1

REZUMAT TEZĂ DOCOTRAT “Căi de semnalizare cu rol în diferenţierea celulelor stem”

Doctorand: Maria Linda Cruceru

Capitolul I – Introducere Celulele stem au reprezentat o descoperire crucială în domeniul cercetării medicale din

ultimele decenii. Datorită rolului normal al celulelor stem s-a intuit posibilitatea utilizării acestora în medicina regenerativă, în patologiile traumatice sau degenerative, cum sunt accidentele vasculare cerebrale, traumatismele la nivelul măduvei spinării, Parkinson, Alzheimer, scleroza multiplă, scleroza laterală amiotrofică, infarctul miocardic, patologii distructive hepatice etc. Datorită microcosmosului reprezentat de celulele stem, celulele-nişă şi celulele diferenţiate rezultate, cu relaţii funcţionale care depăşesc limitele cunoaşterii actuale, până în prezent nu s-a reuşit refacerea arhitecturii structurale complexe şi a funcţiei organelor vizate în diverse patologii.Astfel, terapiile cu celule stem la care lumea ştiinţifică spera întârzie să-şi arate roadele, în ciuda eforturilor deosebite de cercetare în mai multe domenii: neurologie, cardiologie etc.

Descoperirea mai recentă a celulelor stem maligne a redeşteptat speranţele spre o nouă utilizare terapeutică a informaţiilor acumulate privind mecanismele de reglare şi semnalizarea în celulele stem sau progenitorii lor, urmărindu-se ţintirea terapeutică a acestor celule stem maligne în diverse patologii tumorale deosebit de agresive şi/sau rezistente la terapiile convenţionale. Această linie strategică de terapie prezintă avantajul atacării tocmai a celulelor responsabile de iniţierea, menţinerea sau metastazarea tumorii (eventual în combinaţie cu terapiile clasice) şi, prin necesitatea manipulării celulelor stem maligne, prevede exploatarea informaţiilor pe care cercetarea fundamentală continuă să le furnizeze.

Dintre patologiile tumorale care încă nu beneficiază de terapie eficientă, tumorile cerebrale ocupă un loc fruntaş, glioamele, în special cele cu grad înalt de malignitate – glioblastoamele – fiind dintre tumorile cele mai agresive, cu răspuns nesatisfăcător la terapiile convenţionale şi cu rată de supravieţuire în jur de un an de la diagnostic. Totodată s-a descoperit deja prezenţa unui procent de celule stem maligne la nivelul lor, celule incriminate în această evoluţie nefastă. Astfel, glioblastoamele reprezintă încă o provocare medicală şi sunt foarte potrivite pentru testarea de noi strategii terapeutice care să ţintească populaţia de celule stem maligne, inclusiv prin manipularea căilor de semnalizare pe care aceste celule le folosesc. Am ales deci să îmi focalizez cercetările privind căile de semnalizare din celulele stem asupra celor utilizate de celulele stem maligne din glioblastoame.

Teza de doctorat intitulată “Căi de semnalizare cu rol în diferenţierea celulelor stem”, în

forma sa in extenso, este structurată în două părţi: o parte generală ce sintetizează cunoştinţele ştiinţifice din literatura internaţională, privind tema studiată, şi o parte sepecială ce cuprinde contribuţia doctorandei la dezvoltarea domeniului.

Partea generală, structurată în trei capitole, prezintă informaţiile privind celulele stem din literatura internaţională după cum urmează:

Capitolul I - Celulele stem – caracteristici; Capitolul II - Căi de semnalizare specifice perioadei de dezvoltare, celulelor stem şi patologiei

tumorale; Capitolul III - Celule stem maligne.

2

Capitolul II - Obiective Un model in vitro foarte atractiv pentru studierea semnalizării celulare este reprezentat de

culturile de celule. Deşi există linii celulare standardizate de glioblastom, totuşi ele par să acumuleze, în decursul

imortalizării, aberaţii genetice sau modificări epigenetice importante, care nu se regăsesc la tumorile originare ale pacienţilor, astfel încât s-a constatat că modelul de studiu cel mai fidel este reprezentat de culturi celulare derivate din fragmente tumorale obţinute de la pacienţi.

Eu mi-am propus elaborarea unui astfel de model experimental, pe care să realizez

experimentele, comparativ cu linia celulară standard de glioblastom U87. Mi-am stabilit astfel următoarele obiective:

1. Stabilirea unor culturi celulare derivate din fragmente tumorale – glioblastom, culturi care să reflecte fidel, genotipic şi fenotipic, tumora de origine;

2. Investigarea unor markeri specifici pentru celule stem şi progenitoare, ce reprezintă substratul agresivităţii deosebite a glioblastoamelor şi al rezistenţei acestora la terapia clasică;

3. Analiza simultană a unui panel de molecule implicate în diverse căi de semnalizare, atât în condiţii bazale, cât şi în urma tratării culturilor cu inhibitori ai unor căi de semnalizare;

4. Monitorizarea în timp real a comportamentului celular, pentru verificarea influenţei inhibitorilor de semnalizare care au dovedit eficienţa optimă;

5. Descoperirea unor markeri serici care să poată fi folosiţi ca factori de prognostic sau pentru monitorizarea terapiei la pacienţii cu glioblastom.

Capitolul III – Material şi metode 1. CAZUISTICA

În prezentul studiu au fost incluşi 33 pacienţi diagnosticaţi cu glioblastom stadiu IV, care au fost supuşi curei chirurgicale a tumorii la Institutul Naţional de Neurologie şi Boli Neurovasculare din Bucureşti.A fost obţinut consimţământul informat al pacienţilor, conform standardelor etice incluse în revizia curentă a declaraţiei de la Helsinki. De la aceşti pacienţi s-a recoltat ser, ce a fost analizat comparativ cu serul a 40 subiecţi clinic sănătoşi, privind expresia unor factori de creştere /angiogenici, respectiv a receptorilor acestora, prin multiplexare şi tehnica ELISA. De la 17 dintre pacienţiau fost colectate fragmente din piesele operatorii. Perechi de ţesut tumoral, respectiv peritumoral de la aceste cazuri au fost analizate prin multiplexare xMAP, pentru studierea nivelului de expresie a unor molecule implicate în semnalizare. De asemenea s-a realizat imunohistochimie pentru factori de creştere.Fragmente din piesele tumorale de la 9 cazuri au fost procesate pentru iniţierea de culturi celulare. Supernatanţii culturilor celulare obţinute au fost utilizaţi pentru analiza expresiei fracţiei solubile a receptorilor pentru factorii de creştere /angiogenici, în paralel cu analiza serică. Drept control negativ a fost utilizat supernatantul unei culturi de ţesut cerebral normal uman, îmbogăţită în astrocite, iar drept control pozitiv linia celulară standard de glioblastom U87. Culturile derivate din fragmentele tumorale de la pacienţi au fost investigate, în paralel cu linia standard U87, prin imunofluorescenţă şi citometrie în flux, ceea ce a relevat prezenţa a numeroşi markeri de celule stem /progenitoare. Aceste rezultate atestă prezenţa celulelor stem maligne, care sunt incriminate în agresivitatea deosebită a acestei patologii. Experimentele de multiplexare pentru studiul expresiei bazale a unor molecule de semnalizare, precum şi modularea acestei expresii în prezenţa unor inhibitori ai căilor de semnalizare, au fost realizate pe lizate din culturile celulare derivate din piesele tumorale de glioblastom de la pacienţi, în paralel cu linia standard de glioblastom U87. Culturile din două cazuri, precum şi recidiva tumorală de la unul dintre ele, au fost supuse analizei în timp real a comportamentului celular, studiindu-se capacitatea de aderare şi proliferare a acestor popolaţii de celule tumorale în prezenţa inhibitorilor farmacologici ai căilor de semnalizare, în paralel cu celulele

3

liniei standard de glioblastom U87, prin teste de măsurare a impedanţei. În plus, pe lizate din linia celulară standard de glioblastom U87, s-a realizat şi validarea inhibiţiei semnalizării, determinându-se modularea nivelului de expresie al unor molecule implicate în semnalizare prin Western blot.

Metodele de studiu întrebuinţate au fost: 2. Culturi celulare derivate din fragmente de glioblastom 3. Imunofluorescenţa 4. Citometria în flux 5. Analiza imunohistochimică (IHC) 6. Analiza de multiplexare – xMAP array 7. Metoda enzimatică sandwich ELISA – validarea unor factori de creştere 8. Teste Proliferare 9. Western blot 10. Monitorizarea în timp real a aderării şi proliferării unei populaţii de celule în

cultură prin xCELLingence

Cap. IV REZULTATE IV.1. Culturi celulare obţinute din fragmente de glioblastom

Premiza de la care se porneşte în utilizarea unei culturi celulare ca material de studiueste stabilitatea sa şi comportamentul similar cu al tumorii de origine. Totuşi, au fostraportate o serie de aberaţii genetice care nu au fost regăsite în tumorile extrase de lapacienţi, motiv pentru care este importantă standardizarea metodei de menţinere înculturi a probelor prelevate de la pacienţi, asfel încât cultura derivată să prezinte aberaţiilegenetice şi moleculare ale tumorii originare. Între avantajele menţinerii unei culturi se numărăposibilitatea repetabilităţii experimentelor şi observarea modificării profilului molecular laanumiţi stimuli. Compararea profilurilor expresiei anumitor receptori sau citokine exprimatede diverse culturi celulare tumorale permite evidenţierea unor parametri ce potservi ca bază pentru protocolul de diagnostic sau punct de plecare pentru noi resurseterapeutice.

În această lucrare am utilizat culturi celulare derivate din tumori cerebrale extirpate dela pacienţi în cadrul unor proceduri de rezecţie tumorală.Au fost prelucrate fragmente tumorale de la 9 cazuride glioblastom, din care am iniţiat cu succes 7 culturi, care au prezentat un uşor aspect heterogen. Ulterior, după primul pasaj, au început să se selecteze celule fusiforme, al căror corp a devenit mai globulos, cu prelungiri celulare în numar de 2-4, lungi de cca 40 micrometri.

