rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

63
Universitatea de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași Facultatea de Farmacie CONTRIBUȚII LA IDENTIFICAREA ȘI CARACTERIZAREA UNOR EXTRACTE VEGETALE DIN SPECII INDIGENE SAU ACLIMATIZATE ÎN ROMÂNIA CU ACȚIUNE FAVORABILĂ ÎN AFECȚIUNILE NEURODEGENERATIVE REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Coordonator științific, Prof. univ. dr. Monica HĂNCIANU Doctorand, Biolog Veronica GRĂDINARIU Investeşte în oameni! FONDUL SOCIAL EUROPEAN prin Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013 Axa prioritara 1 “Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere” Domeniul major de interventie 1.5 “Programe doctorale şi postdoctorale în sprijinul cercetării” Titlu proiect: “Program de excelenta in cercetare doctorala si postdoctorala multidisciplinara in bolile cronice” Numarul de identificare al contractului: POSDRU/159/1.5/S/133377 Beneficiar: Universitatea de Medicina si Farmacie "Grigore T. Popa" Iasi IAȘI, 2015

Transcript of rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

Page 1: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

Universitatea de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași

Facultatea de Farmacie

CONTRIBUȚII LA IDENTIFICAREA ȘI

CARACTERIZAREA UNOR EXTRACTE VEGETALE

DIN SPECII INDIGENE SAU ACLIMATIZATE ÎN

ROMÂNIA CU ACȚIUNE FAVORABILĂ ÎN

AFECȚIUNILE NEURODEGENERATIVE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Coordonator științific,

Prof. univ. dr. Monica HĂNCIANU

Doctorand,

Biolog Veronica GRĂDINARIU

Investeşte în oameni!

FONDUL SOCIAL EUROPEAN prin Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013

Axa prioritara 1 “Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere”

Domeniul major de interventie 1.5 “Programe doctorale şi postdoctorale în sprijinul cercetării”

Titlu proiect: “Program de excelenta in cercetare doctorala si postdoctorala multidisciplinara in bolile cronice”

Numarul de identificare al contractului: POSDRU/159/1.5/S/133377

Beneficiar: Universitatea de Medicina si Farmacie "Grigore T. Popa" Iasi

IAȘI, 2015

Page 2: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept
Page 3: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

Componența comisiei de doctorat:

PREȘEDINTE: Prof. univ. dr. Lenuța Profire

Universitatea de Medicină și Farmacie ”Grigore T. Popa”, Iași

CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC:

Prof. univ. dr. Monica Hăncianu

Universitatea de Medicină și Farmacie ”Grigore T. Popa”, Iași

REFERENȚI OFICIALI:

Prof. univ. dr. Cerasela Elena Gîrd

Universitatea de Medicină și Farmacie ”Carol Davila”,

București

Conf. univ. dr. Habil. Lucian Hrițcu

Universitatea Alexandru Ioan Cuza, Iași

Prof. univ. dr. Anca Miron

Universitatea de Medicină și Farmacie ”Grigore T. Popa”, Iași

Page 4: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

Teza de doctorat cuprinde:

156 de pagini

32 de tabele

60 de figuri

366 indicații bibliografice

În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru

cuprins, tabele și figuri.

Cuvinte-cheie: Ocimum, uleiuri volatile, extracte vegetale,

activitate antioxidantă, activitate neuroprotectoare.

Stagiul realizat la Departamentul de Neurobiologie,

Universitatea Osnabrueck, Germania, în perioada ianuarie –

aprilie 2013 a reprezentat un real ajutor în formarea mea

profesională.

Rezultatele științifice obținute pe parcursul studiilor doctorale

sunt datorate și statutului de bursier în cadrul proiectului

"Program de excelență în cercetare doctorală și postdoctorală

multidisciplinară în bolile cronice",

POSDRU/159/1.5/S/133377, statut pe care l-am avut în perioada

iulie 2014 – septembrie 2015.

Page 5: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

1

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT

MULȚUMIRI

ABREVIERI

PARTEA GENERALĂ– stadiul actual al cunoașterii

Capitolul I. Cunoștințe farmacobotanice, fitochimice și biologice actuale

privind speciile Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth. și Ocimum sanctum Linn.

I.1. Încadrare sistematică

I.2. Ocimum basilicum L.

I.2.1. Descriere botanică

I.2.2. Compoziție chimică

I.2.3. Acțiuni biologice

I.2.4. Utilizări

I.3. Ocimum basilicum var. purpurascens Benth.

I.3.1. Descriere botanică

I.3.2. Compoziție chimică

I.3.3. Acțiuni biologice

I.3.4. Utilizări

I.4. Ocimum sanctum Linn.

I.4.1. Descriere botanică

I.4.2. Compoziție chimică

I.4.3. Acțiuni biologice

I.4.4. Utilizări

Capitolul II. Rolul și importanța unor extracte de origine vegetală în

terapia bolilor neurodegenerative (Alzheimer și Parkinson)

II.1. Maladia Alzheimer

II.1.1. Etiopatogenia maladiei Alzheimer

II.1.2. Farmacoterapie

II.2. Maladia Parkinson

II.2.1. Etiologia maladiei Parkinson

II.2.2. Farmacoterapie

II.3. Implicațiile unor extracte de origine vegetală în terapia bolilor

neurodegenerative

II.3.1. Neuroprotecția în maladia Alzheimer

II.3.2. Proprietățile neuroprotectoare ale extractelor de busuioc

II.3.3. Neuroprotecția în maladia Parkinson

II.3.4. Proprietățile farmacologice ale extractelor de busuioc pe

modele animale de maladie Parkinson

PARTEA PERSONALĂ

MOTIVAREA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI, SCOPUL ȘI

OBIECTIVELE URMĂRITE

Capitolul III. Analiza farmacognostică macro- și microscopică a probelor

de busuioc luate în studiu (Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn.)

III.1. Identificarea speciilor luate în studiu; caractere morfologice

iv

v

1

1

1

3

3

4

7

11

13

13

13

14

15

15

15

16

17

21

22

23

23

32

33

33

35

35

35

37

38

39

41

45

45

Page 6: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

2

III.1.1. Material și metodă

III.1.2. Rezultate și discuții

III.2. Evidențierea caracterelor histo-anatomice ale produselor Ocimi basilici herba, Ocimi sanctum herba și Basilici purpurascens herba prin analiză

microscopică

III.2.1. Material și metodă

III.2.2. Rezultate și discuții

III.3. Concluzii

Capitolul IV. Studiul chimic al uleiurilor volatile și extractelor obținute

din cele trei specii de Ocimum (Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum

var. purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn.)

IV.1. Obținerea și analiza chimică a uleiurilor volatile din părțile aeriene ale

speciilor de Ocimum luate în studiu

IV.1.1. Obținerea uleiurilor volatile

IV.1.1.1. Material și metodă

IV.1.1.2. Rezultate și discuții

IV.1.2. Analiza calitativă a uleiurilor volatile

IV.1.2.1. Analiza calitativă a uleiurilor volatile prin gaz-

cromatografie cuplată cu spectrometrie de masă

(GC-MS)

IV.1.2.1.1. Material și metodă

IV.1.2.2. Analiza cantitativă a uleiurilor volatile utilizând

tehnica GC-FID

IV.1.2.2.1. Material și metodă

IV.1.2.3. Rezultate și discuții

IV.2. Obținerea și analiza chimică a extractelor etanolice din părțile aeriene de

Ocimum luate în studiu

IV.2.1. Obținerea extractelor etanolice

IV.2.2. Analiza chimică calitativă a componentelor bioactive

prezente în extractele etanolice

IV.2.2.1. Material și metodă

IV.2.2.2. Rezultate și discuții

IV.2.3. Analiza chimică cantitativă a componentelor bioactive

prezente în extractele etanolice

IV.2.3.1. Determinarea cantitativă a flavonoidelor

IV.2.3.1.1. Material și metodă

IV.2.3.2. Determinarea spectrofotometrică a

acizilor polifenolici

IV.2.3.2.1. Material și metodă

IV.2.3.3. Determinarea cantitativă a polifenolilor

totali

IV.2.3.3.1. Material și metodă

IV.2.3.4. Rezultate și discuții

IV.2.4. Determinarea HPLC a flavonoidelor și acizilor

polifenolcarboxilici

IV.2.4.1. Material și metodă

IV.2.4.2. Rezultate și discuții

45

45

49

49

49

53

55

56

57

57

57

58

58

59

59

59

60

65

65

66

66

68

70

70

70

72

72

74

74

76

78

78

84

Page 7: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

3

IV.3. Concluzii

Capitolul V. Evaluarea activității antioxidante a unor extracte vegetale

obținute din specii de Ocimum

V.1. Studiul activității antioxidante in vitro a extractelor etanolice

V.1.1. Determinarea capacității de scavenger de radicali liberi

(DPPH)

V.1.1.1. Material și metodă

V.1.1.2. Rezultate și discuții

V.1.2. Determinarea capacității de chelatare a ionului feros

V.1.2.1. Material și metodă

V.1.2.2. Rezultate și discuții

V.2. Determinarea capacității antioxidante in vitro a uleiurilor volatile

V.2.1. Determinarea capacității de scavenger de radicali liberi

(DPPH)

V.2.1.1. Material și metodă

V.2.1.2. Rezultate și discuții

V.3. Concluzii

Capitolul VI. Evaluarea in vivo a activității neuroprotectoare a uleiurilor

volatile de Ocimum pe model animal de Alzheimer indus experimental

VI.1. Inducerea experimentală a modelului animal de maladie Alzheimer

VI.1.1. Material și metodă

VI.1.1.1. Inducerea modelului animal experimental

cu ajutorul beta-amiloidului

VI.1.1.2. Administrarea uleiurilor volatile la

animalele incluse în studiu

VI.2. Teste comportamentale

VI.2.1. Testul labirintului Y

VI.2.1.1. Mod de lucru

VI.2.1.2. Rezultate și discuții

VI.2.2. Testul labirintului cu brațe radiale

VI.2.2.1. Mod de lucru

VI.2.2.2. Rezultate și discuții

VI.2.3. Testul elevated-plus maze

VI.2.3.1. Mod de lucru

VI.2.3.2. Rezultate și discuții

VI.2.4. Testul de înot forțat

VI.2.4.1. Mod de lucru

VI.2.4.2. Rezultate și discuții

VI.3. Concluzii

Capitolul VII. Evaluarea acțiunii uleiurilor volatile din specii de Ocimum

asupra statusului biochimic pe omogenate de creier provenite de la

animale cu patogenie Alzheimer indusă experimental

VII.1. Material și metodă

VII.2. Determinarea activității superoxid dismutazei

VII.2.1. Material și metodă

VII.2.2. Rezultate și discuții

VII.3. Determinarea activității glutation peroxidazei

86

88

88

89

89

90

93

94

95

97

98

98

99

102

103

104

104

104

105

106

106

106

106

109

109

110

112

112

112

115

115

116

119

121

122

123

123

123

125

Page 8: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

4

VII.3.1. Material și metodă

VII.3.2. Rezultate și discuții

VII.4. Determinarea activității catalazei

VII.4.1. Material și metodă

VII.4.2. Rezultate și discuții

VII.5. Determinarea activității malondialdehidei

VII.5.1. Material și metodă

VII.5.2. Rezultate și discuții

VII.6. Concluzii

Capitolul VIII. Concluzii generale. Gradul de originalitate. Perspective

de cercetare

CONCLUZII GENERALE

GRADUL DE ORIGINALITATE

PERSPECTIVE DE CERCETARE

BIBLIOGRAFIE

LUCRĂRI PUBLICATE IN EXTENSO DIN TEMATICA TEZEI DE

DOCTORAT

În reviste cotate ISI

125

125

126

127

127

128

129

129

131

132

132

135

135

136

155

155

Page 9: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

5

MOTIVAREA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI, SCOPUL

ȘI OBIECTIVELE URMĂRITE

Prevalenţa afecţiunilor neurodegenerative este în continuă

creştere, fiind corelată în mod direct cu standardul de viaţă ridicat al

societății moderne. Maladia Alzheimer reprezintă forma cea mai

comună de demență, fiind întâlnită la persoanele în vârstă de peste

65 de ani. Se estimează că, la nivel mondial, până în anul 2030, 76

milioane de persoane vor fi diagnosticate cu această maladie.

Maladia Alzheimer este rezultatul unui proces multifactorial

ce declanșează o cascadă de reacţii neuropatologice şi

neuroimunologice la nivelul sistemului nervos central, fiind

caracterizată prin pierderea progresivă a memoriei şi degradarea

funcţiilor cognitive şi emoţionale.

Din punct de vedere clinic, maladia Alzheimer se

caracterizează prin disfuncții ale memoriei de scurtă și lungă durată,

dificultăți de vorbire, deprecierea personalității, dificultăți cognitive și de relaționare, afectarea capacității decizionale, dificultăți în

efectuarea activităților zilnice curente, probleme cu orientarea în

timp și spațiu.

