II

Laborator 3 Farmacie IIsemnifica{ia clinici a compugilor azota{i neproteici: uree, creatinini, NH3 in s6nge gi urini

in lichidele biologice se gesesc Ai o serie de compu$i azottqi neproteici, rc tatidin degradareaproteinelor in procesele metabolice. Catabolilii proteici sunt reprezentati de amoniac, uree, creatindgi creatinind. Determinarea concentraliei acestora este importanti pentru stabilirea diagnosticuluimor afecliuni insolite de un catabolism intens al proteinelor, de o sintezd deficitarh a acestorcompugi ca rczultr.t al unei funcrionari necorespunzaioare a organelor implicate in sinleza acesrorasau de o eliminare defectuoasd din organism.

Ureea. Metode de dozare a ureeiUreea este principalul produs al catabolismului proteic, reprezent6nd circa 15% dincompuqii

azotali neproteici ce se excretd prin urind.Biosinteza sa este o consecinld fiziologicd pentru conhacararea efectului toxic al amoniacului,

incorporat astfel intr-o substanfd netoxicd, solubilh in apd, forma de eliminare, in special pe calercnald., a azotl}ui aminic excedentar.

Biosinteza are loc in ficat prin procesul de ureogenezd, amoniacul provenind in cea mai mareparte din acidul glutamic dezaminat oxidativ sub acliunea glutamat dehidrogenazei.. _Formarea ureei este dependentd intr-o mare mdsurd de: dietd, acliLrnia normald a enzimelorimplicate in ureogenezd gi integritatea firncliilor hepatice.

Peste 90 Yo din uree se indepdrteazi prin rinichi la nivelul glomerulului qi, in mod normal, 40 -70 %o din wee depdqegte pasiv tubii renali.

^ Eliminare ureei este dependenti, in special, de buna funclionare a rinichilor, astfel incdt unele

afecfiuni, ca cele glomerulare, tubulare sau interstiliale renale, vor induce tulburdri de filtrare aureei gi, in consecinfd, vor determina cre$terea concentaliei sale in s6nge.

Deoarece determinarea ure ei s-a realizat la inceput pe un filtrat proteic deproteinizat al s6ngeluitotal 9i se mesua cantitate a de azot, analiza este numitd deseori BUN (blood urea nihogen). Pentrua converti concenftalia azotului ureic in concentralie de uree, se inmullegte valoarei oblinutd ladeterminare cu 2.14.

Dozarea ureei s-a realizat prin mai multe metode:a) metoda azotometricd (Kowarsky) (mai pulin exactd);b) metoda colorimetricd cu diacetilmonoxima (Kitamwa-Jukv):c) mel.ode enzimalice.in prezent, metodele cele mai folosite sunt cele enzimatioe.

Metoda colorimetrici cu diacetilmonoximaPrincipiu: Ureea condenseazd cu diacetilul formAnd un compus colorat, diazina. Se utilizeaz[diacetilmonoxima care, in mediu acid, genercazd diacetilul instabil, conform reactiei:

ilc-ff,-crl + qo + 4c-fi fr_Crr3 + HO_NH'ooHO-NOqc+o

I

H3C{=OHN\^ ^ 11C{=N..-I L

=J --J' r | -1--- Hn/.'"t1"2"Hl( sn1=N/. '-:']--" '-

Metoda enzimatici BerthelotPrincipiu: Ureea este hidrolizatd. sub acliunea ureazei, amoniacul format fiind dozat orin reactiaBenhelot- prin care ionul amoniu reactioneazS. cu hipocloritui de sodiu gi fenolul. in mediu alcalin 9iin_ prezenla nitroprusiatului de sodiu ca si catalizator, rezultAnd indofenolul, substanld coloratd inalbastru. Intensitatea culorii este indirect propo4ionald cu concentratia meei din propa analizata.

wa/A r 2-2r\nr L u- - H^U 2NHo CO,OH

,/\ uo+ 5Naocl * 21 ll\-,/ "y) (lo",*o ,no\-'\N-^\-,,,

Metoda enzimatici cineticiPrincipiu: Uresa este hidrolizatd sub acliunea ureazei formdnd amoniac Ai dioxid de carbon.Amoniacul rezultat va fi transformat in prezenla unei oxidoreductaze" glutamat dehidrogenaza,enzimd NAD - dependenti.

