rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept
Transcript of rezumat_teza_romana_Gradinariu_Veronica - 28 sept
Universitatea de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași
Facultatea de Farmacie
CONTRIBUȚII LA IDENTIFICAREA ȘI
CARACTERIZAREA UNOR EXTRACTE VEGETALE
DIN SPECII INDIGENE SAU ACLIMATIZATE ÎN
ROMÂNIA CU ACȚIUNE FAVORABILĂ ÎN
AFECȚIUNILE NEURODEGENERATIVE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Coordonator științific,
Prof. univ. dr. Monica HĂNCIANU
Doctorand,
Biolog Veronica GRĂDINARIU
Investeşte în oameni!
FONDUL SOCIAL EUROPEAN prin Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013
Axa prioritara 1 “Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere”
Domeniul major de interventie 1.5 “Programe doctorale şi postdoctorale în sprijinul cercetării”
Titlu proiect: “Program de excelenta in cercetare doctorala si postdoctorala multidisciplinara in bolile cronice”
Numarul de identificare al contractului: POSDRU/159/1.5/S/133377
Beneficiar: Universitatea de Medicina si Farmacie "Grigore T. Popa" Iasi
IAȘI, 2015
Componența comisiei de doctorat:
PREȘEDINTE: Prof. univ. dr. Lenuța Profire
Universitatea de Medicină și Farmacie ”Grigore T. Popa”, Iași
CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC:
Prof. univ. dr. Monica Hăncianu
Universitatea de Medicină și Farmacie ”Grigore T. Popa”, Iași
REFERENȚI OFICIALI:
Prof. univ. dr. Cerasela Elena Gîrd
Universitatea de Medicină și Farmacie ”Carol Davila”,
București
Conf. univ. dr. Habil. Lucian Hrițcu
Universitatea Alexandru Ioan Cuza, Iași
Prof. univ. dr. Anca Miron
Universitatea de Medicină și Farmacie ”Grigore T. Popa”, Iași
Teza de doctorat cuprinde:
156 de pagini
32 de tabele
60 de figuri
366 indicații bibliografice
În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru
cuprins, tabele și figuri.
Cuvinte-cheie: Ocimum, uleiuri volatile, extracte vegetale,
activitate antioxidantă, activitate neuroprotectoare.
Stagiul realizat la Departamentul de Neurobiologie,
Universitatea Osnabrueck, Germania, în perioada ianuarie –
aprilie 2013 a reprezentat un real ajutor în formarea mea
profesională.
Rezultatele științifice obținute pe parcursul studiilor doctorale
sunt datorate și statutului de bursier în cadrul proiectului
"Program de excelență în cercetare doctorală și postdoctorală
multidisciplinară în bolile cronice",
POSDRU/159/1.5/S/133377, statut pe care l-am avut în perioada
iulie 2014 – septembrie 2015.
1
CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT
MULȚUMIRI
ABREVIERI
PARTEA GENERALĂ– stadiul actual al cunoașterii
Capitolul I. Cunoștințe farmacobotanice, fitochimice și biologice actuale
privind speciile Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth. și Ocimum sanctum Linn.
I.1. Încadrare sistematică
I.2. Ocimum basilicum L.
I.2.1. Descriere botanică
I.2.2. Compoziție chimică
I.2.3. Acțiuni biologice
I.2.4. Utilizări
I.3. Ocimum basilicum var. purpurascens Benth.
I.3.1. Descriere botanică
I.3.2. Compoziție chimică
I.3.3. Acțiuni biologice
I.3.4. Utilizări
I.4. Ocimum sanctum Linn.
I.4.1. Descriere botanică
I.4.2. Compoziție chimică
I.4.3. Acțiuni biologice
I.4.4. Utilizări
Capitolul II. Rolul și importanța unor extracte de origine vegetală în
terapia bolilor neurodegenerative (Alzheimer și Parkinson)
II.1. Maladia Alzheimer
II.1.1. Etiopatogenia maladiei Alzheimer
II.1.2. Farmacoterapie
II.2. Maladia Parkinson
II.2.1. Etiologia maladiei Parkinson
II.2.2. Farmacoterapie
II.3. Implicațiile unor extracte de origine vegetală în terapia bolilor
neurodegenerative
II.3.1. Neuroprotecția în maladia Alzheimer
II.3.2. Proprietățile neuroprotectoare ale extractelor de busuioc
II.3.3. Neuroprotecția în maladia Parkinson
II.3.4. Proprietățile farmacologice ale extractelor de busuioc pe
modele animale de maladie Parkinson
PARTEA PERSONALĂ
MOTIVAREA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI, SCOPUL ȘI
OBIECTIVELE URMĂRITE
Capitolul III. Analiza farmacognostică macro- și microscopică a probelor
de busuioc luate în studiu (Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn.)
III.1. Identificarea speciilor luate în studiu; caractere morfologice
iv
v
1
1
1
3
3
4
7
11
13
13
13
14
15
15
15
16
17
21
22
23
23
32
33
33
35
35
35
37
38
39
41
45
45
2
III.1.1. Material și metodă
III.1.2. Rezultate și discuții
III.2. Evidențierea caracterelor histo-anatomice ale produselor Ocimi basilici herba, Ocimi sanctum herba și Basilici purpurascens herba prin analiză
microscopică
III.2.1. Material și metodă
III.2.2. Rezultate și discuții
III.3. Concluzii
Capitolul IV. Studiul chimic al uleiurilor volatile și extractelor obținute
din cele trei specii de Ocimum (Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum
var. purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn.)
IV.1. Obținerea și analiza chimică a uleiurilor volatile din părțile aeriene ale
speciilor de Ocimum luate în studiu
IV.1.1. Obținerea uleiurilor volatile
IV.1.1.1. Material și metodă
IV.1.1.2. Rezultate și discuții
IV.1.2. Analiza calitativă a uleiurilor volatile
IV.1.2.1. Analiza calitativă a uleiurilor volatile prin gaz-
cromatografie cuplată cu spectrometrie de masă
(GC-MS)
IV.1.2.1.1. Material și metodă
IV.1.2.2. Analiza cantitativă a uleiurilor volatile utilizând
tehnica GC-FID
IV.1.2.2.1. Material și metodă
IV.1.2.3. Rezultate și discuții
IV.2. Obținerea și analiza chimică a extractelor etanolice din părțile aeriene de
Ocimum luate în studiu
IV.2.1. Obținerea extractelor etanolice
IV.2.2. Analiza chimică calitativă a componentelor bioactive
prezente în extractele etanolice
IV.2.2.1. Material și metodă
IV.2.2.2. Rezultate și discuții
IV.2.3. Analiza chimică cantitativă a componentelor bioactive
prezente în extractele etanolice
IV.2.3.1. Determinarea cantitativă a flavonoidelor
IV.2.3.1.1. Material și metodă
IV.2.3.2. Determinarea spectrofotometrică a
acizilor polifenolici
IV.2.3.2.1. Material și metodă
IV.2.3.3. Determinarea cantitativă a polifenolilor
totali
IV.2.3.3.1. Material și metodă
IV.2.3.4. Rezultate și discuții
IV.2.4. Determinarea HPLC a flavonoidelor și acizilor
polifenolcarboxilici
IV.2.4.1. Material și metodă
IV.2.4.2. Rezultate și discuții
45
45
49
49
49
53
55
56
57
57
57
58
58
59
59
59
60
65
65
66
66
68
70
70
70
72
72
74
74
76
78
78
84
3
IV.3. Concluzii
Capitolul V. Evaluarea activității antioxidante a unor extracte vegetale
obținute din specii de Ocimum
V.1. Studiul activității antioxidante in vitro a extractelor etanolice
V.1.1. Determinarea capacității de scavenger de radicali liberi
(DPPH)
V.1.1.1. Material și metodă
V.1.1.2. Rezultate și discuții
V.1.2. Determinarea capacității de chelatare a ionului feros
V.1.2.1. Material și metodă
V.1.2.2. Rezultate și discuții
V.2. Determinarea capacității antioxidante in vitro a uleiurilor volatile
V.2.1. Determinarea capacității de scavenger de radicali liberi
(DPPH)
V.2.1.1. Material și metodă
V.2.1.2. Rezultate și discuții
V.3. Concluzii
Capitolul VI. Evaluarea in vivo a activității neuroprotectoare a uleiurilor
volatile de Ocimum pe model animal de Alzheimer indus experimental
VI.1. Inducerea experimentală a modelului animal de maladie Alzheimer
VI.1.1. Material și metodă
VI.1.1.1. Inducerea modelului animal experimental
cu ajutorul beta-amiloidului
VI.1.1.2. Administrarea uleiurilor volatile la
animalele incluse în studiu
VI.2. Teste comportamentale
VI.2.1. Testul labirintului Y
VI.2.1.1. Mod de lucru
VI.2.1.2. Rezultate și discuții
VI.2.2. Testul labirintului cu brațe radiale
VI.2.2.1. Mod de lucru
VI.2.2.2. Rezultate și discuții
VI.2.3. Testul elevated-plus maze
VI.2.3.1. Mod de lucru
VI.2.3.2. Rezultate și discuții
VI.2.4. Testul de înot forțat
VI.2.4.1. Mod de lucru
VI.2.4.2. Rezultate și discuții
VI.3. Concluzii
Capitolul VII. Evaluarea acțiunii uleiurilor volatile din specii de Ocimum
asupra statusului biochimic pe omogenate de creier provenite de la
animale cu patogenie Alzheimer indusă experimental
VII.1. Material și metodă
VII.2. Determinarea activității superoxid dismutazei
VII.2.1. Material și metodă
VII.2.2. Rezultate și discuții
VII.3. Determinarea activității glutation peroxidazei
86
88
88
89
89
90
93
94
95
97
98
98
99
102
103
104
104
104
105
106
106
106
106
109
109
110
112
112
112
115
115
116
119
121
122
123
123
123
125
4
VII.3.1. Material și metodă
VII.3.2. Rezultate și discuții
VII.4. Determinarea activității catalazei
VII.4.1. Material și metodă
VII.4.2. Rezultate și discuții
VII.5. Determinarea activității malondialdehidei
VII.5.1. Material și metodă
VII.5.2. Rezultate și discuții
VII.6. Concluzii
Capitolul VIII. Concluzii generale. Gradul de originalitate. Perspective
de cercetare
CONCLUZII GENERALE
GRADUL DE ORIGINALITATE
PERSPECTIVE DE CERCETARE
BIBLIOGRAFIE
LUCRĂRI PUBLICATE IN EXTENSO DIN TEMATICA TEZEI DE
DOCTORAT
În reviste cotate ISI
125
125
126
127
127
128
129
129
131
132
132
135
135
136
155
155
5
MOTIVAREA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI, SCOPUL
ȘI OBIECTIVELE URMĂRITE
Prevalenţa afecţiunilor neurodegenerative este în continuă
creştere, fiind corelată în mod direct cu standardul de viaţă ridicat al
societății moderne. Maladia Alzheimer reprezintă forma cea mai
comună de demență, fiind întâlnită la persoanele în vârstă de peste
65 de ani. Se estimează că, la nivel mondial, până în anul 2030, 76
milioane de persoane vor fi diagnosticate cu această maladie.
Maladia Alzheimer este rezultatul unui proces multifactorial
ce declanșează o cascadă de reacţii neuropatologice şi
neuroimunologice la nivelul sistemului nervos central, fiind
caracterizată prin pierderea progresivă a memoriei şi degradarea
funcţiilor cognitive şi emoţionale.
Din punct de vedere clinic, maladia Alzheimer se
caracterizează prin disfuncții ale memoriei de scurtă și lungă durată,
dificultăți de vorbire, deprecierea personalității, dificultăți cognitive și de relaționare, afectarea capacității decizionale, dificultăți în
efectuarea activităților zilnice curente, probleme cu orientarea în
timp și spațiu.
Semnele patologice ale acestei maladii includ pierderi
neuronale, care la rândul lor sunt determinate de acumulări excesive
extracelulare de amiloid beta, Aβ (1-42) (plăci senile) și de
depozitarea intracelulară a benzilor neurofibrilare (NFT), alcătuite
din proteine tau hiperfosforilate. Aceste pierderi neuronale conduc la
degradarea proiecţiilor colinergice, noradrenergice şi serotonergice.
Procesele inflamatorii sunt declanşate de activarea de către factorii
proinflamatori a microgliilor şi astrocitelor, ce vor fi cantonate în
jurul plăcilor de amiloid. Apoptoza neuronală este localizată în
special în lobul temporal median, în regiunea CA3 hipocampică,
extinzându-se la nivelul nucleului amigdalian și, ulterior, a
cortexului frontal [159; 167].
Maladia Parkinson, considerată, după maladia Alzheimer, a
doua formă de demență din punct de vedere al incidenței, este o tulburare neurodegenerativă cronică. Se estimează că, la ora actuală,
10 milioane de oameni suferă de această boală.