Dintre cele 7 culturi, două şi-au menţinut caracteristicile morfologice dincolo de pasajul 2, fiind astfel utilizate în toate experimentele ulterioare. De asemenea, pentru unul din aceste cazuri s-a obţinut material biologic şi din recidiva tumorală, realizându-se cultură celulară pe care au fost efectuate o parte din experimente. Menţionez că pacientul respectiv nu a fost supus chimio- sau radioterapiei între cele două intervenţii chirurgicale. Cazurile menţionate au fost selectate pentru că au prezentat cele mai bune rate de proliferare dintre culturile realizate. Astfel, aceste culturi au putut fi comparate cu linia celulară standardizată de glioblastom U87 în privinţa ratei de proliferare. Totodată au permis generarea unui număr suficient de celule/ pasaj încât să conducă la obţinerea unor lizate celulare care să asigure o concentraţie proteică satisfăcătoare pentru desfăşurarea experimentelor ulterioare. De asemenea a mai fost supusă prelucrării o piesă de ţesut nervos normal rezultat din rezecţia necesară pentru a se realiza cura unui anevrism vascular cerebral important. Piesa a fost supusă protocolului de obţinere a culturilor îmbogăţite în astrocite prezentat mai sus.

Ulterior prelucrarea probelor a ţintit 3 direcţii principale, în vederea obţineriiculturilor celulare din tumori cerebrale tip glioblastom:

- obţinerea de explant tumoral şi de celule migrate din explant; - obţinerea de culturi celulare din piese tumorale/peritumorale prin disocierea mecanică

apieselor bioptice; - obţinerea de culturi celulare din piese tumorale/peritumorale prin disociere enzimatică.

4

Figura IV.1.1.(stanga) Cultură primară din glioblastom, ziua 12. Obiectiv 20x, contrast de fază; (dreapta) Sferă tumorală formată în cultură de celulele de glioblastom, obţinute de la cazul 3, obiectiv 20x, contrast de fază

Am observat că metoda de disociere enzimatică furnizează rezultate superioare celorlalte, atât în privinţa numărului de celule rezultat în urma procedurii,cât şi a supravieţuirii acestora după însămânţare.

Celulele au avut un ritm susţinut de diviziune, ajungând la confluenţă în 7-8 zile, pasajele fiind făcute 1:4. Celulele prezintă aspect fibroblast-like, etalate, crescând până la confluenţă şi fiind capabile de generarea unor zone suprapuse, aspect tipic pentru cultura astrocitară.

Celulele au fost verificate periodic prin imunocitochimie cu anticorpi anti GFAP, pentru a se observa raportul de celule cu origine glială (provenite din tumoraluată în studiu) versus celule din stromă. După obţinerea pe parcursul pasajelor a unei culturicelulare stabilizate (cu fenotip şi morfologie stabilă, rată de proliferare constantă), acestea au fost supuse experimentelor ulterioare: evidenţierea profilului de expresie a unor molecule implicate în semnalizarea celulară, modificarea acestui profil în urma acţiunii unor inhibitori de semnalizare (pe diferite căi), studierea în timp real a comportamentului populaţiei celulare în situaţia expunerii la astfel de inhibitori.

La cultivare mai îndelungată, celulele provenite de la unul din cazuri au dezvoltat neurosfere similare cu cele generate de celulele liniei standardizate de glioblastom U87 (Figura.VI.1.1.dreapta) Astfel, s-a observat o tendinţă de nucleere şi generare a unor mase celulare sferice conţinand celule mici, cu corp globulos şi prelungiri subţiri şi lungi, în cazul în care erau menţinute fără a fi pasate peste 10 zile. Se poate susţine că aceste celule au pierdut fenomenul de inhibiţie de contact, fapt caracteristic mai ales celulelor tumorale.

O abordare similară a fost raportată de Qiu et al, grup care a utilizat GFAP ca marker pentru celulele de gliom în cultură[272].Witusik-Perkowska et al au raportat celule aderate şi culturi sferoide derivate din glioblastoame, ce prezentau morfologie similară cu celulele cultivate în studiul de faţă; în continuare autorii au examinat capacitatea de proliferare şi stabilitatea genetică a celulelor din culturile obţinute[273] Celulele din cultură şi-au păstrat trăsăturile morfologice de-a lungul mai multor pasaje, aşa cum se poate observa urmărind forma şi dimensiunile celulare, precum şi densitatea lor în cultură.

Examinarea prin imunofluorescenţă a GFAP, nestinei a detectat o prezenţă relativ constantă a acestor biomarkeri de la un pasaj la altul. GFAP a fost exprimată în peste 90% din celule în toate situaţiile, atestând originea tumorală a celulelor cultivate (aşadar celule gliale, cu rată de proliferare crescută, şi nu celule care să prezinte în mod normal această importantă rată de creştere, cum ar fi, spre exemplu, celulele endoteliale sau fibroblaste de la nivelul meningelui). Exemple ale distribuţiei GFAP şi nestinei în pasajele 1 şi 4 sunt prezentate în figura IV.1.2.

5

Figura IV.1.2. Expresia de GFAP (verde) şi Nestină (roşu) în celulele cultivate din piesele tumorale de glioblastom. Immunofluorescenţă, examinată pe Nikon TE300, obiectiv 60x : Caz 1 - pasaj 1, GFAP (a), Nestină (b); Caz 1- pasaj 4, GFAP (c), Nestină (d); Caz 3 - Pasaj 1, GFAP (e), Nestină (f); Caz 3 - Pasaj 4, GFAP (g), Nestină (h); nuclei contracoloraţi cu DAPI (albastru). Scală: 20 µm. IV.2. Investigarea prezenţei fenotipului stem în culturile celulare de glioblastom – imunofluorescenţă şi citometrie în flux

Am investigat prezenţa caracterelor de celule stem sau progenitoare în culturile celulare derivate din cazurile de glioblastom. S-a realizat imunofluorescenţă indirectă, folosind procedura descrisă la material şi metode. Rezultatele au fost comparate cu linia standardizată de celule tumorale cu fenotip de glioblastom - U87. Celulele au fost examinate pentru a se observa nivelul expresiei şi distrubuţia pentru Nestina, Notch (1-4) şi c-Kit (stem cell factor receptor), precum şi EGFR, VEGFR2.

S-a constatat că aceste populaţii celulare prezintă o expresie a GFAP încă imatură, mai consistentă în celulele ce migrează din “sferă”, dar patternul este unul difuz citoplasmatic, nefibrilar. În acelaşi timp, prezenţa unui nivel crescut al expresiei nestinei, cu pattern fibrilar, sugerează o populaţie de celule slab diferenţiate, cu fenotip aparţinând sferei progenitorilor neurali. Caracterul nediferenţiat al acestor celule este sugerat şi de expresia importantă a tuturor variantelor de receptori Notch şi a c-Kit (markeri stemness), fapt care confirmă existenţa CELULELOR STEM TUMORALE în glioblastoame.

6

Figura IV.2.1.Imunofluorescenţă indirectă pentru Nestină: A. cultură celulară din fragmente tumorale de glioblastom, nucleii coloraţi cu DAPI (albastru) şi nestina cu AlexaFluor 488 (verde);obiectiv 100x.B. linia standard de glioblastom U87, nucleii coloraţi cu DAPI (albastru) şi nestina cu AlexaFluor 594 (roşu); obiectiv 40x.

Figura IV.2.2. Imunofluorescenţă indirectă pentru Notch 1. cultură derivată din glioblastom, obiectiv 60x. B.linia standard de glioblastom U87, obiectiv 40x. Nuclei coloraţi cu DAPI (albastru), Notch 1 cuplat cu AlexaFluor 488 (verde).

Figura IV.2.3.Imunofluorescenţă indirectă pentru Notch 2:A.cultură derivată din glioblastom;B.linia standard de glioblastom U87. Nuclei coloraţi cu DAPI (albastru), Notch 2 cuplat cu AlexaFluor 488 (verde); obiectiv 40x.

Figura IV.2.4.Imunofluorescenţă indirectă pentru Notch 3:A.cultură derivată din glioblastom;B.linia standard de glioblastom U87. Nuclei coloraţi cu DAPI (albastru), Notch 3 cuplat cu AlexaFluor 488 (verde); obiectiv 60x.

A B

A B

A B

A B

7

Figura IV.2.5.Imunofluorescenţă indirectă pentru Notch 4:A.cultură derivată din glioblastom, obiectiv 60x. B.linia standard de glioblastom U87, obiectiv 40x. Nuclei coloraţi cu DAPI (albastru), Notch 4 cuplat cu AlexaFluor 488 (verde).

Figura IV.2.6. Imunofluorescenţă indirectă pentru c-Kit:A.cultură derivată din glioblastom, obiectiv 60x. B.linia standard de glioblastom U87, obiectiv 40x. Nuclei coloraţi cu DAPI (albastru), c-Kit cuplat cu AlexaFluor 488 (verde).

Figura IV.2.8.Imunofluorescenţă indirectă pentru EGFR, realizată pe culturi celulare din fragmente tumorale de glioblastom, nucleii coloraţi cu DAPI (albastru) şi EGFR cu AlexaFluor 488 (verde). A.Obiectiv 40x; B. Obiectiv 100x.

Figura IV.2.9.Imunofluorescenţă indirectă pentru VEGFR2, realizată pe culturi celulare din fragmente tumorale de glioblastom.A.VEGFR2 cuplat cu AlexaFluor 594 (roşu),obiectiv 40x; B. VEGFR2 cuplat cu AlexaFluor 488 (verde),obiectiv 100x. Nucleii coloraţi cu DAPI (albastru).

A B

A B

A B

A B

8

Aceste celule exprimă de asemenea importante cantităţi de EGFR si VEGFR2. Imunofluorescenţa indirectă a evidenţiat prezenţa receptorilor membranari pentru EGF, respectiv VEGF, cu intensitate crescută, în majoritatea celulelor din culturile de glioblastom (88% celule pozitive pentru EGFR, respectiv 76% celule pozitive pentru VEGFR2). Patternul este unul membrabar difuz, uşor punctat (figurile VI.2.8, respective VI.2.9). Prezenţa acestei constelaţii de receptori poate face aceste celule susceptibile influenţei externe realizată prin inhibitori specifici pentru fiecare în parte sau cumulativ. În practica curentă, sunt aprobaţi pentru uzul uman inhibitori c-Kit, EGFR şi sunt în studiu clinic inhibitori Notch.