GIDH2 NH3 + 2 NADH,Ht + 2 o-cetoglutarat

-----+ 2 L-glutamat + 2NAD*+ 2H2O

Se misoard scdderea absorbtiei la 340 nm care este proporlionald cu cantitatea de uree din probaanalizatd.Reactivi:

1. Reactiv R1: NADH,H* (320 pmol/l)2- Reactiv R2: tampon Tris (100 mmol/l), pH 7,6, ct-cetoghrtarar (9 mmol/l), ureaza (6500 u/1),

glutamat dehidrogenaza (1 100 U/1), NADH, Ff (1,5 mmoyl,) , azida de sodiu 9,5 gil;3. Standard de uree:48,2 mg/l00 ml

Prepararea reactilrrlui de lucnr: se amestece 3 pirfi reactiv R1 cu 1 parte reactiv R2.Mod de lucru:

NH4

fL,5 t =

Se pipeteza conform schemei:Reactivi Probi Standardrlasma l0 ulStandard de uree 10 ulReactiv de lucru (^l LinlSe agitd gi se citegte qb se incubeazd inc[g{1$,i.t?:ilffHgbsorbtia 1E1pqi Ers) dup-4-lQ sec,r"de de inoHiir{ gl4lpol se citeste din nou absorbtia la 340 nm (Erp si Ers).ll#! git{ioi se iitegte din nou absorblia la 340 nm (Ezp $i

-Ezs).Cafculr mguree/100ml:(Erp-E2p)/(Er5-E2s)x48,2. :;, = 1 lliTestul este liniar pdnd la 400 mg/l00 ml 15 '

c1993

Valoare normqld: uree sericd (adul1i) 15 -

40 mg /100 ml (7-18 mgldl - BltN);uree urinard 23 - 43 el24h (12-20 gi24h - BUD.

Nivelul ureei serice prezint[ v ariayii fiziologice dependente

Azotemii extrarenale pot fi prerenale (insuf cardiacd, stdri de goc, hemoragii, deshidratare,cre$terea.catabolismului proteic

- dietb, febri, stres) qi postrenale (obstrucfia ciilor urinare

- tumori

ale vezicii urinare, calculi urinari. tumori ale prostatei, infeclii severe)

Azotemii renale Azotemii extrarenale Nivel scizut al ureeiInsuficien,ti. renald acuti gi

croniclGlomerulonefi:iti acutd gi

cronicACalculozS. renaldNecrozd tubulari

InsuficienJi cardiaciBoli infeclioaseDiaree, vdrsdturiBoala AddisonDiabet zaharat

Hemoragii

Aport proteic scdzutAfecliuni hepatice severe

Sarcind normald

Modificarea nivelrilui ureei ce este inso de alterdri ale ureei urinare.Hiperazoturii Hipoazoturii

Stiri cu un catabolism proteic intens:stiri febrile. afecliuni endocrine(hipertirodism, diabet zaharat, diabetazoturic), adm in istrare de liroxindlntoxical.ii cu plumb qi mercur

Afecliuni hepaticeAfecliuni renale

Administrare de hormoni ce cresc sintezaproteiceAcidoze

Nivelul foarte crescut al ureei serice ce insole$te insuficienJa renald se mrme$te uremie sattsindrom uremic. Sindromul uremic este manifestarea clinicd terminald a insufrcienlei renale,ren'ltat in urma incapacifilii rinichilor de a-si indeplini adecvat funcliile excretorii, reglatorii qiendocrine. Simptomele clasice ale uremiei includ oboseald qi sldbiciune musculard, pierdereaapetitului, grealA, vome, tremor, acidozd metabolicS, iar in cazul in care nu se intervine prin dializasau tansplant renal evolueazd spre comA $i moarte.

In concluzie, valoarea semiologicd a nivelului ureei este datd de faptul cd acumularea sa inplasmd este un indice de insuficienld renald, deqi existi numerogi factori extrarenali care-iinfluenleazd sinteza gi concentratia sanguind.