Maladia Parkinson este caracterizată clinic prin deficienţe
6
motorii specifice: tremor, bradikinezie, rigiditate musculară,
instabilitate posturală. Totuşi, cu mult timp înainte de afectarea
funcţiilor motorii, are loc o deteriorare a unor funcţii non-motorii,
ceea ce determină apariția hipotensiunii ortostatice, oboselii,
anxietății, depresiei, insomniei, problemelor de memorie, confuziei,
afecțiunilor tractului urinar, constipaţiei, toate acestea putând afecta
şi deteriora semnificativ calitatea vieţii pacientului.
La nivel cerebral, sunt afectați neuronii dopaminergici din
substantia nigra şi ganglionii bazali, cu diminuarea producerii și
eliberării dopaminei, urmată de pierderea progresivă a funcţiilor
motorii normale. De asemenea, sunt prezente și agregate
intraneuronale de proteine, α-sinucleină (corpii Lewy), lucru ce
afectează semnificativ funcția mitocondrială [283].
La ora actuală, numai în Statele Unite ale Americii, costul
estimat pentru pacienții cu maladie Alzheimer se ridică la peste 226
bilioane de dolari. Se preconizează că în anul 2050 costurile pentru
pacienții cu orice formă de demență vor atinge valoarea de 1,1
trilioane de dolari. Afecțiunile neurodegenerative au implicații majore asupra
calității vieții pacienților. Degenerarea neuronală cauzează, mai ales,
afectarea capacității de integrare psiho-socială, dificultăți în
efectuarea activităților zilnice curente, precum și aspecte legate de
manipulare și independență, ceea ce face ca pacientul să necesite,
aproape în permanență, și, cu precădere, în stadiile avansate ale
bolilor, supraveghere și ajutor medical specializat.
Declinul în plan intelectual, asociat cu deprecierea calității
activităților cotidiene uzuale ale pacientului, cum ar fi spălatul,
îmbrăcatul, alimentarea, igiena persoanlă, impune ca principala
preocupare a aparținătorilor să fie aceea de a prelungi și păstra, cât
mai mult timp, o oarecare independență și un sentiment de încredere
în sine ale pacientului.
Evoluția lentă a bolii, cu degradarea funcțiilor cognitive,
dar și psihice, determină, în timp, apariția tulburărilor
comportamentale (ce pot merge până la violență fizică manifestată
împotriva aparținătorilor sau a personalului medical) și, ulterior, a celor motorii, cu imobilizare la pat în faza severă a maladiei. Aceste
evenimente pot avea un impact psihic semnificativ asupra
aparținătorilor. Astfel, aceștia trebuie consiliați și asistați
7
corespunzător, pregătiți să fie capabili să vină în întâmpinarea
nevoilor și îngrijirilor speciale ale pacientului.
La ora actuală, în farmacoterapia bolii Alzheimer sunt
înregistrate şi utilizate, în funcţie de diagnostic, câteva clase de
medicamente:
• inhibitori ai acetilcolinesterazei: donepezil [231],
galantamina [284];
• inhibitori ai acetilcolinesterazei şi butirilcolinesterazei:
rivastigmina [285];
• modulatori glutamatergici: memantina [238].
Inhibitorii de colinesterază acţionează prin creșterea
concentrației cerebrale, dar și periferice, de acetilcolină, ceea ce
determină apariția unor reacții adverse, precum creşterea secreţiei
gastrice acide, creşterea secreţiei bronşice, tulburări de ritm cardiac,
coșmaruri, greaţă, vărsături, anorexie şi diaree.
Donepezil este cel de-al doilea inhibitor de colinesterază
apărut pe piață după tacrin. Este un inhibitor selectiv al
acetilcolinesterazei, dezvoltând o acţiune procolinergică. Efectele adverse cel mai frecvent întâlnite sunt greaţă, diaree, cefalee şi
insomnie.
Rivastigmina inhibă selectiv acetilcolinesteraza şi
butirilcolinesteraza, având o acţiune colinomimetică. Este
administrat (emplastre) în formele ușoare, moderate și severe ale
maladiei. Stabilizează tulburările de comportament și funționale.
Cele mai frecvent raportate efecte adverse sunt cele
gastrointestinale: greaţă, vomă, anorexie.
Galantamina este un inhibitor selectiv de acetilcolinesterază.
Ca și rivastigmina, galantamina, administrată sub formă de capsule
retard, are rol în stabilizarea tulburărilor de comportament și a
tulburărilor funcționale, efectele adverse apărute fiind similare.
Studiile privind administrarea galantaminei în tratamentul
tulburărilor cognitive uşoare, au arătat că mortalitatea fost de până
la trei ori mai mare, comparativ cu placebo.
Inhibitorii de colinesterază se pot administra în combinaţie
cu antagonişti ai receptorilor glutamatergici. Memantina este un antagonist şi modulator al receptorilor glutamatergici NMDA,
administrarea sa fiind recomandată în demenţa severă şi moderat
severă. Memantina a arătat o tolerabilitate și efectivitate ridicate în
8
doze zilnice unice, astfel că această tactică de administrare a fost
acceptată începând cu anul 2008. Totuși, administrarea a fost
asociată cu apariţia efectelor adverse precum, sedarea, confuzia,
cefaleea şi constipaţia.
Tratamentul simptomatic al pacienţilor cu maladie Parkinson
are în vedere atenuarea simptomelor prin restabilirea circuitelor
dopaminergice şi a sinapselor striatumului. Principalul medicament
folosit la ora actuală în vederea ameliorării simptomelor maladiei
Parkinson, levodopa, este un precursor natural al dopaminei, fiind
administrat sub formă de tablete sau capsule. Deşi tratamentul cu
levodopa poate restabili continuitatea circuitelor dopaminergice,
odată cu progresul bolii şi apoptoza neuronilor dopaminergici, doza
de levodopa este eficientă pentru perioade tot mai scurte de timp.
Prin urmare, starea pacienţilor se înrăutăţeşte, în ciuda administrării
medicamentului.
În cadrul tratamentului, levodopa este asociată cu carbidopa
sau benzerazidă în vederea optimizării eficienței terapiei, dar și a
diminuării efectele secundare (grețuri, vărsături, amețeală, somnolență).
Cauzele principale ale procesului neurodegenerativ sunt cele
endogene şi cele de mediu. Dintre mecanismele patogene comune
care determină apoptoza neuronală specifică bolilor
neurodegenerative, amintim: agregarea anormală a proteinelor,
formarea în exces a speciilor reactive de oxigen, stresul oxidativ.
Speciile reactive de oxigen (anionul superoxid, radicalul
hidroxil, peroxidul de hidrogen) sunt rezultate în urma unor reacții
normale, dar și anormale ce au loc în corpul uman. În organsimul
pacienților diagnosticați cu diferite afecțiuni neurodegenerative,
sistemele antioxidante endogene (superoxid dismutază, catalază,
glutation peroxidază) nu fac faţă supraproducţiei de specii reactive
de oxigen, conducând la instalarea stării de stres oxidativ. Această
supraproducție de specii reactive de oxigen va determina
amplificarea reacțiilor de peroxidare a lipidelor membranare,
proteinelor, acizilor nucleici, crescând riscul instalării apoptozei
neuronale şi a simptomelor aferente. Sistemul nervos central este vulnerabil față de radicalii
liberi de oxigen datorită concentrațiilor mari de lipide polinesaturate
din membranele neuronilor. Astfel, datorită consumului mare de
9
oxigen și a metabolismului crescut, țesutul cerebral este predispus
agresiunilor de tip oxidativ.
Bolile neurodegenerative reprezintă, poate, cea mai
importantă problemă a sistemelor medicale din țările dezvoltate,
preconizându-se o creștere substanțială a incidenței acestor boli și în
alte țări de pe glob, pe măsura îmbunătăţirii standardului de viaţă.
Astfel, devine impetuos necesară dezvoltarea de soluții
durabile și integrate de tratament și asistență medicală, colaborând
activ și eficient cu pacienții și, mai ales, cu aparținătorii.
Totodată, este necesară accelerarea identificării de noi
substanțe care să îmbunătățească fie prognosticul bolii, fie, împreună
cu tratamentul de bază, să prelungească autonomia pacientului ce
devine tot mai depentent de îngrijirea de specialitate și atenția
aparținătorilor sau a personalului medical.
Genul Ocimum este larg răspândit și cunoscut atât în
medicina tradițională, cât și în gastronomie. Nu doar utilizările
tradiționale, dar și studii recente recomandă speciile acestui gen
pentru efecte terapeutice care pot fi avantajoase în afecțiunile neurodegenerative.
Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn. reprezintă speciile
luate în studiu în această teză de doctorat.
În contextul descris, principalele obiective ale cercetărilor
întreprinse au fost:
Stabilirea caracterelor morfologice și histo-
anatomice ale produselor vegetale luate în studiu:
Ocimi basilici herba, Ocimi sanctum herba și
Basilici purpurascens herba,
Studiul chimic al fracțiunilor volatile izolate din
cele trei surse vegetale,
Caracterizarea conținutului în polifenoli și flavone
a trei extracte etanolice realizate din Ocimum
basilicum L., Ocimum basilicum var. purpurascens
Benth., Ocimum sanctum Linn.,
Evaluarea potențialului antioxidant in vitro pentru uleiurile volatile și pentru extractele etanolice
obținute,
10
Studiul potențialului neuroprotector al fracțiunilor
volatile pe model experimental de maladie
Alzheimer,
Evaluarea activității antioxidante in vivo a
fracțiunilor volatile obținute de la speciile Ocimum
basilicum L. și Ocimum sanctum Linn..
11
Capitolul III. Analiza farmacognostică macro- și microscopică
a probelor de busuioc luate în studiu (Ocimum basilicum L.,
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth., Ocimum sanctum
Linn.)
Studiul macroscopic a urmărit precizarea caracteristicilor
morfologice a părților aeriene înflorite provenite de la speciile
Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var. purpurascens Benth.,
Ocimum sanctum Linn..
Studiul histo-anatomic a presupus analiza microscopică a
pulberilor obținute din somitățile celor trei specii de Ocimum luate în
studiu.
Toate cele trei specii s-au evidențiat prin prezența unui
număr mare de peri glandulari secretori bicelulari și octocelulari (fig. III.9, III.10).
Figura III.1. Somitățile aeriene înflorite la speciile Ocimum basilicum L.
(1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2), Ocimum sanctum
Linn. (3)
Studiul microscopic a mai evidențiat prezența perilor tectori
pluricelulari verucoși, a celulelor endocarpice cu îngroșări
moniliforme, a elementelor conducătoare, precum și a epidermelor
frunzelor și tulpinilor (fig. III.8 – 12).
12
Figura III.2. Aspect al tulpinii tetramuchiate (detaliu) la speciile Ocimum
basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2), Ocimum sanctum Linn. (3)
Figura III.3. Aspectul macroscopic al frunzelor (fața superioară) la speciile Ocimum basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2),
Ocimum sanctum Linn. (3)
Figura III.5. Aspectul macroscopic al inflorescențelor la speciile Ocimum basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2), Ocimum
sanctum Linn. (3)
13
Figura III.8. Aspectul microscopic (x40) al perilor tectori verucoși la
speciile Ocimum basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2), Ocimum sanctum Linn. (3)
Figura III.9. Aspectul microscopic (x40) al perilor glandulari bicelulari la
speciile Ocimum basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens
Benth. (2), Ocimum sanctum Linn. (3)
Figura III.10. Aspectul microscopic (x40) al perilor glandulari octocelulari
la speciile Ocimum basilicum L. (1), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2), Ocimum sanctum Linn. (profil) (3)
14
Figura III.11. Aspectul microscopic (x40) al grăuncioarelor de polen la
speciile Ocimum basilicum L. (1) și Ocimum sanctum Linn. (2)
Figura III.12. Aspectul microscopic (x40) al elementelor comune
identificate la speciile Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var. purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn..
15
Capitolul IV. Studiul chimic al uleiurilor volatile și extractelor
obținute din cele trei specii de Ocimum (Ocimum basilicum L.,
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth., Ocimum sanctum
Linn.)
IV.1. Obținerea și analiza chimică a uleiurilor volatile din
părțile aeriene ale speciilor de Ocimum luate în studiu
Materialul vegetal
Produsul vegetal a fost reprezentat de părțile aeriene
înflorite ale speciilor Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn., recoltate în perioada
iulie-august 2011, din culturi biologice realizate în câmpul
experimental al Centrului de Cercetări Biologice Stejarul, Piatra
Neamţ și depozitate în cadrul Disciplinei de Farmacognozie,
Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicină și Farmacie ―Gr.
T. Popa‖, Iași.
Obținerea uleiurilor volatile
Uleiurile volatile au fost izolate prin antrenarea cu vapori
de apă a materialului vegetal uscat obținut de la cele trei specii de busuioc luate în studiu, folosind un aparat de tip Neo-Clevenger, în
conformitate cu prevederile Farmacopeei Europene 6.0. și FR X.
