Rezumat TD solanina

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE,,GR. T. POPA” IA I

FACULTATEA DE FARMACIE

CERCETAREA FITOCHIMIC IFARMACOTOXICOLOGIC A UNORPLANTE DIN FAMILIA SOLANACEAE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conduc tor tiin ificPROF. DR. MIHAI IOAN LAZ R

DoctorandFarm. primar CLAUDIA BUTNARU

(C LINESCU)

IA I2011

Rezumatul tezei de doctorat

2

Conform deciziei rectorului Universit ii de Medicin iFarmacie „Gr. T. Popa” Ia i nr. 26115 din 24.12.2010, s-a stabilitcomisia de doctorat:

Prof. univ. dr. Antonia Poiat , U.M.F. „Gr. T. Popa” Ia iProf. univ. dr. Daniela Lucia Muntean, U.M.F. Târgu MureProf. univ. dr. Monica Bârc , U.M.F. „Carol Davila” Bucure ti

Sus inerea public a tezei de doctorat va avea loc în data de 14aprilie 2011 ora 11.00 în Sala Societ ii de Medici i Naturali ti Ia i


3

CUPRINS

Introducere CAPITOLUL 1CONSIDERA II GENERALE PRIVIND PLANTELE TOXICE DIN FAMILIASOLANACEAE 1

1.1. Descrierea familiei Solanaceae 11.2. Plante toxice din familia Solanaceae ce con in alcaloizi tropanici 21.2.1. Atropa belladonna L. 21.2.1.1. Descriere. R spândire 21.2.1.2. Principiile active toxice 31.2.1.3. Propriet i fizico-chimice 31.2.1.4. Cazuri de intoxica ii 41.2.1.5. Simptomatologie. Tratament 51.2.2. Datura innoxia Mill. 61.2.2.1. Descriere. R spândire 61.2.2.2. Principiile active toxice. Structura chimic 61.2.2.3. Propriet i fizico-chimice 71.2.2.4. Cazuri de intoxica ii 71.2.2.5. Simptomatologie. Tratament 71.2.3. Datura stramonium L. 81.2.3.1. Descriere. R spândire 81.2.3.2. Principiile active toxice 81.2.3.3. Cazuri de intoxica ii 91.2.3.4. Simptomatologie. Tratament 101.2.4. Hyoscyamus niger L. 101.2.4.1. Descriere. R spândire 101.2.4.2. Principii active toxice 111.2.4.3. Cazuri de intoxica ii 111.2.4.4. Simptomatologie. Tratament 121.2.5. Scopolia carniolica JACQ. 121.2.5.1. Descriere. R spândire 121.2.5.2. Principiile active toxice 131.2.5.3. Simptomatologie. Tratament 131.3. Plante toxice din familia Solanaceae ce con in alcaloizi piridinici 131.3.1. Plante din genul Nicotiana 131.3.1.1. Nicotiana tabacum L. 131.3.1.2. Nicotiana rustica L. 141.3.2. Principiile active toxice. Propriet i fizico-chimice 141.3.3. Simptomatologie. Tratament 161.4. Plante toxice din familia Solanaceae ce con in glicoalcaloizi 171.4.1. Solanum nigrum L. 171.4.1.1. Descriere. R spândire 171.4.1.2. Principii active toxice. Structur . Propriet i fizico-chimice 171.4.1.3. Simptomatologie. Tratament 181.4.2. Solanum dulcamara L. 191.4.2.1. Descriere. spândire 191.4.2.2. Principiile active toxice. propriet i fizico-chimice 191.4.2.3. Simptomatologie. Tratament 211.4.3. Physalis alkekengi L. 221.4.3.1. Descriere. R spândire 221.4.3.2. Principiile active toxice 23


4

1.4.3.3. Particularit i farmacodinamice 241.4.3.4. Utiliz ri în medicina popular 251.4.3.5. Simptomatologie. Tratament 251.5. Concluzii 25

CAPITOLUL 2METODE DE DETERMINARE A TOXICIT II 282.1. Aspecte generale ale evalu rii toxicit ii 282.1.1. Toxic. Toxicitate. Efect toxic 282.1.2. Intoxica ia. Defini ie. Clasificare 282.1.3. Doze toxice i letale 292.1.4. R spunsuri gradate. R spunsuri cuantale 292.1.5. Poten ial de toxicitate. Factor de cronicitate. Risc 312.2. Metode in vivo de determinare a toxicit ii 342.3. Determinarea toxicit ii acute 362.3.1. Metoda cu doz fix (Fixed-Dose Procedure) 362.3.2. Metoda „Acute Toxic Class Method” 432.3.3. Metoda „Up and Down“ 442.3.4. Limitarea metodelor care înlocuiesc testul clasic DL50 442.4. Concluzii 45

CAPITOLUL 3METODE DE EXTRAC IE I ANALIZ A PRINCIPIILOR ACTIVE DIN PLANTELEAPAR INÂND FAMILIEI SOLANACEAE 463.1. Metode de extrac ie 463.2. Metode cromatografice 463.2.1. Cromatografia pe strat sub ire 483.2.2. Metode HPLC 513.2.3. Metode gaz-cromatografice 583.3. Metode spectrale 593.3.1. Metode spectrometrice în UV-VIS 593.4. Metode LC-MS 603.5. Metode electrochimice 623.5.1. Metode electroforetice 623.5.2. Metode voltametrice 67

CAPITOLUL 4STRUCTURA ANATOMIC A ORGANELOR VEGETATIVE A PLANTELORPHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUM DULCAMARA L. 714.1. Materiale i metod 714.1.1. Recoltare 714.1.2. Condi ionare 714.1.3. Realizarea preparatelor microscopice 714.1.4. Examinarea microscopic i microfotografierea preparatelor 714.2. Rezultate i Discu ii 714.2.1. Physalis alkekengi L. 714.2.1.1. R cina 714.2.1.2. Tulpina 724.2.1.3. Frunza 734.2.2. Solanum dulcamara L. 744.2.2.1. R cina 744.2.2.2. Tulpina 754.2.2.3. Frunza 764.3. Concluzii 77


5

CAPITOLUL 5DETERMINAREA COMPU ILOR POLIFENOLICIDIN PHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUM DULCAMARA L. 795.1. Introducere. Obiective 795.2. Analiza polifenolilor i flavonoidelor prin metode spectrofotometrice 795.2.1. Material i metode 795.2.1.1. Prelucrarea probelor vegetale 805.2.1.2. Determinarea cantitativ a polifenolilor totali, exprima i în acid cafeic 805.2.1.3. Determinarea cantitativ a flavonoidelor, exprimate în rutozid i cvercetol 815.2.2. Rezultate i discu ii 825.2.2.1. Con inutul de polifenoli totali, exprima i în acid cafeic, în plantele analizate 825.2.2.2. Con inutul de flavonoide, exprimate în rutozid i cvercetol, în plantele analizate 845.3. Analiza polifenolilor i flavonoidelor prin HPLC/MS 865.3.1. Materiale i metode 865.3.1.1. Metoda de analiz a compu ilor polifenolici prin HPLC/MS 865.3.1.2. Standarde 865.3.1.3. Analiza polifenolilor prin detec ie UV 885.3.1.4. Analiza polifenolilor prin detec ie MS 895.3.1.5. Prelucrarea probelor vegetale 975.3.2. Rezultate i discu ii 975.4. Concluzii 125

CAPITOLUL 6EVALUAREA FITOSTEROLILOR DINPHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUM DULCAMARA L. PRIN HPLC 1266.1. Material i metode 1266.1.1. Prelucrarea probelor vegetale 1276.1.2. Metoda de analiz HPLC/MS. Validarea metodei 1276.2. Rezultate i discu ii 1286.2.1. Metoda MS 1286.2.2. Con inutul de fitosteroli în plantele analizate 1376.2.2.1. Con inutul de steroli liberi în plantele analizate 1376.2.2.2. Con inutul de steroli totali în plantele analizate 1396.3. Concluzii 143

CAPITOLUL 7DETERMINAREA SCOPOLETINEI DIN PHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUMDULCAMARA L. 144

7.1. Structur i propriet i fizico-chimice. Ac iuni farmacologice 1447.2. Analiza scopoletinei prin CSS 1457.2.1. Material i metod . Prelucrarea probelor vegetale 145Extrac ie cu metanol 70% (v/v) prin refluxare 146Condi ii de lucru pentru CSS 1467.2.2. Rezultate i discu ii 1467.2.3. Concluziile analizei CSS 1477. 3. Analiza scopoletinei prin HPLC/MS 1487.3.1. Material i metod 1487.3.2. Rezultate i discu ii 1507.3.2.1. Metoda HPLC/MS 1507.3.2.2. Con inutul de scopoletin în plantele analizate 1527. 4. Concluzii 156


6

CAPITOLUL 8DETERMINAREA SOLANINEI DIN PHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUMDULCAMARA L. 1578.1. Introducere 1578.1.1. Structur i propriet i fizico-chimice. Istoric 1578.1.2. Toxicitatea solaninei 1588.1.3. Noi utiliz ri ale solaninei 1598.1.4. Obiective 1598.2. Analiza solaninei prin cromatografie pe strat sub ire 1598.2.1. Material i metod 1598.2.2. Analiza solaninei din Physalis alkekengi L. prin cromatografie pe strat sub ire 160I. Extrac ia la cald prin refluxare cu alcool amilic 160II. Extrac ia la rece cu alcool amilic (extrac ia solid/lichid prin macerare) 160Condi iile de lucru pentru cromatografia pe strat sub ire 161A. Metoda cu reactiv iod 161B. Metoda cu reactiv Marquis 1618.2.3. Analiza solaninei din Solanum dulcamara L. prin cromatografie pe strat sub ire 162Extrac ia solaninei 163I. Extrac ia la cald în aparatul Soxhlet cu alcool amilic 163II. Extrac ia la cald prin refluxare cu alcool amilic 163III. Extrac ia la rece cu alcool amilic (extrac ia solid/lichid prin macerare) 163Condi iile de lucru pentru cromatografia pe strat sub ire 163A. Metoda cu reactiv iod 163B. Metoda cu reactiv Marquis 1648.2.4. Analiza solaninei din Solanum dulcamara L. i Physalis alkekengi L. prin CSS 165Extrac ia lichid/lichid cu alcool amilic 166Condi iile de lucru pentru cromatografia pe strat sub ire 1668.2.5. Concluziile analizei solaninei prin CSS 1678.3. Analiza solaninei prin HPLC/MS 1678.3.1. Material i metod 1678.3.1.1. Prelucrarea probelor vegetale 1688.3.1.2. Metoda de analiz HPLC/MS 1688.3.2. Rezultate i discu ii 1698.3.2.1. Analiza MS 1698.3.2.2. Con inutul de solanin în plantele analizate 1728.3.2.3. Concluziile analizei solaninei prin HPLC/MS 1758.4. Concluzii 175

CAPITOLUL 9ANALIZA ALCALOIZILOR TROPANICI DIN PHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUMDULCAMARA L. 1769.1. Introducere. Obiective 1769.1.1. Structura i propriet i fizico-chimice ale atropinei. Ac iuni farmacologice 1769.1.2. Structura i propriet i fizico-chimice ale scopolaminei. Ac iuni farmacologice 1779.2. Materiale i Metod 1789.2.1. Metoda HPLC 1789.2.2. Prelucrarea probelor vegetale 1789.3. Rezultate i discu ii 1799.3.1. Analiza atropinei 1799.3.2. Analiza scopolaminei 1819.3.3. Determinarea atropinei i scopolatinei în plantele cercetate 1839.4. Concluzii 186


7

CAPITOLUL 10EVALUAREA ACTIVIT II ANTIMICROBIENE A EXTRACTELOR OB INUTE DINPHYSALIS ALKEKENGI L. 187

10.1. Introducere. Obiective 18710.2. Material i metode 18710.2.1. Materialul vegetal i prelucrarea probelor 18810.2.2. Microorganisme test 18910.2.3. Testarea activit ii antimicrobiene 18910.3. Evaluarea poten ialului antimicrobian a extractelor de Physalis alkekengi L. 19010.3.1. Rezultate 19110.3.2. Discu ia rezultatelor 19610.4. Concluzii 199

CAPITOLUL 11EVALUAREA TOXICIT II ACUTE I A AC IUNII ANALGEZICE-ANTIINFLAMATOARE A EXTRACTELOR ALCOOLICEDIN PHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUM DULCAMARA L. 20011.1. Obiective 20011.2. Material i metod 20011.2.1. Substan e medicamentoase 200Ibuprofen 20011.2.2. Substan e auxiliare 200Carboximetilceluloza sodic CMC-Na 200Zymosan A 200Carrageenan lambda 20011.2.3. Animale de laborator 20111.2.4. Metode experimentale 20111.3. Aparatura i instrumentar utilizate pentru determin rile experimentale 20211.3.1. Testul r spunsului constrictiv abdominal 20211.4. Metode de interpretare a datelor experimentale 20411.5. Rezultate i discu ii 20611.5.1 Evaluarea toxicit ii acute a extractelor alcoolice de Physalis alkekengi L. i Solanumdulcamara L. 20611.5.2. Testul r spunsului constrictiv abdominal indus prin zymosan 20811.5.3. Testul Randall-Selitto 21011.7. Concluzii 214

CONCLUZII GENERALE 215

BIBLIOGRAFIE 219ANEXE


8


9

În teza de doctorat sunt prezentate rezultatele cercet riifitochimice i farmacotoxicologice a dou specii din familiaSolanaceae: Physalis alkekengi L. i Solanum dulcamara L., speciispontane din flora rii noastre. Lucrarea este structurat în dou

i: „Stadiul cunoa terii” (trei capitole) i „Contribu iipersonale” care cuprinde 8 capitole. Partea „Stadiul cunoa terii”include informa ii din materialul bibliografic referitoare la subiectultezei de doctorat.