Pentru confirmarea expresiei crescute a markerilor de stemness, am investigat culturile

derivate din piesele de glioblastom şi linia celulară standard de glioblastom U87 prin citometrie în flux.

Figura IV.2.10. Citometrie în flux, realizată pe culturi celulare din fragmente tumorale de glioblastom. A.Nestină versus control; B.c-Kit versus control.;C, CGFAP versus control.

Figura IV.2.11. Citometrie în flux, realizată pe culturi celulare din fragmente tumorale de glioblastom, pentru receptorii Notch. A. Notch 1 versus control; B. Notch 2 versus control; C. Notch 3 versus control; D. Notch 4 versus control.

Rezultatele au atestat prezenţa nestinei, filament intermediar caracteristic celulelor stem şi progenitoare, în 84,84% din celule (figura IV.2.10, A), precum şi a receptorului pentru factorul de celule stem (stem cell factor receptor) – c-Kit, în 49,07% din celule (figura IV.2.10, B).

Analizând panelul receptorilor Notch, implicaţi în semnalizarea celulelor stem, amconstatat o expresie crescută a tuturor celor 4 tipuri de receptori Notch, cu menţiunea creşterii majore a nivelului de expresie pentru Notch 3 şi Notch 2, urmată de Notch 1 şi Notch 4 (figura VI.2.11 A-D). Astfel, 78,18% din celule au prezentat Notch 1;90,3% Notch 2;97, 74% Notch 3, respectiv 43,26% Notch 4.

Pleiomorfismul expresiei Notch 1-4, c-Kit şi nestinei confirmă de asemenea datele din literatură, ce sugerează multiclonalitatea celulelor stem maligne şi a celulelor progenitoare derivate în glioblastom.

A B C

A B

C D

9

Direcţionarea către fenotipul glial a celulelor din culturile obţinute de la pacienţii cu glioblastom este certificată de expresia GFAP în aproape toată populaţia celulară – 99,59% (figura IV.2.12).

Acest fenomen particular al expresiei unor filamente intermediare caracteristice unor celule parţial diferenţiate concomitent cu expresia covârşitoare a unei pleiade de markeri stem-ness poate sugera că apariţia celulelor stem maligne este mai degrabă rezultatul unui proces de dediferenţiere tumorală, bazată pe mutaţii punctiforme ce reactivează mecanisme stem, decât tumorigeneza cu punct de plecare în celulele stem neuronale normale. IV.3. Nivelul de expresie a factorilor de creştere/angiogenici în culturi primare, linii celulare şi serul pacienţilor cu glioame prin tehnologia xMAP

Pentru analiza citokinelor şi a factorilor de creştere: IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, GM-CSF, INFγ, TNFα, VEGF şi FGF-2 prin tehnologia xMAP – Luminex 200 au fost luate în studiu 33 cazuri de pacienţi diagnosticaţi cu glioame.

Glioblastomas/control

GM-CSF IFNg IL-1b IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 IL-12p70 TNFa FGF-2 VEGF0123456789

Sti

mu

lati

on in

dex

Figura IV.3.1. Creşterea nivelului expresieipentru citokine, respectiv factori de creştereîn serul pacienţilor cu glioame, faţă de control. Histogramele reprezintăraportul dintre valoarea medie a lotului de pacienţi şi valoarea medie a lotului martor pentru fiecare citokină /factor de creştere (“fold increase”).

Analiza citokinelor şi a factorilor de creştere serici prin metoda multiplex a relevat modificări

ale nivelului de expresie, în cazul pacienţilor cu glioame faţă de lotul martor, după cum urmează: Creşteri semnificative ale nivelului de expresie în glioame faţă de lotul control, pentru:

- GM-CSF: 43,86 /16,47 pg/mL (p<0,05); - IFNγ: 51,1/ 31,84 pg/mL; - IL-1β: 23,46/ 4,23pg/mL (p<0,01); - IL-2: 23,29 /9,73 pg/mL (p<0,05); - IL-6: 59,03/ 12,2 pg/mL (p<0,01); - IL-8: 27,9/ 14,97 pg/mL (p<0,05); - IL-10: 26,9/ 3,1 pg/mL (p<0,01); - TNFα: 12,63/ 3,5 pg/mL (p<0,01); - VEGF: 368/ 115 pg/mL (p<0,05); - bFGF: 32,48/ 10,83 pg/mL (p<0,05);

scăderi semnificative ale nivelurilor de expresie la pacienţii cu glioame faţă de lotul control, pentru: - IL-4: 8,62/10,22 pg/mL; - IL-12: 7,56/13,17 pg/mL.

Astfel, în urma analizei xMAP s-a detectat o puternică supraexpresie pentru IL-6, IL-1β, IL-10 şi TNFα (> 3 ori la pacienţii cu glioame). Un nivel seric crescut s-a înregistrat şi pentru VEGF, FGF2, IL-8, IL-2 şi GM-CSF. Expresia semnificativ crescută a acestor factori de creştere şi citokine a fost corelată cu gradul tumoral, markerii de proliferare şi agresivitatea clinică în glioame.

10

Figura IV.3.2 Nivelul de expresie pentru citokine, respectiv factori de creştereîn serul pacienţilor cu glioame. Pentru fiecare citokină /factor de creştere, histograma din stânga reprezintă valoarea medie a lotului de pacienţi cu gliom, iar histograma din dreapta reprezintă valoarea medie a lotului control. IV.4. Validarea factorilor de creştere VEGF şi bFGF în serul pacienţilor cu glioame

Validarea a fost efectuată prin tehnica ELISA. Pentru analiza factorilor angiogenici VEGF şi bFGF prin ELISA au fost luate în studiu 40 cazuri de pacienţi diagnosticaţi cu glioame.

Concentraţiile VEGF din serul pacienţilor şi al martorilor s-au determinat pe baza curbei de etalonare şi a ecuaţiei curbei (y=0,0005x+0,0574; R2=0,9978) obţinute.

Concentraţiile bFGF din serul pacienţilor, respectiv al martorilor s-au determinat pe baza curbei de etalonare şi a ecuaţiei curbei (y=0,0037x+0,0692; R2=0,998) obţinute.

VEGF

0

250

500

750

1000

1250

control pacienti

pg

/mL

bFGF

0

25

50

75

100

control pacienti

pg/m

L

Figura VI. 4.1.Reprezentarea grafică a nivelului seric al VEGF (pg/mL) şi al bFGF (pg/mL,) la martori şi la pacienţii cu glioame

Analiza prin ELISA a serului provenit de la pacienţii cu glioame a relevat diferenţe semnificative între lotul martor şi cel al pacienţilor, astfel:

- pentru VEGF nivelul seric a variat la pacienţi între 193,54 pg/mL şi 520,61 pg/mL, cu o medie de 372,07 pg/mL, versus 112,5 pg/mL la lotul martor (p<0,001).

- pentru bFGF, la aceeaşi pacienţi, nivelul seric a variat între 22,84 pg/mL şi 41,61 pg/mL, cu o medie de 32,24 pg/mL, versus 10,83 pg/mL la lotul martor (p<0,01). IV.5. Confirmarea prin imunohistochimie /imunofluorescenţă a prezenţei factorilor de creştere VEGF şi bFGF

Un aport deosebit în caracterizarea agresivităţii glioamelor îl are evaluarea/determinarea profilului angiogenic, respectiv a factorilor angiogenici.

Prin tehnica de imunohistochimie s-a observat expresia pozitivă pentru VEGF şi bFGF la nivelul glioblastoamelor.Imaginile de mai jos au fost selectate de la cele două cazuri luate în studiu pentru toate experimentele pe culturi celulare.

11

Figura IV.5.1.A. Reacţie intens pozitivă pentru VEGF în celule tumorale – glioblastom detaliu, IHC 40x B..Confirmarea prezenţei VEGF (AlexaFluor 488 - verde), pattern difuz citoplasmatic, preponderent perinuclear, în celulele din cultura derivată din glioblastom.Nuclei contracoloraţi cu DAPI (albatru).Imunofluorescenţă indirectă, obiectiv 100x.

Figura IV.5.2.A.Reacţie intens pozitivă difuză pentru bFGF în celule endoteliale şi tumorale – glioblastom, IHC 20x; B.Reacţie pozitivă pentru bFGF în celule tumorale şi endoteliale – glioblastom, IHC 10x.

Analiza imunohistochimică a demonstrat prezenţa expresiei VEGF şi bFGF în majoritatea

cazurilor studiate, cu preponderenţă în tumorile cerebrale invazive, ceea ce concordă cu potenţialul de proliferare – Ki67. S-a remarcat reacţie imunopozitivă comparabilă pentru VEGF şi bFGF, în majoritatea cazurilor, atât în ceea ce priveşte intensitatea reacţiei, cât şi numărul de celule imunoreactive (50-60% celule pozitive). În tumorile studiate, VEGF şi bFGF au prezentat o reacţie intens pozitivă, difuză, atât în endoteliul vascular, cât şi în celulele tumorale (figurile IV.5.1-2).

Imunoreacţia pentru VEGF a fost observată atât la nivelul celulelor endoteliale cât şi în cele tumorale, în procent mai ridicat în cele cu grad înalt de agresivitate, şi a fost confirmată şi pe culturile celulare obţinute din piesele de glioblastom. Imunofluorescenţa a permis observarea distribuţiei VEGF în celulele cultivate de la pacienţi – pattern difuz citoplasmatic, mai intens perinuclear.

bFGF a prezentat o imunoreacţie mai pronunţată decât VEGF în celulele tumorale, în concordanţă cu gradul de agresivitate tumorală. IV.6. Nivelul de expresie a receptorilor factorilor de creştere/angiogenici în culturi primare, linii celulare şi serul pacienţilor cu glioblastom, analizat prin tehnologia xMAP Analizarea expresiei fracţiei solubile a receptorilor pentru VEGF, EGF, respectiv IL-2α

S-a analizat nivelul expresiei fracţiei solubile a receptorilor pentru VEGF, EGF şi IL-2α pe serul obţinut de la 12 pacienţi diagnosticaţi cu glioblastom, în comparaţie cu serurile a 20 de subiecţi normali, cu ajutorul platformei xMAP array Luminex 200. Achiziţia datelor multiplex s-a realizat cu ajutorul StarStation 2.3 (sistem de citometrie aplicată – Sheffield, UK).