Semnele patologice ale acestei maladii includ pierderi

neuronale, care la rândul lor sunt determinate de acumulări excesive

extracelulare de amiloid beta, Aβ (1-42) (plăci senile) și de

depozitarea intracelulară a benzilor neurofibrilare (NFT), alcătuite

din proteine tau hiperfosforilate. Aceste pierderi neuronale conduc la

degradarea proiecţiilor colinergice, noradrenergice şi serotonergice.

Procesele inflamatorii sunt declanşate de activarea de către factorii

proinflamatori a microgliilor şi astrocitelor, ce vor fi cantonate în

jurul plăcilor de amiloid. Apoptoza neuronală este localizată în

special în lobul temporal median, în regiunea CA3 hipocampică,

extinzându-se la nivelul nucleului amigdalian și, ulterior, a

cortexului frontal [159; 167].

Maladia Parkinson, considerată, după maladia Alzheimer, a

doua formă de demență din punct de vedere al incidenței, este o tulburare neurodegenerativă cronică. Se estimează că, la ora actuală,

10 milioane de oameni suferă de această boală.

Maladia Parkinson este caracterizată clinic prin deficienţe

Page 10: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

6

motorii specifice: tremor, bradikinezie, rigiditate musculară,

instabilitate posturală. Totuşi, cu mult timp înainte de afectarea

funcţiilor motorii, are loc o deteriorare a unor funcţii non-motorii,

ceea ce determină apariția hipotensiunii ortostatice, oboselii,

anxietății, depresiei, insomniei, problemelor de memorie, confuziei,

afecțiunilor tractului urinar, constipaţiei, toate acestea putând afecta

şi deteriora semnificativ calitatea vieţii pacientului.

La nivel cerebral, sunt afectați neuronii dopaminergici din

substantia nigra şi ganglionii bazali, cu diminuarea producerii și

eliberării dopaminei, urmată de pierderea progresivă a funcţiilor

motorii normale. De asemenea, sunt prezente și agregate

intraneuronale de proteine, α-sinucleină (corpii Lewy), lucru ce

afectează semnificativ funcția mitocondrială [283].

La ora actuală, numai în Statele Unite ale Americii, costul

estimat pentru pacienții cu maladie Alzheimer se ridică la peste 226

bilioane de dolari. Se preconizează că în anul 2050 costurile pentru

pacienții cu orice formă de demență vor atinge valoarea de 1,1

trilioane de dolari. Afecțiunile neurodegenerative au implicații majore asupra

calității vieții pacienților. Degenerarea neuronală cauzează, mai ales,

afectarea capacității de integrare psiho-socială, dificultăți în

efectuarea activităților zilnice curente, precum și aspecte legate de

manipulare și independență, ceea ce face ca pacientul să necesite,

aproape în permanență, și, cu precădere, în stadiile avansate ale

bolilor, supraveghere și ajutor medical specializat.

Declinul în plan intelectual, asociat cu deprecierea calității

activităților cotidiene uzuale ale pacientului, cum ar fi spălatul,

îmbrăcatul, alimentarea, igiena persoanlă, impune ca principala

preocupare a aparținătorilor să fie aceea de a prelungi și păstra, cât

mai mult timp, o oarecare independență și un sentiment de încredere

în sine ale pacientului.

Evoluția lentă a bolii, cu degradarea funcțiilor cognitive,

dar și psihice, determină, în timp, apariția tulburărilor

comportamentale (ce pot merge până la violență fizică manifestată

împotriva aparținătorilor sau a personalului medical) și, ulterior, a celor motorii, cu imobilizare la pat în faza severă a maladiei. Aceste

evenimente pot avea un impact psihic semnificativ asupra

aparținătorilor. Astfel, aceștia trebuie consiliați și asistați

Page 11: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

7

corespunzător, pregătiți să fie capabili să vină în întâmpinarea

nevoilor și îngrijirilor speciale ale pacientului.

La ora actuală, în farmacoterapia bolii Alzheimer sunt

înregistrate şi utilizate, în funcţie de diagnostic, câteva clase de

medicamente:

• inhibitori ai acetilcolinesterazei: donepezil [231],

galantamina [284];

• inhibitori ai acetilcolinesterazei şi butirilcolinesterazei:

rivastigmina [285];

• modulatori glutamatergici: memantina [238].

Inhibitorii de colinesterază acţionează prin creșterea

concentrației cerebrale, dar și periferice, de acetilcolină, ceea ce

determină apariția unor reacții adverse, precum creşterea secreţiei

gastrice acide, creşterea secreţiei bronşice, tulburări de ritm cardiac,

coșmaruri, greaţă, vărsături, anorexie şi diaree.

Donepezil este cel de-al doilea inhibitor de colinesterază

apărut pe piață după tacrin. Este un inhibitor selectiv al

acetilcolinesterazei, dezvoltând o acţiune procolinergică. Efectele adverse cel mai frecvent întâlnite sunt greaţă, diaree, cefalee şi

insomnie.

Rivastigmina inhibă selectiv acetilcolinesteraza şi

butirilcolinesteraza, având o acţiune colinomimetică. Este

administrat (emplastre) în formele ușoare, moderate și severe ale

maladiei. Stabilizează tulburările de comportament și funționale.

Cele mai frecvent raportate efecte adverse sunt cele

gastrointestinale: greaţă, vomă, anorexie.

Galantamina este un inhibitor selectiv de acetilcolinesterază.

Ca și rivastigmina, galantamina, administrată sub formă de capsule

retard, are rol în stabilizarea tulburărilor de comportament și a

tulburărilor funcționale, efectele adverse apărute fiind similare.

Studiile privind administrarea galantaminei în tratamentul

tulburărilor cognitive uşoare, au arătat că mortalitatea fost de până

la trei ori mai mare, comparativ cu placebo.

Inhibitorii de colinesterază se pot administra în combinaţie

cu antagonişti ai receptorilor glutamatergici. Memantina este un antagonist şi modulator al receptorilor glutamatergici NMDA,

administrarea sa fiind recomandată în demenţa severă şi moderat

severă. Memantina a arătat o tolerabilitate și efectivitate ridicate în

Page 12: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

8

doze zilnice unice, astfel că această tactică de administrare a fost

acceptată începând cu anul 2008. Totuși, administrarea a fost

asociată cu apariţia efectelor adverse precum, sedarea, confuzia,

cefaleea şi constipaţia.

Tratamentul simptomatic al pacienţilor cu maladie Parkinson

are în vedere atenuarea simptomelor prin restabilirea circuitelor

dopaminergice şi a sinapselor striatumului. Principalul medicament

folosit la ora actuală în vederea ameliorării simptomelor maladiei

Parkinson, levodopa, este un precursor natural al dopaminei, fiind

administrat sub formă de tablete sau capsule. Deşi tratamentul cu

levodopa poate restabili continuitatea circuitelor dopaminergice,

odată cu progresul bolii şi apoptoza neuronilor dopaminergici, doza

de levodopa este eficientă pentru perioade tot mai scurte de timp.

Prin urmare, starea pacienţilor se înrăutăţeşte, în ciuda administrării

medicamentului.

În cadrul tratamentului, levodopa este asociată cu carbidopa

sau benzerazidă în vederea optimizării eficienței terapiei, dar și a

diminuării efectele secundare (grețuri, vărsături, amețeală, somnolență).

Cauzele principale ale procesului neurodegenerativ sunt cele

endogene şi cele de mediu. Dintre mecanismele patogene comune

care determină apoptoza neuronală specifică bolilor

neurodegenerative, amintim: agregarea anormală a proteinelor,

formarea în exces a speciilor reactive de oxigen, stresul oxidativ.

Speciile reactive de oxigen (anionul superoxid, radicalul

hidroxil, peroxidul de hidrogen) sunt rezultate în urma unor reacții

normale, dar și anormale ce au loc în corpul uman. În organsimul

pacienților diagnosticați cu diferite afecțiuni neurodegenerative,

sistemele antioxidante endogene (superoxid dismutază, catalază,

glutation peroxidază) nu fac faţă supraproducţiei de specii reactive

de oxigen, conducând la instalarea stării de stres oxidativ. Această

supraproducție de specii reactive de oxigen va determina

amplificarea reacțiilor de peroxidare a lipidelor membranare,

proteinelor, acizilor nucleici, crescând riscul instalării apoptozei

neuronale şi a simptomelor aferente. Sistemul nervos central este vulnerabil față de radicalii

liberi de oxigen datorită concentrațiilor mari de lipide polinesaturate

din membranele neuronilor. Astfel, datorită consumului mare de

Page 13: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

9

oxigen și a metabolismului crescut, țesutul cerebral este predispus

agresiunilor de tip oxidativ.

Bolile neurodegenerative reprezintă, poate, cea mai

importantă problemă a sistemelor medicale din țările dezvoltate,

preconizându-se o creștere substanțială a incidenței acestor boli și în

alte țări de pe glob, pe măsura îmbunătăţirii standardului de viaţă.

Astfel, devine impetuos necesară dezvoltarea de soluții

durabile și integrate de tratament și asistență medicală, colaborând

activ și eficient cu pacienții și, mai ales, cu aparținătorii.

Totodată, este necesară accelerarea identificării de noi

substanțe care să îmbunătățească fie prognosticul bolii, fie, împreună

cu tratamentul de bază, să prelungească autonomia pacientului ce

devine tot mai depentent de îngrijirea de specialitate și atenția

aparținătorilor sau a personalului medical.

Genul Ocimum este larg răspândit și cunoscut atât în

medicina tradițională, cât și în gastronomie. Nu doar utilizările

tradiționale, dar și studii recente recomandă speciile acestui gen

pentru efecte terapeutice care pot fi avantajoase în afecțiunile neurodegenerative.

Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn. reprezintă speciile

luate în studiu în această teză de doctorat.

În contextul descris, principalele obiective ale cercetărilor

întreprinse au fost:

Stabilirea caracterelor morfologice și histo-

anatomice ale produselor vegetale luate în studiu:

Ocimi basilici herba, Ocimi sanctum herba și

Basilici purpurascens herba,

Studiul chimic al fracțiunilor volatile izolate din

cele trei surse vegetale,

Caracterizarea conținutului în polifenoli și flavone

a trei extracte etanolice realizate din Ocimum

basilicum L., Ocimum basilicum var. purpurascens

Benth., Ocimum sanctum Linn.,

Evaluarea potențialului antioxidant in vitro pentru uleiurile volatile și pentru extractele etanolice

obținute,

Page 14: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

10

Studiul potențialului neuroprotector al fracțiunilor

volatile pe model experimental de maladie

Alzheimer,

Evaluarea activității antioxidante in vivo a

fracțiunilor volatile obținute de la speciile Ocimum

basilicum L. și Ocimum sanctum Linn..

Page 15: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

11

Capitolul III. Analiza farmacognostică macro- și microscopică

a probelor de busuioc luate în studiu (Ocimum basilicum L.,

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth., Ocimum sanctum

Linn.)

Studiul macroscopic a urmărit precizarea caracteristicilor

morfologice a părților aeriene înflorite provenite de la speciile

Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var. purpurascens Benth.,

Ocimum sanctum Linn..

Studiul histo-anatomic a presupus analiza microscopică a

pulberilor obținute din somitățile celor trei specii de Ocimum luate în

studiu.

Toate cele trei specii s-au evidențiat prin prezența unui

număr mare de peri glandulari secretori bicelulari și octocelulari (fig. III.9, III.10).

Figura III.1. Somitățile aeriene înflorite la speciile Ocimum basilicum L.

(1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2), Ocimum sanctum

Linn. (3)

Studiul microscopic a mai evidențiat prezența perilor tectori

pluricelulari verucoși, a celulelor endocarpice cu îngroșări

moniliforme, a elementelor conducătoare, precum și a epidermelor

frunzelor și tulpinilor (fig. III.8 – 12).

Page 16: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

12

Figura III.2. Aspect al tulpinii tetramuchiate (detaliu) la speciile Ocimum

basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2), Ocimum sanctum Linn. (3)

Figura III.3. Aspectul macroscopic al frunzelor (fața superioară) la speciile Ocimum basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2),

Ocimum sanctum Linn. (3)

Figura III.5. Aspectul macroscopic al inflorescențelor la speciile Ocimum basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2), Ocimum

sanctum Linn. (3)

Page 17: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

13

Figura III.8. Aspectul microscopic (x40) al perilor tectori verucoși la

speciile Ocimum basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2), Ocimum sanctum Linn. (3)

Figura III.9. Aspectul microscopic (x40) al perilor glandulari bicelulari la

speciile Ocimum basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens

Benth. (2), Ocimum sanctum Linn. (3)

Figura III.10. Aspectul microscopic (x40) al perilor glandulari octocelulari

la speciile Ocimum basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2), Ocimum sanctum Linn. (profil) (3)

Page 18: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

14

Figura III.11. Aspectul microscopic (x40) al grăuncioarelor de polen la

speciile Ocimum basilicum L. (1) și Ocimum sanctum Linn. (2)

Figura III.12. Aspectul microscopic (x40) al elementelor comune

identificate la speciile Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var. purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn..

Page 19: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

15

Capitolul IV. Studiul chimic al uleiurilor volatile și extractelor

obținute din cele trei specii de Ocimum (Ocimum basilicum L.,

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth., Ocimum sanctum

Linn.)