STADIUL CUNOA TERII

Capitolul 1. Considera ii generale privind plantele toxice din familiaSolanaceae

1.1. Descrierea familiei Solanaceae1.2. Plante toxice din familia Solanaceae ce con in alcaloizi tropanici1.3. Plante toxice din familia Solanaceae ce con in alcaloizi piridinici1.4. Plante toxice din familia Solanaceae ce con in glicoalcaloizi1.5. Concluzii

Capitolul 2. Metode de determinare a toxicit ii2.1. Aspecte generale ale evalu rii toxicit ii2.2. Metode in vivo de determinare a toxicit ii2.3. Determinarea toxicit ii acute2.4. Concluzii

Capitolul 3. Metode de extrac ie i analiz a principiilor active din planteleapar inând familiei Solanaceae

3.1. Metode de extrac ie3.2. Metode cromatografice3.3. Metode spectrale3.4. Metode LC-MS3.5. Metode electrochimice


10

CONTRIBU II PERSONALE

CAPITOLUL 4. STRUCTURA ANATOMIC A ORGANELORVEGETATIVE A PLANTELOR PHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUM

DULCAMARA L.

În acest capitol am caracterizat din punct de vedere anatomic planteleluate în studiu. Materialul vegetal proasp t a fost p strat în alcool de 70%.Pentru ob inerea sec iunilor transversale prin organele vegetative s-auutilizat briciul anatomic i microtomul manual, conform tehnicilor uzuale.Sec iunile ob inute au fost clarificate cu ap de Javel i colorate prin dublacolorare cu verde de iod i carmin alaunat. Preparatele microscopice astfelcolorate au fost fixate pe lam folosind masa glicero-gelatinoas .Observarea s-a realizat la microscopul Nikon de tip Eclipse E 400, iarmicrofotografierea s-a realizat folosind un aparat de fotografiat digital SLRNikon D70.

4.2.1. Physalis alkekengi L.

cina cu structur tipic secundar , în care se mai observtotu i amprenta structurii diarhe a cilindrului central, din etapa destructur primar :

• saci cu nisip oxalic în m duv i scoar a secundar ;• primul strat extern al sec iunii este format din exoderm cu

celule suberificate (2 straturi);• primele straturi ale mezodermei sunt u or colenchimatizate;• endoderma vizibil are punctua iile caspariene;• periciclu unsitratificat vizibil;• zonele de liber secundar extern i intern sunt flancate de

grupuri de fibre liberiene pu in lignificate.


11

Fig. 4.2.

Tulpina cu structur secundar are contur circular costat (3-4coaste):

• în dreptul coastelor se disting masive colenchimatice, iar încilindrul central fascicule bicolaterale;

• prezen a de fibre periciclice;• epiderma are resturi de peri tectori pluricelulari rup i;• centrul sec iunii este ocupat de m duv ;• insule de esut lemnos intern, în cilindrul central.

Fig. 4.3. Fig. 4.4.


12

Frunza este prev zut cu proeminen e la nivelul nervurii mediane,la ambele fe e, dar mult mai accentuat la fa a intern :

• structura bifacial cu simetrie dorso-ventral i mezofil heterogen-asimetric;

• în nervura median se distinge un fascicul conduc tor bicolateralmare i saci cu nisip oxalic în parenchim;

• peri tectori epidermici, pluricelulari cu 4-5 celule i vârf ascu it,frecvent drep i i mai rar îndoi i;

• epiderma v zut din fa are celule cu pere ii pu in încre i.

Fig. 4.5. Fig. 4. 6.

4.2.2. Solanum dulcamara L.

cina cu structur secundar prezint numero i saci cu nisipoxalic situa i în special la nivelul zonei de liber secundar:

• în centrul sec iunii transversale prin r cina se constat înlocuireaduvei cu vase lemnoase;


13

• la exteriorul sec iunii prin r cin se observ un periderm cusuber care prezint lenticele i feloderm colenchimatizat (colenchimtabular);

• atât în scoar a secundar cât i în m duv se observ amidonabundent în parenchim, cu gr uncioare foarte mici;

• la nivelul masivului lemnos (lemn secundar) se disting 2 ineleanuale de cre tere.

Fig. 4.10. Fig. 4.11.

Tulpina cu structur secundar are un contur circular costat(5 coaste):

• fascicule conduc toare bicolaterale mai mari în dreptul coastelor;• în centrul sec iunii este prezent o lacun medular ;• epiderm cutinizat i prev zut cu peri scur i, conici, unicelulari;• în scoar , zona colenchimatic foarte evident ;• liberul intern discontinuu sub form de insule liberiene.

Fig. 4.12. Fig. 4.13.


14

Frunza cu structur bifacial i simetrie dorso-ventral , mezofilheterogen asimetric:

• proeminen e ale nervurii mediane la ambele fe e, dar mult maiaccentuat la fa a inferioar ;

• mai multe tipuri de peri epidermici: peri tectori bicelulari conici,veruco i, rari peri glandulari capita i, cu picior unicelular i glandapluricelular , rari peri tectori pluricelulari, veruco i, recurba i (cârlig) saudrep i;

• saci cu nisip oxalic situa i în special în liberul de la parteainferioar a fasciculului bicolateral din nervura median ;

• în mezofilul foliar sunt prezente druze, pe lâng nervuri, iarepiderma v zut din fa are celule cu pere i sinuo i;

• în nervura median este prezent un fascicul conduc tori bicolateralmare cu lemn dispus în iruri radiare, foarte vizibil.

Fig. 4.15 Fig. 4.17.


15

CAPITOLUL 5. DETERMINAREA COMPU ILOR POLIFENOLICIDIN PHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUM DULCAMARA L.

5.1. INTRODUCERE. OBIECTIVE

Obiective:• determinarea polifenolilor totali exprima i prin acid cafeic

prin spectrofotometrie UV/VIS;• determinarea flavonoidelor, exprimate în rutozid i cvercetol

prin spectrofotometrie UV/VIS;• identificarea i dozarea compu ilor polifenolici prin

HPLC/MS.

5.2. ANALIZA POLIFENOLILOR I FLAVONOIDELORPRIN METODE SPECTROFOTOMETRICE

5.2.1. Material i metode

5.2.1.1. Prelucrarea probelor vegetaleMaterialul vegetal constituit din frunze de Solanum dulcamara L. i

Physalis alkekengi L. a fost recoltat din lotul experimental din Gr dinaBotanic „Anastasie F tu” Ia i, doi ani consecutiv (2005, 2006). Pentruextrac ie s-a utilizat metanol absolut i metanol 70 % (v/v).

5.2.1.2. Determinarea cantitativ a polifenolilor totali,exprima i în acid cafeic

Principiul metodei se bazeaz pe formarea unui compus albastruîntre acidul fosfowolframic i polifenoli (în mediul alcalin). Concentra ia înpolifenoli totali a probelor de analizat s-a calculat cu ajutorul curbei etalon,realizate în acelea i condi ii ca solu iile prob . Pentru scara etalon s-a luatîn lucru o solu ie etalon de acid cafeic 0,025 g/L (figura 5.2).


16

y = 0,2127x + 0,0172R2 = 0,9757

00,05

0,10,15

0,20,25

0,30,35

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

concentra ia (micrograme acid cafeic/mL)

abso

rban

a

Fig. 5.2. Curba etalon pentru determinarea cantitativ a polifenolilor,exprima i în acid cafeic

5.2.1.3. Determinarea cantitativ a flavonoidelor,exprimate în rutozid i cvercetol

Principiul metodei se bazeaz pe formarea unui compus coloratgalben-portocaliu prin reac ia dintre flavonoide i clorura dealuminiu. S-au realizat dou sc ri etalon: una cu solu ie etalon derutozid 0,1 g/L i una cu solu ie etalon de cvercetol 0,1 g/L (figurile5.3 i 5.4).

y = 0,0308x + 0,0168R2 = 0,9999

00,10,20,30,40,50,6

0 4 8 12 16 20

mg rutozida/mL

absorban a

Fig. 5.3. Curba etalon pentru dozarea flavonoidelorexprimate în rutozid


17

y = 0.0654x + 0.0198R2 = 0.99981

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

1,6 3,2 4,8 6,4

mg cvercetol/mL

Abs

orba

na

Fig. 5.4. Curba etalon pentru dozarea flavonoidelorexprimate în cvercetol

5.2.2. Rezultate i discu ii

5.2.2.1. Con inutul de polifenoli totali, exprima i în acid cafeic, în plantele analizate

Figurile 5.5. i 5.6. prezint varia ia con inutului de polifenoli totalifunc ie de anul recolt rii. Constat m c plantele recoltate în anul 2005 aufost mai bogate în polifenoli totali, iar extrac ia cea mai bun a fost cumetanol 70%.


18

403,6

439,98

466,78

414,7

370

380

390

400

410

420

430

440

450

460

470

480

Extrac ie cu metanol absolut Extrac ie cu metanol 70%(v/v)

mg%2005

2006

Fig. 5.5. Varia ia con inutului de polifenoli totali,exprima i în acid cafeic (mg%), pentru Solanum dulcamara

487,76530,09

450,99410,36

0

100

200

300

400

500

600

Extrac ie cu metanol absolut Extrac ie cu metanol 70%(v/v)

mg%

2005

2006

Fig. 5.6. Varia ia con inutului de polifenoli totali,exprima i în acid cafeic (mg%), pentru Physalis alkekengi


19

5.2.2.2. Con inutul de flavonoide, exprimate în rutozid i cvercetol,în plantele analizate

Pentru probele de Solanum dulcamara L. extrac ia cea mai bun s-arealizat cu metanol 70%, valoarea maxim înregistrându-se pentru probarecoltat în 2006: 2529,12 mg% rutozid . Observ m c probele recoltate înanul 2006 sunt mai bogate în flavonoide, atât pentru Solanum dulcamara L.cât i pentru Physalis alkekengi L. Varia ia valorilor ob inute func ie deanul recolt rii este prezentat în figura 5.7.

1936,96

2529,12

3408,463184,82

1740,721862,21

1381,61

1057,41

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Solanumdulcamara 2005

Solanumdulcamara 2006

Physalisalkekengi 2005

Physalisalkekengi 2006

mg%Rutozid Cvercetol

Fig. 5.7. Varia ia valorilor flavonoidelor, exprimate în rutozid icvercetol (mg%), func ie de anul recolt ri i specie

5.3. ANALIZA POLIFENOLILOR I FLAVONOIDELORPRIN HPLC/MS

5.3.1. Materiale i metode

5.3.1.1. Metoda de analiz a compu ilor polifenolici prin HPLC/MSPentru analiza compu ilor polifenolici din extracte vegetale s-a

folosit cromatografia de lichide de înalt performan cuplat cuspectrometria de mas (LC/MS). Metoda de analiz utilizat se


20

bazeaz pe o metoda HPLC publicat în literatura de specialitate lacare s-au adus unele modific ri.

Principala modificare adus metodei ini iale este schimbareafazei mobile (s-a înlocuit fosfatul de potasiu cu acid acetic); astfelîncât de la o faz mobil cu componente nevolatile s-a ajuns la unavolatil . Principalul beneficiu al acestei modific ri este faptul celuentul din coloana cromatografic poate fi introdus înspectrometrul de mas (care necesit doar componen i volatili în fazamobil ). În acest mod se pot ob ine informa ii suplimentarereferitoare la compu ii polifenolici con inu i în prob , deoarecespectrometrul înregistreaz masele moleculare i spectrele de masale compu ilor detecta i.

Metoda se poate aplica pentru analiza calitativ (18 compu i)dar i cantitativ (14 compu i).

5.3.1.2. StandardeAu fost utilizate 18 standarde de compu i polifenolici. Acestea

au fost: acid caftaric, acid gentisic, acid cafeic, acid clorogenic, acidparacumaric, acid ferulic, acid sinapic, hiperozid, isoquercitrin,rutozid, miricetol, fisetina, quercitrin, cvercetol, patuletina, luteolina,kemferol i apigenina.

5.3.1.3. Analiza polifenolilor prin detec ie UVCromatograma unui amestec de standarde corespunz tor

compu ilor polifenolici men iona i anterior este prezentat în figura5.9.

Fig. 5.9. Cromatograma unui amestec de 18 polifenoli, detec ie UV la330 i 370 nm


21

5.3.1.4. Analiza polifenolilor prin detec ie MSDatorit prezen ei a cel pu in a unei grup ri fenolice în

molecul (dar i a unei grup ri carboxil, în cazul acizilorpolifenolici), to i compu ii pot pierde un proton acid transformându-se în ioni negativi de tipul [M-H] i pot fi analiza i prin ionizarenegativ . Ulterior, spectrometrul izoleaz ionii de interes (pentrueliminarea interferen elor) i apoi îi fragmenteaz , înregistrândtotodat i spectrul MS.

În cazul probelor de extracte vegetale, compu ii se potidentifica analizând spectrele MS. Ini ial se verific masa moleculara ionului [M-H], iar dac aceasta corespunde se compar spectrul demas (MS) al compusului necunoscut cu spectrul de mas alstandardelor. În cazul în care ionii din spectrul de mas sunt aceia ise poate considera identificat compusul respectiv.

Au fost înregistrate spectrele de mas ale celor 18 polifenoliutiliza i ca standarde în metoda analitic .

5.3.1.5. Prelucrarea probelor vegetaleProbele de produse vegetale au fost recoltate din diferite loca ii

din jurul municipiului Ia i (tabelul 5.7.).

