Rolul compusilor farmacologici in inhibarea protein kinazelor implicate in cancer(Zachary A. Knight, Henry Lin si Kevan M. Shokat. 2010. Targeting the cancer kinome through polypharmacology. Nature Reviews)

Incepand cu 2001 au fost atestate mai mult de 10000 de aplicatii ale inhibitorilor kinazelor doar in Statele Unite (1). Aceste investigatii au fost realizate deoarece, s-a constatat ca protein kinazele sunt implicate in mod direct in cresterea, proliferarea si supravietuirea celulelor canceroase. Intr-adevar, kinazele si reglatorii acestora fac parte din categoria oncogenelor si supresoarelor de tumori care sufera mutatii cel mai frecvent (2-4) . Cele mai cunoscute exemple sunt: kinaza oncogenica PIK3CA (subunitatea p110 a PI3K), receptorul factorului de crestere epidermal (EGFR), BRAF, familia de oncogene Ras( care activeaza atat PI3K cat si Raf) si supresorul de tumori PTEN (care inhiba semnalizarea PI3K). Inhibitorii kinazelor au revolutionat tratamentul unui grup selectiv de boli, cum ar fi leucemia mieloida cronica (CML) si tumorile gastrointestinale stromale (GIST), care sunt provocate de o singura kinaza oncogenica. In aceste conditii inhibitorii kinazelor au prelungit supravietuirea cativa ani (5-7). In cazul unor cancere (cum ar fi carcinomul de celule renale) care sunt dependente de angiogeneza, deci sensibile la inhibitorii semnalizarii factorului de crestere al endoteliului vascular (VEGF), s-au observat raspunsuri mai slabe dar semnificative (8-11). Inhibitorii kinazelor au un efect mai slab in tratarea tipurilor de cancere care au cele mai mari rate de mortalitate, cum ar fi: cancerul de plamani, san, colorectal, pancreatic sau de prostata. Experimentele clinice au aratat ca pentru aceste tipuri de cancere, chiar si cei mai eficienti inhibitori ai kinazelor prelungesc supravietuirea doar pentru cateva luni (12-17). Rezultatele au fost imbunatatite prin identificarea markerilor pentru pacientii care raspund cel mai probabil la terapia cu inhibitori kinazici, cum ar fi: mutatiile EGFR in cancerul de plamani (18), supraexpresia ERBB2 in cancerul de san (19), si proteina KRAS de tip salbatic in cancerul de plamani si colorectal (20,21). Dar, si printre aceste subgrupe, recidivarea este inevitabila pentru pacientii care prezinta boala diseminata. De ce este progresul clinic o provocare? Unul dintre motive consta in faptul ca majoritatea tumorilor poseda mecanisme de inhibare a oricarei kinaze (Fig.1). Acest lucru a devenit evident atunci cand au fost descoperite mutatii rezistente in cadrul proteinei BCR-ABL la pacientii cu CML, care erau rezistenti la imatinib (22). Mutatii similare au fost detectate apoi si in alte kinaze dupa tratamentul cu inhibitori kinazici (23-26). Alternativ, tumorile pot dobandi rezistenta la agenti terapeutici prin mecanisme care nu implica mutatia tintei (Fig.1a). Aceste mecanisme includ activarea unor kinaze surogat care substituie tinta medicamentului (27) si inactivarea fosfotazelor pentru a amplifica activitatea kinazelor reziduale care persista in timpul tratamentului (28).

De asemenea, este clar ca multe tumori poseda rezistenta intrinseca la inhibitorii kinazici, in momentul in care se incepe terapia (Fig.1b). Acest lucru poate fi rezultatul activarii unor cai de semnalizare in care sunt implicate kinazele (29) sau al prezentei unor mutatii activatoare in componentele caii de semnalizare situate downstream, cum ar fi KRAS sau PTEN. Acestea fac posibil ca tumoarea sa nu fie afectata de medicamentul tinta (20,21,30). Depasirea acestor mecanisme de rezistenta necesita ca celulele tumorale sa fie tintite prin folosirea unui singur medicament, care se leaga la mai multe proteine (31), sau amestecuri de inhibitori inalt selectivi (32). Cea mai mare provocare cu care comunitatea de cercetare a cancerului se confrunta este aceea de a invata sa prezica cea mai buna combinatie de tinte si apoi sa prioritizeze aceste combinatii pentru testele clinice. Aceasta este o misiune descurajanta, deoarece numarul de combinatii posibile sunt nelimitate, iar testele clinice decurg incet si sunt scumpe.

