Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela
-
Upload
nuberthoodk -
Category
Documents
-
view
115 -
download
13
description
Transcript of Rezumat Popa (Morariu) Ionela Daniela
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE
,,Grigore T. Popa” - IAŞI
FACULTATEA DE FARMACIE
DETERMINAREA REZIDUURILOR
MEDICAMENTOASE DIN
MIEREA DE ALBINE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Coordonator ştiinţific,
Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu
Doctorand,
Popa (Morariu) Ionela Daniela
IAŞI, 2013
Decizia Rectorului U.M.F. "Grigore. T. Popa" - Iaşi de numire a
Comisiei de Doctorat nr. 5041/19.03.2013
Data susţinerii publice a tezei de Doctorat: 11.04.2013
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
3
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
CUPRINS INTRODUCERE..............................................................................................5
Motivaţia cercetării...............................................................................7
Obiective...............................................................................................8
PARTEA GENERALĂ..................................................................................10
CAPITOLUL I................................................................................................10
ALBINA - MORFOLOGIE, FIZIOLOGIE, PATOLOGIE......................10
I.1. Albina............................................................................................10
I.2. Bolile albinelor.............................................................................13
I.2.1. Bolile contagioase........................................................14
I.2.1.1. Bolile virotice...............................................14
I.2.1.2. Bolile bacteriene...........................................15
I.2.1.3. Boli parazitare...............................................16
I.2.1.4. Boli micotice.................................................18
I.2.2. Bolile necontagioase.....................................................19
I.3. Substanţe chimioterapice utilizate în apicultură pentru prevenirea
şi tratarea bolilor albinelor...............................................................................19
I.3.1. Antibiotice....................................................................19
I.3.2. Alte chimioterapice antimicrobiene..............................21
CAPITOLUL II..............................................................................................24
MIEREA DE ALBINE - ASPECTE GENERALE.....................................24
II.1. Istoric...........................................................................................24
II.2. Producerea mierii.........................................................................25
II.3. Tipuri de miere............................................................................27
II.4. Proprietăţile mierii.......................................................................27
II.4.1. Proprietăţile senzoriale................................................27
II.4.2.Proprietăţile fizico-chimice ale mierii..........................30
II.5. Mierea în apiterapie.....................................................................33
II.6. Mierea în circuitul economic.......................................................33
II.7. Legislaţia şi condiţiile de admisibilitate ale mierii de
albine................................................................................................................34
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
4
CAPITOLUL III............................................................................................38
PREZENŢA REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE
(CHIMIOTERAPICE ANTIMICROBIENE) ÎN MIEREA DE
ALBINE...........................................................................................................38
III.1. Surse de poluare a mierii............................................................38
III.1.1. Poluarea datorată unor factori de mediu....................38
III.1.2. Poluarea datorată practicilor apicole..........................38
III.2. Metode de determinare a reziduurilor medicamentoase în
miere.................................................................................................................39
III.2.1.Metodele de screening................................................40
III.2.1.1. Clasificarea după principiul de
detecţie.............................................................................................................40
III.2.1.2. Clasificarea după gradul de
cuantificare.......................................................................................................40
III.2.2. Metodele confirmatorii..............................................42
III.3. Reziduuri medicamentoase în produse apicole..........................44
PARTEA EXPERIMENTALĂ.....................................................................52
CAPITOLUL IV.............................................................................................52
ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE SULFONAMIDE ÎN MIEREA DE
ALBINE...........................................................................................................52
IV.1. Introducere.................................................................................52
IV.1.1. Corelaţii între structura chimică şi activitatea
antimicrobiană..................................................................................................53
IV.1.2. Mecanismul de acţiune al
sulfonamidelor..................................................................................................53
IV.1.3. Provenienţa reziduurilor de sulfonamide în
miere.................................................................................................................56
IV.2. Obiective....................................................................................57
IV.3. Principiul metodei......................................................................57
IV.3.1.Tehnologia Panelurilor Biocip....................................57
IV.3.2. Biocipul......................................................................57
IV.3.3. Detecţia......................................................................58
IV.4. Material şi metodă......................................................................60
IV.5. Validarea metodei......................................................................63
IV.5.1. Liniaritatea metodei...................................................68
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
5
IV.5.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie
(IC50)...............................................................................................................71
IV.5.3. Specificitatea şi selectivitatea....................................72
IV.5.4. Precizia şi acurateţea..................................................73
IV.5.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie
(CCβ)................................................................................................................75
IV.5.6. Regăsirea (recuperarea).............................................76
IV.6. Probele de miere........................................................................77
IV.7. Rezultate şi discuţii....................................................................79
IV.8. Concluzii....................................................................................80
CAPITOLUL V..............................................................................................82
ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE NITROFURANI ŞI
CLORAMFENICOL ÎN MIEREA DE
ALBINE...........................................................................................................82
V.1. Introducere..................................................................................82
V.1.1. Nitrofuranii..................................................................82
V.1.2. Cloramfenicolul...........................................................83
V.2. Obiective.....................................................................................84
V.3. Material şi metodă.......................................................................84
V.4. Validarea metodei.......................................................................86
V.4.1. Liniaritatea metodei....................................................89
V.4.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie
(IC50)...............................................................................................................91
V.4.3. Specificitatea şi selectivitatea......................................91
V.4.4. Precizia şi acurateţea...................................................92
V.4.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie
(CCβ)................................................................................................................94
V.4.6. Regăsirea (recuperarea)...............................................94
V.5. Probele de miere..........................................................................96
V.6. Rezultate şi discuţii.....................................................................97
V.7. Concluzii...................................................................................100
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
6
CAPITOLUL VI...........................................................................................101
ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE CHINOLONE ŞI ANTIBIOTICE
ÎN MIEREA DE ALBINE...........................................................................101
VI.1. Introducere...............................................................................101
VI.1.1. Chinolonele..............................................................101
VI.1.2. Cefalosporine (ceftiofur)..........................................102
VI.1.3. Amfenicol (fluorfenicol)..........................................103
VI.1.4. Aminoglicozide (Streptomicina)..............................104
VI.1.5. Macrolide (tilozină).................................................104
VI.1.6. Tetracicline..............................................................105
VI.2. Obiective..................................................................................106
VI. 3. Material şi metodă...................................................................106
VI.4. Validarea metodei....................................................................108
VI.4.1. Liniaritatea metodei.................................................111
VI.4.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie
(IC50).............................................................................................................113
VI.4.3. Specificitatea şi selectivitatea..................................114
VI.4.4. Precizia şi acurateţea................................................115
VI.4.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie
(CCβ)..............................................................................................................117
VI.4.6. Regăsirea (recuperarea)...........................................117
VI.5. Probele de miere......................................................................119
VI.6. Rezultate şi discuţii..................................................................120
VI.7. Concluzii..................................................................................124
CAPITOLUL VII.........................................................................................125
STUDIU EXPERIMENTAL AL INFLUENŢEI REZIDUURILOR
MEDICAMENTOASE (SULFONAMIDE) DIN MIERE ASUPRA UNOR
PARAMETRI BIOCHIMICI, IMUNOLOGICI ŞI HEMATOLOGICI
LA ANIMALE DE LABORATOR.............................................................125
VII.1. Introducere..............................................................................125
VII.2. Obiectivele cercetării..............................................................130
VII.3. Protocol experimental.............................................................130
VII.4. Evidenţierea răspunsului imun la şobolani după administrare de
miere conţinând sulfonamide.........................................................................131
VII.4.1. Material şi metodă..................................................131
VII.4.2. Prelucrarea şi interpretarea statistică......................138
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
7
VII.4.3. Rezultate.................................................................141
VII. 4.3.1. Analiza comparativă a rezultatelor
parametrilor analizaţi......................................................................................141
VII.4.3.2. Analiza corelaţiei rezultatelor citokinelor
implicate în reacţia alergică cu rezultatele IgE şi a
eozinofilelor...................................................................................................157
VII.4.4. Discuţii...................................................................172
VII.4.5. Concluzii.................................................................176
VII. 5. Evaluarea parametrilor biochimici şi hematologici la şobolani
după administrare de miere conţinând reziduuri de
sulfonamide....................................................................................................177
VII.5.1 Material şi metodă...................................................177
VII.5.2. Rezultate.................................................................184
VII.5.3. Discuţii...................................................................201
VII.5.4. Concluzii.................................................................203
CAPITOLUL VIII........................................................................................205
CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE.
PERSPECTIVE DE CERCETARE...........................................................205
VIII.1. Concluzii generale.................................................................205
VIII.2. Contribuţii originale..............................................................208
VIII.3. Perspective de cercetare........................................................209
BIBLIOGRAFIE..........................................................................................210
AVIZ COMISIA DE ETICĂ A CERCETĂRII........................................224
AVIZ LABORATOR...................................................................................225
LISTA INDICATORILOR REALIZAŢI DIN PROIECT......................226
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
8
Teza de doctorat cuprinde:
• 209 pagini (partea generală: 50 pagini, contribuţii
personale: 159 pagini)
• 73 tabele
• 144 figuri
• 267 referinţe bibliografice
• Aviz Comisia de Etica Cercetării
• Aviz laborator
• Lista indicatorilor realizaţi din proiect
• 3 Articole ştiinţifice -1 B+; 2 ISI
În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru
cuprins, tabele, figuri şi referinţe bibliografice.
Cuvinte Cheie: reziduuri medicamentoase, sulfonamide,
nitrofurani, chinolone, antibiotice, citokine, miere.
Această cercetare a fost susț inută de proiectul
POSDRU/88/1.5/S/63117 „Burse doctorale pentru doctoranzi competitivi în
Aria Europeanã a Cercetãrii”.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
9
INTRODUCERE
Mierea este principalul produs apicol, apreciat atât pentru
însuşirile sale nutritive, cât şi pentru efectele sale terapeutice; a fost
prima substanţă dulce folosită în hrana omului, fiind precursoarea
zahărului din trestie sau din sfeclă.
Tendinţa actuală spre consum şi necesitatea îndeplinirii tuturor
cerinţelor de calitate pentru produsele alimentare, în care se încadrează
mierea şi celelalte produse apicole, determină şi la noi în ţară stabilirea
unor standarde de calitate şi metode performante de analiză acceptate de
Uniunea Europeană (UE).
O condiţie esenţială pe care trebuie să o îndeplinească
alimentele este ca ele să nu conţină substanţe nocive pentru
consumatori. Prezenţa substanţelor nocive în alimente i-a preocupat şi
îngrijorat de mulţi ani pe specialişti, această problemă căpătând în
ultimele decenii o nouă dimensiune datorită poluării crescânde a
mediului ambiant, precum şi prin folosirea necontrolată a unor
substanţe chimice în scopul optimizării calităţii lor.
În ultima perioadă, o nouă clasă de poluanţi ai alimentelor au
intrat în atenţia oamenilor de ştiinţă şi anume reziduurile de produse
farmaceutice. Preparatele farmaceutice administrate animalelor
domestice, incluzând antibiotice, hormoni, anestezice, tranchilizante,
chimioterapice etc., sunt reţinute ca şi reziduuri în diferite produse. Mai
mult, există tendinţa de a nu percepe medicamentele ca un factor
poluant, cu toate că există o mare probabilitate ca acestea să se transfere
ca atare sau ca metaboliţi în produsele alimentare de origine animală
(Hughes, Heritage, 2004).
Asigurarea integrităţii lanţului alimentar şi protejarea sănătăţii
consumatorilor devine astfel o necesitate.
Standardele de calitate a mierii în UE restricţionează sever
intrarea mierii în oricare din statele europene. Când vorbim de calitatea
mierii ne referim la respectarea parametrilor de calitate prin aplicarea
unei tehnici apicole corecte, dar şi la absenţa reziduurilor
medicamentoase.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
10
Reglementările comunitare admit utilizarea mai multor clase de
medicamente veterinare (antibiotice, sulfonamide, nitrofurani,
chinolone) pentru tratarea bolilor la albine şi nu permit prezenţa
reziduurilor medicamentoase în miere.
Reziduurile medicamentoase din alimente trebuie studiate şi
determinate deoarece prin alimentaţie pot deveni un factor de risc
pentru sănătatea publică. Se impune atât identificarea principiului activ
medicamentos cât şi al metaboliţilor lor responsabili în unele cazuri de
efecte nocive asupra consumatorilor (Bura M et al.,2008).
Reglementările UE cu privire la calitatea produselor apicole
relevă necesitatea dezvoltării şi implementării unor metode de
determinare rapide, de înaltă sensibilitate şi specificitate pentru
identificarea şi dozarea cantitativă a reziduurilor medicamentoase.
Dezvoltarea şi îmbunătăţirea metodele analitice în vederea
monitorizării nivelurilor de reziduuri din mierea de albine asigură
punerea pe piaţă a produselor alimentare sigure.
Lucrarea de faţă prezintă rezultatele privind determinarea
reziduurilor medicamentoase (antibiotice şi alte chimioterapice
antimicrobiene - sulfonamide, chinolone, nitrofurani) din mierea de
albine folosind o metodă nouă de determinare şi anume tehnologia
Biocip.
Obiective
Teza de doctorat are ca scop principal studiul unor metode de
determinare rapide, de înaltă sensibilitate şi specificitate, în vederea
identificării şi dozării cantitative a reziduurilor medicamentoase din
mierea de albine.
Studiul a fost iniţiat în vederea realizării următoarelor obiective:
Validarea metodei de determinare simultană a 12
sulfonamide din miere utilizând tehnologia de analiză cu biocipuri
(Biochip Array Technology, BAT) şi aplicarea acesteia la analiza
probelor de miere.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
11
Validarea metodei de determinare simultană a 4 nitrofurani şi
a cloramfenicolului utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la
analiza probelor de miere.
Validarea metodei de determinare simultană a chinolonelor,
cefalosporinelor (ceftiofur), amfenicolilor (florfenicol),
aminoglicozidelor (streptomicina), macrolidelor (tilozina),
tetraciclinelor utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la analiza
probelor de miere.
Evidenţierea răspunsului imun la şobolani prin determinarea
citokinelor, eozinofilelor şi a imunoglobulinei E (IgE), după
administrarea de miere conţinând sulfonamide.
Studiu experimental al influenţei reziduurilor
medicamentoase (sulfonamide) din miere asupra unor parametri
biochimici şi hematologici la animale de laborator (şobolani).
Partea generală a tezei de doctorat este structurată în 3
capitole:
Capitolul I expune date din literatura de specialitate privind
morfologia, fiziologia şi patologia albinei.
Albinele fac parte din clasa Insectelor, ordinul Hymenoptera,
familia Apidae, genul Apis. Albina meliferă prezintă 3 grupe geografice
mari şi anume: albina meliferă africană, albina meliferă din orientul
apropiat şi albina meliferă europeană, care datorită însuşirilor sale
superioare s-a răspândit pe tot globul.
Sunt prezentate, de asemenea, bolile albinelor, mai ales cele
contagioase care spre deosebire de bolile necontagioase, sunt mai
periculoase şi se tratează cu chimioterapice antimicrobiene.
Bolile contagioase ale albinelor pot fi virotice, bacteriene şi
micotice.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
12
Bolile bacteriene cele mai răspândite sunt Loca americana, Loca
europeana, septicemia şi paratifoza.
Loca americana este de departe cea mai virulentă boală de puiet
cunoscută la albinele melifere fiind rezultatul infectării cu bacteria
sporulată Paenibacillus larvae subsp. larvae (Ashiralieva, Genersch,
2006). Este foarte contagioasă şi dacă nu este tratată la timp şi
corespunzător poate conduce la dispariţia întregii colonii, răspândindu-
se şi la alte stupine (Williams, 2000).
Loca europeana este mai puţin gravă decât Loca americana,
deoarece majoritatea bacteriilor care contribuie la apariţia ei nu
sporulează, iar sporii speciilor sporogene au o rezistenţă mai scăzută
faţă de acţiunea agenţilor fizici sau chimici.
Cele mai cunoscute boli parazitare sunt nosemoza, varrooza şi
senotainioza.
Compuşii utilizaţi în tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor
sunt: antibiotice şi alte chimioterapice antimicrobiene (sulfonamide,
chinolone, nitrofurani).