Tabelul 5.7. Probele vegetale i nota iile solu iilor extractive pentruanaliza polifenolilor prin HPLC

Nota ieprob

Nota ieprob Specie Loca ie recoltare Perioada de

recoltareR 1 T1 Physalis alkekengi Aroneanu August 2009R 2 T2 Physalis alkekengi Bârnova Septembrie 2009R 3 T3 Physalis alkekengi Breazu Septembrie 2009R 4 T4 Physalis alkekengi Bucium Septembrie 2009R 5 T5 Physalis alkekengi Gr dina botanic Iulie 2008R 6 T6 Physalis alkekengi Gr dina botanic Iulie 2007R 7 T7 Solanum dulcamara Gr dina botanic Iulie 2007R 8 T8 Solanum dulcamara Gr dina botanic Iulie 2008R 9 T9 Solanum dulcamara Zona UMF August 2009R 10 T10 Solanum dulcamara Zona UMF Septembrie 2009

Am realizat extrac ie cu metanol 70% (v/v) prin refluxare (probenotate cu R) i extrac ie cu etanol 70% (v/v) - tincturi (probe notate cu T).


22


Au fost analizate în paralel dou probe din fiecare extractvegetal, una ca atare (nehidrolizat , notat cu Rn, respectiv Tn) iuna hidrolizat (notat cu Rh, respectiv Th). Motivul pentru care s-arealizat hidroliza este faptul c , în general, unii agliconi flavonici sauunii acizi polifenolcarboxilici nu se afl în stare liber , ci legat(glicozide, esteri, etc.). Deci, realizarea unei hidrolize acide va ducela eliberarea acestor compu i din forma legat i ob inem mai multeinforma ii despre compozi ia chimic – polifenoli – a planteistudiate. Din analiza datelor ob inute se desprind urm toarele idei:

1. pentru extractele ob inute prin extrac ie cu metanol 70% (v/v)ü apigenina s-a determinat numai în probele hidrolizate

de Physalis alkekengiü kemferolul i acidul p-cumaric s-au determinat numai

în probele hidrolizate atât în Physalis alkekengi, cât iîn Solanum dulcamara

ü rutozidul i quercitrinul apar numai în probelenehidrolizate atât în Physalis alkekengi, cât i înSolanum dulcamara

ü isoquercitrinul s-a determinat numai în probelenehidrolizate de Solanum dulcamara

2. pentru extractele ob inute prin extrac ie cu etanol 70% (v/v)ü kemferolul i acidul p-cumaric s-a determinat numai



ü apigenina s-a determinat atât în probele hidrolizate câti în probele nehidrolizate de Physalis alkekengi

3. prin hidrolizare se ob in cantit i mai mari de compu ipolifenolici în extractele vegetale

Având în vedere a treia idee formulat mai sus, pentru analizastatistic am considerat numai probele hidrolizate. S-a calculat


23

concentra ia de compus polifenolic exprimat în mg %. Extrac ia ceamai bun s-a realizat cu metanol 70% (v/v), când valorile au variatîntre:

• 17,131 – 62,717 mg% cvercetol;• 33,309 – 94,704 mg% luteolin ;• 0,615 – 1,411 mg% kemferol.Pentru probele de Solanum dulcamara cantit ile de cvercetol

i kemferol în probele hidrolizate au fost mai mari dup extrac ie cuetanol 70% (tincturi conform FR X). Astfel pentru cvercetolconcentra iile sunt cuprinse între: 3,312 i 128,565 mg%, iar pentrukemferol: 1,013-5,258 mg%. Func ie de perioada de recoltare, seobserv c proba de Solanum dulcamara din Gr dina Botanic Ia i,din iulie 2008, are cele mai mari valori pentru compu ii polifenolicianaliza i. Pentru probele recoltate în 2009 nu s-a eviden iat prezen aluteolinei.

Ponderea compu ilor polifenolici este reprezentat în figurile5.13. i 5.14.

8% 1% 5%2%

42%

41% 1%

Ac ferulic

Ac p-cumaric

Ac sinapic

Apigenina

Kemferol

Luteolina

Cvercetol

Fig. 5.13. Ponderea fiec rui compus polifenolic analizatîn Physalis alkekengi (extras cu etanol 70% din probe hidrolizate)


24

2% 2% 5% 5%

86%

Ac ferulicAc p-cumaricAc sinapicKemferolCvercetol

Fig. 5.14. Ponderea fiec rui compus polifenolic analizatîn Solanum dulcamara (extras cu etanol 70% din probe hidrolizate)


25

CAPITOLUL 6. EVALUAREA FITOSTEROLILOR DINPHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUM DULCAMARA L. PRIN HPLC

Analiza fitosterolilor s-a realizat prin cromatografie de lichidede înalt performan cuplat cu spectrometria de mas (HPLC/MS).Metoda de analiz utilizat se bazeaz pe o metoda HPLC publicatîn literatura de specialitate, la care s-au adus unele modific ri.

Principala modificare adus metodei ini iale este schimbareacoloanei cromatografice i a debitului fazei mobile. Ca rezultat, fade metoda publicat în literatur , timpul de analiz a sc zut de la 30minute la 5 minute f a afecta separarea i rezolu ia sterolilor.

6.2. REZULTATE I DISCU II

6.2.2. Con inutul de fitosteroli în plantele analizate

Concentra iile de steroli liberi sunt incluse în tabelul 6.7.pentru Physalis alkekengi i tabelul 6.8. pentru Solanum dulcamara.

Tabelul 6.7. Concentra iile de steroli liberi în probelede Physalis alkekengi (mg compus/ 100 g produs vegetal)

Loca ia/perioada derecoltare Ergosterol Stigmasterol Campesterol Sitosterol

Aroneanu/august 2009 0,80 9,54 13,12 12,07Bârnova/septembrie 2009 0 13,11 14,42 11,14Breazu/septembrie 2009 0 13,45 17,94 14,35Bucium/septembrie 2009 0 17,86 17,80 16,77Gr dina Botanic /iulie 2008 0 15,75 15,54 9,63Gr dina Botanic /iulie 2007 0 14,59 14,83 10,01Maxima - 17,86 17,94 16,77Minima - 9,54 13,12 9,63

Tabelul 6.8. Concentra iile de steroli liberi în probelede Solanum dulcamara (mg compus/ 100 g produs vegetal)

Loca ia/perioada derecoltare Ergosterol Stigmasterol Campesterol Sitosterol

Gr dina Botanic /iulie 2007 0 6,60 2,72 7,46Gr dina Botanic /iulie 2008 0 3,24 1,47 4,40UMF/august 2009 0 4,18 0,80 2,61UMF/septembrie 2009 0,16 8,45 2,47 12,76Maxima - 8,45 2,72 12,76

Minima - 3,24 0,80 2,61


26

Ergosterolul nu se g se te sub form liber în planteleanalizate. La determinarea sterolilor liberi, fitosterolii apar încantit i mai mari în probele de Physalis alkekengi (concentra iamaxim este de 17,94 mg campesterol/ 100 g) decât în cele deSolanum dulcamara (12,76 mg sitosterol/100g). În Physalisalkekengi predomin campesterolul, iar în Solanum dulcamarasitosterolul.

Pentru probele de Physalis alkekengi, am determinat urm toriisteroli sub form liber : stigmasterolul, valorile au variat între 9,54 i17,86 mg%, campesterolul (13,12-17,94 mg%) i sitosterolul (9,63-16,77 mg%).

Concentra ii mai mici de steroli liberi s-au determinat înprobele de Solanum dulcamara: pentru stigmasterol 3,24-8,45 mg%,pentru campesterol 0,80-272 mg% i pentru sitosterol 2,61-12,76mg%.

Concentra iile de steroli totali (dup saponificare) dinmaterialul vegetal sunt incluse în tabelul 6.11. pentru Physalisalkekengi i tabelul 6.12. pentru Solanum dulcamara.

Dup saponificare în probele analizate se p streaz acelea ipropor ii în con inutul de fitosteroli. În Physalis alkekengiconcentra ia cea mai mare o are campesterolul, iar în Solanumdulcamara - sitosterolul. Concentra iile variaz diferit func ie delocul recolt rii i perioada de recoltare.

Tabelul 6.11. Concentra iile de steroli totali în probelede Physalis alkekengi (mg compus/ 100 g produs vegetal)

Loca ia/perioada derecoltare/organ plant Ergosterol Stigmasterol Campesterol Sitosterol

Aroneanu /august 2009/frunze 1,84 15,83 32,79 17,63Bârnova/septembrie 2009/frunze 0,80 17,68 33,08 17,87Breazu/septembrie 2009/frunze 1,07 12,74 29,15 17,17Breazu/septembrie 2009/r cin 0,38 10,33 9,38 20,74Breazu/septembrie 2009/fructe 2,11 14,36 18,05 26,32Breazu/septembrie 2009/tulpini 0,77 6,56 8,67 18,99Bucium/septembrie 2009/frunze 1,88 23,48 35,11 24,43Gr dina Botanic /iulie2008/frunze 0 13,60 17,88 10,22

Gr dina Botanic /iulie2007/frunze 0 13,64 21,74 12,07

Maxima 2,11 23,48 35,11 26,32Minima - 6,56 8,67 10,22


27

Tabelul 6.12. Concentra iile de steroli totali în probelede Solanum dulcamara (mg compus/ 100 g produs vegetal)

Loca ia/perioada derecoltare/organ plant Ergosterol Stigmasterol Campesterol Sitosterol

Gr dina Botanic /iulie 2007/frunze 0 6,15 3,91 9,89Gr dina Botanic /iulie 2008/frunze 0 2,73 3,06 5,50UMF Ia i/august 2009/frunze 0 2,19 0,38 2,91UMF Ia i/septembrie 2009/frunze 0,81 8,63 2,73 14,67Maxima - 8,63 3,91 14,67Minima - 2,19 0,38 2,91

Pentru proba Physalis alkekengi/ Breazu/ septembrie 2009 s-aanalizat con inutul de steroli totali din p ile plantei: r cin ,tulpin , frunze i fructe (figura 6.11).

29,15

20,74

26,32

18,99

0,772,110,381,07

14,36

6,56

10,3312,74

18,05

8,679,38

17,17

0

5

10

15

20

25

30

35

frunze cin fructe tulpini

Ergosterol

Stigmasterol

Campesterol

Sitosterol

Fig. 6.11. Concentra iile de steroli totali în Physalis alkekengi


28

CAPITOLUL 7. DETERMINAREA SCOPOLETINEIÎN PHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUM DULCAMARA L.

7.1. STRUCTUR I PROPRIET I FIZICO-CHIMICE.AC IUNI FARMACOLOGICE. OBIECTIVE.

O OHO

H3CO

Fig. 7.1. Structura scopoletineiObiectivele acestui capitol sunt:• identificarea scopoletinei prin CSS în Physalis alkekengi i

Solanum dulcamara;• identificarea i determinarea cantitativ a scopoletinei în

extractele vegetale ale celor dou plante luate în studiu, prinHPLC/MS/MS.

7.2. ANALIZA SCOPOLETINEI PRIN CSS

7.2.1. Material i metod . Prelucrarea probelor vegetale

Am realizat extrac ii cu metanol 70% (v/v) prin refluxare,extractele s-au hidrolizat în mediul acid, apoi am f cut extrac ielichid/lichid cu cloroform.

Condi ii de lucru pentru CSSPlaca cromatografic : silicagel 60 F254 10x20 cmSistem de solven i: aceton : ap : amoniac (45 + 3,3 + 1,5)Etalon: scopoletin (Sigma) în metanol 70%, 10 µL;Probe: extract cloroformic 10 µLRevelare: UV la 365 nm, spoturi albastre în UV.


S-au ob inut dou cromatopl ci în condi iile de lucruprezentate: figura 7.2. pentru probele de Physalis alkekengi i figura7.3. pentru probele de Solanum dulcamara.


29

Fig. 7.2. Cromatoplaca pentru scopoletin Fig. 7.3. Cromatoplaca pentru scopoletin pentru probele de Physalis alkekengi pentru probele de Solanum dulcamara

Rf-ul etalonului a fost 0,40 iar pentru probe a variat între 0,38i 0,42 în condi iile de lucru prezentate.

7. 3. ANALIZA SCOPOLETINEI PRIN HPLC/MSScopul acestui subcapitol a fost analiza scopoletinei în Physalis

alkekengi i Solanum dulcamara (Solanaceae), substan ce nu a fostanalizat niciodat în aceste dou plante. Mi-am propus identificareai dozarea acestei hidroxicumarine printr-o metod optimizat ,

modern i rapid . În ara noastr scopoletina a fost studiat în altespecii din familia Solanaceae, dar metodele de analiz nu au fostpublicate în reviste de circula ie na ional i interna ional .

7.3.1. Material i metod

Condi iile de lucru HPLC: Coloana analitic : Zorbax SB-C18100 mm x 3,0 mm i.d., 3,5 µm (Agilent, SUA); filtru on-line: 0,2


30

microni (Agilent); faza mobil : amestec solu ie acid formic 0,1%(v/v) i metanol 68/32 (v/v), elu ie izocratic ; Debitul: 1 mL/minut,temperatura: 40°C. Detec ia: MS – izolare i fragmentare ion cu m/z193, corespunz tor moleculei scopoletinei protonate, apoimonitorizare ion cu m/z 133 din spectrul MS/MS al analitului.