Figura 1. Rezistenta la inhibitorii kinazici. a. Mecanisme de rezistenta dobandita. Tratamentul cu inhibitori kinazici poate selecta mutatiile care blocheaza legarea medicamentului (stanga). Acest lucru a fost prima oara demonstrat pentru mutatia T315I a proteinei Bcr-ABL in leucemia mieloida cronica (22). Tratamentul cu un inhibitor kinazic poate induce reglarea in amonte a unei alte kinaze care inlocuieste tinta medicamentului (centru). S-a demonstrat ca receptorul tirozin kinazic Met (cunoscut si sub denumirea de receptorul factorului de crestere al hepatocitelor) este supraexprimat in cancerul de plamani, iar aceste celule tumorale capata rezistenta la inhibitorii receptorului factorului de crestere epidermal (EGFR) (27). Celulele tumorale pot raspunde la tratamentul cu un inhibitor kinazic prin reglarea in aval a fosfatazei care in mod normal defosforileaza substratul acelei kinaze (dreapta) (efectul este acela de a scadea eficienta inhibitorului kinazic). Acest mecanism a fost observat in cazul dobandirii rezistentei la inhibitorii EGFR in celulele de cancer de san (28). b. Mecanisme de rezistenta intrinseca. Multe tumori exprima o serie de kinaze oncogenice care semnalizeaza excesiv pentru a promova supravietuirea celulara (stanga). De exemplu, unele celule gliale au aratat o activare constitutiva a mai multor receptori tirozin kinazici (29). Activarea unei mutatii in aval de catre un component al unei cai de semnalizare poate reduce eficienta unui inhibitor kinazic (dreapta). Mutatiile proteinei KRAS sunt

asociate cu rezistenta la inhibitorii EGFR in cazul cancerului de plamani si colorectal (20-21). IGF1R- receptorul factorului 1 de crestere insulin-like; INSR- receptorul insulinei.

Tintirea unei singure kinaze cu ajutorul mai multor agenti

Daca o tumora depinde de activitatea unei singure kinaze, atunci folosirea mai multor agenti tinta pentru aceea kinaza poate fi eficienta. Acest lucru a fost demonstrat pentru prima data in CML, unde testele clinice timpurii au demonstrat ca mai mult de 90% dintre pacientii aflati in faza cronica au raspuns la tratamentul cu inhibitorul BCR-ABL imatinib5 (Table 1). Totusi o parte dintre acesti pacienti au recedivat in timp ce faceau tratament. Progresia bolii a fost asociata cu aparitia celulelor leucemice care prezinta proteine BCR-ABL mutante si blocheaza legarea imatinibului (22), sugerand ca agentii tinta pentru proteinele BCR-ABL mutante vor fi afectati. Au fost descoperiti doi inhibitori BCR-ABL de generatia a doua, dasatinib si nilotinib, care au activitatea impotriva a mai mult de 50 de mutatii rezistente BCR-ABL, iar acesti agenti sunt foarte eficiente impotriva bolilor rezistente la imatinib (33,34).

