UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE CRAIOVA

FACULTATEA DE FARMACIE

REZUMAT

TEZĂ DOCTORAT

SINTEZA, CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMICĂ ŞI

TESTAREA FARMACOLOGICĂ A UNOR NOI

DERIVAŢI COLESTERICIConducător ştiinţific

Prof. Univ. Dr. Stelian Radu

DoctorandFarm. Elena Dumitru

Craiova2012

2

Cuprins

INTRODUCERE .................................................................Error! Bookmark not defined.CAPITOLUL I.....................................................................Error! Bookmark not defined.STEREOIZOMERIA STEROLILOR...................................Error! Bookmark not defined.

1.1. Generalităţi ................................................................Error! Bookmark not defined.1.2. Configuraţia atomului C-3..........................................Error! Bookmark not defined.1.3. Efecte de conformaţie la steroide................................Error! Bookmark not defined.1.4. Stereochimia sterolilor şi acizilor biliari .....................Error! Bookmark not defined.1.5. Stereochimia unor cetone steroidice ...........................Error! Bookmark not defined.

1.5.1. Stereochimia hidrocianării cetonelor steroidice a, b-nesaturate Error! Bookmark notdefined.1.5.2. Hidrocianarea dienonelor steroidice ............................Error! Bookmark not defined.

CAPITOLUL II ..................................................................Error! Bookmark not defined.DERIVAŢI STEROLICI......................................................Error! Bookmark not defined.

2.1. Esteri sterolici ............................................................Error! Bookmark not defined.2.2. Carbonaţi şi tiocarbonaţi sterolici ...............................Error! Bookmark not defined.2.3. Tioesteri şi tioeteri sterolici ........................................Error! Bookmark not defined.

2.3.1. S-colesterilalcantionati................................................Error! Bookmark not defined.2.3.2. S-colesteril tioacetatul (tioester al acidului acetic) .......Error! Bookmark not defined.2.3.3. Tiocolesteril b- metil valeriana (tioester al acidului b -metil valerianic)Error! Bookmarknot defined.2.3.4. Tioesteri ai acizilor ciclohexil carboxilici ....................Error! Bookmark not defined.2.3.5. S-colesteril-tiobenzoaţi p-substituiţi ............................Error! Bookmark not defined.2.3.6. Tioeteri .......................................................................Error! Bookmark not defined.

2.4. Carbamaţi sterolici .....................................................Error! Bookmark not defined.2.4.1. Colesteril N-fenilcarbamaţi .........................................Error! Bookmark not defined.2.4.2. Colesteril N-alchilcarbamaţi........................................Error! Bookmark not defined.2.4.3. Colesteril p-fenoxifenilcarbamaţi ................................Error! Bookmark not defined.2.4.4. Colesteril-p-tiofenoxifenilcarbamaţi............................Error! Bookmark not defined.2.4.5. Colesterilcarbamaţi heterociclici .................................Error! Bookmark not defined.2.4.6. Colesterilcarbamaţi poliaminici...................................Error! Bookmark not defined.2.4.7. Aspecte ale chimiei supramoleculare la carbamaţii steroliciError! Bookmark not defined.2.4.8. Interacţia amfotericinei B cu carbamaţii sterolici........Error! Bookmark not defined.2.4.8.1 Generalităţi ...............................................................Error! Bookmark not defined.2.4.8.2. Interacţia amfotericinei B cu stigmasteriltrifluorometilfenil carbamatulError! Bookmarknot defined.2.4.8.3. Interacţia amfotericinei B cu colesteriltrifluorometilfenil carbamatul Colesteril-trifluorometilfenil-carbamatul (Ch-CF3)................................Error! Bookmark not defined.

CONTRIBUŢII PERSONALE...........................................Error! Bookmark not defined.CAPITOLUL III ..................................................................Error! Bookmark not defined.SINTEZA ŞI CARACTERIZAREA UNOR NOI DERIVAŢI STEROLICIError! Bookmark notdefined.

3.1. Aparatura şi metode folosite.......................................Error! Bookmark not defined.3.2. Abrevieri. Materii prime ............................................Error! Bookmark not defined.3.3. Materii prime sintetizate.............................................Error! Bookmark not defined.3.4. Noi colesterilbutiraţi ..................................................Error! Bookmark not defined.

3

3.4.1. Generalităţi .............................................................Error! Bookmark not defined.3.4.2. Sinteza unor noi colesterilbutiraţi ...........................Error! Bookmark not defined.

3.4.2.2. Caracterizarea spectrală a colesterilbutiraţilor sintetizaţiError! Bookmark not defined.3.4.4. Caracteristici termice ..............................................Error! Bookmark not defined.3.4.5. Discuţii ...................................................................Error! Bookmark not defined.3.5. Noi carbonaţi sterolici ...............................................Error! Bookmark not defined.3.5.1. Generalităţi ............................................................Error! Bookmark not defined.3.5.2. Sinteza şi caracterizarea unor noi carbonaţi sterolici cu structură azometinică la C3-sterolic.........................................................................................Error! Bookmark not defined.

3.5.2.1. Sinteza noilor compuşi cu structură azometinică ......Error! Bookmark not defined.3.5.2.2. Caracteristici spectrale .............................................Error! Bookmark not defined.3.5.2.3. Complecşi cu transfer de sarcină ai carbonaţilor 17 şi 18 cu acidul picric .......Error!Bookmark not defined.

3.5.3. Sinteza unor carbonaţi sterolici cu grupe azo...........Error! Bookmark not defined.3.5.3.1. Sinteza şi caracterizarea fizico-chimică ..................Error! Bookmark not defined.3.5.3.2. Caracterizări spectrale .............................................Error! Bookmark not defined.

3.5.4 Discuţii ....................................................................Error! Bookmark not defined.3.6. Sinteza şi caracterizarea unor carbamaţi colesterici ....Error! Bookmark not defined.3.6.1. Generalităţi .............................................................Error! Bookmark not defined.3.6.2. Siteza şi caracterizarea fizico-chimică a noilor carbamaţi colestericiError! Bookmark notdefined.3.6.3. Caracteristici spectrale ............................................Error! Bookmark not defined.