IV.1. Obținerea și analiza chimică a uleiurilor volatile din

părțile aeriene ale speciilor de Ocimum luate în studiu

Materialul vegetal

Produsul vegetal a fost reprezentat de părțile aeriene

înflorite ale speciilor Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn., recoltate în perioada

iulie-august 2011, din culturi biologice realizate în câmpul

experimental al Centrului de Cercetări Biologice Stejarul, Piatra

Neamţ și depozitate în cadrul Disciplinei de Farmacognozie,

Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicină și Farmacie ―Gr.

T. Popa‖, Iași.

Obținerea uleiurilor volatile

Uleiurile volatile au fost izolate prin antrenarea cu vapori

de apă a materialului vegetal uscat obținut de la cele trei specii de busuioc luate în studiu, folosind un aparat de tip Neo-Clevenger, în

conformitate cu prevederile Farmacopeei Europene 6.0. și FR X.

Randamentul de extracție a uleiului volatil a variat în

funcție de specie, cea mai bogată sursă de ulei volatil fiind

reprezentată de busuiocul cu frunze roșii, Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth..

Tabel IV.1.

Randamentul de extracție a uleiurilor volatile din părțile aeriene ale speciilor

Ocimum analizate

Specie mL ulei volatil/100 g

produs vegetal (%, v/m)

Ocimum basilicum L. 1,18

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. 2,0

Ocimum sanctum Linn. 0,91

Page 20: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

16

IV.1.2. Analiza calitativă a uleiurilor volatile

IV.1.2.3. Rezultate și discuții

Analiza gaz-cromatografică cuplată cu spectrometrie de

masă (GC-MS) și GC-FID a uleiurilor volatile extrase din

probele de busuioc luate în studiu.

Compoziția chimică a uleiurilor volatile izolate de la

speciile Ocimum basilicum L. – UOb, Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth. – UObp și Ocimum sanctum Linn. – UOs a fost

studiată prin GC-MS și GC-FID.

În tabelul IV.3 sunt prezentați compușii identificați în cele

trei uleiuri volatile, în ordinea eluției lor pe coloana DB-5 MS,

indicii de retenție și concentrațiile acestora.

Cei 41 de compuși identificați în UOs au reprezentat

98,98% din procentul total, în timp ce în cazul UOb, cei 34 de

compuși identificați au reprezentat 98,03% din procentul total. În ceea ce privește analiza uleiului volatil izolat de la specia

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp), cei 21 de

compuși identificați au reprezentat 98,84% din componența acestuia.

Monoterpenele oxigenate reprezintă constituenții majoritari

în toate cele trei uleiuri volatile analizate: 38,02% pentru UOb,

71,52% pentru UObp și 32,54% pentru UOs.

În toate cele trei uleiuri, compusul cel mai important din

punct de vedere cantitativ este linaloolul: 31,08% pentru UOb,

66,72% pentru UObp și 19,25% pentru UOs.

Tabelul IV.4.

Principalele grupe de compuși identificate în probele de Ocimum aetheroleum

Grupa de compuși UOb (%) UObp (%) UOs (%)

Hidrocarburi monoterpenice 3,53 1,08 3,46

Monoterpene oxigenate

(majoritar linalool) 38,02 71,52 32,54

Derivați fenilpropanici

(majoritar estragol) 18,21 - 9,88

Sescviterpene 28,59 11,77 33,31

Page 21: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

17

Tabel IV.3.

Compuşii principali identificaţi în uleiurile volatile obținute din speciile de

busuioc analizate

Nr. TR

(min) IRa Compus

Aria %

UOb UObp UOs

1 5,47 927 -tuien - - 0,04

2 5,61 935 -pinen 0,31 - 0,34

3 5,88 938 camfen 0,26 - 0,21

4 6,21 974 sabinen 0,16 0,08 0,30

5 6,27 978 octen-3-ol 0,12 - 0,17

6 6,23 980 -pinen 0,38 0,21 0,59

7 6,42 991 mircen 0,74 0,4 0,59

8 6,48 - dehidrocineol - - 0,03

9 6,53 1000 3-octanol - - 0,04

10 6,64 1006 acetat de cis-3-hexenil 0,1 - 0,04

11 6,73 1007 1-felandren - - 0,03

12 6,77 1010 3-caren - - 0,03

13 6,90 1015 -terpinen 0,06 - 0,13

14 7,03 1028 o-cimen - 0,11 0,11

15 7,10 1031 l-limonen 0,53 0,39 0,43

16 7,18 1034 1,8-cineol 3,29 - 3,9

17 7,321 1041 trans--ocimen 0,97 - 0,67

18 7,54 1065 -terpinen 0,12 - 0,61

19 7,74 1075 L-linalool-oxid - 0,5 1,21

20 8,19 1098 L-linalool 31,08 66,72 19,25

21 9,06 1150 camfor 2,26 1,7 2,31

22 9,65 1197 -terpineol - 1,17 -

23 9,74 1200 estragol 15,57 - 7,59

24 10,00 1241 acetat de fenchil 0,1 0,74 0,1

25 10,43 1254 trans-geraniol - - 3,96

26 10,95 1291 acetat de bornil 1,29 0,69 1,78

27 11,09 1354 carvacrol - - 0,79

28 11,87 1357 eugenol 2,64 - 1,39

29 12,41 1375 -elemen 3,24 2,32 3,71

30 12,87 1421 -cariofilen 1,12 1,03 1,93

31 12,97 1439 -bergamoten 2,95 0,42 2,53

32 13,01 1440 -guaien 1,22 1,03 1,46

33 13,33 1456 -humulen 0,87 0,47 1,24

34 13,39 1482 epi-biciclosescvifelandren 8,3 1,99 1,39

35 13,66 1489 germacren 3,82 1,58 3,25

36 13,75 1491 -selinen 0,36 - 0,62

37 13,82 1504 biciclo-germacren 1,44 0,71 1,88

38 13,88 1506 -guaien 1,85 1,15 2,09

39 14,04 1566 -amorfen 2,34 1,07 3,3

40 14,83 1580 spatulenol 0,96 - 1,49

41 14,92 1585 cariofilenoxid 0,47 - 1,62

42 15,60 1515 -cadinen 0,1 - 6,8

Total 98,03 98,84 98,98 aindici Kovats calculați pe coloana capilară DB-5MS.

Page 22: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

18

Figura IV.2. Gaz-cromatograma uleiului volatil de Ocimum basilicum L.

Figura IV.3. Gaz-cromatograma uleiului volatil de Ocimum basilicum var.

pururascens Benth.

Figura IV.4. Gaz-cromatograma uleiului volatil de Ocimum sanctum Linn.

Page 23: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

19

IV.2.1. Obținerea extractelor etanolice

Produsul vegetal (2,5 g) a fost extras cu 100 mL etanol 50

% pe baia de apă, la reflux, timp de 30 minute. Extractul a fost filtrat

printr-un filtru de vată, într-un balon cotat de 250 mL, iar filtrul de

vată a fost reintrodus în balonul inițial cu reziduul vegetal şi extras,

din nou, pentru încă 30 de minute cu 125 mL etanol 50%. După

răcire, extractele astfel obținute au fost filtrate, reunite și concentrate

prin uscare la etuva termostatată, la 30˚C.

IV.2.2. Analiza chimică calitativă a componentelor

bioactive prezente în extractele etanolice

Studiul chimic calitativ s-a realizat prin cromatografia pe

strat subţire pentru două grupe de principii active importante din

punct de vedere farmacologic, și anume, flavonoide și acizi

polifenolcarboxilici.

Rezultatele analizei calitative prin cromatografie pe strat subțire sunt prezentate în figura IV.5, în care se poate observa

aspectul general al cromatogramelor realizate pentru derivați

flavonoidici și acizi polifenolcarboxilici.

În toate cele trei probe au fost identificați următorii

compuși: rutozidă, cvercetol, luteolin 7-glucozidă, apigenol 7-

glucozidă, apigenol, acid cafeic, acid clorogenic, acid galic.

Figura IV.5. Cromatografia pe strat subțire pentru derivații flavonoidici (A)

și pentru acizii polifenolcarboxilici (B) din extractele de busuioc

Page 24: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

20

Tabel IV.6.

Flavonoide identificate prin tehnica cromatografiei în strat subțire în probele

investigate (A) Probă Rf exp. Culoare Component atribuit

EOb

0,23 albastru, fără fluorescență n.i.

0,39 brun-portocaliu Rutozidă

0,44 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic

0,48 albastru, slab fluorescent n.i.

0,50 brun-portocaliu Derivat de cvercetol

0,62 galben-verzui, fluorescent Luteolin-7-glucozidă

0,64 portocaliu Apigenol-7-glucozidă

0,78 bleu-verzui, slab fluorescent Ac. izoclorogenic

0,92 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic

0,95 albastru, cu fluorescență Ac. ferulic

EOs

0,23 albastru, fără fluorescență n.i.

0,39 brun-portocaliu Rutozidă

0,44 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic

0,48 albastru, slab fluorescent n.i.

0,50 brun-portocaliu Derivat de cvercetol

0,62 galben-verzui, fluorescent Luteolin-7-glucozidă

0,64 portocaliu Apigenol-7-glucozidă

0,78 bleu-verzui, slab fluorescent Ac. izoclorogenic

0,92 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic

0,95 albastru, cu fluorescență Ac. ferulic

EObp

0,23 albastru, fără fluorescență n.i.

0,44 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic

0,45 brun-portocaliu Rutozidă

0,48 albastru, slab fluorescent n.i.

0,50 brun-portocaliu Derivat de cvercetol

0,62 galben-verzui, fluorescent Luteolin-7-glucozidă

0,64 portocaliu Apigenol-7-glucozidă

0,78 bleu-verzui, slab fluorescent Ac. izoclorogenic

0,92 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic

0,95 albastru, cu fluorescență Ac. ferulic

Tabel IV.7.

Acizi polifoncarboxilici identificați prin tehnica cromatografiei în strat

subțire în probele investigate (B) Probă Rf exp. Culoare Component atribuit

EOb

0,22 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic

0,48 bleu, cu fluorescență Ac. izoclorogenic

0,72 albastru, cu fluorescență n.i

0,78 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic

EOs

0,22 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic

0,48 bleu, cu fluorescență Ac. izoclorogenic

0,72 albastru, cu fluorescență n.i

0,78 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic

EObp

0,22 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic

0,48 bleu, cu fluorescență Ac. izoclorogenic

0,72 albastru, cu fluorescență n.i

0,78 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic

Page 25: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

21

IV.2.3. Analiza chimică cantitativă a componentelor

bioactive prezente în extractele etanolice

Studiul chimic cantitativ a presupus cuantificarea

flavonoidelor, acizilor polifenolici și polifenolilor totali din

extractele etanolice obținute (Ocimum basilicum L. – EOb, specia

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp și specia

Ocimum sanctum Linn. – EOs).

Din cele trei extracte realizate, EOs s-a remarcat prin

conținutul cel mai mare de polifenoli totali (479,31 mg acid galic/g

extract uscat), fiind urmat de EObp, ce a înregistrat o valoare

apropiată (477,71 mg acid galic/g extract uscat) și de EOb (379,51

mg acid galic/g extract uscat). De asemenea, EOs s-a remarcat și

prin conținutul în acizi polifenolcarboxilici (28,99 mg acid cafeic/g

extract uscat), fiind urmat de EObp (27,32 mg acid cafeic/g extract

uscat) și de EOb (17,17 mg acid cafeic/g extract uscat). În ceea ce

privește conținutul în flavonoide, EObp a înregistrat valoarea cea

mai ridicată (192,17 mg (±) catehină/g extract uscat), fiind urmat de EOs (82,31 mg (±) catehină/g extract uscat) și de EOb (54,52 mg (±)

catehină/g extract uscat).

Figura IV.9. Conținutul în acizi polifenolici, flavonoide și polifenoli totali

în extractele etanolice - Ocimum basilicum L. (EOb), Ocimum basilicum

var. purpurascens Benth. (EObp), Ocimum sanctum Linn. (EOs)

acizi polifenolici

(mg acid cafeic)

flavonoide

(mg (±)-catehină)

polifenoli totali

(mg acid galic)

EOb 17,17 54,52 379,51

EOs 28,99 82,31 479,31

EObp 27,32 192,17 477,71

050

100150200250300350400450500

mg/g extract uscat

Page 26: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

22

IV.2.4. Determinarea HPLC a flavonoidelor și acizilor

polifenolcarboxilici

Analiza prin cromatografie de lichide de înaltă performanță a

fost realizată în vederea caracterizării chimice calitative și semi-

cantitative a acizilor polifenolcarboxilici și flavonoidelor din cele

trei extracte etanolice concentrate obținute de la cele trei specii luate

în studiu (Ocimum basilicum L. – EOb, specia Ocimum basilicum

var. purpurascens Benth. – EObp și specia Ocimum sanctum Linn. –

EOs). Extractele au fost analizate prin compararea cu soluțiile

etalon: acid cafeic, acid clorogenic, acid t-cinamic, acid ferulic,

catehină, epicatehină, hiperozidă, apigenol 7-glucozidă, acid

rozmarinic și apigenol. Au fost identificați toți compușii, cu excepția

acidului t-cinamic și hiperozidei.