Totusi, o mutatie comuna BCR-ABL (T315I) previne legarea celor 3 agenti, iar acest lucru a aparut in lipsa unei alele in cazul pacientilor supusi unei terapii cu inhibitori pe termen lung. In vederea rezolvarii acestei probleme au fost descoperite agenti de generatie a treia care pot inhiba proteina BCR-ABL T315I. Acesti agenti au fost eficienti in testele preclinice efectuate pe pacienti cu CML, iar patru dintre acesti compusi se afla in curs de testare clinica. Unii pacienti au supravietuit mai mult de 10 ani de la inceputul tratamentului, prin urmarea unor terapii secventiale cu inhibitori BCR-ABL din cele trei generatii (40). Acest lucru a demonstrat ca este posibil sa se extinda raspunsul terapeutic in CML prin tintirea repetata a aceleasi kinaze. O abordare asemanatoare a fost utilizata si pentru receptorul tirozin kinazic ERBB2 in cancerul de san. Trastuzumab este un anticorp monoclonal care se leaga la domeniul extracelular al ERBB2, in acest mod realizeaza si inhibarea semnalizarii ERBB2 si recrutarea celulelor imune la locul tumorii (19). Totusi, pacientii care au cancer metastatic si sunt tratati cu trastuzumab recidiveaza. Mecanismul de rezistenta la trastuzumab nu este inteles, dar este clar ca tumorile rezistente raman dependente de calea de semnalizare ERBB2. Acest lucru se datoreaza faptului ca pacientii cu cancer de san care au progresat in timpul tratamentului cu trastuzumab, raspund si la lapatinib, o molecula mica inhibitor a domeniul tirozin kinazic al ERBB2. Astfel, este posibil sa induci un al doilea raspuns la acesti pacienti prin tintirea ERBB2 cu un medicament care se leaga la un situs diferit al proteinei. Spre deosebire de CML, raspunsul clinic la lapatinib in cancerul metastatic este scurt, iar boala progreseaza de obicei in cateva luni (14). Aceste exemple demostreaza ca, in unule cazuri, terapia prin tintirea secventiala a unei singure kinaze cu mai multi agenti poate prelungi raspunsul terapeutic. Insa, este neclar cum acest model se aplica, deoarece nu este clar cate tumori sunt intradevar dependente de o singura oncogena. Dovada cea mai buna in favoarea acestei ipoteze este descoperirea unor mutatii rezistente dupa tratamentul cu inhibitor kinazic in CML, GIST, cancerul de plamani si sindromul hiper-eozinofilic (o boala mieloproliferativa) (22-26). Astfel de mutatii sunt dovada definitorie ca pentru supravietuirea tumorii a fost necesara existenta kinazei mutante. Modelul dependentei oncogenei este de asemenea sustinut de multe studii preclinice, care au aratat ca liniile celulare tumorale care contin o mutatie activatoare sau o amplificare a unei kinaze pot fi mai sensibile la inhibitorii acelei kinaze in vitro (42-44). In schimb, detectia unei kinaze oncogenice mutante nu garanteaza

sensibilitatea la inhibitorul kinazic corespunzator. De exemplu, mutatiile in PIK3CA sau PTEN ofera un prognostic slab al sensibilitatii liniilor celulare tumorale la inhibitorii PI3K (31,45). Celulele tumorale care prezinta mutatii in KRAS nu sunt sensibile, in general, la inhibitori ai Raf sau Mek (43,46). Intradevar, raspunsul majoritatii tumorilor la o oncogena inhibitoarea este mai putin evident decat raspunsul in CML, in care, chiar si inhibarea tranzitorie a BCRABL conduce la apoptoza ireversibila a celulelor (44) (fig.2).

Termenul de dependenta oncogenica a devenit din ce in ce mai utilizat, deoarece acesta descrie un paradox: inhibarea unei oncogene ar trebui sa reverseze functia oncogenei, nu sa extirpe toate celulele tumorale. Recent acest termen a fost asociat cu ideea ca oncogenele sunt necesare pentru supravietuirea tumorii. Din aceasta cauza, exista o nevoie evidenta de a indentifica si alti factori vulnerabili in cazul tumorilor in afara de genele care sufera mutatii in mod direct.

Figura 2. Grade de dependenta oncogenica.Trei exemple de dependenta oncogenica din literatura recenta. a. Tratamentul celulelor K252a care prezinta leucemie mieloida cronica cu inhibitorul BCR-ABL imatinib conduce la moarte celulara completa din ziua a 4-a (31). b. Subminarea oncogenei KRASG13D in celulele DLD-1 care prezinta cancer colorectal conduce la incetinirea ratei de proliferare celulara (72). c. Subminarea oncogenei PIK3CAH1047R in celulele Hct-116 (cancer colorectal) conduce la incetinirea ratei de proliferare celulara.

