Spectro Foto Me Trie

18
UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie Spectrofotometrie

Transcript of Spectro Foto Me Trie

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Spectrofotometrie

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Ce este un spectru? Definitie

    Definitie generala = toate valorile pe care le poate lua o marime fizica

    Spectre continue / discrete Spectru continuu marimea fizica

    poate lua orice valoare, intr-un interval

    Spectru discret marimea fizica poate lua doar anumite valori discrete in interiorul unui interval

    Spectru continuu

    Spectru discret

    valori

    valori

    valori

    valori

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Spectrul EM

    Spectrul electromagnetic

    c=T=

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Spectrul EM

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Spectrofotometrie.Spectre de absorbtie si de emisie

    Spectrofotometria = masuratoare cantitativa a spectrelor de absorbtie / emisie ale unei substante

    Absorbtia radiatiei EM: Apare la orice substanta

    Este maxima la o anume lungime de unda (specifica substantei analizate)

    Emisia radiatiei EM: Emisia anumitor lungimi de unda, in functie de molecula, ca rezultat al excitarii

    moleculei (transfer de energie)

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Spectrofotometrie.Spectre de absorbtie si de emisie

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Spectre de absorbtie si emisie Energia radiatiei incidente poate fi absorbita la:

    Nivel atomic electronii sar pe niveluri energetice superioare; energia absorbita corespunde diferentei de energie intre nivelul fundamental si nivelul excitat, de aceea spectrul de absorbtie va fi discret

    Nivel molecular energia va fi utilizata pentru he energy will be used to: Cresterea vitezei de agitatie moleculara (energie cinetica) efect termic, spectru de

    absorbtie continuu

    Cresterea energiei cinetice de rotatie a moleculelor

    Cresterea energiei cinetice de vibratie a moleculelor

    Moleculele care au absorbit energie intra intr-o stare excitata, cu timp de viata scurt; revenirea la starea fundamentala se face prin eliberare de energie:

    Emisie radiativa: Fotoluminescenta (lungimea de unda emisa va fi intotdeauna mai mare ca

    cea absorbita energia emisa ESTE INTOTDEAUNA sa fie mai mica decat energia absorbita!)

    Emisie neradiativa: Emisie de caldura Declansarea unor reactii fotochimice

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Spectre de absorbtie. Cromofori

    Cromoforii sunt anumite grupari din structura unei molecule, responsabile pentru culoarea ei

    Fiecare cromofor va prezenta un maxim de absorbtie specific

    Cromofor Varf de absorbtie

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Spectre de absorbtie. Cromofori

    Cand intr-o molecula exista mai multi cromofori, aceastia isi influenteaza reciproc maximele de absorbtie:

    Efect batocromic (max ) / efect hipsocromic (max ) Efect hipercromic (absorbtie crescuta) / efect hipocromic

    (absorbtie scazuta)

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Aplicatiile spectrofotometriei

    Analiza calitativa Din spectrul de absorbtie pot fi deduse informatii

    structurale, pe baza varfurilor de absorptie intalnite

    Analiza cantitativa Amplitudinea absorbtiei depinde de concentratia

    substantei Determinari de concentratii ADN/ARN Determinarea densitatii bateriilor intr-o cultura Screening toxicologic etc

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Legea Beer-Lambert Exprima legatura intre intensitatea luminii care

    traverseaza o solutie si concentratia solutiei respective

    I0 = intensitatea luminii incidenteI = intensitatea luminii emergenteC = concentratia solutieid = grosimea cuvetei cu solutie = coeficient de absorbtie

    I= I 0 10Cd

    Coeficientul de absorbtie depinde de lungimea de unda a luminii

    N.B. - pentru gaze, legea se scrie de obicei in forma exponentiala

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Transmisia si extinctia

    In spectrofotometrie se folosesc uzual doi parametri pentru a cuantifica absorbtia:

    Transmisia (T) Extinctia (E)

    T= II 0= 10Cd

    T[0, 1]

    E= log 1T =log T

    E=C d

    E0,

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Transmisia si extinctia

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Masurarea spectrului de absorbtie

    Masurarea extinctiei pentru un interval de lungimi de unda

    Trasarea curbei E = f()

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Masurarea spectrului de absorbtie

    Spectrul de absorbtie este influentat de: Concentratie varfuri mai inalte la concentratii mai mari Temperatura

    pH influenteaza echilibrul intre formele protonate / neprotonate ale gruparilor moleculare, forme care pot avea varfuri de absorbtie diferite

    Formele dimerice / trimerice ale moleculelor pot avea varfuri de absorbtie suplimentare

    Echilibrul intre formele mono / dimerice etc este influentat de:

    Temperatura temperaturile crescute favorizeaza formele monomerice

    Concentratia concentratiile mai mari cresc procentul de forme dimerice

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Activitate experimentala Masurarea spectrului de absorbtie al unor solutii de

    colorant (acridin oranj) cu concentratiile de: 2, 4, 8, si o concentratie necunoscuta x Pentru fiecare solutie, masuram extinctia intre 360 nm si 600

    nm, cu pasi de 20 nm; datele vor fi trecute intr-un tabel ca cel de mai jos;

    Pe baza datelor din tabel, desenam curbele de absorbtie pentru cele patru solutii

    2 4 8 x

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Activitate experimentala

    Calculam concentratia x : Alegem setul de valori ale E care corespund varfului de

    absorbtie (sunt suficiente valoarea pentru x si pentru una din solutiile cunoscute)

    Ex= x dEcunoscuta=Ccunoscutad

    ExEcunoscuta

    = x dCcunoscutad

    x=ExCcunoscutaEcunoscuta

  • UMF Carol Davila Catedra de Biofizica Spectrofotometrie

    Activitate experimentalaExemplu (Atentie! Nu corespunde cu datele ce se vor obtine la LP!) Obtinem 3 varfuri de absorbtie, la 415 nm, 500 nm si 570 nm, dupa

    cum se vede in figura

    Alegem valorile corespunzatoare lungimii de unda de 570 nm (cel mai mare varf de absorbtie)

    2 4 8 x570 0.75 1.5 3 1.2

    Concentratia solutiei necunoscute va fi ():

    x=E x 8E8

    ; x= 1.283x= 3.2

    Slide 1Slide 2Slide 3Slide 4Slide 5Slide 6Slide 7Slide 8Slide 9Slide 10Slide 11Slide 12Slide 13Slide 14Slide 15Slide 16Slide 17Slide 18