Rezumat Teza Doctorat Albu Florin

download Rezumat Teza Doctorat Albu Florin

of 241

Transcript of Rezumat Teza Doctorat Albu Florin

  • Universitatea din Bucureti Facultatea de Chimie

    Catedra de Chimie Analitic

    - 2009 -

    CUPLAJUL LC/MS N SEPARAREA I DETERMINAREA

    SUBSTANELOR ACTIVE DIN FLUIDELE BIOLOGICE

    REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

    Conductor tiinific, Prof.dr. Lucia MUTIHAC

    Doctorand, Florin-Daniel ALBU

  • 1.

    Cuprins (numerotarea paginilor este cea corespunztoare tezei de doctorat)

    CAPITOLUL 1. CUPLARE LC / MS..........................................................................................................1.

    1.1. Aspecte generale....................................................................................................................................1.

    1.1.1. Avantajele cuplrii cromatografiei de lichide de nalt performan cu spectrometria de mas.......................................................................................2.

    1.1.2. Performanele necesare unei asemenea combinaii.....................................................................3. 1.1.3. Problemele puse de funcionarea cuplajului LC/MS...................................................................4.

    1.2. Modaliti de interfaare.........................................................................................................................5. 1.2.1. Interfa de tip Introducere Direct de Lichid (DLI)..................................................................5. 1.2.2. Interfa cu Transport..................................................................................................................5. 1.2.3. Interfa cu Jet de Particule (PBI)..............................................................................................6.

    1.3. Modaliti de ionizare............................................................................................................................7. 1.3.1. Ionizare n Flux Continuu i Bombardament cu Atomi Rapizi....................................................7. 1.3.2. Ionizare de tip Electrospray........................................................................................................8.

    1.3.3. Ionizare Chimic la Presiune Atmosferic.................................................................................9. 1.3.4. Ionizare prin Impact cu Fotoni la Presiune Atmosferic..........................................................11. 1.3.5. Ionizare prin Desorpie din Matrice Asistat LASER (MALDI)...............................................12. 1.3.6. Ionizare Tip ICP........................................................................................................................13.

    CAPITOLUL 2. ANALIZOARE DE MAS...............................................................................................16. 2.1. Analizoare de mas de tip sector..........................................................................................................17. 2.2. Analizorul de mas cu msurarea timpului de zbor (TOF).................................................................19. 2.3. Analizorul de mas de tip cvadrupol (QMA).......................................................................................21. 2.4. Analizorul de mas de tip trap ionic sau quistor (QIT)....................................................................24. 2.5. Analizorul de mas cu rezonan ionic ciclotronic (ICR)................................................................26.

    CAPITOLUL 3. CUPLAJE MS MULTIDIMENSIONALE......................................................................30.

    3.1. Analizor de mas de tip triplu cvadrupol (QQQ).................................................................................32. 3.2. Analizor de mas de tip trap ionic (MSn QITs)................................................................................34. 3.3. Analizorul de mas cu rezonan ionic ciclotronic (FTICR MSn)...................................................35. 3.4. Alte tipuri de cuplaje MS2....................................................................................................................36.

    3.4.1. Analizor de mas de tip cvadrupol / Analizor de mas cu msurare a timpului de zbor (Q/TOF).....................................................36.

    3.4.2. Analizor de mas cu msurarea timpului de zbor / Analizor de mas cu msurarea timpului de zbor (TOF/TOF).................................................37.

  • Rezumatul tezei de doctorat

    2.

    3.5. Moduri de lucru n spectrometria de mas...........................................................................................38. 3.5.1. Scanarea Ionilor Produs........................................................................................................39.

    3.5.2. Scanarea Ionului Precursor...................................................................................................40.

    3.5.3. Scanarea pierderii sau ctigului de mas neutr......................................................................40. 3.5.4. Monitorizarea simultan a unuia sau mai multor procese de disociere (SRM/MRM)..............41.

    CAPITOLUL 4. Elemente de farmacocinetic. Determinarea biodisponibilitii i bioechivalenei.....42. 4.1. Biodisponibilitatea...............................................................................................................42.

    4.2. Bioechivalena......................................................................................................................................44. 4.3. Parametri farmacocinetici....................................................................................................................47.

    4.4. Modele pentru studiile de biodisponibilitate i bioechivalen............................................................51. 4.4.1. Obictivele studiului...................................................................................................................52.

    4.4.1.1. Studiile de bioechivalen unidoz...................................................................................52. 4.4.1.2. Studiile de proporionalitate a dozei.................................................................................52. 4.4.1.3. Studiile de saturaie (Steady-state)....................................................................................52.

    4.4.2. Descrierea studiului...................................................................................................................53.

    4.4.2.1. Modelul experimental.......................................................................................................53.

    4.4.2.2. Randomizarea....................................................................................................................53.

    4.4.2.3. Intervalul de prelevare......................................................................................................53.

    4.4.2.4. Perioada de eliminare a medicamentului..........................................................................53.

    4.4.2.5. Numrul de subieci..........................................................................................................53. 4.4.3. Modele de studii........................................................................................................................54.

    4.4.3.1. Modelul paralel.................................................................................................................54.

    4.4.3.2. Modelul ncruciat.............................................................................................................54. 4.4.4. Efectul de splare si efectele reziduale.....................................................................................55. 4.4.5. Alegerea modelului pentru un studiu de bioechivalen...........................................................56. 4.4.6. Diferene clinice importante......................................................................................................57. 4.4.7. Reguli de decizie pentru stabilirea bioechivalenei...................................................................58.

    CAPITOLUL 5. Aspecte generale privind realizarea experimental i modaliti practice de evaluare a datelor .........................................................................................59.

    5.1. Condiii experimentale.........................................................................................................................59. 5.1.1. Aparatura utilizat.....................................................................................................................59. 5.1.2. Reactivi i solveni....................................................................................................................59. 5.1.3. Standarde de referin................................................................................................................60.

    5.2. Algoritmul de validare a metodelor analitice.......................................................................................62.

    5.2.1. Selectivitatea metodei cromatografice......................................................................................62.

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    3.

    5.2.2. Funcia de rspuns a detectorului..............................................................................................63.

    5.2.3. Precizia.................................................................................................................................68.

    5.2.4. Exactitatea............................................................................................................................68.

    5.2.5. Stabilitatea analiilor n probe..............................................................................................70. 5.3. Realizarea studiilor clinice...................................................................................................................72.

    5.4. Parametrii farmacocinetici...................................................................................................................72.

    CAPITOLUL 6. Avantajele utilizrii cuplajului LC/MS n determinarea substanelor active / metaboliilor n fluide bilogice, cu aplicaii n studiile de biodisponibilitate / bioechivalen...................................................................................74.

    6.1. Sensibilitatea deteciei MS...........................................................................................................75. 6.1.1. Detecie MS versus detecie MS/MS........................................................................................75.

    6.1.1.1. Aparatura utilizat.............................................................................................................75. 6.1.1.2. Metoda cromatografic.....................................................................................................75. 6.1.1.3. Detecia MS.......................................................................................................................76. 6.1.1.4. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare.....................................................................78. 6.1.1.5. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC...................................................79.

    6.1.1.6. Dezvoltarea metodei cromatografice................................................................................79.

    6.1.1.7. Validarea metodei.............................................................................................................81.

    6.1.1.7.1. Selectivitatea metodei cromatografice......................................................................81.

    6.1.1.7.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare...................................82. 6.1.1.7.3. Precizia......................................................................................................................85.

    6.1.1.7.4. Exactitatea.................................................................................................................86.

    6.1.1.7.5. Stabilitatea analiilor n probe...................................................................................87. 6.1.1.8. Aplicaii ale metodei.........................................................................................................87. 6.1.1.9. Concluzii...........................................................................................................................89.

    6.1.1.10. Dezvoltri ulterioare.......................................................................................................90. 6.1.1.10.1. Studii preliminare....................................................................................................91.

    6.1.1.10.2. Aparatura utilizat...................................................................................................91. 6.1.1.10.3. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...........................................................92. 6.1.1.10.4. Detecia MS/MS......................................................................................................92. 6.1.1.10.5. Prepararea probelor.................................................................................................93.

    6.1.1.10.6. Studiul de liniaritate................................................................................................93.

    6.1.1.11. Concluzii finale...............................................................................................................94.

    6.1.2. Detecie ITD versus detecie TQD............................................................................................95. 6.1.2.1. Compararea deteciilor ITD / TQD n studiul de determinare a Metforminului

    din probe de plasm........................................................................................................96.

  • Rezumatul tezei de doctorat

    4.