Condi iile de lucru MS: Sursa de ioni: APCI (atmosfericpressure chemical ionisation); mod ionizare: pozitiv; nebulizator:azot, presiune 70 psi; gaz de uscare: azot, debit 7 L/minut,vaporizator 425°C, temperatura uscare: 325°C; poten ial capilar : -3500 V; mod analiz : monitorizare tranzi ii m/z 193> 133

Prelucrarea probelor vegetale

Tabelul 7.3. Probele vegetale i nota iile solu iilor extractivepentru analiza scopoletinei prin HPLC

Nota ieproba

Nota ieprob Specie Loca ie recoltare Perioada de

recoltareR 1 T1 Physalis alkekengi Aroneanu August 2009R 2 T2 Physalis alkekengi Bârnova Septembrie 2009R 3 T3 Physalis alkekengi Breazu Septembrie 2009R 4 T4 Physalis alkekengi Bucium Septembrie 2009R 5 T5 Physalis alkekengi Gr dina botanic Iulie 2008R 6 T6 Physalis alkekengi Gr dina botanic Iulie 2007R 7 T7 Solanum dulcamara Gr dina botanic Iulie 2007R 8 T8 Solanum dulcamara Gr dina botanic Iulie 2008R 9 T9 Solanum dulcamara Zona UMF Ia i August 2009R 10 T10 Solanum dulcamara Zona UMF Ia i Septembrie 2009

Am realizat extrac ie cu metanol 70% (v/v) prin refluxare(probele notate cu R) i extrac ie cu etanol 70% (v/v) - tincturi, probenotate cu T. În urma analizei probelor ca atare cantitatea descopoletin liber a fost sub capacitatea de detec ie a aparatului. Prinurmare, probele au fost hidrolizate în vederea eliber rii scopoletineidin forma glicozilat : scopolin.


7.3.2.1. Metoda HPLC/MSSpectrul de mas (full-scan) înregistrat pentru o solu ie de

scopoletin , în condi iile descrise anterior este prezentat în figura 7.4.Ionul a teptat, conform masei moleculare a substan ei analizate(M=192,1) i în func ie de modul de ionizare (pozitiv ) ar fi ionul cum/z 193,1, corespunz tor moleculei protonate.


31

114.0 125.9

141.9 158.0172.1

183.0

193.0

205.0 223.1239.2

120 140 160 180 200 220 240 m/z0

1

2

3

4

4x10Intens.

Fig. 7.4. Spectrul de tip full-scan al scopoletinei în faz mobil Pentru cre terea selectivit ii metodei de analiz HPLC/MS,

s-a realizat fragmentarea ionului caracteristic scopoletinei (m/z 193)i s-a înregistrat spectrul MS (figura 7.5.).

133.0

137.0

149.0165.0

177.9

192.9

100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 m/z0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4x10Intens.

Fig. 7.5. Spectrul de tip MS/MS al scopoletinei în faza mobilSe observ c prin fragmentare, scopoletina se scindeaz în

cinci fragmente principale, cu m/z 133, 137, 149, 165 respectiv 178.Ionul cu m/z 133 a fost ales pentru cuantificare, fiind cel mai intens.

7.3.2.2. Con inutul de scopoletin în plantele analizatePentru probele hidrolizate de Physalis alkekengi extrase ini ial

cu metanol 70% (v/v) prin refluxare, valorile ob inute au variat între:


32

83,32 i 267,90 mg% scopoletin . Pentru probele extrase cu etanol70% (tinctur ), valorile au fost între 86,53-255,14 mg% scopoletin .Pentru Physalis alkekengi nu se poate face nici o compara ie func iede anul recolt rii, valorile fiind prea variate.

Se observ c media concentra iei de scopoletin este mai mareîn probele de Physalis alkekengi dup extrac ie cu metanol 70% (v/v)prin refluxare (166,18 mg%), comparativ cu media pentru probeleextrase cu etanol 70% (v/v) (159,95 mg%).

La analiza valorilor ob inute func ie de anul recolt rii probelor,se observ c plantele Solanum dulcamara recoltate în 2009 auconcentra ii semnificativ mai mari (de dou -trei ori) decât celerecoltate în anii preceden i 2008, respectiv 2007.

Valorile maxime, minime i medii sunt mai mici pentruPhysalis alkekengi comparativ cu cele ob inute pentru Solanumdulcamara. Din figurile 7.10. i 7.11. se observ c extrac ia cumetanol 70% (v/v) prin refluxare este mai bun decât cea cu etanol70% (v/v), atât pentru Physalis alkekengi, cât i pentru Solanumdulcamara.

135,10161,30

267,90

107,94

255,14

179,62150,40

199,03

83,32

148,56

95,44

86,53

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

1 2 3 4 5 6

Probe

mg scopoletin %

RH

TH

Fig. 7.10. Concentra iile scopoletinei în probele de Physalis alkekengi,în func ie de metoda de extrac ie


33

438,93

132,53

415,68

220,70

186,89

419,79

123,13

428,8

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

400,00

450,00

500,00

1 2 3 4

Probe

mg scopoletin %

RH

TH

Fig. 7.11. Concentra iile scopoletinei în probele de Solanum dulcamara,în func ie de metoda de extrac ie

În figura 7.12. sunt reprezentate comparativ valorileconcentra iilor de scopoletin (mg%) ob inute din extractelemetanolice de Physalis alkekengi i Solanum dulcamara.

Physalis alkekengi

Solanum dulcamara

186,89220,7

419,79 438,93

150,4

199,03

135,1

83,32

161,3

267,9

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Scop

olet

in m

g%

Probe

Fig. 7.12. Valorile concentra iilor de scopoletinei în Physalis alkekengii Solanum dulcamara


34

CAPITOLUL 8. DETERMINAREA SOLANINEIDIN PHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUM DULCAMARA L.

8.1. INTRODUCERE

8.1.1. Structur i propriet i fizico-chimice. Istoric

Solanina (figura 8.1.) este alc tuit dintr-un trizaharid –solatrioza (glucoz , galactoz , manoz ) i un aglicon alcaloidic –solanidin .

Fig. 8.1. Structura chimic a solaninei

8.2. ANALIZA SOLANINEI PRINCROMATOGRAFIE PE STRAT SUB IRE


Condi iile de lucru pentru cromatografia pe strat sub ire (CSS)Placa cromatografic : Silicagel 60, 20 x 20 mm, activat la

110°C la etuv timp de 1 or , stropit cu solu ie de hidroxid depotasiu 0,1M în metanol

Sistemul de solven i: metanol : amoniac (100 : 1,5)Timp developare: aproximativ 1 orEtalon: α-solanin (Fluka) în alcool amilic, 5 µL


35

Probe: extractele vegetale, 5 µLRevelare: reactiv iod: spoturi verzi-albastre pe fond violet

deschis i reactiv Marquis: spoturi de culoare albastre-violet-brunepe fond alb

8.2.2. Analiza solaninei din Physalis alkekengi L.prin cromatografie pe strat sub ire

Fig. 8.2. Cromatoplaca pentru solanin (reactiv iod)


36

Fig. 8.3. Cromatoplaca pentru solanin (reactiv Marquis)


37

8.2.3. Analiza solaninei din Solanum dulcamara L.prin cromatografie pe strat sub ire



38

Fig. 8.5. Cromatoplaca pentru solanin (reactiv Marquis)


39

8.2.4. Analiza solaninei dinSolanum dulcamara L. i Physalis alkekengi L. prin CSS


8.3. ANALIZA SOLANINEI PRIN HPLC/MS


8.3.1.1. Prelucrarea probelor vegetaleProbele de produse vegetale au fost recoltate din flora

spontan , dup cum urmeaz :• Solanum dulcamara: august-septembrie 2009 – zona UMF,

Ia i i Vân tori Neam .• Physalis alkekengi: august-septembrie 2009 – Bucium,


40

Bârnova i Breazu, Ia i. Izolarea s-a realizat prin ultrasonare cuamestec de ap :metanol:acid acetic = 49:49:2 (v/v/v).

8.3.1.2. Metoda de analiz HPLC/MSAparatura: HPLC cuplat cu spectrometru de mas• HP 1100 Series binary pump• autosampler HP 1100 Series• termostat HP 1100 Series• spectrometru de mas Agilent Ion Trap 1100 SL

Condi iile de lucru HPLC: coloana analitic : Zorbax SB-C18 100mm x 3.0 mm i.d., 3,5 µm (Agilent, SUA); filtru on-line: 0,2 microni(Agilent); faza mobil : amestec solu ie acid formic 0,1% (v/v) iacetonitril 75/25 (v/v), elu ie izocratic ; debitul: 1 mL/minut;temperatura: 40°C. Detec ia: MS – izolare i fragmentare ion cu m/z869, corespunz tor moleculei solaninei protonate, apoi monitorizareioni cu m/z 706,4 i 722,4 din spectrul MS/MS al analitului.Condi iile de lucru MS: sursa de ioni: ESI (electrospray ionisation);mod ionizare: pozitiv; nebulizator: azot, presiune 55 psi; gaz deuscare: azot, debit 12 L/minut, temperatura de uscare 350°C;poten ial capilar : -2500 V; mod de analiz : monitorizare tranzi iim/z 869> m/z (706,4 + 722,4)


8.3.2.1. Analiza MSSpectrul de mas (full-scan) înregistrat al unei solu ii de

solanin , în condi iile descrise anterior este prezentat în figura 8.7.Ionul a teptat, conform masei moleculare a substan ei analizate(M=868) i în func ie de modul de ionizare (pozitiv ) ar fi ionul cum/z 869, corespunz tor moleculei protonate.

Pentru cre terea selectivit ii metodei de analiz HPLC/MS, s-arealizat fragmentarea ionului caracteristic solaninei (m/z 869) i s-aînregistrat spectrul MS (figura 8.8.).


41

869

+MS

0

1

2

3

6x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z

Fig. 8.7. Spectrul de tip full-scan al solaninei în faza mobil

398.3

560.3

706.4

868.5

+MS2(869)

0

1

2

3

5x10Intens.

400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 m/z

Fig. 8.8. Spectrul de tip MS/MS al solaninei în faza mobil

Se observ c prin fragmentare, solanina se scindeaz în patrufragmente cu m/z 398, 560, 706 i 722. Dintre aceste fragmente, ioniicu cele mai mari intensit i au fost ionii cu m/z 706 i 722; ace ti ioniau fost ale i pentru cuantificare.


42

8.3.2.2. Con inutul de solanin în plantele analizate

Tabelul 8.7. Concentra iile de solanin în extractele analizate, precumi cantit ile de solanin în materialul vegetal

Proba Locrecoltare

Concentra iaîn extractul

vegetal(ng/mL)

Cantitatea desolanin înprob (ng)

Concentra iade solanin în

plantg/g)

Solanumdulcamara/frunze 84,332 421,659 4,2166

Solanumdulcamara/tulpini 76,606 383,029 3,8303

Solanumdulcamara/r cini 32,015 160,074 1,6007

Solanumdulcamara/fructe

UMF Ia i

27,277 136,387 1,3639

Solanumdulcamara/frunze 15,926 79,632 0,7963

Solanumdulcamara/tulpini 64,050 320,250 3,2025

Solanumdulcamara/r cini 30,232 151,159 1,5116

Solanumdulcamara/fructe

Vân toriNeam

31,002 155,009 1,5501

Physalis alkekengi/frunze 0,000 0,000 0,0000

Physalis alkekengi/tulpini 5,636 28,181 0,2818Physalisalkekengi/r cini 4,466 22,328 0,2233

Physalis alkekengi/fructe

Bucium

1,852 9,259 0,0926




Bârnova

0,000 0,000 0,0000




Breazu

0,000 0,000 0,0000

În figura 8.11. sunt prezentate, ca exemplu, cromatogrameletipice pentru solanina determinat în probele vegetale.


43

PROB_A__000025.D: EIC 706.4; 722.5 +MS2(869.0), Smoothed (0.5,1, GA)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

5x10Intens.

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Time [min]


0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.54x10

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Time [min]


0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

4x10

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Time [min]

Fig. 8.11. Cromatogramele solaninei extrase din probele Solanumdulcamara/frunze/ UMF (sus), Solanum dulcamara/frunze/Zimbru

(mijloc) i Physalis alkekengi/frunze/Bucium (jos)

În plantele studiate s-a identificat i dozat solanina, s-au ob inutvalori foarte diferite depinzând în primul rând de specie i apoi delocul de recoltare. Varia ia concentra iilor de solanin din probele deSolanum dulcamara comparativ cu cele din Physalis alkekengi estereprezentat în figura 8.12, se observ c Solanum dulcamaracon ine mai mult solanin .


44

0,0000

0,5000

1,0000

1,5000

2,0000

2,5000

3,0000

3,5000

4,0000

4,5000

1 2 3 4 5 6 7 8

Probe

mic

rogr

ame/

g

Solanum dulcamaraPhysalis alkekengi

Fig. 8.12. Valorile concentra iilor de solaninîn Solanum dulcamara i Physalis alkekengi (µg/g)

În frunzele de Solanum dulcamara concentra ia maxim desolanin a fost de 4,2166 g/g (zona UMF, Ia i), iar concentra iaminim - 0,7963 g/g s-a determinat în plantele recoltate din zonaVân tori Neam .

Pentru Physalis alkekengi, în 50% dintre probe analizatevalorile solaninei au fost sub limita de detec ie a aparaturii (tabelul8.7.). Valoarea maxim (0,2818 µg/g) s-a înregistrat în proba detulpini a plantelor recoltate din zona Bucium, Ia i.

Dac se compar valoarea medie de solanin pentru Solanumdulcamara cu valoarea medie pentru Physalis alkekengi, se observ

este mai mare de 21,67 ori.


45

CAPITOLUL 9. ANALIZA ALCALOIZILOR TROPANICI DINPHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUM DULCAMARA L.