De asemenea, tot cu ajutorul platformei xMAP array, a fost analizată expresia aceloraşi fracţiuni solubile ale VEGFR2, EGFR, respectiv IL-2Rα şi în supernatanţiia 5 culturi primare de

A B

A B

12

glioblastom selectate şi al liniei standardizate U87, folosindu-se drept control negativ supernatantul culturii obţinute din creier uman normal, îmbogăţită în astrocite.

La pasajul 3 celulele au fost însămânţate la o densitate standard de 2x105 celule/flask şi cantitate fixă de 5 ml mediu. După 72 de ore supernatantul a fost recoltat pentru analiza nivelul expresiei fracţiunii solubile a receptorilor pentru VEGF (VEGFR2), EGF (EGFR) şi IL-2α (IL-2Rα) pe platforma xMAP Array Luminex 200. Datele obţinute au fost normalizate pentru o populaţie de 5x105 celule, un timp de 72 de ore şi o cantitate fixă de 5 ml mediu.

Secreţia EGFR seric (sEGFR) este crescută – statistic semnificativ –la pacienţii cu glioblastom (pre-operator) faţă de subiecţii normali, iar post-operator secreţia scade, apropiindu-se de valorile normale.

Secreţia în mediul de cultură a receptorului solubil pentru EGF a prezentat pattern-ul ilustrat în figura VI.6.1. Supernatanţii culturilor obţinute din cazurile de glioblastom, precum şi cel din linia standard de glioblastom U87 au prezentat valori crescute ale acestui receptor solubil, comparativ cu cultura primară îmbogăţită în astrocite, obţinută din creier uman normal.

Acest rezultat vine să susţină testul efectuat pe serul pacienţilor cu glioblastom înainte şi după rezecţia tumorală. Coroborate, aceste date susţin ipoteza utilizării sEGFR drept biomarker într-un panel extins de markeri pentru evoluţia tratamentului şi monitorizarea/depistarea recidivelor la pacienţii cu glioblastom.

Figura IV.6.1.Expresia sEGFR prin tehnica XMAP array. Stânga – supernatanţi de culturi celulare, dreapta – seruri de la subiecţi normali şi pacienţi cu glioblastom, pre- şi post-operator. Rezultatele sunt exprimate în pg/mL.

Rezultatele testărilor pe ser prezintă o secreţie crescută la pacienţii cu glioblastom înainte de rezecţie(semnificativ statistic), faţă de subiecţii normali. După rezecţia tumorală se evidenţiază o scădere a secreţiei sVEGFR2, totuşi nivelul rămânând mai crescut decât la subiecţii normali, dar fără relevanţă statistică.

Secreţia în mediul de cultură a VEGFR2 seric (sVEGFR2) a prezentat pattern-ul evidenţiat în figura de mai jos. Supernatanţii culturilor obţinute din cazurile de glioblastom, precum şi cel din linia standard de glioblastom U87 au prezentat valori crescute ale acestui receptor solubil, comparativ cu cultura astrocitară de control.

Coroborate, aceste date susţin folosirea sVEGFR2 ca biomarker, însă valoarea sa luată individual este mai scăzută decât în cazul sEGFR, dar poate fi folosit în cadrul unui panel, pentru creşterea sensibilităţii procedurilor de diagnostic.

05000

100001500020000250003000035000400004500050000

sEGFR

0100002000030000400005000060000700008000090000

Normal Patients

GB Patients serum

GB patients post surgery

sEGFR

13

Figura IV.6.2.Expresia sVEGFR2 prin tehnica XMAP array. Stânga – supernatanţi de culturi celulare; dreapta – seruri de la subiecţi normali şi pacienţi cu glioblastom, pre- şi post-operator.Rezultatele sunt exprimate în pg/mL.

În cazul expresiei IL-2Rα, valorile au fost scăzute preoperator la pacienţii cu glioblastom faţă de control, revenind către normal postoperator, dar fără semnificaţie statistică. În ceea ce priveşte sIL-2Rα, determinările în supernatanţii culturilor celulare au prezentat valori asemănătoare, atât pentru cultura standard astrocitară, cât şi pentru cele 5 cazuri sau linia standardizată U87. În opinia mea, sIL-2Rα nu este util ca potenţial marker pentru monitorizarea tratamentului pacienţilor cu glioblastom.

Figura IV.6.3.Expresia IL2-Rα prin tehnica XMAP array. Stânga – supernatanţi de culturi celulare; dreapta – seruri de la subiecţi normali şi pacienţi cu glioblastom, pre- şi post-operator. Rezultatele sunt exprimate în pg/mL.

În serurile obţinute de la pacienţii cu glioblastom s-au evidenţiat creşteri ale fracţiunilor solubile de EGFR, VEGFR2, comparativ cu serurile de la subiecţi normali, cu o diferenţă semnificativăîn cazul EGFR. În cazul expresiei IL-2Rα, valorile au fost scăzute la pacienţii cu glioblastom faţă de control, dar fără semnificaţie statistică.

Supernatanţii din culturile celulare obţinute din glioblastoame au demonstrat de asemenea valori modificate ale nivelurilor receptorilor solubili pentru EGF şi VEGF, cu tendinţă similară cu nivelurile serice. Supernatantul liniei standard de glioblastom U87 a prezentat valori crescute ale acestor receptori solubili, comparativ cu o cultură primarăîmbogăţităîn astrocite, obţinută din creier uman normal. În cazul IL-2Rα solubil, rezultatele pe supernatanţi au fost neconcludente.

Fracţiunile solubile ale EGFR, respectiv VEGFR2 sunt promiţătoare pentru utilizarea ca markeri serici în glioblastoame, având marele avantaj al neinvazivităţii ţestului. Rezultatele obţinute s-au corelat cu cele obţinute pe culturi celulare, care nu pot fi utilizate în practica medicală ca test de screening.

01000200030004000500060007000

sVEGFR2

0.00

5,000.00

10,000.00

15,000.00

20,000.00

25,000.00

30,000.00

Normal Patients

GB Patients serum

GB patients post surgery

sVEGFR2

0

200

400

600

800

1000

1200

sIL-2Ra

0200400600800

10001200140016001800

Normal Patients

GB Patients serum

GB patients post surgery

sIL-2R alpha

14

VI.7. Evaluarea moleculelor de semnalizare pe linii standard, culturi primare de glioblastom şi ţesut aferent În studiul de faţă a fost examinat pattern-ul de expresie al mai multor molecule implicate în transducţia semnalului pe diverse căi de semnalizare, molecule-cheie în variate tipuri de cancer, inclusiv în glioblastom. Nivelul de expresie pentru astfel de molecule-cheie relevante în semnalizarea implicată în carcinogeneza cerebrală – ERK 1/2, JNK, P70S6K, IκBα, p38şi CREB – a fost determinat în probe de ţesut tumoral de la pacienţi cu glioblastom, comparativ cu ţesut peritumoral de la pacienţii respectivi. Profilul de expresie este prezentat în figura VI.7.1. S-au evidenţiat diferenţe semnificative în probele de ţesut tumoral, faţă de cele de ţesut peritumoral: kinazele ERK 1/2, P70S6K, p38 şi factorul de transcriere CREB au fost crescute de 1,9-2,17 ori.

Fig IV.7.1. Nivelul de expresie a unor molecule implicate în semnalizare pe ţesut tumoral/peritumoral.Intensitatea medie a fluorescenţei (Mean Fluorescence Intensities - MFI) estimată prin Luminex-xMAP.Normalizarea s-a bazat pe nivelul GADPH.

Profilul de expresie bazal (fără stimulare) alaceloraşi molecule a fost examinat în culturile celulare obţinute din piesele tumorale de glioblastom şi în linia celulară de glioblastom U87, fiind prezentat în figura VI.7.2.Pattern-ul de expresie apare similar între celulele derivate din cazuri şi celulele U87, pentru majoritatea moleculelor.

Figura IV.7.2. Expresia bazală a moleculelor de semnalizare pe culturi derivate din fragmente tumorale de glioblastom şi pe linia standard de glioblastom U87.Intensitatea medie a fluorescenţei (Mean Fluorescence Intensities - MFI) estimată prin LuminexxMAP.Normalizarea s-a bazat pe nivelul GADPH.

15

Profilul de expresie al moleculelor de semnalizare prezentat de celulele din culturile derivate de la pacienţi urmează acelaşi trend observer pe ţesutul tumoral de origine, dar la concentraţii crescute. Acest fapt poate fi explicat de o rată mai mare a celulelor fiziologic active şi o “contaminare” mai redusă cu cellule stromale, endoteliale, inflamatorii la nivelul culturilor, faţă de ţesutul tumoral de origine (Figurile IV.7.1, respective IV.7.2).

Tratarea celulelor cu inhibitori de protein-kinaze a relevat o varietate de răspunsuri la nivelul expresiei moleculelor de semnalizare, pattern apreciat ca specific pentru fiecare cultură celulară (Figura IV.7.3).

Figura IV.7.3. Modularea expresiei moleculelor de semnalizare în culturi celulare obţinute din piese tumorale de la pacienţi, tratate cu inhibitori farmacologici: LY 294002 (A), PD 98059 (B), U 0126 (C) şi SB 203580 (D).