Punctele tinta dintr-o retea de semnalizare

Trei grupuri de tinte importante fac obiectul eforturilor curente in ceea ce priveste descoperirea inhibitorilor kinazici folositi drept agenti. Acestea sunt: receptorii tirozin kinazici (de exemplu: EGFR, ERBB2, receptorul factorului de crestere derivate din plachete (PDGFR) si receptorul 2 VEGF (VEGFR2)), kinazele din calea de semnalizare MAPK (de exemplu: BRAF, MEK1 si MEK2) si kinazele din calea de semnalizare PI3K (de exemplu: PIK3CA, Akt si mTOR). Mecanismele de actiune al acestor trei grupuri de tinte sunt interconectate deoarece, majoritatea receptorilor tirozin kinazici au drept functie elementara activarea cailor de semnalizare MAPK si PI3K (Fig.3). Exista un puternic rationament biologic in ceea ce priveste tintirea combinata a acestor trei grupuri. De exemplu, rezistenta la inhibitorii tirozin kinazici este adesea asociata cu reactivarea caii de semnalizare PI3K (28). De aceea, eficacitatea inhibitorilor tirozin kinazici poate creste prin combinarea cu un inhibitor al caii de semnalizare PI3K (aceasta combinatie s-a dovedit a fi eficienta in cazul animalelor testate). In momentul de fata sunt intreprinse numeroase teste clinice, cel putin 21, care evalueaza efectul combinatiei dintre un inhibitor tirozin kinazic si un inhibitor mTOR in cazul diferitelor tipuri de cancer. S-a pus un accent deosebit pe folosirea inhibitorilor PI3K pentru a sensibiliza tumorile la inhibitori ca EGFR sau ERBB2, cum ar fi erlotinib (47),lapatinib (48) si trastuzumab (49). Acest lucru s-a datorat faptului ca activitatea antitumorala a inhibitorilor EGFR si/sau ERBB2 a fost corelata cu abilitatea acestora de a inhiba fosforilarea lui ERBB3, un receptor kinazic-inactiv, care are drept functie principala activarea caii PI3K (28). Alte combinatii de tinte sunt sugerate prin intermediul conexiunilor realizate de acestea cu reteaua de semnalizare. De exemplu, mTOR activeaza bucla de feedback negativ care inhiba activitatea lui PI3K (Fig.3a). Inhibitorii mTOR, cum ar fi rapamicina, blocheaza aceasta bucla de feedback negativ conducand la hiperactivarea lui PI3K care ar putea contracara efectul antiproliferativ al inhibitiei mTOR. Din acest motiv, s-a presupus ca inhibitia duala a lui PI3K si a lui mTOR ar putea fi mai eficienta, decat inhibarea unei singure tinte. Experimentele preclinice au sustinut aceasta idee (45), si au fost elaborate agenti, cum ar fi PP121, care tintesc mai multe etape din cadrul acestei cai (31) (fig.3a). O serie de inhibitori duali PI3K si mTOR sunt testate, in prezent, in cadrul experimentelor clinice (de exemplu: NVPBEZ235, BGT226 si XL765 ), alaturi de agenti selectivi care tintesc ori PI3K (de exemplu: XL147 si GDC-0941) sau mTOR (de exemplu: OSI-027, AZD8055 si analogii rapamicinei). Terapia combinata poate fi utilizata si in alte cazuri pentru tintirea unei altfel de proteine, care nu este folosita drept medicament. De exemplu, KRAS este una dintre oncogenele care sufera mutatii cel mai frecvent, dar incercarile de a se gasi un inhibitor Ras au esuat. Mult timp s-a crezut ca MAPK este principalul efector Ras in majoritatea tumorilor (51), dar inhibitorii Raf si Mek au activitatea inconsecventa impotriva celulelor tumorale care prezinta mutatii Ras (43,46). De asemenea, Ras se leaga direct la PI3K52 activandu-l, iar aceasta intrerupere previne tumorigeneza cauzata de KRAS la soareci (53). Din aceasta cauza, se pare ca este necesar inhibarea ambelor cai de semnalizare MAPK si PI3K pentru a impedica cresterea tumorilor care prezinta mutatii Ras. Aceasta