Randamentul de extracție a uleiului volatil a variat în
funcție de specie, cea mai bogată sursă de ulei volatil fiind
reprezentată de busuiocul cu frunze roșii, Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth..
Tabel IV.1.
Randamentul de extracție a uleiurilor volatile din părțile aeriene ale speciilor
Ocimum analizate
Specie mL ulei volatil/100 g
produs vegetal (%, v/m)
Ocimum basilicum L. 1,18
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. 2,0
Ocimum sanctum Linn. 0,91
16
IV.1.2. Analiza calitativă a uleiurilor volatile
IV.1.2.3. Rezultate și discuții
Analiza gaz-cromatografică cuplată cu spectrometrie de
masă (GC-MS) și GC-FID a uleiurilor volatile extrase din
probele de busuioc luate în studiu.
Compoziția chimică a uleiurilor volatile izolate de la
speciile Ocimum basilicum L. – UOb, Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth. – UObp și Ocimum sanctum Linn. – UOs a fost
studiată prin GC-MS și GC-FID.
În tabelul IV.3 sunt prezentați compușii identificați în cele
trei uleiuri volatile, în ordinea eluției lor pe coloana DB-5 MS,
indicii de retenție și concentrațiile acestora.
Cei 41 de compuși identificați în UOs au reprezentat
98,98% din procentul total, în timp ce în cazul UOb, cei 34 de
compuși identificați au reprezentat 98,03% din procentul total. În ceea ce privește analiza uleiului volatil izolat de la specia
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp), cei 21 de
compuși identificați au reprezentat 98,84% din componența acestuia.
Monoterpenele oxigenate reprezintă constituenții majoritari
în toate cele trei uleiuri volatile analizate: 38,02% pentru UOb,
71,52% pentru UObp și 32,54% pentru UOs.
În toate cele trei uleiuri, compusul cel mai important din
punct de vedere cantitativ este linaloolul: 31,08% pentru UOb,
66,72% pentru UObp și 19,25% pentru UOs.
Tabelul IV.4.
Principalele grupe de compuși identificate în probele de Ocimum aetheroleum
Grupa de compuși UOb (%) UObp (%) UOs (%)
Hidrocarburi monoterpenice 3,53 1,08 3,46
Monoterpene oxigenate
(majoritar linalool) 38,02 71,52 32,54
Derivați fenilpropanici
(majoritar estragol) 18,21 - 9,88
Sescviterpene 28,59 11,77 33,31
17
Tabel IV.3.
Compuşii principali identificaţi în uleiurile volatile obținute din speciile de
busuioc analizate
Nr. TR
(min) IRa Compus
Aria %
UOb UObp UOs
1 5,47 927 -tuien - - 0,04
2 5,61 935 -pinen 0,31 - 0,34
3 5,88 938 camfen 0,26 - 0,21
4 6,21 974 sabinen 0,16 0,08 0,30
5 6,27 978 octen-3-ol 0,12 - 0,17
6 6,23 980 -pinen 0,38 0,21 0,59
7 6,42 991 mircen 0,74 0,4 0,59
8 6,48 - dehidrocineol - - 0,03
9 6,53 1000 3-octanol - - 0,04
10 6,64 1006 acetat de cis-3-hexenil 0,1 - 0,04
11 6,73 1007 1-felandren - - 0,03
12 6,77 1010 3-caren - - 0,03
13 6,90 1015 -terpinen 0,06 - 0,13
14 7,03 1028 o-cimen - 0,11 0,11
15 7,10 1031 l-limonen 0,53 0,39 0,43
16 7,18 1034 1,8-cineol 3,29 - 3,9
17 7,321 1041 trans--ocimen 0,97 - 0,67
18 7,54 1065 -terpinen 0,12 - 0,61
19 7,74 1075 L-linalool-oxid - 0,5 1,21
20 8,19 1098 L-linalool 31,08 66,72 19,25
21 9,06 1150 camfor 2,26 1,7 2,31
22 9,65 1197 -terpineol - 1,17 -
23 9,74 1200 estragol 15,57 - 7,59
24 10,00 1241 acetat de fenchil 0,1 0,74 0,1
25 10,43 1254 trans-geraniol - - 3,96
26 10,95 1291 acetat de bornil 1,29 0,69 1,78
27 11,09 1354 carvacrol - - 0,79
28 11,87 1357 eugenol 2,64 - 1,39
29 12,41 1375 -elemen 3,24 2,32 3,71
30 12,87 1421 -cariofilen 1,12 1,03 1,93
31 12,97 1439 -bergamoten 2,95 0,42 2,53
32 13,01 1440 -guaien 1,22 1,03 1,46
33 13,33 1456 -humulen 0,87 0,47 1,24
34 13,39 1482 epi-biciclosescvifelandren 8,3 1,99 1,39
35 13,66 1489 germacren 3,82 1,58 3,25
36 13,75 1491 -selinen 0,36 - 0,62
37 13,82 1504 biciclo-germacren 1,44 0,71 1,88
38 13,88 1506 -guaien 1,85 1,15 2,09
39 14,04 1566 -amorfen 2,34 1,07 3,3
40 14,83 1580 spatulenol 0,96 - 1,49
41 14,92 1585 cariofilenoxid 0,47 - 1,62
42 15,60 1515 -cadinen 0,1 - 6,8
Total 98,03 98,84 98,98 aindici Kovats calculați pe coloana capilară DB-5MS.
18
Figura IV.2. Gaz-cromatograma uleiului volatil de Ocimum basilicum L.
Figura IV.3. Gaz-cromatograma uleiului volatil de Ocimum basilicum var.
pururascens Benth.
Figura IV.4. Gaz-cromatograma uleiului volatil de Ocimum sanctum Linn.
19
IV.2.1. Obținerea extractelor etanolice
Produsul vegetal (2,5 g) a fost extras cu 100 mL etanol 50
% pe baia de apă, la reflux, timp de 30 minute. Extractul a fost filtrat
printr-un filtru de vată, într-un balon cotat de 250 mL, iar filtrul de
vată a fost reintrodus în balonul inițial cu reziduul vegetal şi extras,
din nou, pentru încă 30 de minute cu 125 mL etanol 50%. După
răcire, extractele astfel obținute au fost filtrate, reunite și concentrate
prin uscare la etuva termostatată, la 30˚C.
IV.2.2. Analiza chimică calitativă a componentelor
bioactive prezente în extractele etanolice
Studiul chimic calitativ s-a realizat prin cromatografia pe
strat subţire pentru două grupe de principii active importante din
punct de vedere farmacologic, și anume, flavonoide și acizi
polifenolcarboxilici.
Rezultatele analizei calitative prin cromatografie pe strat subțire sunt prezentate în figura IV.5, în care se poate observa
aspectul general al cromatogramelor realizate pentru derivați
flavonoidici și acizi polifenolcarboxilici.
În toate cele trei probe au fost identificați următorii
compuși: rutozidă, cvercetol, luteolin 7-glucozidă, apigenol 7-
glucozidă, apigenol, acid cafeic, acid clorogenic, acid galic.
Figura IV.5. Cromatografia pe strat subțire pentru derivații flavonoidici (A)
și pentru acizii polifenolcarboxilici (B) din extractele de busuioc
20
Tabel IV.6.
Flavonoide identificate prin tehnica cromatografiei în strat subțire în probele
investigate (A) Probă Rf exp. Culoare Component atribuit
EOb
0,23 albastru, fără fluorescență n.i.
0,39 brun-portocaliu Rutozidă
0,44 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic
0,48 albastru, slab fluorescent n.i.
0,50 brun-portocaliu Derivat de cvercetol
0,62 galben-verzui, fluorescent Luteolin-7-glucozidă
0,64 portocaliu Apigenol-7-glucozidă
0,78 bleu-verzui, slab fluorescent Ac. izoclorogenic
0,92 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic
0,95 albastru, cu fluorescență Ac. ferulic
EOs
0,23 albastru, fără fluorescență n.i.
0,39 brun-portocaliu Rutozidă
0,44 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic
0,48 albastru, slab fluorescent n.i.
0,50 brun-portocaliu Derivat de cvercetol
0,62 galben-verzui, fluorescent Luteolin-7-glucozidă
0,64 portocaliu Apigenol-7-glucozidă
0,78 bleu-verzui, slab fluorescent Ac. izoclorogenic
0,92 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic
0,95 albastru, cu fluorescență Ac. ferulic
EObp
0,23 albastru, fără fluorescență n.i.
0,44 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic
0,45 brun-portocaliu Rutozidă
0,48 albastru, slab fluorescent n.i.
0,50 brun-portocaliu Derivat de cvercetol
0,62 galben-verzui, fluorescent Luteolin-7-glucozidă
0,64 portocaliu Apigenol-7-glucozidă
0,78 bleu-verzui, slab fluorescent Ac. izoclorogenic
0,92 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic
0,95 albastru, cu fluorescență Ac. ferulic
Tabel IV.7.
Acizi polifoncarboxilici identificați prin tehnica cromatografiei în strat
subțire în probele investigate (B) Probă Rf exp. Culoare Component atribuit
EOb
0,22 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic
0,48 bleu, cu fluorescență Ac. izoclorogenic
0,72 albastru, cu fluorescență n.i
0,78 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic
EOs
0,22 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic
0,48 bleu, cu fluorescență Ac. izoclorogenic
0,72 albastru, cu fluorescență n.i
0,78 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic
EObp
0,22 bleu, cu fluorescență Ac. clorogenic
0,48 bleu, cu fluorescență Ac. izoclorogenic
0,72 albastru, cu fluorescență n.i
0,78 bleu, cu fluorescență Ac. cafeic
21
IV.2.3. Analiza chimică cantitativă a componentelor
bioactive prezente în extractele etanolice
Studiul chimic cantitativ a presupus cuantificarea
flavonoidelor, acizilor polifenolici și polifenolilor totali din
extractele etanolice obținute (Ocimum basilicum L. – EOb, specia
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp și specia
Ocimum sanctum Linn. – EOs).
Din cele trei extracte realizate, EOs s-a remarcat prin
conținutul cel mai mare de polifenoli totali (479,31 mg acid galic/g
extract uscat), fiind urmat de EObp, ce a înregistrat o valoare
apropiată (477,71 mg acid galic/g extract uscat) și de EOb (379,51
mg acid galic/g extract uscat). De asemenea, EOs s-a remarcat și
prin conținutul în acizi polifenolcarboxilici (28,99 mg acid cafeic/g
extract uscat), fiind urmat de EObp (27,32 mg acid cafeic/g extract
uscat) și de EOb (17,17 mg acid cafeic/g extract uscat). În ceea ce
privește conținutul în flavonoide, EObp a înregistrat valoarea cea
mai ridicată (192,17 mg (±) catehină/g extract uscat), fiind urmat de EOs (82,31 mg (±) catehină/g extract uscat) și de EOb (54,52 mg (±)
catehină/g extract uscat).
Figura IV.9. Conținutul în acizi polifenolici, flavonoide și polifenoli totali
în extractele etanolice - Ocimum basilicum L. (EOb), Ocimum basilicum
var. purpurascens Benth. (EObp), Ocimum sanctum Linn. (EOs)
acizi polifenolici
(mg acid cafeic)
flavonoide
(mg (±)-catehină)
polifenoli totali
(mg acid galic)
EOb 17,17 54,52 379,51
EOs 28,99 82,31 479,31
EObp 27,32 192,17 477,71
050
100150200250300350400450500
mg/g extract uscat
22
IV.2.4. Determinarea HPLC a flavonoidelor și acizilor
polifenolcarboxilici
Analiza prin cromatografie de lichide de înaltă performanță a
fost realizată în vederea caracterizării chimice calitative și semi-
cantitative a acizilor polifenolcarboxilici și flavonoidelor din cele
trei extracte etanolice concentrate obținute de la cele trei specii luate
în studiu (Ocimum basilicum L. – EOb, specia Ocimum basilicum
var. purpurascens Benth. – EObp și specia Ocimum sanctum Linn. –
EOs). Extractele au fost analizate prin compararea cu soluțiile
etalon: acid cafeic, acid clorogenic, acid t-cinamic, acid ferulic,
catehină, epicatehină, hiperozidă, apigenol 7-glucozidă, acid
rozmarinic și apigenol. Au fost identificați toți compușii, cu excepția
acidului t-cinamic și hiperozidei.
Dintre toți acizii polifenolici, acidul rozmarinic a fost cel mai
bine reprezentat în toate cele trei probe: 32,05 mg/g extract uscat în
proba EOs, 45,33 mg/g extract uscat în proba EOb, 92,89 mg/g
extract uscat în proba EObp. Concentrația flavonoidelor măsurată separat în cele trei probe a avut valori mici, aceasta fiind o
caracteristică comună tuturor extractelor.