    6.1.2.1.1. Aparatura utilizat.....................................................................................................96. 6.1.2.1.2. Metoda cromatografic.............................................................................................96.

    6.1.2.1.3. Detecia MS/MS (TQD)............................................................................................96. 6.1.2.1.4. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare.............................................................97. 6.1.2.1.5. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC...........................................98.

    6.1.2.1.6. Dezvoltarea metodei cromatografice........................................................................98.

    6.1.2.1.7. Validarea metodei...................................................................................................101.

    6.1.2.1.7.1. Selectivitatea metodei cromatografice............................................................101.

    6.1.2.1.7.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.........................102. 6.1.2.1.7.3. Precizia............................................................................................................104.

    6.1.2.1.7.4. Exactitatea.......................................................................................................105.

    6.1.2.1.7.5. Stabilitatea analiilor n probe.........................................................................106. 6.1.2.1.8. Aplicaii ale metodei...............................................................................................106. 6.1.2.1.9. Concluzii.................................................................................................................107.

    6.1.2.1.10. Compararea detecie ITD / TQD...........................................................................108. 6.1.2.2. Compararea analizoarelor de mas ITD / TQD n studiul de dozare a

    Bromazepamului n probe de plasm...........................................................................110. 6.1.2.2.1. Aparatura utilizat...................................................................................................110. 6.1.2.2.2. Procedura de preparare a probelor pentru injectare n sistemul HPLC..................114.

    6.1.2.2.3. Metode cromatografice...........................................................................................114.

    6.1.2.2.4. Dezvoltarea metodei cromatografice......................................................................115.

    6.1.2.2.5. Validarea metodei...................................................................................................117.

    6.1.2.2.5.1. Robusteea metodei cromatografice................................................................117. 6.1.2.2.5.2. Selectivitatea metodei cromatografice............................................................119.

    6.1.2.2.5.3. Randamentul de regsire pentru analiii de interes.........................................119. 6.1.2.2.5.4. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.........................120. 6.1.2.2.5.5. Precizia............................................................................................................122.

    6.1.2.2.5.6. Exactitatea.......................................................................................................123.

    6.1.2.2.5.7. Stabilitatea analiilor n probe.........................................................................124. 6.1.2.2.6. Rezultatele aplicrii metodei...................................................................................124. 6.1.2.2.8. Concluziile la metoda bioanalitic de dozare a Bromazepamului

    n probe de plasm................................................................................................126. 6.1.2.3. Concluzii.........................................................................................................................126.

    6.1.3. Simplificarea proceselor de prelucrare a probelor biologice..................................................127.

    6.1.3.1. Extracia lichid - lichid a Indapamidului din probe de plasm.......................................130. 6.1.3.1.1. Modul de preparare a probelor pentru injectare n sistemul HPLC........................130.

    6.1.3.1.2. Aparatura utilizat...................................................................................................131.

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    5.

    6.1.3.1.3. Metoda cromatografic...........................................................................................131. 6.1.3.1.4. Detecia MS............................................................................................................131. 6.1.3.1.5. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...........................................................132.

    6.1.3.1.6. Dezvoltarea metodei extracie.................................................................................133. 6.1.3.1.7. Dezvoltarea metodei cromatografice......................................................................134.

    6.1.3.1.8. Validarea metodei...................................................................................................135.

    6.1.3.1.8.1. Selectivitatea metodei cromatografice............................................................135.

    6.1.3.1.8.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.........................136. 6.1.3.1.8.3. Precizia............................................................................................................137.

    6.1.3.1.8.4. Exactitatea.......................................................................................................138.

    6.1.3.1.8.5. Stabilitatea analiilor n probe.........................................................................139. 6.1.3.1.9. Aplicaii ale metodei...............................................................................................139. 6.1.3.1.10. Concluziile metodei de dozare a Indapamidului din probe de plasm.................140.

    6.1.3.2. Precipitarea proteinelor plasmatice prin adaos de acid tare n vederea determinrii Trimetazidinei din probe biologice...............................................................................141.

    6.1.3.2.1. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.........................................141.

    6.1.3.2.2. Aparatura utilizat...................................................................................................141. 6.1.3.2.3. Metoda cromatografic...........................................................................................142. 6.1.3.2.4. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...........................................................142. 6.1.3.2.5. Detecia MS............................................................................................................142. 6.1.3.2.6. Dezvoltarea metodei cromatografice......................................................................143.

    6.1.3.2.7. Validarea metodei...................................................................................................145.

    6.1.3.2.7.1. Selectivitatea metodei cromatografice............................................................145.

    6.1.3.2.7.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.........................146. 6.1.3.2.7.3. Precizia............................................................................................................147.

    6.1.3.2.7.4. Exactitatea.......................................................................................................148.

    6.1.3.2.7.5. Stabilitatea analiilor n probe.........................................................................149. 6.1.3.2.8. Aplicaii ale metodei...............................................................................................149. 6.1.3.2.9. Concluziile metodei de dozare a Trimetazidinei din probe de plasm...................152.

    6.1.3.3. Precipitarea proteinelor plasmatice prin adugarea de solvent organic miscibil cu apa n vederea determinrii Meloxicamului din probe biologice...............................152.

    6.1.3.3.1. Prepararea probelor ................................................................................................152.

    6.1.3.3.2. Aparatura utilizat...................................................................................................153. 6.1.3.3.3. Metoda cromatografic...........................................................................................153. 6.1.3.3.4. Detecia MS............................................................................................................153. 6.1.3.3.5. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...........................................................154. 6.1.3.3.6. Dezvoltarea metodei cromatografice......................................................................154.

  • Rezumatul tezei de doctorat

    6.

    6.1.3.3.7. Validarea metodei...................................................................................................158.

    6.1.3.3.7.1. Selectivitatea metodei cromatografice............................................................158.

    6.1.3.3.7.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.........................158. 6.1.3.3.7.3. Precizia............................................................................................................161.

    6.1.3.3.7.4. Exactitatea.......................................................................................................162.

    6.1.3.3.7.5. Stabilitatea analiilor n probe.........................................................................162. 6.1.3.3.8. Aplicaii ale metodei...............................................................................................163. 6.1.3.3.9. Concluziile metodei de dozare a Meloxicamului din probe de plasm..................164.

    6.1.3.4. Concluzii.........................................................................................................................164.

    6.1.4. Problema legat de supra-sensibilitate................................................................................167. 6.1.4.1. Prepararea probelor n vederea separrii cromatografice................................................169. 6.1.4.2. Aparatura utilizat...........................................................................................................170. 6.1.4.3. Metoda cromatografic...................................................................................................170. 6.1.4.4. Detecia MS.....................................................................................................................170. 6.1.4.5. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...................................................................171. 6.1.4.6. Dezvoltarea metodei cromatografice..............................................................................171.

    6.1.4.7. Validarea metodei...........................................................................................................175.

    6.1.4.7.1. Selectivitatea metodei cromatografice....................................................................175.

    6.1.4.7.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.................................176. 6.1.4.7.3. Precizia....................................................................................................................179.

    6.1.4.7.4. Exactitatea...............................................................................................................180.

    6.1.4.7.5. Stabilitatea analiilor n probe.................................................................................180. 6.1.4.8. Aplicaii ale metodei.......................................................................................................173. 6.1.4.9. Concluziile metodei de dozare a Amlodipinei din probe de plasm...............................182. 6.1.4.10. Concluzii.......................................................................................................................182.

    6.2. Selectivitatea intrinsec a deteciei MS (acceptarea eluiilor cromatografice neideale)....................183. 6.2.1. Metoda de dozare a Captoprilului din probe de plasm..........................................................185.

    6.2.1.1. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.................................................185.

    6.2.1.2. Aparatura utilizat...........................................................................................................186. 6.2.1.3. Metoda cromatografic...................................................................................................186. 6.2.1.4. Detecia MS.....................................................................................................................186. 6.2.1.5. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...................................................................188. 6.2.1.6. Optimizarea reaciei de derivatizare................................................................................188. 6.2.1.7. Dezvoltarea metodei cromatografice..............................................................................190.

    6.2.1.8. Validarea metodei...........................................................................................................193.

    6.2.1.8.1. Selectivitatea metodei cromatografice....................................................................193.

    6.2.1.8.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.................................195.

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    7.

    6.2.1.8.3. Precizia....................................................................................................................197.

    6.2.1.8.4. Exactitatea...............................................................................................................198.

    6.2.1.8.5. Stabilitatea analiilor n probe.................................................................................198. 6.2.1.9. Aplicaii ale metodei.......................................................................................................199. 6.2.1.10. Concluziile metodei de dozare a Captoprilului din probe de plasm............................200.