concluzie este confirmata de rezultate, care arata ca rezistenta inhibitorilor Mek in celulele KRAS-mutante este cauzata de mutatiile in PIK3CA sau PTEN , iar aceasta rezistenta este reversata de inhibarea PI3K (54). In plus, combinarea inhibitorilor PI3K si Mek este activa in soarecii model care prezinta cancer se plamani cauzat de KRAS (55). Logica acestei combinatii este foarte riguroasa incat Merck si AstraZeneca au anuntat recent realizarea unor experimente clinice care vor testa efectul combinatiei dintre un inhibitor Akt (MK-2206) si un inhibitor Mek (AZD6244) impotriva tumorilor solide (Fig.3b).

Figura 3. Strategii pentru inhibitori kinazici multi-targeted. a. PP121 s-a dovedit a fi eficient in tintirea tirozin kinazei (de exemplu: receptorul 2 al factorului de crestere al endoteliului vascular, BCR-ABL si RET), si a membrilor familiei PI3K (PIK3CA si mTOR). Inhibarea combinatiei dintre mTOR si PI3K de catre PP121 inactiveaza o bucla de feedback negativ in care mTOR inhiba PI3K. b. Combinarea inhibitorului Mek AZD6244 si a inhibitorului Akt MK-2206 conduce la inhibarea ambelor cai de semnalizare MAPK si PI3K. RTK-receptor tirozin kinazic

Limitele combinatiilor de agenti

Dezvoltarea acestor tipuri de agenti reprezinta o provocare deoarece, experimentele preclinice nu pot prezice eficienta acestora la oameni. Acest lucru este valabil chiar si in cazul in care agentii individuali au prezentat activitate antitumorala in clinica. De exemplu, testele preclinice au dovedit eficienta combinatiilor dintre gefitinib si trastuzumab in cancerul de san (56,57), erlotinib si bevacizumab in carcinomul cu cellule renale (58), cetuximab si bevacizumab in cancerul colorectal (59), dar in cazul testelor clinice acestea nu au mai fost eficiente (58,60,61). Combinatia dintre cetuximabului si bevacizumabului a redus supravietuirea celulelor tumorale in comparatie cu agentul individual (60). In unele cazuri, aceste discrepante se pot datora mai degraba interpretarii gresite a datelor preclinice, decat a unei erori in modelul preclinic. De exemplu,

studii amanuntite au demonstrat ca adaugarea gefitinibului la terapia cu trastuzumab in cazul modelelor care prezinta xenogrefe de cancer de san a condus la o crestere modesta a eficientei (62), dar aceasta crestere necesita concentratii de gefitinib care ar putea fi toxice la oameni (63). In alte cazuri, schimbari minore in regimul de dozare pot avea un efect in masa asupra activitatii combinatiei respective. De exemplu, studiile preclinice ale flavopiridolului, un inhibitor kinazic ciclin dependent , si ale irinotecanului, un inhibitor al topoizomerazelor, au demonstrat ca aceasta combinatie poate induce apoptoza in celulele de cancer de colon, doar atunci cand se administreaza in felul urmator: irinotecan urmat de flavopiridol (43% din celule sufera apoptoza) (64). Administrarea inversa conduce la scaderea eficientei (15%), la fel intamplandu-se si daca se foloseste terapia concurenta (30%). Aceasta descoperire are la baza un model, in care tratamentul cu flavopiridol a condus la stoparea ciclului celular in faza G1, astfel reducand numarul celulelor care vor trece prin faza S, mai mult decat atat celulele dobandind sensibilitate la irinotecan (64). Studiile preclinice ale combinatiilor de agenti sunt probabil inclinate spre validarea tintelor care se cunosc deja a fi importante, iar aceasta tendinta limiteaza abilitatea acestora de a prioritiza combinatii noi de agenti pentru a fi folosite in studiile clinice. De exemplu, toti inhibitorii kinazelor au o anumita toxicitate celulara, si de aceea doi inhibitori kinazici pot fi mai toxici impreuna decat separate. Pentru un grup mic de kinaze tinta (receptorii tirozin kinazici oncogenici si componentele principale ale cailor de semnalizare PI3K si MAPK) se desfasoara si sunt planificate numeroase teste clinice, deoarece acest grup prezinta rol indiscutabil in terapia cancerului. Totusi, nu este chiar atat de sigur ca aceste kinaze reprezinta cea mai buna tinta terapeutica in cancer (67), si ca alti agenti care tintesc alte kinaze nu pot fi la fel, sau chiar mai eficienti.

Utilizarea ARNi pentru descoperirea de noi tinte

Descoperirea ARN de interferenta (ARNi) a facut posibila scanarea directa a genelor necesare proliferarii tumorale in celulele mamaliene. Aceste scanari au doua avantaje:

se pot identifica noi agenti tinta, adica orice gena care blocheaza selectiv cresterea tumorii atunci cand expresia acesteia este blocata de ARNi se pot genera modele corecte de cai de semnalizare implicate in evolutia tumorala, deoarece se examineaza care gena este mai importanta pentru supravietuirea celulelor tumorale Aceasta perspectiva este valoroasa, deoarece majoritatea terapiilor combinate sunt bazate pe modele simple de semnalizare. Totusi, exista putine date care sa demonstreze ca aceste modele cuprind interactiile cele mai importante din celulele tumorale. Exista trei lucrari recente care pun in evidenta importanta folosirii ARNi in cazul celulelor tumorale care exprima proteina KRAS mutanta activa 72-74. Luo et al., au scanat aproximativ 75000 de molecule scurte de ARN hairpin (shRNAs) si au gasit 83 de astfel de molecule care tintesc 77 de gene care conduc la cresterea defectuoasa a celulelor KRASG13D comparate cu un control in care alelele KRASG13D au fost distruse prin recombinare omoloaga (72). Analiza acestor date au condus la o imbogatire neasteptata a grupului de gene implicate in mitoza. O molecula mica inhibitor a kinazei mitotice (kinaza polo-like 1 PLK1) a crescut nivelul citotoxicitatii la celulele mutante KRAS in vitro si in vivo 72. Scholl et al. au scanat un set de molecule shRNAs (5024 care tintesc 1011 gene) dintr-o serie de 8 linii celulare tumorale (4 KRASG13D mutante and 4 KRAS de tip salbatic) si 2 linii celulare de control (73). Principala descoperire a fost ca o serin treonin kinaza din familia calmodulin kinazelor STK33, despre care nu se stia ca ar fi implicata in semnalizarea Ras sau cancer. STK33 (tinta pentru shRNAs) a indus mutatii in KRAS dependente de toxicitate in cadrul unor linii celulare tumorale, printr-un mecanism care ar putea implica modificarea activitatii S6K1 kinazei (73). Barbie et al. au scanat, de asemenea, un set de molecule shRNAs care au tintit kinaze, fosfataze si oncogene dintr-o serie de 19 linii celulare tumorale. Apoi acestia au identificat genele necesare pentru supravietuirea celulelor KRAS mutante (74). Principalul compus descoperit a fost TNK1, o protein kinaza care activeaza semnalizarea factorului nuclear B (NF-B) prin fosforilarea proteinei inhibitor NF-B, IB. O alta lucrare a demonstrat ca inhibarea caii de semnalizare NF-B este suficienta pentru a bloca dezvoltarea tumorii la soarecii cu adenocarcinom de plamani cauzat de KRAS. O descoperire comuna a acestor trei lucrari a fost aceea ca, desi sunt necesare mai multe gene pentru supravietuirea celulelor KRAS mutante,

putine dintre acestea au fost estimate in cadrul interactiilor biochimice cunoscute sau in modelele caii de semnalizare Ras.

Folosirea medicamentelor pentru descoperirea de kinaze tinta Din punct de vedere istoric majoritatea medicamentelor au fost descoperite deoarece acestea prezentau activitate in celule, mecanismele de actiune si tintele acestora fiind elucidate mai tarziu. Acest lucru se numeste descoperire bazata pe fenotip (phenotype-based) deoarece fenotipul s-a descoperit inaintea tintei. In mod contrar, azi toate descoperirile sunt bazate pe tinta (target-based), ceea ce inseamna ca in primul rand este selectata tinta, pe baza unor ipoteze despre rolul acesteia in boala. Totusi, au existat situatii cand descoperirea bazata pe fenotip a contribuit la dezvoltarea inhibitorilor kinazici pentru cancer, desi nu in mod intentionat. Un exemplu in aceasta directie este sorafenib, care a fost desemnat initial ca fiind un inhibitor al Raf, plecand de la premiza ca inhibarea Raf ar putea fi eficienta pentru tumorile Ras mutante (81). Studiile clinice inca demonstreaza beneficiile sorafenibului in tratarea tumorilor care contin mutatii Ras, cum ar fi cancerul de plamani si pancreatic. In ceea ce priveste tratarea melanomei (o boala care are o frecventa ridicata de mutatii BRAF) sorafenibul s-a dovedit a fi ineficient (43,83). Totusi, in studiile clinice timpurii realizate pe sorafenib au fost observate raspunsuri in doua tipuri neasteptate de tumori (84) : cancerul de rinichi si de ficat. In prima faza a experimentului un pacient care prezenta cancer de rinichi, s-a stabilizat pentru 2 ani de zile (84), conducand la continuarea studiilor si aprobarea sorafenibului pentru tratarea cancerului de rinichi (si recent pentru cancerul de ficat). Eficienta sorafenibului in cancerul de rinichi este azi atribuita mai degraba inhibarii VEGFR2 in celulele endoteliale, care conduce la blocarea angiogenezei, decat inhibarii proteinei Raf. Studiile preclinice au demonstrat ca inhibarea unei tinte suplimentare (PDGFR in pericite) ar putea fi importanta (85). De aceea, sorafenibul probabil blocheaza cresterea celulelor tumorale prin inhibarea a doua kinaze exprimate in tesuturi diferite, nici una dintre ele nefiind tinta destinata a medicamentului. Imatinibul este un al doilea exemplu de descoperire intamplatoare a tintei. Dupa aprobarea initiala in tratarea CML, imatinibul a fost testat pe 5 pacienti cu sindrom hipereozinofilic, o boala a carei origini moleculare nu sunt

cunoscute. Logica tratamentul a fost aceea ca medicamentele care au efect in CML sunt uneori eficiente si pentru pacientii cu hipereozinofilie (86) (desi mecanismul de actiune al altor medicamente, cum ar fi hidroxiurea sau interferon-, nu are legatura cu mecanismul de actiune al imatinibului). Remarcabil, 4 dintre cei 5 pacienti tratati cu imatinib au prezentat un raspuns hematologic complet, astfel incat acestia au fost capabili sa intrerupa alte terapii. Analiza ADN din leucocitele acestor pacienti a condus la descoperirea unui rearanjament cromozomal care genereaza fuziunea dintre PDGFRA si FIP1L1, producand o kinaza PDGFR activa constitutiv (24). PDGFR face parte dintr-un numar restrans de kinaze inhibate de imatinib, acest lucru sugerand ca activarea PDGFR a fost probabil cauza bolii. Acest fapt a fost confirmat de descoperirea unei mutatii rezistente T675I in PDGFR la pacientii care au recidivat dupa terapia cu imatinib (24). Asa cum se poate observa din aceste exemple, avantajul folosirii medicamentelor pentru a identifica diferite tinte in cancer este acela ca se pot descoperi, in mod absolut corect, proteinele esentiale din tumora respectiva. Principala limita a acestui aspect este aceea a dificultatii de a identifica tintele unei molecule care prezinta un mod de actiune necunoscut (87).

Compusi farmacologici tintiti

In cazul sorafenibului si imatinibului a fost usor sa se identifice tintele relevante, deoarece se stia aproape sigur ca tintele erau kinaze. Posibilitatile au putut fi testate rapid, deoarece aceste doua medicamente au numar mic de tinte (mai putin de 20). O trasatura unica a acestor inhibitori kinazici este aceea ca prezinta un potential mai mare pentru a fi utilizate drept tinte, decat aproape orice alt tip de medicament. Acest lucru se datoreaza faptului ca superfamilia kinazelor (incluzand proteinele inrudite structural, lipidele si moleculele kinazici mici) este cea mai mare familie de gene ce pot fi tratate, care se leaga la un substrat comun (ATP). Din acest punct de vedere kinazele difera de alte familii mari de gene, cum ar fi receptorii cuplati cu proteine G, care interactioneaza la situsul de legare cu diversi liganzi, incluzand peptide si molecule mici. Activitatea majoritatii inhibitorilor kinazici in celule este corelat cu parametri biochimici, care pot fi masurati in vitro, cum ar fi constanta de

disociere (KD) a medicamentului si constanta MichaelisMenten de legare a ATP la kinaza (KM,ATP) (88). Deoarece kinazele au devenit niste tinte importante in terapie, masurarea acestor parametri biochimici a fost introdusa in industrie, iar acum exista un numar mare de furnizori care ofera o scanare a kinazelor (aproximativ jumatate din numarul total de kinaze din genomul uman a fost scanat) (fig.4a). Deoarece costurile compusilor necesari scanarii kinazelor au scazut, a avut loc selectarea doar a acelor experimente care sunt fezabile (Fig.4b). In 2008, cercetatorii de la GlaxoSmithKline au raportat testarea unui tablou de 577 de inhibitori kinazici diversi impotriva a 203 kinaze (mai mult de 117000 de perechi unice kinaza-medicament) (91). In acest caz scopul nu a fost evaluarea vreunui compus specific, ci caracterizarea proprietatilor selective ale inhibitorilor kinazici drept o clasa de medicamente. Existenta acestor date de selectivitate va permite chimistilor medicali sa se axeze mai degraba pe optimizarea profilului medicamentelor, decat pe maximizarea specificitatii unei singure tinte. Principalul avantaj al acestei abordari este acela ca permite descoperirea de tinte care nu au fost estimate, dar care sunt optime pentru a fi folosite in tratarea cancerului. Intre timp chimistii medicali vor optimiza compusul respectiv prin masuratori biochimice ale proteinei purificate.

Figura 4. Profilul de selectivitate a inhibitorilor kinazici. a. Numarul de kinaze disponibil pentru screening de la diferiti furnizori pe an. Numarul total de protein kinaze din genomul uman este de aproximativ 520, plus un numar mic de lipide si kinaze cu molecula mica. b. Numeroase lucrari despre profilul de selectivitate a inhibitorilor kinazici (89-91,93,96,97) sunt prezentate in comparatie cu masuratorile de selectivitate (kinaze*medicamente). Sunt prezentate trei abordari diferite care masoara legarea inhibitorului.

Knight et al., 2010 au analizat baza de date a selectivitatii inhibitorilor

kinazici (93) pentru a descoperi daca anumite combinatii de kinaze tinta se regasesc printre inhibitorii kinazici cunoscuti; daca preferinta pentru aceste combinatii de tinte poate fi explicata logic pe baza analizei secventelor; si daca aceste date pot fi utilizate pentru a estima combinatiile cele mai eficiente, care nu au fost inca tintite de o molecula mica (Fig.5). Acestia au descoperit ca exista clustere ale kinazelor care au tendinta de a fi inhibate de un medicament similar, dar, de asemenea exista multe combinatii care ar trebui sa fie accesibile dar inca raman nedescoperite. Aceasta descoperire ofera o oportunitate importanta pentru a descoperi inhibitori kinazici multi-targeted cu activitati biologice noi. Knight et al., 2010 s-au axat pe descoperirea unor combinatii de kinaze tinta cu o activitate antitumorala crescuta, dar intelegerea toxicitatii mediate de inhibitorii kinazici a celulelor normale este de asemenea valoroasa. Indepartarea acestei toxicitati sistemice pentru noile medicamente va permite o inhibare completa a tintelor din celulele tumorale.

Figura 5. Compusii farmaceutici implicati in totalitatea kinazelor din genomul uman. Perechile de kinaze au fost asociate pe baza datelor de selectivitate furnizate de o gama larga de inhibitori scaffold si pe baza secventelor conservate ale situsurilor de legare a ATP. Perechile de kinaze care au un inhibitor comun (constanta de disociere comuna KD