9.1. INTRODUCERE. OBIECTIVEObiectiv: În cadrul studiului celor dou plante din familia

Solanaceae am analizat i alcaloizii tropanici: atropina iscopolamina. Pentru analiza atropinei i scopolaminei din extractevegetale s-a folosit cromatografia de lichide de înalt performancuplat cu spectrometria de mas (LC/MS/MS).

9.2. MATERIALE I METOD

9.2.1. Metoda HPLC

Condi iile de lucru HPLC: coloana analitic : Zorbax SB-C1850 mm x 2,1 mm i.d., 3,5 µm (Agilent, SUA); filtru on-line: 0,2microni (Agilent); faza mobil : amestec solu ie acid formic 0,2%(v/v) : metanol = 80:20 (v/v); debitul: 0,25 mL/minut, temperatura:50°C; detec ia : electrospray pozitiv, MS/MS(MRM) pentru ambiianali i; timp de reten ie: atropina -1,1 minute, scopolamina – 1,95minute, volumul de injectare: 1,5 µL

Condi iile de lucru MS: sursa de ioni: ESI (electrosprayionisation); mod ionizare: pozitiv; nebulizator: azot, presiune 40 psi;gaz de uscare: azot, debit 9 L/minut, temperatura 350°C; poten ialcapilar : 2700 V. Mod analiz : pentru atropina: monitorizaretranzi ie m/z 290,2 > m/z 124,2; pentru scopolamina: monitorizaretranzi ii m/z 304,2 > (138,2;156,2)

9.2.2. Prelucrarea probelor vegetale

Probele de produse vegetale au fost recoltate din floraspontan , dup cum urmeaz :

• Solanum dulcamara: august-septembrie 2009 – zona UMF,Ia i i Vân tori Neam .

• Physalis alkekengi: august-septembrie 2009 – Bucium iBreazu, Ia i.

Izolarea alcaloizilor tropanici s-a realizat prin ultrasonareutilizând un amestec de solven i de extrac ie: ap :metanol = 25:75(v/v), cu acid formic 2%.


46

9.3. REZULTATE I DISCU II

9.3.1. Analiza atropinei

Am înregistrat spectrul de mas (full-scan) al unei solu ii deatropin , în condi iile descrise anterior. Ionul a teptat, conform maseimoleculare a atropinei (M=289,3) i în func ie de modul de ionizare(pozitiv ) ar fi ionul cu m/z 290,2, corespunz tor moleculeiprotonate. Prin fragmentarea ionului cu m/z 290 s-a ob inut unspectru în care ionul predominant este 124,2 (figura 9.4.), acestafiind ales pentru cuantificarea atropinei.

91.2

124.2

214.3260.2

290.2

+MS2(290.2)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

6x10Intens.

50 100 150 200 250 300 m/z

Fig. 9.4. Spectrul de tip MS/MS al atropinei în faza mobil

9.3.2. Analiza scopolaminei

Spectrul de mas (full-scan) a fost înregistrat pentru o solu iede scopolamin . Ionul a teptat, conform masei moleculare ascopolaminei (M=303,3) i în func ie de modul de ionizare (pozitiv )ar fi ionul cu m/z 304. Prin fragmentarea ionului cu m/z 304,2 s-aob inut un spectru în care exist doi ioni majoritari, cu m/z 138,2 i156,2 (figura 9.8.). Ambii ioni din spectru au fost utiliza i pentrucuantificarea scopolaminei.


47

110.3

138.2

156.2

285.3 304.2

+MS2(304.2)

0

1

2

3

4

5x10Intens.

100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 m/z

Fig. 9.8. Spectrul de tip MS/MS al scopolaminei în faza mobil

Curba de calibrare pentru dozarea scopolaminei s-a realizat înintervalul de concentra ii 6,85-274 ng/mL.

9.3.3. Determinarea atropinei i scopolaminei în plantele analizate

În nici una din probele analizate nu s-a pus în eviden atropinai scopolamina.


48

CAPITOLUL 10. EVALUAREA ACTIVIT II ANTIMICROBIENEA EXTRACTELOR OB INUTE DIN PHYSALIS ALKEKENGI L.

10.1. INTRODUCERE, OBIECTIVE

Scopul acestui studiu const în evaluarea poten ialuluiantibacterian al extractelor ob inute din frunze, tulpini, r cini icapsule de Physalis alkekengi L. pentru a confirma utilizarea înmedicina tradi ional în afec iuni asociate cu microorganismelepatogene i a detecta noi surse de agen i antimicrobieni. Date privindutilizarea terapeutic i propriet ile farmacologice ale speciilor dePhysalis au fost comunicate de Ray i Gupta (1997) i Tomassini icolab. (1999).

10.2. MATERIAL I METODE

10.2.1. Materialul vegetal i prelucrarea probelor

Plantele Physalis alkekengi au fost recoltate din zona deperiferie a municipiului Ia i (Breazu, Bucium) în vara anului 2009.Pentru compararea activit ii antimicrobiene am utilizat probe deanason (Pimpinella anisum L.) coriandru (Coriandrum sativum L.),chimen (Carum carvi L.) scor oar (Cinnamomum verum J.Pres.),cucurma (Cuminum cyminum L.) i cardamom (Elettariacardamomum L.). Aceste probe au fost ob inute din surse comercialesub form de pulbere i s-au prelucrat prin infuzare cu apa distilat .Probele testate sunt prezentate în tabelul 10.1.

Tabelul 10.1. Probele de material vegetal incluse în studiu pentruevaluarea activit ii antimicrobiene a Physalis alkekengi L.

Proba Produsvegetal Solvent Metoda de extrac ie

1 r cini alcool etilic Aparat Soxhlet2 tulpini alcool etilic Aparat Soxhlet3 frunze alcool etilic Aparat Soxhlet4 capsule alcool etilic Aparat Soxhlet5 r cini alcool etilic Soxhlet, evaporare, reluare cu hexan

: acetat de etil6 tulpini alcool etilic Soxhlet, evaporare, reluare cu hexan

: acetat de etil7 frunze alcool etilic Soxhlet, evaporare, reluare cu hexan

: acetat de etil


49

8 capsule alcool etilic Soxhlet, evaporare, reluare cu hexan: acetat de etil

9 r cini alcool etilic 70% tinctur10 tulpini alcool etilic 70% tinctur11 frunze alcool etilic 70% tinctur12 capsule alcool etilic 70% tinctur13 r cini alcool etilic 50% tinctur14 tulpini alcool etilic 50% tinctur15 frunze alcool etilic 50% tinctur16 capsule alcool etilic 50% tinctur17 r cini alcool metilic tinctur18 tulpini alcool metilic tinctur19 frunze alcool metilic tinctur20 capsule alcool metilic tinctur21 r cini alcool metilic 50% tinctur22 tulpini alcool metilic 50% tinctur23 frunze alcool metilic 50% tinctur24 capsule alcool metilic 50% tinctur25 r cini ap infuzie26 tulpini ap infuzie27 frunze ap infuzie28 capsule ap infuzie29 anason ap infuzie30 coriandru ap infuzie31 chimen ap infuzie32 scor oar ap infuzie33 cucurma ap infuzie34 cardamom ap infuzie

În teste au fost incluse i dilu iile de alcool etilic, respectivmetilic.

10.2.2. Microorganisme test

Au fost incluse în test urm toarele tulpini procurate din TheAmerican Type Culture Collection: Staphylococcus aureus ATCC25923, Sarcina lutea ATCC 9341, Bacillus cereus ATCC 14579,Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922,Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC10231. Bacteriile testate au fost cultivate pe bulion Mueller-Hintoniar Candida pe mediu lichid Sabouraud. Ampicilina (10 µg/disc) inistatina (100 µg/disc) au fost utilizate pentru controlul pozitiv alac iunii antimicrobiene.


50

10.3. EVALUAREA POTEN IALULUI ANTIMICROBIAN AEXTRACTELOR DE PHYSALIS ALKEKENGI L.

Cea mai satisf toare metod pentru m surarea poten ialuluiantimicrobian al extractelor investigate este tehnica microbiologic adifuziei în agar (Sutherland i Rolinson, 1978).

10.3.1. Rezultate

Activitatea antimicrobian evaluat prin metoda cantitativ ,difuzimetric , a extractelor de Physalis alkekengi i a celor deanason, coriandru, chimen i scor oar sunt prezentate înfigura 10.2. (a, b, c, d, e, f, g).

a. Staphylococcus aureus (probele 1÷12)

b. Staphylococcus aureus(probele 13÷24)

c. Staphylococcus aureus (probele 25÷36)

d. Bacillus cereus(probele 1÷12)

e. Bacillus cereus(probele 13÷24)

f. Bacillus cereus(probele 25÷36)


51

g. Bacillus subtilis (probele 25÷36)

Fig. 10.2. Activitatea antimicrobian a extractelor de Physalisalkekengi i a celor de anason, coriandru, chimen i scor oar

10.3.2. Discu ii

Tehnica standardizat a difuziei în agar ofer date calitativeprivind poten ialul antimicrobian, rezultatele sunt reproductibile isunt corelate cu valorile concentra iei minime inhibitorie (CMI).Extractele luate în studiu prezint o ac iune antimicrobian bunasupra cocilor gram-pozitiv. Asupra Bacillus cereus ATCC 14579,activitate antimicrobian manifest toate variantele de extracte dinfrunze i extractele în alcool etilic 50% din r cini i tulpini.Ac iunea asupra Bacillus subtilis, sc zut , este prezent doar în cazulinfuziei din frunze. Toate extractele testate nu au ac iune asuprabacteriilor gram-negativ i nici asupra Candida albicans.

Activitatea antimicrobian a infuziilor ob inute din diversesorturi comerciale de anason, coriandru, cimbru i scor oar estecomparabil cu cea a infuziilor ob inute din r cini, frunze, tulpinii capsule de Physalis alkekengi L (figura 10.4.).


52

2

1 1

2

1

2 2 2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

cini tulpini frunze capsule anason coriandru chimen scor oar

mic

rogr

ame/

mL

Fig. 10.4. Activitatea antimicrobian a infuziilordin Physalis alkekengi comparativ cu cea a condimentelor

Concentra iile principiilor active ale extractelor determinateprin metoda microbiologic a difuziei în agar, propus de Sutherlandi Rolinson (1978) sunt diferite, func ie de metoda de extrac ie

utilizat i partea vegetal prelucrat .Indiferent de metoda de extrac ie utilizat , cele mai mari

concentra ii ale principiului activ sunt prezente în r cini iar încapsule concentra ia nu difer semnificativ, fiind cuprins între 2,02– 3 µg/mL.

Concentra ia cea mai mare a principiului activ din frunze (10,5µg/mL) s-a ob inut pentru extractul în alcool etilic dup extrac ie înaparatul Soxhlet. Cantit i aproximativ echivalente de principiu activs-au ob inut pentru extractele în etanol 70% i metanol 50%.


53

CAPITOLUL 11. EVALUAREA TOXICIT II ACUTE I A AC IUNIIANALGEZICE-ANTIINFLAMATOARE A EXTRACTELOR ALCOOLICE

DIN PHYSALIS ALKEKENGI L. I SOLANUM DULCAMARA L.

11.2. MATERIAL I METODMaterialul vegetal a fost recoltat din flora spontan din Ia i:

Physalis alkekengi L. din Bucium în august 2009 i Solanumdulcamara L. din zona UMF în septembrie 2009. Am realizatextracte alcoolice din frunzele plantelor cu alcool etilic 70% (v/v) ile-am analizat în capitolul 7 prin HPLC pentru determinareacantitativ a scopoletinei, substan cu efect antiinflamator. Cu P1 s-anotat extractul ob inut din frunzele de Physalis alkekengi L. i cu P2s-a notat extractul din frunzele de Solanum dulcamara L. Conformdatelor ob inute prin HPLC proba P1 con ine 0,159 mg scopoletin/mL extract i proba P2 con ine 0,275 mg scopoletin /mL extract.Deoarece extractele con in alcool 70% (v/v), a fost necesarevaporarea acestuia, luând în lucru reziduul ob inut în urmaevapor rii.

Pentru realizarea acestor studii s-au utilizat oareci albi Swiss,masculi, adul i cu greutatea între 18 - 25 g. Cazarea animalelor a fostefectuat în incinta vivarium-ului Disciplinei de Farmacodinamieîntr-o înc pere a c rei temperatur a fost controlat (21°C ± 2°C), cuun ciclu de lumin /întuneric (12 ore/12ore). În fiecare cu ,prev zut cu ad tor, au fost cazate câte 6-10 animale pentruacomodare. Animalele au primit hran standard i ap ad libitum. Cu10 zile înainte de a efectua test rile s-a observat comportamentulacestora. Cu 3 ore înainte de a efectua protocolul experimental s-asistat accesul la hran i ap .

Toate procedeele experimentale utilizate în realizarea acestuistudiu au fost efectuate în laboratorul disciplinei de Farmacodinamie-Farmacie clinic , în acord cu reglement rile interna ionale debioetic referitoare la studiile realizate pe animale de laborator ireglement rile UMF „Gr. T. Popa” Ia i.