    6.2.2. Metoda de dozare a Pentoxifilinei i a metaboliilor si din probe de plasm........................200. 6.2.2.1. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.................................................200.

    6.2.2.2. Aparatura utilizat...........................................................................................................201. 6.2.2.3. Metoda cromatografic...................................................................................................201. 6.2.2.4. Detecia MS.....................................................................................................................202. 6.2.2.5. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...................................................................204. 6.2.2.6. Dezvoltarea metodei cromatografice..............................................................................204.

    6.2.2.7. Validarea metodei...........................................................................................................206.

    6.2.2.7.1. Selectivitatea metodei cromatografice....................................................................206.

    6.2.2.7.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.................................208. 6.2.2.7.3. Precizia....................................................................................................................212.

    6.2.2.7.4. Exactitatea...............................................................................................................215.

    6.2.2.7.5. Stabilitatea analiilor n probe.................................................................................215. 6.2.2.8. Aplicaii ale metodei.......................................................................................................215. 6.2.2.9. Concluziile metodei de dozare a Pentoxifilinei i Metaboliilor

    si din probe de plasm................................................................................................217. 6.2.3. Concluzii.................................................................................................................................217.

    CAPITOLUL 7. Dezavantaje legate de utilizarea cuplajului LC/MS n determinarea

    substanelor active / metaboliilor n fluide bilogice, cu aplicaii n studiile de biodisponibilitate / bioechivalen...........................................................218.

    7.1. Comparaie LC/UV i LC/MS din punct de vedere al preciziei metodei..........................................220. 7.1.1. Aparatura utilizat...................................................................................................................220. 7.1.2. Metode cromatografice...........................................................................................................224.

    7.1.3. Prepararea probelor.................................................................................................................225.

    7.1.4. Studiul comparativ al Preciziei celor dou metode cromatografice........................................225. 7.1.5. Validarea metodei cromatografice cu detecie MS-MS..........................................................232.

    7.1.5.1. Selectivitatea metodei cromatografice............................................................................232.

    7.1.5.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.........................................232. 7.1.5.3. Exactitatea.......................................................................................................................236.

    7.1.5.4. Randamentul de regsire pentru analiii de interes.........................................................236. 7.1.5.5. Stabilitatea analiilor n probe.........................................................................................236.

  • Rezumatul tezei de doctorat

    8.

    7.1.5.6. Robusteea metodei cromatografice................................................................................237. 7.1.6. Aplicaii ale metodei...............................................................................................................238. 7.1.7. Concluziile metodei de dozare a Nimesulidului i Metabolitului su.....................................239. 7.1.8. Concluzii.................................................................................................................................239.

    7.2. APCI vs. ESI......................................................................................................................................240.

    7.2.1. Compararea surselor de ionizare APCI vs. ESI n studiul de determinare a Indapamidului..242.

    7.2.1.1. Aparatura utilizat...........................................................................................................242. 7.2.1.2. Metoda cromatografic...................................................................................................242. 7.2.1.3. Detecia MS.....................................................................................................................243. 7.2.1.4. Parametrii operaionali ai surselor de ionizare................................................................244. 7.2.1.5. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.................................................245.

    7.2.1.6. Compararea surselor de ionizare ESI vs. APCI..............................................................245.

    7.2.1.6.1. Selectivitatea metodei cromatografice....................................................................245.

    7.2.1.6.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.................................247. 7.2.1.6.3. Precizia....................................................................................................................248.

    7.2.2. Compararea surselor de ionizare APCI vs. ESI n studiul de determinare

    a Bromazepamului.................................................................................................................249.

    7.2.2.1. Aparatura utilizat...........................................................................................................249. 7.2.2.2. Metoda cromatografic...................................................................................................249. 7.2.2.3. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...................................................................249. 7.2.2.4. Detecia MS.....................................................................................................................249. 7.2.2.5. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.................................................251.

    7.2.2.6. Compararea surselor de ionizare ESI vs. APCI..............................................................252.

    7.2.3. Concluzii.................................................................................................................................253.

    7.3. Efecte de ionizare datorate matricei reziduale din prob...................................................................255. 7.3.1. Efectul elementelor endogene de matrice rezidual n determinarea

    Amlodipinei din probe de plasm........................................................................................256. 7.3.2. Efectul elementelor endogene de matrice rezidual n determinarea

    Glibenclamidului din probe de plasm.................................................................................259. 7.3.2.1. Aparatura utilizat...........................................................................................................259. 7.3.2.2. Metoda cromatografic...................................................................................................259. 7.3.2.3. Detecia MS.....................................................................................................................259. 7.3.2.4. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...................................................................260. 7.3.2.5. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.................................................260.

    7.3.2.6. Determinarea influenei matricei plasmatice coextrase. Randamentul de regsire.........261. 7.3.2.7. Validarea metodei...........................................................................................................262.

    7.3.2.7.1. Selectivitatea metodei cromatografice....................................................................262.

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    9.

    7.3.2.7.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.................................263. 7.3.2.7.3. Precizia....................................................................................................................265.

    7.3.2.7.4. Exactitatea...............................................................................................................266.

    7.3.2.7.5. Stabilitatea analiilor n probe.................................................................................266. 7.3.2.8. Aplicaii ale metodei.......................................................................................................267. 7.3.2.9. Concluzii.........................................................................................................................268.

    7.3.3. Efectul elementelor exogene de matrice plasmatic rezidual n determinarea Glimepiridului din probe de plasm.....................................................................................268.

    7.3.3.1. Aparatura utilizat...........................................................................................................268. 7.3.3.2. Metoda cromatografic...................................................................................................269. 7.3.3.3. Detecia MS.....................................................................................................................269. 7.3.3.4. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...................................................................270. 7.3.3.5. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.................................................270.

    7.3.3.6. Efectul elementelor exogene de matrice rezidual (influena anticoagulantului)...........270. 7.3.3.7. Validarea metodei...........................................................................................................272.

    7.3.3.7.1. Selectivitatea metodei cromatografice....................................................................272.

    7.3.3.7.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.................................272. 7.3.3.7.3. Precizia....................................................................................................................274.

    7.3.3.7.4. Exactitatea...............................................................................................................275.

    7.3.3.7.5. Stabilitatea analiilor n probe.................................................................................276. 7.3.3.8. Aplicaii ale metodei.......................................................................................................276. 7.3.3.9. Concluziile metodei de dozare a Glimepiridului din probe de plasm...........................277.

    7.3.4. Efectul indus de anumite etape de preparare asupra regsirii analitului n probe n cazul determinrii Tenoxicamului din probe de plasm..................................................278.

    7.3.4.1. Aparatura utilizat...........................................................................................................278. 7.3.4.2. Metode cromatografice...................................................................................................278.

    7.3.4.3. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.................................................279.

    7.3.4.4. Determinarea efectului indus de anumite etape de preparare asupra regsirii analitului n probe. Randamentul de regsire.............................................................280.

    7.3.4.5. Validarea metodei...........................................................................................................282.

    7.3.4.5.1. Selectivitatea metodei cromatografice....................................................................282.

    7.3.4.5.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.................................282. 7.3.4.5.3. Precizia....................................................................................................................284.

    7.3.4.5.4. Exactitate.................................................................................................................285.

    7.3.4.5.5. Stabilitatea analiilor n probe.................................................................................285. 7.3.4.6. Aplicaii ale metodei.......................................................................................................286.

  • Rezumatul tezei de doctorat

    10.

    7.3.4.7. Concluzii.........................................................................................................................287.

    7.3.5. Concluzii.................................................................................................................................287.

    7.4. Funcii de calibrare neliniare..............................................................................................................289. 7.4.1. Utlizarea unei funcii de calibrare log-log pentru dozarea Diltiazemului

    i Metaboliilor si din probe reale de plasm........................................................................292. 7.4.1.1. Aparatura utilizat...........................................................................................................292. 7.4.1.2. Metoda cromatografic...................................................................................................292. 7.4.1.3. Detecia MS.....................................................................................................................293.

    7.4.1.4. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...................................................................295. 7.4.1.5. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.................................................295.

    7.4.1.6. Validarea metodei...........................................................................................................296.

    7.4.1.6.1. Selectivitatea metodei cromatografice....................................................................297.

    7.4.1.6.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.................................297. 7.4.1.6.3. Precizia....................................................................................................................302.

    7.4.1.6.4. Exactitatea...............................................................................................................303.

