spectrometria de mas n tandem (MS&MS)

45

determinat de eliminarea unei molecule de CO sau de eten. Pentru a preciza acest lucru, a fost selecionat ionul m/e 137, ce difer de ionul m/e 135 prin prezena 18O. n spectrul din figura 4.1c se observ deplasarea corespunztoare a semnalului cu dou uniti; rezult c 18O este conservat de ctre fragment. Semnalele de la m/e 107 i 108 reprezint contribuii ale 13C. n acest mod s-a demonstrat c ionul molecular pierde, mai nti, un radical metil, apoi se rearanjeaz i pierde o molecul de eten.

a) spectrul EI al p-tbutil-fenolului;

b) fragmentrile ionului precursor de la m/e 135;

c) fragmentrile ionului precursor de la m/e 137.

Figura 4.1. Utilizarea tehnicii MS/MS pentru elucidarea fragmentrilor p-t-butilfenolului

46

Izotopii elementelor chimice aranjai n ordine alfabetic

CAPITOLUL 5 SPECTRUL DE MAS 5.1. Introducere Informaiile eseniale furnizate de ctre spectrometrul de mas se refer la masele i abundenele relative ale ionilor rezultai din substana investigat. De obicei, aceste informaii sunt sumarizate n dou moduri: 1. forma grafic. Semnalele ionilor sunt prezentate sub form de linii verticale aflate la valorile m/e corespunztoare i a cror nlime este proporional cu intensitile (abundenele) ionilor. Din motive practice, aceste abundene sunt recalculate funcie de semnalul cel mai intens (numit i pic de baz, base peak), cruia i se atribuie valoarea de 100 %. Operaia se numete normalizarea spectrului; abundenele nregistrate ale celorlali ioni se amplific cu factorul:f = 10 0 au dn b n e ta p u i d b za ic lu e a

Dei reprezentarea grafic este deosebit de util pentru realizarea de comparaii rapide cu alte spectre, ea prezint dezavantajul imposibilitii de a prezenta, la aceeai scar, abundenele exacte ale ionilor cu intensitate mic (i n special cele ale picurilor izotopice); 2. forma tabelar. Prezint sub form de tabel lista ionilor i a abundenelor lor relative fa de ionul de baz, considerat ca avnd abundena de 100 %. Din considerente practice, i aceast list poate s exclud ionii cu abundene extrem de sczute. n cazul nregistrrii spectrului pe un aparat cu rezoluie joas este util s se normalizeze abundenele picurilor izotopice din zona ionului molecular funcie de acesta din urm. n figura 5.1. este prezentat, n cele dou variante, spectrul de mas al etil-dimetil-aminei. Utilizarea computerelor pentru stocarea i prelucrarea datelor furnizate de ctre spectrometrul de mas permite actualmente selectarea i analiza complex a informaiilor, funcie de scopurile urmrite. Ca i n cazul celorlalte tipuri de investigaii spectrale, la analiza i, mai ales, la compararea spectrelor de mas este necesar precizarea condiiilor de nregistrare a spectrului.

Izotopii elementelor chimice aranjai n ordine alfabetic

47

m/ e 15 27 28 29 30 31

% 1,3 10, 0 11, 0 8,1 13, 0 0,2 7

m/e 39 40 41 42 43 44

% 1,2 2,1 4,5 28, 0 7,2 25, 0

m/e 45 56 57 58 59 71

a % 1,8 7,3 5,0 10 0 3,9 1,0

m/ e 72 73 74

% 17,0 23,0 1,1

M 100

M+1 4,78

b Figura 5.1. Spectrul de mas al etildimetilaminei: a. reprezentare grafic; b. reprezentare tabelar (n colul din dreapta jos este prezentat normalizarea picului izotopic al ionului molecular) 5.2. Informaii analitice Deducerea structurii compuilor investigai de ctre spectrometria de mas se realizeaz prin parcurgerea mai multor etape. ntr-o prim etap, se ncearc identificarea, manual sau computerizat, a spectrului nregistrat printre spectrele aflate n diverse colecii. Trebuie ns s se in cont de faptul c, de multe ori, izomerii ce fac parte din aceeai clas de compui prezint spectre similare; de asemenea, spectre asemntoare pot s aparin unor substane foarte diferite. Dei poate fi extrem de util, simpla comparare nu poate fi o metod infailibil de atribuire structural. n prezent exist trei mari colecii de spectre de mas: 1. colecia NBS/EPA/NIH (Mass spectral date base, Heller, S.R. and Milne, G.W.A., National Bureau of Standards, Washinton, 1978, 1983). Colecia conine peste 45.000 de spectre, prezentate n form grafic i clasificate n fu

Spectrometria de Masa

Documents

Transcript of Spectrometria de Masa