Sonde Fluorescente

Sonda Marcata FluorescentNedelcu Alina Larissa Alexandra Seria C , grupa 15 Sonda ADN este o secventa de ADN marcata fluorescent sau radioactiv ce este folosita pentru identificarea unei gene. Poate fi vizualizata cu ajutorul microscopului cu florescenta , ce absoarbe lumina cu o anumita lungime de unda si emite lumina cu o lungime de unda mai mare decat cea absorbita.Daca un astfel de component este iluminat cu o lumina pe care o absoarbe , apoi vizualizat utilizand un filtru ce permite doar trecerea luminii emise, acesta lumina va starlucii pe un camp intunecat , astfel ca si o cantitate infima este detectata.

Tehnica PCRReactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN si care consta in generarea rapida a unor copii multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode.Produsul PCR care reprezinta o copie a ADN/ARN tinta original este denumit amplicon. Aceasta metoda permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor concentratii foarte scazute ale secventei tinta.Astfel PCR cantitativ utilizeaz ageni chimici fluorescenti ce pot fi mpriti n dou tipuri: sonde fluorescente i colorani fluorescenti.Reactia PCR se desfasoara in 3 etape:1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94C, ADN-ul tinta este separat (denaturat) in 2 catene;2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 55-70C, primerii se vor atasa complementar la capetele 3 ale celor 2 catene;3. Elongatia: la temperatura de 72C, ADN polimeraza termostabila in prezenta Mn2+ si a excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si deoxiuridina) va extinde primerii atasati in lungul matritei tinta si va produce un amplicon ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un numar stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ADN.

La randul sau, procesul global de amplificare desfasurat de-a lungul unui numar definit de cicluri poate fi divizat in 3 faze:- Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN (se admite o eficienta de 100% a reactiei);- Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt consumate, se produce o incetinire a reactiei iar produsii PCR incep sa se degradeze;- Platou (end-point): reactia este stopata, nu se mai formeaza alti produsi de amplificare, iar daca faza se prelungeste mult produsii PCR vor suferi o degradare importanta.

Metodele PCR traditionale (conventionale) au la baza o detectie a produsilor PCR in faza de platou a procesului (detectie end-point). In ultimii ani, tehnologia PCR a fost revolutionata prin dezvoltarea metodelor de detectie in faza exponentiala (detectie in timp real: real-time PCR).Tehnologia real-time PCR prezinta numeroase avantaje fata de cea conventionala: - acuratete mai mare a rezultatelor obtinute (efectuarea detectiei se realizeaza in faza de crestere exponentiala a amplificarii, comparativ cu tehnica PCR conventional, unde detectia are loc in faza de platou, dupa ce reactia a fost stopata iar produsii au inceput sa se degradeze)- domeniu de linearitate mult extins (sunt necesare mai putine dilutii ale probelor);- limita inferioara de detectie mult imbunatatita (se pot detecta cantitati mai mici ale ADN-ului tinta, avantaj esential, spre exemplu, in evaluarea raspunsului virusologic sustinut la pacientii cu hepatita cronica cu virus C.

Cele 2 metode PCR se aplica la efectuarea urmatoarelor teste:- Real-time PCR: determinarea cantitativa a viremiei la pacientii infectati cu virusurile hepatice B sau C; analiza mutatiei factorului V Leiden si a mutatei protrombinei;- PCR conventional: detectia calitativa a tipurilor oncogene ale virusului papilomatozei umane (HPV).

Determinarea cantitativa a viremiei are la baza 2 procese majore:- pregatirea probei pentru a izola ADN-VHB;- amplificarea PCR a ADN-ului tinta cu detectia simultana a sondei oligonucleotidice dublu marcate clivate specifice tintei.Cuantificarea viremiei se realizeaza cu ajutorul unei secvente ADN neinfectioase denumita Quantitation Standard (QS). ADN QS cu un numar cunoscut de copii este adaugat in fiecare proba si parcurge aceleasi etape de preparare a probei, amplificare PCR si detectie, ca si secventa tinta. QS contine secvente VHB cu zone identice de legare a primerilor ca si ADN-ul tinta, dar cu o zona unica de legare a sondei de detectie care permite diferentierea ampliconului QS de ampliconul tintei. Analizorul calculeaza concentratia ADN-VHB prin comparararea semnalului tintei cu semnalul QS din fiecare proba si controale.In cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se face in prezenta unui sistem raportor care emite fluorescenta. Detectia se realizeaza cu ajutorul sondelor de tip 5 nucleaza-sonde TaqMan, dublu marcate: la un capat cu o substanta fluorofora si la celalat capat cu o molecula blocanta . Cat timp sonda este intacta, fluorescenta sistemului R va fi inhibata de molecula Q. In cazul in care amplificarea este eficienta, moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan; in cursul etapei de elongatie, ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin activitatea sa enzimatica de 5 endonucleaza si va elibera astfel fluoroforul. Energia emisa de fluorofor in urma excitarii in UV va fi inregistrata la sfarsitul fiecarui ciclu de amplificare, fiind proportionala cu cantitatea de ADN tinta prezenta in tub pana in momentul respectiv. Sondele HBV si HBV QS sunt marcate cu fluorofori R diferiti, permitand inregistrarea independenta a emisiilor lor. Hibrizitatea fluorescenta

Hibridizarea fluorescenta in situ (FISH) este o tehnic de citogenetic molecular utilizat n scopul identificrii anomaliilor cromozomiale, numerice i structurale. Principiul acestei metode const n ataarea la secvena-int a unei sonde de ADN monocatenar marcat fluorescent, pe baza complementaritii, de o secven-int a unui cromozom. Hibridizarea sondei cu ADN-ul celular este vizualizat la microscopul cu fluorescen echipat cu filtre de excitaie i emisie, ceea ce permite citirea semnalelor specifice zonei-int. Se numr i se analizeaz semnalele prezente n o sut de celule (de ex., trei semnale fluorescente specifice pentru cromozomul 21 indic sindromul Down).

FISH interfazic prezenta a trei semnale roii indica trisomia 21 (Down)FISH metafazic Prader WilliMai multe sindroame dismorfice (sindromul Williams, Prader Willi, Angelman, Di George) produse de microdeleii sau microduplicaii, suspectate clinic, imposibil de observat prin tehnicile citogenetice convenionale, pot fi evideniate prin FISH metafazic. ntruct aceast metod presupune ca prim etap de lucru obinerea unor culturi celulare (limfocite din snge periferic sau amniocite recoltate prin amniocentez n sptmnile 15-17 de sarcin), rezultatul investigaiei este obinut n dou sptmni.FISH-ul interfazic permite punerea n eviden a anomaliilor numerice, detecia sexului genetic ntr-un timp scurt (48-72 h). Se realizeaz pe nuclei interfazici fr s fie nevoie de efectuarea de culturi celulare. Se folosesc sonde de ADN corespunztoare regiunilor centromerice ale cromozomilor 18, X, Y (CEP18, CEPX, CEPY), respectiv sonde locus specifice pentru cromozomii 13 i 21 (LSI13, LSI21). Metoda este mai puin informativ n cazul contaminrii cu celule materne (comparativ cu alte tehnici).Analiza FISH este o metod specific, performant, dar laborioas, care necesit celule intacte; nu se substituie celorlalte metode de analiz cromozomial i are indicaii foarte precise. FISH-ul interfazic este indicat a fi folosit ca test de screening rapid atunci cnd exist semne de alert ecografic sau biochimic (dublu test, triplu test), iar ulterior se recomand o evaluare citogenetic complet.

Intrebari