    7.4.1.6.5. Stabilitatea analiilor n probe.................................................................................304. 7.4.1.7. Aplicaii ale metodei.......................................................................................................305. 7.4.1.8.Concluziile metodei de dozare a Diltiazemului

    i Metaboliilor si din probe de plasm.........................................................................306. 7.4.2. Utlizarea unei funcii de calibrare ponderate cu 1/x pentru dozarea

    Atenololului din probe reale de plasm..................................................................................307. 7.4.2.1. Aparatura utilizat...........................................................................................................307. 7.4.2.2. Metoda cromatografic...................................................................................................307. 7.4.2.3. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...................................................................307. 7.4.2.4. Detecia MS.....................................................................................................................307. 7.4.2.5. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.................................................309.

    7.4.2.6. Validarea metodei...........................................................................................................310.

    7.4.2.6.1. Selectivitatea metodei cromatografice....................................................................310.

    7.4.2.6.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.................................311. 7.4.2.6.3. Precizia....................................................................................................................313.

    7.4.2.6.4. Exactitatea...............................................................................................................314.

    7.4.2.6.5. Stabilitatea analiilor n probe.................................................................................315. 7.4.2.7. Aplicaii ale metodei.......................................................................................................316. 7.4.2.8.Concluziile metodei de dozare a Atenololului din probe de plasm................................317.

    7.4.3. Concluzii:................................................................................................................................317.

    7.5. Impact potenial al lipsei de precizie asociate deteciei MS asupra procesrii probelor....................318. 7.5.1. Dozarea Felodipinei din probe reale de plasm......................................................................320.

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    11.

    7.5.1.1. Aparatura utilizat...........................................................................................................320. 7.5.1.2. Metoda cromatografic...................................................................................................320. 7.5.1.3. Detecia MS.....................................................................................................................322. 7.5.1.4. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...................................................................324. 7.5.1.5. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.................................................325.

    7.5.1.6. Validarea metodei...........................................................................................................325.

    7.5.1.6.1. Selectivitatea metodei cromatografice....................................................................325.

    7.5.1.6.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.................................327. 7.5.1.6.3. Precizia....................................................................................................................328.

    7.5.1.6.4. Exactitatea...............................................................................................................329.

    7.5.1.7. Aplicaii ale metodei.......................................................................................................330. 7.5.1.8. Concluziile metodei de dozare a Felodipinei din probe de plasm.................................331.

    7.5.2. Concluzii.................................................................................................................................331.

    7.6. Reproductibilitatea paternului de ionizare.........................................................................................332.

    7.6.1. Dozarea Simvastatinului i Metabolitului su din probe reale de plasm...............................333. 7.6.1.1. Aparatura utilizat...........................................................................................................333. 7.6.1.2. Metoda cromatografic...................................................................................................333. 7.6.1.3. Detecia MS.....................................................................................................................333. 7.6.1.4. Parametrii operaionali ai sursei de ionizare...................................................................336. 7.6.1.5. Prepararea probelor pentru injectare n sistemul HPLC.................................................336.

    7.6.1.6. Validarea metodei...........................................................................................................337.

    7.6.1.6.1. Selectivitatea metodei cromatografice....................................................................337.

    7.6.1.6.2. Liniaritatea, domeniul de liniaritate i limita de cuantificare.................................338. 7.6.1.6.3. Precizia....................................................................................................................342.

    7.6.1.6.4. Exactitatea...............................................................................................................342.

    7.6.1.6.5. Stabilitatea analiilor n probe.................................................................................343. 7.6.1.7. Aplicaii ale metodei.......................................................................................................344. 7.6.1.8. Concluziile metodei de dozare........................................................................................345.

    7.6.2. Concluzii.................................................................................................................................345.

    CONCLUZII GENERALE............................................................................................................................346.

    BIBLIOGRAFIE..354.

    CUPRINS....366.

  • Rezumatul tezei de doctorat

    12.

    PRIVIRE DE ANSAMBLU

    Lucrarea intitulat Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluidele biologicea fost structurat n apte capitole.

    Capitolul 1 cuprinde informaii de literatur referitoare cuplarea cromatografiei de lichide cu spectrometria de mas, cteva din avantajele realizrii acestui cuplaj, performanele necesare unei asemenea combinaii, probleme puse de funcionarea acestui cuplaj, modalitile de interfaare ntre cele dou tehnici i modalitile de ionizare a analiilor de interes n sursele.

    Capitolul 2 prezint principalele analizoare de mas utilizate n construcia spectrometrelor de mas moderne, principiile de funcionare, caracteristicile i modurile de cuplare ale acestora.

    Capitolul 3 prezint modalitile de cuplare ntre analizoarele de mas, unele dintre manierele de realizare a disocierii ionilor precursori utilizate n practic, principalele modurie de lucru n spectrometria de mas.

    Capitolul 4 prezint conceptele de biodisponibilitate i bioechivalen, parametrii farmacocinetici i modul lor de calcul, modele pentru studiile de biodisponibilitate i bioechivalen, precum i regulile de decizie pentru stabilirea bioechivalenei ntre dou produse farmaceutice.

    Capitolul 5 prezint condiiile experimentale utilizate n tez (aparatur utilizat, reactivi i solveni utilizai, standarde de referin), algoritmul de validare a metodelor analitice (selectivitate, funcia de rspuns a detectorului, exactitatea i stabilitatea analiilor n probe), modul de realizare a studiilor clinice i principalii parametrii farmacocinetici avui n vedere la evaluarea bioechivalenei.

    Capitolul 6 cuprinde contribuiile originale, experimentale i teoretice, n ceea ce privete avantajele utilizrii cuplajului LC/MS n determinarea substanelor active / metaboliilor n fluide bilogice din punct de vedere al sensibilitii deteciei MS (compararea detecie MS cu detecia MS/MS, compararea analizorului de mas ITD cu cel TQD, simplificarea proceselor de prelucrare a probelor biologice, problema legat de supra-sensibilitate) i al selectivitii intrinseci a deteciei MS (acceptarea eluiilor cromatografice neideale) n studiile de biodisponibilitate / bioechivalen.

    Capitolul 7 cuprinde contribuiile originale, experimentale i teoretice, n ceea ce privete dezavantajele legate de utilizarea cuplajului LC/MS n determinarea substanelor active / metaboliilor n fluide bilogice din punct de vedere al preciziei metodei (comparaia LC/UV cu LC/MS), al sursei de ionizare (compararea APCI cu ESI), al efectelor de ionizare datorate matricei reziduale din prob, al apariiei funciilor de calibrare neliniare, al reproductibilitatea paternului de ionizare i al impactului potenial al lipsei de precizie asociate deteciei MS asupra procesrii probelor.

    Pentru fiecare din metode au fost incluse informaii legate de particularitile metodelor cromatografice, optimizarea procesului de detecie, date legate de validarea prospectiv, concurenial i retrospectiv a metodelor analitice precum i informaiile cu caracter de cercetare fundamental obinute n cadrul fiecrei aplicaii.

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    13.

    Capitolul 1. CUPLARE LC / MS

    1.1. Aspecte generale

    Combinarea tehnicilor cromatografice cu spectrometria de mas (MS) a fost un subiect care a atras un interes deosebit din partea oamenilor de stiin n ultimii patruzeci de ani. Prima realizare n acest sens a fost cuplarea cromatografiei de gaze (GC) cu spectrometria de mas (GC-MS). Acest cuplaj s-a realizat n 1958, iar primul aparat a devenit disponibil comercial n 1967. De atunci, aceast tehnic a nceput s fie utilizat din ce n ce mai mult, devenind una din cele mai rspndite tehnici de analiz n urme. Combinarea celor dou tehnici (tehnica cromatografic cu spectrometria de mas) este cunoscut sub denumirea de tehnic tandem sau cuplat. Tehnica GC-MS a fost asimilat rapid ca o tehnic de rutin, innd cont de faptul c interfeele au fost disponibile pentru ambele tipuri de coloane utilizate n GC (umplute i capilare) i n acelai timp au permis marii majoriti de compui ce pot fi separai prin cromatografie de gaze, s fie transferai eficient n spectrometrul de mas. Compuii care se preteaz la analiz GC trebuie s fie att volatili la temperaturile utilizate la realizarea separrii cromatografice, ct i termic stabili, acestea fiind i cerinele necesare pentru obinerea unui spectru de mas pentru un analit prin ionizare prin impact electronic (EI) sau ionizare chimic (CI). Altfel spus, teoretic, orice compus care poate fi separat pe o coloan GC, poate fi ionizat i analizat prin spectrometrie de mas [1].