Dintre toți acizii polifenolici, acidul rozmarinic a fost cel mai

bine reprezentat în toate cele trei probe: 32,05 mg/g extract uscat în

proba EOs, 45,33 mg/g extract uscat în proba EOb, 92,89 mg/g

extract uscat în proba EObp. Concentrația flavonoidelor măsurată separat în cele trei probe a avut valori mici, aceasta fiind o

caracteristică comună tuturor extractelor.

Figura IV.18. Cromatograma HPLC obținută pentru proba Ocimum

basilicum L. (λ= 282 nm, 326 nm)

Page 27: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

23

În continuare, sunt prezentate cromatogramele HPLC obținute

în urma analizei extractelor obținute din Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth. și Ocimum sanctum Linn..

Figura IV.19. Cromatograma HPLC obținută pentru proba Ocimum

basilicum var. purpurascens Benth. λ= 282 nm, 326 nm)

Figura IV.20. Cromatograma HPLC obținută pentru proba Ocimum

sanctum Linn. (λ= 282 nm, 326 nm)

Page 28: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

24

Capitolul V. Evaluarea activității antioxidante a unor extracte vegetale obținute din specii de Ocimum

Existenţa unei componente fenolice importante în probele

analizate de Ocimum, precum şi proprietăţile antioxidante generale

ale polifenolilor, a orientat analiza biologică în direcţia testării

abilităţilor antioxidante a probelor incluse în studiu.

Ne-am propus să apreciem acţiunea antioxidantă in vitro a

extractelor etanolice și a uleiurilor volatile din probele de busuioc.

Evaluarea activităţii antioxidante s-a realizat prin următoarele

teste: determinarea capacităţii de scavenger faţă de radicalul

difenilpicrilhidrazil (DPPH) şi investigarea capacităţii de chelatare a

ionului feros.

V.1. Studiul activității antioxidante in vitro a extractelor

etanolice

V.1.1. Determinarea capacității de scavenger de radicali

liberi (radical DPPH)

V.1.1.2. Rezultate și discuții

Activitatea de scavenger a extractelor de Ocimum a variat

dependent de concentrație (fig. V.1). Extractul EObp (obținut din

părțile aeriene înflorite ale speciei Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth.) a fost cel mai activ dintre extractele supuse

analizei (tab. V.2).

La concentrație de 1 mg/mL, EObp a prezentat o activitate de

scavenger de 59,5±0,72%. La aceiași concentrație, EOb (obținut din

Ocimum basilicum L.) a inactivat radicalul DPPH în proporție de

47,5±0,59%, iar EOs (obținut din Ocimum sanctum Linn.), în

proporție de 21,18±0,14%.

La concentrație de 5 mg/mL, activitatea EObp (85,01±0,55%)

a fost mai scăzută comparativ cu cea a EOs (86,16±0,72%) și cu cea a EOb (91,26±0,13%). La aceiași concentrație, martorul pozitiv a

avut o activitate de peste 95%.

Page 29: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

25

Figura V.1. Capacitatea de scavenger faţă de radicali DPPH determinată

pentru extractele etanolice obținute din cele trei specii de busuioc (Ocimum

basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp,

Ocimum sanctum Linn. – EOs)

Tabel V.1.

Valorile activității de scavenger față de radicalul DPPH înregistrate pentru

extractele etanolice obținute din cele trei specii de busuioc studiate (Ocimum

basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs)

Extract/Martor

pozitiv

15,67

mg/mL 5mg/mL 1 mg/mL

EOb 92,6 ± 0,17 91,26 ± 0,13 47,5 ± 0,59

EOs 90,7 ± 0,19 86,16 ± 0,72 21,18 ± 0,14

EObp 91,12 ± 0,08 85,01 ± 0,55 59,5 ± 0,72

Cvercetol

95,54 ± 0,05

Tabel V.2. Valorile CI50 în testul pentru determinarea capacității de scavenger faţă de

radicalul DPPH (Ocimum basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs)

Extract/Martor

pozitiv CI50 (µg/mL)

EOb 1161,7 ± 0,4

EObp 60,23 ± 0,12

EOs 2128,4 ± 0,7

Cvercetol 3,4 ± 0,05

EOb

EOs

EObp

0

20

40

60

80

100

15,67 mg/ml 5 mg/ml 1mg/ml

% a

ctivitate

d

e sc

aven

ger

fa

ta

de

rad

ical

i D

PP

H

EOb EOs EObp

Page 30: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

26

Figura V.3. Acţiunea antioxidantă: evoluția în timp a activităţii de

scavenger faţă de radicalul DPPH (Ocimum basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs)

V.1.2. Deteminarea capacității de chelatare a ionului feros

V.1.2.2. Rezultate și discuții

Capacitatea de chelatare a extractelor etanolice de Ocimum

a variat dependent de concentrație (fig. V.4). EObp a fost cel mai

activ dintre extracte (fig. V.6). La concentrație de 5 mg/mL, valoarea

activității de chelatare a EObp a fost de 62,84±0,47%, comparativ cu

cea înregistrată pentru EOs, de 55,11±0,33%, și cea obținută pentru EOb, de 50,69±0,91%. Martorul pozitiv, acidul cafeic, a fost mai

activ la concentrație de 0,5 mg/mL, valoarea activității de chelatare

fiind de 62,94±0,32%. Tabel V.3.

Valorile activității de chelatare a ionilor feroși înregistrate pentru extractele etanolice obținute din cele trei specii de busuioc studiate (Ocimum basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum

Linn. – EOs) Extract/martor

(activitate%)

Concentrație

EOb EOs EObp Acid

cafeic

40 mg/mL 73,75±0,15 89,09±0,59 81,16±0,21

20 mg/mL 54,68±0,43 70,05±0,27 70,28±0,64

5 mg/mL 50,69±0,91 55,11±0,33 62,84±0,47

2,5 mg/mL 34,78±0,37 33,16±0,78 28,66±0,39

0,5 mg/mL 62,94±0,32

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 1 2 3 4 5

Inte

nsi

tate

ab

sorb

anță

Timp (min)

EObp

EOs

EOb

Page 31: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

27

Figura V.4. Capacitatea de chelatare a ionului feros determinată pentru extractele

etanolice obținute din cele trei specii de busuioc (Ocimum basilicum L. – EOb,

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs)

Figura V.5. Acţiunea antioxidantă: evoluția în timp a activității de chelatare a ionului feros (Ocimum basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs)

Tabel V.4.

Acţiunea antioxidantă: concentrația inhibitorie 50 pentru capacitatea de chelatare a ionului feros (Ocimum basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs) Extract/Martor pozitiv CI50 (µg/mL)

EOb 4,9 ± 0,15

EObp 3,9 ± 0,03

EOs 4,3 ± 0,91

Acid cafeic 2,2 ± 0,17

EOb

EOs

EObp

0

20

40

60

80

100

40 mg/mL 20 mg/mL 5 mg/mL 2,5 mg/mL

% a

ctiv

itat

e de

chel

atar

e EOb EOs EObp

0

1

2

3

4

0 1 2 3

Inte

nsi

tate

ab

sorb

anță

Timp (min)

EObp

EOs

EOb

Page 32: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

28

V.2. Determinarea activității antioxidante in vitro a

uleiurilor volatile

Activitatea antioxidantă a uleiurilor izolate de la cele trei

specii de Ocimum luate în studiu (Ocimum basilicum L. – UOb,

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – UObp, Ocimum

sanctum Linn. – UOs) a fost evaluată prin testarea capacității de

scavenger față de radicalii DPPH.

V.2.1. Determinarea capacității de scavenger de radicali

liberi (radicalul DPPH)

V.2.1.2. Rezultate și discuții

Capacitatea de scavenger față de radicalul DPPH a uleiurilor

volatile a indicat faptul că UObp a fost cel mai activ dintre uleiurile

volatile testate (CI50 = 3,8±0,4 µg/mL), fiind urmat de uleiul volatil

izolat de la specia Ocimum basilicum L. (CI50 = 5,3±0,6 µg/mL) și de cel obținut de la specia Ocimum sanctum Linn. (CI50 = 6,8±0,7

µg/mL).

Tabel V.5. Activitatea de scavenger față de radicalul DPPH a uleiurilor volatile obținute din cele trei specii de Ocimum (Ocimum basilicum L. – UOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – UObp, Ocimum sanctum Linn. – UOs)

Probă Concentrația (µg/mL) % activitate de scavenger față de

radicalul DPPH

UOb

200 65,07±0,63

100 54,19±0,13

50 19,4±0,25

UObp

200 78,1±0,96

100 77,3±0,48

50 8,67±0,60

UOs

200 43,57±0,76

100 20,06±0,56

50 15,28±0,42

În ceea ce privește proba de Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth. (UObp), aceasta a prezentat cea mai slabă

activitate de scavenger asupra radicalului DPPH (8,67±0,60%) la

concentrația cea mai scăzută, de 50 μg/mL comparativ cu celelalte

Page 33: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

29

două probe. O dată cu creșterea concentrației probelor, 100 μg/mL

respectiv, 200 μg/mL, acțiunea de scavenger a crescut, înregistrând

valori de 77,3±0,48% respectiv, 78,1±0,96%. Linaloolul, testat ca și

substanță etalon, a dovedit o activitate antioxidantă mai scăzută

decât a tuturor celor trei probe de uleiuri volatile studiate, valoarea

CI50 (16,7±0,1 μg/mL) fiind de până la 4 ori mai mare decât cea a

UObp.

Figura V.7. Acţiunea antioxidantă a uleiului volatil: evoluția în timp a

activității de scavenger (Ocimum basilicum L. – UOb, Ocimum basilicum

var. purpurascens Benth. – UObp, Ocimum sanctum Linn. – UOs)

Tabel V.6.

Valorile CI50 (μg/mL) obținute în testul DPPH al probelor (μg/mL) de ulei volatil

(Ocimum basilicum L. – UOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – UObp,

Ocimum sanctum Linn. – UOs)

Extract/Martor pozitiv CI50 (µg/mL)

UOb 5,3 ± 0,06

UObp 3,8 ± 0,40

UOs 6,8 ± 0,70

Linalool 16,7 ± 0,10

Aceste rezultate sunt în concordanță cu studii anterioare ce au

raportat că activitatea antioxidantă a uleiurilor volatile a fost

superioară componentelor studiate individual, indicându-se, astfel,

existența unui efect sinergic între componentele uleiului volatil [40].

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200µg/mL 100µgl/mL 50µg/mL

UOb UObp UOs

Page 34: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

30

Capitolul VI. Evaluarea in vivo a activității

neuroprotectoare a uleiurilor volatile de Ocimum pe model

animal de Alzheimer indus experimental

VI.1. Inducerea experimentală a modelului animal de

maladie Alzheimer

Inducerea modelului animal experimental de Alzheimer cu

ajutorul beta-amiloidului [Aβ(1-42)] a fost realizată

neurochirurgical, pe șobolani Wistar anesteziați (pentobarbital sodic,

50 mg/kg corp, i.p.), prin administrarea stereotaxică

intracerebroventriculară (i.c.v.) a peptidului amiloidic beta (1-42)

(400pmoli) cu 20 de zile înaintea administrării uleiurilor volatile

(tab. VI.1), conform procedurii stabilite de Laursen și Belknap

[335].

Uleiurile volatile (Ocimum basilicum L. – UOb, Ocimum

basilicum var. purpurascens Benth. – UObp, Ocimum sanctum Linn. – UOs) au fost administrate prin inhalare. Au fost administrate câte

două concentrații pentru fiecare tip de ulei. Doza de 1% este doza

folosită la ora actuală în aromaterapie, iar cea de 3% a fost aleasă

pentru a observa o eventuală potențare a efectelor dorite [337].

Expunerea la uleiurile volatile de busuioc (200 µL, la

concentrație 1% și respectiv, 3%) a fost realizată cu ajutorul unui

vaporizator plasat într-o cutie de Plexiglas, astfel încât animalele să

nu poată avea acces direct la el. Șobolanii din grupurile pe care au

fost testate uleiurile volatile de busuioc au fost expuși vaporilor de

ulei volatil timp de 60 de minute, zilnic, timp de 21 de zile

consecutive. Conform Linck și colaboratorii (2010), perioada de 60

de minute reprezintă o perioadă de inhalare corespunzătoare

instalării efectelor dorite [338].

Animalele au fost împărțite în 10 loturi a câte 10 șobolani:

• Lotul control (fals-operat) - soluţie salină (NaCl 0,9%);

• Lotul Aβ(1-42) (control negativ) – Alzheimer experimental;

• Lotul TRM (control pozitiv – testul de înot forțat) –

Tramadol (10 mg/kg corp);

Page 35: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

31

• Lotul DZP (control pozitiv – testul elevated-plus

maze) – Diazepam (1,5 mg/kg corp);

• Lotul Aß (1-42) + UOb1%;

• Lotul Aß (1-42) + UOb3%;

• Lotul Aß (1-42) + UObp1%;

• Lotul Aß (1-42) + UObp3%;

• Lotul Aß (1-42) + UOs1%;

• Lotul Aß (1-42) + UOs3%.

Tabel VI.1.

Codificarea probelor de uleiuri volatile luate în studiu

Ulei volatil Concentrație Codificare

Ocimum basilicum L. 1% UOb1%

3% UOb3%

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth.

1% UObp1%

3% UObp3%

Ocimum sanctum Linn. 1% UOs1%

3% UOs3%

VII.2. Teste comportamentale

Activitatea neuroprotectoare a fracțiunilor volatile izolate din

cele trei specii de Ocimum a fost evaluată cu ajutorul unor teste

specifice, fiind astfel urmărite efectele asupra memoriei de scurtă și

lungă durată (testul labirintului Y și a labirintului cu brațe radiale),

comportamentului anxios (testul elevated-plus maze) și efectele antidepresive (testul de înot forțat).

Analiza statistică

Analiza statistică a fost realizată folosind analiza variației

ANOVA (two-way ANOVA). Toate rezultatele sunt exprimate ca

media ± eroarea standard a mediei (E.S.M.), unde media reprezintă

suma valorilor determinărilor împărțite la numărul de determinări.

Valorile indicelui general F pentru care p < 0.05 au fost

considerate ca fiind semnificative statistic. Diferențele semnificative

au fost determinate cu ajutorul testului post hoc Tukey.

Page 36: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

32

VI.2.1. Testul labirintului Y – evaluarea memoriei de

scurtă durată

Testul labirintului Y reprezintă un test specific și precis al

cuantificării memoriei spațiale la rozătoare. Testul se bazează pe

tendința acestor animale de a explora orice mediu nou în care se află.

VI.2.1.2. Rezultate și discuții

Uleiurile volatile din cele trei specii de busuioc luate în studiu

au avut efecte pozitive, de îmbunătățire a memoriei de scurtă durată

în cadrul testului labirintului Y. Uleiul obținut din specia Ocimum

basilicum var. purpurascens Benth. a înregistrat cele mai importante

efecte de îmbunătățire a memoriei de scurtă durată. Cel mai slab

efect asupra memoriei de scurtă durată a fost înregistrat pentru

grupurile expuse uleiului volatil izolat de la specia Ocimum

basilicum L..

Tabelul VI.2.

Valorile procentului de alternare spontană în cadrul testului labirintului Y

Control Aß Aß+

UOs1%

Aß+

UOb1%

Aß+

UObp1%

Aß+

UOs3%

Aß+

UOb3%

Aß+

UObp3%

65,48 38,56 66,67 60 100 77,78 80 100

69,67 45,76 77,78 75 75 81,82 66,67 86,67

59,86 48,06 70 80 100 76,92 100 66,67

68,05 44,65 86,67 75 63,64 54,54 57,14 75

72,29 40,54 84,21 77,78 83,33 100 66,67 66,67

Media 67,08 43,52 77,07 73,56 84,39 78,21 74,10 79,00

E.S.M. 2,11 1,74 3,88 3,52 7,10 7,25 7,43 6,40

Tabelul VI.3.

Valorile înregistrate pentru numărul intrărilor în brațe în cadrul testului labirintului Y

Control Aß Aß+

UOs1%

Aß+

UOb1%

Aß+

UObp1%

Aß+

UOs3%

Aß+

UOb3%

Aß+

UObp3%

9,59 8,51 8 7 8 11 7 8

10,76 5,6 11 6 10 13 8 17

10,42 5,71 12 7 4 15 4 14

13,79 5,09 17 10 24 13 9 14

12,87 7,96 21 11 8 16 5 14

Media 8,93 5,21 11,28 6,54 9,49 10,55 5,33 10,64

E.S.M. 1,63 0,92 2,03 1,16 2,12 1,93 0,94 1,88

Page 37: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

33

Figura VI.1. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb),

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp) și Ocimum sanctum Linn. (UOs) asupra procentului de alternare spontană în cadrul testului

labirintului Y. Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10 animale per

grup), p < 0.0004 vs. grupul de control

Figura VI.2. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp) și Ocimum sanctum

Linn. (UOs) asupra numărului de intrări în brațe în cadrul testului

labirintului Y. Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10 animale per

grup), p < 0.0098 vs. grupul de control

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pro

cen

tul d

e al

tern

are

sponta

(%)

Testul labirintului Y

0

5

10

15

20

Num

ărul

intr

ăril

or

în b

rațe

Testul labirintului Y

Page 38: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

34

VI.2.2. Testul labirintului cu brațe radiale – evaluarea

memoriei de scurtă și de lungă durată

Pentru a studia dacă uleiurile volatile obținute din specia

Ocimum sanctum Linn. (UOs) influențează formarea memoriei

spațiale, animalele au fost supuse testului labirintului cu brațe

radiale.

Testul labirintului cu brațe radiale este un test foarte des

folosit de către cercetătorii din domeniul neuroștiinței

comportamentale [341]. Acest test este extrem de util în evaluarea

efectelor diferitelor medicamente asupra proceselor de memorare.

Memoria de referință și memoria de lucru reprezintă două

variabile ce indică statusul fiziologic cerebral [342].

VI.2.2.2. Rezultate și discuții

Valorile parametrilor înregistrați pentru testul labirintului cu

brațe radiale sunt prezentate în figura VI.3 și tabelele VI.4 și VI.5. Testul pentru evaluarea memoriei de scurtă și de lungă durată

(testul labirintului cu brațe radiale) a permis realizarea următoarelor

observații:

- uleiurile volatile din speciile de busuioc luate în studiu

îmbunătățesc performanțele memoriei spațiale ale modelului animal

de demență;

- uleiul volatil (1%) obținut de la specia Ocimum sanctum

Linn. a înregistrat efectele cele mai importante.

Tabelul VI.4.

Valorile erorilor memoriei de referință înregistrate pentru loturile control, Aβ(1-42) și cele expuse la concentrațiile de 1%, respectiv 3% ale uleiului

volatil obținut din specia Ocimum sanctum Linn. Zile de

antrenament

Lot

1 2 3 4 5 6 7 Media E.S.M.

Control 2,83 2,17 2,50 2,17 2,00 1,70 1,83 2,17 0,15

Aβ(1-42) 3,00 3,00 3,00 3,00 2,83 2,73 2,33 2,84 0,09

Aβ(1-42)+UOs1% 2,73 2,63 3,00 2,67 2,00 1,83 2,00 2,41 0,17

Aβ(1-42)+UOs3% 2,73 2,50 2,60 2,67 2,33 2,00 2,17 2,43 0,10

Page 39: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

35

Tabelul VI.5.

Valorile erorilor memoriei de lucru înregistrate pentru loturile control,

Aβ(1-42) și cele expuse la concentrațiile de 1% și respectiv, 3%, ale uleiului

volatil obținut din specia Ocimum sanctum Linn. Zile de

antrenament

Lot

1 2 3 4 5 6 7 Media E.S.M.

Control 1,17 0,33 0,33 0,33 0,00 0,17 0,00 0,33 0,15

Aβ(1-42) 3,17 4,33 4,17 3,17 3,00 2,67 3,17 3,38 0,23

Aβ(1-42)+UOs1% 1,33 0,83 1,00 0,50 0,33 0,50 0,17 0,67 0,15

Aβ(1-42)+UOs3% 1,17 0,68 0,51 0,21 0,00 0,00 0,00 0,37 0,17

Figura VI.3. Efectele uleiului volatil din specia Ocimum sanctum Linn.

(UOs1%, UOs3%) folosit în cadrul testului labirintului cu brațe radiale

asupra erorilor memoriei de referință (a) și erorilor memoriei de lucru (b) în

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7

Ero

rile

m

emo

riei

de

refe

rin

ță

Zile de antrenament

Control

Aβ(1-42)

Aβ(1-42)+UOs1%

Aβ(1-42)+UOs3%

0

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7

Ero

rile

m

emo

riei

de

lucru

Zile de antrenament

Control

Aβ(1-42)

Aβ(1-42)+UOs1%

Aβ(1-42)+UOs3%

(a)

(b)

Page 40: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

36

timpul celor 7 zile de antrenament. Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n =

10 animale per grup), *p < 0.0001 vs. grupul de control

VI.2.3. Testul elevated-plus maze – evaluarea

comportamentului anxios

Anxietatea și comportamentul motor au fost evaluate prin

observarea comportamentului în testul elevated plus-maze.

Anxietatea și depresia sunt simptome comune ale pacienților

diagnosticați cu maladie Alzheimer, fiind asociate cu durata și severitatea demenței, precum și cu nivelul scăzut al educației

individului [345].

VI.2.3.2. Rezultate și discuții

Valorile parametrilor înregistrați pentru testul elevated plus-

maze sunt prezentate în figurile VI.4 și VI.5 și tabelele VI.6 și VI.7.

Testul pentru evaluarea comportamentului anxios și a celui

motor a evidențiat că expunerea animalelor tratate cu beta-amiloid la

uleiurile volatile de busuioc luate în studiu a determinat efecte

anxiolitice. Uleiul obținut de la specia Ocimum sanctum Linn. a

înregistrat cele mai importante efecte anxiolitice, indiferent de

concentrație. Cele mai slabe efecte au fost observate pentru uleiul

volatil obținut de la specia Ocimum basilicum L..

Tabelul VI.6.

Valorile înregistrate pentru timpul petrecut în brațele deschise (%) în cadrul

testului labirintului elevated-plus maze

Contr. DZP Aß Aß+

UOs1%

Aß+

UOb1%

Aß+

UObp1%

Aß+

UOs3%

Aß+

UOb3%

Aß+

UObp3%

0 0 0 50 0 25 20 57,14 28,57

36,36 30 0 45,45 33,33 25 42,86 40 0

28,57 28,57 20 33,33 40 33,33 42,86 25 43,75

33,33 14,29 0 33,33 0 16,67 37,5 66,67 60

Media 24,57 18,22 5,00 40,53 18,33 25,00 35,81 47,20 33,08

E.S.M. 8,34 7,03 5,00 4,26 10,67 3,40 5,42 9,23 12,76

Animale din grupurile expuse uleiurilor volatile de

concentrație 3% au prezentat o creștere a timpului petrecut în brațele deschise mai bună, comparativ cu animalele cărora le-au fost

Page 41: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

37

administrate uleiurile volatile în concentrație de 1%, sugerând efecte

anxiolitice mai bune la administrarea uleiurilor volatile în

concentrație 3%.

Tabelul VI.7.

Valorile înregistrate pentru numărul intrărilor în brațele deschise în cadrul testului labirintului elevated-plus maze

Control DZP Aß Aß+

UOs1%

Aß+

UOb1%

Aß+

UObp1%

Aß+

UOs3%

Aß+

UOb3%

Aß+

UObp3%

0 0 0 4 0 1 1 4 2

4 3 0 5 1 1 3 2 0

2 2 1 2 2 1 3 1 7

2 1 0 2 0 1 3 2 3

Media 2,00 1,50 0,25 3,25 0,75 1,00 2,50 2,25 3,00

E.S.M. 0,82 0,65 0,25 0,75 0,48 0,00 0,50 0,63 1,47

Figura VI.4. . Efectele uleiurilor volatile din speciile Ocimum basilicum L.

(UOb1%, UOb3%), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp1%,

UObp3%) și Ocimum sanctum Linn. (UOs1%, UOs3%) folosite în cadrul testului elevated-plus maze asupra valorilor parametrilor înregistrați pentru

timpul petrecut în brațele deschise (%).Valorile reprezintă media ± E.S.M.

(n = 10 animale per grup), p < 0.0259 vs. grupul de control

Animale din grupurile expuse uleiurilor volatile de

concentrație 3% au prezentat o creștere a numărului de intrări în brațele deschise mai bună, comparativ cu animalele cărora le-au fost

administrate uleiurile volatile în concentrație de 1%.

0

20

40

60

Tim

pul

petr

ecut ăn

bra

țele

desc

his

e (

%)

Elevated -p lus maze

Page 42: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

38

Figura VI.5. Efectele uleiurilor volatile din speciile Ocimum basilicum L.

(UOb1%, UOb3%), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp1%, UObp3%) și Ocimum sanctum Linn. (UOs1%, UOs3%) din cadrul testului

elevated-plus maze asupra valorilor înregistrate pentru numărul intrărilor în

brațele deschise. Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10 animale per

grup), p < 0.0833 vs. grupul de control

VI.2.4. Testul de înot forțat – evaluarea răspunsului

depresiv

Testul de înot forțat a fost validat ca fiind o metodă

corespunzătoare în analiza efectelor antidepresive ale

medicamentelor [350]. Când rozătoarele sunt obligate să înoate într-

un spațiu limitat, după o inițială perioadă de zbatere, ele vor începe

să plutească, stare ce se aseamănă cu cea de depresie mentală.

VI.2.4.2. Rezultate și discuții

Au fost evaluați doi parametri: timpul de înot al animalului și

timpul de imobilitate.

Testul pentru evaluarea răspunsului depresiv a evidențiat că

uleiurile volatile obținute din speciile de busuioc incluse în studiu au acționat avantajos asupra comportamentului depresiv, prin

0

1

2

3

4

5

Num

ărul

intr

ăril

or

în b

rațe

le d

esc

his

e

Elevated -p lus maze

Page 43: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

39

mecanisme intrinseci cerebrale, invers proporțional cu concentrația

dozei administrate: fracțiunile volatile administrate în concentrație

1% au fost mai active decât cele în concentrație 3%.

Cel mai important efect a fost observat pentru uleiul volatil

izolat de la specia Ocimum basilicum var. purpurascens Benth., care

a prezentat cele mai bune efecte la concentrația de 1%. Cel mai slab

efect a fost înregistrat pentru uleiul volatil obținut de la specia

Ocimum sanctum Linn..

Tabelul VI.8.

Valorile timpului de înot (secunde) în cadrul testului de înot forțat

Control Aß TRM Aß+

UOs1%

Aß+

UOb1%

Aß+

UObp1%

Aß+

UOs3%

Aß+

UOb3%

Aß+

UObp3%

241 154 114 235 235 303 224 172 234

89 108 126 287 221 292 214 230 308

137 114 105 299 297 276 167 279 273

130 94 180 192 262 244 172 219 229

Media 149,25 117,5 131,25 253,25 253,75 278,75 194,25 225 261

E.S.M. 32,36 12,87 16,81 24,69 16,74 12,84 14,47 21,96 18,50

Figura VI.6. Efectele uleiurilor volatile de busuioc, Ocimum basilicum L.

(UOb1%, UOb3%), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp1%,

UObp3%) și Ocimum sanctum Linn. (UOs1%,U Os3%), asupra valorilor timpului de înot al șobolanilor tratați cu Aβ (1-42), în timpul perioadei de 6

minute a testului de înot forțat. Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10

animale per grup), **p < 0.00001, *p < 0.0001 vs. grupul de control

0

100

200

300

400

Tim

pul

de î

no

t (s

ecunde)

Testul de înot forțat

Page 44: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

40

Tabelul VI.9.

Valorile timpului de imobilitate (secunde) în cadrul testului de înot forțat

Control Aß TRM Aß+

UOs1%

Aß+

UOb1%

Aß+

UObp1%

Aß+

UOs3%

Aß+

UOb3%

Aß+

UObp3%

119 206 246 187 125 57 146 188 126

271 252 234 125 139 68 193 130 52

223 246 255 73 159 84 198 189 87

230 266 180 168 98 116 184 141 131

Media 210,75 242,5 228,75 138,25 130,25 81,25 180,25 162 99

E.S.M. 32,36 12,87 16,81 25,32 12,82 12,84 11,78 15,47 18,50

Figura VI.7. Efectele uleiurilor volatile de busuioc, Ocimum basilicum L.

(UOb1%, UOb3%), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp1%,

UObp3%) și Ocimum sanctum Linn. (UOs1%, UOs3%), asupra timpului de

imobilitate al șobolanilor tratați cu Aβ (1-42), în cadrul testului de înot forțat. Valorile reprezintă media ± S.E.M. (n = 10 animale per grup), **p <

0.00001, *p < 0.0001 vs. grupul de control

La concentrații de 3% ulei volatil administrat în camera de

vaporizare, timpul de imobilitate scade, înregistrând volari mai mici

față de control și martorul pozitiv pentru probele de ulei volatil UOb

și UOs, în timp ce, lotul căruia i-a fost administrat UObp3%, își

menține eficacitatea față de control și martor pozitiv. Pentru toate probele, efectele sunt inferioare celor

înregistrate la administrarea uleiului în concentrație de 1%.

0

100

200

300

Tim

pul

de i

mo

bil

itat

e (

secu

nde)

Testul de înot forțat

Page 45: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

41

Capitolul VII. Evaluarea acțiunii uleiurilor volatile din

specii de Ocimum asupra statusului biochimic pe omogenate de

creier provenite de la animale cu patogenie Alzheimer indusă

experimental

După evaluarea performanţelor cognitive prin teste

specifice (testul labirintului Y, testul labirintului cu brațe radiale,

testul elevated-plus maze, testul de înot forțat), a fost determinată

activitatea unor antioxidanți endogeni în probe de creier (amigdală)

provenite de la animalele din grupurile de tratament.

Analiza statistică

Analiza statistică a fost realizată folosind analiza variației

ANOVA (two-way ANOVA). Toate rezultatele sunt exprimate ca

media ± eroarea standard a mediei (E.S.M.), unde media reprezintă

suma valorilor determinărilor împărțite la numărul de determinări.

VII.2. Determinarea activității superoxid dismutazei

Amiloidul beta exercită un puternic efect pro-oxidant

caracterizat prin diminuarea activității specifice a superoxid

dismutazei (SOD, E.C. 1.15.1.1).

VII.2.2. Rezultate si discuții

Rezultatele obținute pentru evaluarea activității superoxid

dismutazei din omogenatele de hipocamp sunt redate în tabelul VII.1

și figura VII.1.

Datele obținute arată o creștere semnificativă a activității

superoxid dismutazei specifice în grupurile tratate cu Aβ (1-42) și

expuse ulterior diferitelor concentrații de uleiuri volatile, comparativ

cu grupurile tratate doar cu Aβ (1-42).

La concentrații de 3%, uleiurile volatile au fost mai eficiente comparativ cu cele de concentrație 1%.

Cel mai important efect a fost observat pentru uleiul volatil

izolat de la specia Ocimum basilicum L..

Page 46: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

42

Tabelul VII.1.

Activitatea superoxid dismutazei în omogenatele de hipocamp (USOD/mg

proteină)

Control Aß(1-42) Aß(1-42)+

UOs1%

Aß(1-42)+

UOb1%

Aß(1-42)+

UOs3%

Aß(1-42)+

UOb3%

0,35 0,37 0,7 0,67 0,74 0,92

0,35 0,37 0,7 0,73 0,8 0,85

0,4 0,36 0,42 0,76 0,91 0,7

Media 0,37 0,37 0,61 0,72 0,82 0,82

E.S.M. 0,02 0,00 0,09 0,03 0,05 0,06

Figura VII.1. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb) și

Ocimum sanctum Linn. (UOs) (Aβ (1-42) + UOs1%, Aβ (1-42) + UOb1%,

Aβ (1-42) + UOs3%, Aβ (1-42) + UOb3%) asupra activității specifice a

superoxid dismutazei la șobolanii tratați cu Aβ (1-42). Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10 animale per grup), *p < 0.0001

VII.3. Determinarea activității glutation peroxidazei

Glutation peoxidaza (GPX, E.C. 1.11.1.9) este o enzimă

seleniu-dependentă, prezentă în toate celulele corpului uman, ca

parte a sistemelor antioxidante endogene. În cadrul studiului de față,

activitatea enzimei glutation peroxidază a fost evaluată monitorizând

capacitatea ei de a oxida fotochimic glutationul (GSH).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

US

OD

/mg p

rote

ină

Superoxid dismutaza

Page 47: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

43

VII.3.2. Rezultate si discuții

Datele obținute indică o creștere semnificativă a activității

glutation peroxidazei în grupurile tratate cu Aβ (1-42) și care au fost

ulterior expuse uleiurilor volatile, comparativ cu grupurile control și

cel tratat doar cu Aβ (1-42). Uleiul volatil de Ocimum basilicum L.,

administrat în concentrație 3% a înregistrat cele mai importante

efecte. La concentrații de 1%, cel mai activ a fost uleiul izolat de la

specia Ocimum sanctum Linn..

Tabelul VII.2.

Activitatea glutation peroxidazei în omogenatele de hipocamp (UGPX/mg proteină)

Control Aß(1-42) Aß(1-42)+

UOs1%

Aß(1-42)+

UOb1%

Aß(1-42)+

UOs3%

Aß(1-42)+

UOb3%

0,35 0,37 0,68 0,36 0,82 0,92

0,35 0,37 0,82 0,12 0,84 1,03

0,4 0,36 0,66 0,94 0,01 1,21

Media 0,37 0,37 17,01 18,38 20,67 24,27

E.S.M. 0,02 0,00 0,42 1,28 0,55 1,81

Figura VII.2. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb) și Ocimum sanctum Linn. (UOs) (Aβ (1-42) + UOs1%, Aβ (1-42) + UOb1%,

Aβ (1-42) + UOs3%, Aβ (1-42) + UOb3%) asupra activității specifice a

glutation peroxidazei la șobolanii tratați cu Aβ (1-42). Valorile reprezintă

media ± E.S.M. (n = 10 animale per grup), *p < 0.0631

0,0

0,5

1,0

1,5

UG

PX

/mg p

rote

ină

Glutation peroxidaza

Page 48: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

44

VII.4. Determinarea activității catalazei

Catalaza (CAT, E.C. 1.11.1.6) este o enzimă cu rol

antioxidant, prezentă în toate celulele corpului, fiind localizată la

nivelul peroxizomilor. Ea catalizează descompunerea peroxidului de

hidrogen la apă și oxigen molecular.

VII.4.2. Rezultate si discuții

Rezultatele obținute pentru evaluarea activității catalazei

din omogenatele de hipocamp sunt redate în tabelul VII.3 și figura

VII.3.

Studiul asupra activității catalazei a evidențiat că

administrarea uleiurilor volatile a determinat o creștere a activității

specifice a acesteia.

Efectele înregistrate în urma administrării uleiurilor volatile

în concentrație 3% au fost mai bune decât cele observate în cazul

administrării uleiurilor în concentrație 1%.

Cel mai important efect a fost observat pentru uleiul volatil

izolat de la specia Ocimum basilicum L..

Tabelul VII.3.

Activitatea catalazei în probele de omogenate luate în studiu (µmol de

H2O2/min/mg proteină)

Control Aß(1-42) Aß(1-42)+

UOs1%

Aß(1-42)+

UOb1%

Aß(1-42)+

UOs3%

Aß(1-42)+

UOb3%

0,35 0,37 16,64 15,92 20,85 22,91

0,35 0,37 16,54 18,95 19,64 22,05

0,4 0,36 17,85 20,25 21,50 27,85

Media 0,37 0,37 0,72 0,48 0,56 1,05

E.S.M. 0,02 0,00 0,05 0,25 0,27 0,08

Se poate observa efectul benefic mai pronunțat, în special al

uleiului volatil de Ocimum basilicum L., la concentrația de 3%,

asupra creșterii activității specifice a catalazei la nivelul

omogenatelor obținute din lobii temporali comparativ cu uleiul izolat

de la specie Ocimum sanctum Linn la aceiași concentrație, de 3%.

Page 49: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

45

Figura VII.3. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb) și

Ocimum sanctum Linn. (UOs) (Aβ (1-42) + UOs1%, Aβ (1-42) + UOb1%, Aβ (1-42) + UOs3%, Aβ (1-42) + UOb3%) asupra activității specifice a

catalazei la șobolanii tratați cu Aβ (1-42). Valorile reprezintă media ±

E.S.M. (n = 10 animale per grup), * p < 0.0001

VII.5. Determinarea activității malondialdehidei

Creșterea concentrației malondialdehidei (MDA) reprezintă

un important marker al peroxidării lipidice in vivo [362].

Peroxidarea lipidică a fost măsurată indirect prin măsurarea

spectrofotometrică a malonaldehidei, folosind metoda propusă de

Ohkawa și colab., cu acid tiobarbituric [364].

VII.5.2. Rezultate și discuții

Rezultatele obținute pentru evaluarea activității

malondialdehidei din omogenatele de hipocamp sunt redate în

tabelul VII.4 și figura VII.4. Studiul asupra activității malondialdehidei a evidențiat că

administrarea uleiurilor volatile în două concentrații, de 1% și

respectiv, 3%, a determinat o creștere a concentrației

malondialdehidei.

0

10

20

30

μm

ol H

20

2 c

osu

maț

i/m

in/

mg p

rote

ină

Catalaza

Page 50: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

46

Tabel VII.4.

Activitatea malondialdehidei în probele de omogenate luate în studiu

(nmol/mg proteină)

Control Aß(1-42) Aß(1-42)+

UOs1%

Aß(1-42)+

UOb1%

Aß(1-42)+

UOs3%

Aß(1-42)+

UOb3%

0,35 0,37 8,58 7,96 8,23 12,83

0,35 0,37 7,19 9,96 7,96 9,62

0,4 0,36 7,47 9,46 9,45 11,81

Media 0,37 0,37 7,75 9,13 8,55 11,42

E.S.M. 0,02 0,00 0,42 0,60 0,46 0,95

Figura VII.4. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb) și

Ocimum sanctum Linn. (UOs) (Aβ (1-42) + UOs1%, Aβ (1-42) + UOb1%,

Aβ (1-42) + UOs3%, Aβ (1-42) + UOb3%) asupra activității specifice a

malondialdehidei la șobolanii tratați cu Aβ (1-42). Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10 animale per grup), *p < 0.0001

La concentrații de 1%, între grupurile Aβ (1-42) + UOs1%

și Aβ (1-42) + UOb1% nu a fost evidențiată o diferență notabilă din

punct de vedere statistic, uleiul obținut din specia Ocimum basilicum

L. (UOb) fiind doar cu puțin mai eficient decât cel obținut din specia

Ocimum sanctum Linn. (UOs). La concentrații de 3%, a fost observată o diferență

semnificativă statistic între grupurile Aβ (1-42) + UOs3% și Aβ (1-

42) + UOb3%, uleiul volatil UOb administrat șobolanilor din grupul

respectiv de studiu exercitând efecte mai bune de atenuare a

peroxidării lipidice decât uleiul izolat de la specia Ocimum sanctum

Linn. (UOs).