Culturile celulare obţinute din piesele tumorale de la pacienţi au răspuns la tratamentul cu inhibitorul LY 294002 prin scăderea nivelului de expresie al tuturor moleculelor de semnalizare investigate. Ceilalţi 3 inhibitori au fost mai puţin eficienţi (FiguraVI.7.3.A). Celulele obţinute de la cazul 3 au răspuns mai bine, prezentând o scădere a nivelului de expresie între 30.47% şi 66.61%, în timp ce pentru celulele obţinute de la cazul 1 marja a fost între 18.66 şi 50.44%. Este important de subliniat că această scădere nu reflectă inhibiţia proliferării celulare, din moment ce rezultatele au fost normalizate în funcţie de nivelul proteinei “house keeping” GADPH, şi nici nu reflectă un efect toxic al inhibitorilor folosiţi, întrucât viabilitatea a fost similară.

Efectele inhibiţiei kinazelor au fost demonstrate atât pe componentele cascadelor de semnalizare ţintite (PI3K P70S6K, Mek-Erk1/2 P70S6K), cât şi pe molecule implicate în alte cascade de transducţie a semnalului (CREB). Expresia P70S6K este scăzută semnificativ în urma inhibiţiei PI3K prin utilizarea LY 294002 (Figura IV.7.3.A); întrucât P70S6K are o importanţă deosebită în controlul sintezei proteice, este de aşteptat o scădere generală a sintezei proteice, ca o consecinţă a inhibiţiei unuia dintre principalii săi activatori. Interesant este că inhibiţia MEK 1 asupra celulelor din cazul 3, prin utilizarea PD 98059, a rezultat într-o scădere moderată a nivelului de expresie pentru toate moleculele de semnalizare investigate, ceea ce nu s-a observat şi pentru cazul 1, unde efectele inhibitorului au fost mai selective. Inhibitorii de MEK 1 şi MEK1/2 au exercitat un efect mai puternic decât inhibitorul pentru p38 (FiguraIV.7.3.B-D), ceea ce sugerează că Erk1/2 ar fi o ţintă teraspeutică mai potrivită pentru cazurile de glioblastom. Comparativ cu celulele din culturile obţinute de la pacienţi, linia celulară U87 a fost sensibilă, în grade variate, la toţi inhibitorii utilizaţi

16

(Figura IV.7.4). Această diferenţă între culturile primare şi linia celulară standardizată poate reflecta defecte adiţionale acumulate de celulele liniei standard în decursul pasajelor. Totuşi, şi la nivelul liniei standard U87, tot inhibitorul de PI3K a fost cel mai activ şi mai constant asupra tuturor moleculelor investigate.

Figura IV.7.4. Modularea expresiei proteinelor de semnalizare în linia celulară de glioblastom U87, în urma tratamentului cu inhibitorii farmacologici LY 294002, PD 98059, U 0126 şi SB 203580.

Se remarcă inhibiţia pe multiple căi a nivelului de expresie a unor proteine -cheie din

procesele de semnalizare celulară. Deşi inhibitorii au o ţintă specifică la nivel celular, datorită fenomenului de cross-talk între căile de semnalizare se modifică întreaga constelaţie a moleculelor implicate în transducţia semnalului. Magnitudinea cea mai mare a fost constatată pentru inhibitorul LY 294002, care a reuşit să scadă expresia proteinelor, în toate culturile şi pe toate căile investigate. VI.8. Influenţa tratamentului cu inhibitori farmacologici asupra ratei de proliferare celulară

În imaginea de mai sus (Figura IV.8.1) se observă proliferarea celulelor din culturile derivate din glioblastoame obţinute de la pacienţi şi a celuleor din linia standard de glioblastom U87, cuantificată prin test MTS, sub tratament cu cei 4 inhibitori farmacologici: inhibitor de PI3K – LY294002 25 μM, inhibitor MEK-1 – PD98059 25 μM, inhibitor MEK – U0126 10 μM şi inhibitor p38 – SB203580 10 μM.. Inhibitorul LY294002a fost cel mai eficace în ceea ce priveşte scăderea proliferării tuturor culturilor luate în studiu. Examinarea viabilităţii celulare cu albastru tripan a relevat procente sub 2% în toate cazurile, certificând faptul că rezultatele inhibiţiei proliferării nu se datorează efectului toxic al inhibitorului aplicat.

Figura IV.8.1.Rata proliferării celulare la aplicarea pe culturile celulare derivate din glioblastom şi pe linia standard U87 a inhibitorilor farmacologici: inhibitor de PI3K – LY294002 25 μM (LY),

0

100

200

300

400

500

600

700

U87 Caz 1 Caz 3

CTRL DMSO

SB

U

PD

LY

17

inhibitor MEK-1 – PD98059 25 μM (PD), inhibitor MEK – U0126 10 μM (U) şi inhibitor p38 – SB203580 10 μM (SB), cuantificată prin test MTS. IV.9. Validarea prin tehnica Western blot a efectului inhibitor al inhibitorului LY294002 asupra activităţii moleculei ţintă a modulării expresiei unor molecule de semnalizare

Fiziologic, PI3K acţionează direct asupra Akt, activând această moleculă prin fosforilare. Este de aşteptat ca inhibiţia eficientă a PI3K să împiedice fosforilarea Akt, însă efectul administrării unui inhibitor în culturi celulare este influenţat de penetranţa sa în citoplasmă, de realizarea unei concentraţii eficace, de durata de acţiune şi viteza de degradare a acestuia.

Pentru a verifica eficacitatea inhibiţiei semnalizării prin inhibitorul de PI3K (LY294002), ce s-a dovedit cel mai eficient în scăderea nivelului de expresie a moleculelor de semnalizare investigate în experimentele de multiplexare, am verificat prin Western blot starea de activitate a moleculei ţintite de PI3K în calea de semnalizare. Astfel, în condiţiile unei încărcări echivalente, garantate de nivelul egal al β actinei, fracţiunea fosforilată a Akt (pAkt) a înregistrat o scădere marcată în urma tratamentului cu LY294002, dovedind eficienţa inhibiţiei PI3K (figura IV.9.1).

Figura IV.9.1. Analiya Western blot pentru verificarea efectului inhibitor al inhibitorului LY294002 asupra activităţii moleculei ţintă şi asupra nivelului de expresaie al P70S6K, ERK 1/2, şi CREB Celulele liniei standard de glioblastom U87 incubate cu vehicul (1/400 DMSO) pentru control, respectiv inhibitor de PI3K (LY294002) 25 µM timp de 24 ore. Pentru controlul încărcării s-a realizat reblotarea pentru β actină. Se observă că tratamentul cu inhibitor de PI3K a redus semnificativ nivelul de pAkt. IV.10. Monitorizare în timp real a aderării şi proliferării celulare în culturile celulare derivate din glioblastom şi linia standard de glioblastom U87 – cu platforma xCELLigence

După rezultatele obţinute în urma analizei xMAP, am dorit verificarea impactului pe care aceşti inhibitori ai unor căi de semnalizare îi au asupra comportamentului populaţiilor de celule tumorale, utilizând platforma xCELLigence. În condiţii bazale, celulele din culturile obţinute din piesele tumorale de la pacienţi au atins faza de platou în primele 24 ore, similar celulelor din linia standard de glioblastom U87. Alegerea de a folosi doar celule în condiţii bazale (creştere în mediu de cultură obişnuit, fără deprivare de ser sau stimulare) ca punct de referinţă faţă de experimentele cu inhibitori ai căilor de semnalizare s-a făcut ţinând seama de rezultatele publicate de Bartscht et al. [274]. Acest grup a arătat că atât celulele stimulate, cât şi cele nestimulate prezintă comportament similar în privinţa experimentelor de inhibiţie [274]. Primele ore de experiment au demonstrat o comportare uşor diferită a celulelor din culturile de glioblstom obţinute de la pacienţi faţă de linia standard de glioblastom U87 (Figura IV.10.1.a). Deşi, aşa cum era de aşteptat, celulele din cultura obţinută din cazul 1 au prezentat rată de proliferare mai scăzută decât celulele U87 şi au ajuns mai devreme în faza de platou (Figura IV.10.1.b), celulele din cultura obţinută de la cazul 3 au depăşit celulele liniei standardizate în primele 12 ore după însămânţare (Figura IV.10.c.). De la acest pacient (caz 3) a fost posibilă obţinerea de ţesut tumoral şi de la recidivă (Figura IV.10.d). Celulele din cultura obţinută din piesa de recidivă tumorală au prezentat aderenţă şi proliferare crescute comparativ cu celulele liniei standard U87, în aceeaşi tendinţă cu comportamentul celular al culturii obţinute din piesa tumorală iniţială de la cazul 3. Astfel, fenotipul pare să fie stabil şi să progreseze în

18

sensul agresivităţii, întrucât aderenţa şi proliferarea celulelor cultivate din recidivă au fost crescute faţă de comportamentul celulelor cultivate din fragmentul tumoral iniţial de la cazul 3.

Studiul în timp real al modificărilor de impedanţă electrică a demonstrat că inhibiţia PI3K scade adeziunea şi proliferarea celulară în toate cazurile analizate.

La aplicarea inhibitorilor de semnalizare pe celulele din linia standard de glioblastom U87, aderenţa şi proliferarea celulară au scăzut, inhibitorul de PI3K – LY 294002 având efectul cel mai pronunţat, în concordanţă cu rezultatele obţinute prin analiza xMAP (figura IV.10.1).

Figura IV.10.1. Aderarea şi proliferarea celulelor din linia standard de glioblastom U87 în urma tratamentului cu inhibitori ai căilor de semnalizare.

În aceste circumstanţe, am decis să investighez în continuare dacă modificările la nivel

molecular manifestate la inhibiţia PI3K au răsunet semnificativ şi la nivelul comportamentului celular asupra culturilor obţinute din piesele de glioblastom de la pacienţi. 25 μM de LY 294002 au determinat scăderea aderenţei şi proliferării celulelor din linia U87, cât şi a celulelor din culturile obţinute din piesele de glioblastom de la pacienţi (Figura IV.10.2). Celulele provenite de la cazul 1 au răspuns întârziat inhibiţiei PI3K (Figura IV.10.2.a); totuşi, după 24 ore, acest răspuns a ajuns la semnificaţie statistică, aşa cum se observă în graficul din dreapta.