    Nu aceeai asociere facil s-a putut realiza n cazul cuplrii directe a spectrometriei de mas la cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC). Datorit incompatibilitilor dintre cele dou tehnici, acestea nu au putut fi cuplate direct, ci numai prin intermediul unor interfee. Principalul scop al acestor interfee este eliminarea din sistem a fazei mobile utilizate la separarea cromatografic (un debit de 1 mL/minut ap este convertit n 1244 mL/minut vapori la presiune atmosferic, ceea ce este extrem de mult pentru a fi ndeprtat de sistemul de vacuum al unui spectrometru de mas standard. De aceea au fost construite i au devenit disponibile comercial mai multe tipuri de interefee care asigur trecerea analiilor din soluie n stare de vapori.

    Mai multe tipuri de interfee care asigur cuplajul LC/MS au fost dezvoltate pentru rezolvarea acestor probleme. Interfee cum ar fi cea cu fasciculul de particule (PB) i cea cu transport [2] se bazeaz pe eliminarea solventului nainte de introducerea probei n spectrometrul de mas. Interfeele cu flux continuu cuplat i bombardament cu atomi rapizi (cf-FAB) [3, 4] sau introducerea direct a lichidului (DLI) [5] reduc debitul de intrare n spectrometru de mas, utiliznd un dispozitiv de splitare. Un dezavantaj al acestor interfee este reducerea sensibilitii cauzat de factorul de splitare. Un debit de aproape 1 mL/minut, utilizat n cazul clasic al unei coloane cromatografice cu diametru intern de 4,6 mm

    este tolerat numai de interfeele de tip termospray (TSP) i cele de tip ionizare chimic la presiune atmosferic (APCI). Electrosprayul (ESI) lucreaz cu debite de ordinul nL/min., pn la 0,2 mL/minut,

  • Rezumatul tezei de doctorat

    14.

    care poate fi extins pn la debite de 1 mL/minut. Cea mai important diferen ntre acest interfa i altele este c semnnalul ESI este dependent mai mult de concentraia de analit dect de cantitatea injectat. Acest fapt permite utilizarea de splitere, pentru a reduce cantitatea de eluent introdus n sursa spectrometrului de mas i deschide posibilitatea miniaturizrii tehnicii LC la dimensiuni capilare (300 m diametrul intern al coloanei, 4 L/min. debitul fazei mobile) i nano (75 m diametrul intern al coloanei, 200-300 nL/min. debitul fazei mobile). Aceleai caracteristici permit cuplarea electroforezei capilare cu spectrometria de mas, debitele fiind i n acest caz n intervalul nL/minut.

    Diferit de cele prezentate anterior este interfaa cu plasm cuplat inductiv (ICP-MS), care prezint multe aplicaii n analizele de compui anorganici. Din acest motiv, aceasta va fi tratat separat. Cele mai multe interfee i aplicaii LC-MS sunt bazate pe analiza moleculelor intacte, de cele mai multe ori de natur organic. Probe care conin biomolecule sunt analizate prin aceast tehnic.

    Separat de existena unui sistem de introducere a probei n spectrometrul de mas, un sistem LC poate fi cuplat prin intermediul unei interfee la MS, acesta din urm devenind un detector al cromatografului. Alegerea interfeei MS este puternic influenat de caracteristicile unui detector LC ideal. Acesta trebuie:

    s aib sensibilitate mare; s aib rspuns pentru toi analiii sau s aib selectivitate; s nu fie afectat de schimbrile de temperatur i de debitul de faz mobil; s aib rspuns independent de tipul de faz mobil utilizat la separarea cromatografic; s nu contribuie la lrgirea frontului de analit dup ieirea din coloan; s fie robust i uor de utilizat; s aib rspuns care s varieze liniar cu cantitatea de analit; s fie nedistructiv n raport cu analitul (n cazul utilizrii unei detecii multiple n lan); s furnizeze informaii calitative pentru picurile detectate.

    nainte de a prezenta aceste interfee n detaliu, este necesar s avem n vedere cteva aspecte generale, i anume:

    (1) Avantajele cuplrii HPLC cu spectrometria de mas, (2) Performanele necesare unei asemenea combinaii, (3) Problemele puse de funcionarea cuplajului LC/MS.

    1.1.1. Avantajele cuplrii cromatografiei de lichide de nalt performan cu spectrometria de mas.

    Pentru a trata acest prim aspect, trebuie definite problemele analitice care pot fi rezolvate cu acest

    cuplaj.

    n cele mai multe analize ntlnite , compuii de interes se gsesc ca parte a unui amestec complex (matrice), iar rolul tehnicii cromatografice este de a separa amestecul n componeni, pentru a permite identificarea sau determinarea lor cantitativ. Din punct de vedere calitativ, principala limitare a

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    15.

    cromatografiei este incapacitatea ei de a da o identificare sigur a componenilor unui amestec, chiar dac ei pot fi complet separai unul de altul. Identificarea, n cazul cromatografiei de lichide, are la baz compararea caracteristicilor de retenie (mai simplu a timpului de retenie) a unui compus necunoscut cu compui de referin, utiliznd aceleai condiii cromatografice. ntr-un amestec pot exista att de muli compui nct, chiar i n cazul n care caracteristicile de retenie ale compusului necunoscut i cele ale referinei sunt identice, n limitele erorilor experimentale, identificarea nu poate fi fcut cu certitudine. Cu toate c analistul are la dispoziie mai multe condiii cromatografice care pot fi modificate pentru a obine o separare cromatografic, aceasta nu poate fi realizat ntotdeauna cu separarea complet a tuturor componenilor unui amestec. Acest lucru poate influena precizia i acurateea determinrii cantitative a analitului de interes.

    Avantajul spectrometriei de mas este dat de faptul c spectrele de mas a celor mai muli compui sunt suficient de specifice pentru a permite identificarea lor cu un mare grad de ncredere, dac nu cu certitudine. Dac analitul de interes face parte dintr-un amestec, spectrul de mas obinut va conine linii spectrale aparinnd tuturor compuilor prezeni n amestec. Mai mult dect att, dac analitul de interes este un component minor al acelui amestec, identificarea cu un grad mare de certitudine este mult mai

    dificil, dac nu imposibil. Combinarea capacitii de separare a cromatografiei de lichide, care permite obinerea de compui puri ce urmeaz a fi introdui n spectrometrul de mas, i a capacitii de identificare a spectrometriei de mas este mult mai avantajoas, n cazurile particulare n care n proba de analizat sunt mai muli compui care au caracteristici de retenie similare sau identice i spectre de mas complet diferite. Aceast specificitate mrit care permite cuantificarea, nu ar fi posibil numai prin intermediul cromatografiei de lichide, cu un detector clasic.

    Combinarea HPLC cu spectrometria de mas permite confirmarea structural i determinarea cantitativ a compuilor care nu pot fi identificai numai prin intermediul cromatografiei de lichide.

    1.1.2. Performanele necesare unei asemenea combinaii. Ideal, performanele celor dou instrumente nu ar trebui afectate de cuplarea lor. Acestea ar fi:

    Interfaa nu ar trebui s reduc performanele cromatografice. Acest lucru este important n analiza amestecurilor complexe multi-component (cu toate c selectivitatea spectrometrului de mas poate, n anumite condiii, s compenseze aceast pierdere de performan).

    Nu trebuie s apar modificri chimice necontrolate la trecerea analitului prin interfa sau la introducerea n spectrometru de mas.

    Interfaa ar trebui s asigure o vitez mare de transfer a analiilor n spectrometru de mas sau, dac acetia se gsesc n interfa, s le asigure o ionizare eficient. Acest lucru este foarte important cnd avem de-a face cu o analiz n urme sau cnd sunt analizai compui polari i/sau instabili.

    Interfaa ar trebui s dea un zgomot de fond sczut, acest lucru minimaliznd posibile interferenele cu analiii.

    Interfaa ar trebui s fie fiabil i uor de utilizat. Interfaa ar trebui s fie simpl i ieftin (la o evaluare subiectiv).

  • Rezumatul tezei de doctorat

    16.

    Operarea interfeei ar trebui s fie compatibil cu toate condiiile cromatografice care ar putea fi ntlnite: debitele de faz mobil de la 20 nL/min. pn la 2 mL/min., compoziia fazei mobile de la 100% organic la 100% apos, eluia n gradient, care este important n domeniul biologic n care amestecurile acoper un domeniu larg de polariti i tampoane att volatile ct i nevolatile.

    Operarea interfeei nu ar trebui s compromit cerinele de vid ale spectrometrului de mas i s permit utilizarea tuturor performanelor acestuia, adic modurile de ionizare, rezoluii mari, etc.