3.6.3.1. Spectre IR................................................................Error! Bookmark not defined.3.6.3.2. Spectre RMN ...........................................................Error! Bookmark not defined.

3.6.4 Discuţii ....................................................................Error! Bookmark not defined.CAPITOLUL IV..................................................................Error! Bookmark not defined.STUDIUL ACTIVITĂŢII ANTIBACTERIENE..................Error! Bookmark not defined.

4.1. Generalităţi ................................................................Error! Bookmark not defined.4.2. Material şi metode folosite în cercetările microbiologiceError! Bookmark not defined.4.3. Activitatea antibacteriană a colesterilbutiraţilor 1 – 5 .Error! Bookmark not defined.4.4. Activitatea antibacteriană a carbonaţilor 17 – 18 ........Error! Bookmark not defined.4.4. Activitatea antibacteriană a carbonaţilor 23 – 24 ........Error! Bookmark not defined.4.5. Activitatea antibacteriană a carbamaţilor 35 – 38 .......Error! Bookmark not defined.4.6. Discuţii ......................................................................Error! Bookmark not defined.

CAPITOLUL V ...................................................................Error! Bookmark not defined.TESTAREA ACŢIUNII NOILOR DERIVAŢI COLESTERICI ASUPRA CELULEI VEGETALE............................................................................................Error! Bookmark not defined.

5.1. Generalităţi ................................................................Error! Bookmark not defined.5.2. Materiale şi metode folosite în testările fitobiologice..Error! Bookmark not defined.5.3. Testări fitobiologice ...................................................Error! Bookmark not defined.5.4. Analiza microscopică .................................................Error! Bookmark not defined.5.5. Discuţii ......................................................................Error! Bookmark not defined.

CAPITOLUL VI..................................................................Error! Bookmark not defined.CONCLUZII GENERALE ..................................................Error! Bookmark not defined.BIBLIOGRAFIE..................................................................Error! Bookmark not defined.Anexe ..................................................................................Error! Bookmark not defined.

4

INTRODUCERE

Lucrarea se axează pe sinteza şi caracterizarea unor esteri sterolici, cu

proprietăţi deosebite. S-a observat la mulţi derivaţi sterolici, în special esteri colesterici

că prezintă proprietăţi de cristal lichid (C.L.). Existenţa cristalelor lichide (CL) este

cunoscută de mai bine de un secol, descoperirea lor fiind atribuită lui Reinitzer care a

observat că benzoatul de colesteril se topeşte într-un interval de temperatură de 114,5°-

178,5°, trecând printr-o fază intermediară, cu aspect lăptos. O serie de

colesterilcarbamaţi colesterici cu structuri azo la C-3 sterolic, a fost sintetizată şi

studiată, stabilindu-se că aceşti compuşi sunt mezogeni cu aplicaţii în vopseluri.

Amestecurile unor astfel de colesterilcarbamaţi cu mezogeni cu temperaturi de tranziţie

scăzute prezintă culori foarte intense, fără a afecta semnificativ intervalul de tranziţie.

Mezogenii coloraţi îmbunătăţesc contrastul de culori din dispozitivele electro-optice,

obţinându-se o gamă decorativă de culori de la portocaliu la roşu, fără a afecta

proprietăţile de cristal lichid.

De la descoperirea cristalelor lichide şi până în prezent, au fost sintetizate

numeroase tipuri de cristale lichide, s-au făcut corelaţii între proprietăţile structurale şi

cele fizice şi au fost examinate sistematic texturile prezentate de diferitele tipuri de

mezofaze .

Aplicaţiile cristalelor lichide termotrope sunt, în prezent, extrem de numeroase

şi cuprind arii largi de interes: în spectroscopia în vizibil sau de fluorescenţă, în

spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară, în rezonanţa paramagnetică electronică,

împrăştiere de neutroni, în medicină etc.

Totuşi cea mai largă utilizare a cristalelor lichide, începând cu anul 1970 şi până

în prezent, este ca materiale pentru dispozitive de afişaj. S-au dezvoltat numeroase

5

tehnici de realizare a display-urilor cu cristale lichide, bazate pe efecte produse de

câmpurile externe asupra diferitelor tipuri de geometrii moleculare: efectul de

împrăştiere dinamică a luminii, efectul “guest-host” , tehnologia TN şi STN-LCD etc.

O serie de esteri colesterici cu azot şi sulf la C-3 sterolic prezintă un mare interes

în medicină, fiind utilizaţi la tratarea unor tumori canceroase, a unor afecţiuni ale pielii,

mulţi asemenea compuşi prezentând o puternică activitate antimicrobiană.

Lucrarea a fost structurată în două părţi. Prima parte prezintă o sinteză a datelor

de literatură referitoare la metode de sinteză a derivaţilor sterolici şi efectele potenţiale

farmacologice ale acestora. În partea experimentală a lucrării au fost sintetizaţi şi

caracterizaţi treisprezece derivaţi colesterici (5 colesterilbutiraţi, 4 carbonaţi colesterici

şi 4 carbamaţi colesterici) ce prezintă reflexie selectivă în solvenţii din care au fost

recristalizaţi, anticipând astfel o comportare de cristal lichid. Prin sintezele carbonaţilor

sterolici cu structură azometinică la C-3 sterolic s-a încercat obţinerea unor dimezogeni

sterolici, compuşi care au în structura lor două unităţi: carbonat steroidic şi bază Schiff,

ambele unităţi fiind tipuri de cristale lichide. A fost de asemenea evaluată activitatea

biologică a acestora şi toxicitatea acestora asupra celulei vegetale.

CAPITOLUL 1

STEREOIZOMERIA STEROLILOR

Inelele ciclohexanice au conformaţia scaun atât în trans-decalină cât şi în cis-

decalină.

În consecinţă, sistemele ciclice ale colestanului şi coprostanului corespund celor

reprezentate în formulele perspectivice de mai jos.

6

Formule conformaţonale ale sistemului ciclic din seria colestanului şi coprostanului.

În toate steroidele, inelele B şi C, C şi D sunt unite prin legături trans.

