Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

75
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE ,,Grigore T. Popa” - IAŞI FACULTATEA DE FARMACIE DETERMINAREA REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE DIN MIEREA DE ALBINE REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Coordonator ştiinţific, Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu Doctorand, Popa (Morariu) Ionela Daniela IAŞI, 2013

description

/

Transcript of Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Page 1: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

,,Grigore T. Popa” - IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

DETERMINAREA REZIDUURILOR

MEDICAMENTOASE DIN

MIEREA DE ALBINE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Coordonator ştiinţific,

Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu

Doctorand,

Popa (Morariu) Ionela Daniela

IAŞI, 2013

Page 2: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Decizia Rectorului U.M.F. "Grigore. T. Popa" - Iaşi de numire a

Comisiei de Doctorat nr. 5041/19.03.2013

Data susţinerii publice a tezei de Doctorat: 11.04.2013

Page 3: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

3

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

CUPRINS INTRODUCERE..............................................................................................5

Motivaţia cercetării...............................................................................7

Obiective...............................................................................................8

PARTEA GENERALĂ..................................................................................10

CAPITOLUL I................................................................................................10

ALBINA - MORFOLOGIE, FIZIOLOGIE, PATOLOGIE......................10

I.1. Albina............................................................................................10

I.2. Bolile albinelor.............................................................................13

I.2.1. Bolile contagioase........................................................14

I.2.1.1. Bolile virotice...............................................14

I.2.1.2. Bolile bacteriene...........................................15

I.2.1.3. Boli parazitare...............................................16

I.2.1.4. Boli micotice.................................................18

I.2.2. Bolile necontagioase.....................................................19

I.3. Substanţe chimioterapice utilizate în apicultură pentru prevenirea

şi tratarea bolilor albinelor...............................................................................19

I.3.1. Antibiotice....................................................................19

I.3.2. Alte chimioterapice antimicrobiene..............................21

CAPITOLUL II..............................................................................................24

MIEREA DE ALBINE - ASPECTE GENERALE.....................................24

II.1. Istoric...........................................................................................24

II.2. Producerea mierii.........................................................................25

II.3. Tipuri de miere............................................................................27

II.4. Proprietăţile mierii.......................................................................27

II.4.1. Proprietăţile senzoriale................................................27

II.4.2.Proprietăţile fizico-chimice ale mierii..........................30

II.5. Mierea în apiterapie.....................................................................33

II.6. Mierea în circuitul economic.......................................................33

II.7. Legislaţia şi condiţiile de admisibilitate ale mierii de

albine................................................................................................................34

Page 4: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

4

CAPITOLUL III............................................................................................38

PREZENŢA REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE

(CHIMIOTERAPICE ANTIMICROBIENE) ÎN MIEREA DE

ALBINE...........................................................................................................38

III.1. Surse de poluare a mierii............................................................38

III.1.1. Poluarea datorată unor factori de mediu....................38

III.1.2. Poluarea datorată practicilor apicole..........................38

III.2. Metode de determinare a reziduurilor medicamentoase în

miere.................................................................................................................39

III.2.1.Metodele de screening................................................40

III.2.1.1. Clasificarea după principiul de

detecţie.............................................................................................................40

III.2.1.2. Clasificarea după gradul de

cuantificare.......................................................................................................40

III.2.2. Metodele confirmatorii..............................................42

III.3. Reziduuri medicamentoase în produse apicole..........................44

PARTEA EXPERIMENTALĂ.....................................................................52

CAPITOLUL IV.............................................................................................52

ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE SULFONAMIDE ÎN MIEREA DE

ALBINE...........................................................................................................52

IV.1. Introducere.................................................................................52

IV.1.1. Corelaţii între structura chimică şi activitatea

antimicrobiană..................................................................................................53

IV.1.2. Mecanismul de acţiune al

sulfonamidelor..................................................................................................53

IV.1.3. Provenienţa reziduurilor de sulfonamide în

miere.................................................................................................................56

IV.2. Obiective....................................................................................57

IV.3. Principiul metodei......................................................................57

IV.3.1.Tehnologia Panelurilor Biocip....................................57

IV.3.2. Biocipul......................................................................57

IV.3.3. Detecţia......................................................................58

IV.4. Material şi metodă......................................................................60

IV.5. Validarea metodei......................................................................63

IV.5.1. Liniaritatea metodei...................................................68

Page 5: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

5

IV.5.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie

(IC50)...............................................................................................................71

IV.5.3. Specificitatea şi selectivitatea....................................72

IV.5.4. Precizia şi acurateţea..................................................73

IV.5.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie

(CCβ)................................................................................................................75

IV.5.6. Regăsirea (recuperarea).............................................76

IV.6. Probele de miere........................................................................77

IV.7. Rezultate şi discuţii....................................................................79

IV.8. Concluzii....................................................................................80

CAPITOLUL V..............................................................................................82

ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE NITROFURANI ŞI

CLORAMFENICOL ÎN MIEREA DE

ALBINE...........................................................................................................82

V.1. Introducere..................................................................................82

V.1.1. Nitrofuranii..................................................................82

V.1.2. Cloramfenicolul...........................................................83

V.2. Obiective.....................................................................................84

V.3. Material şi metodă.......................................................................84

V.4. Validarea metodei.......................................................................86

V.4.1. Liniaritatea metodei....................................................89

V.4.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie

(IC50)...............................................................................................................91

V.4.3. Specificitatea şi selectivitatea......................................91

V.4.4. Precizia şi acurateţea...................................................92

V.4.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie

(CCβ)................................................................................................................94

V.4.6. Regăsirea (recuperarea)...............................................94

V.5. Probele de miere..........................................................................96

V.6. Rezultate şi discuţii.....................................................................97

V.7. Concluzii...................................................................................100

Page 6: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

6

CAPITOLUL VI...........................................................................................101

ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE CHINOLONE ŞI ANTIBIOTICE

ÎN MIEREA DE ALBINE...........................................................................101

VI.1. Introducere...............................................................................101

VI.1.1. Chinolonele..............................................................101

VI.1.2. Cefalosporine (ceftiofur)..........................................102

VI.1.3. Amfenicol (fluorfenicol)..........................................103

VI.1.4. Aminoglicozide (Streptomicina)..............................104

VI.1.5. Macrolide (tilozină).................................................104

VI.1.6. Tetracicline..............................................................105

VI.2. Obiective..................................................................................106

VI. 3. Material şi metodă...................................................................106

VI.4. Validarea metodei....................................................................108

VI.4.1. Liniaritatea metodei.................................................111

VI.4.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie

(IC50).............................................................................................................113

VI.4.3. Specificitatea şi selectivitatea..................................114

VI.4.4. Precizia şi acurateţea................................................115

VI.4.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie

(CCβ)..............................................................................................................117

VI.4.6. Regăsirea (recuperarea)...........................................117

VI.5. Probele de miere......................................................................119

VI.6. Rezultate şi discuţii..................................................................120

VI.7. Concluzii..................................................................................124

CAPITOLUL VII.........................................................................................125

STUDIU EXPERIMENTAL AL INFLUENŢEI REZIDUURILOR

MEDICAMENTOASE (SULFONAMIDE) DIN MIERE ASUPRA UNOR

PARAMETRI BIOCHIMICI, IMUNOLOGICI ŞI HEMATOLOGICI

LA ANIMALE DE LABORATOR.............................................................125

VII.1. Introducere..............................................................................125

VII.2. Obiectivele cercetării..............................................................130

VII.3. Protocol experimental.............................................................130

VII.4. Evidenţierea răspunsului imun la şobolani după administrare de

miere conţinând sulfonamide.........................................................................131

VII.4.1. Material şi metodă..................................................131

VII.4.2. Prelucrarea şi interpretarea statistică......................138

Page 7: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

7

VII.4.3. Rezultate.................................................................141

VII. 4.3.1. Analiza comparativă a rezultatelor

parametrilor analizaţi......................................................................................141

VII.4.3.2. Analiza corelaţiei rezultatelor citokinelor

implicate în reacţia alergică cu rezultatele IgE şi a

eozinofilelor...................................................................................................157

VII.4.4. Discuţii...................................................................172

VII.4.5. Concluzii.................................................................176

VII. 5. Evaluarea parametrilor biochimici şi hematologici la şobolani

după administrare de miere conţinând reziduuri de

sulfonamide....................................................................................................177

VII.5.1 Material şi metodă...................................................177

VII.5.2. Rezultate.................................................................184

VII.5.3. Discuţii...................................................................201

VII.5.4. Concluzii.................................................................203

CAPITOLUL VIII........................................................................................205

CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE.

PERSPECTIVE DE CERCETARE...........................................................205

VIII.1. Concluzii generale.................................................................205

VIII.2. Contribuţii originale..............................................................208

VIII.3. Perspective de cercetare........................................................209

BIBLIOGRAFIE..........................................................................................210

AVIZ COMISIA DE ETICĂ A CERCETĂRII........................................224

AVIZ LABORATOR...................................................................................225

LISTA INDICATORILOR REALIZAŢI DIN PROIECT......................226

Page 8: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

8

Teza de doctorat cuprinde:

• 209 pagini (partea generală: 50 pagini, contribuţii

personale: 159 pagini)

• 73 tabele

• 144 figuri

• 267 referinţe bibliografice

• Aviz Comisia de Etica Cercetării

• Aviz laborator

• Lista indicatorilor realizaţi din proiect

• 3 Articole ştiinţifice -1 B+; 2 ISI

În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru

cuprins, tabele, figuri şi referinţe bibliografice.

Cuvinte Cheie: reziduuri medicamentoase, sulfonamide,

nitrofurani, chinolone, antibiotice, citokine, miere.

Această cercetare a fost susț inută de proiectul

POSDRU/88/1.5/S/63117 „Burse doctorale pentru doctoranzi competitivi în

Aria Europeanã a Cercetãrii”.

Page 9: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

9

INTRODUCERE

Mierea este principalul produs apicol, apreciat atât pentru

însuşirile sale nutritive, cât şi pentru efectele sale terapeutice; a fost

prima substanţă dulce folosită în hrana omului, fiind precursoarea

zahărului din trestie sau din sfeclă.

Tendinţa actuală spre consum şi necesitatea îndeplinirii tuturor

cerinţelor de calitate pentru produsele alimentare, în care se încadrează

mierea şi celelalte produse apicole, determină şi la noi în ţară stabilirea

unor standarde de calitate şi metode performante de analiză acceptate de

Uniunea Europeană (UE).

O condiţie esenţială pe care trebuie să o îndeplinească

alimentele este ca ele să nu conţină substanţe nocive pentru

consumatori. Prezenţa substanţelor nocive în alimente i-a preocupat şi

îngrijorat de mulţi ani pe specialişti, această problemă căpătând în

ultimele decenii o nouă dimensiune datorită poluării crescânde a

mediului ambiant, precum şi prin folosirea necontrolată a unor

substanţe chimice în scopul optimizării calităţii lor.

În ultima perioadă, o nouă clasă de poluanţi ai alimentelor au

intrat în atenţia oamenilor de ştiinţă şi anume reziduurile de produse

farmaceutice. Preparatele farmaceutice administrate animalelor

domestice, incluzând antibiotice, hormoni, anestezice, tranchilizante,

chimioterapice etc., sunt reţinute ca şi reziduuri în diferite produse. Mai

mult, există tendinţa de a nu percepe medicamentele ca un factor

poluant, cu toate că există o mare probabilitate ca acestea să se transfere

ca atare sau ca metaboliţi în produsele alimentare de origine animală

(Hughes, Heritage, 2004).

Asigurarea integrităţii lanţului alimentar şi protejarea sănătăţii

consumatorilor devine astfel o necesitate.

Standardele de calitate a mierii în UE restricţionează sever

intrarea mierii în oricare din statele europene. Când vorbim de calitatea

mierii ne referim la respectarea parametrilor de calitate prin aplicarea

unei tehnici apicole corecte, dar şi la absenţa reziduurilor

medicamentoase.

Page 10: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

10

Reglementările comunitare admit utilizarea mai multor clase de

medicamente veterinare (antibiotice, sulfonamide, nitrofurani,

chinolone) pentru tratarea bolilor la albine şi nu permit prezenţa

reziduurilor medicamentoase în miere.

Reziduurile medicamentoase din alimente trebuie studiate şi

determinate deoarece prin alimentaţie pot deveni un factor de risc

pentru sănătatea publică. Se impune atât identificarea principiului activ

medicamentos cât şi al metaboliţilor lor responsabili în unele cazuri de

efecte nocive asupra consumatorilor (Bura M et al.,2008).

Reglementările UE cu privire la calitatea produselor apicole

relevă necesitatea dezvoltării şi implementării unor metode de

determinare rapide, de înaltă sensibilitate şi specificitate pentru

identificarea şi dozarea cantitativă a reziduurilor medicamentoase.

Dezvoltarea şi îmbunătăţirea metodele analitice în vederea

monitorizării nivelurilor de reziduuri din mierea de albine asigură

punerea pe piaţă a produselor alimentare sigure.

Lucrarea de faţă prezintă rezultatele privind determinarea

reziduurilor medicamentoase (antibiotice şi alte chimioterapice

antimicrobiene - sulfonamide, chinolone, nitrofurani) din mierea de

albine folosind o metodă nouă de determinare şi anume tehnologia

Biocip.

Obiective

Teza de doctorat are ca scop principal studiul unor metode de

determinare rapide, de înaltă sensibilitate şi specificitate, în vederea

identificării şi dozării cantitative a reziduurilor medicamentoase din

mierea de albine.

Studiul a fost iniţiat în vederea realizării următoarelor obiective:

Validarea metodei de determinare simultană a 12

sulfonamide din miere utilizând tehnologia de analiză cu biocipuri

(Biochip Array Technology, BAT) şi aplicarea acesteia la analiza

probelor de miere.

Page 11: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

11

Validarea metodei de determinare simultană a 4 nitrofurani şi

a cloramfenicolului utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la

analiza probelor de miere.

Validarea metodei de determinare simultană a chinolonelor,

cefalosporinelor (ceftiofur), amfenicolilor (florfenicol),

aminoglicozidelor (streptomicina), macrolidelor (tilozina),

tetraciclinelor utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la analiza

probelor de miere.

Evidenţierea răspunsului imun la şobolani prin determinarea

citokinelor, eozinofilelor şi a imunoglobulinei E (IgE), după

administrarea de miere conţinând sulfonamide.

Studiu experimental al influenţei reziduurilor

medicamentoase (sulfonamide) din miere asupra unor parametri

biochimici şi hematologici la animale de laborator (şobolani).

Partea generală a tezei de doctorat este structurată în 3

capitole:

Capitolul I expune date din literatura de specialitate privind

morfologia, fiziologia şi patologia albinei.

Albinele fac parte din clasa Insectelor, ordinul Hymenoptera,

familia Apidae, genul Apis. Albina meliferă prezintă 3 grupe geografice

mari şi anume: albina meliferă africană, albina meliferă din orientul

apropiat şi albina meliferă europeană, care datorită însuşirilor sale

superioare s-a răspândit pe tot globul.

Sunt prezentate, de asemenea, bolile albinelor, mai ales cele

contagioase care spre deosebire de bolile necontagioase, sunt mai

periculoase şi se tratează cu chimioterapice antimicrobiene.

Bolile contagioase ale albinelor pot fi virotice, bacteriene şi

micotice.

Page 12: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

12

Bolile bacteriene cele mai răspândite sunt Loca americana, Loca

europeana, septicemia şi paratifoza.

Loca americana este de departe cea mai virulentă boală de puiet

cunoscută la albinele melifere fiind rezultatul infectării cu bacteria

sporulată Paenibacillus larvae subsp. larvae (Ashiralieva, Genersch,

2006). Este foarte contagioasă şi dacă nu este tratată la timp şi

corespunzător poate conduce la dispariţia întregii colonii, răspândindu-

se şi la alte stupine (Williams, 2000).

Loca europeana este mai puţin gravă decât Loca americana,

deoarece majoritatea bacteriilor care contribuie la apariţia ei nu

sporulează, iar sporii speciilor sporogene au o rezistenţă mai scăzută

faţă de acţiunea agenţilor fizici sau chimici.

Cele mai cunoscute boli parazitare sunt nosemoza, varrooza şi

senotainioza.

Compuşii utilizaţi în tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor

sunt: antibiotice şi alte chimioterapice antimicrobiene (sulfonamide,

chinolone, nitrofurani).

Capitolul II este destinat principalului produs apicol, mierea de

albine şi debutează cu o prezentare succintă a importanţei şi

semnificaţiei mierii la multe civilizaţii antice, ce au înflorit şi decăzut

pe parcursul timpului.

Acest capitol continuă cu prezentarea modului de producere a

mierii, precum şi a diferitelor criterii de clasificare ale acesteia.

Proprietăţile mierii sunt prezentate în două secţiuni distincte şi

anume: proprietăţi senzoriale şi proprietăţi fizico-chimice.

Caracteristicele organoleptice ale mierii sunt determinate de

categoria acesteia, de speciile florale din care provine, de compoziţia ei

chimică, de modul de extracţie din faguri, de modul de condiţionare, de

timpul şi condiţiile de păstrare.

Principalele componente ale mierii de albine sunt zaharurile.

Mierea conţine cantităţi reduse de substanţe azotoase reprezentate în

principal de enzime. Substanţele minerale sunt moderat reprezentate în

mierea de flori şi relativ abundente în cea de mană. Mierea conţine o

Page 13: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

13

gamă largă de acizi organici, lipide, pigmenţi, enzime, uleiuri eterice,

substanţe cu acţiune antimicrobiană, vitamine. De conţinutul în zaharuri

depind în mare măsură calităţile fizice ale mierii şi anume: vâscozitatea,

higroscopicitatea şi capacitatea de cristalizare.

Acţiunea terapeutică a mierii de albine se exercită atât asupra

aparatului digestiv (stomac, intestin), cât şi asupra ficatului şi căilor

biliare, ale aparatului cardiovascular, respirator, urinar, sistemului

nervos (Andriţoiu, 2006; Grigore, 2008).

Spre finalul capitolului II sunt atinse câteva aspecte legate de

circuitul economic al mierii în Europa şi la nivel mondial. Dacă în

Europa suntem pe locul doi, la nivel mondial, România a urcat în primii

20 producători de miere ai lumii; clasamentul este dominat de China, cu

cele 300 mii tone obţinute anual. Printre marii producători ai lumii se

mai numără ţări precum Argentina, Statele Unite ale Americii, Turcia şi

Ucraina, având fiecare producţii în jur de 80 mii tone pe an.

Un aspect important prezentat în acest capitol îl reprezintă

legislaţia şi condiţiile de admisibilitate ale mierii de albine.

În Regulamentul CE 470/2009 de stabilire a procedurilor

comunitare pentru limitele de reziduuri medicamentoase din alimentele

de origine animalã, legislaţia europeană defineşte prin termenul de

reziduuri toate substanţele farmacologic active: principii active,

excipienţi sau produse de degradare, precum şi metaboliţii acestora,

care se regăsesc în produsele alimentare obţinute de la animalele cărora

li s-au administrat medicamente de uz veterinar.

Controlul şi monitorizarea reziduurilor medicamentoase în

alimentele de origine animală este reglementată de către Uniunea

Europeană. Obiectivul principal al legislaţiei este de a elabora norme pe

baza cărora să se detecteze utilizarea ilegală de substanţe în produsele

de origine animală, utilizarea abuzivă a medicamentelor de uz veterinar

şi de a asigura punerea în aplicare a acţiunilor adecvate în vederea

minimizării reapariţiei tuturor acestor reziduuri în alimentele de origine

animală.

Termenul de ,,limita maximă de reziduuri’’ (LMR) poate fi

definit drept concentraţia maximă de reziduu, care rezultă din utilizarea

Page 14: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

14

unui medicament veterinar, exprimată în µg/kg, care este permisă de

lege sau este recunoscută ca acceptabilă în sau pe un aliment. LMR se

exprimă pe tipul şi cantitatea de reziduuri, considerat a fi fără risc

toxicologic pentru sănătatea umană.

Un rol important în determinarea reziduurilor medicamentoase

din miere îl au sensibilitatea şi precizia metodei de detecţie. Deoarece

sunt analize de urme, este necesar ca tehnica analitică să garanteze o

limită de detecţie cât mai scăzută.

Decizia Comisiei 2002/657/CE este decizia de punere în

aplicare a Directivei 96/23/CE a Consiliului în ceea ce priveşte

performanţa metodelor analitice şi interpretarea rezultatelor. Această

decizie prevede criterii de performanţă şi alte cerinţe pentru metodele

de analiză care urmează să fie utilizate în testarea probelor de miere,

pentru a asigura calitatea şi compararea rezultatelor analitice generate

de către laboratoarele autorizate pentru controlul oficial al reziduurilor.

Conform Deciziei Consiliului 2003/181/CE (de modificare a

Deciziei 2002/657/CE) este necesar să se prevadă stabilirea progresivă a

limitelor de performanță minime necesare (LPMN) aplicabile

metodelor de analiză care trebuie utilizate pentru substanțele pentru

care nu s-a definit nici o limită autorizată şi, în special, pentru

substanțele a căror utilizare nu este autorizată sau este special interzisă

în Comunitate în vederea garantării punerii în aplicare armonizate a

Directivei 96/23/CE.

Limita de performanță minimă necesară (LPMN) reprezintă

conținutul minim de analit într-o probă care trebuie cel puțin detectat și confirmat (limita minimă de detecţie a metodei).

Pentru majoritatea chimioterapicelor antimicrobiene, LPMN

variază în jurul valorii de 10 µg/kg; pentru cloramfenicol această limită

este de 0,3 µg/kg, iar pentru nitrofurani de 1 µg/kg (Michaud, 2005).

Capitolul III prezintă principalele surse de poluare ale

produselor apicole care sunt mediul poluant şi substanţele utilizate de

apicultori pentru tratamentul bolilor albinelor.

Page 15: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

15

Activitatea albinelor este influenţată de toate elementele de

mediu (sol, vegetaţie, aer şi apă) (Pohl, 2009). Bogdanov (2006) subliniază faptul că pericolul de contaminare a

produselor apicole provine într-o mai mare măsură din practicile

apicole, decât din mediul înconjurător. Apicultorii trebuie să ia măsuri

pentru prevenirea contaminării produselor apicole optând pentru

alternative ecologice în controlul bolilor albinelor, prin utilizarea

substanţelor naturale netoxice în detrimentul celor sintetice.

La ora actuală, în tratamentul bolilor de albine, apicultorii

folosesc frecvent acaricidele pentru combaterea varroozei şi

chimioterapicele antimicrobiene pentru boala Loca americana şi boala

Loca europeana (Kleespies, 2000).

Prezenţa reziduurilor de chimioterapice antimicrobiene din

miere este corelată cu tratamentele aplicate albinelor în cazul bolii Loca

americana şi/sau boala Loca europeana, boli infecto-contagioase

cauzate de bacteriile Paenibacillus larvae subsp. larvae şi respectiv

Melissococcus pluton. În tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor,

care sunt foarte periculoase deoarece pot distruge complet şi rapid

stupina, apicultorii utilizează sulfamidele şi unele antibiotice.

Tratamentul medicamentos ar duce numai la o aparentă vindecare

pentru că bacteria dezvoltă spori foarte rezistenţi care nu sunt distruşi de

aceste chimioterapice antimicrobiene şi provoacă reinfectarea. De

aceea, tratamentul trebuie repetat la anumite intervale de timp. Astfel,

pericolul reziduurilor în produsele apicole este mare, coloniile rămân

purtătoare de spori, iar pericolul infecţios persistă (Ritter, 2000).

De asemenea, în acest capitol sunt prezentate metodele de

determinare a reziduurilor medicamentoase din miere conform normelor

Uniunii Europene incluse în Directiva Consiliului 96/23/CE. Aceste

metode se împart în metode de screening şi metode confirmatorii.

Metodele de screening cele mai utilizate pentru determinarea

reziduurilor medicamentoase din mierea de albine sunt: testul ELISA,

testul Charm II şi testul ROSA. În general, rata rezultatelor fals pozitive

pentru testul Charm II este destul de ridicată (Reybroeck, 2003; Beaune

et al., 2005).

Page 16: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

16

Testul ELISA, utilizat cu succes pentru miere, evidenţiază

prezenţa antibioticelor în urma reacţiilor imunoenzimatice pentru

determinarea anticorpilor şi a antigenelor specifici.

Metoda ELISA se utilizează pentru determinări semicantitative

datorită încrucişării reactivităţilor antibioticelor ce aparţin aceluiaşi

grup de antibiotice. În prezent, testul ELISA este frecvent înlocuit de

testul Charm II (Bogdanov, 2003). Testul Charm II reprezintă tot o metodă de screening utilizată

pentru diferite matrici, cum ar fi carnea şi laptele şi a fost adaptată şi

pentru miere. Sunt cunoscute teste Charm II pentru determinarea de

chimioterapice antimicrobiene (sulfonamide, antibiotice: tetracicline,

antibiotice betalactamice, macrolide, amfenicoli şi aminoglicozide). Un

procent cuprins între 0-30% dintre probele depistate pozitive în urma

testărilor vor fi confirmate prin alte metode, cum ar fi HPLC sau LC-

MS (Kocher,1996; Edder et al., 1999; Edder, Corvi, 2001).

Un dezavantaj al testului Charm II constă în faptul că acesta

permite detectarea întregului grup de antibiotice, nu a fiecărui

reprezentant individual fiind astfel inferior altor metode cantitative

(Bogdanov, 2003; Quintana-Rizzo et al., 2005; Bonvehi, Gutierrez,

2009).

Testul ROSA (Rapid One Step Assay) reprezintă o altă metodă

de screening calitativă pentru detectarea reziduurilor medicamentoase

din miere. Acesta utilizează o bandă test şi un minim de echipament (un

incubator), iar rezultatele se pot citi direct. Testul ROSA este utilizat

pentru depistarea penicilinei G şi a unor compuşi β-lactamici

(cefalosporine) din miere. Sensibilitatea pentru penicilină este de 20

µg/kg, iar pentru compuşii β-lactamici analizaţi este de 20-200 µg/kg

(Legg et al., 2003).

Rezultatele metodelor de screening sunt calitative şi

semicantitative, iar probele testate pozitiv se vor confirma prin metode

analitice de mare sensibilitate (HPLC, LC) în vederea cuantificării

reziduurilor de antibiotice şi chimioterapice antimicrobiene.

Metoda HPLC este cea mai extinsă tehnică cromatografică

utilizată pentru analiza antibioticelor (Kanfer et al., 1998) în special cea

Page 17: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

17

cuplată cu detector UV (Vinas et al., 2004), dar prezintă şi unele

dezavantaje, precum faptul că fiecare clasă de antibiotice trebuie testată

separat.

Prin cuplarea cromatografului de lichide cu spectrometrul de

masă s-a obţinut un instrument de analiză performant, capabil să separe,

să identifice şi să cuantifice componenţii din cele mai complexe probe.

Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE prevede ca toate

metodele bazate pe cromatografie fără utilizarea MS, să fie confirmate

prin spectrometrie de masă (Gentili et al., 2005).

Metoda LC-MS prezintă o siguranţă de detecţie de aproape

100% (Nakazawa et al., 1999). Metoda a fost dezvoltată pentru

sulfonamide şi tetracicline (tetraciclină, oxitetraciclină şi

cloroxitetraciclină). Limita de detecţie este între 0,5 - 10 µg/kg,

depinzând de substanţă. Metoda a continuat să se extindă şi pentru

cloramfenicol şi streptomicină. Obiectivul principal a fost dezvoltarea

metodei LC-MS, capabilă să detecteze toate reziduurile de antibiotice

din miere (Bogdanov, 2003).

În ultima perioadă s-au efectuat numeroase studii privind

depistarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine utilizând

numeroase metode de determinare cu diferite limite de detecţie şi

cuantificare. Stadiul actual al cunoaşterii privind utilizarea acestor

metode de determinare pentru probele de miere este prezentat în cadrul

acestui capitol al tezei de doctorat.

Page 18: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

18

Partea experimentală a tezei de doctorat este structurată în

5 capitole care urmăresc îndeplinirea sistematică a obiectivelor propuse

în cercetarea doctorală.

Capitolul IV - ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE

SULFONAMIDE ÎN MIEREA DE ALBINE

Scopul cercetãrii

Cercetarea prezentă a avut drept scop validarea unei metode de

determinare simultană a 12 sulfonamide din miere utilizând tehnologia

de analiză cu biocipuri (Biochip Array Technology, BAT) în vederea

evaluãrii conţinutului acestora în probe de miere disponibile pe piaţa

comercială din România.

Introducere

La ora actuală, în medicina veterinară, sulfonamidele sunt

printre cele mai folosite substanţe medicamentoase, datorită faptului că

au un preţ scăzut (comparativ cu antibioticele), un spectru antibacterian

larg şi o eficacitate terapeutică apreciabilă în unele boli infecţioase.

Sulfonamidele sunt folosite în apicultură pentru a trata trei boli

ale albinelor şi anume, boala Loca americana, boala Loca europeana şi

nosemoza (Reybroeck et al., 2010).

Sulfadimetoxina, sulfametoxazolul, sulfachinoxalina şi

sulfadiazinele sunt cele mai folosite sulfonamide în medicina veterinară,

inclusiv în apicultură. Dacă perioada dintre tratamentul albinelor şi

recoltarea mierii nu este respectată, aceasta poate fi contaminată cu

reziduuri din aceste substanţe. Interesul pentru detectarea acestor

reziduuri este de mare actualitate.

Avertizări recente ale Uniunii Europene în legătură cu prezenţa

sulfonamidelor în miere au condus la intensificarea supravegherii

reziduurilor medicamentoase şi necesitatea dezvoltării de metode

sensibile şi rapide de screening ale reziduurilor acestor substanţe în

acest produs alimentar deosebit de apreciat de consumatori (Thompson,

Noot, 2005).

Page 19: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

19

Material şi metodă

Metoda Biocip aplicată se încadrează, conform criteriilor de

clasificare a metodelor de determinare a reziduurilor din miere, în

categoria metodelor de screening.

Toate determinările au fost efectuate pe analizorul Evidence

Investigator produs de firma Randox, UK. Acest sistem utilizează

principiile imunologice de bază: metoda competitivă tip sandwich,

bazată pe captură de anticorpi. Metoda de detecţie este

chemiluminescenţa.

Reactivii sunt livraţi de producătorul aparatului şi includ:

Antimicrobial Array I - kit (cod de catalog EV3523, Randox

Laboratories, UK).

Control: Sulphonamide Multianalit Control (cod de catalog

AMC5004, Randox Laboratories, UK).

Validarea metodei

Metoda de validare şi procedura de analiză a produselor apicole

s-a realizat în conformitate cu ghidurile de validare pentru metodele

analitice ale FDA, ghidurile de validare pentru reziduuri

medicamentoase, ghidurilor pentru implementarea Deciziei Comisiei

2002/657/CE, ghidurilor de validarea a metodelor de screening pentru

reziduurile de medicamente veterinare şi Procedurile Standard de

Operare ale Laboratorului S.C.Investigaţii Medicale Praxis S.R.L. Iaşi.

Parametrii de validare evaluaţi au fost următorii: calibrarea

(liniaritatea); sensibilitatea (IC50); specificitatea şi selectivitatea;

precizia (intermediară şi reproductibilitate) şi acurateţea; limita de

detecţie, regăsirea (recuperarea) (tabel IV.2 - IV.5). Limita de decizie obţinută pentru sulfonamidele determinate s-a

încadrat între valorile 0,54 µg/kg şi 5,14 µg/kg. Capabilitatea de

detecţie obţinută pentru sulfonamidele determinate s-a încadrat între

valorile 0,79 µg/kg şi 7,99 µg/kg conform tabel IV.3, tabel IV.5 şi fig.

IV.32.

Page 20: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

20

Fig. IV.32: Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ)

0

2

4

6

8SZ

SDM

SQ

SMT

ST

SSSP

SM

SMP

SCP

SMZ

SD

Limita de decizie CCα (μg/kg)

Capabilitatea de detecţie CCβ (μg/kg)

Page 21: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e albin

e

21

Tabelul IV.2: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie şi acurateţe)

Parametrii de validare ANALIT

SZ SDM SQ SMT ST SS L

inia

rita

te

Interval de calibrare (µg/kg) 0 - 20,00 0 - 20,50 0 - 20,20 0 - 11,20 0 - 21,10 0 - 11,20

Coeficient de corelatie r 0,987 0,982 0,986 0,988 0,991 0,986

Sen

ibil

ita

te

IC 50 (μg/kg) 0,89 1,90 1,60 0,20 0,40 0,60

Pre

cizi

e şi

acu

rate

ţe

Ace

eaşi

ser

ie Nivel 1

Conc.(μg/kg) 57 51 50 51 59 47

CV (%) 6 7 10 9 5 8

Nivel 2 Conc.(μg/kg) 115 99 89 112 131 113

CV (%) 7 6 9 7 9 5

Nivel 3 Conc.(μg/kg) 164 140 134 170 206 167

CV (%) 6 5 5 7 6 7

Ser

ii d

ifer

ite Nivel 1

Conc.(μg/kg) 84 51 54 61 51 36

CV (%) 10 11 10 14 14 11

Nivel 2 Conc.(μg/kg) 171 101 141 101 122 90

CV (%) 12 8 10 7 12 9

Nivel 3 Conc.(μg/kg) 259 160 212 138 207 136

CV (%) 15 10 10 7 11 10

Page 22: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

22

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e albin

e

Tabelul IV.3: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie şi capabilitate de detecţie)

Parametrii de validare ANALIT

SZ SDM SQ SMT ST SS

Rec

up

era

rea

Nivel 1 Conc.(μg/kg) 44 51 49 50 57 46

Recuperare (%) 112 102 98 100 115 92

Nivel 2 Conc.(μg/kg) 113 96 86 112 129 112

Recuperare (%) 113 96 86 112 129 112

Nivel 3 Conc.(μg/kg) 159 138 134 169 204 166

Recuperare (%) 106 92 89 113 136 111

Lim

ita d

e d

eciz

ie C

şi

cap

ab

ilit

ate

de

det

ecţi

e C

Conc. medie (μg/kg) 1,71 2,41 1,23 2,29 0,71 2,01

DS 0,39 0,54 0,11 1,74 0,24 0,30

1,64 x DS 0,64 0,89 0,18 2,85 0,39 0,49

CCα (μg/kg) 2,35 3,30 1,41 5,14 1,10 2,50

CCβ (μg/kg) 2,99 4,19 1,59 7,99 1,49 2,99

Page 23: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

23

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e albin

e

23

Tabelul IV.4: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie şi acurateţe)

Parametrii de validare ANALIT

SP SM SMP SCP SMZ SD L

inia

rita

te

Interval de calibrare (μg/kg) 0 - 19,40 0 - 2,50 0 - 19,60 0 - 19,60 0 - 11,70 0 - 19,40

Coeficient de corelatie r 0,993 0,985 0,991 0,993 0,996 0,989

Sen

ibil

ita

te

IC 50 (μg/kg) 2,50 0,20 0,80 0,60 0,30 0,60

Pre

cizi

e şi

acu

rate

ţe

Ace

eaşi

ser

ie Nivel 1

Conc.(μg/kg) 58 50 53 48 68 45

CV (%) 7 7 7 6 5 9

Nivel 2 Conc.(μg/kg) 100 112 129 102 149 101

CV (%) 6 10 6 8 5 8

Nivel 3 Conc.(μg/kg) 140 174 190 149 236 139

CV (%) 7 5 6 5 6 7

Ser

ii d

ifer

ite Nivel 1

Conc.(μg/kg) 94 62 58 78 98 38

CV (%) 11 10 9 11 9 11

Nivel 2 Conc.(μg/kg) 192 80 112 124 158 64

CV (%) 13 14 8 11 8 10

Nivel 3 Conc.(μg/kg) 275 156 175 189 231 95

CV (%) 8 17 9 11 9 10

Page 24: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e albin

e

24

Tabelul IV.5: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie şi capabilitate de detecţie)

Parametrii de validare ANALIT

SP SM SMP SCP SMZ SD

Rec

up

era

rea

Nivel 1 Conc.(μg/kg) 53 49 52 47 66 44

Recuperare (%) 106 99 105 94 132 88

Nivel 2 Conc.(μg/kg) 97 112 128 101 148 100

Recuperare (%) 97 112 128 101 148 100

Nivel 3 Conc.(μg/kg) 139 173 190 148 234 138

Recuperare (%) 93 115 126 99 156 92

Lim

ita d

e d

eciz

ie C

şi

cap

ab

ilit

ate

de

det

ecţi

e C

Conc. medie (μg/kg) 1,19 2,17 1,89 3,81 1,41 0,29

DS 0,09 0,19 0,55 0,48 0,24 0,15

1,64 x DS 0,15 0,31 0,90 0,79 0,39 0,25

CCα (μg/kg) 1,34 2,48 2,79 4,60 1,80 0,54

CCβ (μg/kg) 1,49 2,79 3,69 5,39 2,19 0,79

Page 25: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

25

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Analiza cantitativă a celor 12 sulfonamide studiate

în diferite probe de miere În cercetările efectuate am analizat 11 probe de miere

achiziţionate din supermarketuri şi 5 probe achiziţionate de la mai mulţi

producători din diferite regiuni geografice ale României.

Prelucrarea probelor

Extracţia sulfonamidelor din probele de miere se realizează

astfel: în jur de 1g de probă de miere dizolvată în 9 ml tampon de

spălare (soluţie de lucru) se menţine la incubat la 37°C timp de 30

minute şi se agită pe un roller pentru 10 minute până la dizolvare.

Soluţia probei se diluează cu o cantitate egală de soluţie tampon de

spălare şi se aplică pe suprafaţa biocipului.

Din acest mod de lucru rezultă o diluţie a probei de miere de

1:20, de care se va ţine cont la calcul.

Etape de lucru se execută manual şi sunt similare celor de la

tehnica ELISA:

• reactivii şi proba sunt adăugaţi pe un biocip pregătit pentru

utilizare

• incubare biocipuri la 37°C cu agitare.

• spălare biocipuri pentru a îndepărta de pe suprafaţa lor orice

component care nu s-a legat.

• reactivul semnal este adăugat pe fiecare biocip înainte să aibă

loc citirea imaginii în modulul de captare imagine al analizorului

Evidence Investigator.

• lumina emisă de fiecare regiune de test este analizată cu

ajutorul softului de procesare imagine şi cuantificată rapid în unităţi de

măsură RLU (Relative Light Unit) folosind o curbă de calibrare;

rezultatele sunt calculate automat de un software dedicat. Intensitatea

luminoasă este invers proporţională cu concentraţia analitului.

Rezultate şi discuţii

Pentru confirmarea rezultatelor obţinute prin metoda Biocip,

probele de miere au fost testate şi prin metoda LC-MS/MS. Analizele

au fost efectuate utilizând sistemul Agilent 1100 LC (Agilent

Page 26: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

26

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Technologies, SUA) cuplat cu spectrometru de masă 4000 Q TRAP

(Applied Biosystems, SUA).

Două din probele analizate au fost pozitive în urma

determinărilor prin metoda Biocip, având valori mai mari decât 10

μg/kg pentru mai multe sulfonamide analizate cu ajutorul Panelului I

Antimicrobian. Majoritatea ţărilor din UE au stabilit limita minimă de

performanță necesară (LMPN) pentru sulfonamide la valoarea de 10

μg/kg (Michaud, 2005).

Performanţele metodei Biocip au fost bune, valorile obţinute au

fost comparabile cu rezultatele metodei confirmatorii atât pentru

probele pozitive, cât şi pentru probele negative. Probele pozitive

confirmate prin metoda LC-MS/MS sunt prezentate în tabel IV.9.

Tabelul IV.9: Valorile obținute pentru probele pozitive prin metoda

Biocip şi metoda confirmatorie LC-MS/MS

Proba1 Proba 2

Biochip LC-MS/MS Biochip LC-MS/MS

Sulfonamide Conc. (μg/kg) Conc. (μg/kg)

1 Sulfadiazina 11.4 7.3 9.2 8.8

2 Sulfadimetoxina < LOD < LOD < LOD < LOD

3 Sulfakinoxalina < LOD < LOD < LOD < LOD

4 Sulfametazina 24.8 32.6 17.1 21.3

5 Sulfatiazol 22.6 18.4 16.2 11.7

6 Sulfisoxazol < LOD < LOD < LOD < LOD

7 Sulfapiridina < LOD < LOD < LOD < LOD

8 Sulfamerazina < LOD < LOD < LOD < LOD

9 Sulfametoxipiridazina < LOD < LOD < LOD < LOD

10 Sulfaclorpiridazina < LOD < LOD < LOD < LOD

11 Sulfametizol 51.2 58.9 68.2 72.9

12 Sulfadoxina < LOD < LOD < LOD < LOD

Rezultatele probelor pozitive identificate prin metoda Biocip şi

confirmate prin metoda LC-MS/MS au evidenţiat prezenţa aceloraşi

sulfonamide la valori peste LMPN şi anume: sulfadiazina,

sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol.

Rezultatele obţinute în acest studiu sunt comparabile cu cele

existente în literatura de specialitate.

Page 27: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

27

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Concluzii

Tehnologia Biocip aplicată a permis măsurarea simultană şi

selectivă a 12 sulfonamide în miere la nivele mult mai mici decât LMR

stabilite.

Determinarea cantitativă simultană a celor 12 sulfonamide

prezintă specificitate pentru fiecare analit ţintit, iar senbilitatea metodei

exprimată ca IC50 este ≤ 2,5 µg/kg.

Metoda prezintă o precizie foarte bună atât în cadrul aceleeaşi

serii analitice, cât şi în serii analitice diferite, cu valori tipice mai mici

de 15 % pentru concentraţiile de 50, 100 şi 150 µg/kg. Criteriile de validare ale metodei: specificitate, acurateţe,

liniaritate, limite de detecţie şi cuantificare, respectă recomandările

Deciziei Comisiei Europene 2002/657/CE şi demonstrează că metoda

poate detecta şi cuantifica reziduuri din sulfonamidele amintite fără

analiza prin spectrometrie de masă sau derivatizarea fluorescentă a

analiţilor.

CAPITOLUL V - ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE

NITROFURANI ŞI CLORAMFENICOL ÎN MIEREA

DE ALBINE

Scopul cercetãrii

În acest capitol ne-am propus validarea metodei de determinare

a 4 metaboliţi ai nitrofuranului din mierea de albine şi anume 1-amino-

imidazolidin-2,4-dionă (AHD), 3-amino-5-morfolinometil-2-

oxazolidinonă (AMOZ), 3-amino-2-oxazolidonă (AOZ), semicarbazidă

(SEM) şi a cloramfenicolului (CAP) utilizând tehnologia Biocip şi

aplicarea acesteia la analiza probelor de miere.

Introducere

Nitrofuranii au fost utilizaţi în practica veterinară ca agenţi

antibacterieni, pentru tratarea infecţiilor cauzate de bacterii şi

protozoare. Deşi utilizarea lor a fost interzisă pentru prima dată în UE

începând cu data de 1 ianuarie 1997 prin anexa IV a Regulamentului

Page 28: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

28

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

2377/90/CE (Leitner et al., 2001), la ora actuală se mai folosesc pentru

animalele care nu sunt crescute pentru consum.

Numeroase publicaţii menţionează că nitrofuranii sunt utilizaţi

în tratarea albinelor pentru producţia de miere, deşi actualmente,

conform Regulamentului nr. 37/2010 al Comisiei UE, nitrofuranii sunt

substanţe interzise pentru toate animalele producătoare de hrană.

Nitrofuranii utilizaţi în tratamentele albinelor sunt

nitrofurantoina, furazolidona, furaltadona şi nitrofurazona. Rezultatele

unei determinări simultane a reziduurilor din patru nitrofurani

(furazolidon, furaltadon, nitrofurantoin, şi nitrofurazona), au demonstrat

că furazolidonul este principalul chimioterapic antimicrobian

administrat în tratarea bolilor bacteriene ale albinelor (Khong et al.,

2004).

Dezvoltarea unor metode accesibile care să permită detectarea

lor este de interes pentru programele de monitorizare şi de reglementare

a reziduurilor în alimente.

Detectarea reziduurilor de nitrofurani este de obicei realizată cu

ajutorul lichid cromatografiei în tandem cu spectrometria de masă (LC-

MS/MS) (Leitner et al., 2001; O’Keeffe et al., 2004). Metoda

imunochimică a fost propusă ca o alternativă pentru a detecta

reziduurile de nitrofurani în miere.

Cloramfenicolul are acţiune bacteriostatică şi este eficient în

tratamentul bolilor infecţioase. Are un spectru de activitate asemănător

tetraciclinei, dar utilizarea lui în medicina umană şi veterinară este

interzisă datorită efectelor adverse pe care le are asupra organismului

uman (Joshi, 2002).

Material şi metodă

Tehnologia Panelurilor Biocip şi aparatura pentru determinarea

cantitativă simultană a nitrofuranilor şi cloramfenicolului din miere au

fost prezentate în capitolul IV din partea experimentală a tezei de

doctorat.

Toţi reactivii sunt multianalit şi sunt furnizaţi într-un kit

compact care include:

Page 29: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

29

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Antimicrobial Array III – kit (cod de catalog EV3695,

Randox Laboratories, UK).

Antimicrobial Array III Control – kit (cod AMC5036, Randox

Laboratories, UK).

Validarea metodei

Parametrii de validare evaluaţi au fost următorii:

a) Liniaritatea metodei

Liniaritatea metodei s-a verificat prin efectuarea unei calibrări în

9 puncte pentru fiecare din cei 4 nitrofurani şi pentru cloramfenicol

utilizând calibratorii incluşi în kitul Anti Microbial Array III.

Softul analizorului utilizează pentru calibrare o ecuaţie specifică

pentru metoda de detecţie imunoenzimatică competitivă (Findlay,

Dillard, 2007):

y = D + [(A-D)/1+(x/C)B]

unde:

x = concentratia analitului (µg/kg),

y = intensitatea semnalului chemiluminescent exprimată

în RLU

A, B, C, D - parametri ai metodei competitive şi sunt predefiniţi

în softul analizorului:

A = intensitatea semnalului chemiluminiscent la

concentraţia 0 a analitului

B = factorul pantei

C = punctul de inflexiune al curbei de calibrare

D = intensitatea semnalului luminos de răspuns la o

concentraţie teoretică infinită a analitului.

În urma determinărilor s-au obţinut coeficienţi de corelaţie (r)

mai mari de 0,98, cel mai mic coeficient s-a obţinut în cazul SEM

(0,982).

Rezultatele obţinute dovedesc faptul că a fost îndeplinită

condiţia de admisibilitate a curbei de calibrare (coeficienţii de corelaţie

admişi trebuie să fie > 0.949).

Page 30: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

30

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

b) Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie (IC50)

Concentraţia inhibitorie (IC50) pentru fiecare analit testat s-a

calculat luând 50% din valoarea semnalului RLU generat de calibratorul

de concentraţie zero şi extrapolând valoarea RLU astfel obţinută pe axa

x a curbei de calibrare pe care sunt exprimate unităţile de concentraţie

în µg/kg. Concentraţia astfel obţinută corespunde concentraţiei

inhibitorii ce produce 50% inhibiţie.

Sensibilitatea metodei exprimată sub formă de IC50 pentru

determinarea cantitativă simultană a celor 4 nitrofurani şi a

cloramfenicolului a înregistrat valori care au fost ≤ 2,32 µg/kg şi care

sunt detaliate în fig. V.8.

Fig. V.8: Valorile sensibilităţii metodei pentru nitrofuranii analizaţi şi

cloramfenicol

c) Precizia şi acurateţea

Conform legislaţiei actuale şi ghidurilor de validare pentru

metodele de determinare ale reziduurilor medicamentoase din miere,

precizia şi acurateţea se evaluează atât pentru concentraţia

corespunzătoare limitelor LMPN (1 µg/kg), cât şi pentru concentraţii

reprezentând 50 %, respectiv 150 % din LMPN.

0,4

0,09

0,44

0,74

2,32

0

0,5

1

1,5

2

2,5

AHD AOZ SEM AMOZ CAP

IC50 (µg/kg)

Page 31: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

31

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Precizia s-a determinat în cadrul aceleiaşi serii analitice şi în

serii analitice diferite. Valorile obţinute pentru determinarea preciziei şi

acurateţei sunt prezentate în fig. V.9. şi în fig.V.10.

Page 32: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e albin

e

32

Fig.V.9: Precizia şi acurateţea pentru concentraţii care reprezintă 50 %, 100% şi 150% din LMPN în

cadrul aceleiaşi serii analitice

Fig. V.10: Precizia şi acurateţea pentru concentraţii care reprezintă 50 %, 100% şi 150% din LMPN în

serii analitice diferite

Nivel 1 (0,50 µg/kg)

n = 20

0,68 0,64 0,61 0,960,44

10,15

7,878,32

5,86

8,92

0

2

4

6

8

10

12

AOZ AMOZ AHD SEM CAP

Conc. (µg/kg)

CV (%)

Nivel 2 (1 µg/kg)

n = 20

1,16 1,14 1,07 1,250,75

8,02 8,1

5,72

7,46 7,26

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

AOZ AMOZ AHD SEM CAP

Conc. (µg/kg)

CV (%)

Nivel 3 (1,5 µg/kg)

n = 20

1,84 1,73 1,81 2,25

1,06

8,33

11,78

8,719,84

12,93

0

2

4

6

8

10

12

14

AOZ AMOZ AHD SEM CAP

Conc. (µg/kg)

CV (%)

Page 33: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

33

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

d) Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ)

Limita de decizie (CCα) a fost calculată ca fiind media

aritmetică a concentraţiei analitului la nivel LMPN plus 1.64 x DS a

repetabilităţii la α = 5% (CCα) Capabilitatea de detecţie (CCβ) a fost

calculată ca fiind media aritmetică a concetraţiei analitului la nivel CCα

plus 1.64 x DS a repetabilităţii la α = 5% (CCα). Valorile obţinute sunt

redate în fig. V.11.

Fig. V.11: Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ)

e) Regăsirea (recuperarea)

Procentul de recuperare s-a calculat pentru 3 nivele de

concentraţie reprezentând 50%, 100 % şi 150 % din limita minimă de

performanţă necesară pentru reziduurile de nitrofurani şi cloramfenicol

în mierea de albine (LMPN = 1 µg/kg). Probele de miere au fost

îmbogăţite cu următoarele concentraţii de nitrofurani şi cloramfenicol:

0.5, 1, 1.5 µg/kg. Procentele de recuperare au fost calculate efectuând

raportul dintre concentraţia analitului din proba analizată şi concentraţia

teoretică a analitului din soluţia standard.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2AOZ

AMOZ

AHDSEM

CAP

Limita de decizie CCα (μg/kg)

Capabilitatea de detecţie CCβ (μg/kg)

Page 34: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

34

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Procentele de recuperare obţinute sunt prezentate în fig.V.12-

V.14.

Fig.V.12: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care

reprezintă 50 % din LMPN

Fig. V.13: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care

reprezintă 100 % din LMPN

AOZAMOZ

AHDSEM

CAP

Conc. (µg/kg)

Recuperare (%)

124 124 136

192

64

0,620,62

0,680,96

0,320

50

100

150

200

Procentul de recuperare - Nivel 1 (0,50 µg/kg)

n = 20

AOZAMOZ

AHDSEM

CAP

Conc. (µg/kg)

Recuperare (%)

106 111 119 125

75

1,061,11

1,191,25

0,750

20

40

60

80

100

120

140

Procentul de recuperare - Nivel 2 (1 µg/kg)

n = 20

Page 35: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

35

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Fig.V.14: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care

reprezintă 150 % din LMPN

Analiza cantitativă a celor 4 metaboliţi de

nitrofuran şi a cloramfenicolului în diferite probe de

miere

Metoda validată a fost aplicată la determinarea a 11 probe de

miere achiziţionate din supermarketuri şi 5 probe achiziţionate de la

producători din diferite regiuni geografice ale României în perioada mai

- august 2011.

Prelucrarea probelor Derivatizarea şi extracţia nitrofuranilor şi cloramfenicolului din

probele de miere s-a realizat astfel:

▪ mase de probă în jur de 1g de probă de miere dizolvate în 4 ml

apă distilată se incubează la 37°C timp de 30 minute şi se agită pe un

agitator pentru 10 minute până la dizolvare.

▪ peste soluţia probei se adaugă mai întâi 0,5 ml soluţie HCl 1M

şi apoi 100 µl soluţie 10mM 4-nitrobenzaldehidă. Se omogenizează

amestecul, se agită pe un agitator pentru 10 minute şi apoi se incubează

timp de 16 – 24 ore la 37°C.

AOZ AMOZ AHD SEMCAP

Conc. (µg/kg)

Recuperare (%)

123115 121

150

71

1,84 1,73 1,81 2,251,06

0

50

100

150

Nivel 3 (1,5 µg/kg)

n = 20

Page 36: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

36

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

▪ după incubare, în fiecare probă se adaugă 5 ml soluţie fosfat

dipotasic (0.1M K2HPO4·3H2O). Se corectează pH-ul soluţiei obţinute

la valoarea de 7,4 cu soluţie NaOH 1M.

▪ peste această soluţie se adaugă acetat de etil (15 ml acetat de

etil la 5ml proba miere derivatizată). După agitare cu ajutorul

agitatorului Vortex timp de 2 minute, urmează omogenizarea timp de

10 minute şi centrifugarea probei 10 min la 4500 rcf.

▪ din supernatant se transferă în microtuburi câte 6 ml din fiecare

probă. Microtuburile cu probe se evaporă pentru 30 min la 60°C şi

presiune 15 psi.

▪ reziduul obţinut după evaporare se reia cu 375 µl diluant

pentru probe (AM III DIL SPE) şi se agită cu ajutorul agitatorului

Vortex timp de 2 minute.

Etape de lucru se execută manual şi sunt similare celor de la

tehnica ELISA:

Rezultate şi discuţii

Confirmarea rezultatelor obţinute prin metoda Biocip pentru

probele de miere analizate s-a realizat prin metoda LC-MS/MS,

utilizând sistemul Agilent 1100 LC (Agilent Technologies, SUA) cuplat

cu spectrometru de masă 4000 Q TRAP (Applied Biosystems, SUA).

Rezultatele probelor pozitive identificate prin metoda Biocip şi

confirmate prin metoda LC-MS/MS au evidenţiat prezenţa aceloraşi

reziduuri medicamentoase la valori peste LMPN. În proba 3 s-au

determinat concentraţii de nitrofurani (SEM şi AOZ) peste valoarea de

1 μg/kg (LMPN), valorile obţinute prin metoda Biocip fiind

comparabile cu cele obţinute prin metoda LC-MS/MS (tabel V.4).

Page 37: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

37

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Tabelul V.4: Concentraţiile celor 4 nitrofurani şi cloramfenicol

determinate prin metoda Biocip şi LC-MS/MS Proba Metoda Concentraţie analit (μg/kg)

AOZ AMOZ AHD SEM CAP

Proba 1 Biocip 0,50 0,74 0,46 0,75 0,79

LC-MS/MS 0,17 0,12 0,32 0,19 0,88

Proba 2 Biocip 0,76 0,75 0,78 0,66 0,84

LC-MS/MS 0,41 0,42 0,13 0,28 0,33

Proba 3 Biocip 1,24 2,88 4,16 7,21 3,07

LC-MS/MS 1,11 1,46 2,34 6,54 2,34

Proba 4 Biocip 0,68 0,53 0,55 0,54 0,23

LC-MS/MS 0,08 0,34 0,11 0,38 0,07

Proba 5 Biocip 0,35 0,65 0,73 0,44 0,76

LC-MS/MS 0,12 0,18 0,65 0,22 0,61

Proba 6 Biocip 0,44 0,88 0,67 0,57 0,49

LC-MS/MS 0,43 0,65 0,60 0,52 0,29

Proba 7 Biocip 0,41 0,54 0,65 0,72 0,77

LC-MS/MS 0,09 0,16 0,45 0,43 0,43

Proba 8 Biocip 0,28 0,78 0,89 0,34 0,44

LC-MS/MS 0,22 0,98 0,99 0,21 0,94

Proba 9 Biocip 0,27 0,99 0,54 0,88 0,11

LC-MS/MS 0,07 0,76 0,76 0,72 0,32

Proba 10 Biocip 1,07 0,99 1,14 0,88 0,11

LC-MS/MS 0,72 0,77 0,76 0,72 0,32

Proba 11 Biocip 0,43 0,43 0,54 0,88 0,11

LC-MS/MS 0,44 0,76 0,76 0,72 0,32

Proba 12 Biocip 0,76 0,65 0,42 0,63 0,85

LC-MS/MS 0,42 0,48 0,53 0,26 0,12

Page 38: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

38

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Proba Metoda Concentraţie analit (μg/kg)

AOZ AMOZ AHD SEM CAP

Proba 13 Biocip 0,43 0,74 0,89 0,34 0,44

LC-MS/MS 0,87 0,81 0,19 0,21 0,14

Proba 14 Biocip 0,89 0,89 0,54 0,88 0,11

LC-MS/MS 0,80 0,16 0,26 0,42 0,02

Proba 15 Biocip 0,89 0,79 0,54 0,88 0,11

LC-MS/MS 0,80 0,76 0,46 0,62 0,53

Proba 16 Biocip 0,89 0,89 0,54 0,88 0,11

LC-MS/MS 0,48 0,32 0,32 0,21 0,26

Rezultatele obţinute în acest studiu sunt comparabile cu cele

existente în literatura de specialitate.

Concluzii

Tehnologia Biocip a permis măsurarea simultană şi selectivă a 4

metaboliţi de nitrofurani şi a cloramfenicolului în miere la nivele mult

mai mici decât LMPN admise.

Metoda aplicată se caracterizează prin specificitate pentru

fiecare analit ţintit şi prin sensibilitate exprimată ca IC50, care a

înregistrat valori ≤ 2,32 µg/kg.

Metoda prezintă o precizie foarte bună atât în cadrul aceleeaşi

serii analitice, cât şi în serii analitice diferite, cu valori tipice mai mici

de 15 % pentru concentraţiile de 0,5, 1 şi 1,5 µg/kg. Limita de decizie

(CCα) obţinută pentru determinarea metaboliţilor a 4 nitrofurani şi

cloramfenicolului s-a încadrat între valorile 0,37 µg/kg şi 1,05 µg/kg.

Capabilitatea de detecţie (CCβ) a înregistrat valori care s-au încadrat în

intervalul 0,42 - 1,14 µg/kg. Coeficientul de recuperare obţinut s-a

situat în domeniul 64 – 192 % faţă de concentraţia iniţială.

Page 39: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

39

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

CAPITOLUL VI - ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE

CHINOLONE ŞI ANTIBIOTICE ÎN MIEREA DE ALBINE

Scopul cercetãrii

Studiul din acest capitol a avut drept scop validarea unei

metode de determinare simultană a chinolonelor (QNL),

cefalosporinelor (ceftiofur - CEFT), amfenicolilor (tiamfenicol - TAF),

aminoglicozidelor (streptomicina - STR), macrolidelor (tilozina - TYL),

tetraciclinelor (TCN) utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la

analiza probelor de miere.

Introducere

Chinolonele constituie o clasă de agenţi antimicrobieni sintetici

eficienţi în tratamentul multor boli infecţioase provocate de bacterii atât

în medicina umană, cît şi în cea veterinară.

Majoritatea utilizărilor de uz veterinar al acestor chimioterapice

antimicrobiene este sub formă de fluorochinolone. Deşi la ora actuală

datele ştiinţifice privind eficacitatea fluorochinolonelor în apicultură

sunt reduse, utilizarea acestora ca profilaxie a bolilor albinelor, în

special în Asia, a luat amploare în ultimii ani. Această utilizarea a fost

confirmată de detectarea reziduurilor de chinolone în mierea din acea

zona (Savoy Perroud, 2009).

Utilizarea pe scară largă a chinolonelor în medicina veterinară

reprezintă un pericol potențial pentru sănătatea umană; acestea fi

prezente sub formă de reziduuri în produsele alimentare (Wegener,

1999), care poate determina reacții alergice sau fenomene de rezistenţă

la antibiotice la om.

Ceftiofurul face parte din cefalosporinele de generaţia a treia,

dezvoltate exclusiv pentru uz veterinar. Este bactericid in vitro prin

inhibarea sintezei peretelui celular al germenilor.

În ultimii ani, ceftiofurul a fost folosit în apicultură pentru

tratarea infecţiilor bacteriene deşi nu este recomandat în timpul

producţiei mierii, totuşi poate fi detectat în miere (Moats, Buckley,

1998).

Page 40: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

40

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Tiamfenicolul şi fluorfenicolul sunt antibiotice cu spectrul larg,

foarte asemănătoare ca structură şi mod de a acţiona cu cele ale

cloramfenicolului.

Streptomicina se utilizează în apicultură împotriva bolii Loca

americana şi Loca europena în mai multe ţări, în special în America

Centrală şi de Sud.

În ciuda faptului că tratamentele cu streptomicină nu sunt

permise în cele mai multe țări (UE, SUA) datorită toxicităţii crescute,

utilizarea acesteia este adesea sugerată în diferite forumuri apicole și în

manualele de apicultură (Mutinelli, 2003). În China, streptomicina și cloramfenicolul au fost antibiotice preferate pentru a controla un mare

focar de boală Loca americana în 1997 (Ortelli et al., 2004).

Macrolidele sunt chimioterapice antibacteriene larg răspândinte

în practica medicală şi veterinară. Din grupa macrolidelor mai face

parte tilozină care este utilizată la nivel global în apicultură şi a cărei

eficacitate a fost dovedită de către autori diferiţi (Hitchcock et al., 1970;

Moffett et al., 1970; Peng et al., 1996; Pettis, Feldlaufer, 2005).

Tetraciclinele sunt chimioterapice antimicrobiene cu spectru larg

bacteriostatic, cu o lungă istorie în medicina veterinară. Oxitetraciclina,

de obicei sub formă de clorhidrat, este utilizată în apicultură de la

începutul anilor cincizeci în tratamentul bolilor bacteriene de puiet, cum

ar fi Loca americana (Hopingarner, Nelson, 1987; Spivak, 2000) și Loca europeana (Oldroyd et al., 1989.; Waite et al, 2003;. Thompson et

al., 2005).

Material şi metodă

Tehnologia Biocip a permis determinarea simultană, cantitativă

atât a compuşilor părinte din cele 6 clase de chimioterapice

antimicrobiene cât şi a principalilor metaboliţi ai acestora. Toate determinările au fost efectuate pe analizorul Evidence

Investigator produs de firma Randox, UK.

Toţi reactivii sunt multianalit şi sunt furnizaţi de producătorul

aparatului într-un kit compact care include:

Anti Microbial Array II (EV3524) produs de Randox

Laboratories, UK

Page 41: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

41

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Control: Multianalit Control (cod de catalog AMC5004,

Randox Laboratories, UK).

Validarea metodei

Validarea metodei de determinare cantitativă simultană a celor

6 tipuri de chimioterapice antimicrobiene luate în studiu utilizând

tehnologia Biocip reprezintă un protocol care întruneşte concomintent

cerinţele deciziei 2002/657/CE şi posibilităţile unui laborator oficial cu

număr mare de probe de testat.

Parametrii de validare evaluaţi au fost următorii: calibrarea

(liniaritatea); sensibilitatea (IC50); specificitatea şi selectivitatea;

precizia (intermediară şi reproductibilitate) şi acurateţea; limita de

detecţie; regăsirea (recuperarea). Valorile parametrilor de validare sunt

inserate în tabel VI.1 şi tabel VI.2.

Limita de decizie obţinută pentru clasele de antibiotice

determinate s-a încadrat între valorile 1,25 µg/kg şi 5,5 µg/kg.

Capabilitatea de detecţie obţinută pentru aceleaşi chimioterapice s-a

încadrat între valorile 2,05 µg/kg şi 8,81 µg/kg.

Valorile obţinute sunt redate în tabel VI.2 şi fig. VI.16.

Page 42: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

42

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Fig. VI.16: Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ)

0

2

4

6

8

10CEFT

QNL

STR

TCN

TAF

TYL

Limita de decizie CCα (μg/kg)

Capabilitatea de detecţie CCβ (μg/kg)

Page 43: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e albin

e

43

Tabelul VI.1: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie şi acurateţe)

Parametrii de validare ANALIT

CEFT QNL STR TCN TAF TYL L

inia

rita

te

Interval de calibrare (μg/kg) 0 - 7 0 - 11,5 0 - 76 0 - 4 0 - 5 0 - 5

Coeficient de corelatie r 0,986 0,982 0,987 0,994 0,998 0,991

Sen

ibil

ita

te

IC 50 (μg/kg) 0,25 0,52 1,30 1,70 0,50 0,55

Pre

cizi

e şi

acu

rate

ţe

Ace

eaşi

ser

ie

Nivel 1 Conc.(μg/kg) 1,25 0,63 3,91 1,48 0,31 0,31

CV (%) 6,8 4,30 4,60 6,90 3,40 5,00

Nivel 2 Conc.(μg/kg) 2,50 1,25 7,81 2,22 0,63 0,63

CV (%) 5,80 6,60 3,40 7,60 4,50 4,00

Nivel 3 Conc.(μg/kg) 5,00 2,50 15,63 3,33 1,25 1,25

CV (%) 5,00 6,80 4,60 5,70 6,80 4,00

Ser

ii d

ifer

ite

Nivel 1 Conc.(μg/kg) 0,49 0,93 5,03 0,99 0,38 0,33

CV (%) 6,80 4,30 4,60 6,90 3,40 5,00

Nivel 2 Conc.(μg/kg) 1,05 1,80 8,51 1,43 0,59 0,66

CV (%) 5,80 6,60 3,40 7,60 4,50 4,00

Nivel 3 Conc.(μg/kg) 1,97 3,29 18,88 2,25 1,17 1,28

CV (%) 5,00 6,80 4,60 5,70 6,80 4,00

Page 44: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

ed

icamen

toase d

in m

ierea de

albin

e

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e albin

e

44

Tabelul VI.2: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie şi capabilitate de detecţie)

Parametrii de validare ANALIT

CEFT QNL STR TCN TAF TYL R

ecu

per

are

a

Nivel 1 Conc.(μg/kg) 0,56 0,62 0,57 0,63 0,60 0,60

Recuperare (%) 112 123 113 125 119 119

Nivel 2 Conc.(μg/kg) 0,87 1,00 0,91 0,84 1,00 1,05

Recuperare (%) 87 100 91 84 100 105

Nivel 3 Conc.(μg/kg) 1,54 1,74 2,00 1,68 1,98 1,86

Recuperare (%) 77 87 100 84 99 93

1L

imit

a d

e d

eciz

ie C

şi

cap

ab

ilit

ate

de

det

ecţi

e C

Conc. medie (μg/kg) 0,49 0,93 5,03 0,99 0,38 0,33

DS 2,44 1,52 0,28 2,38 0,53 0,65

1,64 x DS 4,01 2,50 0,47 3,91 0,87 1,07

CCα (μg/kg) 4,50 3,43 5,50 4,90 1,25 1,40

CCβ (μg/kg) 8,51 5,93 5,97 8,81 2,05 2,47

Page 45: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

45

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Analiza cantitativă a chinolonelor şi a diferitelor

tipuri de antibiotice în probe de miere Metoda validată a fost aplicată pe 43 de probe de miere de

diferite sortimente în vederea determinării reziduurilor de chinolone şi

antibiotice.

Prelucrarea probelor

Eşantioane de miere analizate prin metoda LC-MS/MS şi

identificate ca fiind fără reziduuri de medicamente au fost utilizate ca şi

probe blanc sau controale negative în cadrul protocolului de validare.

Optimizarea procedurii de extracţie

Datorită faptului că mierea este o matrice complexă ce conţine

zaharuri, dar şi alte substanţe precum pigmenţi sau compuşi fenolici,

care trebuie eliminaţi înainte de începerea determinărilor de reziduuri

medicamentose, am inclus o etapă de extracţie în cadrul protocolului de

testare, ţinînd cont de proprietăţile diferite ale antibioticelor incluse în

studiu.

S-a luat în considerare necesitatea de a dezvolta o metodă

comună pentru extracţia simultană a mai multor clase de antibiotice.

Prelucrarea probelor poate fi făcută în două moduri:

Metoda diluţiei rapide:

cântărirea a ≈ 1 g de miere;

adăugarea a 9 ml de soluţie tampon de reacţie (37oC);

omogenizare, diluţie şi filtrare;

aplicarea probei pe suprafaţa de microtitrare (biocip).

Metoda extracţiei:

cântărirea a ≈ 1 g de miere;

adăugarea a 9 ml de soluţie tampon de reacţie (37oC);

vortexare şi adăugare de acetat de etil;

vortexare, omogenizare, centrifugare;

eluare şi evaporare până la uscare a stratului organic superior;

resuspensie în soluţie tampon de reacţie şi vortexare;

Page 46: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

46

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

aplicarea probei pe suprafaţa de microtitrare (biocip).

Etape de lucru se execută manual şi sunt similare celor de la

tehnica ELISA.

Rezultate şi discuţii

După testarea celor 43 probe de miere, în 9 probe au fost

identificate reziduuri de chinolone, ceftiofur, tiamfenicol, streptomicină,

tilozină şi tetracicline. Atât probele pozitive cât şi cele negative au fost

confirmate prin metoda LC-MS/MS. După cum se observă din datele

prezentate în tabel VI.9, valorile de concentraţie obţinute cu ajutorul

metodei Biocip sunt comparabile cu cele obţinute prin metoda LC-

MS/MS. Doar pentru o singură probă au fost identificate reziduuri de

tilozină cu ajutorul Panelului Antimicrobian II, ceee ce nu s-a confirmat

prin metoda LC-MS/MS. Astfel, putem afirma că pentru tilozină, în

probe de miere, metoda Biocip a permis detectarea cu precizie a unei

valori mici de concentraţie, însă această concentraţie de 1.9 μg/kg nu a

fost detectată de metoda LC-MS/MS. Acest rezultat ar putea de

asemenea să indice faptul că sensibilitatea metodei Biocip este mult mai

înaltă decât cea a metodei LC-MS/MS.

Rezultatele comparative pentru cele 9 probe de miere pozitive

pentru reziduurile de antibiotice analizate sunt prezentate în tabelul

VI.9.

Rezultatele probelor pozitive identificate prin metoda Biocip şi

confirmate prin metoda LC-MS/MS au evidenţiat prezenţa aceloraşi

antibiotice la valori peste LMPN şi anume: ciprofloxacină,

norfloxacină, streptomicină, tilozină şi clortetraciclină.

Cele 9 probe pozitive de miere provin de la apicultori particulari

din diferite regiuni geografice din România.

Page 47: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

47

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Tabelul VI.9. Concentraţiile celor 6 clase de antibiotice în probele de

miere determinate prin metoda Biocip şi confirmate prin metoda LC-MS/MS Proba Metoda QNL

(µg/kg)

CEFT

(µg/kg)

TAF

(µg/kg)

STR

(µg/kg)

TYL

(µg/kg)

TCN

(µg/kg)

Proba

1

Biocip < LOD < LOD < LOD < LOD 3.4 < LOD

LC-

MS/MS

< LOD < LOD < LOD < LOD 6 < LOD

Proba

2

Biocip 10.4 < LOD < LOD 29 < LOD < LOD

LC-

MS/MS

Ciprofloxacină

5µg/kg,

Norfloxacină

7µg/kg

< LOD < LOD 22 < LOD < LOD

Proba

3

Biocip 54.9 < LOD < LOD 34.9 < LOD < LOD

LC-

MS/MS

Ciprofloxacină

41µg/kg,

Norfloxacină

10µg/kg

< LOD < LOD 28 < LOD < LOD

Proba

4

Biocip 12.7 < LOD < LOD < LOD < LOD 10.7

LC-

MS/MS

Ciprofloxacină

4µg/kg,

Norfloxacină

2µg/kg

< LOD < LOD < LOD < LOD Clor-

tetraciclină

8µg/kg

Proba

5

Biocip 11.4 < LOD < LOD 26.6 < LOD < LOD

LC-

MS/MS

Ciprofloxacină

7 µg/kg,

Norfloxacină

3µg/kg

< LOD < LOD 19 < LOD < LOD

Proba

6

Biocip < LOD < LOD < LOD 17.8 < LOD < LOD

LC-

MS/MS

< LOD < LOD < LOD 18 < LOD < LOD

Proba

7

Biocip 9.4 < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD

LC-

MS/MS

Ciprofloxacină

6µg/kg,

Norfloxacină

4µg/kg

< LOD < LOD < LOD < LOD < LOD

Proba

8

Biocip 24.6 < LOD < LOD 13.4 < LOD < LOD

LC-

MS/MS

Ciprofloxacină

3µg/kg,

Norfloxacină

15µg/kg

< LOD < LOD 11 < LOD < LOD

Proba

9

Biocip < LOD < LOD < LOD < LOD 1.9 < LOD

LC-

MS/MS

< LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD

Page 48: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

48

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Rezultatele obţinute în acest studiu sunt comparabile cu cele

existente în literatura de specialitate.

Vidal et al. (2009) au dezvoltat recent o metodă pentru

detectarea simultană a 16 antibiotice (macrolide, tetracicline, chinolone

şi sulfonamide). Majoritatea probelor de miere au fost achiziţionate din

supermarketuri, iar cinci dintre ele au fost colectate de la diferiţi

apicultori particulari din Granada şi Almería. Rezultatele studiului au

relevant un conţinut de 8,6 μg/kg în una din probele comercializate, în

timp ce o probă provenită de la un apicultor particular a prezentat urme

de sarafloxacină şi reziduuri de tilozină, sulfadimidină şi

sulfaclorpiridazină (Vidal et al., 2009).

Concluzii Sub aspectul performanţei analitice, metoda Biocip prezintă o

precizie excelentă atât în cadrul aceleeaşi serii analitice, cât şi în serii

analitice diferite, cu valori tipice mai mici de 15 % pentru concentraţiile

de 0,5, 1 şi 1,50 µg/kg. Limita de decizie (CCα) obţinută pentru cele 6

clase de chimioterapice antimicrobiene determinate s-a încadrat între

valorile 1,25 µg/kg şi 5,5 µg/kg. Capabilitatea de detecţie (CCβ) a

înregistrat valori situate în intervalul 2,05 - 8,81 µg/kg. Coeficientul de

recuperare obţinut s-a situat în domeniul 77– 125 % faţă de concentraţia

iniţială. Performanţele metodei Biocip au fost corespunzătoare,

rezultatele obţinute au fost comparabile cu valorile de concentraţie

determinate prin metoda confirmatorie, atât pentru probele pozitive cât

şi pentru probele negative.

Panelul Antimicrobian II reprezintă un sistem foarte eficient

pentru detectarea şi cuantificarea simultană multianalit pentru 6 clase

diferite de chimioterapice antimicrobiene în probe de miere.

Compararea rezultatelor obţinute prin metoda Biocip şi LC-MS/MS a

evidenţiat că metoda biosenzor propusă, prezintă adecvare la scopul

propus, şi anume determinarea concentraţiei fiecărui analit în parte, în

cadrul programelor europene de supraveghere a siguranţei alimentelor.

Page 49: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

49

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

CAPITOLUL VII - STUDIU EXPERIMENTAL AL

INFLUENŢEI REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE

(SULFONAMIDE) DIN MIERE ASUPRA UNOR

PARAMETRI BIOCHIMICI, IMUNOLOGICI ŞI

HEMATOLOGICI LA ANIMALE DE LABORATOR

Scopul cercetării

Obiectivele cercetărilor incluse în acest capitol au urmărit

studierea influenţei unor reziduuri medicamentoase (sulfonamide) din

mierea de albine asupra şobolanilor, rasa Wistar prin:

• evaluarea modificărilor valorilor plasmatice ale parametrilor

implicaţi în reacţiile de hipersensibilitate de tip alergic prin analizarea

variaţiei valorilor serice ale citokinelor: interleukina IL-2, IL-4, IL-6,

IL-8, IL-10, factorul de creştere al endoteliului vascular (VEGF),

interferon gamma (IFNγ), factor de necroză tumorală alfa (TNFα), IL-

1α, IL-1β, MCP-1, factorul de creştere epidermică (EGF), înainte şi

după administrarea de miere de albine conţinând un amestec de

sulfonamide (20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina,

sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol, sulfadimetoxina)

• evaluarea unor parametri biochimici (uree, creatinină, acid

uric, bilirubină totală, bilirubină directă, aspartat aminotransferaza -

AST, alanin aminotransferaza - ALT, triiodotironina - T3, tiroxina - T4)

şi hematologici (hematocrit - Hct, hemoglobina - Hb, numărătoare

globule roşii - RBC, concentraţia medie a hemoglobinei dintr-un volum

dat de eritrocite - MCHC, volum eritrocitar mediu - MCV) după

administrare de miere conţinând sulfonamide.

Introducere

Chimioterapicele antimicrobiene sunt eficiente împotriva bolilor

albinelor, însă reziduurile medicamentoase pot să persiste o perioadă

mai mare de timp în ţesuturi (uneori chiar şi o lună), iar consumul de

miere care conţine astfel de reziduuri reprezintă un potenţial risc pentru

sănătatea omului. Literatura include date privind toxicitatea acestor

compuşi.

Page 50: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

50

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Intensitatea acţiunii, durata de acţiune şi toxicitatea

sulfonamidelor derivă din capacitatea organismului de a le transforma

în sulfonilamidă, activitatea antibacteriană datorându-se structurii

sulfanilamidice. Prezenţa grupei metoxi pe radicalii heterociclici

determină o întârziere a eliminării din organism şi o acţiune prelungită

(Castrejon, 2010).

Se consideră că sulfonamidele au o toxicitate medie care include

tulburări gastrointestinale (greaţă, vomă, diaree), reacţii de

hipersensibilitate (alergice) care constau în erupţii cutanate, eozinofilie,

rareori şoc anafilactic; la persoanele cu deficit genetic de glucozo-6-

fosfat dehidrogenază a enterocitelor poate apărea anemia hemolitică.

Sulfamidele au acţiune competitivă cu bilirubina pentru situsurile de

legare ale acesteia şi de aceea nu trebuie administrate în ultimul

trimestru de sarcină şi la nou-născut. Bilirubina nelegată se poate

depozita în ganglionii bazali ai creierului şi în subtalamus, determinând

encefalopatie toxică (icter nuclear – Kernicterus) (Naisbitt et al., 2001;

Verdel et al., 2006 ).

În urma biotestelor efectuate la rozătoare s-a raportat că

sulfametazinul produce tumori cu diferite localizări; de asemenea au

fost prezentate dovezi privind toxicitatea sulfonamidelor asupra glandei

tiroide (Finkelman, 2007). Unele sulfonamide inhibă prin mecanism

competitiv lactoperoxidaza şi tiroid peroxidaza, mediatori în sinteza

hormonilor tiroidieni, putând conduce la hipertiroidism.

În plus sulfonamidele pot da uneori febra medicamentoasă,

boala serului şi lupus eritematos sistemic (hipersensibilitate de tip III

mediată de imunoglobulinele G), toxicitate hepatică (inclusiv necroza).

Sulfonamidele pot da reacţii alergice severe, incluzând toxicitate

hepatică şi hematologică, pe lângă toxicitatea dermatologică. Şi reacţiile

de fotosensibilizare sunt relativ frecvente la sulfonamide. Aproximativ

3% din populaţie este afectată de reacţii alergice la sulfonamide.

Citotoxicitatea compuşilor hidroxilaminici asupra limfocitelor umane a

fost demonstrată prin studii in vitro (Contreras, 2003). Aceşti compuşi

produc ocazional un număr de reacţii alergice (hipersensibilitate), de la

rash-uri tegumentare minore (inclusiv reacţii maculopapulare şi reacţii

Page 51: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

51

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

de tip pruriginos care apar tipic după o săptămână de tratament), până la

reacţii severe sau care pun uneori în pericol viaţa pacienţilor cum ar fi:

eritemul multiform, sindromul Stens-Johnson şi necroliza epidermică

toxică. Reacţiile de hipersensibilitate la niveluri terapeutice de

sulfonamide, au fost intens studiate în schimb nu s-au raportat cazuri

de alergie la sulfonamide datorită ingestiei de alimente contaminate cu

reziduuri medicamentoase, însă manifestările specifice ar fi greu de

recunoscut la doze atât de mici. Deoarece în publicaţiile din literatura

de specialitate sunt disponibile doar date limitate am decis efectuarea

unei evaluări mai complete pentru acest aspect.

Biomarkerii care evidenţiază reacţile de hipersensibilitate sunt

citokinele, imunoglobulinele E, limfocitele şi histamina.

Evidenţierea răspunsului imun la şobolani după administrare

de miere conţinând sulfonamide

Protocol experimental

Studiul s-a desfăşurat pe 2 loturi de şobolani care au consumat

miere conţinând amestec de sulfonamide (100 µg/kg amestec de 5

sulfonamide - 20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina,

sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol, sulfadimetoxina);

concentraţiile citokinelor obţinute au fost comparate cu valorile obţinute

pentru lotul martor. Fiecare lot a inclus 15 şobolani, pentru ca

semnificaţia statistică să fie acceptabilă, iar lotul martor a fost format

din 10 şobolani.

Pentru acest studiu s-au selecţionat femele de şobolani rasa

Wistar cu greutate de 180 - 220 g. Şobolanii au fost împărţiti în 3 loturi:

l - lot de control – administrare prin gavaj gastric de hrană standard şi 2

ml miere de albine, lotul 2 - şobolani cărora li s-au administrat prin

gavaj gastric timp de 5 zile, miere cu amestec de sulfonamide şi lotul 3

- şobolani cărora li s-au administrat prin gavaj gastric 2 ml de miere

îmbogăţită cu 100 µg/kg amestec de sulfonamide, timp de 14 zile

consecutiv.

Page 52: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

52

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e U

niversitatea d

e Med

icină şi Farm

acie „Grigo

re T. Po

pa” - Iaşi, Facu

ltatea de Farm

acie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Studiul a fost realizat în conformitate cu aprobarea emisă de

către Comitetul de Etică a Cercetării al Universităţii de Medicină şi

Farmacie "Grigore T. Popa "- Iaşi.

Material şi metodă

Determinările cantitative ale citokinelor, s-au efectuat pe

analizorul Evidence Investigator (Randox Laboratories, UK),

determinările cantitative ale imunoglobulinei E (IgE) s-au efectuat pe

aparatul Stat Fax 303 Plus (Awareness Technology, SUA), iar

eozinofilele s-au determinat pe analizorul automat de hematologie,

model Sysmex XT 1800i (Sysmex Europe Gmbh, Germania).

Reactivi:

Rectivi pentru determinarea simultană a 12 citokine: IL-2,

IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, IFNγ, TNFα, IL-1α, IL-1β, MCP-1,

EGF sunt furnizaţi într-un kit compact care cuprinde:

Kit High Sensitivity Cytokine Array I (cod EV3623,

producător Randox Laboratories, UK)

Control : Multianalit Control (Randox Laboratories, UK)

utilizat pentru verificarea preciziei şi acurateţii metodei

Reactivi pentru determinările de IgE: kit ELISA (Clin Pro

Internaţional, SUA), cod EH-518

Reactivi pentru determinarea hemoleucogramei sunt

reactivi dedicaţi pentru analizorul automat de hematologie Sysmex XT

1800i.

Prelucrarea şi interpretarea statistică

Datele obţinute au fost prelucrate statistic în vederea eliminării

variaţiilor biologice şi a erorilor de determinare şi totodată pentru

validarea rezultatelor studiului. S-a efectuat în acest scop descrierea

statistică a eşantioanelor de probe pentru obţinerea descriptorilor de

interes (medie, mediană, eroare standard a mediei - ES, deviaţie

standard, varianţă, amplitudine, coeficient Skewness, coeficient

Kurtosis).

Prelucrarea şi reprezentarea grafică a datelor s-a realizat

utilizând module de lucru ale softurilor MedCalc şi Microsoft Office

2007.

Page 53: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

53

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Testele statistice aplicate: pentru probele cu valori normal

distribuite au fost t-Student pentru probe independente cu varianţe egale

şi t-Student pentru probe independente cu varianţe inegale, iar pentru

cele a căror distribuţie nu a putut fi normalizată - testul Mann-Whitney.

Pentru a verifica normalitatea distribuţiei datelor s-au utilizat

testele D’Agostino-Pearson şi Kolmogorov-Smirnov.

Rezultate

A. Analiza comparativă a rezultatelor parametrilor

analizaţi Rezultatele obţinute pentru determinarea citokinelor, IgE şi

eozinofilelor în urma administrării de miere conţinând reziduuri de

sulfonamide la şobolani Wistar sunt redate în tabel VII..4.

Media valorilor obţinute pentru citokine, IgE şi eozinofile în

cadrul loturilor analizate este prezentată în fig.VII.9 - VII.10.

Page 54: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e albin

e

54

Fig.VII.9: Variaţia valorilor interleukinelor Th-1 derivate (A), Th-2 derivate (B) şi APC derivate (C)

Fig. VII.10: Variaţia valorilor factorilor de creştere (A), a valorilor IgE (B) şi eozinofilelor (C)

B

5,39

16,14

14,19

2,85

9,288,37

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Lot 1 Lot 2 Lot 3

0

2

4

6

8

10

12

De

via

tia

sta

nd

ard

a m

ed

iei

IL-4

(pg/mL)

IL-10

(pg/mL)

Page 55: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

55

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Tabelul VII.4: Tabelul sinoptic al rezultatelor determinărilor de

citokine, IgE şi eozinofile Parametru

determinat

Media ± DS

Lot 1 (n = 10) Lot 2 (n = 15) Lot 3 (n = 15)

Interleukine Th-1

derivate (pg/ml)

IL-2 4,96 ± 0,73± 6,57± 0,72 6,75± 0,73

IFN-γ 4,07± 0,45 6,80 ± 0,85 6,71 ± 0,78

Interleukine Th-2

derivate (pg/ml)

IL-4 5,39 ± 0,73 14,19 ± 2,35 16,14 ± 2,87

IL-10 2,85 ± 0,28 9,28 ± 2,92 8,37 ± 2,13

Interleukine APC

derivate (pg/ml)

IL-1α 3,22 ± 0,47 3,17 ± 0,35 2,57 ± 0,21

IL-1β 4,68 ± 1,24 3,84 ± 1,29 5.99 ± 2.07

IL-6 5,23 ± 0,50 9,85 ± 2,50 8,16 ± 1,39

IL-8 4,58 ± 0,67 9,34 ± 2,07 8,56 ± 2,07

TNF-α 3,04 ± 0,24 4,66 ± 0,48 4,93 ± 0,54

Factori de creştere

(pg/ml)

VEGF 2,91 ± 0,36 8,53 ± 1,91 8,59 ± 1,91

MCP1 137,1 ± 1,26 150,51 ± 4,03 148,31 ± 3,62

EGF 4,76 ± 0,63 6,72 ± 0,81 6,85 ± 1,00

IgE (UI/ml) 2,05 ± 0,34 14,43 ± 2,52 16,03 ± 3,08

Eozinofile (%) 2,42 ± 0,42 7,18 ± 0,90 8,33 ± 0,96

B. Analiza corelaţiei rezultatelor citokinelor implicate în

reacţia alergică cu rezultatele IgE şi a eozinofilelor.

Valorile fiecărui lot examinat au fost considerate ca fiind diferite

semnificativ statistic faţă de celelalte pentru un anumit parametru atunci

când probabilitatea de eroare a fost mai mică de 0,05 (p < 0,05).

Pentru compararea variabilelor cantitative s-a folosit indicele de

corelaţie Pearson (r). Procentul în care valorile variabilelor analizate

sunt realmente corelate este indicat de coeficientul de corelare Pearson

(R2

).

Analiza parametrilor luaţi în studiu pentru fiecare lot şi corelaţia

între valorile lor cu ajutorul indicelui de corelaţie Pearson este ilustrată

în tabel VII.19- VII.20.

Page 56: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e albin

e

56

Tabelul VII.19: Analiza corelaţiei citokinelor cu IgE Interleukine Th-1

derivate

Interleukine Th-2

derivate

Interleukine APC derivate Factori de creştere

IL-2

(pg/ml)

IFN-γ

(pg/ml)

IL-4

(pg/ml)

IL -10

(pg/ml)

IL-1α

(pg/ml)

IL-1β

(pg/ml)

IL-6

(pg/ml)

IL-8

(pg/ml)

TNF-α

(pg/ml)

VEGF

(pg/ml)

MCP1

(pg/ml)

EGF

(pg/ml)

Lot

1

r 0,2434 -0,1098 -0,3065 -0,0486 0,0492 0,1340 -0,1928 -0,3676 0,2860 -0,3950 -0,2191 -0,2606

P 0,4981 0,7627 0,3891 0,8939 0,8926 0,7121 0,5935 0,2960 0,4231 0,2586 0,5431 0,4670

R2 0,0592 0,0121 0,0939 0,0024 0,0024 0,0180 0,0372 0,1351 0,0818 0,1560 0,0480 0,0679

Lot

2

r 0,0586 -0,3220 0,8579 0,5250 -0,0299 0,1240 -0,00357 0,1639 0,5319 0,1500 -0,1570 -0,1875

P 0,8357 0,2418 < 0,0001*** 0,0445* 0,9158 0,6597 0,9899 0,5594 0,0413* 0,5936 0,5763 0,5034

R2 0.0034 0,1037 0,7360 0,2756 0,0009 0,0154

0,1274 x

10-6 0,0269 0,2829 0,0225 0,0246 0,0352

Lot

3

r 0,5887 0,6019 0,7537 0,3130 0,5582 0,4170 0,3137 0,2180 0,3160 -0,1235 0,3933 0,1560

P 0,0210* 0,0176 0,0012** 0,2560 0,0306* 0,1220 0,2548 0,4350 0,2512 0,6610 0,1469 0,5788

R2 0,3466 0,3622 0,5681 0,0980 0,3115 0,1739 0,0984 0,0475 0,0999 0,0153 0,1547 0,0243

p < 0.05 semnificativ(*), p ≤ 0,01 distinct semnificativ (**), p ≤ 0,001 foarte semnificativ (***)

Page 57: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

57

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e albin

e

57

Tabelul VII.20: Analiza corelaţiei citokinelor cu eozinofilele Interleukine Th-1

derivate

Interleukine Th-2

derivate

Interleukine APC derivate Factori de creştere

IL-2

(pg/ml)

IFN-γ

(pg/ml)

IL-4

(pg/ml)

IL -10

(pg/ml)

IL-1α

(pg/ml)

IL-1β

(pg/ml)

IL-6

(pg/ml)

IL-8

(pg/ml)

TNF-α

(pg/ml)

VEGF

(pg/ml)

MCP1

(pg/ml)

EGF

(pg/ml)

Lot 1 r 0,3426 -0,1593 -0,4433 -0,4420 0,2597 0,0545 -0,4268 -0,2998 -0,0303 0,0909 -0,3271 -0,5131

P 0,3325 0,6601 0,1994 0,2009 0,4687 0,8811 0,2187 0,4001 0,9338 0,8028 0,3563 0,1293

R2 0,1174 0,0254 0,1966 0,1954 0,0674 0,0030 0,1821 0,0898 0,0009 0,0083 0,1070 0,2633

Lot 2 r -0,0184 0,0025 0,6865 0,4610 -0,1119 0,2600 0,0179 0,1183 0,2401 0,2640 -0,0340 -0,1516

P 0,9482 0,9928 0,0047** 0,0837 0,6913 0,3493 0,9495 0,6747 0,3888 0,3417 0,9043 0,5897

R2 0,0003

0,0645 x 10-

4 0,4713 0,2125 0,0125 0,0676

0,3204 x

10-3 0,0140 0,0576 0,0697 0,0012 0,0230

Lot 3 r 0,5280 0,3553 0,5857 0,2930 0,6600 0,4630 0,1905 0,2630 0,4650 -0,0895 0,3627 0,0948

P 0,0431* 0,1937 0,0218* 0,2892 0,0074** 0,0822 0,4964 0,3436 0,0807 0,7512 0,1840 0,7368

R2 0,2788 0,1263 0,3431 0,0858 0,4356 0,2144 0,0363 0,0692 0,2162 0,0080 0,1315 0,0090

p < 0.05 semnificativ(*), p ≤ 0,01 distinct semnificativ (**), p ≤ 0,001 foarte semnificativ (***)

Page 58: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

58

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e alb

ine

Discuţii

Reacţiile de hipersensibilitate/întârziată tip IV, mediate de

citokine eliberate de celulele T sensibilizate, activează cascada reacţiilor

sistemului imunitar implicată în producerea leziunilor tisulare

(Castrejon et al., 2010).

În urma măsurării concentraţiilor citokinelor serice APC

derivate la loturile de şobolanii studiate putem concluziona că citokine

au prezentat valori serice semnificativ crescute ale IL-1α, IL-1β, IL-6,

IL-8, TNF-α în cadrul loturilor 2 şi 3 comparativ cu lotul martor,

concentraţiile medii fiind corelate cu perioada de timp pe care s-a

desfaşurat administrarea de miere cu sulfonamide.

Rezultatele obţinute concordă cu mecanismele imunologice şi

datele prezentate în literatură, în cadrul studiilor privitoare la reacţiile

de hipersensibilitate la sulfonamide. Astfel, interleukinele IL-1α, IL-1β,

IL-6, IL-8, TNF-α sunt produse de către celulele dendritice mature

numite, grupate sub denumirea de interleukine APC (antigen-presenting

cell) derivate, ele având un rol crucial în iniţierea răspunsului imun de

către limfocitele T. (Sallusto, Lanzavecchia, 1994).

Concluzii

În urma măsurării concentraţiilor citokinelor serice la loturile de

şobolanii studiate putem concluziona că citokinele analizate prezintă

profil dublu pro-inflamator şi anti-inflamator şi diferă de cele ale

şobolanilor din lotul martor. Douăsprezece componente diferite, atât

pro- cât şi anti-inflamatorii, au fost analizate: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-

10, VEGF, IFNγ, TNF, IL-1α, IL-1β, MCP-1 şi FEG.

Evaluarea modificărilor profilului de citokine după

administrarea de miere conţinând sulfonamide a condus la rezultate care

evidenţiază faptul că la şobolanii care au consumat miere conţinând

sulfonamide nivelurile de citokine IL-4 şi IL-10, împreună cu IgE şi

eozinofilele plasmatice au crescut de 5-30 ori. Prin contrast, nu s-au

observat concentraţii semnificativ crescute ale citokinelor pro-

inflamatorii, cum ar fi TNF, IL-1α sau IL-1β. Concentraţiile citokinelor

studiate, care sunt indici de hipersensibilitate, sunt crescute în sânge şi

se corelează cu prezenţa de eozinofilie la şobolani, după ingestia de

Page 59: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

59

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

miere conţinând sulfonamide. Celelalte tipuri de citokine au fost uşor

crescute, cu nivele de concentraţie care, în studiul de faţă nu par a fi

corelate cu biomarkerii indicatori de hipersensibilitate.

Valorile obţinute pentru citokinele IL-4 şi IL-10, împreună cu

IgE şi eozinofilele indică un răspuns maxim după o expunere timp de

14 zile, diferenţele fiind semnificative statistic comparativ cu lotul

martor.

Determinarea citokinelor plasmatice este un instrument util în

studiul reacţiilor de hipersensibilitate de tip întârziat la şobolani.

Evaluarea parametrilor biochimici şi hematologici la şobolani

după administrare de miere conţinând reziduuri de

sulfonamide

Protocol experimental

Studiul s-a desfăşurat pe 1 lot de şobolani care a consumat miere

conţinând amestec de sulfonamide (100 µg/kg amestec de 5

sulfonamide - 20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina,

sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol, sulfadimetoxina), iar

concentraţiile obţinute pentru parametri biochimici, hematologici şi

imunologici au fost comparate cu valorile obţinute pentru lotul martor.

Fiecare lot a inclus 5 şobolani, număr minim necesar pentru ca

semnificaţia statistică a studiului să fie acceptabilă.

Material şi metodă

Determinările cantitative ale parametrilor biochimici (uree,

creatinină, acid uric, bilirubină totală, bilirubină directă, AST, ALT)

vizaţi de experimentul realizat s-au efectuat pe analizorul automat Rx

Imola (Randox Laboratories, UK), parametrii imunologici (T3, T4) s-au

efectuat pe aparatul Stat Fax 303 Plus (Awareness Technology, SUA),

iar parametri hematologici s-au efectuat pe analizorul automat de

hematologie, model Sysmex XT 1800i (Sysmex Europe Gmbh,

Germania).

Page 60: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

60

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Reactivi:

Rectivi pentru determinări biochimice sunt produşi de

firma Randox Laboratories, UK şi sunt reactivi dedicaţi pentru

analizorul automat Rx Imola:

Kit pentru determinarea cantitativă a ureei în ser, plasmă şi

urină prin metoda cinetică enzimatică, cod UR3825

Kit pentru determinarea cantitativă a creatininei în ser, plasmă

şi urină prin metoda colorimetrică, cod CR3814

Kit pentru determinarea cantitativă a acidului uric în ser,

plasmă şi urină prin metoda enzimatică colorimetrică, cod UA3824

Kit pentru determinarea cantitativă a bilirubinei totale în ser

sau plasmă prin metoda colorimetrică, cod BR3859

Kit pentru determinarea cantitativă a bilirubinei directe în ser

sau plasmă prin metoda colorimetrică, cod BR3807

Kit pentru determinarea cantitativă a activităţii

aspartataminotransferazei în ser sau plasmă prin metoda UV (IFCC)

Kit pentru determinarea cantitativă a activităţii

alaninaminotransferazei în ser sau plasmă prin metoda UV (IFCC)

Reactivi pentru determinările imunologice:

Kit pentru determinarea T3 (triiodotironina), cod EH-500,

producător Clin Pro Internaţional, SUA.

Kit pentru determinarea T4 (tetraiodotironina sau tiroxina),

cod EH-501, producător Clin Pro Internaţional, SUA.

Reactivi pentru determinarea eozinofilelor

(hemoleucograma) sunt reactivi dedicaţi pentru analizorul automat de

hematologie Sysmex XT 1800i.

Rezultate

Rezultatele obţinute pentru parametri biochimici, imunologici şi

hematologici în urma administrării de miere conţinând reziduuri de

sulfonamide la şobolani Wistar sunt redate în tabel VII.26

Page 61: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

61

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Tabelul VII.26: Tabelul sinoptic pentru valorile obţinute pentru

parametri biochimici ºi hematologici după administrare de miere cu reziduuri

de sulfonamide la şobolani Parametru

determinat

Media ± DS

Lot 1 (n = 5) Lot 2 (n = 5)

Creatinină (mg/dl) 0,45 ± 0,05 0,72 ± 0,03

Uree (mg/dl) 17,04 ± 3,80 18,36 ± 0,87

Acid uric (mg/dl) 1,71 ± 0,29 2,40 ± 0,42

Bilirubina totală (mg/dl) 0,62 ± 0,04 1,27 ± 0,09

Bilirubina directă (mg/dl) 0,08 ± 0,017 0,32 ± 0,070

AST (U/l) 60,71 ± 8,66 109,57 ± 7,36

ALT (U/l) 72,75 ± 4,14 128.23 ± 5,99

T4 (µg/dl) 4,50 ± 0,30 3,32 ± 0,21

T3 (ng/dl) 0,70 ± 0,14 0,34 ± 0,03

Hct (%) 47,80 ± 3,69 52,70 ± 6,64

VEM (MCV) (fL) 81,60 ± 6,13 98,50 ± 5,49

RBC (milioane/mm3) 9,72 ± 1,14 5,14 ± 0,38

Hb (g/dl) 16,10 ± 0,92 14,50 ± 1,16

CHEM (MCHC) (g/dl) 38,.60 ± 2,79 34,50 ± 2,20

Concluzii

Rezultatele obţinute evidenţiază variaţii moderate în cadrul

loturilor luate în studiu. Concentraţiile serice ale alanin

aminotransferazei şi ale aspartat aminotransferazei au crescut în urma

administrării de miere cu sulfonamide, comparativ cu valorile

determinate la lotul martor.

Aceste rezultate sunt în concordanţă cu date din literatura de

specialitate, conform cărora acţiunea toxică a sulfonamidelor, chiar

administrate în cantităţi foarte mici, se manifestă prin perturbarea

parametrilor hepatici la animalele de laborator (Hess et al., 1999).

Astfel, activitatea ALT şi activitatea AST au înregistrat creşteri

semnificative statistic (p < 0,0001) la şobolanii care au primit miere cu

sulfonamide, comparativ cu lotul de control, evidenţiind astfel

modificarea permeabilităţii membranei hepatocitului.

Page 62: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

62

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Valorile concentraţiei bilirubinei directe variază asemănător cu

cele ale bilirubinei totale, astfel, pentru lotul care a consumat miere cu

sulfonamide, valorile bilirubinei directe au fost de 0,32 mg/dl ± 0,07

faţă de 0,08 mg/dl ± 0,017 înregistrate pentru lotul martor.

Cercetările noastre au înregistrat o creştere nesemnificativă

statistic a uremiei, la 18,36 ± 0,87 mg/dl pentru lotul tratat cu

sulfonamide, comparativ cu lotul de referinţă pentru care concentraţia

medie a ureei a fost 17,04 ± 3,80.

Efectul administrării de miere cu sulfonamide la şobolani asupra

funcţiei renale s-a concretizat în creşterea semnificativă a valorilor

concentraţiilor acidului uric şi creatininei în cadrul lotului test

comparativ cu lotul martor.

În literatura de specialitate nu există date suficiente cu privire la

modificarea parametrilor biochimici determinaţi în prezentul studiu ca

urmare a toxicităţii datorate administrării de miere cu sulfonamide.

Rezultatele obţinute pentru valorile triiodotironinei (T3)

sugerează confirmarea ipotezei conform căreia sulfonamidele interferă

în sinteza hormonilor tiroidieni.

Valorile plasmatice ale tiroxinei (T4) au scăzut foarte

semnificativ la animalele care au consumat miere cu sulfonamide,

comparativ cu lotul martor. Rezultatele sunt concordante cu cele

obţinute de Cribb et al.(1996).

CAPITOLUL VIII - CONCLUZII GENERALE.

CONTRIBUŢII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE

CERCETARE

Concluzii generale În urma rezultatelor obţinute la validarea metodei Biocip pentru

cele 3 Paneluri Antimicrobiene, dar şi la determinările cantitative

efectuate pe diferite probe de miere, putem concluziona următoarele:

Page 63: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

63

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

metoda biosenzor propusă este adecvată scopului şi anume

pentru determinarea concentraţiei fiecărui analit în parte, în cadrul

programelor de supraveghere a siguranţei alimentelor.

metoda Biocip utilizată prezintă avantajul că nu necesită

extracţia analitului din matricea biologică cu solvenţí organici.

tehnica multiplexarii permite detecţia simultană, dintr-o

singură probă, minimalizând astfel variaţiile biologice, variaţiile

analitice şi de stabilitate. Detectarea se realizează prin

chemiluminiscenţă indusă enzimatic, iar fiecare biocip conţine opţiunea

de controale incluse.

această tehnică de multiplexare are de asemenea largi

implicaţii atât asupra cantităţii de probă cât şi asupra vitezei de testare,

permiţând posibilitatea obţinerii unui număr mare de rezultate (540

determinări) într-un timp scurt.

determinarea reziduurilor medicamentoase prin metoda

Biocip nu necesită operaţii adiţionale (derivatizare), echipamente şi

accesorii suplimentare, prin urmare este mai puţin laborioasă, şi implică

costuri mai mici comparativ cu metodele cromatografice.

volumul de reactiv utilizat pentru un test este mai mic decât la

oricare alt sistem. Un volum total de reacţie de 350 µl este necesar

pentru toate testele dintr-un panel antimicrobian.

Acest avantaj al metodei Biocip presupune un spaţiu de stocare

redus şi producerea unor cantităţi mai mici de deşeuri biologice

periculoase.

toţi reactivii utilizaţi pentru sistemul Evidence Investigator au

coduri de bare făcând sistemul foarte uşor de folosit şi facilitând

eficientizarea timpului de lucru şi a costurilor.

Obiectivele cercetărilor din această teză au inclus şi studiul

influenţei reziduurilor sulfonamidelor din mierea de albine asupra

şobolanilor Wistar prin evaluarea modificărilor valorilor plasmatice ale

parametrilor implicaţi în reacţiile de hipersensibilitate de tip alergic prin

analizarea variaţiei valorilor serice ale citokinelor: interleukina IL-2, IL-

4, IL-6, IL-8, IL-10, factorul de creştere al endoteliului vascular

Page 64: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

64

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

(VEGF), interferon gamma (IFNγ), factor de necroză tumorală alfa

(TNFα), IL-1α, IL-1β, MCP-1, factorul de creştere epidermică (EGF),

înainte şi după administrarea de miere de albine conţinând un amestec

de sulfonamide (20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina,

sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametoxazol, sulfadimetoxina).

În urma măsurării concentraţiilor citokinelor serice APC

derivate la loturile de şobolanii incluse în experiment putem

concluziona că citokinele au prezentat valori serice semnificativ

crescute pentru IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α în cadrul loturilor 2 şi 3

comparativ cu lotul martor, concentraţiile medii fiind corelate cu

perioada de timp în care s-a desfaşurat administrarea de miere

conţinând sulfonamide. Rezultatele obţinute concordă cu mecanismele

imunologice şi datele prezentate în literatură, în cadrul studiilor

privitoare la reacţiile de hipersensibilitate la sulfonamide.

După administrarea de miere cu sulfonamide, parametrii

biochimici, hematologici şi imunologici (hormonii tiroidieni) la lotul

căruia i s-a administrat miere conţinând sulfonamide, comparativ cu

lotul de control, au înregistrat modificări după cum urmează:

1. Evoluţia valorilor alanil aminotransferazei, evidenţiază

creşteri semnificative ale activităţii acesteia (p < 0,0001), sugerând

permeabilizarea membranei hepatocitului şi migrarea sa în spaţiul

intercelular. Dinamica valorilor determinate pentru AST sugerează că ar

avea loc migrarea AST din citoplasma hepatocitelor în spaţiul

intercelular datorită creşterii permeabilităţii membranare. Această

permeabilizare a membranei hepatocitului poate fi consecinţa lezării

consecutive legării sulfonamidelor sau a unor metaboliţi ai acestora de

proteinele membranare.

Bilirubina totală a înregistrat o creştere de 48,81%. Rezultatele

obţinute în urma determinării concentraţiilor plasmatice ale bilirubinei

totale şi bilirubinei directe confirmă afectarea severă a funcţiei hepato-

biliare în urma administrării timp de 14 zile, prin gavaj gastric, a mierii

conţinând sulfonamide. Parametrii de investigare a funcţiei renale au

înregistrat concentraţii crescute la lotul testat, ca urmare a toxicităţii

datorate administrării de miere conţinând sulfonamide. Astfel, s-au

Page 65: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

65

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

înregistrat creşteri ale creatininei, ureei şi acidului uric în procente de

60 %, 7,74%, respectiv 40,35%.

2. Parametrii hematologici au înregistrat variaţii semnificative.

Modificările indicilor hematologici în sensul reducerii semnificative a

numărului de eritrocite, a cantităţii de hemoglobină şi a valorii

hematocritului au evidenţiat instalarea unei anemii eritrocitare la lotul

testat.

3. Investigarea funcţiei tiroidiene prin determinarea T3 şi T4 şi

urmărirea raportului acestora a evidenţiat scăderea foarte semnificativă

a valorilor plasmatice ale tiroxinei la animalele care au consumat miere

conţinând sulfonamide, comparativ cu lotul martor.

Contribuţii originale Sintetizând activitatea de cercetare din studiile efectuate în

cadrul acestei teze de doctorat se remarcă următoarele elemente de

originalitate:

validarea unei metode de analiză cantitativă a reziduurilor

medicamentoase (antibiotice, sulfonamide, nitrofurani şi chinolone) din

mierea de albine prin metoda Biocip, metodă care se distinge atât prin

precizie şi acurateţe, liniaritate, limită de decizie şi capabilitate de

detecţie, randament de recuperare, cât şi prin simplitatea şi uşurinţa

metodologiei de lucru, prin costuri reduse pentru aparatură şi reactivi,

comparativ cu metodele gaz cromatografice sau lichid cromatografice

utilizate în prezent;

tehnologia Biocip simplifică metodologia de confirmare a

prezenţei reziduurilor medicamentoase prin posibilitatea de cuantificare

şi identificare individuală a substanţelor antimicrobiene utilizate în

tratamentul bolilor la albine şi care se regăsesc ca reziduuri în miere;

determinarea conţinutului în reziduuri medicamentoase al

mierii de albine disponibilă pe piaţa românească utilizând metoda

Biocip evită obţinerea unor rezultate fals pozitive;

tehnologia Biocip permite identificarea individuală a

citokinelor, biomarkeri care evidenţiază reacţiile de hipersensibilitate;

Page 66: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

66

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

realizarea unui model experimental pe animale de laborator

care a avut ca obiectiv major identificarea reacţiilor de hipersensibilitate

cu manifestări alergice la doze foarte mici datorate ingestiei de miere

conţinând sulfonamide, precum şi repercusiunile generate de aceste

reziduuri medicamentoase la nivel biochimic, imunologic şi

hematologic. În literatura de specialitate sunt disponibile doar date

limitate referitoare la dozarea citokinelor plasmatice, un instrument util

în studiul reacţiilor de hipersensibilitate de tip întârziat la şobolani.

Perspective de cercetare Rezultatele obţinute în cadrul prezentei teze de doctorat oferă

posibilitatea orientării către noi direcţii de cercetare:

continuarea determinărilor cantitative ale reziduurilor

medicamentoase în alte produse apicole (polen, lăptişor de matcă,

propolis);

extinderea cercetărilor din mierea de albine prin validarea

metodei Biocip pentru încă 3 sulfonamide şi anume: sulfametoxazol

(SMX), sulfamonometoxină(SMM) şi trimetoprim (TMP) incluse în

Panelul Antimicrobian I Plus;

extinderea determinărilor cantitative de citokine şi la IL-5 şi

IL-13 care sunt indici de hipersensibilitate şi care nu au fost evaluate în

acest experiment şi corelarea rezultatelor din ambele studii;

evaluarea modificărilor parametrilor biochimici, hematologici

şi a stresului oxidativ în cadrul studierii toxicităţii reziduurilor

metaboliţilor de nitrofurani la şobolani ca urmare a administrării prin

gavaj gastric de miere de albine conţinând aceste reziduuri;

revizuirea legislaţiei privind siguranţa alimentului, prin

introducerea unor limite maxime admisibile vizând prezenţa

reziduurilor medicamentoase în mierea de albine şi în alte produse

apicole. Se cunoaşte faptul că depistarea reziduurilor în miere în urma

controalelor întreprinse de organismele autorizate, poate duce la

sancţiuni financiare pentru producătorii acesteia, la retrageri de pe piaţă

a loturilor corespunzătoare şi la declanşarea unor alerte de siguranţă.

Page 67: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

67

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Bibliografie selectivă

Andriþoiu V. Mierea. In cap.VI Produse apicole, Apiterapia în

planningul familial, tezã de disertaþie, Arad, 2006; 162-166.

Ashiralieva A, Genersch E. Reclassification, genotypes and virulence of

Paenibacillus larvae, the etiological agent of American

foulbrood in honeybees - a review. Apidolologie 2006; 37: 411–

420.

Beaune P, Diserens JM, Reybroeck W. Proficiency Testing of Charm II

Tests for Residue Control of honey. Proceedings of the 39th

Apimondia International Agricultural Congress, Dublin, Ireland,

August 21-26, 2005: 33-34. Bogdanov S. Contaminants of bee products, Apidologie 2006; 37, 1-18.

Bogdanov S. Current state of analytical methods for the detection of

residues in bee products. Apiacta 2003; 38, 399-409

Bonvehý´ JS and Coll FV. Flavour index and aroma profiles of fresh

and processed honeys. J Sci Food Agr 2003; 83, 275.

Bura M, Pătruică S, Bura VA. Tehnologia apicolă. Timişoara: Editura

Waldpress, 2008, 235-249.

Castrejon JL, Lavergne SN, El-Sheikh A et al. Metabolic and chemical

origins of cross-reactive immunological reactions to arylamine

benzenesulfonamides: T-cell responses to hydroxylamine and

nitroso derivatives. Chem Res Toxicol 2010; 23:184-92.

Contreras JP, Ly NR, Gold DR, et al. Allergen-induced cytokine

production, atopic disease, IgE, and wheeze in children. J

Allergy Clin Immun 2003; 112:1072–1077.

Cribb AE, Lee BL, Trepanier LA, Spielberg SP. Adverse reactions to

sulphonamide and sulphonamide-trimethoprim antimicrobials:

clinical syndromes and pathogenesis. Adverse Drug React

Toxicol Rev 1996; 15: 9-50.

Decizia 2002/657/CE din 12 august 2002 de aplicare a Directivei

96/23/CE a Consiliului în ceea ce priveşte performanţa

metodelor analitice şi interpretarea rezultatelor. JOUE 2002, L

221:8.

Page 68: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

68

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Decizia 2003/181/CE din 13 martie 2003 de modificare în ceea ce

priveşte stabilirea limitelor de performanţă minime necesare

(LMPN) pentru anumite reziduuri în alimente de origine animal.

JOUE 2003, L 71:17.

Directiva 96/23/CE a Consiliului din 29 aprilie 1996 privind mãsurile

de control care se aplicã anumitor substanþe ºi reziduurilor

acestora existente în animalele vii ºi în produsele obþinute de la

acestea ºi de abrogare a Directivelor 85/358/CEE ș i

86/469/CEE ºi a Deciziilor 89/187/CEE ºi 91/664/CEE. JOUE

1996, L 125:10.

Edder P, Cominoli A, Corvi C. Determination of streptomycin residues

in food by solid phase extraction and liquid with post-column

derivation and fluorometric detection. J Chromatogr A 1999;

830: 345-351.

Edder P, Corvi C. Utilisation du Charm II pour le depistage des residus

d’antibiotique dans les dendees alimentairea d’origine animale.

Mitt Lebensm Hyg 2001; 92: 218-228.

Findlay JWA, Dillard RF. Appropriate Calibration Curve Fitting in

Ligand Binding Assays. AAPS J 2007, 9 (29) : E260-E267.

Finkelman FD. Anaphylaxis: lessons from mouse models. J Allergy

Clin Immun 2007; 120:506-15.

Gentili A, Perret D, Marchese S. Liquid chromatography-tandem mass

spectrometry for performing confirmatory analysis of veterinary

drugs in animal-food products, Trend Anal Chem 2005;

24(7):704-733 Grigore G. Fitoterapia şi apiterapia. Boli tratate cu plante medicinale şi

produse apicole, Bucureşti, Ed. Ştefan, 2008, 98-115.

Hess DA, Sisson ME, Suria H et al. Cytotoxicity of sulfonamide

reactive metabolites: apoptosis and selective toxicity of CD81

cells by the hydroxylamine of sulfamethoxazole. Faseb J 1999;

13(13): 1688-98.

Hitchcock JD, Moffett JO, Lackett JJ, Elliott JR. Tylosin for control of

American foulbrood disease in honey bees. J. Econ. Entomol.

1970; 63: 204-207.

Page 69: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

69

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

Hopingarner R, Nelson K. 1987. American foulbrood cleanup rate using

three terramycin treatments. Am Bee J 1987; 128:120-121.

Hughes P, Heritage J. Antibiotic growthpromoters in food animals.

FAO Anim Pr 2004; 160: 129-52.

Joshi S. HPLC separation of antibiotics present in formulated and

unformulated samples. J Pharmaceut Biomed 2002; 28:795-809.

Kanfer I, Skinner M, Walker RB. Analysis of macrolide antibiotics. J

Chromatogr A 1998; 812:255-286

Khong SP, Gremaud E, Richoz J et al. Analysis of matrix-bound

nitrofuran residues in worldwide-originated honeys by isotope

dilution high-performance liquid chromatography-tandem mass

spectrometry. J Agr Food Chem 2004; 52(17): 5309-5315.

Kleespies RG, Radtke J, Bienefeld K. Virus -like particles found in the

ectoparasitic bee mite Varroa jacobsoni Oudemans. J Invertebr

Pathol 2000; 15, 87-90.

Kocher U. Nachweis von Streptomycin-Ruckstanden in Honig mittels

Charm II- Test und Absicherung der Befunde durch HPLC mit

Nachsaulenderivatisierung und Fluorescenzdetektion.

Lebensmittelchemie 1996; 50:115-117.

Legg, DR, Baumgartner A, Salter R, Wheeler A. ROSA (Rapid One

Step Assay) for antibiotics in honey. Apiacta 2003; 38, 207-217.

Michaaud V. Antibiotic residues in honey - the FEEDM view, Apiacta

2005; 40, 52-54.

Moats WA, Buckley SA. Determination of free metabolites of ceftiofur

in animal tissues with an automated liquid chromatographic

cleanup. J AOAC Int 1998; 81(4): 709-13.

Moffett JO, Wilson WT, Parker RL. The effect of Penicel, tetracycline

and erythromycin on adult bees, brood-rearing, and honey

production. Am Bee J 1958;98: 22-24.

Mutinelli F. Practical Application of Antibacterial drugs for the Control

of Honey Bee Diseases. Apiacta 2003; 38:149-155.

Naisbitt DJ, Gordon SF, Pirmohamed M, et al. Antigenicity and

immunogenicity of sulphamethoxazole: demonstration of

Page 70: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

70

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

metabolism-dependent haptenation and T-cell proliferation in

vivo. British J Pharmacol 2001; 133:295-305.

Nakazawa H, Ino S, Kato K, Watanabe T et al. Simultaneous

determination of residual tetracyclines in food by high-

performance liquid chromatography with atmospheric pressure

chemical ionization tandem mass spectrometry. J Chromatogr B

1999; 732(1):55-64.

O'Keeffe M, Conneely A, Cooper KM et al. Nitrofuran antibiotic

residues in pork: The FoodBRAND retail survey. Anal Chim

Acta 2004; 520:125-131.

Oldroyd BP, Goodman RD, Hornitzky MAZ, Chandler D. 1989. The

effect on American foulbrood of standard oxytetracycline

hydrochloride treatments for the control of European foulbrood

of honeybees (Apis mellifera). Aust J Agr Res 1989; 40(3): 691-

697.

Ortelli D, Edder P, Corvi C. Analysis of Chloramphenicol Residues in

Honey by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry.

Chromatographia 2004; 59:61-64.

Peng CYS, Mussen E, Fong A et al. Laboratory and field studies on the

effects of the antibiotic tylosin on honey bee Apis mellifera L.

(Hymenoptera: Apidae) development and prevention of

American foulbrood disease. J Invertebr Pathol 1996; 67(1): 65-

71.

Pettis J, Feldlaufer M. Efficacy of tylosin and lincomycin in controlling

American foulbrood in honey bee colonies. J Apic Res 2005;

44(3): 106-108. Pohl P. Determination of metal content in honey by atomic absorption and

emission spectrometries. Trend Anal Chem 2009; 28(1):117-128.

Quintana-Rizzo J, Salter RS, Saul SJ. Solid phase extraction procedures

for validation of Charm II sulfonamide, streptomycin and

chloramphenicol positives and detection of tylosin in honey.

Apiacta 2005; 40:55-62.

Regulamentul (CE) Nr. 470/2009 al Parlamentului European ºi al

Consiliului din 6 mai 2009 de stabilire a procedurilor

Page 71: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

71

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

comunitare în vederea stabilirii limitelor de reziduuri ale

substanþelor farmacologic active din alimentele de origine

animalã, de abrogare a Regulamentului (CEE) nr. 2377/90 al

Consiliului ºi de modificare a Directivei 2001/82/CE a

Parlamentului European ºi a Consiliului ºi a Regulamentului

(CE) nr. 726/2004 al Parlamentului European ºi al Consiliului.

JOUE 2009, L 152:11-22.

Regulamentul (UE) nr. 37/2010 al Comisiei din 22 decembrie 2009

privind substanþele active din punct de vedere farmacologic ºi

clasificarea lor în funcþie de limitele reziduale maxime din

produsele alimentare de origine animal. JOUE 2011, L 15:1.

Reybroeck W, Jacobs FJ, De Brabander HF, Daeseleire E. Transfer of

sulfamethazine from contaminated beeswax to honey. J Agr

Food Chem 2010; 58:7258–7265.

Reybroeck W. Residues of antibiotics and sulphonamides in honey on

the Belgian Market. Apiacta 2003; 38: 23-30.

Ritter W, 2000, Bolile albinelor, Bucureşti: Ed. M.A.S.T., 2000, 117-

145.

Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by

cultured human dendritic cells is maintained by

granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus

interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.

J Exp Med 1994; 179:1109-18.

Savoy Perroud MC, Le-Breton MH, Graveleau L, Diserens JM .

Validation of an ELISA kit for the detection of fluoroquinolones

in honey. Poster at 41st Apimondia Congress 2009, France,

Montpellier, September 15-20.

Spivak M. Preventive antibiotic treatments for honey bees. Am. Bee J.

2000; 140: 867-868.

Thompson HM, Waite RJ, Wilkins S et al. Effects of European

foulbrood treatment regime on oxytetracycline levels in honey

extracted from treated honeybee (Apis mellifera) colonies and

toxicity to brood. Food Addit Contam 2005; 22: 573-578.

Thompson TS, Noot DK. Determination of sulfonamides in honey by

Page 72: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

72

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

lichid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Chim

Acta 2005; 551:168-176.

Verdel BM, Souverein PC, Egberts ACG, Leufkens HG. Diference in

Risk of Allergic Reaction of Sulfonamide Drugs based on

Chemical Structure. Ann Pharmacother 2006; 40:1040-6.

Vidal JL, Aguilera-Luiz MM, Romero-Gonzalez R, Garrido-Frenich A.

Multiclass Analysis of Antibiotic Residues in Honey by

Ultraperformance Liquid Chromatography-Tandem Mass

Spectrometry. J Agr Food Chem 2009; 57(5): 1760–1767.

Vinas P, Balsalobre N, Lopez-Erroz C, Hernandez-Cordoba M. Liquid

chromatography with ultraviolet absorbance detection for the

analysis of tetracycline residues in honey. J Chromatogr A

2004; 1022, 125-129.

Waite RJ, Brown MA, Thompson HM, Brew MH. 2003. Controlling

European foulbrood with the shook swarm method and

oxytetracycline in the UK. Bee World 2003; 82: 130-138.

Wegener HC, Aarestrup FM, Gerner-Smidt P, Bager F. Transfer of

antibiotic resistant bacteria from animals to man. Acta Vet Scand

Suppl 1999; 92:51–57.

Williams DL. A veterinary approach to the European honey-bee (Apis

mellifera). Rev Vet J 2000; 160:61-73.

Page 73: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

73

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

ARTICOLE PUBLICATE IN EXTENSO

Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Mătiuţ S, Cuciureanu R.

Method validation for simultaneous determination of 12 sulfonamides

in honey using Biochip Array Technology. Rev. Farmacia 2012;

60(1):143-154. (Jurnal ISI, factor de impact :0.850).

http://www.revistafarmacia.ro/201201/issue12012art16.html

Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Ungureanu D, Cuciureanu R.

Immune response in rats following administration of honey with

sulfonamides residues. Rev Romana Med Lab 2012; (1/4):63-72. (Jurnal

ISI, factor de impact 2010: 0,113).

http://rrml.ro/articole/articol.php?year=2012&vol=1&poz=8

Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Cuciureanu R. Multi-analytic

detection of antibiotic residues in honey using a multiplexing Biochip

Assay. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi 2012; 116(1):324-329. (Jurnal

indexat în baze de date internaţionale - B+).

http://www.revmedchir.ro/uploads/1/5/7/2/15722076/50_popa.pdf

PARTICIPAREA LA CONFERINŢE NAŢIONALE

Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Ungureanu D, Cuciureanu R.

Evidenţierea răspunsului imun la şobolani după administrarea de miere

conţinând sulfonamide, prezentare orală, Sesiunea ştiinţifică

(videoconferinţă) în cadrul activităţii din proiect ''Organizarea de

sesiuni ştiinţifice ale doctoranzilor (simpozioane)'', Videoconferinţă

Iaşi-Timişoara, 11 decembrie 2012.

Morariu D.I., Schiriac C.E., Cuciureanu R. Validarea metodei

de determinare a 12 sulfonamide din miere utilizând Tehnologia

Biochip, prezentare orală, Simpozionul Naţional: Contribuţii ale

Page 74: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

74

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

tinerilor cercetători la dezvoltarea cercetării ăn domeniul medico-

farmaceutic, Iaşi, 7-9 noiembrie 2012.

Ionela Daniela Popa (Morariu) , I. Chirila, Elena Corina

Şchiriac , Rodica Cuciureanu. Evaluation of oxidative stress and serum

biochemical parameters in rats following administration of honey with

nitrofurans, poster, A 5-a Conferinţă a Doctoranzilor şi a 2-a

Conferinţă a Postdoctoranzilor în Medicină şi şi Farmacie, Tg Mureş, 4-

6 iulie 2012.

Popa (Morariu) Ionela Daniela, Şchiriac Elena –Corina,

Cuciureanu Rodica. Determinarea profilului de citokine la şobolani în

urma administrării de miere de albine îmbogăţită cu sulfonamide,

poster, 50 de ani de învăţmânt universitar farmaceutic la Iaşi, ediţia a

V-a, 6-8 octombrie 2011.

Popa (Morariu) ID, Hristodorescu C, Schiriac EC, Matiut S,

Cuciureanu R. Simultaneous detection of four nitrofuran metabolites in

honey using biochip array technology, prezentare orală, Simpozionul

Doctoranzilor din cadru proiectului POSDRU cu titlul: Burse doctorale

pentru doctoranzi competitive în Aria Europeană a Cercetării

POSDRU/88/1.5/63117, Timişoara, 8 septembrie 2011.

Morariu D.I., Schiriac C.E., Cuciureanu R. Simultaneous

detection and quantification for drug residues in honey.New

possibilities, poster, Congresul Naţional de Farmacie, ediţia a XIV-a,

Tg.Mureş, 13-16 octombrie 2010.

Popa (Morariu), I. D., Schiriac, C.E.,Cuciureanu, R. Method

validation for simultaneous multianalit detection of drug residues in

honey using Biochip Array Technology, poster, European Strategy for

Phd Programs din cadru proiectului POSDRU cu titlul: Burse

doctorale pentru doctoranzi competitive în Aria Europeană a Cercetării

POSDRU/88/1.5/63117, Timişoara, 20-22 septembrie 2010.

Page 75: Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

75

Un

iversitatea de M

edicin

ă şi Farmacie „G

rigore T. P

op

a” - Iaşi, Facultatea d

e Farmacie

Po

pa (M

orariu

) Ion

ela D

aniela - D

eterm

inarea rezid

uu

rilor m

edicam

ento

ase din

mierea d

e

albin

e

PARTICIPAREA LA CONFERINŢE INTERNAŢIONALE

Ionela Daniela Popa (Morariu), Elena Corina Schiriac, Rodica

Cuciureanu. Method validation for simultaneous multianalyt detection

of quinolones, ceftiofur, thiamphenicol, streptomycin, tylosin and

tetracyclines in honey using Biochip Array Technology, poster, The

15th Panhellenic Pharmaceutical Congress, Atena-Grecia, 13-15 mai

2011.

Popa (Morariu), I. D. , Chirila, I., Şchiriac, E. C., Cuciureanu,

R. Toxic effect of drug residues on the serum biochemical parameters

of rats following administration of honey with sulfonamides, poster,

DKMT Euroregional Conference on Environment and Health, 18 -19

mai 2012, Szeged-Ungaria.

Popa(Morariu), I.D.; Rodríguez, Y; Berrada, H; Mañes, J;

Cuciureanu, R; Font, G. Evaluación de la presencia de micotoxinas en

polen mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de

masas en tandem, prezentare orală, Aetox Congres, Valencia, Spania,

29 iunie 2012.