    Spectru de mas obinut trebuie s furnizeze informaii certe asupra maselor moleculare pentru un interval larg de compui care ar putea fi analizai prin HPLC, inclusiv biomolecule cu mase mai mari de 1000 Da. Studierea acestor tipuri de molecule prin spectrometria de mas poate fi limitat de asocierea ionizrii i deteciei lor cu intervalul de mase moleculare ce poate fi analizat de instrumentul utilizat.

    Spectrometrul de mas trebuie s furnizeze informaii structurale care la rndul lor trebuie s fie reproductibile, interpretabile i s fie gsite ntr-o bibliotec de spectre. Ideal, ar trebui generat un spectru de mas obinut prin impact electronic (EI). O interfa trebuie s ndeplineasc aceste condiii i/sau s produc informaii asupra maselor moleculare. De asemenea, acestea ar trebui s poat fi utilizate ca o alternativ mult mai convenabil la modul clasic de introducere a probelor solide n spectrometru de mas. Anumite interfee care au fost dezvoltate, pot fi utilizate n acest scop.

    Interfaa trebuie s furnizeze informaii cantitative cu o reproductibilitate mai bun de 10%, cu limite mici de detecie i s aib un rspuns liniar pe un interval pe un interval larg de concentraii (de la cteva pg la g).

    1.1.3. Problemele puse de funcionarea cuplajului LC/MS. Este posibil ca dup efectuarea separrii cromatografice s se colecteze toi analiii sau separat,

    fracii care conin anumii analii. Dup nlturarea majoritii solvenilor volatili, acetia sunt transferai ntr-un spectrometru de mas, prin utilizarea unui injector clasic pentru probe solide. Cuplarea direct a celor dou tehnici este avantajoas din mai multe privine: viteza de analiz, avantajul de a reduce posibilitatea de pierdere a probelor (n special pentru analizele amestecurilor multicomponent),

    capacitatea de a scoate n eviden cantiti exacte, utiliznd izotopi ca standard intern i capacitatea de a pune n eviden anumite lucruri, cum ar fi evaluarea puritii picului, care nu ar fi realizat altfel.

    Exist dou mari incompatibiliti ntre HPLC i MS. Prima este legat de faptul c n HPLC faza mobil este lichid, adesea coninnd proporii semnificative de ap, care este pompat printr-o faz staionar (coloan) la un debit n mod obinuit de 1 mL/min., pe cnd spectrometru de mas opereaz la presiuni n jur de 106 torri (1,33322 104 Pa). Nu este, prin urmare, posibil simpla pompare a eluentului obinut dintr-o coloan HPLC direct ntr-o surs a unui spectrometru de mas. De aici rezult c o important funcie a oricrei interfee este aceea de a nltura toat faza mobil sau ct mai mult posibil din aceasta.

    A doua incompatibilitate este legat de faptul c majoritatea analiilor care se pot separa prin HPLC sunt relativ nevolatili i/sau labili termic i prin urmare nu se preteaz la a fi ionizai utiliznd fie EI, fie CI. Prin urmare, trebuie s fie dezvoltate metode de ionizare alternativ.

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    17.

    Au fost prezentate n tez mai multe tipuri de interfee care sunt disponibile comercial. De asemenea au fost prezentate cele mai cunoscute modaliti de ionizare utilizate n practica de laborator. Un accent se va pune pe interfeele de tip electrospray (ESI) i cele cu ionizare chimic la presiune atmosferic (APCI), care prezint aplicabilitatea cea mai mare.

    Modaliti de interfaare 1. Interfa de tip INTRODUCERE DIRECT DE LICHID (DLI); 2. Interfa CU TRANSPORT; 3. Interfa CU JET DE PARTICULE (PBI).

    Modaliti de ionizare 1. Ionizare n FLUX CONTINUU I BOMBARDAMENT CU ATOMI RAPIZI; 2. Ionizare de tip ELECTROSPRAY;

    3. Ionizare chimic la presiune atmosferic; 4. Ionizare prin impact cu fotoni la presiune atmosferic; 5. Ionizare prin desorpie din matrice asistat laser (MALDI); 6. Ionizare tip ICP.

  • Rezumatul tezei de doctorat

    18.

    Capitolul 2. ANALIZOARE DE MAS

    Analizorul de mas este acea component a spectrometrului de mas n care odat ajuni, ionii generai de sursa de ionizare sunt separai, ordonai n funcie de valoarea m/z i msurai ca intensitate (abunden reletiv). Acest concept este cel mai important lucru ce trebuie neles i reinut despre analizoarele de mas, c ele msoar raportul m/z nu masa molecular. Acest lucru este adesea un punct de confuzie, n special n cazul ionizrii de tip electrospray a ionilor cu sarcin multipl, cnd raportul m/z este semnificativ mai mic dect masa molecular a acestora (de exemplu ionul peptidei, C37H68N16O142+, are m/z 488,3, iar masa molecular este 976,5 daltoni). Deasemenea trebuie avut n vedere importana raportului m/z, deoarece n special n ionizarea de tip electrospray unei specii i pot corespunde mai mai

    multe picuri.

    Principiul de funcionare al unui analizor de mas se bazeaz pe interacia pe care ionii int o au cu cmpuri externe de natur electrostatic i magnetic, cu geometrie precis.

    Primul analizor de mas a fost dezvoltat la nceputul anilor 1900, cnd s-a realizat separarea ionilor n cmp magnetic i electric n funcie de raportul m/z. Analizoarele de mas moderne, n a cror structur au fost incluse variaii ale primelor metode de separare magnetic, au capacitatea de a realiza separri cu acuratee i sensibilitate nalt, pe intervale de mas mari i deasemenea au posibilitatea de a da informaii structurale. Ca urmare a evoluiei tehnicilor de ionizare, a fost nevoie de o dezvoltare a analizoarelor de mas astfel nct s poat fi observai compui cu mase moleculare mari cu o acuratee de ordinul 0,1 pn la 0,0001%. Deasemenea, sensibilitatea necesar (de ordinul picomolilor pn la femtomoli) pentru numeroase aplicaii biologice a fost obinut cu surse de ionizare de tip electrospray i MALDI, care au o efecien mare de trasmitere a ionilor formai la analizorul de mas.

    Principalele caracteristici ale analizoarelor de mas sunt acurateea, rezoluia, intervalul de mas i capacitatea acestora de a lucra n tandem (cuplaj) cu alte analizoare de mas.

    Acurateea este posibilitatea analizorului de mas de a furniza informaii exacte asupra raportului m/z. Aceasta este n foarte mare msur dependent de o stabilitate a instrumentului. De exemplu, un instrument cu o acuratee declarat de 0,01% poate furniza informaii despre o peptid cu masa de 1.000 Da cu o acuratee de 0,1 Da sau despre o protein cu masa de 10.000 Da cu o acuratee de 1,0 Da. Acurateea variaz de la analizor de mas la analizor de mas, cte o dat chiar foarte mult.

    Rezoluia este capacitatea analizorului de mas de a distinge ntre doi ioni cu raport m/z diferit. Cu ct rezoluia este mai mare cu att crete capacitatea analizorului de mas de a face diferena ntre raporturile m/z corespunztoare ionilor. De exemplu un spectrometru de mas cu o rezoluie de 500 poate face distincia ntre ioni care au raportul m/z = 500 i 501. Cea mai cunoscut definiie a rezoluiei este dat de urmtoarea ecuaie:

    Rezoluia = M/M

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    19.

    unde M este raportul m/z corespunztor ionului i M este limea picului corespunztor ionului la jumtate din nlimea acestuia. De exemplu, dac limea la jumtate din nlime a unui pic corespunztor raportului m/z 500 este de 1, rezoluia va fi M/M = 500 / 1= 500.

    Intervalul de mas este intervalul de rapoarte m/z care pot fi determinate cu un analizor de mas. De exemplu, un analizor de tip cvadrupol are un interval de mas pn la m/z 3.000, un analizor de mas de tip sector magnetic poate ajunge pn la m/z 10.000, iar analizor de mas de tip timp de zbor are un interval de mas teoretic nelimitat.

    Capacitatea analizoarelor de mas de a lucra n cuplaj reprezint posibilitatea acestora de a separa un ion de ali ioni cu raport m/z diferit, realiznd n prima faz o disociere indus colizional a ionului precursor i apoi analiza ionilor produi. Acest proces se numete analiz cuplat deoarece analiza complet este realizat n mai multe analizoare de mas cuplate ntre ele (cuplaj n spaiu), cum este cazul analizorului de mas de tip triplu cvadrupol, care este compus din trei analizoare de mas de tip cvadrupol identice, sau este realizat n acelai analizor de mas (cuplaj n timp), cum este cazul analizoarelor de mas de tip trap ionic unde ionii de interes sunt izolai, fragmentai i apoi analizai ionii produi n aceiai incint. n cele mai multe cazuri, experimentele tandem MS sunt realizate prin generarea ionilor de interes i izolarea lor cu ajutorul primului analizor de mas. Ionii sunt apoi ciocnii cu molecule de gaz inert cum ar fi Argonul sau Heliu, iar fragmentele generate prin ciocnire sunt analizate.

    Principalele analizoare de mas prezentate n tez sunt: analizoare de mas de tip sector; analizoare de mas cu msurarea timpului de zbor; analizoare de mas de tip cvadrupol magnetic; analizoare de mas de tip trap ionic sau quistor; analizoare de mas cu rezonan ionic ciclotronic.

    Pentru acestea au fost prezentate principiile de funcionare, caracteristicile i modurile de cuplare.

  • Rezumatul tezei de doctorat

    20.

    Capitolul 3. CUPLAJE MS MULTIDIMENSIONALE

    Pentru anumite experimente poate aprea necesitatea real de a izola un ion specific (precursor sau printe) i de a-l fragmenta mai apoi, urmnd s se analizeze fragmentele ionice rezultate (ioni produi sau fiic)[80]. Teoretic, acest lan de procese poate continua de cteva ori cosecutiv, rezultnd experimente (MS)n multidimensionale.

    Pricipalul obiectiv al cuplajului MS/MS este acela de a mri selectivitatea metodelor cu finalitate cantitativ sau care i propun studii structurale / de stabilitate pentru analiii int.

    n conformitate cu Compendiul de Termeni n domeniul Chimiei IUPAC [81], cuplajul MS/MS

    reprezint un aranjament n care ionii sunt supui la dou sau mai multe etape secveniale de analiz (care pot fi separate spaial sau temporal) n raport cu valoarea mas/sarcin.

    Cuplarea MS/MS n spaiu impune utilizarea a dou sau mai multe analizoare de mas cuplate n serie (unul pentru fiecare proces de discriminare ionic). Cuplarea MS/MS n timp const n utilizarea unui singur analizor de mas, selecia ionilor precursor / produs fcndu-se succesiv, la diferite intervale de timp, determinate n raport cu momentul iniierii procesului.

    Odat ce ionul precursor a fost izolat, este necesar s se iniieze disocierea lui pentru a se putea produce fragmentele ionice corespunztoare (produi). Urmtoarele maniere de realizare a disocierii ionilor precursori sunt utilizate n practic:

    1. Disocierea indus colizional (CID collissional induced dissociation) [82-84]. n urma coliziunii dintre un ion i o specie gazoas neutr, o parte din energia de translaie a ionului

    este transformat n energie intern. Acest energie intern duce la disocierea ionului n fragmente ionice mici i poate cauza schimbri n sarcina ionului. Disocierea indus colizional este deasemenea cunoscut ca disociere activat colizional (sau descompunere activat colizional) i se abreviaz CAD. Disocierea indus colizional este foarte des ntlnit n experimente de tip MS/MS.

    2. Disocierea indus la nivelul unei suprafae (SID surface induced dissociation) [85-87]. Disocierea indus la nivelul unei suprafee este fragmentarea unui ion indus de coliziunea

    puternic a acestui ion cu o suprafa solid, care poate fi plasat ntre doi analizori de mas. Suprafaa ia locul moleculelor de gaz neutru din disocierea indus colizional.

    3. Disociere prin fotoni IR cu band larg de energie (IRMPD infrared multiphoton dissociation) Disociere prin fotoni IR cu band larg de energie [88-92] este o metod eficient de realizare a

    experimentelor MS/MS n cazul utilizrii unui analizor de mas de tip FTICR MSn. Disocierea ionilor are loc prin absorbia fotonilor IR cu band larg de energie provenii de la un fascicul laser CO2 cu emisie n infrarou, care ajunge n analizorul de mas printr-o fereastr de ZnSe dispus perpendicular fa de axa de micare a ionilor. Aceast tehnic este mai bun dect tehnica SORI, lipsa gazului neutru de coliziune mbuntind intervalul dinamic de scanare IRMPD.

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    21.

    4. Disociere IR n prezena unui corp negru (BIRD blackbody infrared dissociation) Disociere IR n prezena unui corp negru [93-96] este un caz special de disociere prin fotoni IR cu

    band larg de energie, n care excitarea ionilor precursor este obinut prin absorbia fotonilor IR produi de corpurile negre fierbini aflate n apropiere. Aceste corpuri negre se gsesc de obicei pe pereii camerei de vid.

    5. Iradiere susinut n stare de ne-rezonan (SORI - Sustained Off-Resonance Irradiation) Iradiere susinut n stare de ne-rezonan [97-100] este o tehnic de disociere a ionilor specific

    analizoarelor de mas de tip FTICR MSn. Prin intermediul acestei tehnici ionii precursori sunt supui simultan la coliziuni cu molecule de gaz dopant i la excitare cu ajutorul unui puls de frecven radio, cu frecven mai mic dect frecvena de rezonan a ciclotronului pentru ionul precursor. n funcie de frecvena de rezonan a ciclotronului pentru ionul precursor i de pulsul de frecven radio fie primesc energie i ncep s se deplaseze pe orbite cu raze din ce n ce mai mari rezultnd coliziuni cu gazul dopant, fie se deplaseaz pe orbite cu raze din ce n ce mai mici spre centru celulei. Cantitatea mic de energie obinut n urma acestor coliziuni este transformat n energie intern. Aceasta la rndul ei este disipat prin inetrmediul moleculelor din faza gazoas rezultnd astfel ioni produs cu energie mic.

    6. Disociere cu captur de electroni (ECD electron capture dissociation) Disocierea cu captur de electroni [101-109] este un proces n care molecule protonate cu sarcin

    multipl (de tipul [M+nH]n+) interacioneaz cu electroni cu energie de translaie sczut (n mod obinuit mai mic de 3 eV). Capturarea unui electron conduce la eliberarea de energie i reducerea strii de ncrcare electronic a ionului cu producerea ionului (M + nH)(n-1)+ cu electroni nemperecheai, care se fragmenteaz cu uurin. Aceast tehnic de fragmentare este foarte des utilizat pentru analiza ionilor de peptide i proteine n faz gazoas prin observarea modificrilor minore posttranslaie (PTMs). Deasemenea, acest tehnic funizeaz informaii complete despre secvenele de aminoacizi.

    7. Alterare energetic dup sursa de ionizare (PSD post source decay). Alterarea energetic dup sursa de ionizare [110-112] este o tehnic de disociere ionic specific

    analizoarelor de mas de tip msurarea timpului de zbor, disocierea avnd loc n zona de fug a acestuia. Dup formarea iniial a ionilor i accelerarea acestora la ieirea din sursa de ionizare acetia ptrund n zona de fug. Aici pot disocia sau se pot neutraliza.ntr-un instrument liniar de tip msurarea timpului de zbor, aceste fragmente ionice sau specii neutre pot ajunge la detector n acelai timp cu ionul precursor din care s-au format. Aceste reacii pot fi studiate mai n amnunt utiliznd un analizor TOF cu electrod de deflexie (ajustnd raportul de accelerarea al voltajelor electrodului de deflexie n modul de lucru n

    pai) pentru a transporta fragmentele ionice obinute prin alterarea energetic dup sursa de ionizare pn la detector.

    Cazurile 1-2 au un spectru larg de aplicabilitate, cele amintitite la punctele 3-6 sunt caracteristice

    pentru analizoarele de mas de tip trap ionic, n timp ce ultimul caz este dedicat surselor de ionizare de tip MALDI. Modul de disociere al ionilor precursori cel mai des ntlnit este fr ndoial CID. Procesul necesit atomi de Heliu pentru a coliziona ionii precursori producnd astfel fragmentarea lor. Deoarece

  • Rezumatul tezei de doctorat

    22.

    controlul energiei cinetice a speciilor neutre din punct de vedere electric (atomii de He) este dificil,

    reproductibilitatea proceselor de disociere indus colizional este obinut prin intermediul unui control riguros al accelerrii ionilor precursori.