Figura IV.18. Cromatograma HPLC obținută pentru proba Ocimum
basilicum L. (λ= 282 nm, 326 nm)
23
În continuare, sunt prezentate cromatogramele HPLC obținute
în urma analizei extractelor obținute din Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth. și Ocimum sanctum Linn..
Figura IV.19. Cromatograma HPLC obținută pentru proba Ocimum
basilicum var. purpurascens Benth. λ= 282 nm, 326 nm)
Figura IV.20. Cromatograma HPLC obținută pentru proba Ocimum
sanctum Linn. (λ= 282 nm, 326 nm)
24
Capitolul V. Evaluarea activității antioxidante a unor extracte vegetale obținute din specii de Ocimum
Existenţa unei componente fenolice importante în probele
analizate de Ocimum, precum şi proprietăţile antioxidante generale
ale polifenolilor, a orientat analiza biologică în direcţia testării
abilităţilor antioxidante a probelor incluse în studiu.
Ne-am propus să apreciem acţiunea antioxidantă in vitro a
extractelor etanolice și a uleiurilor volatile din probele de busuioc.
Evaluarea activităţii antioxidante s-a realizat prin următoarele
teste: determinarea capacităţii de scavenger faţă de radicalul
difenilpicrilhidrazil (DPPH) şi investigarea capacităţii de chelatare a
ionului feros.
V.1. Studiul activității antioxidante in vitro a extractelor
etanolice
V.1.1. Determinarea capacității de scavenger de radicali
liberi (radical DPPH)
V.1.1.2. Rezultate și discuții
Activitatea de scavenger a extractelor de Ocimum a variat
dependent de concentrație (fig. V.1). Extractul EObp (obținut din
părțile aeriene înflorite ale speciei Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth.) a fost cel mai activ dintre extractele supuse
analizei (tab. V.2).
La concentrație de 1 mg/mL, EObp a prezentat o activitate de
scavenger de 59,5±0,72%. La aceiași concentrație, EOb (obținut din
Ocimum basilicum L.) a inactivat radicalul DPPH în proporție de
47,5±0,59%, iar EOs (obținut din Ocimum sanctum Linn.), în
proporție de 21,18±0,14%.
La concentrație de 5 mg/mL, activitatea EObp (85,01±0,55%)
a fost mai scăzută comparativ cu cea a EOs (86,16±0,72%) și cu cea a EOb (91,26±0,13%). La aceiași concentrație, martorul pozitiv a
avut o activitate de peste 95%.
25
Figura V.1. Capacitatea de scavenger faţă de radicali DPPH determinată
pentru extractele etanolice obținute din cele trei specii de busuioc (Ocimum
basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp,
Ocimum sanctum Linn. – EOs)
Tabel V.1.
Valorile activității de scavenger față de radicalul DPPH înregistrate pentru
extractele etanolice obținute din cele trei specii de busuioc studiate (Ocimum
basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs)
Extract/Martor
pozitiv
15,67
mg/mL 5mg/mL 1 mg/mL
EOb 92,6 ± 0,17 91,26 ± 0,13 47,5 ± 0,59
EOs 90,7 ± 0,19 86,16 ± 0,72 21,18 ± 0,14
EObp 91,12 ± 0,08 85,01 ± 0,55 59,5 ± 0,72
Cvercetol
95,54 ± 0,05
Tabel V.2. Valorile CI50 în testul pentru determinarea capacității de scavenger faţă de
radicalul DPPH (Ocimum basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs)
Extract/Martor
pozitiv CI50 (µg/mL)
EOb 1161,7 ± 0,4
EObp 60,23 ± 0,12
EOs 2128,4 ± 0,7
Cvercetol 3,4 ± 0,05
EOb
EOs
EObp
0
20
40
60
80
100
15,67 mg/ml 5 mg/ml 1mg/ml
% a
ctivitate
d
e sc
aven
ger
fa
ta
de
rad
ical
i D
PP
H
EOb EOs EObp
26
Figura V.3. Acţiunea antioxidantă: evoluția în timp a activităţii de
scavenger faţă de radicalul DPPH (Ocimum basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs)
V.1.2. Deteminarea capacității de chelatare a ionului feros
V.1.2.2. Rezultate și discuții
Capacitatea de chelatare a extractelor etanolice de Ocimum
a variat dependent de concentrație (fig. V.4). EObp a fost cel mai
activ dintre extracte (fig. V.6). La concentrație de 5 mg/mL, valoarea
activității de chelatare a EObp a fost de 62,84±0,47%, comparativ cu
cea înregistrată pentru EOs, de 55,11±0,33%, și cea obținută pentru EOb, de 50,69±0,91%. Martorul pozitiv, acidul cafeic, a fost mai
activ la concentrație de 0,5 mg/mL, valoarea activității de chelatare
fiind de 62,94±0,32%. Tabel V.3.
Valorile activității de chelatare a ionilor feroși înregistrate pentru extractele etanolice obținute din cele trei specii de busuioc studiate (Ocimum basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum
Linn. – EOs) Extract/martor
(activitate%)
Concentrație
EOb EOs EObp Acid
cafeic
40 mg/mL 73,75±0,15 89,09±0,59 81,16±0,21
20 mg/mL 54,68±0,43 70,05±0,27 70,28±0,64
5 mg/mL 50,69±0,91 55,11±0,33 62,84±0,47
2,5 mg/mL 34,78±0,37 33,16±0,78 28,66±0,39
0,5 mg/mL 62,94±0,32
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 1 2 3 4 5
Inte
nsi
tate
ab
sorb
anță
Timp (min)
EObp
EOs
EOb
27
Figura V.4. Capacitatea de chelatare a ionului feros determinată pentru extractele
etanolice obținute din cele trei specii de busuioc (Ocimum basilicum L. – EOb,
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs)
Figura V.5. Acţiunea antioxidantă: evoluția în timp a activității de chelatare a ionului feros (Ocimum basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs)
Tabel V.4.
Acţiunea antioxidantă: concentrația inhibitorie 50 pentru capacitatea de chelatare a ionului feros (Ocimum basilicum L. – EOb, Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth. – EObp, Ocimum sanctum Linn. – EOs) Extract/Martor pozitiv CI50 (µg/mL)
EOb 4,9 ± 0,15
EObp 3,9 ± 0,03
EOs 4,3 ± 0,91
Acid cafeic 2,2 ± 0,17
EOb
EOs
EObp
0
20
40
60
80
100
40 mg/mL 20 mg/mL 5 mg/mL 2,5 mg/mL
% a
ctiv
itat
e de
chel
atar
e EOb EOs EObp
0
1
2
3
4
0 1 2 3
Inte
nsi
tate
ab
sorb
anță
Timp (min)
EObp
EOs
EOb
28
V.2. Determinarea activității antioxidante in vitro a
uleiurilor volatile
Activitatea antioxidantă a uleiurilor izolate de la cele trei
specii de Ocimum luate în studiu (Ocimum basilicum L. – UOb,
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – UObp, Ocimum
sanctum Linn. – UOs) a fost evaluată prin testarea capacității de
scavenger față de radicalii DPPH.
V.2.1. Determinarea capacității de scavenger de radicali
liberi (radicalul DPPH)
V.2.1.2. Rezultate și discuții
Capacitatea de scavenger față de radicalul DPPH a uleiurilor
volatile a indicat faptul că UObp a fost cel mai activ dintre uleiurile
volatile testate (CI50 = 3,8±0,4 µg/mL), fiind urmat de uleiul volatil
izolat de la specia Ocimum basilicum L. (CI50 = 5,3±0,6 µg/mL) și de cel obținut de la specia Ocimum sanctum Linn. (CI50 = 6,8±0,7
µg/mL).
Tabel V.5. Activitatea de scavenger față de radicalul DPPH a uleiurilor volatile obținute din cele trei specii de Ocimum (Ocimum basilicum L. – UOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – UObp, Ocimum sanctum Linn. – UOs)
Probă Concentrația (µg/mL) % activitate de scavenger față de
radicalul DPPH
UOb
200 65,07±0,63
100 54,19±0,13
50 19,4±0,25
UObp
200 78,1±0,96
100 77,3±0,48
50 8,67±0,60
UOs
200 43,57±0,76
100 20,06±0,56
50 15,28±0,42
În ceea ce privește proba de Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth. (UObp), aceasta a prezentat cea mai slabă
activitate de scavenger asupra radicalului DPPH (8,67±0,60%) la
concentrația cea mai scăzută, de 50 μg/mL comparativ cu celelalte
29
două probe. O dată cu creșterea concentrației probelor, 100 μg/mL
respectiv, 200 μg/mL, acțiunea de scavenger a crescut, înregistrând
valori de 77,3±0,48% respectiv, 78,1±0,96%. Linaloolul, testat ca și
substanță etalon, a dovedit o activitate antioxidantă mai scăzută
decât a tuturor celor trei probe de uleiuri volatile studiate, valoarea
CI50 (16,7±0,1 μg/mL) fiind de până la 4 ori mai mare decât cea a
UObp.
Figura V.7. Acţiunea antioxidantă a uleiului volatil: evoluția în timp a
activității de scavenger (Ocimum basilicum L. – UOb, Ocimum basilicum
var. purpurascens Benth. – UObp, Ocimum sanctum Linn. – UOs)
Tabel V.6.
Valorile CI50 (μg/mL) obținute în testul DPPH al probelor (μg/mL) de ulei volatil
(Ocimum basilicum L. – UOb, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. – UObp,
Ocimum sanctum Linn. – UOs)
Extract/Martor pozitiv CI50 (µg/mL)
UOb 5,3 ± 0,06
UObp 3,8 ± 0,40
UOs 6,8 ± 0,70
Linalool 16,7 ± 0,10
Aceste rezultate sunt în concordanță cu studii anterioare ce au
raportat că activitatea antioxidantă a uleiurilor volatile a fost
superioară componentelor studiate individual, indicându-se, astfel,
existența unui efect sinergic între componentele uleiului volatil [40].
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200µg/mL 100µgl/mL 50µg/mL
UOb UObp UOs
30
Capitolul VI. Evaluarea in vivo a activității
neuroprotectoare a uleiurilor volatile de Ocimum pe model
animal de Alzheimer indus experimental
VI.1. Inducerea experimentală a modelului animal de
maladie Alzheimer
Inducerea modelului animal experimental de Alzheimer cu
ajutorul beta-amiloidului [Aβ(1-42)] a fost realizată
neurochirurgical, pe șobolani Wistar anesteziați (pentobarbital sodic,
50 mg/kg corp, i.p.), prin administrarea stereotaxică
intracerebroventriculară (i.c.v.) a peptidului amiloidic beta (1-42)
(400pmoli) cu 20 de zile înaintea administrării uleiurilor volatile
(tab. VI.1), conform procedurii stabilite de Laursen și Belknap
[335].
Uleiurile volatile (Ocimum basilicum L. – UOb, Ocimum
basilicum var. purpurascens Benth. – UObp, Ocimum sanctum Linn. – UOs) au fost administrate prin inhalare. Au fost administrate câte
două concentrații pentru fiecare tip de ulei. Doza de 1% este doza
folosită la ora actuală în aromaterapie, iar cea de 3% a fost aleasă
pentru a observa o eventuală potențare a efectelor dorite [337].
Expunerea la uleiurile volatile de busuioc (200 µL, la
concentrație 1% și respectiv, 3%) a fost realizată cu ajutorul unui
vaporizator plasat într-o cutie de Plexiglas, astfel încât animalele să
nu poată avea acces direct la el. Șobolanii din grupurile pe care au
fost testate uleiurile volatile de busuioc au fost expuși vaporilor de
ulei volatil timp de 60 de minute, zilnic, timp de 21 de zile
consecutive. Conform Linck și colaboratorii (2010), perioada de 60
de minute reprezintă o perioadă de inhalare corespunzătoare
instalării efectelor dorite [338].
Animalele au fost împărțite în 10 loturi a câte 10 șobolani:
• Lotul control (fals-operat) - soluţie salină (NaCl 0,9%);
• Lotul Aβ(1-42) (control negativ) – Alzheimer experimental;
• Lotul TRM (control pozitiv – testul de înot forțat) –
Tramadol (10 mg/kg corp);
31
• Lotul DZP (control pozitiv – testul elevated-plus
maze) – Diazepam (1,5 mg/kg corp);
• Lotul Aß (1-42) + UOb1%;
• Lotul Aß (1-42) + UOb3%;
• Lotul Aß (1-42) + UObp1%;
• Lotul Aß (1-42) + UObp3%;
• Lotul Aß (1-42) + UOs1%;
• Lotul Aß (1-42) + UOs3%.
Tabel VI.1.
Codificarea probelor de uleiuri volatile luate în studiu
Ulei volatil Concentrație Codificare
Ocimum basilicum L. 1% UOb1%
3% UOb3%
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth.