54

11. 5. REZULTATE I DISCU II

11.5.1 Evaluarea toxicit ii acute a extractelor alcoolicede Physalis alkekengi L. i Solanum dulcamara L.

Testul de toxicitate acut s-a efectuat prin administrareareziduului suspendat în mucilag de CMC-Na 0,1%, doz unic , apoiobservarea animalelor de experiment timp de 7 zile consecutiv. S-auutilizat serii succesive de doze în progresie geometric dup cumurmeaz : pentru proba P1 s-au utilizat: 2389,2; 1192,6; 597,3mg/kg/p.o. iar pentru proba P2: 2107,33; 1053,66; 526,83mg/kg/p.o. Peste dozele maxime nu s-au mai putut efectuaadministr ri p.o. datorit unor probleme de formulare care ar fi dus ladate eronate. Aceste doze au fost considerate ca fiind dozele maximetolerate pentru cele dou probe. Pentru toate seriile de doze utilizatenu am înregistrat mortalit i sau evenimente care s exprimetoxicitate ridicat . Pentru doza maxim tolerat s-a înregistrat o u oarstare de disconfort mai vizibil la proba P2, tradus prin agita ie itremor, care a disp rut în primele dou ore de la administrare.

22,89

9,71

4,33

23,52

9,78

3,90

22,61

9,78

4,35

20,71

9,64

5,21

0

5

10

15

20

25

martor P1 lot 1 P1 lot 2 P1 lot 3

greutate (g) consum hran (g) consum ap (mL)

Fig. 11.4. Evaluarea greut ii corporale, consumului mediude hran i ap / greutate medie animal, pentru proba P1


55

22,89

9,21

4,33

21,71

8,92

3,9

21,66

8,07

3,71

21,9

8,59

3,85

0

5

10

15

20

25

martor P2 lot1 P2 lot2 P2 lot3

greutate (g) consum hran (g) consum ap (mL)

Fig. 11.5. Evaluarea greut ii corporale, consumului mediude hran i ap / greutate medie animal, pentru proba P2

În urma analizei rezultatelor s-a constat c la dozele studiate,probele P1 i P2 s-au dovedit a fi netoxice i nu au influen atgreutatea corporal i comportamentul alimentar al animalelor deexperiment (figurile 11.4. i 11.5).

11.5.2. Testul r spunsului constrictiv abdominal indus prin zymosan

Acest test a fost realizat pentru proba P2. Pentru stabilireadozei eficace 50 (DE50) animalele de experiment au fost tratate cuserii de doze în progresie geometric (cu ra ia 2) luând ca punct dereper doza maxim tolerat pentru proba P2. S-au utilizaturm toarele doze: 143,75; 287,50; 575,00; 765,80 mg/kg p.o.reziduu. Doza de 1150,00 mg/kg a limitat apari ia r spunsuluiconstrictiv abdominal datorit st rii de disconfort indus la animalelede experiment. Dozele de P2 s-au administrat p.o. sub form desuspensii în carboximetilceluloz sodic 0,1%. La 45 minute dupadministrarea suspensiilor, s-a administrat, pe cale intraperitonealsuspensia de zymosan A în ser fiziologic (40 mg/kg corp). Animalele


56

au fost plasate pe gr tar sub cristalizoare i s-a înregistrat num rul despunsuri constrictive abdominale timp de 12 minute.

Prin analiza dreptelor de regresie ob inute la testulspunsului constrictiv abdominal s-a determinat DE50 pentru

ac iunea antinociceptiv a reziduului ob inut prin evaporarea probeiP2: DE50 = 534,28 ± 125,86 mg/kg/p.o. reziduu, cu un con inut de6,966 ± 1,638 mg scopoletin . Ac iunea antinociceptiv pentrumodelul indus prin zymosan poate fi explicat prin capacitateascopoletinei de a inhiba dependent de doz produc ia de citokine proinflamatorii: TNF-alfa, IL-1beta, IL8.

11.5.3. Testul Randall-Selitto

Acest test a fost realizat pentru proba P2. Pentru realizareaacestui test i îndep rtarea erorilor, am utilizat un lot martor care aprimit pe cale oral doar vehicolul suspensie de CMC-Na 0,1%. La30 minute dup aceasta s-a administrat subcutanat, în regiuneaplantar pentru laba stâng , 0,05 mL carageenan 3,00% m/v în serfiziologic iar pentru laba dreapt ser fiziologic i dup 4 ore (timpnecesar dezvolt rii edemului) s-a m surat perioada de laten pentrulaba inflamat i pentru controlateral . Loturile tratate au primit pecale oral suspensie de CMC-Na cu reziduul probei P2 i solu ieibuprofen, cu 30 minute înainte de administrarea agentuluiinflamagen, testarea efectuându-se conform preciz rilor anterioare.

Având posibilitatea s m sur m volumul labei inflamate(metoda pletismometric ) f a influen a edemul, am încercat, înparalel, s evalu m i ac iunea antiinflamatoare, pe de o parte, inândcont de faptul c substan ele luate în studiu prezint ambele ac iuni,iar pe de alt parte pentru a crea posibilitatea separ rii nete a ac iuniiantinociceptive de cea antiinflamatoare pentru secven ele de dozestudiate.

Prin analiza dreptelor de regresie s-a determinat DE50 pentruac iunea antinociceptiv i antiinflamatoare a reziduului ob inut prinevaporarea extractului alcoolic pentru proba P2, pentru testulRandall-Selitto. Pentru ac iunea antinociceptiv s-a ob inut DE50 =848,69 ± 37,735 mg/kg/p.o. reziduu, cu un con inut de 11,070 ±0,492 mg scopoletin , pentru ac iunea antiinflamatoare DE50 =746,90 ± 31,840 mg/kg/p.o. reziduu cu un con inut de 9,742 ± 0,415


57

mg scopoletin . Atât ac iunea antinociceptiv cât i ceaantiinflamatoare pot fi explicate prin capacitatea scopoletinei de ainhiba PGE2.

Dreptele de regresie ale probei P2 au fost comparate cudreptele de regresie ale ibuprofenului, substan medicamentoas cuac iune antinociceptiv i antiinflamatoare demonstrat . Parametriistatistici rezulta i din studiul de fa indic faptul c reziduul probeiP2 prezint ac iune semnificativ antinociceptiv i antiinflamatoareasem toare cu cea a ibuprofenului.


58

CONCLUZII GENERALE. CONTRIBU II ORIGINALE.PERSPECTIVE DE CERCETARE

CONCLUZII GENERALE

În teza de doctorat sunt prezentate rezultatele cercet riifitochimice i farmacotoxicologice a dou specii de plante dinfamilia Solanaceae: Physalis alkekengi L. i Solanum dulcamara L.,specii spontane din flora rii noastre. Lucrarea este structurat îndou p i: „Stadiul cunoa terii” (trei capitole) i „Contribu iipersonale” ce cuprinde 8 capitole. Partea general include informa iidin materialul bibliografic referitoare la subiectul tezei de doctorat.

Capitolul 1 cuprinde considera ii generale privind planteletoxice din familia Solanaceae. Clasificarea plantelor din aceastfamilie s-a f cut în func ie de principiile active toxice. Pantele dinfamilia Solanaceae se clasific astfel: cu alcaloizii tropanici (genurileAtropa, Datura, Hyoscyamus, Mandragora, Scopolia), plante cecon in alcaloizi piridinici (genul Nicotiana) i plante cuglicoalcaloizi (genurile Solanum, Physalis, Lycium). Fiecaremonografie reune te date privind: descrierea, r spândirea,propriet ile fizico-chimice ale principiilor active toxice, cazuri deintoxica ii precum i simptomatologie i tratament. Unele plante suntcitate în literatur ca fiind toxice f a se cunoa te exact principiiletoxice. Astfel se justific cercet rile fitochimice ifarmacotoxicologice asupra speciilor Solanum dulcamara i Physalisalkekengi.

În capitolul 2 sunt descrise metodele de determinare atoxicit ii: metoda „Fixed Dose Procedure”, metoda „Acute ToxicClass Method” i metoda „Up and Down”. Am inclus acest capitol caparte de studiu în cercetarea farmacotoxicologic a extractelorvegetale. Orice substan activ biologic este supus cercet rilor „invivo” iar aceste teste sunt vitale pentru s tatea i siguran a omului.

Capitolul 3 cuprinde date privind metodele de extrac ie ianaliz a principiilor active din plantele apar inând familieiSolanaceae. Pentru extrac ia alcaloizilor din plante se practic ini ial


59

o purificare cu eter de petrol sau hexan apoi se extrage cu alcool(metanol sau etanol). Alcaloizii bazici se extrag în mediu alcalin(NH3 sau Na2CO3), iar alcaloizii acizi i neutri se extrag în mediuacid (acid tartric, acid citric); ca solven i organici se utilizeaz acetatde etil, cloroform, eter etilic, benzen.

Metodele de analiz sunt: metode cromatografice (CSS, HPLCi GC), metode spectrale, metode LC-MS i metode electrochimice

(electroforetice i voltametrice).Partea tezei de doctorat „Contribu ii personale” este

structurat în 8 capitole. Pentru o bun cunoa tere a plantelor luate înstudiu am realizat capitolul 4 al tezei de doctorat în care prezintdatele ob inute privind structura anatomic a organelor vegetative aleplantelor.

Capitolele 5, 6, 7, 8 i 9 includ studiul fitochimic al dou speciide plante din familia Solanaceae: Solanum dulcamara L. i Physalisalkekengi L.

În capitolul 5 s-a realizat analiza compu ilor polifenolici înmai multe etape:

A. Prin metode spectrofotometrice conform FarmacopeeiRomâne (edi ia X) s-au determinat cantitativ polifenolii totaliexprima i în acid cafeic i flavonoidele exprimate în rutozid icvercetol. Datele ob inute arat c frunzele de Physalis alkekengisunt mai bogate în polifenoli totali i flavonoide; iar extrac ia cea maibun este cu metanol 70% (v/v).

B. Validarea metodei HPLC/MS modificat pentru 18standarde de compu i polifenolici pentru care s-a realizat analiza prindetec ie UV i MS. Pentru ace ti compu i am elaborat metoda dedozare HPLC/MS/MS.

C. Am aplicat metoda HPLC/MS/MS pentru extractele dinplantele analizate.

Din analiza datelor ob inute prin HPLC/MS/MS se desprindurm toarele idei:

1. pentru extractele ob inute prin extrac ie cu metanol 70%(v/v):

ü apigenina s-a determinat numai în probele hidrolizatede Physalis alkekengi

ü kemferolul i acidul p-cumaric s-au determinat numai


60



ü isoquercitrinul s-a determinat numai în probelenehidrolizate de Solanum dulcamara

2. pentru extractele ob inute prin extrac ie cu etanol 70% (v/v):ü kemferolul i acidul p-cumaric s-a determinat numai


ü rutozidul i quercitrinul s-au g sit numai în probelenehidrolizate atât în Physalis alkekengi, cât i înSolanum dulcamara

ü apigenina s-a determinat atât în probele hidrolizate câti în probele nehidrolizate de Physalis alkekengi

3. prin hidrolizare se ob in cantit i mai mari de compu ipolifenolici în extractele vegetale.

Valorile compu ilor polifenolici sunt foarte variate i depind despecie, modul de extrac ie, locul de recoltare i perioada recolt rii. Oconcluzie important este faptul c dup hidroliza probelor extrase cuetanol 70% valorile compu ilor polifenolici determinate prinHPLC/MS sunt semnificativ mai mari, de asemenea cantit iimportante de luteolin i cvercetol se g sesc în Physalis alkekengi.

Capitolul 6 cuprinde rezultatele ob inute în cadrul studiuluiprezen ei compu ilor fitosterolici în Solanum dulcamara L. iPhysalis alkekengi L. Men ion m c aceste dou plante din familiaSolanaceae sunt studiate pentru prima dat în România. S-a dezvoltato metod HPLC/MS pentru identificarea i dozarea a patrufitosteroli: sitosterol, stigmasterol, campesterol i ergosterol.Materialul vegetal s-a prelucrat pentru determinarea sterolilor liberiprin extrac ie cu hexan în aparatul Soxhlet i pentru determinareasterolilor totali prin saponificare, apoi extrac ie cu hexan. Dupsaponificare s-au ob inut cantit i mai mari de fitosteroli pentruambele plante luate în studiu. Valorile ob inute sunt foarte variabilei depind de specie, locul de recoltare, perioada recolt rii i p ile

plantei. În Physalis alkekengi L. predomin campesterolul, iar în


61

Solanum dulcamara L. sitosterolul, valoarea medie a sitosterolului înprobele de Physalis alkekengi L. este de dou ori mai mare decât înprobele de Solanum dulcamara L. S-a pus în eviden faptul cfructele de Physalis alkekengi L. sunt bogate în fitosteroli.

În capitolul 7 continu m studiul fitochimic al celor dou plantecu identificarea i dozarea scopoletinei, o hidroxicumarin cumultiple propriet i farmacologice în cercetare. Analiza s-a efectuatîn dou etape:

A. analiza prin CSS: prezen a scopoletinei s-a eviden iat întoate probele luate în studiu prin CSS pe suport adsorbant silicagel cufluorescen . Extrac ia scopoletinei s-a realizat dup o prealabilhidroliz acid prin extrac ie lichid/lichid cu cloroform. Sistemul desolven i utilizat a fost aceton : ap : amoniac (45:3,3:1,5). Rf-uletalonului a fost 0,40 iar pentru probe a variat între 0,38 i 0,42 încondi iile de lucru prezentate.

B. analiza prin HPLC/MS: scopoletina s-a extras: cu metanol70% (v/v) prin refluxare i cu etanol la rece 70% (v/v). Extractele aufost analizate, dup ce în prealabil s-a validat metoda de dozare. Înprobele ca atare nu s-a putut doza scopoletina i am realizat ohidroliz acid . Probele hidrolizate au avut concentra ii semnificativmai mari de scopoletin : între 83,32 i 267,90 mg% pentru Physalisalkekengi i între 123,13 i 438,93 mg% pentru Solanum dulcamara.Cea mai bun extrac ie a fost cu metanol 70% (v/v) prin refluxare.Concentra iile de scopoletin în Solanum dulcamara au fost de douori mai mari decât în Physalis alkekengi.