    Au fost prezentate cteva tipuri de cuplage MS/MS i anume: 1. Analizor de mas de tip triplu cvadrupol (QQQ); 2. Analizor de mas de tip trap ionic (MSn QITs); 3. Analizorul de mas cu rezonan ionic ciclotronic (FTICR MSn); 4. Analizor de mas de tip cvadrupol / Analizor de mas cu msurare a timpului de zbor

    (Q/TOF);

    5. Analizor de mas cu msurarea timpului de zbor / Analizor de mas cu msurarea timpului de zbor (TOF/TOF).

    Moduri de lucru n spectrometria de mas prezentate n tez sunt: - Scanare complet - utilizat n scop calitativ i cantitativ (sensibilitate redus); - Monitorizarea Ionului Selectat (SIM) - analiz cantitativ; - Detecia simultan a mai multor ioni (MID) - analiz cantitativ (creterea sensibilitii) i

    confirmare structural; - Scanarea Ionilor Produs;

    - Scanarea Ionului Precursor;

    - Scanarea pierderii sau ctigului de mas neutr; - Monitorizarea unui singur proces de disocire (SRM);

    - Monitorizarea simultan a mai multor procese de disociere (MRM).

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    23.

    Capitolul 4. Elemente de farmacocinetic. Determinarea biodisponibilitii i bioechivalenei

    Biodisponibilitatea Biodisponibilitatea unei substane active (sau a formei active a acesteia) care se gsete ntr-un

    produs farmaceutic este definit ca fiind viteza i cantitatea n care ea este absorbit n compartimentul sanguin i devine disponibil la locul aciunii.

    Biodisponibilitatea este compus din dou variabile: cantitate i vitez, variabile care se pot determina plecnd de la reprezentrile grafice ale concentraiilor sanguine n funie de timp. Variabila cantitate este determinat prin msurarea ariei de sub curb (AUC) a concentraiilor sanguine ale compuilor de interes, iar variabila vitez prin combinarea urmtoarelor dou valori: concentraia maxim sanguin a analiilor de interes i timpul necesar pentru a atinge aceast concentraie.

    n funcie modul de raportare i scopul pentru care este determinat biodisponibilitatea substaei active poate fi de trei tipuri:

    biodisponibilitatea absolut; biodisponibilitatea relativ; biodisponibilitatea relativ optimal.

    Biodisponibilitatea absolut (sau randamentul absolut al adsorbiei) se refer la cantitatea de substan activ care, dup administrarea unui produs, ajunge la nivel sanguin. Aceasta se realizeaz prin compararea concentraiilor sanguine obinute prin administrarea unei substane active condiionat ca o form farmaceutic oarecare, cu concentraiile sanguine obinute prin administrarea aceleai doze de substan activ pe cale intravenoas. Acest tip de biodisponibilitate este considerat ca fiind cel mai relevant din punct de vedere al absorbiei substaei active la nivel sanguin i este destinat evalurii cii de administrare oral n raport cu calea intravenoas, considerat ca referin. Ea mai este denumit uneori i randament absolut al absorbiei, deoarece permite aprecierea fraciunii de substan absorbit dup administrarea pe o cale extravascular n raport cu calea intravascular, unde substana este injectat (se consider total absorbit).

    Biodisponibilitatea relativ se refer la compararea concentraiilor sanguine obinute prin administrarea a dou forme farmaceutice diferite, pe aceeai cale de administrare. Acesat comparaie ntre dou forme farmaceutice poate determina ce form farmaceutic poate oferi cea mai bun biodisponibilitate pentru o substan activ, administrat pe aceeai cale. Propus prima dat pentru a determina i compara cantitatea relativ de substa absorbit pe dou ci diferite de absorbie, ea este din ce n ce mai utilizat pentru a compara ntre ele performanele unor forme farmaceutice identice (sau diferite) administrate fie pe aceeai cale, fie pe ci diferite. Ea permite aprecierea bioechivalenei a dou forme farmaceutice asemntoare (dou tipuri de comprimate care conin aceeai substa activ) sau nu

  • Rezumatul tezei de doctorat

    24.

    (forma farmaceutic comprimate cu cea supozitoare), prin similaritatea biodisponibilitii lor. n acelai timp, contrar determinrii biodisponibilitii absolute, evaluarea biodisponibilitii relative se bazeaz pe compararea cantitii absorbite, disponibile, ct i pe viteza de absorbie (viteza de punere la dispoziie) dup administrarea a dou forme farmaceutice diferite. De exemplu, pentru preparatele administrate oral, se compar biodisponibilitatea cu cea a unei soluii.

    Biodisponibilitatea relativ optimal are un rol important n dezvoltarea formelor farmaceutice. Aceasta se refer la compararea concentraiilor sanguine obinute n urma administrrii unui produs farmaceutic nou formulat cu o form de referin, care teoretic este mai bun pe planul biodisponibilitii pentru fiecare cale de administrare n parte. Pentru calea oral, de exemplu, se estimeaz c o form farmaceutic de tip soluie are cea mai mare biodisponibilitate, cu toate c sunt numeroase exemple care demonstreaz c uneori trebuie utilizat o form farmaceutic de tip suspensie sau emulsie.

    n strns legtur cu noiunea de biodisponibilitate este noiunea de bioechivalen. Echivalena produselor farmaceutice reprezint un termen relativ care compar efectul terapeutic

    sau un ansamblu de condiii de calitate ale unui produs farmaceutic cu acelai efect sau ansamblu de condiii de calitate ale altui produs farmaceutic.

    Bioechivalena Bioechivalena reprezint echivalena biodisponibilitii a dou medicamente ce conin aceeai

    substan activ, n acelai dozaj, n aceeai form de prezentare sau n forme farmaceutice diferite, dar administrate pe aceeai cale.

    Exist mai multe definiii pentru bioechivalen, dar toate exprim n esen acelai lucru. Un medicament este bioechivalent cu un medicament de referin (inovator) atunci cnd curbele concentraiilor plasmatice n funcie de timp sunt superpozabile sau nu prezint diferene semnificative statistic.

    Studiile de bioechivalen se realizeaz ca o alternativ la efectuarea de teste clinice, cu scopul determinrii echivalenei terapeutice a medicamentelor, exprimat la nivel de eficacitate i siguran. Prin studierea bioechivalenei se urmrete identificarea unor echivaleni farmaceutici care s aib acelai efect terapeutic. Astfel produsele medicamentoase bioechivalente sunt echivalente din punct de vedere al

    efectului terapeutic i pot fi folosite pentru nlocuirea unuia cu cellalt (n cele mai multe cazuri nlocuirea produsului inovator cu cel generic supus studiului de bioechivalen). n consecin, FDA a cerut, printr-un Abbreviated New Drug Application (ANDA), studii de bioechivalen companiilor care produc medicamente generice ca o alternativ pentru medicamentele inovatoare care nu mai sunt protejate de un patent sau alt form de proprietate intelectual.

    Ca o consecin direct a realizrii de studii de bioechivalen a fost introdus termenul de drug interchangeability (medicamente care pot fi schimbate ntre ele). Acest termen prezint dou aspecte i anume drug prescribability (medicament prescriptibil) i drug switchability (medicament nlocuitor). Drug prescribability se refer la posibilitatea prescrierii de ctre medic pacienilor si a unei game de

  • Cuplajul LC/MS n separarea i determinarea substanelor active din fluide biologice

    25.

    medicamente generice, pe lng medicamentul de referin, bioechivalente cu acesta. Posibilitate de a prescrie un generic n locul medicamentului inovator este n mod obinuit stabilit pe baza bioechivalenei populaionale. Pe de alt parte drug switchability este legat de posibilitatea nlocuirii unui medicament inovator ce a fost administrat unui pacient al crui organism a atins un nivel stabil de concentraie cu un medicament generic. Posibilitate de a nlocui un medicament inovator cu unul generic este stabilit pe baza bioechivalenei individuale.

    Parametrii farmacocinetici eseniali ce se regsesc n normele FDA pentru studierea bioechivalenei in vivo sunt AUC(0-), Cmax, tmax, t1/2 i te. Aa cu se va vedea n paragraful Parametri farmacocinetici, acetia pot fi obinui direct din nivelurile concentraiei medicamentului n snge la diverse momente de timp, fie prin prelucrarea acestor datelor analitice n cadrul unui model uni sau multicompartimental. n

    general parametrii AUC(0-), Cmax sau tmax se calculeaz direct, ntruct sunt independeni de model, sunt uor de calculat i conin informaia esenial referitoare la caracteristicile farmacocinetice ce determin bioechivalena. Totui aceasta metod de calcul direct are i unele dezavantaje. Unul dintre ele l constituie numrul mic de momente de timp la care se preleveaz probele, insuficient pentru o estimaie riguroas a parametrilor Cmax sau tmax. n consecin tmax