1% UObp1%
3% UObp3%
Ocimum sanctum Linn. 1% UOs1%
3% UOs3%
VII.2. Teste comportamentale
Activitatea neuroprotectoare a fracțiunilor volatile izolate din
cele trei specii de Ocimum a fost evaluată cu ajutorul unor teste
specifice, fiind astfel urmărite efectele asupra memoriei de scurtă și
lungă durată (testul labirintului Y și a labirintului cu brațe radiale),
comportamentului anxios (testul elevated-plus maze) și efectele antidepresive (testul de înot forțat).
Analiza statistică
Analiza statistică a fost realizată folosind analiza variației
ANOVA (two-way ANOVA). Toate rezultatele sunt exprimate ca
media ± eroarea standard a mediei (E.S.M.), unde media reprezintă
suma valorilor determinărilor împărțite la numărul de determinări.
Valorile indicelui general F pentru care p < 0.05 au fost
considerate ca fiind semnificative statistic. Diferențele semnificative
au fost determinate cu ajutorul testului post hoc Tukey.
32
VI.2.1. Testul labirintului Y – evaluarea memoriei de
scurtă durată
Testul labirintului Y reprezintă un test specific și precis al
cuantificării memoriei spațiale la rozătoare. Testul se bazează pe
tendința acestor animale de a explora orice mediu nou în care se află.
VI.2.1.2. Rezultate și discuții
Uleiurile volatile din cele trei specii de busuioc luate în studiu
au avut efecte pozitive, de îmbunătățire a memoriei de scurtă durată
în cadrul testului labirintului Y. Uleiul obținut din specia Ocimum
basilicum var. purpurascens Benth. a înregistrat cele mai importante
efecte de îmbunătățire a memoriei de scurtă durată. Cel mai slab
efect asupra memoriei de scurtă durată a fost înregistrat pentru
grupurile expuse uleiului volatil izolat de la specia Ocimum
basilicum L..
Tabelul VI.2.
Valorile procentului de alternare spontană în cadrul testului labirintului Y
Control Aß Aß+
UOs1%
Aß+
UOb1%
Aß+
UObp1%
Aß+
UOs3%
Aß+
UOb3%
Aß+
UObp3%
65,48 38,56 66,67 60 100 77,78 80 100
69,67 45,76 77,78 75 75 81,82 66,67 86,67
59,86 48,06 70 80 100 76,92 100 66,67
68,05 44,65 86,67 75 63,64 54,54 57,14 75
72,29 40,54 84,21 77,78 83,33 100 66,67 66,67
Media 67,08 43,52 77,07 73,56 84,39 78,21 74,10 79,00
E.S.M. 2,11 1,74 3,88 3,52 7,10 7,25 7,43 6,40
Tabelul VI.3.
Valorile înregistrate pentru numărul intrărilor în brațe în cadrul testului labirintului Y
Control Aß Aß+
UOs1%
Aß+
UOb1%
Aß+
UObp1%
Aß+
UOs3%
Aß+
UOb3%
Aß+
UObp3%
9,59 8,51 8 7 8 11 7 8
10,76 5,6 11 6 10 13 8 17
10,42 5,71 12 7 4 15 4 14
13,79 5,09 17 10 24 13 9 14
12,87 7,96 21 11 8 16 5 14
Media 8,93 5,21 11,28 6,54 9,49 10,55 5,33 10,64
E.S.M. 1,63 0,92 2,03 1,16 2,12 1,93 0,94 1,88
33
Figura VI.1. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb),
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp) și Ocimum sanctum Linn. (UOs) asupra procentului de alternare spontană în cadrul testului
labirintului Y. Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10 animale per
grup), p < 0.0004 vs. grupul de control
Figura VI.2. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp) și Ocimum sanctum
Linn. (UOs) asupra numărului de intrări în brațe în cadrul testului
labirintului Y. Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10 animale per
grup), p < 0.0098 vs. grupul de control
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Pro
cen
tul d
e al
tern
are
sponta
mă
(%)
Testul labirintului Y
0
5
10
15
20
Num
ărul
intr
ăril
or
în b
rațe
Testul labirintului Y
34
VI.2.2. Testul labirintului cu brațe radiale – evaluarea
memoriei de scurtă și de lungă durată
Pentru a studia dacă uleiurile volatile obținute din specia
Ocimum sanctum Linn. (UOs) influențează formarea memoriei
spațiale, animalele au fost supuse testului labirintului cu brațe
radiale.
Testul labirintului cu brațe radiale este un test foarte des
folosit de către cercetătorii din domeniul neuroștiinței
comportamentale [341]. Acest test este extrem de util în evaluarea
efectelor diferitelor medicamente asupra proceselor de memorare.
Memoria de referință și memoria de lucru reprezintă două
variabile ce indică statusul fiziologic cerebral [342].
VI.2.2.2. Rezultate și discuții
Valorile parametrilor înregistrați pentru testul labirintului cu
brațe radiale sunt prezentate în figura VI.3 și tabelele VI.4 și VI.5. Testul pentru evaluarea memoriei de scurtă și de lungă durată
(testul labirintului cu brațe radiale) a permis realizarea următoarelor
observații:
- uleiurile volatile din speciile de busuioc luate în studiu
îmbunătățesc performanțele memoriei spațiale ale modelului animal
de demență;
- uleiul volatil (1%) obținut de la specia Ocimum sanctum
Linn. a înregistrat efectele cele mai importante.
Tabelul VI.4.
Valorile erorilor memoriei de referință înregistrate pentru loturile control, Aβ(1-42) și cele expuse la concentrațiile de 1%, respectiv 3% ale uleiului
volatil obținut din specia Ocimum sanctum Linn. Zile de
antrenament
Lot
1 2 3 4 5 6 7 Media E.S.M.
Control 2,83 2,17 2,50 2,17 2,00 1,70 1,83 2,17 0,15
Aβ(1-42) 3,00 3,00 3,00 3,00 2,83 2,73 2,33 2,84 0,09
Aβ(1-42)+UOs1% 2,73 2,63 3,00 2,67 2,00 1,83 2,00 2,41 0,17
Aβ(1-42)+UOs3% 2,73 2,50 2,60 2,67 2,33 2,00 2,17 2,43 0,10
35
Tabelul VI.5.
Valorile erorilor memoriei de lucru înregistrate pentru loturile control,
Aβ(1-42) și cele expuse la concentrațiile de 1% și respectiv, 3%, ale uleiului
volatil obținut din specia Ocimum sanctum Linn. Zile de
antrenament
Lot
1 2 3 4 5 6 7 Media E.S.M.
Control 1,17 0,33 0,33 0,33 0,00 0,17 0,00 0,33 0,15
Aβ(1-42) 3,17 4,33 4,17 3,17 3,00 2,67 3,17 3,38 0,23
Aβ(1-42)+UOs1% 1,33 0,83 1,00 0,50 0,33 0,50 0,17 0,67 0,15
Aβ(1-42)+UOs3% 1,17 0,68 0,51 0,21 0,00 0,00 0,00 0,37 0,17
Figura VI.3. Efectele uleiului volatil din specia Ocimum sanctum Linn.
(UOs1%, UOs3%) folosit în cadrul testului labirintului cu brațe radiale
asupra erorilor memoriei de referință (a) și erorilor memoriei de lucru (b) în
0
1
2
3
4
5
1 2 3 4 5 6 7
Ero
rile
m
emo
riei
de
refe
rin
ță
Zile de antrenament
Control
Aβ(1-42)
Aβ(1-42)+UOs1%
Aβ(1-42)+UOs3%
0
1
2
3
4
5
1 2 3 4 5 6 7
Ero
rile
m
emo
riei
de
lucru
Zile de antrenament
Control
Aβ(1-42)
Aβ(1-42)+UOs1%
Aβ(1-42)+UOs3%
(a)
(b)
36
timpul celor 7 zile de antrenament. Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n =
10 animale per grup), *p < 0.0001 vs. grupul de control
VI.2.3. Testul elevated-plus maze – evaluarea
comportamentului anxios
Anxietatea și comportamentul motor au fost evaluate prin
observarea comportamentului în testul elevated plus-maze.
Anxietatea și depresia sunt simptome comune ale pacienților
diagnosticați cu maladie Alzheimer, fiind asociate cu durata și severitatea demenței, precum și cu nivelul scăzut al educației
individului [345].
VI.2.3.2. Rezultate și discuții
Valorile parametrilor înregistrați pentru testul elevated plus-
maze sunt prezentate în figurile VI.4 și VI.5 și tabelele VI.6 și VI.7.
Testul pentru evaluarea comportamentului anxios și a celui
motor a evidențiat că expunerea animalelor tratate cu beta-amiloid la
uleiurile volatile de busuioc luate în studiu a determinat efecte
anxiolitice. Uleiul obținut de la specia Ocimum sanctum Linn. a
înregistrat cele mai importante efecte anxiolitice, indiferent de
concentrație. Cele mai slabe efecte au fost observate pentru uleiul
volatil obținut de la specia Ocimum basilicum L..
Tabelul VI.6.
Valorile înregistrate pentru timpul petrecut în brațele deschise (%) în cadrul
testului labirintului elevated-plus maze
Contr. DZP Aß Aß+
UOs1%
Aß+
UOb1%
Aß+
UObp1%
Aß+
UOs3%
Aß+
UOb3%
Aß+
UObp3%
0 0 0 50 0 25 20 57,14 28,57
36,36 30 0 45,45 33,33 25 42,86 40 0
28,57 28,57 20 33,33 40 33,33 42,86 25 43,75
33,33 14,29 0 33,33 0 16,67 37,5 66,67 60
Media 24,57 18,22 5,00 40,53 18,33 25,00 35,81 47,20 33,08
E.S.M. 8,34 7,03 5,00 4,26 10,67 3,40 5,42 9,23 12,76
Animale din grupurile expuse uleiurilor volatile de
concentrație 3% au prezentat o creștere a timpului petrecut în brațele deschise mai bună, comparativ cu animalele cărora le-au fost
37
administrate uleiurile volatile în concentrație de 1%, sugerând efecte
anxiolitice mai bune la administrarea uleiurilor volatile în
concentrație 3%.
Tabelul VI.7.
Valorile înregistrate pentru numărul intrărilor în brațele deschise în cadrul testului labirintului elevated-plus maze
Control DZP Aß Aß+
UOs1%
Aß+
UOb1%
Aß+
UObp1%
Aß+
UOs3%
Aß+
UOb3%
Aß+
UObp3%
0 0 0 4 0 1 1 4 2
4 3 0 5 1 1 3 2 0
2 2 1 2 2 1 3 1 7
2 1 0 2 0 1 3 2 3
Media 2,00 1,50 0,25 3,25 0,75 1,00 2,50 2,25 3,00
E.S.M. 0,82 0,65 0,25 0,75 0,48 0,00 0,50 0,63 1,47
Figura VI.4. . Efectele uleiurilor volatile din speciile Ocimum basilicum L.
(UOb1%, UOb3%), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp1%,
UObp3%) și Ocimum sanctum Linn. (UOs1%, UOs3%) folosite în cadrul testului elevated-plus maze asupra valorilor parametrilor înregistrați pentru
timpul petrecut în brațele deschise (%).Valorile reprezintă media ± E.S.M.
(n = 10 animale per grup), p < 0.0259 vs. grupul de control
Animale din grupurile expuse uleiurilor volatile de
concentrație 3% au prezentat o creștere a numărului de intrări în brațele deschise mai bună, comparativ cu animalele cărora le-au fost
administrate uleiurile volatile în concentrație de 1%.
0
20
40
60
Tim
pul
petr
ecut ăn
bra
țele
desc
his
e (
%)
Elevated -p lus maze
38
Figura VI.5. Efectele uleiurilor volatile din speciile Ocimum basilicum L.
(UOb1%, UOb3%), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp1%, UObp3%) și Ocimum sanctum Linn. (UOs1%, UOs3%) din cadrul testului
elevated-plus maze asupra valorilor înregistrate pentru numărul intrărilor în
brațele deschise. Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10 animale per
grup), p < 0.0833 vs. grupul de control
VI.2.4. Testul de înot forțat – evaluarea răspunsului
depresiv
Testul de înot forțat a fost validat ca fiind o metodă
corespunzătoare în analiza efectelor antidepresive ale
medicamentelor [350]. Când rozătoarele sunt obligate să înoate într-
un spațiu limitat, după o inițială perioadă de zbatere, ele vor începe
să plutească, stare ce se aseamănă cu cea de depresie mentală.
VI.2.4.2. Rezultate și discuții
Au fost evaluați doi parametri: timpul de înot al animalului și
timpul de imobilitate.
Testul pentru evaluarea răspunsului depresiv a evidențiat că
uleiurile volatile obținute din speciile de busuioc incluse în studiu au acționat avantajos asupra comportamentului depresiv, prin
0
1
2
3
4
5
Num
ărul
intr
ăril
or
în b
rațe
le d
esc
his
e
Elevated -p lus maze
39
mecanisme intrinseci cerebrale, invers proporțional cu concentrația
dozei administrate: fracțiunile volatile administrate în concentrație
1% au fost mai active decât cele în concentrație 3%.