În formulele de mai sus, unii substituienţi sau chiar atomii de hidrogen sunt

fixaţi pe nucleu prin legături ecuatoriale (e), iar alţii prin legături axiale (a). Cele două

grupe metil angulare, de la C-10 şi C-13 sunt legate axial, iar catena laterală de la C-17

este fixată pe nucleu printr-o legătură ecuatorială. Grupa OH de la C-3 este legată

ecuatorial în colestanol (configuraţie b) şi axial în coprostanol (de asemenea

configuraţie b). În epimerii acestor alcooli, grupele OH au orientarea inversă.

Substituenţii legaţi ecuatorial de inelul ciclohexanic se comportă diferit de cei

legaţi axial (O. Hassel, 1943). Astfel, o examinare a steroidelor din acest punct de

7

vedere a permis interpretarea logică a mai multor reacţii sau deosebiri de comportare,

neexplicabile prin teoriile vechi.

Analiza conformaţională aplicată la steroide de Barton, 1950 şi Shoppe, 1952, a

condus la următoarele constatări:

- la inelul ciclohexanic în forma scaun, conformaţia cea mai stabilă este aceea în

care substituientul cel mai voluminos ocupă o poziţie ecuatorială, uşor de explicat, de

altfel, întrucât un substituent în poziţie axială se află la distanţe mai mici decât cele

normale între atomi nelegaţi (adică decât razele van der Waals), de atomii de hidrogen

sau de substituenţii din poziţiile 3 si 5 faţă de el (care au de asemenea orientare axială).

Din cauza aceasta, se produce la derivaţii monociclici ai ciclohexanlui, o răsucire a

legăturilor C-C ale ciclului, astfel încât sbstituentul cel mai voluminos să fie adus în

poziţie ecuatorială. Sistemele bi- si policiclice (printre care se numară şi sterolii) fiind

rigide, o asemenea rearanjare a conformaţiei nu este posibilă;

- substituenţii în poziţii ecuatoriale, fiind mai puţin împiedicaţi steric, sunt mai

accesibili atacului diferiţilor reactanţi decît atunci când sunt situaţi în poziţii axiale.

Astfel, un hidroxil în poziţie ecuatorială este acilat mai uşor decât un hidroxil orientat

axial. De asemenea, esterul unui hidroxil ecuatorial se hidrolizează cu viteza mai mare

decât esterul unui hidroxil axial;

CAPITOLUL 2

DERIVAŢI STEROLICI

Mulţi derivaţi sterolici, în special esteri colesterici prezintă proprietăţi de cristal

lichid (C.L.). La aceste substanţe, tranziţia de fază solid-lichid nu este directă, între faza

solidă şi faza lichidă apărând mai multe faze intermediare stabile. În aceste faze

substanţele sunt anizotrope ca şi cristalele solide, având totodată proprietatea de

fluiditate, caracteristică lichidelor. Datorită acestor proprietăţi au primit numele de

8

cristale lichide, mezofaze, faze mezomorfe sau faze fluide condensate cu anizotropie

spontană.

Mezogenii derivaţi de la 3b-steroli prezintă un interes deosebit întrucât se

prepară din materiale de origine vegetală şi animală uşor accesibile, oferind o gamă

largă de aplicaţii.

Condiţia necesară formării mezofazei colesterice este chiralitatea moleculelor.

Întrucât cei mai mulţi compuşi care au capacitatea de a forma astfel de mezofaze derivă

de la colesterol, li s-a atribuit denumirea de cristale lichide colesterice.

Colesterolul, ca atare, asemenea altor 3b-steroli, deşi este optic activ, nu

prezintă mezomorfism. În schimb, derivaţii lui, fenilcarbonaţi, carbamaţi, tiobenzoaţi

prezintă mezomorfism.

Comportamentul mezomorfic, în general şi stabilitatea termică în particular sunt

influenţate de diverşi factori, printre care şi de natura grupelor de atomi terminali din

moleculele mezogenilor.

Mezofazele colesterice sunt însoţite de o puternică reflexie a luminii în spectrul

vizibil. Culorile de dispersie se modifică treptat de la roşu, la albastru violet prin

ridicarea temperaturii. S-a putut observa, că mulţi derivaţi ai sterolilor prezintă reflexie

selectivă chiar în solventul din care au fost recristalizaţi. Aceste valoroase proprietăţi îi

recomandă pentru a fi utilizaţi în termografie.

9

PARTEA EXPERIMENTALĂ

CAPITOLUL 3

SINTEZA ŞI CARACTERIZAREA UNOR NOI DERIVAŢI STEROLICI

3.4. Sinteza şi caracterizarea unor noi colesterilbutiraţi

Colesterilbutiraţii noi sintetizaţi în conformitate cu metodele descrise mai jos,

sunt:

1

tiofenoxibutirat de colesteril

2

p-clorotiofenoxibutirat de colesteril

10

3

p-bromotiofenoxibutirat de colesteril

4

p-iodotiofenoxibutirat de colesteril

5

p-metoxitiofenoxibutirat de colesteril

Pentru sinteza acestora s-au folosit ca materii prime acizii 4-tiofenoxibutirici

substituiţi în poziţia para şi colesterolul.

11

HO+

S CH2 CH2 CH2 COOHR

S CH2 CH2 CH2R CO

O 3

18

19

28293031

1'2'3'

4'5 6

2126

27

I - V

(I: R = H; II: R = Cl; III: R = Br; IV: R = I; V: R = OCH3)

3.4.1. Caracteristici spectrale

Spectre de vibraţieAvând o grupă funcţională esterică, compuşii 1 – 5 prezintă banda caracteristică,

foarte intensă nC=O(ester) situată în jur de 1720 cm-1. De asemenea, se mai observă

vibraţiile nC-O(asim) între 1210- 1241 şi respectiv vibraţiile nC-O(sim) la 1005 – 1023 cm-1.

Partea sterolică este mai greu de analizat cu ajutorul spectroscopiei IR.