Am studiat în continuare patternul de aderenţă şi proliferare al celulelor din linia standard de glioblastom U87 şi al celulelor provenite din recidiva tumorală de la cazul 3 în privinţa răspunsului la inhibiţia MEK-1 prin utilizarea de PD 98059 25 μM (Figura VI.10.3.), întrucât acest inhibitor a fost al doilea ca eficacitate în experimentele pe linia standard U87. După 24 ore de incubare încondiţii standard, cu vehicul conţinând 1/400 DMSO – control, respectiv inhibitor MEK-1, s-a observat scăderea proliferării în urma inhibiţiei MEK-1, atât pentru linia celulară standard U87 (Figura IV.10.3.a), cât şi pentru populaţia celulară derivată din glioblastomul recidivat de la cazul 3(Figura IV.10.3.b). Acest rezultat sugerează acţiunea sinergică a celor 2 inhibitori – inhibitor de PI3K şi inhibitor de MEK-1, ceea ce deschide perspectivele utilizării lor combinate, cu posibilitatea scăderii dozelor, la pacienţii cu glioblastoamesensibile la acest tip de inhibiţie.

19

Figura IV.10.2. Analiza în timp real a proliferării celulare în condiţiile inhibiţiei PI3K, prin măsurarea modificărilor de impedanţă electrică(coloana din stânga). Pentru analiza statistică (coloana din dreapta) s-a utilizat testul T-student pentru indexul celular normalizat la 24 ore (p < 0.01) *. Datele reprezintă media şi deviaţia standard din 3 experimente independente.

Figura IV.10.3. Analiza în timp real a proliferării celulare sub efectul inhibiţiei MEK-1, prin măsurarea modificărilor impedanţei electrice (coloana din stânga). Pentru analiza statistică (coloana din dreapta) s-a utilizat testul T-student pentru indexul celular normalizat la 24 ore (p < 0.01) *. Datele reprezintă media şi deviaţia standard din 3 experimente independente.

20

Capitolul V - DISCUŢII

Căile de semnalizare specifice perioadei de dezvoltare se regăsesc la adult doar la nivelul celulelor stem sau, reactivate în mod aberant, în patologia tumorală. Se discută chiar rolul lor în patogeneza tumorală (de exemplu în cazul receptorilor constitutiv activi).

Celulele stem reprezintă o preocupare majoră în peisajul ştiinţific şi clinic medical actual, prin perspectiva utilizării lor ca terapii celulare. Înţelegerea şi controlarea căilor de semnalizare ce le guvernează permit manipularea cu succes a celulelor stem în scopuri terapeutice, oferind în acelaşi timp perspectivele unor noi abordări terapeutice pentru o gamă largă de neoplazii, având drept ţintă celulele stem maligne.

Având în vedere datele recente care arată rezistența dobândită la tratamentele moleculare sau lipsa lor de eficacitate, s-a sugerat faptul că sensibilitatea celulelor tumorale față de terapia țintită este, în mare măsură, afectată de impactul pe care îl au mutațiile la nivelul unor oncogene sau gene care codifică pentru diverși receptori celulari.În celulele tumorale activarea rețelelor de semnalizare prevalează, iar identificarea componentelor nodale esențiale ar trebui vizată pentru a obține sensibilitate în terapie[275]. Numeroase studii atestă că mai multe cascade de semnalizare pot fi activate prin semnalizarea unui receptor şi alți receptori pot fi co-activați pentru a menține activarea unei căide semnalizare downstream[276]. De exemplu, s-a arătat că inhibarea Akta indus expresia și fosforilarea mai multor receptori tirozin-kinazici, pe de o parte prin inhibiția mTORC1, iar pe de altă parte prin activarea FOXO-dependentă a expresiei receptorului[277].

În studiul de faţă am ales investigarea unor căi de semnalizare în glioblastoame, tumori în care a fost demonstrată prezenţaunui procent de celule stem maligne, considerate responsabile de agresivitatea deosebită a acestui tip tumoral şi de rezistenţa la terapiile convenţionale. Această situaţie creează necesitatea unor noi abordări terapeutice, care să ţintească celulele stem maligne, eventual prin manipularea semnalizării la nivelul acestora.

Dacă luăm în considerare interacția dintre căile de semnalizare Notch și RAS/MEK/ERK și PI3K/Akt downstream de EGFR și rolul lor în glioblastomdovedit experimental, se poate specula că inhibiția simultană a mai multor căi de semnalizare poate conduce la îmbunătățirea tratamentului pentru pacienții cu gliom.

Tumorile intracraniene reprezintă un grup eterogen de neoplasme ce par să stea la baza unor tipare diferite de creştere, invazie, răspuns la terapie şi prognostic[278,279]. Glioblastoamele constituie unul dintre cel mai frecvent întâlnite tipuri de tumori din sistemul nervos central şi cel mai letal tip de tumoră la adulţi[280,281]. În ciuda progresului în domeniile chirurgiei şi radioterapiei şi a adăugării temozolomidei[282], prognosticul pentru pacienţii cu gliom rămâne rezervat[280]. Printre motivele pentru care terapia eşuează se regăsesc şi rezistenţa la terapie şi recurenţa frecventă, alături de fenotipul migrator şi persistenţa celulelor stem maligne responsabile de iniţierea tumorii[257,283].Deşi evenimentul/evenimentele iniţiale transformatoare rămân ambigue, progresia tumorilor craniene a fost asociată cu multiple modificări de semnalizare, despre care s-a postulat că ar conferi avantaje de supravieţuire şi proliferare[284].

Studii privind patogeneza glioblastomului îi subliniază complexitatea moleculară; aşadar, metodele biochimice convenţionale (spre exemplu Western Blot, ELISA) pot omite componente esenţiale şi/sau profilurile de semnalizare ale acestei boli devastatoare.S-a presupus că influenţa combinată a mai multor gene sau biomarkeri s-ar putea dovedi identificatori superiori şi/sau instrumente de predicţie ale comportamentului tumoral şi evoluţiei pacientului[285]. Rămân de descoperit legături mecanistice între diferite căi de semnalizare şi par să depindă de tipul de celulă. Admiţând posibilitatea existenţei mai multor conexiuni de semnalizare, profilul proteomic de înaltă performanţă devine o abordare importantă în cercetarea în cancer. Mai mult, analizele disponibile în prezent, precum xMAP şi tehnologiile proteomice, oferă premize bune în cercetarea tumorilor intracraniene umane. Aceste tehnologii pot realiza analizarea simultană a unui panel de molecule de semnalizare, pentru un diagnostic îmbunătăţit, stratificarea pacienţilor, prognostic şi selectarea tratamentului medicamentos. Descoperirea de biomarkeri pentru tumori intracraniene reprezintă o preocupare constantă, iar căutarea celei mai bune molecule sau combinaţii de molecule este în plină desfăşurare[277,284,286].

21

Investigarea mecanismelor moleculare care stau la baza comportamentului glioblastoamelor (inclusiv a agresivităţii lor şi a rezistenţei la tratament) este în strânsă legătură cu descoperirea şi dezvoltarea unor noi inhibitori ce ţintesc actori cheie, asemenea protein tirozin kinazelor[285,287]. Dereglări raportate ale semnalizării PI3K/Akt/mTOR (fosfatidilinositol 3-kinază/protein kinază B/factorul ţintă al rapamicinei la mamifere) reprezintă adeseori rezultatele supraactivării receptorului tirozin-kinazic (implică receptorul factorului de creştere epidermic, receptorul factorului de creştere derivat din plachete, factorul de tranziţie mezenchimal-epitelială), subunităţi PI3K ce prezintă mutaţii, si/sau pierderea activităţii supresoare tumorale a PTEN[218]. Pe lângă faptul că mai mult de 40% din glioblastoame prezintă pierdere a PTEN, fapt ce cauzează semnalizare PI3K în exces, un număr semnificativ de glioblastoame prezintă inactivare funcţională a PTEN prin modificări post-translaţionale, cum ar fi fosforilare la Y240 şi altele [218].

Din perspectiva medicinei personalizate, evaluarea dereglărilor de semnalizare ar avea cel mai mult de beneficiat de pe urma studiului culturilor celulare din glioblastoame, prelevate din tumorile pacienţilor. Aşadar, culturile celulare provenite de la pacienţi oferă modelul experimental ideal pentru rezultate care se concentrează pe biologia tumorală şi/sau pe noi abordări terapeutice [273].

Premiza de la care se porneşte în utilizarea unei culturi celulare ca material de studiueste stabilitatea sa şi comportamentul similar cu al tumorii de origine. Totuşi, au fostraportate o serie de aberaţii genetice care nu au fost regăsite în tumorile extrase de lapacienţi, motiv pentru care este importantă standardizarea metodei de menţinere înculturi a probelor prelevate de la pacienţi, asfel încât cultura derivată să prezinte aberaţiilegenetice şi moleculare ale tumorii originare. Între avantajele menţinerii unei culturi se numărăposibilitatea repetabilităţii experimentelor şi observarea modificării profilului molecular laanumiţi stimuli. Compararea profilurilor expresiei anumitor receptori sau citokine exprimatede diverse culturi celulare tumorale permite evidenţierea unor parametri ce potservi ca bază pentru protocolul de diagnostic sau punct de plecare pentru noi resurseterapeutice. Astfel, studiul meu se bazează pe culturi celulare derivate din fragmente de glioblastom obţinute de la pacienţi, comparativ cu linia celulară standardizată de glioblastom U87.