Cel mai important efect a fost observat pentru uleiul volatil
izolat de la specia Ocimum basilicum var. purpurascens Benth., care
a prezentat cele mai bune efecte la concentrația de 1%. Cel mai slab
efect a fost înregistrat pentru uleiul volatil obținut de la specia
Ocimum sanctum Linn..
Tabelul VI.8.
Valorile timpului de înot (secunde) în cadrul testului de înot forțat
Control Aß TRM Aß+
UOs1%
Aß+
UOb1%
Aß+
UObp1%
Aß+
UOs3%
Aß+
UOb3%
Aß+
UObp3%
241 154 114 235 235 303 224 172 234
89 108 126 287 221 292 214 230 308
137 114 105 299 297 276 167 279 273
130 94 180 192 262 244 172 219 229
Media 149,25 117,5 131,25 253,25 253,75 278,75 194,25 225 261
E.S.M. 32,36 12,87 16,81 24,69 16,74 12,84 14,47 21,96 18,50
Figura VI.6. Efectele uleiurilor volatile de busuioc, Ocimum basilicum L.
(UOb1%, UOb3%), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp1%,
UObp3%) și Ocimum sanctum Linn. (UOs1%,U Os3%), asupra valorilor timpului de înot al șobolanilor tratați cu Aβ (1-42), în timpul perioadei de 6
minute a testului de înot forțat. Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10
animale per grup), **p < 0.00001, *p < 0.0001 vs. grupul de control
0
100
200
300
400
Tim
pul
de î
no
t (s
ecunde)
Testul de înot forțat
40
Tabelul VI.9.
Valorile timpului de imobilitate (secunde) în cadrul testului de înot forțat
Control Aß TRM Aß+
UOs1%
Aß+
UOb1%
Aß+
UObp1%
Aß+
UOs3%
Aß+
UOb3%
Aß+
UObp3%
119 206 246 187 125 57 146 188 126
271 252 234 125 139 68 193 130 52
223 246 255 73 159 84 198 189 87
230 266 180 168 98 116 184 141 131
Media 210,75 242,5 228,75 138,25 130,25 81,25 180,25 162 99
E.S.M. 32,36 12,87 16,81 25,32 12,82 12,84 11,78 15,47 18,50
Figura VI.7. Efectele uleiurilor volatile de busuioc, Ocimum basilicum L.
(UOb1%, UOb3%), Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (UObp1%,
UObp3%) și Ocimum sanctum Linn. (UOs1%, UOs3%), asupra timpului de
imobilitate al șobolanilor tratați cu Aβ (1-42), în cadrul testului de înot forțat. Valorile reprezintă media ± S.E.M. (n = 10 animale per grup), **p <
0.00001, *p < 0.0001 vs. grupul de control
La concentrații de 3% ulei volatil administrat în camera de
vaporizare, timpul de imobilitate scade, înregistrând volari mai mici
față de control și martorul pozitiv pentru probele de ulei volatil UOb
și UOs, în timp ce, lotul căruia i-a fost administrat UObp3%, își
menține eficacitatea față de control și martor pozitiv. Pentru toate probele, efectele sunt inferioare celor
înregistrate la administrarea uleiului în concentrație de 1%.
0
100
200
300
Tim
pul
de i
mo
bil
itat
e (
secu
nde)
Testul de înot forțat
41
Capitolul VII. Evaluarea acțiunii uleiurilor volatile din
specii de Ocimum asupra statusului biochimic pe omogenate de
creier provenite de la animale cu patogenie Alzheimer indusă
experimental
După evaluarea performanţelor cognitive prin teste
specifice (testul labirintului Y, testul labirintului cu brațe radiale,
testul elevated-plus maze, testul de înot forțat), a fost determinată
activitatea unor antioxidanți endogeni în probe de creier (amigdală)
provenite de la animalele din grupurile de tratament.
Analiza statistică
Analiza statistică a fost realizată folosind analiza variației
ANOVA (two-way ANOVA). Toate rezultatele sunt exprimate ca
media ± eroarea standard a mediei (E.S.M.), unde media reprezintă
suma valorilor determinărilor împărțite la numărul de determinări.
VII.2. Determinarea activității superoxid dismutazei
Amiloidul beta exercită un puternic efect pro-oxidant
caracterizat prin diminuarea activității specifice a superoxid
dismutazei (SOD, E.C. 1.15.1.1).
VII.2.2. Rezultate si discuții
Rezultatele obținute pentru evaluarea activității superoxid
dismutazei din omogenatele de hipocamp sunt redate în tabelul VII.1
și figura VII.1.
Datele obținute arată o creștere semnificativă a activității
superoxid dismutazei specifice în grupurile tratate cu Aβ (1-42) și
expuse ulterior diferitelor concentrații de uleiuri volatile, comparativ
cu grupurile tratate doar cu Aβ (1-42).
La concentrații de 3%, uleiurile volatile au fost mai eficiente comparativ cu cele de concentrație 1%.
Cel mai important efect a fost observat pentru uleiul volatil
izolat de la specia Ocimum basilicum L..
42
Tabelul VII.1.
Activitatea superoxid dismutazei în omogenatele de hipocamp (USOD/mg
proteină)
Control Aß(1-42) Aß(1-42)+
UOs1%
Aß(1-42)+
UOb1%
Aß(1-42)+
UOs3%
Aß(1-42)+
UOb3%
0,35 0,37 0,7 0,67 0,74 0,92
0,35 0,37 0,7 0,73 0,8 0,85
0,4 0,36 0,42 0,76 0,91 0,7
Media 0,37 0,37 0,61 0,72 0,82 0,82
E.S.M. 0,02 0,00 0,09 0,03 0,05 0,06
Figura VII.1. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb) și
Ocimum sanctum Linn. (UOs) (Aβ (1-42) + UOs1%, Aβ (1-42) + UOb1%,
Aβ (1-42) + UOs3%, Aβ (1-42) + UOb3%) asupra activității specifice a
superoxid dismutazei la șobolanii tratați cu Aβ (1-42). Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10 animale per grup), *p < 0.0001
VII.3. Determinarea activității glutation peroxidazei
Glutation peoxidaza (GPX, E.C. 1.11.1.9) este o enzimă
seleniu-dependentă, prezentă în toate celulele corpului uman, ca
parte a sistemelor antioxidante endogene. În cadrul studiului de față,
activitatea enzimei glutation peroxidază a fost evaluată monitorizând
capacitatea ei de a oxida fotochimic glutationul (GSH).
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
US
OD
/mg p
rote
ină
Superoxid dismutaza
43
VII.3.2. Rezultate si discuții
Datele obținute indică o creștere semnificativă a activității
glutation peroxidazei în grupurile tratate cu Aβ (1-42) și care au fost
ulterior expuse uleiurilor volatile, comparativ cu grupurile control și
cel tratat doar cu Aβ (1-42). Uleiul volatil de Ocimum basilicum L.,
administrat în concentrație 3% a înregistrat cele mai importante
efecte. La concentrații de 1%, cel mai activ a fost uleiul izolat de la
specia Ocimum sanctum Linn..
Tabelul VII.2.
Activitatea glutation peroxidazei în omogenatele de hipocamp (UGPX/mg proteină)
Control Aß(1-42) Aß(1-42)+
UOs1%
Aß(1-42)+
UOb1%
Aß(1-42)+
UOs3%
Aß(1-42)+
UOb3%
0,35 0,37 0,68 0,36 0,82 0,92
0,35 0,37 0,82 0,12 0,84 1,03
0,4 0,36 0,66 0,94 0,01 1,21
Media 0,37 0,37 17,01 18,38 20,67 24,27
E.S.M. 0,02 0,00 0,42 1,28 0,55 1,81
Figura VII.2. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb) și Ocimum sanctum Linn. (UOs) (Aβ (1-42) + UOs1%, Aβ (1-42) + UOb1%,
Aβ (1-42) + UOs3%, Aβ (1-42) + UOb3%) asupra activității specifice a
glutation peroxidazei la șobolanii tratați cu Aβ (1-42). Valorile reprezintă
media ± E.S.M. (n = 10 animale per grup), *p < 0.0631
0,0
0,5
1,0
1,5
UG
PX
/mg p
rote
ină
Glutation peroxidaza
44
VII.4. Determinarea activității catalazei
Catalaza (CAT, E.C. 1.11.1.6) este o enzimă cu rol
antioxidant, prezentă în toate celulele corpului, fiind localizată la
nivelul peroxizomilor. Ea catalizează descompunerea peroxidului de
hidrogen la apă și oxigen molecular.
VII.4.2. Rezultate si discuții
Rezultatele obținute pentru evaluarea activității catalazei
din omogenatele de hipocamp sunt redate în tabelul VII.3 și figura
VII.3.
Studiul asupra activității catalazei a evidențiat că
administrarea uleiurilor volatile a determinat o creștere a activității
specifice a acesteia.
Efectele înregistrate în urma administrării uleiurilor volatile
în concentrație 3% au fost mai bune decât cele observate în cazul
administrării uleiurilor în concentrație 1%.
Cel mai important efect a fost observat pentru uleiul volatil
izolat de la specia Ocimum basilicum L..
Tabelul VII.3.
Activitatea catalazei în probele de omogenate luate în studiu (µmol de
H2O2/min/mg proteină)
Control Aß(1-42) Aß(1-42)+
UOs1%
Aß(1-42)+
UOb1%
Aß(1-42)+
UOs3%
Aß(1-42)+
UOb3%
0,35 0,37 16,64 15,92 20,85 22,91
0,35 0,37 16,54 18,95 19,64 22,05
0,4 0,36 17,85 20,25 21,50 27,85
Media 0,37 0,37 0,72 0,48 0,56 1,05
E.S.M. 0,02 0,00 0,05 0,25 0,27 0,08
Se poate observa efectul benefic mai pronunțat, în special al
uleiului volatil de Ocimum basilicum L., la concentrația de 3%,
asupra creșterii activității specifice a catalazei la nivelul
omogenatelor obținute din lobii temporali comparativ cu uleiul izolat
de la specie Ocimum sanctum Linn la aceiași concentrație, de 3%.
45
Figura VII.3. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb) și
Ocimum sanctum Linn. (UOs) (Aβ (1-42) + UOs1%, Aβ (1-42) + UOb1%, Aβ (1-42) + UOs3%, Aβ (1-42) + UOb3%) asupra activității specifice a
catalazei la șobolanii tratați cu Aβ (1-42). Valorile reprezintă media ±
E.S.M. (n = 10 animale per grup), * p < 0.0001
VII.5. Determinarea activității malondialdehidei
Creșterea concentrației malondialdehidei (MDA) reprezintă
un important marker al peroxidării lipidice in vivo [362].
Peroxidarea lipidică a fost măsurată indirect prin măsurarea
spectrofotometrică a malonaldehidei, folosind metoda propusă de
Ohkawa și colab., cu acid tiobarbituric [364].
VII.5.2. Rezultate și discuții
Rezultatele obținute pentru evaluarea activității
malondialdehidei din omogenatele de hipocamp sunt redate în
tabelul VII.4 și figura VII.4. Studiul asupra activității malondialdehidei a evidențiat că
administrarea uleiurilor volatile în două concentrații, de 1% și
respectiv, 3%, a determinat o creștere a concentrației
malondialdehidei.
0
10
20
30
μm
ol H
20
2 c
osu
maț
i/m
in/
mg p
rote
ină
Catalaza
46
Tabel VII.4.
Activitatea malondialdehidei în probele de omogenate luate în studiu
(nmol/mg proteină)
Control Aß(1-42) Aß(1-42)+
UOs1%
Aß(1-42)+
UOb1%
Aß(1-42)+
UOs3%
Aß(1-42)+
UOb3%
0,35 0,37 8,58 7,96 8,23 12,83
0,35 0,37 7,19 9,96 7,96 9,62
0,4 0,36 7,47 9,46 9,45 11,81
Media 0,37 0,37 7,75 9,13 8,55 11,42
E.S.M. 0,02 0,00 0,42 0,60 0,46 0,95
Figura VII.4. Efectele uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. (UOb) și
Ocimum sanctum Linn. (UOs) (Aβ (1-42) + UOs1%, Aβ (1-42) + UOb1%,
Aβ (1-42) + UOs3%, Aβ (1-42) + UOb3%) asupra activității specifice a
malondialdehidei la șobolanii tratați cu Aβ (1-42). Valorile reprezintă media ± E.S.M. (n = 10 animale per grup), *p < 0.0001
La concentrații de 1%, între grupurile Aβ (1-42) + UOs1%
și Aβ (1-42) + UOb1% nu a fost evidențiată o diferență notabilă din
punct de vedere statistic, uleiul obținut din specia Ocimum basilicum
L. (UOb) fiind doar cu puțin mai eficient decât cel obținut din specia
Ocimum sanctum Linn. (UOs). La concentrații de 3%, a fost observată o diferență
semnificativă statistic între grupurile Aβ (1-42) + UOs3% și Aβ (1-
42) + UOb3%, uleiul volatil UOb administrat șobolanilor din grupul
respectiv de studiu exercitând efecte mai bune de atenuare a
peroxidării lipidice decât uleiul izolat de la specia Ocimum sanctum
Linn. (UOs).