Spectre RMNSistemul sterolic prezintă în spectrele 1H-RMN un multiplet complex între 0,90-

2,10 ppm pentru partea saturată. În acest semnal complex se recunosc semnalele

caracteristice pentru grupele metil din poziţia 18 la 0,66 – 0,68 ppm, poziţia 19 la 0,89

ppm care apar ca singleţi.

OC

O

CH2CH2CH2SR 3 5 6

18

19

74

2126

27

282930

1'2'3'

4'31

compusii I - V

1-5

1: R = H; 2: R = Cl; 3: R = Br; 4: R = I; 5: R =OCH3

compuşii 1-5

12

Grupele metil din poziţiile 26, 27 apar ca dubleţi la 0,89 ppm cu un cuplaj de 6,6

– 6,7 Hz. De asemenea, grupa metil din poziţia 21 apare distinct ca un dublet la 0,90

ppm cu o constantă de cuplaj de 6,5 – 6,6 Hz.

Protonul H-3 geminal cu atomul de oxigen în butiraţii de colesteril sintetizaţi 1 –

5 apare ca un multiplet complex la 3,6 – 3,8 ppm, în concordanţă cu dezecranarea

produsă de acest atom. Grupa metilen din poziţia 4 apare în colesterilbutiraţi ca un

dublet lăţit la 2,40 – 2,50 ppm, cu un cuplaj de 7,7 Hz cu protonul H – 3. Grupa metilen

din poziţia 7 apare suprapusă cu ceilalţi multipleţi la limita 1,80 – 2,00 ppm (decelabilă

ca poziţie prin experimente de decuplare).

Caracteristici termice

Datorită ordonării elicoidale, mezofazele colesterice prezintă proprietăţi optice

remarcabile cum ar fi: reflexia selectivă, puterea rotatorie, dispersia şi dicroismul

circular.

Compuşii 1 – 5 prezintă reflexie selectivă în solvenţii din care au fost

recristalizaţi, proprietate ce anticipează comportarea de cristal lichid.

Compuşii 2 şi 3 au fost supuşi unui studiu termic, prin termomicroscopie

Boetius, vizualizând pentru fiecare compus analizat texturile din câmpul microscopului

şi modificările formaţiunilor specifice fiecărui tip de mezofază la variaţia temperaturilor

(forma cristalelor, culoarea etc.). Observaţiile au fost făcute de la temperatura camerei

(structura cristalină), până la topire, observându-se mezofazele intermediare. Astfel,

pentru compusul 2 au fost observate următoarele texturi (figurile 1 şi 2):

13

Figura 1. Textură pentru compusul 2 la al doilea ciclu de răcire, la temperatura 73°C

Figura 2. Textură pentru compusul 2 la al treilea ciclu de răcire, la temperatura 38°C

Pentru compusul 3 a fost observată o textură de tipul fan, la al şaselea ciclu de

răcire (figura 4).

14

CH N OHH3C + OC

O

Cl

Py_ HCl

CH N OH3COC

O

VII

H3CO CH N OH + OC

O

Cl

Py_ HCl

H3CO CH N OOC

O

VI

Figura 4. Textură pentru compusul 3 la al şaselea ciclu de răcire, la temperatura 60°

3.5.2. Sinteza unor carbonaţi steroliciCarbonaţii sterolici 17 şi 18 cu structură azometinică la C-3 sterolic au fost

sintetizaţi pornind de la 4-(4-metoxibenziliden)-aminofenol, 4-(4-metilbenziliden)-

aminofenol şi cloroformiat de colesteril.

17

18

15

Astfel, prin sintezele carbonaţilor 17 şi 18 s-a încercat obţinerea unor

dimezogeni sterolici, compuşi care au în structura lor două unităţi: carbonat steroidic şi

bază Schiff, ambele unităţi fiind tipuri de cristale lichide.

3.5.2.2. Caracteristici spectraleÎn spectrele IR ale compuşilor 17 şi 18 vibraţia grupei azometinice este în jur de

1600 cm-1, aşa cum se observă în tabelul 1.Tabelul 1 Frecvenţe IR (cm-1) obţinute pentru compuşii 17 şi 18

Simbol

textCompus nC=O

nC-

O(asim)

nC-

O(sim)nC=N

17CH N OCOOChH3CO

1700 1260 1020 1606

18CH N OCOOChH3C

1700 1250 1020 1600

3.5.3. Sinteza unor carbonaţi sterolici cu grupe azo

Compuşii 23 şi 24 au fost sinteizaţi plecând de la azo-derivaţii 4-(fenoxatiin-2-

azo)-fenol (25), şi 4-(dibenz-p-dioxin-2-azo)-fenol (26) cu cloroformiatul de colesteril,

în prezenţa piridinei ca acceptor de acid.

16

3[4-(fenoxatiin-2-azo)-fenoxi]- colesterilcarbonat

3[4-(dibenz-p-dioxin-2-azo)-fenoxi]- colesterilcarbonat

4-(fenoxatiin-2-azo)-fenol 4-(dibenz-p-dioxin-2-azo)-fenol

3.5.3.2. Caracterizări spectrale

Spectre de vibraţieSpectrele compuşilor sintetizaţi, obţinute în pastilă de KBr (pentru compusul 25

şi 2-amino-fenoxatiină) şi prin tehnica ATR (compusul 26) sunt prezentate în figurile 5

şi 6.

17

Figura 5. Spectrul IR al compuşilor 25 (linie plină) şi 26 (linie punctată)

Figura 6. Spectrul IR al azoderivatului 25 (linie plină) şi fenoxatiinaminei (linie punctată)

Vibraţia de întindere a grupei azo apare între 1500-1530 cm-1, iar acest lucru se

observă la compusul 25: 1501,31 cm-1, iar pentru compusul 26: 1524,45 cm-1. Dispare

vibraţia de întindere NH de la 3350 cm-1 a aminei (figura 6) în spectrul azoderivatului

25.

18

Apar benzile caracteristice OH-ului fenolic la 3429,78 cm-1 (compusul 25) şi

3453,88 cm-1 (compusul 26).

Spectre RMNÎn spectrele 1H-RMN pentru carbonaţii colesterolici cu structură azo 23-24,

pentru restul sterolic, spectrul este asemănător altor colesterili.