Capitolul II este destinat principalului produs apicol, mierea de
albine şi debutează cu o prezentare succintă a importanţei şi
semnificaţiei mierii la multe civilizaţii antice, ce au înflorit şi decăzut
pe parcursul timpului.
Acest capitol continuă cu prezentarea modului de producere a
mierii, precum şi a diferitelor criterii de clasificare ale acesteia.
Proprietăţile mierii sunt prezentate în două secţiuni distincte şi
anume: proprietăţi senzoriale şi proprietăţi fizico-chimice.
Caracteristicele organoleptice ale mierii sunt determinate de
categoria acesteia, de speciile florale din care provine, de compoziţia ei
chimică, de modul de extracţie din faguri, de modul de condiţionare, de
timpul şi condiţiile de păstrare.
Principalele componente ale mierii de albine sunt zaharurile.
Mierea conţine cantităţi reduse de substanţe azotoase reprezentate în
principal de enzime. Substanţele minerale sunt moderat reprezentate în
mierea de flori şi relativ abundente în cea de mană. Mierea conţine o
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
13
gamă largă de acizi organici, lipide, pigmenţi, enzime, uleiuri eterice,
substanţe cu acţiune antimicrobiană, vitamine. De conţinutul în zaharuri
depind în mare măsură calităţile fizice ale mierii şi anume: vâscozitatea,
higroscopicitatea şi capacitatea de cristalizare.
Acţiunea terapeutică a mierii de albine se exercită atât asupra
aparatului digestiv (stomac, intestin), cât şi asupra ficatului şi căilor
biliare, ale aparatului cardiovascular, respirator, urinar, sistemului
nervos (Andriţoiu, 2006; Grigore, 2008).
Spre finalul capitolului II sunt atinse câteva aspecte legate de
circuitul economic al mierii în Europa şi la nivel mondial. Dacă în
Europa suntem pe locul doi, la nivel mondial, România a urcat în primii
20 producători de miere ai lumii; clasamentul este dominat de China, cu
cele 300 mii tone obţinute anual. Printre marii producători ai lumii se
mai numără ţări precum Argentina, Statele Unite ale Americii, Turcia şi
Ucraina, având fiecare producţii în jur de 80 mii tone pe an.
Un aspect important prezentat în acest capitol îl reprezintă
legislaţia şi condiţiile de admisibilitate ale mierii de albine.
În Regulamentul CE 470/2009 de stabilire a procedurilor
comunitare pentru limitele de reziduuri medicamentoase din alimentele
de origine animalã, legislaţia europeană defineşte prin termenul de
reziduuri toate substanţele farmacologic active: principii active,
excipienţi sau produse de degradare, precum şi metaboliţii acestora,
care se regăsesc în produsele alimentare obţinute de la animalele cărora
li s-au administrat medicamente de uz veterinar.
Controlul şi monitorizarea reziduurilor medicamentoase în
alimentele de origine animală este reglementată de către Uniunea
Europeană. Obiectivul principal al legislaţiei este de a elabora norme pe
baza cărora să se detecteze utilizarea ilegală de substanţe în produsele
de origine animală, utilizarea abuzivă a medicamentelor de uz veterinar
şi de a asigura punerea în aplicare a acţiunilor adecvate în vederea
minimizării reapariţiei tuturor acestor reziduuri în alimentele de origine
animală.
Termenul de ,,limita maximă de reziduuri’’ (LMR) poate fi
definit drept concentraţia maximă de reziduu, care rezultă din utilizarea
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
14
unui medicament veterinar, exprimată în µg/kg, care este permisă de
lege sau este recunoscută ca acceptabilă în sau pe un aliment. LMR se
exprimă pe tipul şi cantitatea de reziduuri, considerat a fi fără risc
toxicologic pentru sănătatea umană.
Un rol important în determinarea reziduurilor medicamentoase
din miere îl au sensibilitatea şi precizia metodei de detecţie. Deoarece
sunt analize de urme, este necesar ca tehnica analitică să garanteze o
limită de detecţie cât mai scăzută.
Decizia Comisiei 2002/657/CE este decizia de punere în
aplicare a Directivei 96/23/CE a Consiliului în ceea ce priveşte
performanţa metodelor analitice şi interpretarea rezultatelor. Această
decizie prevede criterii de performanţă şi alte cerinţe pentru metodele
de analiză care urmează să fie utilizate în testarea probelor de miere,
pentru a asigura calitatea şi compararea rezultatelor analitice generate
de către laboratoarele autorizate pentru controlul oficial al reziduurilor.
Conform Deciziei Consiliului 2003/181/CE (de modificare a
Deciziei 2002/657/CE) este necesar să se prevadă stabilirea progresivă a
limitelor de performanță minime necesare (LPMN) aplicabile
metodelor de analiză care trebuie utilizate pentru substanțele pentru
care nu s-a definit nici o limită autorizată şi, în special, pentru
substanțele a căror utilizare nu este autorizată sau este special interzisă
în Comunitate în vederea garantării punerii în aplicare armonizate a
Directivei 96/23/CE.
Limita de performanță minimă necesară (LPMN) reprezintă
conținutul minim de analit într-o probă care trebuie cel puțin detectat și confirmat (limita minimă de detecţie a metodei).
Pentru majoritatea chimioterapicelor antimicrobiene, LPMN
variază în jurul valorii de 10 µg/kg; pentru cloramfenicol această limită
este de 0,3 µg/kg, iar pentru nitrofurani de 1 µg/kg (Michaud, 2005).
Capitolul III prezintă principalele surse de poluare ale
produselor apicole care sunt mediul poluant şi substanţele utilizate de
apicultori pentru tratamentul bolilor albinelor.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
15
Activitatea albinelor este influenţată de toate elementele de
mediu (sol, vegetaţie, aer şi apă) (Pohl, 2009). Bogdanov (2006) subliniază faptul că pericolul de contaminare a
produselor apicole provine într-o mai mare măsură din practicile
apicole, decât din mediul înconjurător. Apicultorii trebuie să ia măsuri
pentru prevenirea contaminării produselor apicole optând pentru
alternative ecologice în controlul bolilor albinelor, prin utilizarea
substanţelor naturale netoxice în detrimentul celor sintetice.
La ora actuală, în tratamentul bolilor de albine, apicultorii
folosesc frecvent acaricidele pentru combaterea varroozei şi
chimioterapicele antimicrobiene pentru boala Loca americana şi boala
Loca europeana (Kleespies, 2000).
Prezenţa reziduurilor de chimioterapice antimicrobiene din
miere este corelată cu tratamentele aplicate albinelor în cazul bolii Loca
americana şi/sau boala Loca europeana, boli infecto-contagioase
cauzate de bacteriile Paenibacillus larvae subsp. larvae şi respectiv
Melissococcus pluton. În tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor,
care sunt foarte periculoase deoarece pot distruge complet şi rapid
stupina, apicultorii utilizează sulfamidele şi unele antibiotice.
Tratamentul medicamentos ar duce numai la o aparentă vindecare
pentru că bacteria dezvoltă spori foarte rezistenţi care nu sunt distruşi de
aceste chimioterapice antimicrobiene şi provoacă reinfectarea. De
aceea, tratamentul trebuie repetat la anumite intervale de timp. Astfel,
pericolul reziduurilor în produsele apicole este mare, coloniile rămân
purtătoare de spori, iar pericolul infecţios persistă (Ritter, 2000).
De asemenea, în acest capitol sunt prezentate metodele de
determinare a reziduurilor medicamentoase din miere conform normelor
Uniunii Europene incluse în Directiva Consiliului 96/23/CE. Aceste
metode se împart în metode de screening şi metode confirmatorii.
Metodele de screening cele mai utilizate pentru determinarea
reziduurilor medicamentoase din mierea de albine sunt: testul ELISA,
testul Charm II şi testul ROSA. În general, rata rezultatelor fals pozitive
pentru testul Charm II este destul de ridicată (Reybroeck, 2003; Beaune
et al., 2005).
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
16
Testul ELISA, utilizat cu succes pentru miere, evidenţiază
prezenţa antibioticelor în urma reacţiilor imunoenzimatice pentru
determinarea anticorpilor şi a antigenelor specifici.
Metoda ELISA se utilizează pentru determinări semicantitative
datorită încrucişării reactivităţilor antibioticelor ce aparţin aceluiaşi
grup de antibiotice. În prezent, testul ELISA este frecvent înlocuit de
testul Charm II (Bogdanov, 2003). Testul Charm II reprezintă tot o metodă de screening utilizată
pentru diferite matrici, cum ar fi carnea şi laptele şi a fost adaptată şi
pentru miere. Sunt cunoscute teste Charm II pentru determinarea de
chimioterapice antimicrobiene (sulfonamide, antibiotice: tetracicline,
antibiotice betalactamice, macrolide, amfenicoli şi aminoglicozide). Un
procent cuprins între 0-30% dintre probele depistate pozitive în urma
testărilor vor fi confirmate prin alte metode, cum ar fi HPLC sau LC-
MS (Kocher,1996; Edder et al., 1999; Edder, Corvi, 2001).
Un dezavantaj al testului Charm II constă în faptul că acesta
permite detectarea întregului grup de antibiotice, nu a fiecărui
reprezentant individual fiind astfel inferior altor metode cantitative
(Bogdanov, 2003; Quintana-Rizzo et al., 2005; Bonvehi, Gutierrez,
2009).
Testul ROSA (Rapid One Step Assay) reprezintă o altă metodă
de screening calitativă pentru detectarea reziduurilor medicamentoase
din miere. Acesta utilizează o bandă test şi un minim de echipament (un
incubator), iar rezultatele se pot citi direct. Testul ROSA este utilizat
pentru depistarea penicilinei G şi a unor compuşi β-lactamici
(cefalosporine) din miere. Sensibilitatea pentru penicilină este de 20
µg/kg, iar pentru compuşii β-lactamici analizaţi este de 20-200 µg/kg
(Legg et al., 2003).
Rezultatele metodelor de screening sunt calitative şi
semicantitative, iar probele testate pozitiv se vor confirma prin metode
analitice de mare sensibilitate (HPLC, LC) în vederea cuantificării
reziduurilor de antibiotice şi chimioterapice antimicrobiene.
Metoda HPLC este cea mai extinsă tehnică cromatografică
utilizată pentru analiza antibioticelor (Kanfer et al., 1998) în special cea
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
17
cuplată cu detector UV (Vinas et al., 2004), dar prezintă şi unele
dezavantaje, precum faptul că fiecare clasă de antibiotice trebuie testată
separat.
Prin cuplarea cromatografului de lichide cu spectrometrul de
masă s-a obţinut un instrument de analiză performant, capabil să separe,
să identifice şi să cuantifice componenţii din cele mai complexe probe.
Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE prevede ca toate
metodele bazate pe cromatografie fără utilizarea MS, să fie confirmate
prin spectrometrie de masă (Gentili et al., 2005).
Metoda LC-MS prezintă o siguranţă de detecţie de aproape
100% (Nakazawa et al., 1999). Metoda a fost dezvoltată pentru
sulfonamide şi tetracicline (tetraciclină, oxitetraciclină şi
cloroxitetraciclină). Limita de detecţie este între 0,5 - 10 µg/kg,
depinzând de substanţă. Metoda a continuat să se extindă şi pentru
cloramfenicol şi streptomicină. Obiectivul principal a fost dezvoltarea
metodei LC-MS, capabilă să detecteze toate reziduurile de antibiotice
din miere (Bogdanov, 2003).
În ultima perioadă s-au efectuat numeroase studii privind
depistarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine utilizând
numeroase metode de determinare cu diferite limite de detecţie şi
cuantificare. Stadiul actual al cunoaşterii privind utilizarea acestor
metode de determinare pentru probele de miere este prezentat în cadrul
acestui capitol al tezei de doctorat.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
18
Partea experimentală a tezei de doctorat este structurată în
5 capitole care urmăresc îndeplinirea sistematică a obiectivelor propuse
în cercetarea doctorală.
Capitolul IV - ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE
SULFONAMIDE ÎN MIEREA DE ALBINE
Scopul cercetãrii
Cercetarea prezentă a avut drept scop validarea unei metode de
determinare simultană a 12 sulfonamide din miere utilizând tehnologia
de analiză cu biocipuri (Biochip Array Technology, BAT) în vederea
evaluãrii conţinutului acestora în probe de miere disponibile pe piaţa
comercială din România.
Introducere
La ora actuală, în medicina veterinară, sulfonamidele sunt
printre cele mai folosite substanţe medicamentoase, datorită faptului că
au un preţ scăzut (comparativ cu antibioticele), un spectru antibacterian
larg şi o eficacitate terapeutică apreciabilă în unele boli infecţioase.
Sulfonamidele sunt folosite în apicultură pentru a trata trei boli
ale albinelor şi anume, boala Loca americana, boala Loca europeana şi
nosemoza (Reybroeck et al., 2010).
Sulfadimetoxina, sulfametoxazolul, sulfachinoxalina şi
sulfadiazinele sunt cele mai folosite sulfonamide în medicina veterinară,
inclusiv în apicultură. Dacă perioada dintre tratamentul albinelor şi
recoltarea mierii nu este respectată, aceasta poate fi contaminată cu
reziduuri din aceste substanţe. Interesul pentru detectarea acestor
reziduuri este de mare actualitate.
Avertizări recente ale Uniunii Europene în legătură cu prezenţa
sulfonamidelor în miere au condus la intensificarea supravegherii
reziduurilor medicamentoase şi necesitatea dezvoltării de metode
sensibile şi rapide de screening ale reziduurilor acestor substanţe în
acest produs alimentar deosebit de apreciat de consumatori (Thompson,
Noot, 2005).
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
19
Material şi metodă
Metoda Biocip aplicată se încadrează, conform criteriilor de
clasificare a metodelor de determinare a reziduurilor din miere, în
categoria metodelor de screening.
Toate determinările au fost efectuate pe analizorul Evidence
Investigator produs de firma Randox, UK. Acest sistem utilizează
principiile imunologice de bază: metoda competitivă tip sandwich,
bazată pe captură de anticorpi. Metoda de detecţie este
chemiluminescenţa.
Reactivii sunt livraţi de producătorul aparatului şi includ:
Antimicrobial Array I - kit (cod de catalog EV3523, Randox
Laboratories, UK).
Control: Sulphonamide Multianalit Control (cod de catalog
AMC5004, Randox Laboratories, UK).
Validarea metodei
Metoda de validare şi procedura de analiză a produselor apicole
s-a realizat în conformitate cu ghidurile de validare pentru metodele
analitice ale FDA, ghidurile de validare pentru reziduuri
medicamentoase, ghidurilor pentru implementarea Deciziei Comisiei
2002/657/CE, ghidurilor de validarea a metodelor de screening pentru
reziduurile de medicamente veterinare şi Procedurile Standard de
Operare ale Laboratorului S.C.Investigaţii Medicale Praxis S.R.L. Iaşi.
Parametrii de validare evaluaţi au fost următorii: calibrarea
(liniaritatea); sensibilitatea (IC50); specificitatea şi selectivitatea;
precizia (intermediară şi reproductibilitate) şi acurateţea; limita de
detecţie, regăsirea (recuperarea) (tabel IV.2 - IV.5). Limita de decizie obţinută pentru sulfonamidele determinate s-a
încadrat între valorile 0,54 µg/kg şi 5,14 µg/kg. Capabilitatea de
detecţie obţinută pentru sulfonamidele determinate s-a încadrat între
valorile 0,79 µg/kg şi 7,99 µg/kg conform tabel IV.3, tabel IV.5 şi fig.