0
5
10
15
nm
ol/
mg p
rote
ină
Malondialdehida
47
Capitolul VIII. Concluzii generale. Gradul de
originalitate. Perspective de cercetare
Cercetarea de față are ca scop evidențierea acțiunii biologice
a unor extracte (extracte etanolice, fracțiuni volatile) din trei specii
de busuioc introduse în culturi biologice, în România.
Unul dintre aspectele de originalitate ale tezei se referă la
investigarea varietății de busuioc cu frunze roșii, Ocimum basilicum
var. purpurascens Benth., varietate recent introdusă în culturi
biologice.
Rezultatele investigațiilor fitochimice și biologice asupra
speciilor Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn., permit evidențierea
următoarelor concluzii:
Analiza farmacognostică macro- și microscopică a
permis studiul caracteristicilor morfologice și evidențierea
elementelor histo-anatomice specifice celor trei specii de Ocimum studiate. A fost observată existența unor diferențe
macroscopice în ceea ce privește morfologia frunzelor și a
culorii florilor. Din punct de vedere microscopic, toate
speciile sunt caracterizate de prezența unui număr mare de
peri glandulari secretori bicelulari și octocelulari, precum și
a perilor tectori verucoși pluricelulari, cantonați mai ales pe
epiderma inferioară, de-a lungul nervurii principale.
În ceea ce privește randamentul de extracție a uleiurilor
volatile, valoarea cea mai mare a fost înregistrată pentru
specia Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (2%).
Pentru celelalte două specii luate în studiu, valorile
randamentului de extracție a uleiurilor volatile au fost
următoarele: 1,18% pentru specia Ocimum basilicum L. și
0,91% pentru specia Ocimum sanctum Linn..
Analiza gaz-cromatografică (GC-MS și GC-FID) a celor
trei uleiuri volatile obținute din speciile de busuioc luate în
studiu a evidențiat un procent ridicat în monoterpene oxigenate în toate cele trei probe: 71,52% în proba de
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth., 38,02% în
proba de Ocimum sanctum Linn. și 35,54% în proba de
48
Ocimum basilicum L.. Componentul majoritar evidențiat în
toate probele a fost linaloolul. Conținutul cel mai ridicat în
linalool a fost înregistrat în proba UObp (66,72%), urmată
de proba UOb (31,08%) și de proba UOs (19,25%).
Analiza chimică cantitativă, prin metode
spectrofotometrice a extractelor etanolice obținute din
Ocimum basilicum L., Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth., Ocimum sanctum Linn., a permis
determinarea conținutului în polifenoli totali (mg acid
galic/g extract), a flavonoidelor (mg (+)-catehină/g extract)
și a acizilor polifenolcarboxilici (mg acid cafeic/g extract).
Din cele trei extracte etanolice, extractul obținut din
Ocimum sanctum Linn. s-a remarcat printr-un conținut
ridicat în polifenoli totali (479,31 mg acid galic/g extract) și
acizi polifenolcarboxilici (28,99 mg acid cafeic/g extract),
iar cel obținut din Ocimum basilicum var. purpurascens
Benth. printr-un conținut mare de flavonoide (192,17 mg
(+)-catehină/g extract).
Analiza HPLC a extractelor a pus în evidență prezența
următoarelor componente: acid rozmarinic, acid clorogenic,
acid cafeic, acid ferulic, catehină, epicatehină, apigenol 7-
glucozidă și apigenol. Dintre toți acizii polifenolici, acidul
rozmarinic a fost regăsit în cantitatea cea mai mare: 32,05
mg/g extract uscat în proba de Ocimum sanctum Linn.,
45,33 mg/g extract uscat în proba de Ocimum basilicum L.
și 92,89 mg/g extract uscat în proba de Ocimum basilicum
var. purpurascens Benth..
Acțiunea antioxidantă a extractelor etanolice obținute
din cele trei specii de Ocimum analizate a fost evidențiată
prin două teste:
în testul privind evaluarea capacității de
scavenger față de radicalul DPPH, extractul din
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. (CI50
= 60,23±0,12 µg/mL) a fost mai activ decât cel din
Ocimum basilicum L. (CI50 = 1161,7±0,4 µg/mL) și decât cel din Ocimum sanctum Linn. (CI50 =
2128,4±0,7 µg/mL),
49
capacitatea de chelatare a ionilor feroși a indicat
faptul că extractul obținut din Ocimum basilicum
var. purpurascens Benth. a fost cel mai activ
dintre extracte (CI50 = 3,9±0,03 µg/mL), urmat de
extractul din Ocimum sanctum Linn. (CI50 =
4,3±0,91 µg/mL) și de cel din Ocimum basilicum
L. (CI50 = 4,9±0,15 µg/mL).
Acțiunea antioxidantă a uleiurilor volatile a fost evaluată
prin studiul capacității de scavenger față de radicalul
DPPH, uleiul izolat de la specia Ocimum basilicum var.
purpurascens Benth. fiind cel mai activ dintre toate
uleiurile analizate (CI50 = 3,8±0,4 µg/mL). Uleiurile
obținute din Ocimum basilicum L. și Ocimum sanctum
Linn. au prezentat o activitate comparabilă în ceea ce
privește inactivarea radicalului DPPH (CI50 = 5,3±0,6
µg/mL și respectiv, CI50 = 6,8±0,7 µg/mL).
Evaluarea in vivo a activității neuroprotectoare a celor trei fracțiuni volatile de Ocimum a constat în studiul
efectelor asupra memoriei de scurtă și de lungă durată,
asupra comportamentului anxios și asupra
comportamentului depresiv pe modele animale de maladie
Alzheimer indusă experimental:
evaluarea memoriei de scurtă durată a
evidențiat faptul că toate cele trei uleiuri volatile
au avut efecte pozitive, de îmbunătățire a acesteia.
Fracțiunea volatilă izolată de la specia Ocimum
basilicum var. purpurascens Benth. a înregistrat
cele mai importante efecte de îmbunătățire a
memoriei de scurtă durată, secondată fiind de cea
izolată de la Ocimum sanctum Linn. și cea de la
Ocimum basilicum L.. De asemenea, expunerea
animalelor de laborator la concentrațiile de 3% ale
uleiurilor a determinat o creștere a procentului de
alternări spontane, comparativ cu animalele
expuse unei concentrații de 1%, în cadrul testului pentru evaluarea memoriei de
scurtă și de lungă durată fracțiunile volatile au
îmbunătățit performanțele memoriei spațiale ale
50
modelului animal de demență, uleiul volatil (1%)
obținut de la specia Ocimum sanctum Linn.
înregistrând cele mai bune efecte,
testul pentru evaluarea comportamentului
anxios a evidențiat faptul că uleiul obținut de la
specia Ocimum sanctum Linn. a înregistrat cele
mai importante efecte anxiolitice, indiferent de
concentrație, urmat fiind de uleiul volatil de
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. și de
cel de Ocimum basilicum L.. Animale din
grupurile expuse uleiurilor volatile de concentrație
3% au prezentat o creștere a procentului de intrări
în brațele deschise mai importantă, comparativ cu
animalele cărora le-au fost administrate uleiurile
volatile în concentrație 1%, sugerându-se, astfel,
efecte anxiolitice mai pregnante pentru uleiurile
volatile de concentrație 3%,
testul pentru evaluarea răspunsului depresiv a evidențiat faptul că uleiurile volatile au acționat
avantajos asupra comportamentului depresiv,
invers proporțional cu concentrația dozei
administrate. Cel mai important efect a fost
observat pentru uleiul volatil izolat de la specia
Ocimum basilicum var. purpurascens Benth.,
urmat de uleiul obținut de la specia Ocimum
basilicum L. și de cel izolat de la specia Ocimum
sanctum Linn.. Contrar așteptărilor, concentrațiile
ridicate de ulei volatil (3%) au înregistrat timpi de
înot diminuați față de concentrația mai mică (1%),
cu toate că și-au păstrat eficiența față de control și
martor pozitiv, sugerând un efect antidepresiv mai
slab al uleiurilor volatile administrate în
concentrație 3%.
Evaluarea acțiunii uleiurilor volatile asupra statusului
biochimic pe omogenate de creier provenite de la animale cu patogenie Alzheimer indusă experimental a permis
obținerea de rezultate doar pentru efectele uleiurilor de
Ocimum basilicum L. și Ocimum sanctum Linn.. A fost
51
determinată activitatea unor antioxidanți endogeni în
probele de creier recoltate de la animalele din grupurile de
tratament:
studiul efectului asupra activității superoxid
dismutazei a evidențiat creșterea activității
acesteia în urma administrării fracțiunilor volatile.
La concentrații de 3%, uleiurile volatile au fost
mai eficiente comparativ cu cele de concentrație
1%, iar cel mai important efect a fost observat
pentru uleiul volatil izolat de la specia Ocimum
basilicum L.,
studiul efectului asupra activității glutation
peroxidazei a evidențiat creșterea activității
acesteia în urma administrării uleiurilor volatile.
La concentrații de 3%, uleiul volatil de Ocimum
basilicum L. a înregistrat cele mai importante
efecte. La concentrații de 1%, cel mai activ a fost
uleiul izolat de la specia Ocimum sanctum Linn., studiul efectului asupra activității catalazei a
evidențiat creșterea activității acesteia în urma
administrării fracțiunilor volatile. Efectele
înregistrate în urma administrării uleiurilor volatile
în concentrație 3% au fost mai bune decât cele
observate în cazul administrării uleiurilor în
concentrație 1%. Cel mai important efect a fost
observat pentru uleiul volatil izolat de la specia
Ocimum basilicum L., atât la concentrație 1%, cât
și la concentrație 3%,
studiul efectului asupra activității
malondialdehidei a evidențiat creșterea
concentrației acesteia în urma administrării
uleiurilor volatile, efectele uleiurilor de
concentrație 3% fiind mai importante decât cele
ale uleiurilor de concentrație 1%. Cel mai
important efect a fost observat pentru uleiul volatil izolat de la specia Ocimum basilicum L. atât la
concentrație 1%, cât și la concentrație 3%.
52
Gradul de originalitate. Perspective de cercetare
Originalitatea studiului de față constă în:
investigarea pentru prima oară în țara noastră a varietății de
busuioc roșu, Ocimum basilicum var. purpurascens Benth.,
caracterizarea spectrului polifenolic, precum și a fracținii
volatile izolate din părțile aeriene înflorite de Ocimum
basilicum var. purpurascens Benth. în condiţiile în care, în
literatura de specialitate, există foarte puține date privind
identitatea polifenolilor și a compușilor uleiului volatil
obținuți din părțile aeriene înflorite ale acestei varietăți,
caracterizarea chimică și evaluarea activității antioxidante
in vitro a uleiurilor volatile izolate din Ocimum basilicum
L., Ocimum basilicum var. purpurascens Benth. și Ocimum
sanctum Linn.,
evidențierea efectelor asupra memoriei de scurtă și de lungă
durată pe modele animale de maladie Alzheimer pentru uleiurile volatile obținute din cele trei specii de Ocimum,
evidențierea efectelor anxiolitice și antidepresive pe modele
animale de maladie Alzheimer pentru uleiurile volatile
obținute din cele trei specii de Ocimum,
evidențierea efectelor neuroprotectoare administrării
uleiurilor volatile de Ocimum basilicum L. și Ocimum
sanctum Linn. asupra activității unor antioxidanți endogeni
în probele de creier recoltate de la animalele incluse în
studiu.
Perspective de cercetare
Rezultatele cercetărilor întreprinse în cadrul tezei de
doctorat justifică continuarea studiilor în următoarele direcții:
evaluarea activității celor trei uleiuri volatile în alte tipuri
de neurodegenerescență, precum maladia Parkinson,
evaluarea efectelor neuroprotectoare ale unui amestec
obținut din cele trei fracțiuni volatile și investigarea
posibilelor interacțiuni între cele trei uleiuri volatile
(sinergism/adiție),
53
izolarea unor subfracțiuni și evaluarea potențialului lor
antioxidant și neuroprotector,
evaluarea fracțiunilor flavonoidice obținute din cele trei
specii în vederea stabilirii potențialului antiinflamator care
concură la dezvoltarea efectului neuroprotector.
54
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. *** European Pharmacopoeia, ed. a 6-a. Strasbourg: EDQM,
2008.
2. *** Farmacopeea Română, ediţia a X-a. Bucureşti: Editura
Medicală, 1993.
3. Carović-Stanko K, Orlić S, Politeo O et al. Composition and
antibacterial activities of essential oils of seven Ocimum taxa.