Rezultatele evalu rii solaninei în diferite extracte ale plantelorstudiate sunt incluse în capitolul 8. Solanina este principalulglicoalcaloid toxic în speciile familiei Solanaceae, responsabil deintoxica iile prin confuzie cu alte plante sau prin acumulare înanumite condi ii în speciile alimentare ale familiei Solanaceae.

Cercetarea solaninei s-a realizat în dou etape:• Analiza prin CSS – am extras solanina prin mai multe

metode: o metod din literatura de specialitate aplicat pe Solanumtuberosum - extrac ia la cald în aparatul Soxhlet cu alcool amilic idou metode mai rapide: extrac ia prin refluxare cu alcool amilic iextrac ia lichid/lichid la rece cu alcool amilic. Prin toate metodele deextrac ie s-a izolat solanina i s-a identificat prin revelare cu doi


62

reactivi: reactiv cu iod i reactiv Marquis. Rf-ul etalonului desolanin este 0,65, în condi iile de lucru prezentate. O extrac ie multmai bun a solaninei din cele dou plante studiate s-a realizat înmediu acid cu o solu ie de ap : acid acetic : metabisulfit de sodiu(100 : 5 : 0,5) i apoi extrac ie lichid-lichid cu alcool amilic.

• Analiza prin HPLC/MS: am stabilit metoda de analiz pestandard de solanin i am aplicat condi iile de lucru pentruidentificarea i dozarea solaninei în extractele din plante. PentruPhysalis alkekengi, în 50% dintre probe analizate valorile solanineiau fost sub limita de detec ie a aparatului. Valorile ob inute pentruSolanum dulcamara variaz între 0,7963 g/g (plante recoltate dinzona Vân tori Neam ) i 4,2166 g/g (plante recoltate din zonaUMF, Ia i). Cantitatea medie de solanin func ie de p ile vegetativeale plantei variaz astfel: tulpini > frunze > r cini > fructe.

Scopul capitolului 9 al tezei de doctorat a fost analizaalcaloizilor tropanici în Solanum dulcamara L. i Physalis alkekengiL.. Am dezvoltat ini ial o metod HPLC/MS/MS pentru substan elestandard: atropina i scopolamina, apoi am aplicat aceast metod peextractele vegetale ob inute. Concluzia acestui capitol este c nici oprob analizat nu con ine atropin i scopolamin .

În urm toarele dou capitole (10 i 11) s-a procedat la studiulfarmaco-toxicologic al plantelor studiate.

Poten ialul antimicrobian al extractelor de Physalis alkekengiL. a fost evaluat în capitolul 10. S-au realizat mai multe extracte cudiferi i solven i, cea mai eficient metod a fost extrac ia cu alcooletilic în aparatul Soxhlet. Ac iunea antimicrobian s-a determinatasupra cocilor gram-pozitiv. Toate extractele nu au ac iune asuprabacteriilor gram-negativ i nici asupra Candida albicans.

Extractele alcoolice, dar i infuziile din r cini, frunze, tulpinii capsule de Physalis alkekengi L. prezint o ac iune antimicrobian

bun asupra Staphylococcus aureus. Asupra Bacillus cereus,activitatea antimicrobian se manifest în toate variantele de extractedin frunze i extractele în alcool etilic 50% din r cini i tulpini.Ac iunea sc zut asupra Bacillus subtilis este prezent doar în cazulinfuziei din frunze. Activitatea antimicrobian a extractelor dinPhysalis alkekengi L. s-a comparat cu cea a infuziilor ob inute dindiverse sorturi comerciale de anason, coriandru, cimbru i


63

scor oar . Concluzia acestui capitol este c principiile activeprezente în extractele studiate manifest propriet i antibacterieneasupra cocilor gram-pozitiv, comparabile cu cele ale ampicilinei.

În capitolul 11 am evaluat activitatea farmacotoxicologic aextractelor alcoolice de Physalis alkekengi L. i Solanumdulcamara L.

1. S-a realizat testul de toxicitate acut pe animale deexperiment pentru probele luate în studiu. Dozele maxime tolerate aufost 19,08 mg scopoletin (Physalis alkekengi L.) i 27,5 mgscopoletin (Solanum dulcamara L.). La dozele studiate cele douplante s-au dovedit a fi netoxice i nu au influen at greutateacorporal i comportamentul alimentar al animalelor de experiment.

2. Pentru proba de Solanum dulcamara L. am testat ac iuneaanalgezic a reziduului prin testul r spunsului constrictiv abdominalindus de zymosan i am evaluat ac iunea antiinflamatoare prin testulRandall-Selitto. Ac iunea analgezic i antiinflamatoare ascopoletinei (principiul activ testat) a fost comparat cu ac iuneaibuprofenului.

CONTRIBU II ORIGINALE1. Am realizat un studiu fitochimic al speciilor Solanum

dulcamara L. i Physalis alkekengi L., care sunt clasificate ca plantetoxice în literatura de specialitate, dar prezint principii activebiologic nevalorificate înc , nici la nivel mondial.

2. Am dezvoltat metode moderne HPLC/MS pentru analizacalitativ i cantitativ a solaninei i scopoletinei, care le-am aplicatcu succes pe speciile studiate.

3. Am evaluat ac iunea antimicrobian a organelor vegetativeale speciei Physalis alkekengi L., dup diferite tipuri de extrac ii iam f cut o comparare a ac iunii antimicrobiene cu cea a infuziilorunor condimente.

4. Am aplicat o metod HPLC/MS/MS pentru analizaalcaloizilor tropanici în speciile studiate i am concluzionat catropina i scopolamina nu sunt prezente în plantele studiate.


64

5. Am studiat ac iunea analgezic i antiinflamatoare aextractelor alcoolice din frunze de Solanum dulcamara L. i Physalisalkekengi L..

PERSPECTIVE DE CERCETARETema tezei de doctorat ofer posibilitatea orient rii c tre noi

direc ii de cercetare:• aplicarea metodelor HPLC/MS dezvoltate în aceast lucrare

în cercetarea fitochimic a altor specii din familia Solanaceae.• evaluarea activit ii biologice a luteolinei i cvercetolului din

Physalis alkekengi L..• evaluarea activit ii farmacologice a scopoletinei,

hidroxicumarin determinat în concentra ii mari în Solanumdulcamara L..

• extinderea studiului farmacotoxicologic al solaninei,identificat i izolat acum pentru prima dat în Solanum dulcamaraL., premier în România.

• realizarea unor cercet ri fitochimice ulterioare pe Physalisalkekengi L. pentru identificarea altor principii active: fizaline,vitanolide, calistegine în scopul identific rii cu precizie asubstan elor active biologic, mai ales pentru ac iunea antimicrobian .

• formularea unui nou medicament bogat în fitosteroli extra idin fructele de Physalis alkekengi L..


65

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

2 Ciulei I, Grigorescu E, St nescu U, Plante medicinale, fitochimie i fitoterapie, vol. I, II, Ed.Medical , Bucure ti, 1993

3 Gaillard Y, Cheze M, Pepin G, Human Main Plant Poisining: Revue of the Literature, AnnBiol Clin, 2001, 59(6): 764-765

5 Griffin WJ, Lin DG, Chemotaxonomy and Geographical Distribution of Tropane Alkaloids,Phytochemistry, 2000, 53: 623-637

6 Grigorescu E, Laz r MI, St nescu U, Ciulei I, Index fitoterapeutic, Litografia Institutul deMedicin i Farmacie, Ia i, 2001

7 Hanganu D, Popescu H, Plante toxice, Ed. Medical Universitar „Iuliu Ha ieganu”, Cluj,2002

9 Moffat AC, Osselton MD, Widdop B (editors), Clarke`s analysis of drugs and poisons,Pharmaceutical Press, New York, 2004

10 Çaksen H, Odaba D, Akbayram S, Cesur J, Arslan S, ner A, ner AF, Deadly Nightshade(Atropa belladonna) Intoxication: an Analysis of 49 Children, Human & ExperimentalToxicology, 2003, 22(12): 665-668

12 Eddleston M, Persson H, Acute Plant Poisoning and Antitoxin Antibodies, J Toxicol ClinToxicol, 2003, 41(3): 309-315

15 Raffeey M, A Three Year Study of Drugs, Chemicals and Plant Poisoning in Children,MJTUMS, 2003, 57: 22-29

17 Klaus F, Nistorescu I, Indexul plantelor toxice din România – caiet metodologic, Ministerulii i Familiei, Institutul de S tate Public , Bucure ti, 2001

18 St nescu U, Miron A, H ncianu M, Aprotosoaie C, Bazele farmaceutice, farmacologice iclinice ale fitoterapiei, Ed. „Gr. T. Popa“, Ia i, 2002

29 Leikin JB, Paloucek FP, Poisoning & Toxicology Handbook, LEXI-COMP, Inc., Hudson,Ohio, 2002

36 Hornfeldt CS, Collins JE, Toxicity of Nightshade Berries (Solanum dulcamara) in Mice, ClinToxicol, 1990, 28 : 185-192

44 Dornberger K, The Potential Antineoplastic Acting Constituents of Physalis alkekengi L. var.franchetii Mast., Pharmazie, 1986, 41(4): 265-268

48 Zöld E, E ianu S, Csedö C, Antioxidan i hidrofili din fructe de Physalis alkekengi L., Revistade Medicin i Farmacie - Orvosi és Gyógyszerészeti Szemle, 2004, 50(II) : 69-71

53 Hayes AW (editor), Principles and Methods of Toxicology, Third Edition, Raven Press, ofToxicology, Third Edition, Raven Press, New York, 1994

54 www.nlm.nih.gov55 http://europa.en.int/eur-lex/56 http://eurdor.eur-op.eu.int57 Roll R, Höfer-Bosse T, Kayser D, New Perspectives in Acute Toxicity Testing of

Chemicals, Toxicol Lett, 1986, Suppl. 31: 8658 OECD. Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing, Environmental Health and

Safety Monograph Series on Testing and Assessment N., 24, 2001, Paris60 OECD Test Guideline 420. Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Procedure, 2001

http://www.nlm.nih.gov

http://europa.en.int/eur-lex/

http://eurdor.eur-op.eu.int


66

69 Schlede E, Mischke U, Diener W, Kayser D, The International Validation Study of theAcute- Toxic-Class Method (Oral), Arch Toxicol, 1994, 69: 659-670

71 Spielmann H, Genschow E, Liebsch M, Halle W, Determination of the starting dose foracute oral toxicity (LD50) testing in the up and down procedure (UDP) from cytotoxicitydata, ATLA., 1999, 27: 957-966

73 Nikolic NC, Stankovic MY, Markovic DZ, Liquid-liquid systems for acid hydrolysis ofglycoalkaloids from Solanum dulcamara L. tuber sprouts and solanidine extraction, Med SciMonit, 2005, 11(7): 200-205

75 Vessal M, Akmali M, Bambaee-Row N, Thin Layer Chromatographic Detection of Steroidand Alkaloid Glycosides in An Ethanolic Extract of Winter Cherry (Physalis alkekengi)Fruits, Arch Iran Med, 1999, 3: 128-130

78 * * * European Pharmacopoeia 6-th edition 200879 Simonovska B, Vovk I, High-performance thin-layer chromatographic determination of

potato glycoalkaloids, J Chromatogr A, 2000, 903(1-2):219-22581 Matsuda F, Morino K, Miyazawa H, Miyashita M, Miyagawa H, Determination of potato

glycoalkaloids using high-pressure liquid chromatography-electrospray ionisation/massspectrometry, Phytochem Anal, 2004, 15(2): 121-124

86 Laz r MI, Laz r D, Corciov A, Analiza medicamentelor, vol. I, Ed. PIM, Ia i, 200795 Potterat O, Felten RV, Dalsgaard PW, Hamburger M, Indentification of TLC markers and

quantification by HPLC-MS of various constituents in noni fruit powder and commercialnoni-derived products, J Agric Food Chem, 2007, 55(18): 7489-7494

96 Pintea A, Varga A, Stepnowski P, Socaciu C, Culea M, Diehl HA, Chromatographic analysisof carotenol fatty acid esters in Physalis alkekengi and Hippophae rhamnoides, PhytochemAnal, 2005, 16 (3): 188-195

99 * * * Farmacopeea Român , Ed. a X-a, Editura Medical , Bucure ti, 1993106 Ni M, Toma C, Mo iu Tudose M, Contribuitons à la connaissance de la structure de

l`appareil végétatif de certaines espèces de Solanum L. Analele tiin ifice ale Universit ii„Al. I. Cuza”, Ia i, 1990, 36: 15-19

119 Wollenweber E, Dorsam M, Dorr M, Roitman JN, Valant-Vetschera KM. Chemodiversity ofsurface flavonoides in Solanaceae, Z Naturforsch, 2005, 60: 661-671.

120 Butnaru C, Mircea C, Aprotosoaie AC, Butnaru E, Laz r MI, Determinarea polifenolilortotali i flavonoidelor din unele plante din familia Solanaceae, Rev Med Chir Soc Med NatIa i, 2007, 111(2, supl 2): 108-111

130 Qiu L, Zhao F, Jiang ZH, Chen LX, Zhao Q, Liu HX, Yao XS, Qiu F, Steroids andflavonoids from Physalis alkekengi var. franchetii and their inhibitory effects on nitric oxideproduction, J Nat Prod, 2008, 71(4): 642-646

138 Hyung JK, Seon IJ, Young JK, Hun TC, Yong GY, Tai HK, Ok SJ, Youn CK, Scopoletinsuppresses pro-inflammatory cytokines and PGE2 from LPS-stimulated cell line, RAW 264.7cells, Fitoterapia, 2004, 75(3-4): 261-266

139 Rollinger JM, Hornick A, Langer T, Stuppner H, Prast H, Acetylcholinesterase inhibitoryactivity of scopolin and scopoletin discovered by virtual screening of natural products, J MedChem, 2004, 47(25): 6248-6254

140 Hornick A, Lieb A, Vo NP, Rollinger J, Stuppner H, Prast H, Effect of the coumarinscopoletin on learning and memory, on release of acetylcholine from brain synaptosomesand on long-term potentiation in hippocampus, BMC Pharmacology, 2008, 8(suppl 1):A36

142 Yang JY, Koo JH, Yoon HY, Lee JH, Park BH, Kim JS, Chi MS, Park JW, Effect ofscopoletin on lipoprotein lipase activity in 3T3-L1 adipocytes, Int J Mol Med, 2007, 20(4):527-531


67

145 Dalvi RR, Bowie WC, Toxicology of solanine: an overview, Vet Hum Toxicol, 1983, 25(1):13-15

148 Jensen P.H., Juhler R.H., Nielsen N.J., Hansen T.H., Strobel B.W., Jacobsen O.S., Nielsen J.,Hansen H.C., Potato glycoalkaloids in soil-optimizing liquid chromatography-time-of-flightmass spectrometry for quantitative studies. J Chromatogr A, 2008, 1182(1): 65-71

149 Sotelo A., Serrano B., High-performance liquid chromatographic determination of theglycoalkaloids alpha-solanine and alpha-chaconine in 12 commercial varieties of Mexicanpotato. J Agric Food Chem, 2000, 48(6): 2472-2475

156 Kumar P, Sharma B, Bakshi N, Biological activity of alkaloids from Solanum dulcamara,Nat Prod Res, 2009, 23(8): 719-723

159 Friedman M, Lee KR, Kim HJ, Lee IS, Kozukue N, Anticarcinogenic effects ofglycoalkaloids from potatoes against human cervical, liver, lymphoma, and stomach cancercells, J Agric Food Chem, 2005, 53(15): 6162-6169

160 Ji YB, Gao SY, Ji CF, Zou X, Induction of apoptosis in HepG2 cells by solanine and Bcl-2protein, J Ethnopharmacol, 2008, 115(2): 194-202

184 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) 2005. Methods for dilutionantimicrobial susceptibility. Tests for bacteria that grow aerobically. Approved StandardM7-A6, Wayne, PA, NCCLS, 2005

187 Silva MTG, Simas SM, Batista TGF, Cardarelli P, Tomassini TCB. Studies on antimicrobialactivity in vitro of Physalis angulata L. (Solanaceae) fraction and physalin B bringing aut theimportance of assay determination, Mem Inst Oswaldo Cruz, 2005, 100, 7: 779-782

209 Moon PD, Lee BH, Jeong HJ, An HJ, Park SJ, Um JY, Hong SH, Kim HM, Use ofscopoletin to inhibit the production of inflammatory cytokines through inhibition of thelkappaB/NF-kappaB signal cascade in the human mast cell line HMC-1, Eur J Pharmacol,2007, 26, 555(2-3): 218-25

210 Kim HJ, Jang SI, Kim YJ, Chung HT, Yun YG, Kang TH, Jeong OS, Kim YC, Scopoletinsupppresses pro-inflammatory cytokines and PGE2 from LPS stimulated cell line RAW264,7 cells, Fitoterapia, 2004, 75(3-4): 261-266


68

Lista lucr rilor publicate din teza de doctorat

1. Claudia Butnaru, Elena Butnaru, Laurian Vlase, Mihai IoanLaz r, Determination of scopoletine in Physalis alkekengi and Solanumdulcamara by high-performance liquid chromatography, Revista Farmacia,2010, 58 (6):711-718

2. Claudia Butnaru, Laurian Vlase, Doina Laz r, Lumini aAgoroaei, Mihai Ioan Laz r, HPLC/MS analysis of solanine in Physalisalkekengi and Solanum dulcamara, Revista Farmacia, 2010, în curs depublicare

3. Butnaru C., Mircea C., Aprotosoaie AC., Butnaru E., Laz r MI.,Determinarea polifenolilor totali i flavonoidelor din unele plante dinfamilia Solanaceae, Rev Med Chir Soc Med Nat Ia i, 2007, 111(2, supl 2):108-111

4. Claudia Butnaru, Laurian Vlase, Lumini a Agoroaei, Mihai IoanLaz r, Determination of phytosterols in Physalis alkekengi L. and Solanumdulcamara L. by high-performance liquid chromatography, Acta MedicaMarisiensis, 2010, 56(supl 2), p. 69


69

CURRICULUM VITAEFarm. primar BUTNARU (C LINESCU) CLAUDIAe-mail: [email protected]

STUDII2003-prezent Doctorat f frecven în specialitatea Fitochimie: „Cercetarea fitochimic i

farmacotoxicologic a unor specii din familia Solanaceae”2002-2003 Reziden iat specialitatea „Farmacie general ”1996-2000 Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin si Farmacie “Gr. T. Popa” Ia i1994-1996 Facultatea de Chimie (sec ia Chimie Fizic ) de la Universitatea “Al. I. Cuza” Ia i,

transfer la Facultatea de Farmacie1990-1994 Liceul teoretic “C. Negruzzi” din Ia i, clasa de chimie-fizic

SPECIALIZARI PROFESIONALE2009 Farmacist primar specialitatea „Farmacie general ”2004 Farmacist specialist „Farmacie general ”

PREG TIRE POSTUNIVERSITAR2006 Curs postuniversitar „Curs de HPLC. Elaborarea de metode”, cod 377, Disciplina

de Analiza Medicamentului, Facultatea de Farmacie, UMF „Iuliu Ha ieganu” ClujNapoca

2006 Cursul „Opioizii de la clasic la modern”, UMF „Gr. T. Popa”, Ia i2004 Curs postuniversitar de profesionalizare didactic , Universitatea „Al. I. Cuza” Ia i2004 Curs postuniversitar „Metode cromatografice de analiz - HPLC”, cod I.F. 204,

UMF „Gr. T. Popa”, Ia iEXPERIEN A PROFESIONAL

Perioada Func ia Locul de munc Sarcini i responsabilit i10.2007-prezent

Farmacist Farmacia Sensiblu Iasi 9 Eliberarea si recomandarea produselorfarmaceutice, OTC, dermatocosmeticei baby; controlul stocului de

medicamente eliberate pe prescrip iiTab. III; centralizarea facturilor iavizelor; verificarea prescrip iilormedicale

01.2005-09.2007

Asistentuniversitar

Disciplina de Toxicologie,Facultatea de Farmacie,U.M.F. ”Gr. T. Popa” Ia i

Îndrumarea lucr rilor practice custuden ii; participarea la contracte decercetare CNCSIS si CEEX; elaborareamaterialelor didactice; membru încomisia tiin ific a Facult ii deFarmacie; membru în comisiaconcursului de admitere i în comisiade licen

01.2002-12.2004

Preparatoruniversitar

Disciplina de Toxicologie,Facultatea de Farmacie,U.M.F. ”Gr. T. Popa” Ia i

Preg tire reactivi i materiale pentrulucr rile practice; îndrumarea lucr rilorpractice cu studen ii; participarea lalucr rile de cercetare din cadruldisciplinei

01.2001-12. 2001

Farmacistrezident

Farmacia Spitalului„Sf. Spiridon” Ia i

Preparare produse farmaceuticeoficinale; preparare re ete pentruClinica de Dermatologie

09. 2000 –12. 2000

Farmacist Depozitul Farmaceutic„Biosfarm” Ia i

Eliberare produse farmaceutice iparafarmaceutice

mailto:[email protected]


70

APARTENEN A LA SOCIET I TIIN IFICE I PROFESIONALEColegiul Farmaci tilor din RomâniaProfesionale Societatea de tiin e Farmaceutice din RomâniaSocietatea Româna de Istoria Farmacieitiin ificeSocietatea Micologic din România

PARTICIPAREA LA MANIFEST RI TIIN IFICE10.2010 Al 14-lea Congres Na ional de Farmacie, Tg. Mure09. 2009 Al 39-lea Congres Interna ional de Istoria Farmaciei, Viena, Austria05. 2009 Edi ia a II-a a Simpozionului Na ional „Medicamentul - de la concepere pana la

utilizare”, Ia i09. 2008 Al III-lea Colocviu Interna ional de Istoria Farmaciei, Tg. Mure05. 2008 Edi ia a IV-a a Conferin ei Na ionale de Fitoterapie, Ia i2007, 2008 Academia Sensiblu09. 2007 A XIV-a Reuniune Na ional de Istoria Farmaciei, Pite ti05.-06.2007

Edi ia I-a a Simpozionului Na ional „Medicamentul - de la concepere pân lautilizare”, Ia i

09. 2006 Al XIII-lea Congres Na ional de Farmacie- O farmacie puternic într-o Românieeuropean

05. 2006 Campania pentru marcarea „Zilei Mondiale F Tutun – 31 Mai 2006”: masarotund cu autorit i i ONG, Ia i

03. 2006 Prima Conferin Na ional despre Tabagism „Tutunul i S tatea”, Ia i12. 2005 Sesiunea tiin ific „126 de ani de înv mânt medical superior la Ia i”, Ia i10. 2005 Conferin a Na ional Antidrog cu participare interna ional - edi ia a II-a

“România i drogurile în perspectiva ader rii la Uniunea European ”, Cluj-Napoca

09.10. 2005 A XII-a Reuniune Na ional de Istoria Farmaciei, Ia i08. 2005 Simpozionul Na ional de Micologie, Edi ia a XVII-a, Suceava05. 2005 Simpozionul „Farmacia ast zi, între promovare i cercetare”, Timi oara11. 2004 Sesiunea tiin ific „125 de ani de înv mânt medical superior la Ia i”, Ia i10. 2004 Simpozionul tiin ific „Farmaceutica Mariesensis”, Tg. Mure08. 2004 Simpozionul Na ional de Micologie, Edi ia a XVI-a, Sinaia07. 2004 A XI-a Reuniune Na ional de Istoria Farmaciei, Br ila05. 2004 Al II-lea Simpozion Interna ional –„Noi Resurse pentru Industria Farmaceutic ”,

Constan a11. 2003 Sesiunea tiin ific „Zilele Universit ii de Medicin i Farmacie”, U.M.F. „Gr.

T. Popa”, Ia i11. 2003 Simpozionul cu tema “Calitatea Alimentului i Securitatea Alimentar ”, Ia i09. 2003 Al 36-lea Congres Interna ional de Istoria Farmaciei, Sinaia09. 2003 Simpozionul Na ional de Micologie, Edi ia a XV-a, Cluj-Napoca05. 2003 Conferin a Na ional de Fitoterapie, Ia i03. 2003 11th Panhellenic Pharmaceutical Congress, Atena, Grecia09. 2002 Simpozionul Na ional de Micologie, Edi ia a XIV-a, Piatra Neam i Tg. Neam10. 2002 Al XII-lea Congres Na ional de Farmacie, Bucure ti10. 2002 Sesiunea tiin ific „Diversitatea, func ionalitatea i conservarea organismelor

vii” Universitatea „Al. I. Cuza”, Ia i11. 2002 Sesiunea tiin ific „Zilele Universit ii de Medicin i Farmacie”, U.M.F. „Gr.

T. Popa”, Ia i


71

ALTE MEN IUNIMembru in colective de cercetare-membru in Colectivul Centrului de Cercetare CNCSIS (2005, comisia 6), „Centrul de

analize fizico-chimice si biologice”, U.M.F. „Gr. T. Popa” Ia i;-Membru al grantului CNCSIS, tip A, nr. 1221/2005, durat proiect 2 ani; tema “Contribu ii

la prevenirea intoxica iilor cu ciuperci în jude ele din Nordul Moldovei”-Efectuarea determin rilor incluse în Grantul: CNCSIS – MEN aprobat 2001; cod 64/158,

director de grant Conf. Dr. C lin T nase, Facultatea de Biologie, Catedra de Biologie vegetal ; tema“Impactul polu rii asupra diversit ii ciupercilor din Valea Bistri ei (în aval de Zugreni)”

Membru în diferite comisii-septembrie 2005: secretariat al comitetului de organizare la a XII-a Reuniune Na ional

de Istoria Farmaciei, Ia i ;-aprilie 2005: membru în comitetul de organizare al Simpozionului Na ional „Alimenta ia

actual - implica ii toxicologice i clinice” Ia i ;-noiembrie 2004: membru în comisia Contracte – sponsorizare pentru organizarea

manifest rilor prilejuite de „125 de ani de înv mânt medical superior la Ia i”;-noiembrie 2003: secretar sec ia FARMACIE, sesiunea tiin ific cu ocazia Zilelor

Universit ii de Medicin i Farmacie „Gr. T. Popa” Ia i „Tendin e în medicina începutului demileniu”;

-mai 2003: membru în comitetul de organizare a Simpozionului de Fitoterapie, Ia i;-octombrie 1998: membru în Comitetul de primire a invita ilor la Congresul Na ional de

Farmacie din Ia i;

Medalii

decembrie 2005: Medalia de argint „Prof. dr. doc. Mar ian Cotr u” pentru contribu iaadusa la dezvoltarea tiin elor farmaceutice

Limbi str ine cunoscuteengleza


72

Rezumat TD solanina

Documents

Transcript of Rezumat TD solanina