0

5

10

15

nm

ol/

mg p

rote

ină

Malondialdehida

Page 51: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

47

Capitolul VIII. Concluzii generale. Gradul de

originalitate. Perspective de cercetare

Cercetarea de față are ca scop evidențierea acțiunii biologice

a unor extracte (extracte etanolice, fracțiuni volatile) din trei specii

de busuioc introduse în culturi biologice, în România.

Unul dintre aspectele de originalitate ale tezei se referă la

investigarea varietății de busuioc cu frunze roșii, Ocimum basilicum

var. purpurascens Benth., varietate recent introdusă în culturi

biologice.

Rezultatele investigațiilor fitochimice și biologice asupra

speciilor Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn., permit evidențierea

următoarelor concluzii:

Analiza farmacognostică macro- și microscopică a

permis studiul caracteristicilor morfologice și evidențierea

elementelor histo-anatomice specifice celor trei specii de Ocimum studiate. A fost observată existența unor diferențe

macroscopice în ceea ce privește morfologia frunzelor și a

culorii florilor. Din punct de vedere microscopic, toate

speciile sunt caracterizate de prezența unui număr mare de

peri glandulari secretori bicelulari și octocelulari, precum și

a perilor tectori verucoși pluricelulari, cantonați mai ales pe

epiderma inferioară, de-a lungul nervurii principale.

În ceea ce privește randamentul de extracție a uleiurilor

volatile, valoarea cea mai mare a fost înregistrată pentru

specia Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2%).

Pentru celelalte două specii luate în studiu, valorile

randamentului de extracție a uleiurilor volatile au fost

următoarele: 1,18% pentru specia Ocimum basilicum L. și

0,91% pentru specia Ocimum sanctum Linn..

Analiza gaz-cromatografică (GC-MS și GC-FID) a celor

trei uleiuri volatile obținute din speciile de busuioc luate în

studiu a evidențiat un procent ridicat în monoterpene oxigenate în toate cele trei probe: 71,52% în proba de

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth., 38,02% în

proba de Ocimum sanctum Linn. și 35,54% în proba de

Page 52: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

48

Ocimum basilicum L.. Componentul majoritar evidențiat în

toate probele a fost linaloolul. Conținutul cel mai ridicat în

linalool a fost înregistrat în proba UObp (66,72%), urmată

de proba UOb (31,08%) și de proba UOs (19,25%).

Analiza chimică cantitativă, prin metode

spectrofotometrice a extractelor etanolice obținute din

Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn., a permis

determinarea conținutului în polifenoli totali (mg acid

galic/g extract), a flavonoidelor (mg (+)-catehină/g extract)

și a acizilor polifenolcarboxilici (mg acid cafeic/g extract).

Din cele trei extracte etanolice, extractul obținut din

Ocimum sanctum Linn. s-a remarcat printr-un conținut

ridicat în polifenoli totali (479,31 mg acid galic/g extract) și

acizi polifenolcarboxilici (28,99 mg acid cafeic/g extract),

iar cel obținut din Ocimum basilicum var. purpurascens

Benth. printr-un conținut mare de flavonoide (192,17 mg

(+)-catehină/g extract).

Analiza HPLC a extractelor a pus în evidență prezența

următoarelor componente: acid rozmarinic, acid clorogenic,

acid cafeic, acid ferulic, catehină, epicatehină, apigenol 7-

glucozidă și apigenol. Dintre toți acizii polifenolici, acidul

rozmarinic a fost regăsit în cantitatea cea mai mare: 32,05

mg/g extract uscat în proba de Ocimum sanctum Linn.,

45,33 mg/g extract uscat în proba de Ocimum basilicum L.

și 92,89 mg/g extract uscat în proba de Ocimum basilicum

var. purpurascens Benth..

Acțiunea antioxidantă a extractelor etanolice obținute

din cele trei specii de Ocimum analizate a fost evidențiată

prin două teste:

în testul privind evaluarea capacității de

scavenger față de radicalul DPPH, extractul din

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (CI50

= 60,23±0,12 µg/mL) a fost mai activ decât cel din

Ocimum basilicum L. (CI50 = 1161,7±0,4 µg/mL) și decât cel din Ocimum sanctum Linn. (CI50 =

2128,4±0,7 µg/mL),

Page 53: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

49

capacitatea de chelatare a ionilor feroși a indicat

faptul că extractul obținut din Ocimum basilicum

var. purpurascens Benth. a fost cel mai activ

dintre extracte (CI50 = 3,9±0,03 µg/mL), urmat de

extractul din Ocimum sanctum Linn. (CI50 =

4,3±0,91 µg/mL) și de cel din Ocimum basilicum

L. (CI50 = 4,9±0,15 µg/mL).

Acțiunea antioxidantă a uleiurilor volatile a fost evaluată

prin studiul capacității de scavenger față de radicalul

DPPH, uleiul izolat de la specia Ocimum basilicum var.

purpurascens Benth. fiind cel mai activ dintre toate

uleiurile analizate (CI50 = 3,8±0,4 µg/mL). Uleiurile

obținute din Ocimum basilicum L. și Ocimum sanctum

Linn. au prezentat o activitate comparabilă în ceea ce

privește inactivarea radicalului DPPH (CI50 = 5,3±0,6

µg/mL și respectiv, CI50 = 6,8±0,7 µg/mL).

Evaluarea in vivo a activității neuroprotectoare a celor trei fracțiuni volatile de Ocimum a constat în studiul

efectelor asupra memoriei de scurtă și de lungă durată,

asupra comportamentului anxios și asupra

comportamentului depresiv pe modele animale de maladie

Alzheimer indusă experimental:

evaluarea memoriei de scurtă durată a

evidențiat faptul că toate cele trei uleiuri volatile

au avut efecte pozitive, de îmbunătățire a acesteia.

Fracțiunea volatilă izolată de la specia Ocimum

basilicum var. purpurascens Benth. a înregistrat

cele mai importante efecte de îmbunătățire a

memoriei de scurtă durată, secondată fiind de cea

izolată de la Ocimum sanctum Linn. și cea de la

Ocimum basilicum L.. De asemenea, expunerea

animalelor de laborator la concentrațiile de 3% ale

uleiurilor a determinat o creștere a procentului de

alternări spontane, comparativ cu animalele

expuse unei concentrații de 1%, în cadrul testului pentru evaluarea memoriei de

scurtă și de lungă durată fracțiunile volatile au

îmbunătățit performanțele memoriei spațiale ale

Page 54: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

50

modelului animal de demență, uleiul volatil (1%)

obținut de la specia Ocimum sanctum Linn.

înregistrând cele mai bune efecte,

testul pentru evaluarea comportamentului

anxios a evidențiat faptul că uleiul obținut de la

specia Ocimum sanctum Linn. a înregistrat cele

mai importante efecte anxiolitice, indiferent de

concentrație, urmat fiind de uleiul volatil de

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. și de

cel de Ocimum basilicum L.. Animale din

grupurile expuse uleiurilor volatile de concentrație

3% au prezentat o creștere a procentului de intrări

în brațele deschise mai importantă, comparativ cu

animalele cărora le-au fost administrate uleiurile

volatile în concentrație 1%, sugerându-se, astfel,

efecte anxiolitice mai pregnante pentru uleiurile

volatile de concentrație 3%,

testul pentru evaluarea răspunsului depresiv a evidențiat faptul că uleiurile volatile au acționat

avantajos asupra comportamentului depresiv,

invers proporțional cu concentrația dozei

administrate. Cel mai important efect a fost

observat pentru uleiul volatil izolat de la specia

Ocimum basilicum var. purpurascens Benth.,

urmat de uleiul obținut de la specia Ocimum

basilicum L. și de cel izolat de la specia Ocimum

sanctum Linn.. Contrar așteptărilor, concentrațiile

ridicate de ulei volatil (3%) au înregistrat timpi de

înot diminuați față de concentrația mai mică (1%),

cu toate că și-au păstrat eficiența față de control și

martor pozitiv, sugerând un efect antidepresiv mai

slab al uleiurilor volatile administrate în

concentrație 3%.

Evaluarea acțiunii uleiurilor volatile asupra statusului

biochimic pe omogenate de creier provenite de la animale cu patogenie Alzheimer indusă experimental a permis

obținerea de rezultate doar pentru efectele uleiurilor de

Ocimum basilicum L. și Ocimum sanctum Linn.. A fost

Page 55: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

51

determinată activitatea unor antioxidanți endogeni în

probele de creier recoltate de la animalele din grupurile de

tratament:

studiul efectului asupra activității superoxid

dismutazei a evidențiat creșterea activității

acesteia în urma administrării fracțiunilor volatile.

La concentrații de 3%, uleiurile volatile au fost

mai eficiente comparativ cu cele de concentrație

1%, iar cel mai important efect a fost observat

pentru uleiul volatil izolat de la specia Ocimum

basilicum L.,

studiul efectului asupra activității glutation

peroxidazei a evidențiat creșterea activității

acesteia în urma administrării uleiurilor volatile.

La concentrații de 3%, uleiul volatil de Ocimum

basilicum L. a înregistrat cele mai importante

efecte. La concentrații de 1%, cel mai activ a fost

uleiul izolat de la specia Ocimum sanctum Linn., studiul efectului asupra activității catalazei a

evidențiat creșterea activității acesteia în urma

administrării fracțiunilor volatile. Efectele

înregistrate în urma administrării uleiurilor volatile

în concentrație 3% au fost mai bune decât cele

observate în cazul administrării uleiurilor în

concentrație 1%. Cel mai important efect a fost

observat pentru uleiul volatil izolat de la specia

Ocimum basilicum L., atât la concentrație 1%, cât

și la concentrație 3%,

studiul efectului asupra activității

malondialdehidei a evidențiat creșterea

concentrației acesteia în urma administrării

uleiurilor volatile, efectele uleiurilor de

concentrație 3% fiind mai importante decât cele

ale uleiurilor de concentrație 1%. Cel mai

important efect a fost observat pentru uleiul volatil izolat de la specia Ocimum basilicum L. atât la

concentrație 1%, cât și la concentrație 3%.

Page 56: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

52

Gradul de originalitate. Perspective de cercetare

Originalitatea studiului de față constă în:

investigarea pentru prima oară în țara noastră a varietății de

busuioc roșu, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth.,

caracterizarea spectrului polifenolic, precum și a fracținii

volatile izolate din părțile aeriene înflorite de Ocimum

basilicum var. purpurascens Benth. în condiţiile în care, în

literatura de specialitate, există foarte puține date privind

identitatea polifenolilor și a compușilor uleiului volatil

obținuți din părțile aeriene înflorite ale acestei varietăți,

caracterizarea chimică și evaluarea activității antioxidante

in vitro a uleiurilor volatile izolate din Ocimum basilicum

L., Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. și Ocimum

sanctum Linn.,

evidențierea efectelor asupra memoriei de scurtă și de lungă

durată pe modele animale de maladie Alzheimer pentru uleiurile volatile obținute din cele trei specii de Ocimum,

evidențierea efectelor anxiolitice și antidepresive pe modele

animale de maladie Alzheimer pentru uleiurile volatile

obținute din cele trei specii de Ocimum,

evidențierea efectelor neuroprotectoare administrării

uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. și Ocimum

sanctum Linn. asupra activității unor antioxidanți endogeni

în probele de creier recoltate de la animalele incluse în

studiu.

Perspective de cercetare

Rezultatele cercetărilor întreprinse în cadrul tezei de

doctorat justifică continuarea studiilor în următoarele direcții:

evaluarea activității celor trei uleiuri volatile în alte tipuri

de neurodegenerescență, precum maladia Parkinson,

evaluarea efectelor neuroprotectoare ale unui amestec

obținut din cele trei fracțiuni volatile și investigarea

posibilelor interacțiuni între cele trei uleiuri volatile

(sinergism/adiție),

Page 57: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

53

izolarea unor subfracțiuni și evaluarea potențialului lor

antioxidant și neuroprotector,

evaluarea fracțiunilor flavonoidice obținute din cele trei

specii în vederea stabilirii potențialului antiinflamator care

concură la dezvoltarea efectului neuroprotector.

Page 58: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

54

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. *** European Pharmacopoeia, ed. a 6-a. Strasbourg: EDQM,

2008.

2. *** Farmacopeea Română, ediţia a X-a. Bucureşti: Editura

Medicală, 1993.