Food Chem 2010; 119: 196–201.
4. Bora KS, Arora S, Shri R. Role of Ocimum basilicum L. in
prevention of ischemia and reperfusion-induced cerebral damage,
and motor dysfunctions in mice brain. J Ethnopharmacol 2011;
137: 1360-1365.
5. Runyoro D, Ngassapa O, Vagionas K et al. Chemical
composition and antimicrobial activity of the essential oils of
four Ocimum species growing in Tanzania. Food Chem 2010;
119: 311-316.
6. Nguyen PM, Kwee EM, Niemeyer ED. Potassium rate alters the antioxidant capacity and phenolic concentration of basil
(Ocimum basilicum L.) leaves. Food Chem 2010; 123: 1235-
1241.
7. Abdoly M., Farnam A., Fathiazad F. et al. Antidepressant-like
activities of Ocimum basilicum (sweet Basil) in the forced
swimming test of rats exposed to electromagnetic field (EMF).
African J Pharm Pharmacol 2012; 6(3): 211-215.
8. Ismail M. Central properties and chemical composition of
Ocimum basilicum essential oil. Pharm Biol 2006; 44(8): 619–
626.
9. Cha JH, Kim MJ, Kim HS, Kim YI. Effects of aromatherapy in
blending oil of basil, lavender, rosemary, and rose on headache,
anxiety and serum cortisol level in the middle-aged women. J
Korean Biol Nurs Sci 2010; 12(3): 133-139.
10. Selkoe DJ. Alzheimer Disease. În Rosenberg RN, Pascual JM
(eds.) Rosenberg’s Molecular and Genetic Basis of Neurological
and Psychiatric Disease (Fifth Edition) Elsevier Inc., 2015; 753 – 768.
11. Walsh DM, Selkoe DJ. A beta oligomers — a decade of
discovery. J Neurochem 2007; 101: 1172–1184.
55
12. Peter J, Klöppel S. Alzheimer’s Disease. În Toga AW (ed.) Brain
mapping. Introduction To Clinical Brain Mapping (Vol. 3)
Elsevier Inc, 2015; 647-651.
13. Barage SH, Sonawane KD. Amyloid cascade hypothesis:
Pathogenesis and therapeutic strategies in Alzheimer's disease.
Neuropeptides 2015,
http://dx.doi.org/10.1016/j.npep.2015.06.008.
14. Brandt R, Leger J, Lee G. Interaction of tau with the neural
plasma membrane mediated by tau's amino-terminal projection
domain. J Cell Biol 1995; 131: 1327–1340.
15. Iqbal K, Alonso Adel C, Chen S, et al. Tau pathology in
Alzheimer disease and other tauopathies. Biochim Biophys Acta
2005; 1739: 198-210.
16. Tel G, Ozturk M, Duru ME et al. Chemical composition of the
essential oil and hexane extract of Salvia chionantha and their
antioxidant and anticholinesterase activities. Food Chem
Toxicol 2010; 48: 3189-3193.
17. Hriţcu L, Foyet HS, Ştefan M et al. Neuroprotective effect of methanolic extract of Hibiscus asper leaves in 6-
hydroxydopamine-lesioned rat model of Parkinson’s disease. J
Ethnopharmacol 2011; 137: 585-591.
18. Parsons CG, Danysz W, Dekundy A, Pulte I. Memantine and
cholinesterase inhibitors: complementary mechanisms in the
treatment of Alzheimer’s disease. Neurotox Res 2013, 24: 358-
369.
19. RajaSankar S, Manivasagam T, Surendran S. Ashwaghandha
leaf extract : a potential agent in treating oxidative damage and
physiological abnormalities seen in a mouse model of
Parkinson’s disease. Neurosci Lett 2009; 454: 11-15.
20. Cao C, Loewenstein DA, Lin X et al. High blood caffeine levels
in MCI linked to lack of progression to dementia. J Alzheimer’s
Dis 2012; 30(3): 559 – 572.
21. Benedec D, Oniga I, Oprean R, Tamas M. Chemical
composition of the essential oils of Ocimum basilicum L.
cultivated in Romania. Farmacia 2009; 57(5): 625-629.
22. Kaneko Y, Eve DJ, Yu S et al. Acute treatment with herbal
extracts provides neuroprotective benefits in in vitro and in vivo
56
stroke models, characterized by reduced ischemic cell death and
maintenance of motor and neurological functions. Cell Med
2010; 1(3): 137-142.
23. Hriţcu L, Cioancă O, Hăncianu M. Effects of lavender oil
inhalation on improving scopolamine-induced spatial memory
impairment in laboratory rats. Phytomedicine 2012; 19(6): 529 –
534.
24. Mani V, Parle M, Ramasamy K, Majeed ABA. Reversal of
memory deficits by Coriandrum sativum leaves in mice. J Sci
Food Agric 2010; 91: 186-192.
25. Jeon S, Bose S, Hur J et al. A modified formulation of Chinese
traditional medicine improves memory impairment and reduces
Aβ level in the Tg-APPswe/PS1dE9 mouse model of
Alzheimer’s disease. J Ethnopharmacol 2011; 137: 783-789.
26. Levites Y, Amit T, Youdim MB, Mandel S. Involvement of
protein kinase C activation and cell survival/cell cycle genes in
green tea polyphenol (-)-epigallocatechin 3-gallate
neuroprotective action. J Biol Chem 2002; 277: 305-374. 27. Rendeiro C, Vauzour D, Rattray M et al. Dietary levels of pure
flavonoids improve spatial memory performance and increase
hippocampal brain-derived neurotrophic factor. PloS One 2013;
8(5): e63535.
28. Granzotto A, Zatta P. Resveratrol and Alzhemer’s disease:
message in a bottle on red wine and cognition. Front Aging
Neurosci 2014; 6(95): 1-7.
29. Chatterjeea M, Vermaa P, Mauryab R, Palit G. Evaluation of
ethanol leaf extract of Ocimum sanctum in experimental models
of anxiety and depression. Pharm Biol 2011; 49(5): 477-483.
30. Rajeswari A, Sabesan M. Inhibition of monoamine oxidase-B
by the polyphenolic compound, curcumin and its metabolite
tetrahydrocurcumin, in a model of Parkinson’s disease induced
by MPTP neurodegeneration in mice. Inflammopharmacol
2008; 16(2): 96-99.
31. Joshi SV, Bothara SB, Surana SJ. Evaluation of aqueous extract
of Ocimum sanctum in experimentally induced parkinsonism. J
Chem Pharm Res 2011; 3(1): 478-487.
57
32. Samim M, Yajamanam SH, Bano N, Veeresh B, Madhav RB.
Neuroprotective effect of Ocimum sanctum Linn on rotenone
induced parkinsonism in rats. Int J Pharm Res Schol 2014; 3(1):
772-784.
33. Verma RS, Padalia RC, Chauhan A, Thul ST. Exploring
compositional diversity in the essential oils of 34 Ocimum taxa
from Indian flora. Ind Crop Prod 2013; 45: 7– 19.
34. Flanigan PM, Niemeyer ED. Effect of cultivar on phenolic
levels, anthocyanin composition, and antioxidant properties in
purple basil (Ocimum basilicum L.). Food Chem 2014; 164:
518–526.
35. Juntachote T, Berghofer E, Siebenhandl S, Bauer F. The
antioxidative properties of Holy basil and Galangal in cooked
ground pork. Meat Sci 2006; 72: 446–456.
36. Aqil F, Ahmad I, Mehmood Z. Antioxidant and free radical
scavenging properties of twelve traditionally used Indian
medicinal plants. Turk J Biol 2006; 30: 177-183.
37. Albano SM, Miguel MG. Biological activities of extracts of
plants grown in Portugal. Ind Crop Prod, 2011; 33(2): 338-343.
38. Bunrathep S, Palanuvez C, Ruangrungsi N. Chemical
composition and antioxidative activities of essential oils from
four Ocimum species endemic to Thailand. J Health Res 2007;
21: 201 – 206.
39. Joshi RK. Chemical composition, in vitro antimicrobial and
antioxidant activities of the essential oils of Ocimum
gratissimum, O. sanctum and their major constituents. Indian J
Pharm Sci 2013; 75(4): 457–462.
40. Trevisan MTS, Silva MGV, Pfundstein B et al. Characterization
of the volatile pattern and antioxidant capacity of essential oils from different species of the genus Ocimum. J Agric Food
Chem 2006; 54 (12): 4378–4382.
41. Linck VM, da Silva AL, Figueiro M et al. Effects of inhaled
linalool in anxiety, social interaction and aggressive behavior in
mice. Phytomedicine 2010; 17: 679–683.
58
42. Titus ADJ, Shankaranarayana BS, Harsha et al. Hypobaric
hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is
associated with cognitive impairment in adult rats.
Neuroscience 2007; 145: 265–278.
43. Hayashi Y, Sogabe S, Hattori Y, Tanaka J. Anxiolytic and
hypnotic effects in mice of roasted coffee bean volatile
compounds. Neurosci Lett 2012; 531: 166–169.
44. Grundmann O, Nakajima JI, Shujiro Seo S, Butterweck V. Anti-
anxiety effects of Apocynum venetum L. in the elevated plus
maze test. J Ethnopharmacol 2007; 110: 406–411.
45. Emamghoreishi M, Khasaki M, Aazam MF. Coriandrum
sativum: evaluation of its anxiolytic effect in the elevated plus-
maze. J Ethnopharmacol 2005; 96: 365–370.
46. Whiting PJ. GABA-A receptors: a viable target for novel
anxiolytics? Curr Opin Pharmacol 2006; 6: 24–29.
47. Naghizadeh B, Mansouri MT, Ghorbanzadeh B et al. Protective
effects of oral crocin against intracerebroventricular
streptozotocin-induced spatial memory deficit and oxidative stress in rats. Phytomedicine 2013; 20: 537–542.
48. Praticò D, Uryu K, Leight S et al. Increased lipid peroxidation
precedes amyloid plaque formation in an animal model of
Alzheimer amyloidosis. J Neurosci 2001; 21: 4183–4187.
49. Van den Berg SJPL, Klaus V, Alhusainy W, Rietjens IMCM.
Matrix-derived combination effect and risk assessment for
estragole from basil-containing plant food supplements (PFS).
Food Chem Toxicol 2013; 62: 32–40.
50. Martins C, Cação R, Cole KJ et al. Estragole: A weak direct-
acting food-borne genotoxin and potential carcinogen. Mutat
Res 2012; 747: 86-92.
51. Cruz-Sánchez FF, Girones X, Ortega A et al. Oxidative stress in
Alzhemer’s disease hippocampus: a topographical study. J
Neurol Sci 2010; 299: 163-167.
52. Chen Z, Zhong C. Oxidative stress in Alzhemer’s disease.
Neurosci Bull 2014; 30(2): 271-281.
53. Yan MH, Wang X, Zhu X. Mithocondrial defects and oxidative stress in Alzhemer’s disease and Parkinson’s disease. Free
Radic Biol Med 2013; 62: 90-101.
59
Listă lucrări publicate din tematica tezei
Articole publicate în reviste ISI:
Grădinariu V., Cioancă O., Hriţcu L., Gille E, Trifan A,
Hăncianu M. Comparative efficacy of Ocimum sanctum and
Ocimum basilicum volatile oils against beta (1-42)-induced anxiety
and depression in laboratory rats. Phytochem Rev (FI = 2.894),
2014, DOI 10.1007/s11101-014-9389-6.
Grădinariu V., Cioancă O., Gille E., Aprotosoaie A.C., Hriţcu L.,
Hăncianu M. The chemical profile of basil bio-varieties and its
implication on the biological activity. Farmacia (FI = 1,251), 2013,
61 (4): 632- 639.
Grădinariu V., Cioancă O., Hriţcu L. Hăncianu M. Basil bio-
varieties cultivated in Romania and the chemical profile of the
volatile oil. 13th SGEM GeoConference on Nano, Bio and Green –
Technologies For A Sustainable Future, 2013: 113 – 120,
Conference Proceedings, ISBN 978-619-7105-06-3/ISSN 1314-
2704, 16 – 22 iunie, ISI Proceedings,
DOI:10.5593/SGEM2013/BF6?S25.006, Albena, Bulgaria.
Lucrări prezentate la conferinţe de specialitate naționale
și internaționale:
Grădinariu V., Cioancă O., Ioan E., Tănase C., Hriţcu L., Gille E.,
Șpac A., Hăncianu M. Ocimum basilicum var. purpurascens:
Approaches on the chemical and biological profile. Congresul
Național al Farmaciștilor din România, 23-27 septembrie 2014, Iași,
România.
Grădinariu V., Cioancă O., Hriţcu L., Gille E, Trifan A,
Hăncianu M. Comparative efficacy of Ocimum sanctum and
Ocimum basilicum volatile oils against amyloid β-(1-42)-induced anxiety and depression in laboratory rats. PSE, aprilie 2014, Piatra
Neamț, România.