O

X N N OC

O

O1'2'

3'4'

5' 6' 3 4 5 67

19

1821

26

27

23: X=S ; 24: X=O

Sistemul sterolic prezintă în spectrele 1H-RMN un multiplet complex între 0,90-2,10 ppm pentru partea saturată. În acest semnal complex se recunosc semnalelecaracteristice pentru grupele metil din poziţia 18 la 0,65 – 0,68 ppm, poziţia 19 la 0,89ppm care apar ca singleţi. Protonul H-3 geminal cu atomul de oxigen în grupareacolesteril din carbonaţii sintetizaţi 23-24 apare ca un multiplet complex la 4,58- 4,62ppm, în concordanţă cu dezecranarea produsă de acest atom. Grupa metilen din poziţia4 apare ca un dublet lăţit la 2,45 – 2,52 ppm, cu un cuplaj de 7,5 Hz cu protonul H – 3.

3.6. Sinteza şi caracterizarea unor carbamaţi colesterici

3.6.2. Sinteza şi caracterizarea fizico-chimică a noilor carbamaţi colestericiColesterilcarbamatul 35 a fost sintetizat prin două metode: prin condensarea

cloroformiatului de colesteril cu o-iod-anilina (39), în benzen anhidru şi în prezenţa

piridinei ca acceptor de acid, cât şi direct prin reacţia o-iod-fenilizocianatului cu

colesterol, în toluen.

19

OC

O

ClHO

NH2

I

NCOI

OC

O

NH

I

+

+Py

X

Colesterilcarbamaţii 36 – 38 au fost sintetizaţi prin condensarea cloroformiatului de

colesteril cu aminele: 2-metil-5-iodanilina, 2-metil-5-nitroanilina, 2-nitro-4-

metoxianilina, în prezenţa piridinei ca acceptor de acid.

OC

O

Cl

NH2

CH3

I+

XI

XII

XIII

NH2CH3

O2N

NH2NO2

OCH3

+

+Py

Py

PyO

C

O

NH

CH3

I

OC

O

NH

CH3

O2N

OC

O

NHCH3O

NO2

Mersul reacţiilor şi puritatea compuşilor 35 - 38 au fost controlate prin TLC,

folosind ca eluent un amestec: eter de petrol: eter etilic 5:3. Recristalizarea

colesterilcarbamaţilor s-a realizat dintr-un amestec benzen: alcool.

35

36

37

38

35

20

3.6.3. Caracteristici spectrale

Spectre IRSpectrele FT-IR ale colesterilcarbamaţilor 35 - 38 au fost realizate prin

transmisie, atât în pastilă de KBr, cât şi prin ATR (reflexie total atenuată). În figura 7

a-c sunt prezentate spectrele FT-IR obţinute pentru compusul 35, prin transmisie în KBr

(7a), prin ATR (7b) şi prin ATR cu corecţie (7c)

Fig. 7 a.

21

Fig. 7. b.

Fig. 7.c.

Figura 7. Spectrul FT-IR al carbamatului 35 prin transmisie (a), ATR (b) şi ATR cu corecţie (c)

22

Figura 8. Spectrul FT-IR al colesterilcarbamatului 35 prin transmisie (verde), ATR (albastru), ATR cu

corecţie (roşu)

Aşa cum se observă, în figura 8, care prezintă spectrele FT-IR suprapuse pentru

compusul 35, prin ATR s-au obţinut benzi mai slabe ca intensitate (albastru) faţă de cele

obţinute prin transmisie (verde). Prin corecţie de ATR, intensitatea benzilor creşte. Mai

importantă este corecţia aplicată la deplasarea benzilor în ATR către valori mai mari ale

frecvenţei, comparabile cu tehnica transmisiei. Astfel, prin ATR vibraţia C=O din

funcţiunea uretanică, cea mai intensă din spectru, apare la 1734,66 cm-1, prin transmisie

apare la 1738,51 cm-1 . Prin corecţie ATR, vibraţia apare la valoare mai mare 1737,55

cm-1 , apropiată de cea obţinută prin transmisie. Vibraţia grupei C-Osim prin corecţie de

ATR este identică cu cea obţinută prin transmisie, 1038,48 cm-1 .

În figura 9 a-c sunt prezentate spectrele FT-IR obţinute pentru compusul 36,

prin transmisie în KBr (9a), prin ATR (9b) şi prin ATR cu corecţie (9c). Figura 10

prezintă spectrele prin transmisie, ATR şi ATR corectat, suprapuse, pentru compusul

36.

23

Fig. 9. a.

Fig. 9. b.

24

Fig. 9. c.

Figura 9. Spectrul FT-IR al carbamatului 36 prin transmisie (a), ATR (b) şi ATR cu corecţie (c)

Figura 10. Spectrul FT-IR al colesterilcarbamatului 36 prin transmisie (verde), ATR (albastru), ATR

cu corecţie (roşu)

25

Fig. 11. a.

Fig. 11. b.

26

Fig. 11. c.Figura 30. Spectrul FT-IR al carbamatului 37 prin transmisie (a), ATR (b) şi ATR cu corecţie (c)

În figura 11 a-c sunt prezentate spectrele FT-IR obţinute pentru compusul 37,

prin transmisie în KBr (11a), prin ATR (11b) şi prin ATR cu corecţie (11c). Figura 12

prezintă spectrele prin transmisie, ATR şi ATR corectat, suprapuse, pentru compusul 37

27

Figura 12. Spectrul FT-IR al colesterilcarbamatului 37 prin transmisie (verde), ATR (albastru), ATR

cu corecţie (roşu)

Figurile 13 a-b prezintă spectrul ATR şi ATR corectat pentru

colesterilcarbamatul 38.

Fig. 13. a.

28

Fig. 13. b.

Figura 32. Spectrul FT-IR al carbamatului 38 prin ATR (a), ATR cu corecţie (b)

În figurile 7c, 8, 9c, 10, 11c, 12, 13b se observă îmbunătăţiri ale spectrului cu

ajutorul corecţiei ATR, în ceea ce priveşte intensitatea benzilor semnificative şi

deplasarea acestora către frecvenţe mai mari, comparabile cu benzile obţinute prin

transmisie.

Pentru partea sterolică, mai greu de analizat prin spectrometrie IR, se recunosc

grupele metil din radicalii sterolici, caracterizate prin frecvenţele care apar între 2931 –

2970 cm-1 (nasim), respectiv 2866-2875 cm-1 (nsim).

Spectre RMNÎn spectrele 1H-RMN ale pentru carbamaţilor colesterici 35-38 restul sterolic

prezintă caracteristici asemănătoare cu ale colesteril esterilor.

Sistemul sterolic prezintă în spectrele 1H-RMN un multiplet complex între 0,90-

2,10 ppm pentru partea saturată. În acest semnal complex se recunosc semnalele

caracteristice pentru grupele metil din poziţia 18 la 0,66 – 0,68 ppm, poziţia 19 la 0,89

ppm care apar ca singleţi.

29

Grupele metil din poziţiile 26, 27 apar ca dubleţi la 0,89 ppm cu un cuplaj de 6,6

– 6,7 Hz. De asemenea, grupa metil din poziţia 21 apare distinct ca un dublet la 0,90

ppm cu o constantă de cuplaj de 6,5 – 6,6 Hz.

NH CO

O

R

R'

R''

1'2'3'

4'

5' 6' 3 4 5 6

18

19

21

26

27

X: R = I; R'=H; R''=H

XI: R = CH3; R'=H; R''=I

XII: R = CH3; R'=H; R''=NO2

XIII: R = NO2; R'=OCH3; R''=H

CAPITOLUL 4

STUDIUL ACTIVITĂŢII ANTIBACTERIENE

Pentru evaluarea activităţii antimicrobiene a compuşilor sterolici s-au folosit

următoarele microorganisme test: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia

coli ATCC 25922, şi Candida albicans ATCC 10231. Acţiunea inhibitorie comparativă

a fost determinată prin metoda difuzimetrică Kirby-Bauer în agar stabilită de către

National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Pe suprafaţa mediului

însămânţat s-au aplicat discurile folosind o pensă sterilă, după care s-au repartizat (câte

200 μl) din diluţia efectuată, obţinută prin dizolvarea fiecărui compus în DMSO.

Incubarea plăcilor s-a făcut cu capacul în jos la temperatura de 37 oC timp de 16-18 ore.

Exprimarea rezultatelor s-a realizat prin transcripţia directă a diametrului zonei de

inhibiţie.

35: R=I; R’=H; R’’=H;36: R=CH3; R’=H; R’’=I;37: R=CH3; R’=H; R’’=NO2;38: R=NO2; R’=OCH3; R’’=H;

30

Rezultatele sunt prezentate în figurile 14-17

23

22

0

21

0

18

0

19

15

0

20

13

0

Naftin, 16

19

1714

20Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Candida albicans

Diametru inhibitie (mm)

compus 5

compus 4

compus 3

compus 2

compus 1

Kanamicina

Figura 14. Activitatea antibacteriană a colesterilbutiraţilor 1 – 5

Activitatea antibacteriana a compusilor 19-20

23

2218

0

21

15

0

Naftin , 16

17Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Candida albicans

Diametru inhibitie (mm)

comppus 20

compus 19

Kanamicină

Figura 15. Activitatea antibacteriană a carbonaţilor 17 – 18

31

23

22

2019

20

9

Naftin,16

21

7

0 5 10 15 20 25

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Candida albicans

Diametru inhibitie (mm)

compus 24

compus 23

Kanamicină

Figura 16. Activitatea antibacteriană a carbonaţilor 23 – 24

23

22

13

15

00

19

17

0

12

14

0

Naftin, 16

11

9

0 5 10 15 20 25

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Candida albicans

Diametru inhibitie (mm)

compus 38

compus 37

compus 36

compus 35

Kanamicină

Figura 17. Activitatea antibacteriană a carbamaţilor 35 – 38

Acţiunea antibacteriană faţă de Escherichia coli s-a evidenţiat atât în cazul

carbamaţilor 35-38 şi a colesterilbutiraţilor 1-5 şi a carbonaţilor 17-18 şi 23-24, cu

deosebirea că acţiunea inhibitorie asupra creşterii şi dezvoltării microorganismului

testat este mai evidentă în cazul compuşilor 17-18, fapt ilustrat de diametrele zonele de

inhibiţie (19 - 20 mm), faţă de colesteril carbamaţii 35-38 unde diametrul zonelor de

inhibiţie nu depăşesc 19 mm.

În cazul studiului activităţii antibacteriene a carbonaţilor 23 – 24 s-a remarcat pe lângă

activitatea inhibitorie mare asupra bacteriilor gram-pozitive (Escherichia coli şi

32

Staphylococcus aureus ) că aceşti noi derivaţi prezintă spre deosebire de ceilalţi

compuşi studiaţi şi o activitate antifungică deosebită (7 mm diametru de inhibiţie pentru

compusul 23, respectiv 9 mm diametrul de inhibiţie pentru compusul 24) .

Acest lucru se poate datora faptului că fenoxatiina şi o serie de derivaţi ai săi sunt

cunoscuţi a avea o activitate bacteriană, antiinflamatoare, antifungică etc.

CAPITOLUL 5

TESTAREA ACŢIUNII NOILOR DERIVAŢI COLESTERICI ASUPRACELULEI VEGETALE

Testarea fitobiologica a noilor compuşi sintetizaţi evaluează anumite aspecte legate de

citogenitatea şi citotoxicitatea eventuala a produselor realizate. Testarea acţiunii

soluţiilor cloroformice obţinute din compuşii sintetizaţi, asupra alungirii radiculare şi

asupra filmului micotic s-a realizat prin metoda fitobiologică-testul Triticum a prof. dr.

Grigore Constantinescu. Evaluarea creşterii în lungime a fost efectuată utilizând tehnica

măsurătorilor liniare din momentul iniţial al tratamentului, la intervale de 24 de ore , pe

parcursul a 5 zile consecutive, această perioadă reprezentând faza cea mai activă de

creştere. S-au făcut observaţii asupra modificărilor morfologice (aspectul şi lungimea

epicolitului, aspectul şi lungimea radicelelor).

Figura 18 prezintă efectele derivaţilor colesterici asupra soiului Triticum după

120 de ore.

33

Fig.18.a.

Fig.18.b.

Figura 18. a – alungirea rădăcinii principale la probele 1- 7 după 120 de ore; b - alungirea radacinii

principale la probele 7 - 13 şi proba martor după 120 de ore.

S-a observat că toate soluţiile compuşilor sintetizaţi inhibă cu un anumit

procent, mai mare sau mai mic creşterea în lungime a rădăcinii principale. Astfel pentru

colesteril derivatul 17 (4-(4-metoxibenziliden)-aminofenoxi-colesterilcarbonat) se

observă o inhibare totală a alungirii radiculare, în timp ce pentru derivaţii 3 şi 23 se

observă inhibarea rădăcinii principale cu aproximativ 68 % din media rădăcinilor probei

martor.

34

CONCLUZII GENERALE

În lucrarea de faţă s-a urmărit un studiu al literaturii de specialitate existent pânăîn prezent asupra derivaţilor colesterici cu proprietăţi de cristal lichid.

În partea originală a lucrării (capitolele 3 – 6) s-au sintetizat treisprezece noiderivaţi sterolici ce prezintă proprietăţi mezogene remarcabile. S-a testat activitateaantibacteriană a acestor compuşi şi acţiunea acestora asupra celulei vegetale.

Ø Colestesterilbutiraţii 1 – 5 au fost sintetizaţi pornind de la colesterol şi acizii 4-tiofenoxibutirici substituiţi în poziţia para, având un randament de 70 – 85 % (mai puţinpentru colesterilbutiratul 4 pentru care s-a obţinut un randament destul de scăzut, de50%). Puritatea compuşilor, ca şi mersul reacţiilor de sinteză au fost controlate prinTLC, utilizând ca eluent un amestec de eter de petrol: eter etilic 5:3 (v:v).Ø Compuşii 1 – 5 au fost caracterizaţi spectral (prin studii de spectroscopie de

intraroşu cu Transformată Fourier de mare performanţă şi prin spectrometrie RMNîn CDCl3 folosind tetrametilsilanul ca standard intern pentru spectrele de proton şiliniile de rezonanţă ale solventului pentru spectrele de carbon.)

Ø Toţi compuşii 1 – 5 anticipează comportarea de cristal lichid, deoarece prezintăreflexie selectivă în solvenţii din care au fost recristalizaţi.

Ø Compuşii 2 şi 3 au fost supuşi unui studiu termic, prin termomicroscopie Boetius,vizualizând pentru fiecare compus analizat texturile din câmpul microscopului şimodificările formaţiunilor specifice fiecărui tip de mezofază la variaţiatemperaturilor (forma cristalelor, culoarea etc).

Ø De asemenea în cadrul studiului activitaţii antibacteriene realizat asupra S. aureaus,E. coli şi C. albicans s-a constatat o acţiune inhibitorie foarte bună asupra primelordouă bacterii a compuşilor 1-5 dar nicio acţiune antifungică a acestora.

Ø Carbonaţii 17-18 şi 23-24 au fost sintetizaţi pornind de la 4-(4-metoxibenziliden)-aminofenol, 4-(4-metilbenziliden)-aminofenol şi sterolii cloroformiat de colesteril(pentru carbonaţii 17 şi 18 cu structură azometinică la C-3 sterolic) şi plecând de laazo-derivaţii 4-(fenoxatiin-2-azo)-fenol, şi 4-(dibenz-p-dioxin-2-azo)-fenol cucloroformiatul de colesteril, în prezenţa piridinei ca acceptor de acid (pentrucarbonaţii sterolici 23 şi 24 cu structură azo şi heterocicluri la C-3 sterolic).

35

Ø Compuşii 17 şi 18 au fost recristalizaţi de mai multe ori din etanol, puritatea fiindcontrolată prin cromatografie în strat subţire, utilizând ca eluent acetonă: eter depetrol 7:3. Randamentele obţinute au fost de 70 – 75 %.

Ø Întrucât există studii în literatura de specialitate cu privire la aplicaţiile complecşilorcu transfer de sarcină (adsorbţia acceptorilor de electroni pe oxizi metalici pentrucaracterizarea proprietăţilor de donori de electroni ale acestor oxizi metalici,utilizarea în electronică, în memorii de comutaţie cu curent controlat, determinareaconcentraţiei critice micelare, componente ale celulelor solare, utilizarea în industriatipografică, etc), în subcapitolul 3.5.2.3. a fost întreprins un studiu privindcomplecşii cu transfer de sarcină derivaţi de la 4-(4-metoxibenziliden)-aminofenol şi4-(4-metilbenziliden)-aminofenol cu acidul picric. Compuşii cu transfer de sarcină aibazelor Schiff cu structură azometinică, 17 şi 18 au fost preparaţi prin amestecareaunei soluţii saturate în alcool etilic cu o soluţie similară de acid picric la 40°C.Puritatea acestor complecşi a fost verificată prin cromatografie în strat subţire, punctde topire, culoare, spectroscopie UV-VIS şi IR.

Ø În cazul complecşilor cu transfer de sarcină obţinuţi cu acidul picric, compuşii 21 şi22, se observă o deplasare a benzilor de absorbţie caracteristice structuriiazometinice datorate vibraţiilor legăturilor C=N şi C-N către frecvenţe mai mici.

Ø Compuşii 17-18 şi 23-24 au fost caracterizaţi spectral (prin studii de spectroscopiede intraroşu cu Transformată Fourier de mare performanţă şi prin spectrometrieRMN în CDCl3 folosind tetrametilsilanul ca standard intern pentru spectrele deproton şi liniile de rezonanţă ale solventului pentru spectrele de carbon).

Ø Colesterilcarbamatul 35 a fost sintetizat prin două metode: prin condensareacloroformiatului de colesteril cu o-iod-anilina (X’), în benzen anhidru şi în prezenţapiridinei ca acceptor de acid, cât şi direct prin reacţia o-iod-fenilizocianatului cucolesterol, în toluen.

Ø Colesterilcarbamaţii 35 – 38 au fost sintetizaţi prin condensarea cloroformiatului decolesteril cu aminele: 2-metil-5-iodanilina, 2-metil-5-nitroanilina, 2-nitro-4-metoxianilina, în prezenţa piridinei ca acceptor de acid.

Ø Spectrele FT-IR ale colesterilcarbamaţilor 35 - 38 au fost realizate au fost realizateprin transmisie, atât în pastilă de KBr, cât şi prin ATR (reflexie total atenuată),

36

urmărind compararea spectrului ATR cu cel obţinut prin transmisie în pastilă deKBr.

Ø Mersul reacţiilor şi puritatea compuşilor 35 - 38 au fost controlate prin TLC,folosind ca eluent un amestec: eter de petrol: eter etilic 5:3. Recristalizareacolesterilcarbamaţilor s-a realizat dintr-un amestec benzen: alcool. S-au obţinutrandamente foarte bune, cuprinse între 75 – 98 %.

Ø Compuşii 17-18, 23-24, 35-38 au inhibat dezvoltarea bacteriilor S. Aureus şi E. coli,compuşii 23 – 24 având şi activitate antifungică . Acest lucru poate fi explicat prinfaptul ca aceştia sunt derivaţi ai fenoxatiinei, care prezintă activitate antifungicădeosebită.

Ø În experimentele fitobiologice a fost observată inhibarea germinaţiei specieiTriticum Sativa, toţi compuşii sintetizaţi prezentând potenţial citotoxic. Testulaberaţii cromozomiale în ana-telofazele radiculare (fragmente cromozomiale, punţi,micronuclei, cromozomi retardatari, anafaze dezorganizate, alte tipuri de anomaliistructural-cromozomiale) a relevat un efect moderat genetic clastogen (genotoxic)demn de luat în considerare.

37

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. C. Topală, E. Dumitru, C. Drăghici, Synthesis of new cholesteryl butyrates,

Rev. Chim. (Bucureşti), 2009, 60(12):1306-1309

2. A. Bax, R. Freeman, G. A. Morris, J. Magn. Reson., 1981, 42, 169

3. Y. Saka, T. Mita, J. Biochem. Tokyo, 1998, 123, 798-805

4. C. Topală, E. Dumitru, Charge Transfer Complexes of Schiff Bases derived

from p-Methoxybenzyliden Derivatives with Picric Acid, The 33rd Annual

ARA Congress, Modernism and Progress in Art and Sciences, Sibiu, 2-7 iunie

2009

5. E. Dumitru, C. Topală, FT-IR Study of Iodophenyl- cholesteryl Carbamates,

Annual Conference 2009, Rousse, Bulgaria

6. C. Topală, E. Dumitru, C. Drăghici, Studiul spectral al unor carbamaţi

colesterici, Rev. Chim. (Bucureşti), 2010, 61(6):557-562

7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution

antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Villanova

(Pa); 2005. Approved Standard Document M7-A4

8. M. Manea, V. Chiosa, G. Raju, I. Stănculescu, IR spectral study on the nature

of 2-pyridine aldoxime methyl chloride interaction with some sterols.

I.Cholesterol, Anal. Univ. Buc-Chimie, anul XV, (serie noua), II, 2006, 43-48.

9. E. Eweritt, M. Sullivan, J. Wash. Acad. Sci., 1940, 30, 457

10. M. Harferist, C. T. Joyner, P. D. Mize, L. A. White, J. Med. Chem., 1994, 37,

2085; O. Maior, D. Gavriliu, D. Stoica, South. Braz. J. Chem., 1995, 3, 79

11. W. S. Jenks, W. Lee, D. Shutters, J. Phys. Chem., 1994, 98, 2282; S. Ionescu,

D. Gavriliu, O. Maior, M. Hillebrand, J. Photochem. Photobiol. A. Chem.,

1999, 67, 124

12. L. E. Vîjan, C. Topală, Rev.Chim. (Bucureşti), 2008, 59(7), 756-758

13. C. Topală, G. Ioniţă, Rev. Chim. (Bucureşti), 2005, 56(2), 158-159

38

14. V. Meltzer, I. Baciu, C. Topală, E. Pincu, Rev. Chim.(Bucureşti), 2002, 47(8-

9), 839-841

15. D. Do Eui, K. N. Kim, Y. W. Kwon, J. I. Jin, Liq. Cryst., 2006, 33(5), 511-

520

16. A. M. Pall, G. Motika, P. Zsedenyi, Acta Chimica Academiae Scientarum

Hungaricae, 1982, 4, 357-3

17. V. Meltzer, C. Topală şi E. Pincu, Rev.Chim.(Bucureşti), 2002, 47(1-2), 173-

177

18. A. J. Geall, R. J. Taylor, M. E. Earll, M. A. W. Eaton, I. S. Blagbrongh,

Bioconjugate Chem., 2000, 11(3), 314 -326

19. G. X. He, F. Wada, K. Kikukawa, S. Shiukai, T. Matsuda, J.Org.Chem.,

1990, 55, 541-548

20. J. Bolard, P. Legrand, F. Heitz, B. Cybulska, Biochemistry, 1991, 30, 5707-

5715

21. M. Baginski, H. Resat, J. A. McCammon, Mol. Pharmacol., 1997, 52, 560-

570

22. H. A. Benesi, J. H. Hildebrand, J. Am. Chem. Soc., 1949, 71, 2703

23. D. Marcovici-Miryahi, H. E. Gottlieb, V. Marks, A. Nudelman, J. Org.

Chem., 1996, 61, 8402-8406

24. M. Pietsch, M. Gutschow, J. Biol. Chem., 2002, 277, 24006-24013

25. J. M. Lehn, Supramolecular Chemistry. Concepts and Perspectives, VCH

Weinheim, 1995, 11-12

26. B. De Kruijff, R. A. Demel, Biochim. Biophys. Acta, 1974, 339, 57-70

27.V. E. Khutorsky, Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1108, 123-127