3. Carović-Stanko K, Orlić S, Politeo O et al. Composition and

antibacterial activities of essential oils of seven Ocimum taxa.

Food Chem 2010; 119: 196–201.

4. Bora KS, Arora S, Shri R. Role of Ocimum basilicum L. in

prevention of ischemia and reperfusion-induced cerebral damage,

and motor dysfunctions in mice brain. J Ethnopharmacol 2011;

137: 1360-1365.

5. Runyoro D, Ngassapa O, Vagionas K et al. Chemical

composition and antimicrobial activity of the essential oils of

four Ocimum species growing in Tanzania. Food Chem 2010;

119: 311-316.

6. Nguyen PM, Kwee EM, Niemeyer ED. Potassium rate alters the antioxidant capacity and phenolic concentration of basil

(Ocimum basilicum L.) leaves. Food Chem 2010; 123: 1235-

1241.

7. Abdoly M., Farnam A., Fathiazad F. et al. Antidepressant-like

activities of Ocimum basilicum (sweet Basil) in the forced

swimming test of rats exposed to electromagnetic field (EMF).

African J Pharm Pharmacol 2012; 6(3): 211-215.

8. Ismail M. Central properties and chemical composition of

Ocimum basilicum essential oil. Pharm Biol 2006; 44(8): 619–

626.

9. Cha JH, Kim MJ, Kim HS, Kim YI. Effects of aromatherapy in

blending oil of basil, lavender, rosemary, and rose on headache,

anxiety and serum cortisol level in the middle-aged women. J

Korean Biol Nurs Sci 2010; 12(3): 133-139.

10. Selkoe DJ. Alzheimer Disease. În Rosenberg RN, Pascual JM

(eds.) Rosenberg’s Molecular and Genetic Basis of Neurological

and Psychiatric Disease (Fifth Edition) Elsevier Inc., 2015; 753 – 768.

11. Walsh DM, Selkoe DJ. A beta oligomers — a decade of

discovery. J Neurochem 2007; 101: 1172–1184.

Page 59: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

55

12. Peter J, Klöppel S. Alzheimer’s Disease. În Toga AW (ed.) Brain

mapping. Introduction To Clinical Brain Mapping (Vol. 3)

Elsevier Inc, 2015; 647-651.

13. Barage SH, Sonawane KD. Amyloid cascade hypothesis:

Pathogenesis and therapeutic strategies in Alzheimer's disease.

Neuropeptides 2015,

http://dx.doi.org/10.1016/j.npep.2015.06.008.

14. Brandt R, Leger J, Lee G. Interaction of tau with the neural

plasma membrane mediated by tau's amino-terminal projection

domain. J Cell Biol 1995; 131: 1327–1340.

15. Iqbal K, Alonso Adel C, Chen S, et al. Tau pathology in

Alzheimer disease and other tauopathies. Biochim Biophys Acta

2005; 1739: 198-210.

16. Tel G, Ozturk M, Duru ME et al. Chemical composition of the

essential oil and hexane extract of Salvia chionantha and their

antioxidant and anticholinesterase activities. Food Chem

Toxicol 2010; 48: 3189-3193.

17. Hriţcu L, Foyet HS, Ştefan M et al. Neuroprotective effect of methanolic extract of Hibiscus asper leaves in 6-

hydroxydopamine-lesioned rat model of Parkinson’s disease. J

Ethnopharmacol 2011; 137: 585-591.

18. Parsons CG, Danysz W, Dekundy A, Pulte I. Memantine and

cholinesterase inhibitors: complementary mechanisms in the

treatment of Alzheimer’s disease. Neurotox Res 2013, 24: 358-

369.

19. RajaSankar S, Manivasagam T, Surendran S. Ashwaghandha

leaf extract : a potential agent in treating oxidative damage and

physiological abnormalities seen in a mouse model of

Parkinson’s disease. Neurosci Lett 2009; 454: 11-15.

20. Cao C, Loewenstein DA, Lin X et al. High blood caffeine levels

in MCI linked to lack of progression to dementia. J Alzheimer’s

Dis 2012; 30(3): 559 – 572.

21. Benedec D, Oniga I, Oprean R, Tamas M. Chemical

composition of the essential oils of Ocimum basilicum L.

cultivated in Romania. Farmacia 2009; 57(5): 625-629.

22. Kaneko Y, Eve DJ, Yu S et al. Acute treatment with herbal

extracts provides neuroprotective benefits in in vitro and in vivo

Page 60: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

56

stroke models, characterized by reduced ischemic cell death and

maintenance of motor and neurological functions. Cell Med

2010; 1(3): 137-142.

23. Hriţcu L, Cioancă O, Hăncianu M. Effects of lavender oil

inhalation on improving scopolamine-induced spatial memory

impairment in laboratory rats. Phytomedicine 2012; 19(6): 529 –

534.

24. Mani V, Parle M, Ramasamy K, Majeed ABA. Reversal of

memory deficits by Coriandrum sativum leaves in mice. J Sci

Food Agric 2010; 91: 186-192.

25. Jeon S, Bose S, Hur J et al. A modified formulation of Chinese

traditional medicine improves memory impairment and reduces

Aβ level in the Tg-APPswe/PS1dE9 mouse model of

Alzheimer’s disease. J Ethnopharmacol 2011; 137: 783-789.

26. Levites Y, Amit T, Youdim MB, Mandel S. Involvement of

protein kinase C activation and cell survival/cell cycle genes in

green tea polyphenol (-)-epigallocatechin 3-gallate

neuroprotective action. J Biol Chem 2002; 277: 305-374. 27. Rendeiro C, Vauzour D, Rattray M et al. Dietary levels of pure

flavonoids improve spatial memory performance and increase

hippocampal brain-derived neurotrophic factor. PloS One 2013;

8(5): e63535.

28. Granzotto A, Zatta P. Resveratrol and Alzhemer’s disease:

message in a bottle on red wine and cognition. Front Aging

Neurosci 2014; 6(95): 1-7.

29. Chatterjeea M, Vermaa P, Mauryab R, Palit G. Evaluation of

ethanol leaf extract of Ocimum sanctum in experimental models

of anxiety and depression. Pharm Biol 2011; 49(5): 477-483.

30. Rajeswari A, Sabesan M. Inhibition of monoamine oxidase-B

by the polyphenolic compound, curcumin and its metabolite

tetrahydrocurcumin, in a model of Parkinson’s disease induced

by MPTP neurodegeneration in mice. Inflammopharmacol

2008; 16(2): 96-99.

31. Joshi SV, Bothara SB, Surana SJ. Evaluation of aqueous extract

of Ocimum sanctum in experimentally induced parkinsonism. J

Chem Pharm Res 2011; 3(1): 478-487.

Page 61: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

57

32. Samim M, Yajamanam SH, Bano N, Veeresh B, Madhav RB.

Neuroprotective effect of Ocimum sanctum Linn on rotenone

induced parkinsonism in rats. Int J Pharm Res Schol 2014; 3(1):

772-784.

33. Verma RS, Padalia RC, Chauhan A, Thul ST. Exploring

compositional diversity in the essential oils of 34 Ocimum taxa

from Indian flora. Ind Crop Prod 2013; 45: 7– 19.

34. Flanigan PM, Niemeyer ED. Effect of cultivar on phenolic

levels, anthocyanin composition, and antioxidant properties in

purple basil (Ocimum basilicum L.). Food Chem 2014; 164:

518–526.

35. Juntachote T, Berghofer E, Siebenhandl S, Bauer F. The

antioxidative properties of Holy basil and Galangal in cooked

ground pork. Meat Sci 2006; 72: 446–456.

36. Aqil F, Ahmad I, Mehmood Z. Antioxidant and free radical

scavenging properties of twelve traditionally used Indian

medicinal plants. Turk J Biol 2006; 30: 177-183.

37. Albano SM, Miguel MG. Biological activities of extracts of

plants grown in Portugal. Ind Crop Prod, 2011; 33(2): 338-343.

38. Bunrathep S, Palanuvez C, Ruangrungsi N. Chemical

composition and antioxidative activities of essential oils from

four Ocimum species endemic to Thailand. J Health Res 2007;

21: 201 – 206.

39. Joshi RK. Chemical composition, in vitro antimicrobial and

antioxidant activities of the essential oils of Ocimum

gratissimum, O. sanctum and their major constituents. Indian J

Pharm Sci 2013; 75(4): 457–462.

40. Trevisan MTS, Silva MGV, Pfundstein B et al. Characterization

of the volatile pattern and antioxidant capacity of essential oils from different species of the genus Ocimum. J Agric Food

Chem 2006; 54 (12): 4378–4382.

41. Linck VM, da Silva AL, Figueiro M et al. Effects of inhaled

linalool in anxiety, social interaction and aggressive behavior in

mice. Phytomedicine 2010; 17: 679–683.

Page 62: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

58

42. Titus ADJ, Shankaranarayana BS, Harsha et al. Hypobaric

hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is

associated with cognitive impairment in adult rats.

Neuroscience 2007; 145: 265–278.

43. Hayashi Y, Sogabe S, Hattori Y, Tanaka J. Anxiolytic and

hypnotic effects in mice of roasted coffee bean volatile

compounds. Neurosci Lett 2012; 531: 166–169.

44. Grundmann O, Nakajima JI, Shujiro Seo S, Butterweck V. Anti-

anxiety effects of Apocynum venetum L. in the elevated plus

maze test. J Ethnopharmacol 2007; 110: 406–411.

45. Emamghoreishi M, Khasaki M, Aazam MF. Coriandrum

sativum: evaluation of its anxiolytic effect in the elevated plus-

maze. J Ethnopharmacol 2005; 96: 365–370.

46. Whiting PJ. GABA-A receptors: a viable target for novel

anxiolytics? Curr Opin Pharmacol 2006; 6: 24–29.

47. Naghizadeh B, Mansouri MT, Ghorbanzadeh B et al. Protective

effects of oral crocin against intracerebroventricular

streptozotocin-induced spatial memory deficit and oxidative stress in rats. Phytomedicine 2013; 20: 537–542.

48. Praticò D, Uryu K, Leight S et al. Increased lipid peroxidation

precedes amyloid plaque formation in an animal model of

Alzheimer amyloidosis. J Neurosci 2001; 21: 4183–4187.

49. Van den Berg SJPL, Klaus V, Alhusainy W, Rietjens IMCM.

Matrix-derived combination effect and risk assessment for

estragole from basil-containing plant food supplements (PFS).

Food Chem Toxicol 2013; 62: 32–40.

50. Martins C, Cação R, Cole KJ et al. Estragole: A weak direct-

acting food-borne genotoxin and potential carcinogen. Mutat

Res 2012; 747: 86-92.

51. Cruz-Sánchez FF, Girones X, Ortega A et al. Oxidative stress in

Alzhemer’s disease hippocampus: a topographical study. J

Neurol Sci 2010; 299: 163-167.

52. Chen Z, Zhong C. Oxidative stress in Alzhemer’s disease.

Neurosci Bull 2014; 30(2): 271-281.

53. Yan MH, Wang X, Zhu X. Mithocondrial defects and oxidative stress in Alzhemer’s disease and Parkinson’s disease. Free

Radic Biol Med 2013; 62: 90-101.

Page 63: rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept

59

Listă lucrări publicate din tematica tezei

Articole publicate în reviste ISI:

Grădinariu V., Cioancă O., Hriţcu L., Gille E, Trifan A,

Hăncianu M. Comparative efficacy of Ocimum sanctum and

Ocimum basilicum volatile oils against beta (1-42)-induced anxiety

and depression in laboratory rats. Phytochem Rev (FI = 2.894),

2014, DOI 10.1007/s11101-014-9389-6.

Grădinariu V., Cioancă O., Gille E., Aprotosoaie A.C., Hriţcu L.,

Hăncianu M. The chemical profile of basil bio-varieties and its

implication on the biological activity. Farmacia (FI = 1,251), 2013,

61 (4): 632- 639.

Grădinariu V., Cioancă O., Hriţcu L. Hăncianu M. Basil bio-

varieties cultivated in Romania and the chemical profile of the

volatile oil. 13th SGEM GeoConference on Nano, Bio and Green –

Technologies For A Sustainable Future, 2013: 113 – 120,

Conference Proceedings, ISBN 978-619-7105-06-3/ISSN 1314-

2704, 16 – 22 iunie, ISI Proceedings,

DOI:10.5593/SGEM2013/BF6?S25.006, Albena, Bulgaria.

Lucrări prezentate la conferinţe de specialitate naționale

și internaționale:

Grădinariu V., Cioancă O., Ioan E., Tănase C., Hriţcu L., Gille E.,

Șpac A., Hăncianu M. Ocimum basilicum var. purpurascens:

Approaches on the chemical and biological profile. Congresul

Național al Farmaciștilor din România, 23-27 septembrie 2014, Iași,

România.

Grădinariu V., Cioancă O., Hriţcu L., Gille E, Trifan A,

Hăncianu M. Comparative efficacy of Ocimum sanctum and

Ocimum basilicum volatile oils against amyloid β-(1-42)-induced anxiety and depression in laboratory rats. PSE, aprilie 2014, Piatra

Neamț, România.