Celulele stem neuronale au fost definite pentru prima dată înurma cultivării ceulelor din zona subventriculară, demonstrându-se capacitatea lor de a prolifera, de a se auto-reînnoi şi a genera celule fiice multipotente[288,289]. NSC cresc in vitro formând clustere celulare care au fost denumite neurosfere, ulterior acest test in vitro fiind denumit tesul neurosferelor. Testul constă în creşterea în mediu fără ser fetal bovin, conţinând factori de creștere (EGF și FGF-2), într-un sistem lipsit de adeziune celulară. În condiţii ideale o singură celulă stem susceptibilă sau o celulă progenitoare poate genera o neurosferă după câteva diviziuni celulare. Neurosferele cresc ca agregate sferice celulare ce plutesc liber, având sute-mii de celule, numărul acestora fiind direct proporţional cu numărul de diviziuni celulare. Dimensiunea neurosferelor este frecvent cuprinsă între 100 şi 200 µm[290,291].Potenţialul de amplificare in vitro se corelează de asemenea şi cu dimensiunea neurosferei,reprezentând creşterea în număr a celulelor între pasaje succesive. Conceptul de auto-reînnoire este definit ca proprietatea unei singure celule de a determina o clonă. În cazul testului neurosferelor, proprietatea de auto-reînnoire este reprezentată de posibilitatea unei celule de a genera o neurosferă subclonală, fiind cel mai important argument al caracteristicii de stemness pentru o celulă. O regiune este considerată neurogenă dacă celule din componenţa ei pot să genereze neurosfere, numărul de neurosfere generate fiind în legătură directă cu numărul de celule stem din nişa respectivei regiuni. Când factorii de creştere sunt eliminaţi, în prezenţa serului fetal apare aderenţa la substrat şi diferenţierea către neuroni, astrocite şi oligodendroglii[292].

Testul neurosferelor este excelent pentru obţinerea şi expansiunea celulelor stem neuronale, testarea proprietăţilor acestora şi experimente pentru medicina regenerativă. Neurosferele pot fi disociate şi cultivate multe pasaje (până la 60 în funcţie de vârstă şi ţesutul de origine al celulelor), dar când sunt cultivate mai mult de 10 pasaje proprietăţile lor se pot modifica[293], căpatând uneori aspecte de celule tumorale, sau prezentând o instabilitate cromozomială progesivă[294]. Ca atare, doar neurosferele cultivate pentru perioade foarte scurte ar trebui folosite în studiile clinice[292].

Abilitatea NSC de a supravieţui tatamentelor cu medicamente ce ţintesc mitoza şi menţinerea capacităţii neurogenice sugerează diviziunea rară a acestor celule[295]. Această proprietate de stadiu dormant relativ este legată de mentenenţa lor pe termen lung, pe întreaga durată de viaţă a organismului. Statusul dormant al NSC adulte este activat prin câteva mecanisme, inclusiv

22

semnalizarea prin Notch şi BMP[296-298], prin neurotransmiţători[299], molecule de adeziune celulară[300], inhibitori ai ciclului celular[299,301], factori intrinseci[102]. O fracţiune mică, dar detectabilă a populaţiei de celule stem neuronale adulte proliferează destul de rapid in SVZ şi SGZ[299,302].

În studiul de față, caracterizarea multiparametrică a culturilor derivate din fragmentele de glioblastom a relevat prezența mai multormarkeri specifici celulelor stem: Notch1-4, c-Kit, nestină, sau a unora întâlniți atât în celulele stem, cât și în alte tipuri celulare, cu este receptorul pentru EGF. Receptorii Notch 1-4 au fost exprimați la nivel crescut în toate celulele. La adult, calea Notch este rezervată celulelor stem, celulelor progenitoare și celulelor stem tumorale. Acest fapt, dublat deexpresia în celule cultivate de mine a receptorului pentru factorul celulelor stem și a filamentelor intermediare de nestină, sugerează fenotipul stem al celulelor din culturile realizate din fragmentele tumorale prelevate de la pacienți. Expresia receptorului pentru EGF, o moleculă folosită și pentru mentenanța populației de celule stem normale, s-a dovedit prezentă la un nivel crescut în celulele din cultură. Demonstrarea fenotipului stem este susținută de apariția în cultură a unor colonii sferice, cu aspect caracteristic neurosferelor (fig.VI.1.2).

În acest studiu am investigat tiparele de expresie pentru mai multe molecule implicate în transducţia semnalului în celule de glioblastom, utilizând tehnici multiplex, atât în condiţii bazale, cât şi sub tratament cu inhibitor de kinază, ţintind moleculele de semnalizare cheie.

Investigarea panelului de molecule de semnalizare ales pe probe tisulare de glioblastom (perechi de ţesut tumoral, respectiv peritumoral) în paralel cu culturile menţionate, a condus la rezultate comparabile, ceea ce confirmă validitatea utilizării culturilor celulare derivate din piesele tumorale ca model experimental pentru studiul molecular şi funcţional al tumorilor respective.

Întrucât am căutat posibile ţinte terapeutice viitoare, am analizat efectul pe termen mediu al inhibitorilor asupra moleculelor implicate în transducţia semnalului. Am considerat relevantă evaluarea în paralel a acestor tipare pe culturile celulare prelevate de la pacienţi şi pe linia celulara de glioblastom U87. Mai mult, am studiat funcţional comportamentul celular, prin investigarea în timp real a proliferării celulare, folosind abordarea xCELLigence.

Studiul de faţă a relevat faptul că inhibarea căii PI3K în celulele de glioblastom prelevate de la pacienţi are un impact semnificativ asupra expresiei proteinelor de semnalizare, precum şi asupra tiparului de proliferare celulară. O combinaţie de monitorizare a comportamentului celular în timp real şi analiză a nivelului expresiei proteinelor de semnalizare poate semnala diferenţe importante între tumorile primare similare din punct de vedere histologic şi poate permite comparaţii între mostre de tumori primare şi recidive de la acelaşi pacient.

Este esenţială îmbunătăţirea înţelegerii mecanismelor fundamentale ce guvernează proliferarea şi invazivitatea tumorală în vederea dezvoltării în viitor a unor noi strategii terapeutice pentru abordarea unor cancere devastatoare cum este glioblastomul. Ca în orice tip de tumoră malignă, celulele din glioblastom prezintă rată crescută de supravieţuire din cauza mutaţiilor, amplificărilor şi supresiilor genice, ţintind adesea (cel puţin 40%) calea de semnalizare PI3K[303,304]. Deşi calea de semnalizare PI3K este investigată drept posibilă ţintă terapeutică pentru glioblastom [303,305-307], este esenţial să se studieze efectul inhibitorilor pe culturile celulare derivate din piesele prelevate de la pacienţi şi să se caracterizeze cu atenţie sensibilitatea la inhibitori sau la combinaţii de inhibitori. Efectele globale observate în studiile de semnalizare pot susţine dependenţa acestor tumori de calea de semnalizare PI3K; aşadar, inhibitorii PI3K în postura de agenţi terapeutici ar putea schimba peisajul tratamentului clinic în cazul pacienţilor cu glioblastom[215,308,309].

Studiile mele au revelat faptul că tratamentul culturilor celulare de glioblastom prelevate de la pacienţi cu inhibitor de PI3K a dus la o descreştere semnificativă a nivelului expresiei mai multor molecule de semnalizare implicate în supravieţuirea celulară (p38), proliferare (ERK 1/2, IκBα, p38 MAP, CREB), diferenţiere (ERK 1/2, CREB), migrare (ERK 1/2, CREB) şi apoptoză (ERK 1/2, P70S6K, IκBα, JNK, CREB). Până în prezent nu s-a raportat detectarea simultană a mai multor molecule implicate în mai multe căi de semnalizare, in glioblastoame. Sunt necesare studii ulterioare pentru a evalua dacă această reglare este trasncripţională sau post-transcripţională. Efectele inhibitorilor de PI3K asupra expresiei moleculelor de transducţie a semnalului s-au reflectat şi în proliferarea celulară şi sunt conforme cu descoperiri similare, privitoare la rolul PI3K ca ţintă terapeutică, după cum arată Boller et al [310]. Acest grup a demonstrat că inhibitori farmacologici

23

specifici sau interferenţe ARN au împiedicat proliferarea celulară în mai multe tipuri de tumori, inclusiv glioblastom. Eficienţa maximă a inhibitorului PI3K înregistrată de mine în răspunsurile celulare este în conformitate cu alte studii, care demonstrează relevanţa majoră a semnalizării PI3K în glioblastom şi faptul că inhibitorii PI3K pot completa, consolida sau depăşi succesul limitat al utilizării inhibitorilor de EGFR în studii clinice [311]. Una dintre moleculele afectate de inhibitori, P70S6K, poate fi activată de bucle care provin din căile ERK şi PI3K. Acest aspect oferă o ruta de „scăpare” care poate scădea eficienţa atunci când este ţintită o singura cale şi susţine anumite sugestii privitor la folosirea simultană a inhibitorilor de PI3K şi de MAP-kinază [312]. În studiul de faţă, scăderea expresiei P70S6K a fost observată în cazul B atât cu inhibitori PI3K, cât şi MEK-1, în conformitate cu profilul proliferării, revelat de testele de monitorizare în timp real. O interferenţă similară între căile de semnalizare a fost evidenţiată pentru căile PI3K şi MEK/ERK de către Sunayama et al [312].

Tiparele diferite de reactivitate la inhibitori din experimentele mele indică diferenţe între pacienţii cu tumori de grade histologice similare.Sensibilitatea diferită la inhibarea creşterii de către inhibitorii MEK farmacologici a fost demonstrată şi de către See et al pe mai multe linii celulare de glioblastom [313].

Modificarea expresiei proteinei în cazul câtorva molecule de transducţie sub inhibiţia unei căi (în cazul nostru, PI3K) este în conformitate cu demonstraţia anterioara făcută de către Han et al, şi anume: inhibiţia PI3K afectează transcripţia mediată de β-catenină [314]. Mai mult, există precedente în domeniul semnalizării prin receptori de citokinelor unde, spre exemplu, s-a demonstrat că activarea MAP-kinazei ERK de către IL-2 via lanţul IL-2R β şi γ este scăzută de către inhibitorii PI3K. Rief at al au demonstrat că există o legătură crucială între receptorul IL-2, proto-oncogena PKB şi P70S6K [315].

Scăderea nivelului de expresie pentru moleculele cheie implicate în transducţia semnalului generează o posibila desensibilizare a celulelor la semnale extracelulare, dar şi la unele molecule oncogenice endogene. Moleculele modificate afectează semnalizarea la citokine, factori de creştere şi angiogenici şi aparţine (în cele mai multe cazuri, simultan) mai multor ontologii genice (anti-apoptoză, ciclu celular, transcripţie, reglarea transcripţiei, angiogeneză, adeziune celulară, creştere şi diferenţiere celulară) [316]. Mai mult, Cox et al au investigat expresia genică pentru proteine distribuite în diferite căi de transducţie. Inhibarea unei singure molecule (SOX-2) a revelat o modificare semnificativă (creştere sau scădere de mai mult de două ori) a expresiei unui număr mare de gene, raportând un total de 620 de transcripte cu expresia modificată [317].