IV.32.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
20
Fig. IV.32: Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ)
0
2
4
6
8SZ
SDM
SQ
SMT
ST
SSSP
SM
SMP
SCP
SMZ
SD
Limita de decizie CCα (μg/kg)
Capabilitatea de detecţie CCβ (μg/kg)
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e albin
e
21
Tabelul IV.2: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie şi acurateţe)
Parametrii de validare ANALIT
SZ SDM SQ SMT ST SS L
inia
rita
te
Interval de calibrare (µg/kg) 0 - 20,00 0 - 20,50 0 - 20,20 0 - 11,20 0 - 21,10 0 - 11,20
Coeficient de corelatie r 0,987 0,982 0,986 0,988 0,991 0,986
Sen
ibil
ita
te
IC 50 (μg/kg) 0,89 1,90 1,60 0,20 0,40 0,60
Pre
cizi
e şi
acu
rate
ţe
Ace
eaşi
ser
ie Nivel 1
Conc.(μg/kg) 57 51 50 51 59 47
CV (%) 6 7 10 9 5 8
Nivel 2 Conc.(μg/kg) 115 99 89 112 131 113
CV (%) 7 6 9 7 9 5
Nivel 3 Conc.(μg/kg) 164 140 134 170 206 167
CV (%) 6 5 5 7 6 7
Ser
ii d
ifer
ite Nivel 1
Conc.(μg/kg) 84 51 54 61 51 36
CV (%) 10 11 10 14 14 11
Nivel 2 Conc.(μg/kg) 171 101 141 101 122 90
CV (%) 12 8 10 7 12 9
Nivel 3 Conc.(μg/kg) 259 160 212 138 207 136
CV (%) 15 10 10 7 11 10
22
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e albin
e
Tabelul IV.3: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie şi capabilitate de detecţie)
Parametrii de validare ANALIT
SZ SDM SQ SMT ST SS
Rec
up
era
rea
Nivel 1 Conc.(μg/kg) 44 51 49 50 57 46
Recuperare (%) 112 102 98 100 115 92
Nivel 2 Conc.(μg/kg) 113 96 86 112 129 112
Recuperare (%) 113 96 86 112 129 112
Nivel 3 Conc.(μg/kg) 159 138 134 169 204 166
Recuperare (%) 106 92 89 113 136 111
Lim
ita d
e d
eciz
ie C
Cα
şi
cap
ab
ilit
ate
de
det
ecţi
e C
Cβ
Conc. medie (μg/kg) 1,71 2,41 1,23 2,29 0,71 2,01
DS 0,39 0,54 0,11 1,74 0,24 0,30
1,64 x DS 0,64 0,89 0,18 2,85 0,39 0,49
CCα (μg/kg) 2,35 3,30 1,41 5,14 1,10 2,50
CCβ (μg/kg) 2,99 4,19 1,59 7,99 1,49 2,99
23
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e albin
e
23
Tabelul IV.4: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie şi acurateţe)
Parametrii de validare ANALIT
SP SM SMP SCP SMZ SD L
inia
rita
te
Interval de calibrare (μg/kg) 0 - 19,40 0 - 2,50 0 - 19,60 0 - 19,60 0 - 11,70 0 - 19,40
Coeficient de corelatie r 0,993 0,985 0,991 0,993 0,996 0,989
Sen
ibil
ita
te
IC 50 (μg/kg) 2,50 0,20 0,80 0,60 0,30 0,60
Pre
cizi
e şi
acu
rate
ţe
Ace
eaşi
ser
ie Nivel 1
Conc.(μg/kg) 58 50 53 48 68 45
CV (%) 7 7 7 6 5 9
Nivel 2 Conc.(μg/kg) 100 112 129 102 149 101
CV (%) 6 10 6 8 5 8
Nivel 3 Conc.(μg/kg) 140 174 190 149 236 139
CV (%) 7 5 6 5 6 7
Ser
ii d
ifer
ite Nivel 1
Conc.(μg/kg) 94 62 58 78 98 38
CV (%) 11 10 9 11 9 11
Nivel 2 Conc.(μg/kg) 192 80 112 124 158 64
CV (%) 13 14 8 11 8 10
Nivel 3 Conc.(μg/kg) 275 156 175 189 231 95
CV (%) 8 17 9 11 9 10
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e albin
e
24
Tabelul IV.5: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie şi capabilitate de detecţie)
Parametrii de validare ANALIT
SP SM SMP SCP SMZ SD
Rec
up
era
rea
Nivel 1 Conc.(μg/kg) 53 49 52 47 66 44
Recuperare (%) 106 99 105 94 132 88
Nivel 2 Conc.(μg/kg) 97 112 128 101 148 100
Recuperare (%) 97 112 128 101 148 100
Nivel 3 Conc.(μg/kg) 139 173 190 148 234 138
Recuperare (%) 93 115 126 99 156 92
Lim
ita d
e d
eciz
ie C
Cα
şi
cap
ab
ilit
ate
de
det
ecţi
e C
Cβ
Conc. medie (μg/kg) 1,19 2,17 1,89 3,81 1,41 0,29
DS 0,09 0,19 0,55 0,48 0,24 0,15
1,64 x DS 0,15 0,31 0,90 0,79 0,39 0,25
CCα (μg/kg) 1,34 2,48 2,79 4,60 1,80 0,54
CCβ (μg/kg) 1,49 2,79 3,69 5,39 2,19 0,79
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
25
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Analiza cantitativă a celor 12 sulfonamide studiate
în diferite probe de miere În cercetările efectuate am analizat 11 probe de miere
achiziţionate din supermarketuri şi 5 probe achiziţionate de la mai mulţi
producători din diferite regiuni geografice ale României.
Prelucrarea probelor
Extracţia sulfonamidelor din probele de miere se realizează
astfel: în jur de 1g de probă de miere dizolvată în 9 ml tampon de
spălare (soluţie de lucru) se menţine la incubat la 37°C timp de 30
minute şi se agită pe un roller pentru 10 minute până la dizolvare.
Soluţia probei se diluează cu o cantitate egală de soluţie tampon de
spălare şi se aplică pe suprafaţa biocipului.
Din acest mod de lucru rezultă o diluţie a probei de miere de
1:20, de care se va ţine cont la calcul.
Etape de lucru se execută manual şi sunt similare celor de la
tehnica ELISA:
• reactivii şi proba sunt adăugaţi pe un biocip pregătit pentru
utilizare
• incubare biocipuri la 37°C cu agitare.
• spălare biocipuri pentru a îndepărta de pe suprafaţa lor orice
component care nu s-a legat.
• reactivul semnal este adăugat pe fiecare biocip înainte să aibă
loc citirea imaginii în modulul de captare imagine al analizorului
Evidence Investigator.
• lumina emisă de fiecare regiune de test este analizată cu
ajutorul softului de procesare imagine şi cuantificată rapid în unităţi de
măsură RLU (Relative Light Unit) folosind o curbă de calibrare;
rezultatele sunt calculate automat de un software dedicat. Intensitatea
luminoasă este invers proporţională cu concentraţia analitului.
Rezultate şi discuţii
Pentru confirmarea rezultatelor obţinute prin metoda Biocip,
probele de miere au fost testate şi prin metoda LC-MS/MS. Analizele
au fost efectuate utilizând sistemul Agilent 1100 LC (Agilent
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
26
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Technologies, SUA) cuplat cu spectrometru de masă 4000 Q TRAP
(Applied Biosystems, SUA).
Două din probele analizate au fost pozitive în urma
determinărilor prin metoda Biocip, având valori mai mari decât 10
μg/kg pentru mai multe sulfonamide analizate cu ajutorul Panelului I
Antimicrobian. Majoritatea ţărilor din UE au stabilit limita minimă de
performanță necesară (LMPN) pentru sulfonamide la valoarea de 10
μg/kg (Michaud, 2005).
Performanţele metodei Biocip au fost bune, valorile obţinute au
fost comparabile cu rezultatele metodei confirmatorii atât pentru
probele pozitive, cât şi pentru probele negative. Probele pozitive
confirmate prin metoda LC-MS/MS sunt prezentate în tabel IV.9.
Tabelul IV.9: Valorile obținute pentru probele pozitive prin metoda
Biocip şi metoda confirmatorie LC-MS/MS
Proba1 Proba 2
Biochip LC-MS/MS Biochip LC-MS/MS
Sulfonamide Conc. (μg/kg) Conc. (μg/kg)
1 Sulfadiazina 11.4 7.3 9.2 8.8
2 Sulfadimetoxina < LOD < LOD < LOD < LOD
3 Sulfakinoxalina < LOD < LOD < LOD < LOD
4 Sulfametazina 24.8 32.6 17.1 21.3
5 Sulfatiazol 22.6 18.4 16.2 11.7
6 Sulfisoxazol < LOD < LOD < LOD < LOD
7 Sulfapiridina < LOD < LOD < LOD < LOD
8 Sulfamerazina < LOD < LOD < LOD < LOD
9 Sulfametoxipiridazina < LOD < LOD < LOD < LOD
10 Sulfaclorpiridazina < LOD < LOD < LOD < LOD
11 Sulfametizol 51.2 58.9 68.2 72.9
12 Sulfadoxina < LOD < LOD < LOD < LOD
Rezultatele probelor pozitive identificate prin metoda Biocip şi
confirmate prin metoda LC-MS/MS au evidenţiat prezenţa aceloraşi
sulfonamide la valori peste LMPN şi anume: sulfadiazina,
sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol.
Rezultatele obţinute în acest studiu sunt comparabile cu cele
existente în literatura de specialitate.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
27
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Concluzii
Tehnologia Biocip aplicată a permis măsurarea simultană şi
selectivă a 12 sulfonamide în miere la nivele mult mai mici decât LMR
stabilite.
Determinarea cantitativă simultană a celor 12 sulfonamide
prezintă specificitate pentru fiecare analit ţintit, iar senbilitatea metodei
exprimată ca IC50 este ≤ 2,5 µg/kg.
Metoda prezintă o precizie foarte bună atât în cadrul aceleeaşi
serii analitice, cât şi în serii analitice diferite, cu valori tipice mai mici
de 15 % pentru concentraţiile de 50, 100 şi 150 µg/kg. Criteriile de validare ale metodei: specificitate, acurateţe,
liniaritate, limite de detecţie şi cuantificare, respectă recomandările
Deciziei Comisiei Europene 2002/657/CE şi demonstrează că metoda
poate detecta şi cuantifica reziduuri din sulfonamidele amintite fără
analiza prin spectrometrie de masă sau derivatizarea fluorescentă a
analiţilor.
CAPITOLUL V - ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE
NITROFURANI ŞI CLORAMFENICOL ÎN MIEREA
DE ALBINE
Scopul cercetãrii
În acest capitol ne-am propus validarea metodei de determinare
a 4 metaboliţi ai nitrofuranului din mierea de albine şi anume 1-amino-
imidazolidin-2,4-dionă (AHD), 3-amino-5-morfolinometil-2-
oxazolidinonă (AMOZ), 3-amino-2-oxazolidonă (AOZ), semicarbazidă
(SEM) şi a cloramfenicolului (CAP) utilizând tehnologia Biocip şi
aplicarea acesteia la analiza probelor de miere.
Introducere
Nitrofuranii au fost utilizaţi în practica veterinară ca agenţi
antibacterieni, pentru tratarea infecţiilor cauzate de bacterii şi
protozoare. Deşi utilizarea lor a fost interzisă pentru prima dată în UE
începând cu data de 1 ianuarie 1997 prin anexa IV a Regulamentului
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
28
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
2377/90/CE (Leitner et al., 2001), la ora actuală se mai folosesc pentru
animalele care nu sunt crescute pentru consum.
Numeroase publicaţii menţionează că nitrofuranii sunt utilizaţi
în tratarea albinelor pentru producţia de miere, deşi actualmente,
conform Regulamentului nr. 37/2010 al Comisiei UE, nitrofuranii sunt
substanţe interzise pentru toate animalele producătoare de hrană.
Nitrofuranii utilizaţi în tratamentele albinelor sunt
nitrofurantoina, furazolidona, furaltadona şi nitrofurazona. Rezultatele
unei determinări simultane a reziduurilor din patru nitrofurani
(furazolidon, furaltadon, nitrofurantoin, şi nitrofurazona), au demonstrat
că furazolidonul este principalul chimioterapic antimicrobian
administrat în tratarea bolilor bacteriene ale albinelor (Khong et al.,
2004).
Dezvoltarea unor metode accesibile care să permită detectarea
lor este de interes pentru programele de monitorizare şi de reglementare
a reziduurilor în alimente.
Detectarea reziduurilor de nitrofurani este de obicei realizată cu
ajutorul lichid cromatografiei în tandem cu spectrometria de masă (LC-
MS/MS) (Leitner et al., 2001; O’Keeffe et al., 2004). Metoda
imunochimică a fost propusă ca o alternativă pentru a detecta
reziduurile de nitrofurani în miere.
Cloramfenicolul are acţiune bacteriostatică şi este eficient în
tratamentul bolilor infecţioase. Are un spectru de activitate asemănător
tetraciclinei, dar utilizarea lui în medicina umană şi veterinară este
interzisă datorită efectelor adverse pe care le are asupra organismului
uman (Joshi, 2002).
Material şi metodă
Tehnologia Panelurilor Biocip şi aparatura pentru determinarea
cantitativă simultană a nitrofuranilor şi cloramfenicolului din miere au
fost prezentate în capitolul IV din partea experimentală a tezei de
doctorat.
Toţi reactivii sunt multianalit şi sunt furnizaţi într-un kit
compact care include:
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
29
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Antimicrobial Array III – kit (cod de catalog EV3695,
Randox Laboratories, UK).
Antimicrobial Array III Control – kit (cod AMC5036, Randox
Laboratories, UK).
Validarea metodei
Parametrii de validare evaluaţi au fost următorii:
a) Liniaritatea metodei
Liniaritatea metodei s-a verificat prin efectuarea unei calibrări în
9 puncte pentru fiecare din cei 4 nitrofurani şi pentru cloramfenicol
utilizând calibratorii incluşi în kitul Anti Microbial Array III.
Softul analizorului utilizează pentru calibrare o ecuaţie specifică
pentru metoda de detecţie imunoenzimatică competitivă (Findlay,
Dillard, 2007):
y = D + [(A-D)/1+(x/C)B]
unde:
x = concentratia analitului (µg/kg),
y = intensitatea semnalului chemiluminescent exprimată
în RLU
A, B, C, D - parametri ai metodei competitive şi sunt predefiniţi
în softul analizorului:
A = intensitatea semnalului chemiluminiscent la
concentraţia 0 a analitului
B = factorul pantei
C = punctul de inflexiune al curbei de calibrare
D = intensitatea semnalului luminos de răspuns la o
concentraţie teoretică infinită a analitului.
În urma determinărilor s-au obţinut coeficienţi de corelaţie (r)
mai mari de 0,98, cel mai mic coeficient s-a obţinut în cazul SEM
(0,982).
Rezultatele obţinute dovedesc faptul că a fost îndeplinită
condiţia de admisibilitate a curbei de calibrare (coeficienţii de corelaţie
admişi trebuie să fie > 0.949).
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
30
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
b) Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie (IC50)
Concentraţia inhibitorie (IC50) pentru fiecare analit testat s-a
calculat luând 50% din valoarea semnalului RLU generat de calibratorul
de concentraţie zero şi extrapolând valoarea RLU astfel obţinută pe axa
x a curbei de calibrare pe care sunt exprimate unităţile de concentraţie
în µg/kg. Concentraţia astfel obţinută corespunde concentraţiei
inhibitorii ce produce 50% inhibiţie.
Sensibilitatea metodei exprimată sub formă de IC50 pentru
determinarea cantitativă simultană a celor 4 nitrofurani şi a
cloramfenicolului a înregistrat valori care au fost ≤ 2,32 µg/kg şi care
sunt detaliate în fig. V.8.
Fig. V.8: Valorile sensibilităţii metodei pentru nitrofuranii analizaţi şi
cloramfenicol
c) Precizia şi acurateţea
Conform legislaţiei actuale şi ghidurilor de validare pentru
metodele de determinare ale reziduurilor medicamentoase din miere,
precizia şi acurateţea se evaluează atât pentru concentraţia
corespunzătoare limitelor LMPN (1 µg/kg), cât şi pentru concentraţii
reprezentând 50 %, respectiv 150 % din LMPN.
0,4
0,09
0,44
0,74
2,32
0
0,5
1
1,5
2
2,5
AHD AOZ SEM AMOZ CAP
IC50 (µg/kg)
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
31
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Precizia s-a determinat în cadrul aceleiaşi serii analitice şi în
serii analitice diferite. Valorile obţinute pentru determinarea preciziei şi
acurateţei sunt prezentate în fig. V.9. şi în fig.V.10.
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e albin
e
32
Fig.V.9: Precizia şi acurateţea pentru concentraţii care reprezintă 50 %, 100% şi 150% din LMPN în
cadrul aceleiaşi serii analitice
Fig. V.10: Precizia şi acurateţea pentru concentraţii care reprezintă 50 %, 100% şi 150% din LMPN în
serii analitice diferite
Nivel 1 (0,50 µg/kg)
n = 20
0,68 0,64 0,61 0,960,44
10,15
7,878,32
5,86
8,92
0
2
4
6
8
10
12
AOZ AMOZ AHD SEM CAP
Conc. (µg/kg)
CV (%)
Nivel 2 (1 µg/kg)
n = 20
1,16 1,14 1,07 1,250,75
8,02 8,1
5,72
7,46 7,26
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
AOZ AMOZ AHD SEM CAP
Conc. (µg/kg)
CV (%)
Nivel 3 (1,5 µg/kg)
n = 20
1,84 1,73 1,81 2,25
1,06
8,33
11,78
8,719,84
12,93
0
2
4
6
8
10
12
14
AOZ AMOZ AHD SEM CAP
Conc. (µg/kg)
CV (%)
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
33
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
d) Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ)
Limita de decizie (CCα) a fost calculată ca fiind media
aritmetică a concentraţiei analitului la nivel LMPN plus 1.64 x DS a
repetabilităţii la α = 5% (CCα) Capabilitatea de detecţie (CCβ) a fost
calculată ca fiind media aritmetică a concetraţiei analitului la nivel CCα
plus 1.64 x DS a repetabilităţii la α = 5% (CCα). Valorile obţinute sunt
redate în fig. V.11.
Fig. V.11: Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ)
e) Regăsirea (recuperarea)
Procentul de recuperare s-a calculat pentru 3 nivele de
concentraţie reprezentând 50%, 100 % şi 150 % din limita minimă de
performanţă necesară pentru reziduurile de nitrofurani şi cloramfenicol
în mierea de albine (LMPN = 1 µg/kg). Probele de miere au fost
îmbogăţite cu următoarele concentraţii de nitrofurani şi cloramfenicol:
0.5, 1, 1.5 µg/kg. Procentele de recuperare au fost calculate efectuând
raportul dintre concentraţia analitului din proba analizată şi concentraţia
teoretică a analitului din soluţia standard.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2AOZ
AMOZ
AHDSEM
CAP
Limita de decizie CCα (μg/kg)
Capabilitatea de detecţie CCβ (μg/kg)
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
34
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Procentele de recuperare obţinute sunt prezentate în fig.V.12-
V.14.
Fig.V.12: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care
reprezintă 50 % din LMPN
Fig. V.13: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care
reprezintă 100 % din LMPN
AOZAMOZ
AHDSEM
CAP
Conc. (µg/kg)
Recuperare (%)
124 124 136
192
64
0,620,62
0,680,96
0,320
50
100
150
200
Procentul de recuperare - Nivel 1 (0,50 µg/kg)
n = 20
AOZAMOZ
AHDSEM
CAP
Conc. (µg/kg)
Recuperare (%)
106 111 119 125
75
1,061,11
1,191,25
0,750
20
40
60
80
100
120
140
Procentul de recuperare - Nivel 2 (1 µg/kg)
n = 20
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
35
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Fig.V.14: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care
reprezintă 150 % din LMPN
Analiza cantitativă a celor 4 metaboliţi de
nitrofuran şi a cloramfenicolului în diferite probe de
miere
Metoda validată a fost aplicată la determinarea a 11 probe de
miere achiziţionate din supermarketuri şi 5 probe achiziţionate de la
producători din diferite regiuni geografice ale României în perioada mai
- august 2011.
Prelucrarea probelor Derivatizarea şi extracţia nitrofuranilor şi cloramfenicolului din
probele de miere s-a realizat astfel:
▪ mase de probă în jur de 1g de probă de miere dizolvate în 4 ml
apă distilată se incubează la 37°C timp de 30 minute şi se agită pe un
agitator pentru 10 minute până la dizolvare.
▪ peste soluţia probei se adaugă mai întâi 0,5 ml soluţie HCl 1M
şi apoi 100 µl soluţie 10mM 4-nitrobenzaldehidă. Se omogenizează
amestecul, se agită pe un agitator pentru 10 minute şi apoi se incubează
timp de 16 – 24 ore la 37°C.
AOZ AMOZ AHD SEMCAP
Conc. (µg/kg)
Recuperare (%)
123115 121
150
71
1,84 1,73 1,81 2,251,06
0
50
100
150
Nivel 3 (1,5 µg/kg)
n = 20
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
36
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
▪ după incubare, în fiecare probă se adaugă 5 ml soluţie fosfat
dipotasic (0.1M K2HPO4·3H2O). Se corectează pH-ul soluţiei obţinute
la valoarea de 7,4 cu soluţie NaOH 1M.
▪ peste această soluţie se adaugă acetat de etil (15 ml acetat de
etil la 5ml proba miere derivatizată). După agitare cu ajutorul
agitatorului Vortex timp de 2 minute, urmează omogenizarea timp de
10 minute şi centrifugarea probei 10 min la 4500 rcf.
▪ din supernatant se transferă în microtuburi câte 6 ml din fiecare
probă. Microtuburile cu probe se evaporă pentru 30 min la 60°C şi
presiune 15 psi.
▪ reziduul obţinut după evaporare se reia cu 375 µl diluant
pentru probe (AM III DIL SPE) şi se agită cu ajutorul agitatorului
Vortex timp de 2 minute.
Etape de lucru se execută manual şi sunt similare celor de la
tehnica ELISA:
Rezultate şi discuţii
Confirmarea rezultatelor obţinute prin metoda Biocip pentru
probele de miere analizate s-a realizat prin metoda LC-MS/MS,
utilizând sistemul Agilent 1100 LC (Agilent Technologies, SUA) cuplat
cu spectrometru de masă 4000 Q TRAP (Applied Biosystems, SUA).
Rezultatele probelor pozitive identificate prin metoda Biocip şi
confirmate prin metoda LC-MS/MS au evidenţiat prezenţa aceloraşi
reziduuri medicamentoase la valori peste LMPN. În proba 3 s-au
determinat concentraţii de nitrofurani (SEM şi AOZ) peste valoarea de
1 μg/kg (LMPN), valorile obţinute prin metoda Biocip fiind
comparabile cu cele obţinute prin metoda LC-MS/MS (tabel V.4).
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
37
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Tabelul V.4: Concentraţiile celor 4 nitrofurani şi cloramfenicol
determinate prin metoda Biocip şi LC-MS/MS Proba Metoda Concentraţie analit (μg/kg)
AOZ AMOZ AHD SEM CAP
Proba 1 Biocip 0,50 0,74 0,46 0,75 0,79
LC-MS/MS 0,17 0,12 0,32 0,19 0,88
Proba 2 Biocip 0,76 0,75 0,78 0,66 0,84
LC-MS/MS 0,41 0,42 0,13 0,28 0,33
Proba 3 Biocip 1,24 2,88 4,16 7,21 3,07
LC-MS/MS 1,11 1,46 2,34 6,54 2,34
Proba 4 Biocip 0,68 0,53 0,55 0,54 0,23
LC-MS/MS 0,08 0,34 0,11 0,38 0,07
Proba 5 Biocip 0,35 0,65 0,73 0,44 0,76
LC-MS/MS 0,12 0,18 0,65 0,22 0,61
Proba 6 Biocip 0,44 0,88 0,67 0,57 0,49
LC-MS/MS 0,43 0,65 0,60 0,52 0,29
Proba 7 Biocip 0,41 0,54 0,65 0,72 0,77
LC-MS/MS 0,09 0,16 0,45 0,43 0,43
Proba 8 Biocip 0,28 0,78 0,89 0,34 0,44
LC-MS/MS 0,22 0,98 0,99 0,21 0,94
Proba 9 Biocip 0,27 0,99 0,54 0,88 0,11
LC-MS/MS 0,07 0,76 0,76 0,72 0,32
Proba 10 Biocip 1,07 0,99 1,14 0,88 0,11
LC-MS/MS 0,72 0,77 0,76 0,72 0,32
Proba 11 Biocip 0,43 0,43 0,54 0,88 0,11
LC-MS/MS 0,44 0,76 0,76 0,72 0,32
Proba 12 Biocip 0,76 0,65 0,42 0,63 0,85
LC-MS/MS 0,42 0,48 0,53 0,26 0,12
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
38
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Proba Metoda Concentraţie analit (μg/kg)
AOZ AMOZ AHD SEM CAP
Proba 13 Biocip 0,43 0,74 0,89 0,34 0,44
LC-MS/MS 0,87 0,81 0,19 0,21 0,14
Proba 14 Biocip 0,89 0,89 0,54 0,88 0,11
LC-MS/MS 0,80 0,16 0,26 0,42 0,02
Proba 15 Biocip 0,89 0,79 0,54 0,88 0,11
LC-MS/MS 0,80 0,76 0,46 0,62 0,53
Proba 16 Biocip 0,89 0,89 0,54 0,88 0,11
LC-MS/MS 0,48 0,32 0,32 0,21 0,26
Rezultatele obţinute în acest studiu sunt comparabile cu cele
existente în literatura de specialitate.
Concluzii
Tehnologia Biocip a permis măsurarea simultană şi selectivă a 4
metaboliţi de nitrofurani şi a cloramfenicolului în miere la nivele mult
mai mici decât LMPN admise.
Metoda aplicată se caracterizează prin specificitate pentru
fiecare analit ţintit şi prin sensibilitate exprimată ca IC50, care a
înregistrat valori ≤ 2,32 µg/kg.
Metoda prezintă o precizie foarte bună atât în cadrul aceleeaşi
serii analitice, cât şi în serii analitice diferite, cu valori tipice mai mici
de 15 % pentru concentraţiile de 0,5, 1 şi 1,5 µg/kg. Limita de decizie
(CCα) obţinută pentru determinarea metaboliţilor a 4 nitrofurani şi
cloramfenicolului s-a încadrat între valorile 0,37 µg/kg şi 1,05 µg/kg.
Capabilitatea de detecţie (CCβ) a înregistrat valori care s-au încadrat în
intervalul 0,42 - 1,14 µg/kg. Coeficientul de recuperare obţinut s-a
situat în domeniul 64 – 192 % faţă de concentraţia iniţială.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
39
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
CAPITOLUL VI - ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE
CHINOLONE ŞI ANTIBIOTICE ÎN MIEREA DE ALBINE
Scopul cercetãrii
Studiul din acest capitol a avut drept scop validarea unei
metode de determinare simultană a chinolonelor (QNL),
cefalosporinelor (ceftiofur - CEFT), amfenicolilor (tiamfenicol - TAF),
aminoglicozidelor (streptomicina - STR), macrolidelor (tilozina - TYL),
tetraciclinelor (TCN) utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la
analiza probelor de miere.
Introducere
Chinolonele constituie o clasă de agenţi antimicrobieni sintetici
eficienţi în tratamentul multor boli infecţioase provocate de bacterii atât
în medicina umană, cît şi în cea veterinară.
Majoritatea utilizărilor de uz veterinar al acestor chimioterapice
antimicrobiene este sub formă de fluorochinolone. Deşi la ora actuală
datele ştiinţifice privind eficacitatea fluorochinolonelor în apicultură
sunt reduse, utilizarea acestora ca profilaxie a bolilor albinelor, în
special în Asia, a luat amploare în ultimii ani. Această utilizarea a fost
confirmată de detectarea reziduurilor de chinolone în mierea din acea
zona (Savoy Perroud, 2009).
Utilizarea pe scară largă a chinolonelor în medicina veterinară
reprezintă un pericol potențial pentru sănătatea umană; acestea fi
prezente sub formă de reziduuri în produsele alimentare (Wegener,
1999), care poate determina reacții alergice sau fenomene de rezistenţă
la antibiotice la om.
Ceftiofurul face parte din cefalosporinele de generaţia a treia,
dezvoltate exclusiv pentru uz veterinar. Este bactericid in vitro prin
inhibarea sintezei peretelui celular al germenilor.
În ultimii ani, ceftiofurul a fost folosit în apicultură pentru
tratarea infecţiilor bacteriene deşi nu este recomandat în timpul
producţiei mierii, totuşi poate fi detectat în miere (Moats, Buckley,
1998).
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
40
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Tiamfenicolul şi fluorfenicolul sunt antibiotice cu spectrul larg,
foarte asemănătoare ca structură şi mod de a acţiona cu cele ale
cloramfenicolului.
Streptomicina se utilizează în apicultură împotriva bolii Loca
americana şi Loca europena în mai multe ţări, în special în America
Centrală şi de Sud.
În ciuda faptului că tratamentele cu streptomicină nu sunt
permise în cele mai multe țări (UE, SUA) datorită toxicităţii crescute,
utilizarea acesteia este adesea sugerată în diferite forumuri apicole și în
manualele de apicultură (Mutinelli, 2003). În China, streptomicina și cloramfenicolul au fost antibiotice preferate pentru a controla un mare
focar de boală Loca americana în 1997 (Ortelli et al., 2004).
Macrolidele sunt chimioterapice antibacteriene larg răspândinte
în practica medicală şi veterinară. Din grupa macrolidelor mai face
parte tilozină care este utilizată la nivel global în apicultură şi a cărei
eficacitate a fost dovedită de către autori diferiţi (Hitchcock et al., 1970;
Moffett et al., 1970; Peng et al., 1996; Pettis, Feldlaufer, 2005).
Tetraciclinele sunt chimioterapice antimicrobiene cu spectru larg
bacteriostatic, cu o lungă istorie în medicina veterinară. Oxitetraciclina,
de obicei sub formă de clorhidrat, este utilizată în apicultură de la
începutul anilor cincizeci în tratamentul bolilor bacteriene de puiet, cum
ar fi Loca americana (Hopingarner, Nelson, 1987; Spivak, 2000) și Loca europeana (Oldroyd et al., 1989.; Waite et al, 2003;. Thompson et
al., 2005).
Material şi metodă
Tehnologia Biocip a permis determinarea simultană, cantitativă
atât a compuşilor părinte din cele 6 clase de chimioterapice
antimicrobiene cât şi a principalilor metaboliţi ai acestora. Toate determinările au fost efectuate pe analizorul Evidence
Investigator produs de firma Randox, UK.
Toţi reactivii sunt multianalit şi sunt furnizaţi de producătorul
aparatului într-un kit compact care include:
Anti Microbial Array II (EV3524) produs de Randox
Laboratories, UK
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
41
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Control: Multianalit Control (cod de catalog AMC5004,
Randox Laboratories, UK).
Validarea metodei
Validarea metodei de determinare cantitativă simultană a celor
6 tipuri de chimioterapice antimicrobiene luate în studiu utilizând
tehnologia Biocip reprezintă un protocol care întruneşte concomintent
cerinţele deciziei 2002/657/CE şi posibilităţile unui laborator oficial cu
număr mare de probe de testat.
Parametrii de validare evaluaţi au fost următorii: calibrarea
(liniaritatea); sensibilitatea (IC50); specificitatea şi selectivitatea;
precizia (intermediară şi reproductibilitate) şi acurateţea; limita de
detecţie; regăsirea (recuperarea). Valorile parametrilor de validare sunt
inserate în tabel VI.1 şi tabel VI.2.
Limita de decizie obţinută pentru clasele de antibiotice
determinate s-a încadrat între valorile 1,25 µg/kg şi 5,5 µg/kg.
Capabilitatea de detecţie obţinută pentru aceleaşi chimioterapice s-a
încadrat între valorile 2,05 µg/kg şi 8,81 µg/kg.
Valorile obţinute sunt redate în tabel VI.2 şi fig. VI.16.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
42
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Fig. VI.16: Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ)
0
2
4
6
8
10CEFT
QNL
STR
TCN
TAF
TYL
Limita de decizie CCα (μg/kg)
Capabilitatea de detecţie CCβ (μg/kg)
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e albin
e
43
Tabelul VI.1: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie şi acurateţe)
Parametrii de validare ANALIT
CEFT QNL STR TCN TAF TYL L
inia
rita
te
Interval de calibrare (μg/kg) 0 - 7 0 - 11,5 0 - 76 0 - 4 0 - 5 0 - 5
Coeficient de corelatie r 0,986 0,982 0,987 0,994 0,998 0,991
Sen
ibil
ita
te
IC 50 (μg/kg) 0,25 0,52 1,30 1,70 0,50 0,55
Pre
cizi
e şi
acu
rate
ţe
Ace
eaşi
ser
ie
Nivel 1 Conc.(μg/kg) 1,25 0,63 3,91 1,48 0,31 0,31
CV (%) 6,8 4,30 4,60 6,90 3,40 5,00
Nivel 2 Conc.(μg/kg) 2,50 1,25 7,81 2,22 0,63 0,63
CV (%) 5,80 6,60 3,40 7,60 4,50 4,00
Nivel 3 Conc.(μg/kg) 5,00 2,50 15,63 3,33 1,25 1,25
CV (%) 5,00 6,80 4,60 5,70 6,80 4,00
Ser
ii d
ifer
ite
Nivel 1 Conc.(μg/kg) 0,49 0,93 5,03 0,99 0,38 0,33
CV (%) 6,80 4,30 4,60 6,90 3,40 5,00
Nivel 2 Conc.(μg/kg) 1,05 1,80 8,51 1,43 0,59 0,66
CV (%) 5,80 6,60 3,40 7,60 4,50 4,00
Nivel 3 Conc.(μg/kg) 1,97 3,29 18,88 2,25 1,17 1,28
CV (%) 5,00 6,80 4,60 5,70 6,80 4,00
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
ed
icamen
toase d
in m
ierea de
albin
e
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e albin
e
44
Tabelul VI.2: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie şi capabilitate de detecţie)
Parametrii de validare ANALIT
CEFT QNL STR TCN TAF TYL R
ecu
per
are
a
Nivel 1 Conc.(μg/kg) 0,56 0,62 0,57 0,63 0,60 0,60
Recuperare (%) 112 123 113 125 119 119
Nivel 2 Conc.(μg/kg) 0,87 1,00 0,91 0,84 1,00 1,05
Recuperare (%) 87 100 91 84 100 105
Nivel 3 Conc.(μg/kg) 1,54 1,74 2,00 1,68 1,98 1,86
Recuperare (%) 77 87 100 84 99 93
1L
imit
a d
e d
eciz
ie C
Cα
şi
cap
ab
ilit
ate
de
det
ecţi
e C
Cβ
Conc. medie (μg/kg) 0,49 0,93 5,03 0,99 0,38 0,33
DS 2,44 1,52 0,28 2,38 0,53 0,65
1,64 x DS 4,01 2,50 0,47 3,91 0,87 1,07
CCα (μg/kg) 4,50 3,43 5,50 4,90 1,25 1,40
CCβ (μg/kg) 8,51 5,93 5,97 8,81 2,05 2,47
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
45
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Analiza cantitativă a chinolonelor şi a diferitelor
tipuri de antibiotice în probe de miere Metoda validată a fost aplicată pe 43 de probe de miere de
diferite sortimente în vederea determinării reziduurilor de chinolone şi
antibiotice.
Prelucrarea probelor
Eşantioane de miere analizate prin metoda LC-MS/MS şi
identificate ca fiind fără reziduuri de medicamente au fost utilizate ca şi
probe blanc sau controale negative în cadrul protocolului de validare.
Optimizarea procedurii de extracţie
Datorită faptului că mierea este o matrice complexă ce conţine
zaharuri, dar şi alte substanţe precum pigmenţi sau compuşi fenolici,
care trebuie eliminaţi înainte de începerea determinărilor de reziduuri
medicamentose, am inclus o etapă de extracţie în cadrul protocolului de
testare, ţinînd cont de proprietăţile diferite ale antibioticelor incluse în
studiu.
S-a luat în considerare necesitatea de a dezvolta o metodă
comună pentru extracţia simultană a mai multor clase de antibiotice.
Prelucrarea probelor poate fi făcută în două moduri:
Metoda diluţiei rapide:
cântărirea a ≈ 1 g de miere;
adăugarea a 9 ml de soluţie tampon de reacţie (37oC);
omogenizare, diluţie şi filtrare;
aplicarea probei pe suprafaţa de microtitrare (biocip).
Metoda extracţiei:
cântărirea a ≈ 1 g de miere;
adăugarea a 9 ml de soluţie tampon de reacţie (37oC);
vortexare şi adăugare de acetat de etil;
vortexare, omogenizare, centrifugare;
eluare şi evaporare până la uscare a stratului organic superior;
resuspensie în soluţie tampon de reacţie şi vortexare;
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
46
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
aplicarea probei pe suprafaţa de microtitrare (biocip).
Etape de lucru se execută manual şi sunt similare celor de la
tehnica ELISA.
Rezultate şi discuţii
După testarea celor 43 probe de miere, în 9 probe au fost
identificate reziduuri de chinolone, ceftiofur, tiamfenicol, streptomicină,
tilozină şi tetracicline. Atât probele pozitive cât şi cele negative au fost
confirmate prin metoda LC-MS/MS. După cum se observă din datele
prezentate în tabel VI.9, valorile de concentraţie obţinute cu ajutorul
metodei Biocip sunt comparabile cu cele obţinute prin metoda LC-
MS/MS. Doar pentru o singură probă au fost identificate reziduuri de
tilozină cu ajutorul Panelului Antimicrobian II, ceee ce nu s-a confirmat
prin metoda LC-MS/MS. Astfel, putem afirma că pentru tilozină, în
probe de miere, metoda Biocip a permis detectarea cu precizie a unei
valori mici de concentraţie, însă această concentraţie de 1.9 μg/kg nu a
fost detectată de metoda LC-MS/MS. Acest rezultat ar putea de
asemenea să indice faptul că sensibilitatea metodei Biocip este mult mai
înaltă decât cea a metodei LC-MS/MS.
Rezultatele comparative pentru cele 9 probe de miere pozitive
pentru reziduurile de antibiotice analizate sunt prezentate în tabelul
VI.9.
Rezultatele probelor pozitive identificate prin metoda Biocip şi
confirmate prin metoda LC-MS/MS au evidenţiat prezenţa aceloraşi
antibiotice la valori peste LMPN şi anume: ciprofloxacină,
norfloxacină, streptomicină, tilozină şi clortetraciclină.
Cele 9 probe pozitive de miere provin de la apicultori particulari
din diferite regiuni geografice din România.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
47
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Tabelul VI.9. Concentraţiile celor 6 clase de antibiotice în probele de
miere determinate prin metoda Biocip şi confirmate prin metoda LC-MS/MS Proba Metoda QNL
(µg/kg)
CEFT
(µg/kg)
TAF
(µg/kg)
STR
(µg/kg)
TYL
(µg/kg)
TCN
(µg/kg)
Proba
1
Biocip < LOD < LOD < LOD < LOD 3.4 < LOD
LC-
MS/MS
< LOD < LOD < LOD < LOD 6 < LOD
Proba
2
Biocip 10.4 < LOD < LOD 29 < LOD < LOD
LC-
MS/MS
Ciprofloxacină
5µg/kg,
Norfloxacină
7µg/kg
< LOD < LOD 22 < LOD < LOD
Proba
3
Biocip 54.9 < LOD < LOD 34.9 < LOD < LOD
LC-
MS/MS
Ciprofloxacină
41µg/kg,
Norfloxacină
10µg/kg
< LOD < LOD 28 < LOD < LOD
Proba
4
Biocip 12.7 < LOD < LOD < LOD < LOD 10.7
LC-
MS/MS
Ciprofloxacină
4µg/kg,
Norfloxacină
2µg/kg
< LOD < LOD < LOD < LOD Clor-
tetraciclină
8µg/kg
Proba
5
Biocip 11.4 < LOD < LOD 26.6 < LOD < LOD
LC-
MS/MS
Ciprofloxacină
7 µg/kg,
Norfloxacină
3µg/kg
< LOD < LOD 19 < LOD < LOD
Proba
6
Biocip < LOD < LOD < LOD 17.8 < LOD < LOD
LC-
MS/MS
< LOD < LOD < LOD 18 < LOD < LOD
Proba
7
Biocip 9.4 < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD
LC-
MS/MS
Ciprofloxacină
6µg/kg,
Norfloxacină
4µg/kg
< LOD < LOD < LOD < LOD < LOD
Proba
8
Biocip 24.6 < LOD < LOD 13.4 < LOD < LOD
LC-
MS/MS
Ciprofloxacină
3µg/kg,
Norfloxacină
15µg/kg
< LOD < LOD 11 < LOD < LOD
Proba
9
Biocip < LOD < LOD < LOD < LOD 1.9 < LOD
LC-
MS/MS
< LOD < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
48
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Rezultatele obţinute în acest studiu sunt comparabile cu cele
existente în literatura de specialitate.
Vidal et al. (2009) au dezvoltat recent o metodă pentru
detectarea simultană a 16 antibiotice (macrolide, tetracicline, chinolone
şi sulfonamide). Majoritatea probelor de miere au fost achiziţionate din
supermarketuri, iar cinci dintre ele au fost colectate de la diferiţi
apicultori particulari din Granada şi Almería. Rezultatele studiului au
relevant un conţinut de 8,6 μg/kg în una din probele comercializate, în
timp ce o probă provenită de la un apicultor particular a prezentat urme
de sarafloxacină şi reziduuri de tilozină, sulfadimidină şi
sulfaclorpiridazină (Vidal et al., 2009).
Concluzii Sub aspectul performanţei analitice, metoda Biocip prezintă o
precizie excelentă atât în cadrul aceleeaşi serii analitice, cât şi în serii
analitice diferite, cu valori tipice mai mici de 15 % pentru concentraţiile
de 0,5, 1 şi 1,50 µg/kg. Limita de decizie (CCα) obţinută pentru cele 6
clase de chimioterapice antimicrobiene determinate s-a încadrat între
valorile 1,25 µg/kg şi 5,5 µg/kg. Capabilitatea de detecţie (CCβ) a
înregistrat valori situate în intervalul 2,05 - 8,81 µg/kg. Coeficientul de
recuperare obţinut s-a situat în domeniul 77– 125 % faţă de concentraţia
iniţială. Performanţele metodei Biocip au fost corespunzătoare,
rezultatele obţinute au fost comparabile cu valorile de concentraţie
determinate prin metoda confirmatorie, atât pentru probele pozitive cât
şi pentru probele negative.
Panelul Antimicrobian II reprezintă un sistem foarte eficient
pentru detectarea şi cuantificarea simultană multianalit pentru 6 clase
diferite de chimioterapice antimicrobiene în probe de miere.
Compararea rezultatelor obţinute prin metoda Biocip şi LC-MS/MS a
evidenţiat că metoda biosenzor propusă, prezintă adecvare la scopul
propus, şi anume determinarea concentraţiei fiecărui analit în parte, în
cadrul programelor europene de supraveghere a siguranţei alimentelor.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
49
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
CAPITOLUL VII - STUDIU EXPERIMENTAL AL
INFLUENŢEI REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE
(SULFONAMIDE) DIN MIERE ASUPRA UNOR
PARAMETRI BIOCHIMICI, IMUNOLOGICI ŞI
HEMATOLOGICI LA ANIMALE DE LABORATOR
Scopul cercetării
Obiectivele cercetărilor incluse în acest capitol au urmărit
studierea influenţei unor reziduuri medicamentoase (sulfonamide) din
mierea de albine asupra şobolanilor, rasa Wistar prin:
• evaluarea modificărilor valorilor plasmatice ale parametrilor
implicaţi în reacţiile de hipersensibilitate de tip alergic prin analizarea
variaţiei valorilor serice ale citokinelor: interleukina IL-2, IL-4, IL-6,
IL-8, IL-10, factorul de creştere al endoteliului vascular (VEGF),
interferon gamma (IFNγ), factor de necroză tumorală alfa (TNFα), IL-
1α, IL-1β, MCP-1, factorul de creştere epidermică (EGF), înainte şi
după administrarea de miere de albine conţinând un amestec de
sulfonamide (20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina,
sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol, sulfadimetoxina)
• evaluarea unor parametri biochimici (uree, creatinină, acid
uric, bilirubină totală, bilirubină directă, aspartat aminotransferaza -
AST, alanin aminotransferaza - ALT, triiodotironina - T3, tiroxina - T4)
şi hematologici (hematocrit - Hct, hemoglobina - Hb, numărătoare
globule roşii - RBC, concentraţia medie a hemoglobinei dintr-un volum
dat de eritrocite - MCHC, volum eritrocitar mediu - MCV) după
administrare de miere conţinând sulfonamide.
Introducere
Chimioterapicele antimicrobiene sunt eficiente împotriva bolilor
albinelor, însă reziduurile medicamentoase pot să persiste o perioadă
mai mare de timp în ţesuturi (uneori chiar şi o lună), iar consumul de
miere care conţine astfel de reziduuri reprezintă un potenţial risc pentru
sănătatea omului. Literatura include date privind toxicitatea acestor
compuşi.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
50
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Intensitatea acţiunii, durata de acţiune şi toxicitatea
sulfonamidelor derivă din capacitatea organismului de a le transforma
în sulfonilamidă, activitatea antibacteriană datorându-se structurii
sulfanilamidice. Prezenţa grupei metoxi pe radicalii heterociclici
determină o întârziere a eliminării din organism şi o acţiune prelungită
(Castrejon, 2010).
Se consideră că sulfonamidele au o toxicitate medie care include
tulburări gastrointestinale (greaţă, vomă, diaree), reacţii de
hipersensibilitate (alergice) care constau în erupţii cutanate, eozinofilie,
rareori şoc anafilactic; la persoanele cu deficit genetic de glucozo-6-
fosfat dehidrogenază a enterocitelor poate apărea anemia hemolitică.
Sulfamidele au acţiune competitivă cu bilirubina pentru situsurile de
legare ale acesteia şi de aceea nu trebuie administrate în ultimul
trimestru de sarcină şi la nou-născut. Bilirubina nelegată se poate
depozita în ganglionii bazali ai creierului şi în subtalamus, determinând
encefalopatie toxică (icter nuclear – Kernicterus) (Naisbitt et al., 2001;
Verdel et al., 2006 ).
În urma biotestelor efectuate la rozătoare s-a raportat că
sulfametazinul produce tumori cu diferite localizări; de asemenea au
fost prezentate dovezi privind toxicitatea sulfonamidelor asupra glandei
tiroide (Finkelman, 2007). Unele sulfonamide inhibă prin mecanism
competitiv lactoperoxidaza şi tiroid peroxidaza, mediatori în sinteza
hormonilor tiroidieni, putând conduce la hipertiroidism.
În plus sulfonamidele pot da uneori febra medicamentoasă,
boala serului şi lupus eritematos sistemic (hipersensibilitate de tip III
mediată de imunoglobulinele G), toxicitate hepatică (inclusiv necroza).
Sulfonamidele pot da reacţii alergice severe, incluzând toxicitate
hepatică şi hematologică, pe lângă toxicitatea dermatologică. Şi reacţiile
de fotosensibilizare sunt relativ frecvente la sulfonamide. Aproximativ
3% din populaţie este afectată de reacţii alergice la sulfonamide.
Citotoxicitatea compuşilor hidroxilaminici asupra limfocitelor umane a
fost demonstrată prin studii in vitro (Contreras, 2003). Aceşti compuşi
produc ocazional un număr de reacţii alergice (hipersensibilitate), de la
rash-uri tegumentare minore (inclusiv reacţii maculopapulare şi reacţii
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
51
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
de tip pruriginos care apar tipic după o săptămână de tratament), până la
reacţii severe sau care pun uneori în pericol viaţa pacienţilor cum ar fi:
eritemul multiform, sindromul Stens-Johnson şi necroliza epidermică
toxică. Reacţiile de hipersensibilitate la niveluri terapeutice de
sulfonamide, au fost intens studiate în schimb nu s-au raportat cazuri
de alergie la sulfonamide datorită ingestiei de alimente contaminate cu
reziduuri medicamentoase, însă manifestările specifice ar fi greu de
recunoscut la doze atât de mici. Deoarece în publicaţiile din literatura
de specialitate sunt disponibile doar date limitate am decis efectuarea
unei evaluări mai complete pentru acest aspect.
Biomarkerii care evidenţiază reacţile de hipersensibilitate sunt
citokinele, imunoglobulinele E, limfocitele şi histamina.
Evidenţierea răspunsului imun la şobolani după administrare
de miere conţinând sulfonamide
Protocol experimental
Studiul s-a desfăşurat pe 2 loturi de şobolani care au consumat
miere conţinând amestec de sulfonamide (100 µg/kg amestec de 5
sulfonamide - 20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina,
sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol, sulfadimetoxina);
concentraţiile citokinelor obţinute au fost comparate cu valorile obţinute
pentru lotul martor. Fiecare lot a inclus 15 şobolani, pentru ca
semnificaţia statistică să fie acceptabilă, iar lotul martor a fost format
din 10 şobolani.
Pentru acest studiu s-au selecţionat femele de şobolani rasa
Wistar cu greutate de 180 - 220 g. Şobolanii au fost împărţiti în 3 loturi:
l - lot de control – administrare prin gavaj gastric de hrană standard şi 2
ml miere de albine, lotul 2 - şobolani cărora li s-au administrat prin
gavaj gastric timp de 5 zile, miere cu amestec de sulfonamide şi lotul 3
- şobolani cărora li s-au administrat prin gavaj gastric 2 ml de miere
îmbogăţită cu 100 µg/kg amestec de sulfonamide, timp de 14 zile
consecutiv.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
52
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e U
niversitatea d
e Med
icină şi Farm
acie „Grigo
re T. Po
pa” - Iaşi, Facu
ltatea de Farm
acie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Studiul a fost realizat în conformitate cu aprobarea emisă de
către Comitetul de Etică a Cercetării al Universităţii de Medicină şi
Farmacie "Grigore T. Popa "- Iaşi.
Material şi metodă
Determinările cantitative ale citokinelor, s-au efectuat pe
analizorul Evidence Investigator (Randox Laboratories, UK),
determinările cantitative ale imunoglobulinei E (IgE) s-au efectuat pe
aparatul Stat Fax 303 Plus (Awareness Technology, SUA), iar
eozinofilele s-au determinat pe analizorul automat de hematologie,
model Sysmex XT 1800i (Sysmex Europe Gmbh, Germania).
Reactivi:
Rectivi pentru determinarea simultană a 12 citokine: IL-2,
IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, IFNγ, TNFα, IL-1α, IL-1β, MCP-1,
EGF sunt furnizaţi într-un kit compact care cuprinde:
Kit High Sensitivity Cytokine Array I (cod EV3623,
producător Randox Laboratories, UK)
Control : Multianalit Control (Randox Laboratories, UK)
utilizat pentru verificarea preciziei şi acurateţii metodei
Reactivi pentru determinările de IgE: kit ELISA (Clin Pro
Internaţional, SUA), cod EH-518
Reactivi pentru determinarea hemoleucogramei sunt
reactivi dedicaţi pentru analizorul automat de hematologie Sysmex XT
1800i.
Prelucrarea şi interpretarea statistică
Datele obţinute au fost prelucrate statistic în vederea eliminării
variaţiilor biologice şi a erorilor de determinare şi totodată pentru
validarea rezultatelor studiului. S-a efectuat în acest scop descrierea
statistică a eşantioanelor de probe pentru obţinerea descriptorilor de
interes (medie, mediană, eroare standard a mediei - ES, deviaţie
standard, varianţă, amplitudine, coeficient Skewness, coeficient
Kurtosis).
Prelucrarea şi reprezentarea grafică a datelor s-a realizat
utilizând module de lucru ale softurilor MedCalc şi Microsoft Office
2007.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
53
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Testele statistice aplicate: pentru probele cu valori normal
distribuite au fost t-Student pentru probe independente cu varianţe egale
şi t-Student pentru probe independente cu varianţe inegale, iar pentru
cele a căror distribuţie nu a putut fi normalizată - testul Mann-Whitney.
Pentru a verifica normalitatea distribuţiei datelor s-au utilizat
testele D’Agostino-Pearson şi Kolmogorov-Smirnov.
Rezultate
A. Analiza comparativă a rezultatelor parametrilor
analizaţi Rezultatele obţinute pentru determinarea citokinelor, IgE şi
eozinofilelor în urma administrării de miere conţinând reziduuri de
sulfonamide la şobolani Wistar sunt redate în tabel VII..4.
Media valorilor obţinute pentru citokine, IgE şi eozinofile în
cadrul loturilor analizate este prezentată în fig.VII.9 - VII.10.
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e albin
e
54
Fig.VII.9: Variaţia valorilor interleukinelor Th-1 derivate (A), Th-2 derivate (B) şi APC derivate (C)
Fig. VII.10: Variaţia valorilor factorilor de creştere (A), a valorilor IgE (B) şi eozinofilelor (C)
B
5,39
16,14
14,19
2,85
9,288,37
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Lot 1 Lot 2 Lot 3
0
2
4
6
8
10
12
De
via
tia
sta
nd
ard
a m
ed
iei
IL-4
(pg/mL)
IL-10
(pg/mL)
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
55
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Tabelul VII.4: Tabelul sinoptic al rezultatelor determinărilor de
citokine, IgE şi eozinofile Parametru
determinat
Media ± DS
Lot 1 (n = 10) Lot 2 (n = 15) Lot 3 (n = 15)
Interleukine Th-1
derivate (pg/ml)
IL-2 4,96 ± 0,73± 6,57± 0,72 6,75± 0,73
IFN-γ 4,07± 0,45 6,80 ± 0,85 6,71 ± 0,78
Interleukine Th-2
derivate (pg/ml)
IL-4 5,39 ± 0,73 14,19 ± 2,35 16,14 ± 2,87
IL-10 2,85 ± 0,28 9,28 ± 2,92 8,37 ± 2,13
Interleukine APC
derivate (pg/ml)
IL-1α 3,22 ± 0,47 3,17 ± 0,35 2,57 ± 0,21
IL-1β 4,68 ± 1,24 3,84 ± 1,29 5.99 ± 2.07
IL-6 5,23 ± 0,50 9,85 ± 2,50 8,16 ± 1,39
IL-8 4,58 ± 0,67 9,34 ± 2,07 8,56 ± 2,07
TNF-α 3,04 ± 0,24 4,66 ± 0,48 4,93 ± 0,54
Factori de creştere
(pg/ml)
VEGF 2,91 ± 0,36 8,53 ± 1,91 8,59 ± 1,91
MCP1 137,1 ± 1,26 150,51 ± 4,03 148,31 ± 3,62
EGF 4,76 ± 0,63 6,72 ± 0,81 6,85 ± 1,00
IgE (UI/ml) 2,05 ± 0,34 14,43 ± 2,52 16,03 ± 3,08
Eozinofile (%) 2,42 ± 0,42 7,18 ± 0,90 8,33 ± 0,96
B. Analiza corelaţiei rezultatelor citokinelor implicate în
reacţia alergică cu rezultatele IgE şi a eozinofilelor.
Valorile fiecărui lot examinat au fost considerate ca fiind diferite
semnificativ statistic faţă de celelalte pentru un anumit parametru atunci
când probabilitatea de eroare a fost mai mică de 0,05 (p < 0,05).
Pentru compararea variabilelor cantitative s-a folosit indicele de
corelaţie Pearson (r). Procentul în care valorile variabilelor analizate
sunt realmente corelate este indicat de coeficientul de corelare Pearson
(R2
).
Analiza parametrilor luaţi în studiu pentru fiecare lot şi corelaţia
între valorile lor cu ajutorul indicelui de corelaţie Pearson este ilustrată
în tabel VII.19- VII.20.
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e albin
e
56
Tabelul VII.19: Analiza corelaţiei citokinelor cu IgE Interleukine Th-1
derivate
Interleukine Th-2
derivate
Interleukine APC derivate Factori de creştere
IL-2
(pg/ml)
IFN-γ
(pg/ml)
IL-4
(pg/ml)
IL -10
(pg/ml)
IL-1α
(pg/ml)
IL-1β
(pg/ml)
IL-6
(pg/ml)
IL-8
(pg/ml)
TNF-α
(pg/ml)
VEGF
(pg/ml)
MCP1
(pg/ml)
EGF
(pg/ml)
Lot
1
r 0,2434 -0,1098 -0,3065 -0,0486 0,0492 0,1340 -0,1928 -0,3676 0,2860 -0,3950 -0,2191 -0,2606
P 0,4981 0,7627 0,3891 0,8939 0,8926 0,7121 0,5935 0,2960 0,4231 0,2586 0,5431 0,4670
R2 0,0592 0,0121 0,0939 0,0024 0,0024 0,0180 0,0372 0,1351 0,0818 0,1560 0,0480 0,0679
Lot
2
r 0,0586 -0,3220 0,8579 0,5250 -0,0299 0,1240 -0,00357 0,1639 0,5319 0,1500 -0,1570 -0,1875
P 0,8357 0,2418 < 0,0001*** 0,0445* 0,9158 0,6597 0,9899 0,5594 0,0413* 0,5936 0,5763 0,5034
R2 0.0034 0,1037 0,7360 0,2756 0,0009 0,0154
0,1274 x
10-6 0,0269 0,2829 0,0225 0,0246 0,0352
Lot
3
r 0,5887 0,6019 0,7537 0,3130 0,5582 0,4170 0,3137 0,2180 0,3160 -0,1235 0,3933 0,1560
P 0,0210* 0,0176 0,0012** 0,2560 0,0306* 0,1220 0,2548 0,4350 0,2512 0,6610 0,1469 0,5788
R2 0,3466 0,3622 0,5681 0,0980 0,3115 0,1739 0,0984 0,0475 0,0999 0,0153 0,1547 0,0243
p < 0.05 semnificativ(*), p ≤ 0,01 distinct semnificativ (**), p ≤ 0,001 foarte semnificativ (***)
57
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e albin
e
57
Tabelul VII.20: Analiza corelaţiei citokinelor cu eozinofilele Interleukine Th-1
derivate
Interleukine Th-2
derivate
Interleukine APC derivate Factori de creştere
IL-2
(pg/ml)
IFN-γ
(pg/ml)
IL-4
(pg/ml)
IL -10
(pg/ml)
IL-1α
(pg/ml)
IL-1β
(pg/ml)
IL-6
(pg/ml)
IL-8
(pg/ml)
TNF-α
(pg/ml)
VEGF
(pg/ml)
MCP1
(pg/ml)
EGF
(pg/ml)
Lot 1 r 0,3426 -0,1593 -0,4433 -0,4420 0,2597 0,0545 -0,4268 -0,2998 -0,0303 0,0909 -0,3271 -0,5131
P 0,3325 0,6601 0,1994 0,2009 0,4687 0,8811 0,2187 0,4001 0,9338 0,8028 0,3563 0,1293
R2 0,1174 0,0254 0,1966 0,1954 0,0674 0,0030 0,1821 0,0898 0,0009 0,0083 0,1070 0,2633
Lot 2 r -0,0184 0,0025 0,6865 0,4610 -0,1119 0,2600 0,0179 0,1183 0,2401 0,2640 -0,0340 -0,1516
P 0,9482 0,9928 0,0047** 0,0837 0,6913 0,3493 0,9495 0,6747 0,3888 0,3417 0,9043 0,5897
R2 0,0003
0,0645 x 10-
4 0,4713 0,2125 0,0125 0,0676
0,3204 x
10-3 0,0140 0,0576 0,0697 0,0012 0,0230
Lot 3 r 0,5280 0,3553 0,5857 0,2930 0,6600 0,4630 0,1905 0,2630 0,4650 -0,0895 0,3627 0,0948
P 0,0431* 0,1937 0,0218* 0,2892 0,0074** 0,0822 0,4964 0,3436 0,0807 0,7512 0,1840 0,7368
R2 0,2788 0,1263 0,3431 0,0858 0,4356 0,2144 0,0363 0,0692 0,2162 0,0080 0,1315 0,0090
p < 0.05 semnificativ(*), p ≤ 0,01 distinct semnificativ (**), p ≤ 0,001 foarte semnificativ (***)
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
58
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e alb
ine
Discuţii
Reacţiile de hipersensibilitate/întârziată tip IV, mediate de
citokine eliberate de celulele T sensibilizate, activează cascada reacţiilor
sistemului imunitar implicată în producerea leziunilor tisulare
(Castrejon et al., 2010).
În urma măsurării concentraţiilor citokinelor serice APC
derivate la loturile de şobolanii studiate putem concluziona că citokine
au prezentat valori serice semnificativ crescute ale IL-1α, IL-1β, IL-6,
IL-8, TNF-α în cadrul loturilor 2 şi 3 comparativ cu lotul martor,
concentraţiile medii fiind corelate cu perioada de timp pe care s-a
desfaşurat administrarea de miere cu sulfonamide.
Rezultatele obţinute concordă cu mecanismele imunologice şi
datele prezentate în literatură, în cadrul studiilor privitoare la reacţiile
de hipersensibilitate la sulfonamide. Astfel, interleukinele IL-1α, IL-1β,
IL-6, IL-8, TNF-α sunt produse de către celulele dendritice mature
numite, grupate sub denumirea de interleukine APC (antigen-presenting
cell) derivate, ele având un rol crucial în iniţierea răspunsului imun de
către limfocitele T. (Sallusto, Lanzavecchia, 1994).
Concluzii
În urma măsurării concentraţiilor citokinelor serice la loturile de
şobolanii studiate putem concluziona că citokinele analizate prezintă
profil dublu pro-inflamator şi anti-inflamator şi diferă de cele ale
şobolanilor din lotul martor. Douăsprezece componente diferite, atât
pro- cât şi anti-inflamatorii, au fost analizate: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-
10, VEGF, IFNγ, TNF, IL-1α, IL-1β, MCP-1 şi FEG.
Evaluarea modificărilor profilului de citokine după
administrarea de miere conţinând sulfonamide a condus la rezultate care
evidenţiază faptul că la şobolanii care au consumat miere conţinând
sulfonamide nivelurile de citokine IL-4 şi IL-10, împreună cu IgE şi
eozinofilele plasmatice au crescut de 5-30 ori. Prin contrast, nu s-au
observat concentraţii semnificativ crescute ale citokinelor pro-
inflamatorii, cum ar fi TNF, IL-1α sau IL-1β. Concentraţiile citokinelor
studiate, care sunt indici de hipersensibilitate, sunt crescute în sânge şi
se corelează cu prezenţa de eozinofilie la şobolani, după ingestia de
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
59
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
miere conţinând sulfonamide. Celelalte tipuri de citokine au fost uşor
crescute, cu nivele de concentraţie care, în studiul de faţă nu par a fi
corelate cu biomarkerii indicatori de hipersensibilitate.
Valorile obţinute pentru citokinele IL-4 şi IL-10, împreună cu
IgE şi eozinofilele indică un răspuns maxim după o expunere timp de
14 zile, diferenţele fiind semnificative statistic comparativ cu lotul
martor.
Determinarea citokinelor plasmatice este un instrument util în
studiul reacţiilor de hipersensibilitate de tip întârziat la şobolani.
Evaluarea parametrilor biochimici şi hematologici la şobolani
după administrare de miere conţinând reziduuri de
sulfonamide
Protocol experimental
Studiul s-a desfăşurat pe 1 lot de şobolani care a consumat miere
conţinând amestec de sulfonamide (100 µg/kg amestec de 5
sulfonamide - 20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina,
sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol, sulfadimetoxina), iar
concentraţiile obţinute pentru parametri biochimici, hematologici şi
imunologici au fost comparate cu valorile obţinute pentru lotul martor.
Fiecare lot a inclus 5 şobolani, număr minim necesar pentru ca
semnificaţia statistică a studiului să fie acceptabilă.
Material şi metodă
Determinările cantitative ale parametrilor biochimici (uree,
creatinină, acid uric, bilirubină totală, bilirubină directă, AST, ALT)
vizaţi de experimentul realizat s-au efectuat pe analizorul automat Rx
Imola (Randox Laboratories, UK), parametrii imunologici (T3, T4) s-au
efectuat pe aparatul Stat Fax 303 Plus (Awareness Technology, SUA),
iar parametri hematologici s-au efectuat pe analizorul automat de
hematologie, model Sysmex XT 1800i (Sysmex Europe Gmbh,
Germania).
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
60
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Reactivi:
Rectivi pentru determinări biochimice sunt produşi de
firma Randox Laboratories, UK şi sunt reactivi dedicaţi pentru
analizorul automat Rx Imola:
Kit pentru determinarea cantitativă a ureei în ser, plasmă şi
urină prin metoda cinetică enzimatică, cod UR3825
Kit pentru determinarea cantitativă a creatininei în ser, plasmă
şi urină prin metoda colorimetrică, cod CR3814
Kit pentru determinarea cantitativă a acidului uric în ser,
plasmă şi urină prin metoda enzimatică colorimetrică, cod UA3824
Kit pentru determinarea cantitativă a bilirubinei totale în ser
sau plasmă prin metoda colorimetrică, cod BR3859
Kit pentru determinarea cantitativă a bilirubinei directe în ser
sau plasmă prin metoda colorimetrică, cod BR3807
Kit pentru determinarea cantitativă a activităţii
aspartataminotransferazei în ser sau plasmă prin metoda UV (IFCC)
Kit pentru determinarea cantitativă a activităţii
alaninaminotransferazei în ser sau plasmă prin metoda UV (IFCC)
Reactivi pentru determinările imunologice:
Kit pentru determinarea T3 (triiodotironina), cod EH-500,
producător Clin Pro Internaţional, SUA.
Kit pentru determinarea T4 (tetraiodotironina sau tiroxina),
cod EH-501, producător Clin Pro Internaţional, SUA.
Reactivi pentru determinarea eozinofilelor
(hemoleucograma) sunt reactivi dedicaţi pentru analizorul automat de
hematologie Sysmex XT 1800i.
Rezultate
Rezultatele obţinute pentru parametri biochimici, imunologici şi
hematologici în urma administrării de miere conţinând reziduuri de
sulfonamide la şobolani Wistar sunt redate în tabel VII.26
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
61
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Tabelul VII.26: Tabelul sinoptic pentru valorile obţinute pentru
parametri biochimici ºi hematologici după administrare de miere cu reziduuri
de sulfonamide la şobolani Parametru
determinat
Media ± DS
Lot 1 (n = 5) Lot 2 (n = 5)
Creatinină (mg/dl) 0,45 ± 0,05 0,72 ± 0,03
Uree (mg/dl) 17,04 ± 3,80 18,36 ± 0,87
Acid uric (mg/dl) 1,71 ± 0,29 2,40 ± 0,42
Bilirubina totală (mg/dl) 0,62 ± 0,04 1,27 ± 0,09
Bilirubina directă (mg/dl) 0,08 ± 0,017 0,32 ± 0,070
AST (U/l) 60,71 ± 8,66 109,57 ± 7,36
ALT (U/l) 72,75 ± 4,14 128.23 ± 5,99
T4 (µg/dl) 4,50 ± 0,30 3,32 ± 0,21
T3 (ng/dl) 0,70 ± 0,14 0,34 ± 0,03
Hct (%) 47,80 ± 3,69 52,70 ± 6,64
VEM (MCV) (fL) 81,60 ± 6,13 98,50 ± 5,49
RBC (milioane/mm3) 9,72 ± 1,14 5,14 ± 0,38
Hb (g/dl) 16,10 ± 0,92 14,50 ± 1,16
CHEM (MCHC) (g/dl) 38,.60 ± 2,79 34,50 ± 2,20
Concluzii
Rezultatele obţinute evidenţiază variaţii moderate în cadrul
loturilor luate în studiu. Concentraţiile serice ale alanin
aminotransferazei şi ale aspartat aminotransferazei au crescut în urma
administrării de miere cu sulfonamide, comparativ cu valorile
determinate la lotul martor.
Aceste rezultate sunt în concordanţă cu date din literatura de
specialitate, conform cărora acţiunea toxică a sulfonamidelor, chiar
administrate în cantităţi foarte mici, se manifestă prin perturbarea
parametrilor hepatici la animalele de laborator (Hess et al., 1999).
Astfel, activitatea ALT şi activitatea AST au înregistrat creşteri
semnificative statistic (p < 0,0001) la şobolanii care au primit miere cu
sulfonamide, comparativ cu lotul de control, evidenţiind astfel
modificarea permeabilităţii membranei hepatocitului.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
62
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Valorile concentraţiei bilirubinei directe variază asemănător cu
cele ale bilirubinei totale, astfel, pentru lotul care a consumat miere cu
sulfonamide, valorile bilirubinei directe au fost de 0,32 mg/dl ± 0,07
faţă de 0,08 mg/dl ± 0,017 înregistrate pentru lotul martor.
Cercetările noastre au înregistrat o creştere nesemnificativă
statistic a uremiei, la 18,36 ± 0,87 mg/dl pentru lotul tratat cu
sulfonamide, comparativ cu lotul de referinţă pentru care concentraţia
medie a ureei a fost 17,04 ± 3,80.
Efectul administrării de miere cu sulfonamide la şobolani asupra
funcţiei renale s-a concretizat în creşterea semnificativă a valorilor
concentraţiilor acidului uric şi creatininei în cadrul lotului test
comparativ cu lotul martor.
În literatura de specialitate nu există date suficiente cu privire la
modificarea parametrilor biochimici determinaţi în prezentul studiu ca
urmare a toxicităţii datorate administrării de miere cu sulfonamide.
Rezultatele obţinute pentru valorile triiodotironinei (T3)
sugerează confirmarea ipotezei conform căreia sulfonamidele interferă
în sinteza hormonilor tiroidieni.
Valorile plasmatice ale tiroxinei (T4) au scăzut foarte
semnificativ la animalele care au consumat miere cu sulfonamide,
comparativ cu lotul martor. Rezultatele sunt concordante cu cele
obţinute de Cribb et al.(1996).
CAPITOLUL VIII - CONCLUZII GENERALE.
CONTRIBUŢII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE
CERCETARE
Concluzii generale În urma rezultatelor obţinute la validarea metodei Biocip pentru
cele 3 Paneluri Antimicrobiene, dar şi la determinările cantitative
efectuate pe diferite probe de miere, putem concluziona următoarele:
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
63
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
metoda biosenzor propusă este adecvată scopului şi anume
pentru determinarea concentraţiei fiecărui analit în parte, în cadrul
programelor de supraveghere a siguranţei alimentelor.
metoda Biocip utilizată prezintă avantajul că nu necesită
extracţia analitului din matricea biologică cu solvenţí organici.
tehnica multiplexarii permite detecţia simultană, dintr-o
singură probă, minimalizând astfel variaţiile biologice, variaţiile
analitice şi de stabilitate. Detectarea se realizează prin
chemiluminiscenţă indusă enzimatic, iar fiecare biocip conţine opţiunea
de controale incluse.
această tehnică de multiplexare are de asemenea largi
implicaţii atât asupra cantităţii de probă cât şi asupra vitezei de testare,
permiţând posibilitatea obţinerii unui număr mare de rezultate (540
determinări) într-un timp scurt.
determinarea reziduurilor medicamentoase prin metoda
Biocip nu necesită operaţii adiţionale (derivatizare), echipamente şi
accesorii suplimentare, prin urmare este mai puţin laborioasă, şi implică
costuri mai mici comparativ cu metodele cromatografice.
volumul de reactiv utilizat pentru un test este mai mic decât la
oricare alt sistem. Un volum total de reacţie de 350 µl este necesar
pentru toate testele dintr-un panel antimicrobian.
Acest avantaj al metodei Biocip presupune un spaţiu de stocare
redus şi producerea unor cantităţi mai mici de deşeuri biologice
periculoase.
toţi reactivii utilizaţi pentru sistemul Evidence Investigator au
coduri de bare făcând sistemul foarte uşor de folosit şi facilitând
eficientizarea timpului de lucru şi a costurilor.
Obiectivele cercetărilor din această teză au inclus şi studiul
influenţei reziduurilor sulfonamidelor din mierea de albine asupra
şobolanilor Wistar prin evaluarea modificărilor valorilor plasmatice ale
parametrilor implicaţi în reacţiile de hipersensibilitate de tip alergic prin
analizarea variaţiei valorilor serice ale citokinelor: interleukina IL-2, IL-
4, IL-6, IL-8, IL-10, factorul de creştere al endoteliului vascular
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
64
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
(VEGF), interferon gamma (IFNγ), factor de necroză tumorală alfa
(TNFα), IL-1α, IL-1β, MCP-1, factorul de creştere epidermică (EGF),
înainte şi după administrarea de miere de albine conţinând un amestec
de sulfonamide (20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina,
sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametoxazol, sulfadimetoxina).
În urma măsurării concentraţiilor citokinelor serice APC
derivate la loturile de şobolanii incluse în experiment putem
concluziona că citokinele au prezentat valori serice semnificativ
crescute pentru IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α în cadrul loturilor 2 şi 3
comparativ cu lotul martor, concentraţiile medii fiind corelate cu
perioada de timp în care s-a desfaşurat administrarea de miere
conţinând sulfonamide. Rezultatele obţinute concordă cu mecanismele
imunologice şi datele prezentate în literatură, în cadrul studiilor
privitoare la reacţiile de hipersensibilitate la sulfonamide.
După administrarea de miere cu sulfonamide, parametrii
biochimici, hematologici şi imunologici (hormonii tiroidieni) la lotul
căruia i s-a administrat miere conţinând sulfonamide, comparativ cu
lotul de control, au înregistrat modificări după cum urmează:
1. Evoluţia valorilor alanil aminotransferazei, evidenţiază
creşteri semnificative ale activităţii acesteia (p < 0,0001), sugerând
permeabilizarea membranei hepatocitului şi migrarea sa în spaţiul
intercelular. Dinamica valorilor determinate pentru AST sugerează că ar
avea loc migrarea AST din citoplasma hepatocitelor în spaţiul
intercelular datorită creşterii permeabilităţii membranare. Această
permeabilizare a membranei hepatocitului poate fi consecinţa lezării
consecutive legării sulfonamidelor sau a unor metaboliţi ai acestora de
proteinele membranare.
Bilirubina totală a înregistrat o creştere de 48,81%. Rezultatele
obţinute în urma determinării concentraţiilor plasmatice ale bilirubinei
totale şi bilirubinei directe confirmă afectarea severă a funcţiei hepato-
biliare în urma administrării timp de 14 zile, prin gavaj gastric, a mierii
conţinând sulfonamide. Parametrii de investigare a funcţiei renale au
înregistrat concentraţii crescute la lotul testat, ca urmare a toxicităţii
datorate administrării de miere conţinând sulfonamide. Astfel, s-au
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
65
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
înregistrat creşteri ale creatininei, ureei şi acidului uric în procente de
60 %, 7,74%, respectiv 40,35%.
2. Parametrii hematologici au înregistrat variaţii semnificative.
Modificările indicilor hematologici în sensul reducerii semnificative a
numărului de eritrocite, a cantităţii de hemoglobină şi a valorii
hematocritului au evidenţiat instalarea unei anemii eritrocitare la lotul
testat.
3. Investigarea funcţiei tiroidiene prin determinarea T3 şi T4 şi
urmărirea raportului acestora a evidenţiat scăderea foarte semnificativă
a valorilor plasmatice ale tiroxinei la animalele care au consumat miere
conţinând sulfonamide, comparativ cu lotul martor.
Contribuţii originale Sintetizând activitatea de cercetare din studiile efectuate în
cadrul acestei teze de doctorat se remarcă următoarele elemente de
originalitate:
validarea unei metode de analiză cantitativă a reziduurilor
medicamentoase (antibiotice, sulfonamide, nitrofurani şi chinolone) din
mierea de albine prin metoda Biocip, metodă care se distinge atât prin
precizie şi acurateţe, liniaritate, limită de decizie şi capabilitate de
detecţie, randament de recuperare, cât şi prin simplitatea şi uşurinţa
metodologiei de lucru, prin costuri reduse pentru aparatură şi reactivi,
comparativ cu metodele gaz cromatografice sau lichid cromatografice
utilizate în prezent;
tehnologia Biocip simplifică metodologia de confirmare a
prezenţei reziduurilor medicamentoase prin posibilitatea de cuantificare
şi identificare individuală a substanţelor antimicrobiene utilizate în
tratamentul bolilor la albine şi care se regăsesc ca reziduuri în miere;
determinarea conţinutului în reziduuri medicamentoase al
mierii de albine disponibilă pe piaţa românească utilizând metoda
Biocip evită obţinerea unor rezultate fals pozitive;
tehnologia Biocip permite identificarea individuală a
citokinelor, biomarkeri care evidenţiază reacţiile de hipersensibilitate;
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
66
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
realizarea unui model experimental pe animale de laborator
care a avut ca obiectiv major identificarea reacţiilor de hipersensibilitate
cu manifestări alergice la doze foarte mici datorate ingestiei de miere
conţinând sulfonamide, precum şi repercusiunile generate de aceste
reziduuri medicamentoase la nivel biochimic, imunologic şi
hematologic. În literatura de specialitate sunt disponibile doar date
limitate referitoare la dozarea citokinelor plasmatice, un instrument util
în studiul reacţiilor de hipersensibilitate de tip întârziat la şobolani.
Perspective de cercetare Rezultatele obţinute în cadrul prezentei teze de doctorat oferă
posibilitatea orientării către noi direcţii de cercetare:
continuarea determinărilor cantitative ale reziduurilor
medicamentoase în alte produse apicole (polen, lăptişor de matcă,
propolis);
extinderea cercetărilor din mierea de albine prin validarea
metodei Biocip pentru încă 3 sulfonamide şi anume: sulfametoxazol
(SMX), sulfamonometoxină(SMM) şi trimetoprim (TMP) incluse în
Panelul Antimicrobian I Plus;
extinderea determinărilor cantitative de citokine şi la IL-5 şi
IL-13 care sunt indici de hipersensibilitate şi care nu au fost evaluate în
acest experiment şi corelarea rezultatelor din ambele studii;
evaluarea modificărilor parametrilor biochimici, hematologici
şi a stresului oxidativ în cadrul studierii toxicităţii reziduurilor
metaboliţilor de nitrofurani la şobolani ca urmare a administrării prin
gavaj gastric de miere de albine conţinând aceste reziduuri;
revizuirea legislaţiei privind siguranţa alimentului, prin
introducerea unor limite maxime admisibile vizând prezenţa
reziduurilor medicamentoase în mierea de albine şi în alte produse
apicole. Se cunoaşte faptul că depistarea reziduurilor în miere în urma
controalelor întreprinse de organismele autorizate, poate duce la
sancţiuni financiare pentru producătorii acesteia, la retrageri de pe piaţă
a loturilor corespunzătoare şi la declanşarea unor alerte de siguranţă.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
67
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Bibliografie selectivă
Andriþoiu V. Mierea. In cap.VI Produse apicole, Apiterapia în
planningul familial, tezã de disertaþie, Arad, 2006; 162-166.
Ashiralieva A, Genersch E. Reclassification, genotypes and virulence of
Paenibacillus larvae, the etiological agent of American
foulbrood in honeybees - a review. Apidolologie 2006; 37: 411–
420.
Beaune P, Diserens JM, Reybroeck W. Proficiency Testing of Charm II
Tests for Residue Control of honey. Proceedings of the 39th
Apimondia International Agricultural Congress, Dublin, Ireland,
August 21-26, 2005: 33-34. Bogdanov S. Contaminants of bee products, Apidologie 2006; 37, 1-18.
Bogdanov S. Current state of analytical methods for the detection of
residues in bee products. Apiacta 2003; 38, 399-409
Bonvehý´ JS and Coll FV. Flavour index and aroma profiles of fresh
and processed honeys. J Sci Food Agr 2003; 83, 275.
Bura M, Pătruică S, Bura VA. Tehnologia apicolă. Timişoara: Editura
Waldpress, 2008, 235-249.
Castrejon JL, Lavergne SN, El-Sheikh A et al. Metabolic and chemical
origins of cross-reactive immunological reactions to arylamine
benzenesulfonamides: T-cell responses to hydroxylamine and
nitroso derivatives. Chem Res Toxicol 2010; 23:184-92.
Contreras JP, Ly NR, Gold DR, et al. Allergen-induced cytokine
production, atopic disease, IgE, and wheeze in children. J
Allergy Clin Immun 2003; 112:1072–1077.
Cribb AE, Lee BL, Trepanier LA, Spielberg SP. Adverse reactions to
sulphonamide and sulphonamide-trimethoprim antimicrobials:
clinical syndromes and pathogenesis. Adverse Drug React
Toxicol Rev 1996; 15: 9-50.
Decizia 2002/657/CE din 12 august 2002 de aplicare a Directivei
96/23/CE a Consiliului în ceea ce priveşte performanţa
metodelor analitice şi interpretarea rezultatelor. JOUE 2002, L
221:8.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
68
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Decizia 2003/181/CE din 13 martie 2003 de modificare în ceea ce
priveşte stabilirea limitelor de performanţă minime necesare
(LMPN) pentru anumite reziduuri în alimente de origine animal.
JOUE 2003, L 71:17.
Directiva 96/23/CE a Consiliului din 29 aprilie 1996 privind mãsurile
de control care se aplicã anumitor substanþe ºi reziduurilor
acestora existente în animalele vii ºi în produsele obþinute de la
acestea ºi de abrogare a Directivelor 85/358/CEE ș i
86/469/CEE ºi a Deciziilor 89/187/CEE ºi 91/664/CEE. JOUE
1996, L 125:10.
Edder P, Cominoli A, Corvi C. Determination of streptomycin residues
in food by solid phase extraction and liquid with post-column
derivation and fluorometric detection. J Chromatogr A 1999;
830: 345-351.
Edder P, Corvi C. Utilisation du Charm II pour le depistage des residus
d’antibiotique dans les dendees alimentairea d’origine animale.
Mitt Lebensm Hyg 2001; 92: 218-228.
Findlay JWA, Dillard RF. Appropriate Calibration Curve Fitting in
Ligand Binding Assays. AAPS J 2007, 9 (29) : E260-E267.
Finkelman FD. Anaphylaxis: lessons from mouse models. J Allergy
Clin Immun 2007; 120:506-15.
Gentili A, Perret D, Marchese S. Liquid chromatography-tandem mass
spectrometry for performing confirmatory analysis of veterinary
drugs in animal-food products, Trend Anal Chem 2005;
24(7):704-733 Grigore G. Fitoterapia şi apiterapia. Boli tratate cu plante medicinale şi
produse apicole, Bucureşti, Ed. Ştefan, 2008, 98-115.
Hess DA, Sisson ME, Suria H et al. Cytotoxicity of sulfonamide
reactive metabolites: apoptosis and selective toxicity of CD81
cells by the hydroxylamine of sulfamethoxazole. Faseb J 1999;
13(13): 1688-98.
Hitchcock JD, Moffett JO, Lackett JJ, Elliott JR. Tylosin for control of
American foulbrood disease in honey bees. J. Econ. Entomol.
1970; 63: 204-207.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
69
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
Hopingarner R, Nelson K. 1987. American foulbrood cleanup rate using
three terramycin treatments. Am Bee J 1987; 128:120-121.
Hughes P, Heritage J. Antibiotic growthpromoters in food animals.
FAO Anim Pr 2004; 160: 129-52.
Joshi S. HPLC separation of antibiotics present in formulated and
unformulated samples. J Pharmaceut Biomed 2002; 28:795-809.
Kanfer I, Skinner M, Walker RB. Analysis of macrolide antibiotics. J
Chromatogr A 1998; 812:255-286
Khong SP, Gremaud E, Richoz J et al. Analysis of matrix-bound
nitrofuran residues in worldwide-originated honeys by isotope
dilution high-performance liquid chromatography-tandem mass
spectrometry. J Agr Food Chem 2004; 52(17): 5309-5315.
Kleespies RG, Radtke J, Bienefeld K. Virus -like particles found in the
ectoparasitic bee mite Varroa jacobsoni Oudemans. J Invertebr
Pathol 2000; 15, 87-90.
Kocher U. Nachweis von Streptomycin-Ruckstanden in Honig mittels
Charm II- Test und Absicherung der Befunde durch HPLC mit
Nachsaulenderivatisierung und Fluorescenzdetektion.
Lebensmittelchemie 1996; 50:115-117.
Legg, DR, Baumgartner A, Salter R, Wheeler A. ROSA (Rapid One
Step Assay) for antibiotics in honey. Apiacta 2003; 38, 207-217.
Michaaud V. Antibiotic residues in honey - the FEEDM view, Apiacta
2005; 40, 52-54.
Moats WA, Buckley SA. Determination of free metabolites of ceftiofur
in animal tissues with an automated liquid chromatographic
cleanup. J AOAC Int 1998; 81(4): 709-13.
Moffett JO, Wilson WT, Parker RL. The effect of Penicel, tetracycline
and erythromycin on adult bees, brood-rearing, and honey
production. Am Bee J 1958;98: 22-24.
Mutinelli F. Practical Application of Antibacterial drugs for the Control
of Honey Bee Diseases. Apiacta 2003; 38:149-155.
Naisbitt DJ, Gordon SF, Pirmohamed M, et al. Antigenicity and
immunogenicity of sulphamethoxazole: demonstration of
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
70
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
metabolism-dependent haptenation and T-cell proliferation in
vivo. British J Pharmacol 2001; 133:295-305.
Nakazawa H, Ino S, Kato K, Watanabe T et al. Simultaneous
determination of residual tetracyclines in food by high-
performance liquid chromatography with atmospheric pressure
chemical ionization tandem mass spectrometry. J Chromatogr B
1999; 732(1):55-64.
O'Keeffe M, Conneely A, Cooper KM et al. Nitrofuran antibiotic
residues in pork: The FoodBRAND retail survey. Anal Chim
Acta 2004; 520:125-131.
Oldroyd BP, Goodman RD, Hornitzky MAZ, Chandler D. 1989. The
effect on American foulbrood of standard oxytetracycline
hydrochloride treatments for the control of European foulbrood
of honeybees (Apis mellifera). Aust J Agr Res 1989; 40(3): 691-
697.
Ortelli D, Edder P, Corvi C. Analysis of Chloramphenicol Residues in
Honey by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry.
Chromatographia 2004; 59:61-64.
Peng CYS, Mussen E, Fong A et al. Laboratory and field studies on the
effects of the antibiotic tylosin on honey bee Apis mellifera L.
(Hymenoptera: Apidae) development and prevention of
American foulbrood disease. J Invertebr Pathol 1996; 67(1): 65-
71.
Pettis J, Feldlaufer M. Efficacy of tylosin and lincomycin in controlling
American foulbrood in honey bee colonies. J Apic Res 2005;
44(3): 106-108. Pohl P. Determination of metal content in honey by atomic absorption and
emission spectrometries. Trend Anal Chem 2009; 28(1):117-128.
Quintana-Rizzo J, Salter RS, Saul SJ. Solid phase extraction procedures
for validation of Charm II sulfonamide, streptomycin and
chloramphenicol positives and detection of tylosin in honey.
Apiacta 2005; 40:55-62.
Regulamentul (CE) Nr. 470/2009 al Parlamentului European ºi al
Consiliului din 6 mai 2009 de stabilire a procedurilor
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
71
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
comunitare în vederea stabilirii limitelor de reziduuri ale
substanþelor farmacologic active din alimentele de origine
animalã, de abrogare a Regulamentului (CEE) nr. 2377/90 al
Consiliului ºi de modificare a Directivei 2001/82/CE a
Parlamentului European ºi a Consiliului ºi a Regulamentului
(CE) nr. 726/2004 al Parlamentului European ºi al Consiliului.
JOUE 2009, L 152:11-22.
Regulamentul (UE) nr. 37/2010 al Comisiei din 22 decembrie 2009
privind substanþele active din punct de vedere farmacologic ºi
clasificarea lor în funcþie de limitele reziduale maxime din
produsele alimentare de origine animal. JOUE 2011, L 15:1.
Reybroeck W, Jacobs FJ, De Brabander HF, Daeseleire E. Transfer of
sulfamethazine from contaminated beeswax to honey. J Agr
Food Chem 2010; 58:7258–7265.
Reybroeck W. Residues of antibiotics and sulphonamides in honey on
the Belgian Market. Apiacta 2003; 38: 23-30.
Ritter W, 2000, Bolile albinelor, Bucureşti: Ed. M.A.S.T., 2000, 117-
145.
Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by
cultured human dendritic cells is maintained by
granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus
interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.
J Exp Med 1994; 179:1109-18.
Savoy Perroud MC, Le-Breton MH, Graveleau L, Diserens JM .
Validation of an ELISA kit for the detection of fluoroquinolones
in honey. Poster at 41st Apimondia Congress 2009, France,
Montpellier, September 15-20.
Spivak M. Preventive antibiotic treatments for honey bees. Am. Bee J.
2000; 140: 867-868.
Thompson HM, Waite RJ, Wilkins S et al. Effects of European
foulbrood treatment regime on oxytetracycline levels in honey
extracted from treated honeybee (Apis mellifera) colonies and
toxicity to brood. Food Addit Contam 2005; 22: 573-578.
Thompson TS, Noot DK. Determination of sulfonamides in honey by
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
72
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
lichid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Chim
Acta 2005; 551:168-176.
Verdel BM, Souverein PC, Egberts ACG, Leufkens HG. Diference in
Risk of Allergic Reaction of Sulfonamide Drugs based on
Chemical Structure. Ann Pharmacother 2006; 40:1040-6.
Vidal JL, Aguilera-Luiz MM, Romero-Gonzalez R, Garrido-Frenich A.
Multiclass Analysis of Antibiotic Residues in Honey by
Ultraperformance Liquid Chromatography-Tandem Mass
Spectrometry. J Agr Food Chem 2009; 57(5): 1760–1767.
Vinas P, Balsalobre N, Lopez-Erroz C, Hernandez-Cordoba M. Liquid
chromatography with ultraviolet absorbance detection for the
analysis of tetracycline residues in honey. J Chromatogr A
2004; 1022, 125-129.
Waite RJ, Brown MA, Thompson HM, Brew MH. 2003. Controlling
European foulbrood with the shook swarm method and
oxytetracycline in the UK. Bee World 2003; 82: 130-138.
Wegener HC, Aarestrup FM, Gerner-Smidt P, Bager F. Transfer of
antibiotic resistant bacteria from animals to man. Acta Vet Scand
Suppl 1999; 92:51–57.
Williams DL. A veterinary approach to the European honey-bee (Apis
mellifera). Rev Vet J 2000; 160:61-73.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
73
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
ARTICOLE PUBLICATE IN EXTENSO
Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Mătiuţ S, Cuciureanu R.
Method validation for simultaneous determination of 12 sulfonamides
in honey using Biochip Array Technology. Rev. Farmacia 2012;
60(1):143-154. (Jurnal ISI, factor de impact :0.850).
http://www.revistafarmacia.ro/201201/issue12012art16.html
Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Ungureanu D, Cuciureanu R.
Immune response in rats following administration of honey with
sulfonamides residues. Rev Romana Med Lab 2012; (1/4):63-72. (Jurnal
ISI, factor de impact 2010: 0,113).
http://rrml.ro/articole/articol.php?year=2012&vol=1&poz=8
Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Cuciureanu R. Multi-analytic
detection of antibiotic residues in honey using a multiplexing Biochip
Assay. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi 2012; 116(1):324-329. (Jurnal
indexat în baze de date internaţionale - B+).
http://www.revmedchir.ro/uploads/1/5/7/2/15722076/50_popa.pdf
PARTICIPAREA LA CONFERINŢE NAŢIONALE
Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Ungureanu D, Cuciureanu R.
Evidenţierea răspunsului imun la şobolani după administrarea de miere
conţinând sulfonamide, prezentare orală, Sesiunea ştiinţifică
(videoconferinţă) în cadrul activităţii din proiect ''Organizarea de
sesiuni ştiinţifice ale doctoranzilor (simpozioane)'', Videoconferinţă
Iaşi-Timişoara, 11 decembrie 2012.
Morariu D.I., Schiriac C.E., Cuciureanu R. Validarea metodei
de determinare a 12 sulfonamide din miere utilizând Tehnologia
Biochip, prezentare orală, Simpozionul Naţional: Contribuţii ale
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
74
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
tinerilor cercetători la dezvoltarea cercetării ăn domeniul medico-
farmaceutic, Iaşi, 7-9 noiembrie 2012.
Ionela Daniela Popa (Morariu) , I. Chirila, Elena Corina
Şchiriac , Rodica Cuciureanu. Evaluation of oxidative stress and serum
biochemical parameters in rats following administration of honey with
nitrofurans, poster, A 5-a Conferinţă a Doctoranzilor şi a 2-a
Conferinţă a Postdoctoranzilor în Medicină şi şi Farmacie, Tg Mureş, 4-
6 iulie 2012.
Popa (Morariu) Ionela Daniela, Şchiriac Elena –Corina,
Cuciureanu Rodica. Determinarea profilului de citokine la şobolani în
urma administrării de miere de albine îmbogăţită cu sulfonamide,
poster, 50 de ani de învăţmânt universitar farmaceutic la Iaşi, ediţia a
V-a, 6-8 octombrie 2011.
Popa (Morariu) ID, Hristodorescu C, Schiriac EC, Matiut S,
Cuciureanu R. Simultaneous detection of four nitrofuran metabolites in
honey using biochip array technology, prezentare orală, Simpozionul
Doctoranzilor din cadru proiectului POSDRU cu titlul: Burse doctorale
pentru doctoranzi competitive în Aria Europeană a Cercetării
POSDRU/88/1.5/63117, Timişoara, 8 septembrie 2011.
Morariu D.I., Schiriac C.E., Cuciureanu R. Simultaneous
detection and quantification for drug residues in honey.New
possibilities, poster, Congresul Naţional de Farmacie, ediţia a XIV-a,
Tg.Mureş, 13-16 octombrie 2010.
Popa (Morariu), I. D., Schiriac, C.E.,Cuciureanu, R. Method
validation for simultaneous multianalit detection of drug residues in
honey using Biochip Array Technology, poster, European Strategy for
Phd Programs din cadru proiectului POSDRU cu titlul: Burse
doctorale pentru doctoranzi competitive în Aria Europeană a Cercetării
POSDRU/88/1.5/63117, Timişoara, 20-22 septembrie 2010.
Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine
75
Un
iversitatea de M
edicin
ă şi Farmacie „G
rigore T. P
op
a” - Iaşi, Facultatea d
e Farmacie
Po
pa (M
orariu
) Ion
ela D
aniela - D
eterm
inarea rezid
uu
rilor m
edicam
ento
ase din
mierea d
e
albin
e
PARTICIPAREA LA CONFERINŢE INTERNAŢIONALE
Ionela Daniela Popa (Morariu), Elena Corina Schiriac, Rodica
Cuciureanu. Method validation for simultaneous multianalyt detection
of quinolones, ceftiofur, thiamphenicol, streptomycin, tylosin and
tetracyclines in honey using Biochip Array Technology, poster, The
15th Panhellenic Pharmaceutical Congress, Atena-Grecia, 13-15 mai
2011.
Popa (Morariu), I. D. , Chirila, I., Şchiriac, E. C., Cuciureanu,
R. Toxic effect of drug residues on the serum biochemical parameters
of rats following administration of honey with sulfonamides, poster,
DKMT Euroregional Conference on Environment and Health, 18 -19
mai 2012, Szeged-Ungaria.
Popa(Morariu), I.D.; Rodríguez, Y; Berrada, H; Mañes, J;
Cuciureanu, R; Font, G. Evaluación de la presencia de micotoxinas en
polen mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de
masas en tandem, prezentare orală, Aetox Congres, Valencia, Spania,
29 iunie 2012.