Din aceste motive, de o mai mare utilitate clinicd este determinarea rapoftului cantitativuree/creatinind (mgll00 ml ser), care pentru un individ normal este de 12-16:- un raport < 12 denotd o alimentalie proteici deficitard, o afectiune hepaticd cronicd. sinteza

redusd de uree;- un raport > 16 denotd o afectiune renald.

Creatina qi creatinina. Metode de d,ozare a creatininei.

Creatina (acid metilguanidoacetic) este un compus sintetizat in ficat din argininA, glicocol gimetionine, care, uiterior sintezei este transportat, prin sange, in mugchi qi oeier. La aiest nivel,creatina se transformd in fosfocreatind, una dintre cele mai importante substanle energogene,necesard procesului de contracfie musculari qi de obtinere a energiei la nivelul creierului.

-NH-PO}L-+ FNE{(. -ADp

- - NatsoHGl

crelnna fcfiqeatina^ ^

O micd fracliune din fosfocreatinA, constanta pentru aceeagi masd musculard, pierde grupafosfat qi formeazd creatina liberS. Creatina, fiind deosibit de instabila la pH-uri bazice iau acide, setransformd in anhidrida sa, creatinina, ca"re trece in sdnge $i apoi este eliminatd pe cale renald. Dinacest motiv, determinarea cantitativl a creatinei nu are valoare clinicd, ci se determina creatinina.

-.ls1l]KNclcocxr*trGl

-,}trIq{\-&i

C}I,

-,ML'**c+mr --'-t'-rl(]

GL

Metoda cinetici colorimetriciPrincipiu: Creatinina din ser sau plasm6. deproteinizatd reaclioneazd cu acidul picric, in mediualcalin, conform reactiei Jaff6, formdnd picrali de creatinind de culoare portocalie.

I9- [P' o _l(_)*, . ^..il[ I C>"" ni*{ffj_"ilo,6" ct L [] *,.__lReactivi:

1. Reactiv Rl : hidroxid de sodiu (400 mmol/l); fosfat disodic (25 mmol/l).2. Reactiv R2: acid picric (17,5 mmoVl).3. Standard de creatinini 2 ms/100 ml.

Pentru prepararea reactilr:lui de lu-cru se amestecd I parte de reactiv R1 cu o parte reactiv R2.Mod de lucru: Se foloseqte ser nehemolizat, deoarece hemoglobina interferi in reaclia Jaffd. Urinaproaspdti se dilueazd 1i50 cu apd distilatb.In doud eprubete se pipeteazd conform schemei:

Reactivi Probi StandardReactiv de lucru 1ml 1ml

Plasmd 100 ulStandard 100 ul

Ea o= 2,32,? 81, =o1\o!r,', ' c,1)i ;rr= o,311

Se agitd qi se citegte ertincliala 492 (480-520) nm dupd 30 secunde (E1p 9i 815) qi 2 minute (E2p qiE2s) de incubare la3lac.

l,;{- = Calcul: mg creatinin6/100 ml plasmd = lEap - Eap.l/1EX5 - E45)x2Pentru cd urina este diluata 1i50, iar.eruiiutrli" rabofteazdla urina de 24 ore. se va calcula astf'el:j:sfgl-!tle4{:(Ep - Ev)/(E' - Ev) x I o0

lL!j99!! n9!m!!!)- creatinind sericd b6rba{i 0,7

- 1,2 mg/100m1; femei 0,6

- 1,1 mg/100 ml

- creatinini urinard 1-1,8{24h sau birbali: l4-26mgkg/24h. femei: 1 1-20 mglkg/24hValoare semiologicd. Creatinna formatd este direct proporlionalS cu masa musculard, reprezentdndunul din cei mai obiectivi indici ai acesteia. La copii, nivelul creatininei este mai crescut decdt laadulli. La bdrbali, concentralia sericd gi eliminarea urinarh sunt superioare celor de la femei, datoridmasei musculare mai mari.

Deoarece sinteza qi eliminarea din organism a creatininei sunt constante, fac din determinareasa o analizd utild in aprecierea clearance-tlui renal, metodd prin care se poate evalua viteza defiltrare glomerulard gi se poate stabili capacitatea functionalb a rinichilor.

Fafd de uree, creatinina este un parametru mult mai exact pentru m5.surarea ratei de filtrareglomerulard deoarece este mai pulin influenlat[ de integritatea lirncliei hepatice sau de aportulproteic.

Va.rialii patologice Cregterea nivelului creatininei in sdnge qi eliminarea crescutd a acestui compusprin urind implica urmatoarele mecanisme:- cre$terea producliei de creatind;- distrugereacelulelormusculare;- o disproporlie intre produclia de creatind gi masa musculard diminuati, care nu mai poate capta

creatina produsd;- disfunctie in procesul de eliminare.

Hipercreatininemii Hipercreati ninuriiAfecJiuni renale: insuficienli renalS. neffitecronlceAfecliuni musculare: distrofii musculare,atrofie muscularaAfectiuni endocrine: acromegalie, diabet

-feiliuni musculare: atrofi e musculara, distrofi emusculard, miastenia gmvisSecundar in cazul unor afec{iuni ca: tifos,pneumonie, acromegalie, stiri febrile

Hipocreatininemii HipocreatininuriiSciderea masei musculareCarente proteice in dietiAfectiuni hepatice

Insuficienld renali croniciCaren{e proteice in dieti

Rata de filtrare glomerulard (RFG) este un parametru ce ofer6 informalii despre capacltateafimclionald arinichil&, considerandu-se a fi un marker sensibil $i specific al modifrcdrilor funclieirenie globale. o scddere a RFG precede insuficienla renali in toate formele de boall renalaplogresivd.

Determinarea ppG se bazeazd frecvent pe stabilirea clearance-tltti renal pentru o ar.umltdsubstantA ce trebuie sd indeplineascd unele condilii:- concentralia plasmaticd sa fie stabild;- sd se filtreze liber la nivelul glomerulilor;- sA nu fie secretatS, reabsorbitd, sintetizatd sau metabolizatd la nivel renal'

Clearqnce-ul renal al unei substanlei reprezintd volumul de plasmS din care o anumitasubstanF este complet epuratd prin filtrare glomerulard pe unitatea de timp, fiind o mdsur[ a raterde lllrresloucndara IiRFG).

T C* : 0,1* x V) I p*l unde C* = clearance-ul substan{ei (ml/min)V = volumul winar ml/minU : concentra{ia urinard a substanlei (mg/ml)P - concentralia plasmatici a substanlei (mgiml)

Dimensiunea rinichilor gi RFG sunt aproximativ propo4ionale cu marimea corpului- Pentru opersoanA sdndtoasd RFG are o valoare medie de 140 ml/min, insd, deoarece variazd mult in funcjiede suprafaia corporald, valoarea oblinutd se corecteazd raportAnd-o la o suprafala corporald mediede 1,73rl, deci RFG se exprimd in mVminll,73.

Inulina este o substanld exogend ce indeplinegte toate criteriile mentionate qi a fost muit timpconsiderati ca fiind cea mai acr.riati modalitate de a aprecia RFG, dar este mai costisitoare 9i maigreu de utilizat in mod uzual. De aceea, este preferat1 folosirea markerilor endogeni pentruitabilirea RFG, ce necesitd doar recoltarea unor probe de sAnge qi urind in care se fac determindrile,ce simplificd procedura pentru pacient, clinician qi laborator

creatinina este una dinhe substantele endogene uIllizatd in acest ssop. Deoarece simpladeterminare a concentraJiei plasmatice a creatininei nu se coreleazd perfect cu funcJia glomerulard(creatininemia vaiazl frziilogic in funclie de sex, virst6, masd musculara, iar o valoaresemnificativ crescutd a creatininemiei apare atunci cAnd RFG este scdzutd ctt 50oh fa\d de normal),ca mdsurd a RFG se determind fre cveri. clearance-ul de creatinind.

Valorile normale ale clearance-ului de creatinind sunt:- 71-135 mVmin/l,73 pentru femei; u,"- 78-116 mVminl1,73 pentru bdrbali.Deoarece determinarea clearance-ului necesitd respectarea unor condilii bine stabilite, a fost

inlocuit cu formule de calcul pentru determinarea ratei de filtrare glomerulard estimatd (RFGe)'Una dintre acestea este formula Cockcroft Gault ce line cont de vdrst6, greutate corporald qi

valoarea creatininemiei.bdrbaJi RFG : [ (140 - vArsta) x greutate Q