Utilizând diferiţi inhibitori pentru a întrerupe semnalizarea tirozin kinazică, am obţinut ca rezultat schimbări ale ratelor de proliferare a celulelor de glioblastom în cultură, conform studiilor xCELLigence. Analizele in vitro indică faptul că pacientul B ar avea cel mai mult de beneficiat de pe urma terapiei cu inhibitori de PI3K. Diferenţele de răspuns dintre cazuri (după cum s-a demonstrat atât de către analiza proteomică, cât şi de analizele funcţionale) constituie un argument pentru medicina personalizată, în sensul extinderii testării genetice la analize funcţionale şi de semnalizare. Diferenţa de sensibilitate dintre diferite culturi prelevate de la pacienţi nu este surprinzătoare, din moment ce pentru mai multe linii celulare de glioblastom au fost demonstrate diferenţe de profiluri de expresie ale mai multor gene [318].

Foarte important, efectele exercitate de diferiţi inhibitori tirozin-kinazici pe expresia proteică a moleculelor de transducţie se corelează major cu comportamentul celular (adeziune sau proliferare), conform măsurătorilor din cadrul experimentelor în timp real. Aşadar, cei mai puternici inhibitori (stabiliţi prin experimentele de expresie proteică) s-au dovedit a fi şi cele mai eficiente instrumente în inhibarea creşterii celulare.

Tiparul celular al moleculelor de semnalizare în condiţii bazale de cultură (fără stimulare) este în corelaţie cu profilul obţinut în mostrele de ţesut prelevate iniţial de la pacienţi. În opinia mea, aceasta poate reprezenta un instrument valoros pentru evaluarea translatabilităţii in vitro-in vivo. Un pas ulterior în reducerea acestei distanţe ar fi o mai bună reproducere a unor caracteristici ale micro-mediului in vivo, cum ar fi presiunea parţială a oxigenului, întrucât hipoxia şi membrii din familia factorilor inductori ai hipoxiei sunt descrişi printre actorii majori în glioblastom, dar şi în alte tipuri de tumori [319-321].

Analiza serurilor de la pacienţii cu glioblastom a evidenţiat creşteri ale fracţiunilor solubile de EGFR, VEGFR2, comparativ cu serurile de la subiecţi normali, cu o diferenţă semnificativă în cazul

24

EGFR. În cazul expresiei IL-2Rα, valorile au fost scăzute la pacienţii cu glioblastom faţă de control, dar fără semnificaţie statistică.

Supernatanţii din culturile celulare obţinute din glioblastoame au demonstrat de asemenea valori modificate ale nivelurilor receptorilor solubili pentru EGF şi VEGF, cu tendinţă similară cu nivelurile serice. Supernatantul liniei standard de glioblastom U87 a prezentat valori crescute ale acestor receptori solubili, comparativ cu o cultură primară îmbogăţită în astrocite, obţinută din creier uman normal. În cazul IL-2Rα solubil, rezultatele pe supernatanţi au fost neconcludente.

Imunofluorescenţa indirectă a confirmat supraexprimarea VEGFR2, respectiv EGFR şi pentru receptorii ancoraţi în membrana celulară, aceştia prezentând intensitate crescută a fluorescenţei şi dispoziţie în pattern difuz.

Fracţiunile solubile ale EGFR, respectiv VEGFR2 sunt promiţătoare pentru utilizarea ca markeri serici în glioblastoame, având marele avantaj al neinvazivităţii ţestului. Rezultatele obţinute s-au corelat cu cele obţinute pe culturi celulare (care nu pot fi utilizate în practica medicală ca test de screening).

Întrucât semnalizarea Notch, în special Dll-4, este implicată în angiogeneza tumorală, este probabil ca această cale de semnalizare să fie implicată în rezistența anti-VEGF. Deși inițial răspund la bevacizumab, celulele de glioblastom U87 care exprimă Dll-4 continuă să crească cu aceeași rată ca și celulele tumorale tratate folosite drept control după terminarea tratamentului[322]. Blocarea semnalizării Notch prin folosirea unei forme solubile de Dll-4 reduce masa tumorală și crește supraviețuirea în cazul pacienților cu tumori ce exprimă Dll-4. Dll-4 solubil inhibă atât creșterea tumorilor bevacizumab-sensibile, cât și a celor bevacizumab-insensibile, indicând că țintirea căii Notch împreună cu VEGF ar putea duce la îmbunătățirea rezultatelor tratamentului.

Antagonizarea factorului de creştere epidermală (EGF) și a factorului bazic de creștere a fibroblastelor (bFGF) urmărește mai mult să modifice relația cu nișa celulelor stem tumorale[112,323].

Evaluarea moleculelor cheie de semnalizare prin metoda rapidă şi eficientă de screening reprezentată de tehnologia xMAP se poate dovedi folositoare pentru diagnosticul tumorilor intracraniene şi pentru descoperirea unor noi posibile ţinte terapeutice, precum şi pentru monitorizarea terapiei. Mai mult, identificarea profilului molecular, via tehnologii de înaltă performanţă, cum ar fi proteomica, genomica şi metabolomica permite, în prezent, descoperirea unor diferenţe unice în cadrul unei tumori individuale sau între tumori de acelaşi grad histologic [324].

Capitolul VI - Concluzii

CONCLUZII varianta 2

• Prezenţa celulelor stem sau progenitoare în culturile celulare derivate din cazurile de glioblastom a fost demonstrată prin imunofluorescenţă indirectă şi citometrie în flux, investigând expresia Nestinei, a receptorilor Notch (1-4) şi c-Kit (stem cell factor receptor), precum şi EGFR; rezultatele sunt comparabile cu linia standardizată de celule tumorale cu fenotip de glioblastom - U87.

• Ţintirea unor căi de semnalizare prin inhibitori farmacologici poate constitui viitoare terapie

cu eficienţă crescută în glioblastom, în terapie unică sau în combinaţii, în funcţie de caracteristicile moleculare individuale ale fiecărei tumori.

o Tratamentul cu inhibitor de PI3K al culturilor celulare de glioblastom derivate de la pacienţi a dus la o descreştere semnificativă a nivelului expresiei mai multor molecule de semnalizare implicate în supravieţuirea celulară (p38), proliferare (ERK 1/2, IκBα, p38

25

MAP, CREB), diferenţiere (ERK 1/2, CREB), migrare (ERK 1/2, CREB) şi apoptoză (ERK 1/2, P70S6K, IκBα, JNK, CREB). Până în prezent nu s-a raportat detectarea simultană a mai multor molecule implicate în variate căi de semnalizare, în glioblastoame.

o Eficienţa inhibiţiei PI3K este subliniată de modificarea comportamentului celular, concretizată în scăderea aderării şi proliferării, aşa cum reiese din experimentele în timp real – xCELLigence.

o Din panelul de inhibitori utilizaţi, inhibiţia PI3K s-a dovedit cea mai eficientă, atât în influenţarea patternului moleculelor de semnalizare, cât şi in inhibarea proliferării celulelor tumorale din cultură, sugerând această cale ca primă ţintă în terapia glioblastoamelor.

o Inhibitorul MEK-1 este următorul ca eficienţă în scăderea proliferării celulelor tumorale, rezultat ce confirmă eficacitatea sa în scăderea expresiei moleculelor de semnalizare investigate şi sugerează utilizarea sa ca strategie terapeutică în combinaţie cu inhibiţia PI3K.

• Fracţiunile solubile ale EGFR, respectiv VEGFR2 sunt promiţătoare pentru utilizarea ca markeri

serici în glioblastoame, având marele avantaj al neinvazivităţii ţesutului. o Culturile celulare obţinute în acest studiu, precum şi linia standardizată de glioblastom

U87 prezintă supraexprimarea variantei de receptori ancoraţi în membrana celulară în cazul EGFR, respectiv VEGFR2.

o Supernatanţii din culturile celulare obţinute din glioblastoame au demonstrat, ca şi supernatantul liniei standard de glioblastom U87, valori crescute ale nivelurilor receptorilor solubili pentru EGF şi VEGF, comparativ cu o cultură primară îmbogăţită în astrocite, obţinută din creier uman normal. Rezultatele sunt în acord cu tendinţa înregistrată de nivelurile serice.

o Au fost înregistrate de asemenea şi la nivel seric creşteri importante ale fracţiunilor solubile de EGFR, VEGFR2, la pacienţii cu glioblastom comparativ cu subiecţi normali, cu o diferenţă semnificativă în cazul EGFR.

• În serul pacienţilor cu glioblastom au fost detectate (prin tehnica xMAP) expresii crescute ale

unor factori de creştere şi citokine ce se corelează cu gradul tumoral, markerii de proliferare şi agresivitatea clinică în glioame: VEGF, FGF2, IL-8, IL-2, IL-6, IL-1β, IL-10, TNFα şi GM-CSF.

• Investigarea panelului de molecule de semnalizare ales pe probe tisulare de glioblastom

(perechi de ţesut tumoral, respectiv peritumoral), în paralel cu culturile menţionate, a condus la rezultate comparabile, ceea ce confirmă validitatea utilizării culturilor celulare derivate din piesele tumorale ca model experimental pentru studiul molecular şi funcţional al tumorilor respective, putând oferi strategii terapeutice individualizate, atât pentru abordarea tumorilor primare, cât şi a recidivelor.

Perspective: Este necesară extinderea cercetărilor pentru includerea acestor noi markeri în practica

medicală curentă, precum şi pentru obţinerea de noi terapii, inclusiv prin inhibiţia, singulară sau combinată, a unor receptori precum EGFR, VEGFR2, NOTCH, c-Kit sau a unor molecule implicate în transducţia semnalului, precum PI3K.

26

BIBLIOGRAFIE: