REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT · Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte...

Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte la principalele rase de taurine, bubaline, ovine şi caprine din România în scopul utilizării lor ca markeri

genetici în ameliorare şi trasabilitate

Ing. Biolog BÂLTEANU I. VALENTIN ADRIAN

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT STUDIUL POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTE LA PRINCIPALELE RASE DE TAURINE, BUBALINE, OVINE ŞI CAPRINE DIN ROMÂNIA ÎN SCOPUL UTILIZĂRII LOR CA MARKERI GENETICI ÎN AMELIORARE ŞI TRASABILITATE

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof.Univ. Dr. Ing. VLAIC AUGUSTIN

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII



2

CUPRINS INTRODUCERE.....................................................................................................4 PARTEA I: STUDIU BIBLIOGRAFIC CAPITOLUL I COMPOZIŢIA LAPTELUI DE VACĂ, BIVOLIŢĂ, OAIE, CAPRĂ ŞI MECANISMUL SINTEZEI LUI LA NIVELUL GLANDEI MAMARE ÎN LACTAŢIE................................................................5 CAPITOLUL II TEHNICI MOLECULARE UTILIZATE PENTRU STUDIUL POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN LAPTE..................7 CAPITOLUL III STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PRIVIND STUDIUL POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN LAPTE LA TAURINE, BUBALINE, OVINE ŞI CAPRINE..............................7 CAPITOLUL IV IMPORTANŢA STUDIERII POLIMORFISMELOR PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTE PRIN PRISMA POSIBILITĂŢII UTILIZĂRII LOR CA MARKERI GENETICI ÎN AMELIORAREA ANIMALELOR ŞI TRASABILITATEA PRODUSELOR LACTATE.......................................10 PARTEA II: CERCETĂRI PROPRII CAPITOLUL V SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII.....................................................13 CAPITOLUL VI CARTAREA PE CROMOZOMI A GENELOR CARE CODIFICĂ PROTEINELE MAJORE DIN LAPTE PRIN TEHNICA HIBRIDĂRII ÎN SITU CU FLORESCENŢA (FISH)...................14



3

CAPITOLUL VII STUDIUL POLIMORFISMELOR CELOR DOUĂ GENE CE CODIFICĂ K-CAZEINA ŞI -LACTOGLOBULINA LA TAURINE DIN RASA BĂLŢATĂ ROMÂNEASCĂ DE TIP SIMMENTAL PRIN TEHNICA PCR-RFLP......................................15 CAPITOLUL VIII STUDIUL COMPARATIV PRIN TEHNICILE IEF ŞI PCR-RFLP A POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTE LA TAURINE DIN RASA BĂLŢATĂ ROMÂNEASCĂ DE TIP SIEMMENTAL.......................................................................................16 CAPITOLUL IX CARACTERIZAREA POLIMORFISMELOR PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTE LA UNELE RASE DE TAURINE, BUBALINE, OVINE ŞI CAPRINE DIN ROMÂNIA FOLOSIND TEHNICA IEF.......................................................................................................17 CAPITOLUL X CARACTERIZAREA MOLECULARĂ A ALELELOR NOI IDENTIFICATE LA LOCII αS1-CAZEINEI ŞI β-CAZEINEI LA RASA SURA DE STEPĂ, VARIETATEA MOLDOVENEASCĂ ŞI BIVOL ROMÂNESC......................................................................................21 CAPITOLUL XI IDENTIFICAREA AUTENTICITĀŢII/ORIGINII DECLARATE A LAPTELUI ŞI PRODUSELOR LACTATE AUTOHTONE FOLOSIND CA MARKERI GENETICI POLIMORFISMELE PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTE...........................................................23 CAPITOLUL XII CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI.............................................24 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ...........................................................................25



4

INTRODUCERE

Lactogeneza poate fi împartita în doua faze: faza 1 - începe în ultima treime a

gestaţiei în care au loc procese de diferenţiere structurale şi funcţionale ale epiteliului

secretor; faza 2 - începe imediat după naştere şi implică finalizarea diferenţierii celulare,

care coencide cu sinteza şi secreţia laptelui în cantităţi semnificative. Aceste două faze

sunt esenţiale având ca efect final declanşarea lactaţiei.

În laptele rumegătoarelor întâlnim 6 tipuri de proteine majore codificate de 6 gene

nealele, ce se exprimă specific în celulele epiteliale ale glandei mamare în lactaţie: S1-

cazeina (S1-CN), -cazeina (-CN), S2-cazeina (S2-CN), K-cazeina (K-CN), -

lactoglobulina (-CN şi -lactoalbumina (-LA).

Variaţiile care au apărut în structura acestor gene de-a lungul timpului, au dus la

apariţia mai multor alele la aceşti loci. Aceste variaţii, denumite generic polimorfisme,

sunt cauzate de restructurări ale genelor (substituţia unor nucleotide, deleţii, inserţii etc),

ce pot avea ca efect modificarea nivelului lor de expresie, inactivarea expresiei lor,

modificarea compoziţiei în aminoacizi a proteinei etc.

Astfel unele variante genetice de la cei 6 loci au efect pozitiv asupra conţinutului

de cazeină al laptelui, timpului de coagulare, fermităţii coagulului şi randamentului de

obţinere al brânzeturilor, iar altele au efect negativ asupra acestor parametri; unele

variante genetice ale β-CN de la taurine au fost asociate cu declanşarea unor boli la

oameni, cum ar fi: diabetul de tip 1, cardiopatia ischemică, sindromul morţii subite la nou

născuţi, schizofrenia şi autismul (variantele A1, B, C), altele nu (variantele A2, A3); unele

variante genetice ale αS1-CN au fost asociate cu alergii la copii, în urma consumului de

lapte.

Aplicarea în România a informaţiilor furnizate de variantele genetice ale celor 6

proteine majore din lapte, nu poate fi facută fără o caracterizare a raselor/speciilor de

fermă autohtone. Această caracterizare realizată în cadrul tezei mele de doctorat, oferă

informaţii extrem de valoroase despre frecvenţa alelelor de la cei şase loci ai proteinelor



5

din lapte de la speciile/rasele autohtone. Ea deschide noi posibilităţi de utilizare a acestor

polimorfisme ca markeri genetici în ameliorarea animalelor, în manipularea prin selecţie

genetică a componenţilor laptelui, în scopul producerii unui lapte alternativ care să

contracareze o serie de maldii, precum şi ca markeri genetici de indentificare a

autenticităţii, originii şi trasabilităţii produselor lactate.

PARTEA I: STUDIU BIBLIOGRAFIC

CAPITOLUL I

COMPOZIŢIA LAPTELUI DE VACĂ, BIVOLIŢĂ, OAIE, CAPRĂ ŞI

MECANISMUL SINTEZEI LUI LA NIVELUL GLANDEI MAMARE ÎN

LACTAŢIE

Cercetările ştiinţifice au stabilit că laptele are o compoziţie chimică complexă, mai

ales în ceea ce priveşte fracţiunile cazeinice, proteinele din zer, enzimele şi substanţele

antimicrobiene. Laptele reprezintă o sursă de hrană cu valoare biologică ridicată,

conţinând mai mult de 100 de substanţe dizolvate într-o formă uşor asimilabilă, aflate în

suspensie sau sub formă de emulsie, necesare funcţionării normale a organismului uman

şi animal (Banu şi colab., 1998).

Proteinele din laptele sunt împărţite în două mari grupe în funcţie de

comportamentul lor la pH acid = 4,6:

1. Fracţiunea solubilă la acest pH, denumită ,, proteine din zer ’’, este alcătuită din β-

lactoglobulină (β-LG) şi α-lactoalbumină (α-LA) şi alte proteine minore. În procesul de

producere al brânzeturilor prin adaus de cheag, această fracţiune rămâne în zer şi nu intră

în constituţia lor.

2. Fracţiunea insolubilă la acest pH, numită ,,cazeina totală’’, este constituită din patru

tipuri de cazeine: αS1-cazeina (αS1-CN), αS2-cazeina (αS2-CN), β-cazeina (β-CN) şi K-

cazeina (K-CN). Cazeinele se găsesc în laptele proaspăt dispersate sub forma unui număr



6

foarte mare de particule solide în suspensie, fiind sudate între ele prin molecule de

Ca9(PO4)6. Aceste particule sunt denumite micelii.

Conţinutul în proteină al laptelui de vaca este în medie de 3,3%, în laptele de

bivoliţă de 4,1% , în laptele de oaie de 5,3 % , iar în cel de capră de 3,7% (Iurcă şi

colab., 1998) . Din totalul proteinelor, fractiunea cazeinică reprezintă 80%, iar proteinele

serice 20% .

De proporţia fracţiunii cazeinice şi mărimea miceliilor depind în mare masură

proprietăţile de prelucrare ale laptelui, cantitatea şi calitatea brânzei obţinute, textura şi

gustul diferitelor sortimente de brânzeturi şi produse lactate (Buchberger si colab., 2000).

Cele 6 tipuri de proteine majore din lapte sunt codificate de 6 gene nealele, care se

exprimă specific în celulele epiteliale ale glandei mamare în lactaţie.

Analiza privind segregarea Mendeliană a celor 4 gene nealele ce codifică cele 4

tipuri de cazeine de la rumegătoare, a scos în evidenţa faptul că ele sunt situate pe

cromozomii din perechea 6 în următoarea ordine: αs1-CN, β-CN, αs2-CN, K-CN

(Threadgill şi colab., 1990; Hayes şi colab., 1993a). Gena care codifică β-LG a fost

localizata pe cromozomii din perechea 11 (Hayes şi colab., 1993b), iar cea care codifică

α-LA a fost localizată pe cromozomii din perechea 5 (Soulier şi colab., 1989; Vilotte şi

colab., 1987).

Sistemul endocrin, în principal prin glanda hipofiză, joacă un rol central în toate

aspectele ce implică creşterea şi dezvoltarea ţesutului mamar (mamogeneza), declanşarea

lactaţiei şi sinteza laptelui (lactogeneza), menţinerea secreţiei lactate (galactopoieza) şi

apoi intrarea în repaus mamar, prin intermediul a 2 hormoni majori: hormonul de creştere

sau somatotrop (GH sau STH), respectiv prolactina (PRL). Semnalele hormonale

determină activarea transcripţională a genelor ce codifică proteinele din lapte şi sinteza

proteinelor specifice.



7

CAPITOLUL II

TEHNICI MOLECULARE UTILIZATE PENTRU STUDIUL

POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN LAPTE

Studiile realizate încă din anii ’50 folosind electroforeza pe hârtie (PE), au pus în

evidenţă polimorfismul proteinelor majore din lapte, β-LG fiind prima proteină al cărei

polimorfism a fost identificat de către Aschaffenburg şi Drewry (1955).

Odată cu apariţia unor tehnici de analiză a proteinelor mult mai performante: SGE

(electroforeza în gel de amidon), AE (electroforeza în gel de agaroză), PAGE

(electroforeza în gel de poliacrilamidă), IEF (electroforeza prin focalizare izoelectrică),

HPLC (cromatografia în faza lichidă de înaltă performanţă), Maldi TOF-MS

(spectrometria de masă), s-au îmbunătăţit substanţial cunoştinţele legate de

polimorfismul proteinelor majore din lapte la diverse specii de fermă.

Apariţia tehniciilor bazate pe analiza ADN: PCR (reacţia în lanţ a polimerazei),

PCR-RFLP (polimorfismul de lungime al fragmentelor de ADN amplificate şi

restrictate), SSCP (polimorfismul de conformaţie al fragmentelor de ADN

monocatenare), RT-PCR (reacţia în lanţ a polimerazei în timp real) şi a tehnicilor de

secvenţiere a ADN-ului, au permis descifrarea polimorfismelor care apar în structura

genelor, care au repercursiuni asupra expresiei genice şi compoziţiei în aminoacizi a

variantelor genetice ale proteinelor majore din lapte.

CAPITOLUL III

STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR PRIVIND STUDIUL

POLIMORFISMELOR PROTEINELOR DIN LAPTE LA TAURINE,

BUBALINE, OVINE ŞI CAPRINE

Mutaţiile care au apărut de-a lungul timpului în structura genelor care codifică cele

6 proteine majore din lapte, au dus la apariţia mai multor variante genetice la aceşti loci.



8

Aceste variaţii, denumite generic polimorfisme, indică faptul că fiecare specie proteică

din lapte poate să se prezinte sub două sau mai multe forme codificate de gene

autozomale (alele) între care există interacţiune de co-dominanţă, ceea ce înseamnă că

ambele alele se exprimă la indivizii heterozigoţi.

Alfa S1-CN este o proteină din lapte constituită din 199 de aminoacizi, având o

greutate moleculară de 23, 614 kDa. La taurine la locusul αS1-CN au fost identificate

până în prezent 10 variante genetice: A, B, C, D, Eyak, Ebali, F, G, H, (Farrell şi colab.,

2004) şi IRV (Bâlteanu şi colab., 2007a; Bâlteanu şi colab., 2008a,b). Alela IRV a fost

redenumită ISM, deoarece nu a fost evidenţiată la alte rase de taurine din România, fiind

caracteristică doar rasei Sură de Stepă, varietatea Moldovenească (SM = Sură

Moldovenească). La bubaline au fost identificate 3 variante genetice: A, B (Chianese şi

colab., 2009) şi BRV (Bâlteanu şi colab., 2007c; Bâlteanu şi colab., 2008c). În urma

caracterizării la locusul αS1-CN a populatiilor de Bivol Românesc, am constatat că

această variantă genetică este specifică rasei Bivol Românesc, ea fiind redenumită după

regiunea în care a fost identificată: S1-CN BBT (indicele BT reprezentând Bivol din

Transilvania). La ovine au fost identificate 9 variante genetice: A, B, C, D, E, F, G, H, I

(Pirisi şi colab., 1999; Giambra şi colab., 2010). La caprine au fost identificate 17

variante genetice: A, B1, B2, B3, B4, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, 01,02 (Ramunno şi

colab., 2004).

Beta-CN este o proteină din lapte constituită din 209 aminoacizi, având o greutate

moleculară de 23,983 kDa. La taurine la locusul β-CN au fost identificate până în

prezent 14 variante genetice: A1, A2, A3, B, C, D, E, A3m, B2, A4, H, F, A5, G (Farrell

şi colab., 2004). La bubaline au fost identificate 3 variante genetice: A, B (Ferranti şi

colab., 1998) şi CRV (Bâlteanu şi colab., 2007c; Bâlteanu şi colab., 2008c). În urma

caracterizării la locusul β-CN a populatiilor de Bivol Romanesc, am constatat că această

variantă genetică este specifică rasei Bivol Românesc, ea fiind redenumită dupa regiunea

în care a fost identificată: -CN CBT (indicele BT reprezentând Bivol din Transilvania).

La ovine nu există dovezi clare privind polimorfismul la nivel proteic (Chianese şi



9

colab., 1995). La caprine au fost identificate 8 variante genetice: A, A1, B, C, D, E, 0 şi

0’ (Cosenza şi colab., 2005a; Caroli şi colab., 2006)

Alfa S2-CN este o proteină din lapte constituită din 207 de aminoacizi, având o

greutate moleculară de 25,150 kDa. La taurine la locusul αS2-CN au fost identificate

până în prezent 4 variante genetice: A, B, C, D (Farrell şi colab., 2004). La bubaline au

fost identificate 3 variante genetice: A, B, C (Ferranti şi colab., 1998). La ovine au fost

identificate 2 variante genetice: A, B (Rossi şi colab., 1984; Mauriello şi colab., 1990).

La caprine au fost identificate 9 variante genetice: A, B, C, E, F, G, D, 0 şi 0’ (Erhardt şi

colab., 2002).

Kappa-CN este o proteină din lapte constituită din 169 de aminoacizi, având o

greutate moleculară de 19,007 kDa. La taurine la locusul K-CN au fost identificate

până în prezent 11 variante genetice: A, B, C, B2 , E, F, G, Az, H, I, J (Farrell şi colab.,

2004). La bubaline au fost identificate 2 variante genetice: A, B (Mitra şi colab., 1998).

La ovine au fost identificate o singură variantă genetică (Chianese şi colab., 1996;

Ceriotti şi colab., 2004b). La caprine se cunosc 16 situsuri polimorfice ce corespund

unui număr de 13 variante proteice şi 3 mutaţii tăcute, implicând un număr de 15 situsuri

polimorfe doar în exonul 4: A, B, B', B", C, C', F, G, H, I, J, L, D, E, K, M (Jann şi

colab., 2004b).

Alfa-LA este o proteină din lapte constituită din 123 de aminoacizi, având o

greutate moleculară de 14,175 kDa. La taurine la locusul α-LA au fost identificate până

în prezent 3 variante genetice: A, B, C (Farrell şi colab., 2004). La bubaline au fost

identificate 2 variante genetice: A, B (Chianese şi colab., 2004). La ovine au fost

identificate 2 variante genetice: A, B (Dall’Olio şi colab., 1989). La caprine au fost

identificate 2 variante genetice: A1, respectiv A2 (Cosenza şi colab., 2005b).

Beta-LG este o proteină din lapte constituită din 162 aminoacizi, având o greutate

moleculară de 18,277 kDa. La taurine la locusul β-LG au fost identificate până în

prezent 13 variante genetice: A, B, C, D, Dr, Dyak, E, F, G, W, H, I , J (Farrell şi colab.,

2004). La bubaline au fost identificate 2 variante genetice: A, B (Chianese şi colab.,

2004). La ovine au fost identificate 3 variante genetice A, B (Kolde şi colab., 1983;



10

Schlee şi colab., 1993) şi C (Erhardt şi colab., 1989). La caprine au fost identificate 2

variante genetice: A, respectiv B (Yahyaoui şi colab., 2000).

CAPITOLUL IV

IMPORTANŢA STUDIERII POLIMORFISMELOR PROTEINELOR

MAJORE DIN LAPTE PRIN PRISMA POSIBILITĂŢII UTILIZĂRII LOR

CA MARKERI GENETICI ÎN AMELIORAREA ANIMALELOR ŞI

TRASABILITATEA PRODUSELOR LACTATE

Influenţa variantelor genetice ale proteinelor majore din lapte asupra cantităţii

laptelui

La taurine influenţa variantelor genetice ale proteinelor din lapte asupra cantităţii

lui a fost evaluată în numeroase studii. Astfel genotipurile BB de la locusul S1-CN,

A2A2 de la locusul -CN, AA de la locusul -LG şi AA (+15) de la locusul α-LA, au

fost asociate cu o cantitate mai mare de lapte (Bovenhuis şi colab., 1992; Bleck şi colab.,

1993b; Ikonen şi colab., 1999, Ng-Kwai-Hang şi colab., 2006).

La ovine studiile privind influenţa genotipurilor de la locusul β-LG asupra cantităţii

laptelui sunt contradictorii. Bolla şi colaboratorii (1989), respectiv Caroli şi colaboratorii

(1995) au constatat la rasa Sarda că genotipul BB este asociat cu o cantitate mai mare de

lapte. Di Stasio şi colaboratorii (1992) au constatat la rasa de ovine Siciliană o

superioritate a indivizilor AB la acest locus în ceea ce priveşte producţia de lapte. La rasa

de ovine Valle del Belice, genotipul AA a fost asociat cu o cantitate mai mare de lapte

(Giaccone şi colab., 2000).

La caprine Kumar şi colaboratorii (2006) au constatat că genotipurile AA au avut o

producţie mai mare în comparaţie cu celelalte genotipuri.



11

Influenţa variantelor genetice ale proteinelor majore din lapte asupra calităţii

laptelui, proprietăţilor sale de prelucrare şi randamentului de obţinere al

brânzeturilor

La taurine genotipul CC de la locusul αS1-CN, genotipul BB de la locusul K-CN

şi genotipul BB de la locusul β-LG au fost corelate cu un conţinut mai mare de cazeină şi

proteină totală a laptelui (Jakob şi colab., 1994; Fitzgerald şi colab., 1997; Lunden şi

colab., 1997 ). Genotipul BB de la locusul β-LG a fost corelat cu un conţinut mai mare de

grasime al laptelui (Wedholm şi colab., 2006; Heck şi colab., 2009). Laptele provenit de

la genotipul CC de la locusul αS1-CN, genotipul BB la locusul β-CN şi genotipul BB la

locusul K-CN, coagulează într-un timp mult mai scurt în comparaţie cu celelalte

genotipuri (Delacroix - Buchet şi colab., 1994; Fitzgerald şi colab., 1997; Kubarsepp şi

colab., 2005). Genotipul BB de la locusul K-CN influenţează pozitiv randamentul de

transformare al laptelui în brânzeturi în comparaţie cu genotipurile AA, diferenţele

constatate fiind între 2,7-15%, în functie de tipul de brânză fabricată (Van den Berg şi

colab., 1992; Fitzgerald şi colab.,1997; Walsh şi colab., 1998).

La caprine efectele polimorfismului S1-CN asupra calităţii laptelui de capra au

fost studiate la rasele Franceze (Mahe şi colab., 1994; Delacroix şi colab., 1996;

Manfredi şi colab., 2000). Rezultatele obţinute indica faptul că alela A, în comparaţie cu

alelele E şi F, are un efect semnificativ (pozitiv) asupra conţinutului de proteină, grăsime

şi proprietăţilor de prelucrare ale laptelui. În experimente de fabricare a brânzeturilor, s-

au obţinut diferenţe de 7,4% între genotipurile AA şi EE, de 6,9% între genotipurile EE şi

FF de14,8% între AA şi FF. Brânzeturile provenite de la genotipurile AA au avut un gust

mai slab pronunţat de capră (datorită lipolizei mai slabe), în comparaţie cu genotipurile

FF, care au avut un gust mai pronunţat (datorită lipolizei mai accentuate). Rezultate

similare au fost obţinute şi la rasele Spaniole (Sanchez şi colab., 1998), rasele Italiene

(Meggiolaro şi colab., 2000), rasele Norvegiene (Vegarud şi colab., 1999) şi la unele rase

din SUA (Clark şi colab., 2000).



12

La ovine genotipul CC de la locusul αS1-CN are o influenţa pozitivă asupra

compoziţiei laptelui şi randamentului de obţinere al brânzeturilor. În experimente de

fabricare a brânzeturilor s-au obţinut diferenţe de +3,5%, respectiv +8,6%, între genotipul

CC, în comparaţie cu genotipurile CD, respectiv DD (Pirisi şi colab., 1999). Genotipul

BB de la locusul β-LG a fost asociat cu un conţinut mai mare de grăsime al laptelui şi

mai sarac în lactoza, având un efect favorabil asupra randamentului de obţinere al

brânzeturilor (Celuk şi colab., 2006).

Utilizarea polimorfismelor proteinelor majore din lapte ca markeri genetici în

identificarea autenticităţii laptelui şi produselor lactate

Pe plan mondial un număr mare de metode au fost propuse pentru identificarea

posibilelor falsuri cauzate de amestecuri de lapte interspecifice nedeclarate. Majoritatea

metodologiilor de identificare a autenticităţii produselor lactate se bazează pe analiza

polimorfismelor proteinelor majore din lapte: a) Electroforeza în gel de poliacrilamidă

în condiţii native (Kaminarides şi colab., 2002); b) Electroforeza în gel de

poliacrilamida în condiţii denaturante (Veloso şi colab., 2002); c) Electroforeza prin

focalizare izoelectrică (Addeo şi colab,. 1990; Anonymous, 2001; Bâlteanu , 2005;

Bâlteanu şi colab., 2007b,c,d; Vlaic şi colab., 2008; Bâlteanu şi colab., 2008c); d)

Electroforeza de capilaritate (Lee şi colab., 2001); e) Metode imunochimice - ELISA

(Hurley şi colab., 2004); f) Cromatografia de înaltă performanţă în fază lichidă

inversată (Veloso şi colab., 2002); g) Spectrometria de masa (Siciliano şi colab.,

2000); h) Tehnici bazate pe analiza ADN (Bottero şi colab., 2002).



13

PARTEA II: CERCETĂRI PROPRII

CAPITOLUL V

SCOPUL ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII

Studiul polimorfismelor proteinelor majore din lapte la speciile / rasele de fermă

autohtone a avut ca scop evaluarea posibilităţii folosirii ulterioare a acestor informaţii în

mai multe direcţii, ca de exemplu:

- Creşterea calităţii laptelui (în principal al conţinutului de cazeină), proprietăţilor sale de

prelucrare şi randamentului de obţinere al brânzeturilor;

- Obţinerea unui lapte hipoalergenic prin selecţia unor indivizi ce nu produc αS1-CN,

care este principalul alergen din lapte;

- Obţinerea unui lapte mai sănătos ce conţine variante ale β–CN care nu afecteză

sanătatea umana;

- Identificarea autenticităţii/originii laptelui şi produselor lactate.

Aplicarea informaţiilor furnizate de aceşti markeri genetici nu poate fi făcută fără o

cunoaştere aprofundată a polimorfismelor genetice ce apar la cei 6 loci la speciile / rasele

autohtone de taurine, bubaline, ovine şi caprine. Această caracterizare poate oferi

informaţii extrem de valoroase în ceea ce priveşte frecvenţa alelelor de la cei 4 loci ai

cazeinelor şi cei 2 loci ai proteinelor din lactoserum în populaţiile autohtone.

În contextul stadiului actual al cunoaşterii în domeniu, teza are ca obiective

principale direcţii de cercetare cu importanţă deosebită pe plan mondial, însă mai puţin

sau deloc cunoscute pe plan naţional:

- Testarea unor protocoale de hibridare FISH (hibridare in situ cu fluorescenţă), folosind

sonde BAC (cromozom artificial bacterian), care să permită cartarea genelor ce codifică

proteinele majore din lapte pe cromozomii metafazici şi în nuclei interfazici;



14

- Caracterizarea polimorfismelor genetice de la cei 6 loci ce codifică cele 6 proteine

majore din lapte, la unele rase de taurine: Bălţată Românească de tip Simmental, Bălţată

cu Negru Românească, Holstein Roşu, Brună, Pinzgau de Transilvania şi Sura de Stepă;


majore din lapte, la bubalinele autohtone din rasa Bivol Românesc;


majore din lapte, la caprinele autohtone din rasa Carpatina;


majore din lapte, la ovinele autohtone din rasele: Ţurcană, Carabaşa, Ţigaie, Ţigaie

Ruginie, Merinos de Cluj şi Karakul de Botoşani;

- Caracterizarea moleculară a alelei noi descoperite la Sura de Stepă, varietatea

Moldovenească, redenumită S1-CN ISM, în vederea studierii posibilităţii folosirii ei ca

marker genetic de biodiversitate al rasei;

- Caracterizarea moleculară a alelelor noi descoperite la rasa Bivol Românesc,

redenumite S1-CN BBT şi β-CN CBT;

- Studierea posibilităţii folosirii polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din

laptele speciilor/raselor de fermă, ca markeri genetici de identificare a

autenticităţii/originii laptelui, brânzeturilor şi altor produse lactate autohtone, luând în

considerare şi noile alele identificate la cei doi loci ai cazeinelor la rasa Bivol Românesc.

CAPITOLUL VI

CARTAREA PE CROMOZOMI A GENELOR CARE CODIFICĂ

PROTEINELE MAJORE DIN LAPTE PRIN TEHNICA HIBRIDĂRII ÎN

SITU CU FLORESCENŢĂ (FISH)

În cadrul experimentelor realizate am folosit două sisteme de detecţie a sondei

hibridate şi anume: un sistem de detecţie cu un singur anticorp marcat cu un fluorocrom

roşu (TRITC), anticorp care recunoaşte specific digoxigenina cu care a fost marcată una



15

din sonde BAC (sonda ce conţine gena WAP) şi un sistem dublu, în care un anticorp

primar recunoaşte specific biotina cu care a fost marcată cealaltă sondă (sonda ce conţine

clusterul de cazeine), care la rândul său este recunoscut de un anticorp secundar marcat

cu un fluorocrom verde (FITC).

Au fost realizate hibridări (cu sondele menţionate) pe cromozomi metafazici,

proveniţi din culturi celulare de fibroblaşti de iepure şi celule mamare tumorale HC11 din

glanda mamară de şoarece, precum şi pe nuclei interfazici bidimensionali sau

tridimesionali cu structură prezervată preparaţi din celule HC11.

În toate cazurile au fost obţinute semnale de hibridare specifice, care au permis o

cartare corectă pe cromozomi, respectiv în teritoriile cromozomiale specifice, a genelor

studiate.

CAPITOLUL VII

STUDIUL POLIMORFISMELOR CELOR DOUĂ GENE CE CODIFICĂ

K-CAZEINA ŞI -LACTOGLOBULINA LA TAURINE DIN RASA

BĂLŢATĂ ROMÂNEASCĂ DE TIP SIMMENTAL PRIN TEHNICA PCR-

RFLP

Studiul polimorfismelor K-CN şi β-LG a vizat testarea unor protocoale de lucru

PCR-RFLP, care să permită diferenţierea celor mai comune alele de la aceşti doi loci (A,

respectiv B). Astfel în cazul amplificării unui fragment de 350 pb din gena K-CN şi

digestiei cu enzima Hinf I, s-au observat 3 profile de restricţie corespunzătoare

genotipurilor AA, AB şi BB, de la acest locus. În cazul amplificării unui fragment de 262

pb din gena β-LG şi digestiei cu enzima Hae III s-au observat de asemenea 3 profile de

restricţie, corespunzătoare genotipurilor AA, AB si BB, de la acest locus.

Calcularea frecvenţei genotipurilor la locusul K-CN a scos în evidenţă o frecvenţă

mai mare a genotipului AB în comparaţie cu celelalte două. Calcularea frecvenţei



16

alelelorde la acest locus, a scos în evidenţă o frecvenţă mai mare a alelei A, în comparaţie

cu alela B.

Calcularea frecvenţei genotipurilor de la locusul β-LG a scos în evidenţă o

frecvenţă mai mare a genotipului AB în comparaţie cu celelalte 2. Calcularea frecvenţei

alelelorde la acest locus, a scos în evidenţă o frecvenţă mai mare a alelei B în comparaţie

cu alela A.

Rezultatele obţinute evidenţiază că cele 2 teste ADN pot fi folosite pentru

identificarea alelelor comune A şi B de la acesti loci, ceea ce permite o genotipizare

precoce a reproducătorilor taurini pentru cei 2 markeri genetici.

CAPITOLUL VIII

STUDIUL COMPARATIV PRIN TEHNICILE IEF ŞI PCR-RFLP A

POLIMORFISMELOR GENETICE ALE PROTEINELOR MAJORE DIN

LAPTE LA TAURINE DIN RASA BĂLŢATĂ ROMÂNEASCĂ DE TIP

SIEMMENTAL

Studiul a fost realizat pe 14 indivizi din rasa Bălţată Românească de tip

Simmental, care au fost genotipizaţi comparativ la locusul K-CN şi β-LG atât prin PCR-

RFLP, cât şi prin IEF. El a avut ca scop evaluarea eficienţei genotipizării la nivel de

ADN (realizat prin tehnica PCR-RFLP) şi la nivelul expresiei genice (realizat prin

tehnica IEF), la locii ce codifică proteinele majore din lapte.

În urma analizei comparative a rezultatelor obţinute am identificat la locii K-CN,

respectiv β-LG aceleaşi genotipuri, atât prin PCR-RFLP, cât şi prin IEF. În plus prin

tehnica IEF au fost vizualizate în acelaşi gel şi genotipurile de la ceilalţi 4 loci ce codifică

αS1-CN, αS2-CN, β-CN şi α-LA, permiţând o identificare corectă a tuturor alelelor, chiar

şi a celor mai rare, ce apar cu frecvenţă mai redusă.



17

Rezultatele obţinute scot în evidenţă faptul că tehnica IEF permite stabilirea mai

corectă a genotipurilor la cei 6 loci ce codifică proteinele majore din lapte, deoarece pot

fi identificate şi alele mai rare, lucru dificil şi costisitor cu ajutorul tehnicii PCR.

CAPITOLUL IX

CARACTERIZAREA POLIMORFISMELOR PROTEINELOR MAJORE

DIN LAPTE LA UNELE RASE DE TAURINE, BUBALINE, OVINE ŞI

CAPRINE DIN ROMÂNIA FOLOSIND TEHNICA IEF

În cazul taurinelor au fost genotipizaţi prin IEF la cei 6 loci ce codifică

proteinele majore din lapte un număr de 693 de indivizi din 7 rase autohtone, după cum

urmează: Bălţată Românească de tip Simmental (236 de indivizi), Bălţată cu Negru

Românească (230 de indivizi), Holstein Roşu (13 indivizi), Brună (134 de indivizi),

Pinzgau de Transilvania, varietăţile neagră (26 de indivizi) şi roşie (30 de indivizi) şi

Sura de Stepă, varietatea Moldovenească (24 de indivizi).

La locusul αS1-CN au fost identificate cele 2 variante genetice comune B şi C.

Frecvenţa variantei B este de peste 0,9 la rasele mai ameliorate în direcţia unei producţii

mai mari de lapte studiate, atingând frecvenţa 1 la rasa Holstein Roşu. Frecvenţa cea mai

mică a fost observată la rasa Pintzgau, varietatea negră. Frecvenţa variantei C, asociată la

multe rase de taurine cu o calitate superioară de procesare în brânzeturi a laptelui, a fost

cea mai mare la rasa Pinzgau Negru (0,308), această alelă fiind absentă la rasa Holstein

Roşu. La locusul αS1-CN a fost identificată la rasa Sura de Stepă, varietatea

Moldovenească, o nouă variantă genetică denumită ISM, cu un punct izoelectric între cel

al variantelor B şi C. Frecvenţa acestei alele determinată prin IEF este de 0,041 în

populaţiile studiate.

La locusul β-CN au fost identificate 5 variante genetice A1, A2, A3, B, C.

Frecvenţa variantei ancestrale A2 este cea mai mare în comparaţie cu a celorlalte (peste

0,5), cu excepţia rasei Pintzgau, varietatea rosie, la care frecvenţa variantei A1 este mai



18

mare (0,483). Varianta A3 a fost detectată doar un individ din rasa Bălţată Românească de

tip Simmental. Varianta B, asociată la multe rase de taurine cu o calitate superioară de

procesare în brânzeturi a laptelui, are o frecvenţă extrem de redusă la toate rasele (între

0,039-0,117).Varianta C a fost detectată cu o frecvenţă foarte redusă la rasele Bălţată

Românească de tip Simmental, Brună şi Pinzgau Negru. La rasa Sura de Stepă prezenţa

variantei C a fost evidenţiată doar la indivizii genotipizaţi din zona Tazlău şi Tupilaţi, ea

fiind o dovadă a infuziei cu rasa Brună. Ea nu a fost detectată la indivizii consideraţi a fi

rasa curată de la SCDCB Dancu.

La locusul αS2-CN au fost identificate o singură variantă genetică şi anume

varianta A, cu o frecvenţa egala 1.

La locusul K-CN au fost identificate 3 variante genetice A, B şi C. Cea mai mare

frecvenţă a variantei A a fost înregistrată la rasa Bălţată cu Negru Românească (0,835),

iar a variantei B la rasa Brună (0,619). La rasa Bălţată Românească de tip Simmental

frecvenţa alelei A este foarte mare (0,679). Varianta C a fost detectată cu o frecvenţă

redusă la rasele Bălţată Românească de tip Simmental şi Brună.

La locusul α-LA au fost identificate o singură variantă genetică şi anume varianta

B, cu o frecvenţă egală 1.

La locusul β-LG au fost identificate 3 variante genetice A, B şi C. Frecvenţa

variantei A este cea mai mare la rasa Bălţată Românească de tip Simmental şi Sura de

Stepă (peste 0,5). Frecvenţa variantei B este mare la toate rasele, la rasa Holstein Roşu

fiind de 0,769.

În cazul bubalinelor au fost genotipizaţi la cei 6 loci ce codifică proteinele

majore din lapte un număr de 139 de indivizi din rasa Bivol Românesc. La locii αS1-CN

şi β-CN au fost identificate cu o frecvenţă de 0,86 cele 2 variante genetice comune: A de

la locusul αS1-CN şi B de la locusul β-CN. Au fost identificate cu o frecvenţă de 0,14

două variante genetice noi, αS1-CN BRV şi β-CN CRV (redenumite αS1-CN BBT şi β-CN

CBT). Ele au fost observate în linkage pe cromozomul 6. La ceilalţi 4 loci a fost

identificată doar câte o alelă cu o frecvenţă egală cu 1.



19

În cazul ovinelor au fost genotipizaţi la cei 6 loci ce codifică proteinele majore

din lapte un număr de 282 de indivizi din 6 rase autohtone, după cum urmează: Ţurcană

(44 de indivizi), Carabaşa (40 de indivizi), Ţigaie (45 de indivizi), Ţigaie Ruginie (28 de

indivizi), Merinos de Cluj (35 de indivizi), Karakul de Botoşani, varietăţile neagră (15

indivizi), brumărie (15 indivizi), maro (15 indivizi), sură (15 indivizi), roz (15 indivizi),

albă (15 indivizi).

La toate cele 6 rase de ovine genotipizate polimorfismul proteinelor din lapte este

foarte redus, singurul locus polimorf fiind locusul β-LG, unde au fost identificate două

variante genetice A şi B. Varianta A are o frecvenţă mai mare (de peste 0,5) la rasele

Ţurcană, Carabaşă, Merinos de Cluj, respectiv Karakul, cea mai mare fiind la Karakul,

varietatea albă. Alela B are o frecvenţă mai mare, în comparaţie cu A, la rasele Ţigaie şi

Ţigaie Ruginie.

La locii αS1-CN, β-CN, αS2-CN, K-CN şi α-LA a fost identificată câte o singură

variantă genetică cu o frecvenţă egală cu 1. Prezenţa alelei C la locusul αS1-CN are o

semnificaţie pozitivă, deoarece ea a fost asociată în multe studii cu calităţi superioare de

procesare ale laptelui şi randamente mai mari de obţinere a brânzeturilor.

În cazul caprinelor au fost genotipizaţi la cei 6 loci ce codifică proteinele majore

din lapte un număr de 283 de indivizi din rasa Carpatină.

La locusul αS1-CN au fost identificate 4 categorii de alele, asociate cu 4 nivele

diferite de expresie. Rezultatele indică o frecvenţă de 0,569 a alelelor cu expresie

puternică a αS1-CN (A, B, C) şi o frecvenţă de 0,431 în cazul alelelor cu expresie medie,

slabă şi nule. Dacă luăm în considerare efectivul de 700.000 de capre existent în

România şi frecvenţa calculată a alelelor de tip E, F sau 0 de 43,1%, putem deduce că un

număr de 301.700 de capre produc un lapte cu un conţinut mai sărac în proteină, care

afectează substanţial calitatea lui şi randamentul de obţinere al brânzeturilor. Aceste

rezultate pot explica heterogenitatea rasei Carpatină în ceea ce priveşte unii parametrii

calitativi şi de procesare ai laptelui. La locusul αS1-CN au fost identificate 2 posibile noi

variante genetice denumite αS1-CN 0 şi αS1-CN X. Prima, identificată cu o frecvenţă de

0,021, se caracterizează prin absenţa αS1-CN în lapte, fiind observată întotdeauna în



20

linkage cu un profil necunoscut de la locusul β-CN, dovedind transmiterea înlănţuită a

celor 2 variante genetice situate pe acelaşi cromozom. A două posibilă variantă genetică,

αS1-CN X, a fost observată doar la un individ, în stadiu heterozigot cu alela B. Pe baza

comportamentului electroforetic se pare că prezintă în secvenţa aminoacizilor o

restructurare majoră, cauzată probabil de acelaşi fenomen de exon skipping ce

caracterizează şi alela F. Cu toate acestea, pe baza intensităţii de colorarea a benzilor

electroforetice, am concluzionat că face parte probabil din categoria alelelor cu expresie

puternică.

La locusul β-CN au fost identificate 3 variante genetice. Varianta genetică comună

A, respectiv varianta C au fost identificate cu o frecvenţă de 0,979. Ele nu au putut fi

diferenţiate prin IEF deoarece au acelaşi punct izoelectric. La câţiva indivizi a fost

identificată cu o frecvenţă de 0,021, o variantă genetică necunoscută denumită β-CN X

linkată întotdeauna cu αS1-CN 0.

La locusul αS2-CN au fost identificate 3 variante genetice. Varianta genetică C a

αS2-CN are o frecvenţă mai mare (0,553), în comparaţie cu varianta A (0,431), varianta

E având o frecvenţa redusă (0,016).

La locusul K-CN au fost identificate 2 variante genetice. Varianta genetică A este

predominantă (0,912), varianta B având o frecvenţa redusă (0,088). Prezenţa variantei B

şi la rasa Carpatina are o semnificaţie pozitivă deoarece ea a fost asociată în diverse studii

cu o calitate superioară de procesare a laptelui în brânzeturi.

La locii β-LG şi α-LA a fost identificată câte o singură variantă genetică la fiecare

locus, cu frecvenţe egale cu 1.



21

CAPITOLUL X

CARACTERIZAREA MOLECULARĂ A ALELELOR NOI

IDENTIFICATE LA LOCII αS1-CAZEINEI ŞI β-CAZEINEI LA RASA

SURA DE STEPĂ, VARIETATEA MOLDOVENEASCĂ ŞI BIVOL

ROMÂNESC

La Sura de Stepă

O nouă alelă a αS1-CN de la taurine a fost descoperită la rasa Sura de Stepă,

varietatea Moldovenească, denumită ISM, fiind complet caracterizată folosind o

metodologie combinată de secvenţiere a proteinei, cADN-ului şi ADN-ului.

Prin analiza Maldi Tof-MS am reuşit identificarea unei substituţii în poziţia 192 a

proteinei mature. În această regiune varianta ISM conţine glicina ca şi variant C, şi nu acid

glutamic prezent la varianta B. Celelalte substituţii prin care varianta genetică ISM se

diferenţiază de B şi C, nu au putut fi clar identificate prin analiza Maldi Tof-MS.

Secvenţierea comparativă a cADN-rilor din două probe purtătoare ale αS1-CN ISM

(BISM, CISM), respectiv a 2 probe de referinţă (BB, CC), au evidenţiat mutaţiile care

caracterizează această nouă alelă: substituţia unei adenine din alela C şi B (exonul 11,

nucleotidă 297, codonul 99 gaA ce codifică glutamina), cu o timină în alela ISM (gaT ce

codifică acidul aspartic); substituţia unei adenine din alela B (exonul 17, nucleotida 620,

codonul 207 gAa ce codifică glutamina) cu o guanină în alelele C şi ISM (gGa ce codifică

glicina). Această ultimă substituţie a fost confirmată şi la nivel proteic prin analiza Maldi

Tof-MS. Au fost identificate două alte substituţii comune alelelor B, C şi ISM (secvenţiate

de la rasa Sura de Stepă, Varietatea Moldovenească), care sunt diferite de ale unor

secvenţe de referinţă publicate în GenBank, fără efect asupra secvenţei aminoacizilor în

proteină.

Pe baza substituţiei unei adenine din poziţia 21 a exonului 11 din alela C (adenina

regăsită şi în alela B), cu o timină în alela ISM, a fost pus la punct un test PCR-RFLP ,

prin amplificarea şi restricţia cu enzima BseGI a unui fragment de 422 pb din gena αS1-



22

CN incluzând exonul 11. Deoarece prezenţa acestei noi alele a fost observată doar la

indivizi consideraţi rasă curată, apartenenţa ei la rasa Sura de Stepă nu poate fi contestată.

Această teorie este susţinută şi de frecvenţa cu care a fost identificată în populaţia de Sura

de Stepă genotipizată: 0,128; frecvenţa este destul de mare pentru o nouă variantă

genetică. Aceasta sugerează că alela ISM a avut o frecvenţa şi mai mare când această rasă

(şi progenitorii ei) era predominantă în România.

Pe baza similarităţilor şi diferenţelor observate la nivel molecular între alelele αS1-

CN B, C şi ISM am concluzionat că această nouă alelă a derivat filogenetic din alela

ancestrală C, furnizând prima dovadă moleculară despre relaţiile filogenetice dintre Sura

de Stepă şi reprezentanţii genului Bos din Africa şi Asia

La Bivolul Românesc

Secvenţierea cADN-urilor αS1-CN A (alela comună) şi alelei BBT de la Bivolul

Românesc, a scos în evidenţă în cazul alelei BBT 2 mutaţii punctiforme care o diferenţiază

de celelalte alele cunoscute la bivolul Mediteranean şi Indian. Deleţia întregului exon 6,

este un tip de restructurare extrem de interesant, care scurtează proteina matură cu 8

aminoacizi, faţă de proteina normală care are 199 aminoacizi. Au mai fost identificate

încă 3 mutaţii, care fie sunt asemănătoare fie sunt diferite faţă de alte alelele comune.

Secvenţierea cADN-urilor β-CN B (alela comună) şi alelei CBT de la Bivolul

Românesc, a dus la identificarea a 4 mutaţii care diferenţiază cele 2 variante genetice şi

care afectează secvenţa previzionată a proteinei mature. De asemenea au fost identificate

2 mutaţii tăcute în sensul că, codonul rezultat codifică acelaşi aminoacid în ambele

cazuri.

De vreme ce alelele noi identificate apar cu frecvenţă mare la Bivolului Românesc,

ele ar putea fi folosite ca markeri genetici de origine/autenticitate a brânzeturile

autohtone de bivoliţă, cu aplicabilitate imediată.



23

CAPITOLUL XI

IDENTIFICAREA AUTENTICITĀŢII/ORIGINII DECLARATE

A LAPTELUI ŞI PRODUSELOR LACTATE AUTOHTONE

FOLOSIND CA MARKERI GENETICI POLIMORFISMELE

PROTEINELOR MAJORE DIN LAPTE

Dacă în alte ţări UE cazurile de falsificare sunt destul de rare, în România laptele

de vacă (produs la un preţ mai mic şi în cantitate mai mare), este de multe ori adăugat

nedeclarat în laptele de bivoliţă, capră sau oaie, destinat preparării unor produse lactate

,,autentice’’, asta mai ales în cazul laptelui prelucrat industrial.

Metodologia Europeană acreditată de identificare a falsurilor din brânzeturi, se

bazează pe analiza prin IEF a fracţiunilor gama cazeinice, care rezultă din hidroliza cu

plasmină a β-CN, având dezavantajul că nu poate diferenţia laptele de capră de cel de

oaie. La ora actuală în România nu există o metodologie de identificare a adausurilor de

lapte interspecifice nedeclarate în produsele lactate.

Cercetările descrise în acest capitol au avut ca scop studierea posibilităţii folosirii

polimorfismelor genetice ale proteinelor din lapte, descrise la toti cei 6 loci la speciile de

fermă studiate, ca markeri genetici de indentificare a autenticităţii produselor lactate

autohtone. De asemenea, studierea posibilităţii utilizării noilor alele identificate la rasa

Bivol Românesc la locii -CN: alela CBT şi S1-CN: alela BBT, ca markeri genetici de

origine/autenticitate a brânzeturilor tradiţionale româneşti de bivoliţă, a fost un alt

obiectiv al prezentelor cercetări.

Analiza de autenticitate privind depistarea posibilelor amestecuri interspecifice

nedeclarate de lapte, a fost realizată pe număr de 12 sortimente de brânzeturi de pe piaţa

din România, după cum urmează: 2 sortimente de vacă, 3 de bivoliţă, 3 de oaie şi 4 de

capră. În cazul brânzeturilor de vacă s-a constatat că sunt fabricată numai din lapte de

vacă. Acest lucru nu este surprinzător deoarece folosirea altor tipuri de lapte la fabricarea

brânzeturilor de vacă este puţin probabilă. În cazul brânzeturilor de bivoliţă, s-a constatat



24

că majoritatea sunt falsificate cu lapte de vacă în proporţie de 100%. În cazul

brânzeturilor de oaie s-a constatat că două au fost fabricate exclusiv din lapte de oaie, una

fiind falsificată în proporţie de aproximativ 50% cu lapte de vacă. În cazul brânzeturilor

de capră s-a constatat că trei au fost fabricate exclusiv din lapte de capră, cea de-a patra

fiind falsificată în proporţie de 100% din lapte de vacă.

Compararea a două tipuri de brânză de bivoliţă, una de tip Mozzarella produsă din

lapte de la rasa Bivol Italian din regiunea Campania, Italia şi una de tip telemea produsă

din lapte de la rasa Bivol Românesc din Transilvania, a scos în evidenţă în mod clar că

acestea se diferenţiază net prin prezenţa în brânza telemea a variantelor genetice αS1-CN

BBT şi β-CN CBT, variante genetice care sunt absente la Bivolul Italian. Ca urmare

posibilitatea utilizării celor două variante genetice (ce nu au mai fost semnalate până

acum la nici o altă rasă de bivoli din Europa sau din Asia), ca markeri genetici de origine,

autenticitate şi trasabilitate a brânzeturilor Româneşti de bivoliţă este imediată.

CAPITOLUL XII

CONCLUZII GENERALE ŞI RECOMANDĂRI

1. Experimentele de citogenetică au permis cartarea corectă pe cromozomii metafazici,

respectiv în teritoriile cromozomiale specifice, a celor patru cazeine şi a genei WAP. Ca

urmare recomand aceste protocoale de lucru pentru cartarea genelor de interes pe diverşi

cromozomi, studiul linkageului sau crossing-overului, studiul cariotipului în vederea

identificării unor deleţii, duplicaţii, inversii, translocaţii, care nu sunt vizibile prin metode

clasice de bandare a cromozomilor;

2. În urma analizei comparative a rezultatelor obţinute am identificat la locii K-CN,

respectiv β-LG aceleaşi genotipuri, atât prin PCR-RFLP, cât şi prin IEF. In plus prin

tehnica IEF au fost vizualizate în acelaşi gel şi genotipurile de la ceilalţi 4 loci ce codifică

αS1-CN, αS2-CN, β-CN şi α-LA, permiţând o identificare corectă a tuturor alelelor, chiar

şi a celor mai rare, ce apar cu frecvenţă mai redusă;



25

3. Au fost genotipizati prin IEF la cei 6 loci ce codifică proteinele majore din lapte un

număr de 693 de indivizi din 7 rase de taurine autohtone, 139 de indivizi dintr-o rasă

autohtonă de bubaline, 282 de indivizi din 6 rase autohtone de ovine, 283 de indivizi

dintr-o rasă autohtonă de caprine. În urma genotipizării au fost stabilite frecvenţele

alelelor şi genotipurilor la cei şase loci ce codifică proteinele majore din lapte;

4. Ca urmare recomand cele tehnica PCR-RFLP pentru genotipizarea precoce a

reproducătorilor pentru cei doi markeri, iar tehnica IEF pentru genotipizarea la toţi cei 6

loci, în vederea identificării mai corecte a genotipurilor şi evaluarea nivelului de expresie

al acestor alele;

5. Au fost identificate şi caracterizate molecular 3 variante genetice noi, una la locusul

αS1-CN la Sura de Stepă şi două la locii αS1-CN şi β-CN la Bivolul Românesc. La

caprinele din rasa Carpatină au fost identificate 3 posibile noi variante genetice, doua la

locusul αS1-CN şi una la locusul β-CN, care sunt în curs de caracterizare.

6. Folosind o analiză combinată de detecţie a polimorfismului fracţiunii cazeinice şi a

proteinelor din lactoserum de la speciile de fermă autohtone, am reuşit o identificare

rapidă a speciilor în probele de lapte de amestec şi în brânzeturile analizate. Se poate

concluziona că variantele genetice ale celor 6 proteine majore din lapte întâlnite la

speciile de fermă autohtone (majoritatea fiind comune la toate speciile şi rasele din

lume), pot fi folosite cu succes ca markeri genetici de identificare a autenticităţii/originii

produselor lactate autohtone.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia

A., Bocca A., 1990. Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine

milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of 2 γ-caseins.

Milchwissenschaft, 45:708-711;

2. Aschaffenburg R., Drewry J., 1955. Occurrence of different beta-lactoglobulins in

cow's milk. Nature, 176:218-219;



26

3. Bâlteanu V.A., Pop F.D., Vlaic A., Carsai T.C., Creangă Şt., Rusu A.R., 2010a.

Characterization of the αS1-casein IRV allele provides evidence for phylogeny of the

ancient Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian strain. Lucrări Ştiinţifice Seria

Zootehnie Iaşi, 53: 315-320;

4. Bâlteanu V.A., Vlaic A., Pop F.D., Carşai T.C., Pascal C., Creangă Şt., Zaharia N.,

Pădeanu I., Voia O.S., Sauer M., Sauer I.W., 2010b. The study of αS1-casein genetic

marker polymorphism in Carpathian goat breed: synthesis of 2009 research (Project PN II

52104/2008). Lucrări Ştiinţifice Seria Zootehnie Iaşi, 53: 321-325;

5. Bâlteanu V.A., Pop F.D., Vlaic A., Rusu A.R., Creangă S., 2008b. Molecular

characterization of αS1-CN IRV allele discovered in Romanian Grey Steppe cattle and it's

frequency in this breed. Bulletin of USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 65: 477;

6. Bâlteanu V.A., Pop F.D, Vlaic A.Rusu A.R. , 2008c. Multiple mutations events are

characterizing alpha s1 casein BRV and beta casein CRV alleles discovered in Romanian

Buffalo breed. Bulletin of USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 65: 477;

7. Bâlteanu V.A., Vlaic A., Pop F.D., Rusu A. R., Odagiu A., Cighi V., Creanga S.,

2007d. αS1-casein alleles frequency in Carpathian goat. Bulletin of USAMV-CN, Anim.

Sci. and Biotech., 63-64/2007: 527;

8. Chianese L., Garro G., Mauriello R., Laezza P., Ferranti P., Addeo F., 1996.

Occurrence of five αs1 casein variants in ovine milk. J. Dairy Res., 63: 49-59;

9. Farrell H. M., Jimenez-Flores R., Bleck G. T, Brown. E. M.,. Butler J. E, Creamer L.

K., Hicks C. L., Hollar C. M., Ng-Kwai-Hang K. F., Swaisgood H. E., 2004.

Nomenclature of the Proteins of Cows’ Milk-Sixth Revision. J. Dairy Sci., 87:1641–1674;

10. Giaccone P., Di Stasio L., Macciotta N.P.P., Portolano B., Todaro M., Cappio-Borlino

A., 2000. Effect of betalactoglobulin polymorphism on related traits of dairy ewes’ milk

analysed by repeated measures design. J. Dairy Res., 67: 443-448;

11. Heck J. M. L, Schennink A., Valenberg H. J. F., Bovenhuis H., Visker M. H.,

Arendonk J. A. M, Hooijdonk A. C. M, 2009. Effects of milk protein variants on the

protein composition of bovine milk, J. Dairy Sci., 92:1192-1202;



27

12. Mahé M.F., Miranda G., Queval R., Bado A., Zafindrajaona P.S., Grosclaude F.,

1999. Genetic polymorphism of milk proteins in African Bos taurus and Bos indicus

populations. Characterization of variants αs1-Cn H and k-Cn J. Genet. Sel. Evol., 31:

239-253;

13. Ng-Kwai-Hang, K. F., 2006. Genetic variants of milk proteins and their effects on the

yield 484 and quality of cheese. Nutrition and Natural Resources, 56: 1-11;

14. Siciliano R.A., Rega B., Amoresano A., Pucci P., 2000. Modern mass spectrometric

methodologies in monitoring milk quality. Analytical Chemistry, 72: 408-415;

15. Threadgill D.W., Womack J.E., 1990. Genomic analysis of the major bovine milk

protein genes. Nucleic Acids Research, 18: 6935-6942;

16. Veloso A.C.A., Teixeira N., Ferreira I.M., 2002. Separation and quantification of the

major casein fractions by reverse-phase high-performance liquid chromatography and

urea-polyacrylamide gel electrophoresis. Detection of milk adulterations. Journal of

Chromatography, 967: 209-218;

17. Vlaic A., Bâlteanu V.A., F.D. Pop, 2008. Molecular methods used in detection of

cattle milk in buffalo, ewe and goat in dairy products. Lucrări Ştiinţifice Seria Zootehnie,

Iasi, 51: 1016-1021;

18. Vlaic, A., D.C. Pamfil, Ioana Gaboreanu, B. Vlaic, R. Renaville, 2003. Increasing

milk production in cattle using DNA marker assisted selection (Pit-1). Bulletin of

USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 59:188-191;

19. Vlaic A., Ciobanu D.C., Oroian T., Handoca E., 2002.Variantele genetice ale k-

cazeinei determinate prin tehnica PCR – RFLP şi asocierea acestora cu însuşirile

producţiei de lapte la rasa Brună. „Cercetări de genetică vegetală şi animală”, ASAS

Bucureşti şi ICCPT Fundulea, vol. VII;

20. Wedholm A., Larsen L B., Lindmark-Månsson H., Karlsson A. H., Andrén A., 2006.

Effect of Protein Composition on the Cheese-Making Properties of Milk from Individual

Dairy Cows. J. Dairy Sci., 89: 3296-3305;



28

Eng. Biologist BÂLTEANU I. VALENTIN ADRIAN

SUMMARY OF Ph.D. THESIS THE STUDY OF MAJOR MILK PROTEINS GENETIC POLYMORPHISMS IN THE MAIN CATTLE, BUFFALO, SHEEP AND GOAT BREEDS FROM ROMANIA WITH THE AIM OF USING THEM AS GENETIC MARKERS IN BREEDING AND TRACEABILITY

Scientific advisor Prof.Univ. Eng. VLAIC AUGUSTIN Ph.D.

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE CLUJ-NAPOCA

DOCTORAL SCHOOL FACULTY OF ANIMAL HUSBANDRY AND BIOTECHNOLOGY



29

CONTENTS INTRODUCTION.................................................................................................31 PART I: BIBLIOGRAPHIC STUDY CHAPTER I COMPOSITION OF CATTLE, BUFFALO, SHEEP, GOAT MILK AND MILK SYNTHESIS MECHANISM IN LACTATING MAMMARY GLAND..................................................................32 CHAPTER II MOLECULAR TECHNIQUES USED FOR MILK PROTEINS POLYMORPHISMS STUDY.........................................................33 CHAPTER III CURRENT STAGE OF THE RESEARCH CONCERNING THE STUDY OF MILK PROTEINS POLYMORPHISMS IN CATTLE, BUFFALO, SHEEP AND GOAT.................................................34 CHAPTER IV THE IMPORTANCE OF MAJOR MILK PROTEINS POLYMORPHISMS STUDY BY THEIR POSSIBLE USE IN ANIMAL BREEDING AND DAIRY PRODUCTS TRACEABILITY...........................................................................37 PART II: PERSONAL RESEARCH CHAPTER V THE RESEARCH AIM AND OBJECTIVES……………………………........39 CHAPTER VI CHROMOSOME MAPPING OF THE GENES CODING FOR MAJOR MILK PROTEINS BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDISATION (FISH)…………………..…………………….....40



30

CHAPTER VII THE STUDY BY PCR-RFLP OF THE TWO GENES POLYMORHISM CODING FOR K-CASEIN AND β-LACTOGLOBULIN IN CATTLE BELONGING TO ROMANIAN SIMMENTAL BREED ……………………….……….…....41 CHAPTER VIII COMPARATIVE STUDY BY IEF AND PCR-RFLP OF MAJOR MILK PROTEINS GENETIC POLYMORPHISMS IN CATTLE BELONGING TO ROMANIAN SIMMENTAL BREED……..........................................................................................................42 CHAPTER IX THE CHARACTERIZATION OF MAJOR MILK PROTEINS POLYMORPHISMS IN SOME ROMANIAN CATTLE, BUFFALO, SHEEP AND GOAT BREEDS BY IEF TECHNIQUE……………………………………………………...…...42 CHAPTER X MOLECULAR CHARACTERIZATION OF THE NEW ALLELES IDENTIFIED IN αS1-CASEIN AND β-CASEIN LOCI IN ROMANIAN GREY STEPPE CATTLE, MODAVIAN VARIETY AND ROMANIAN BUFFALO..............................................................................................................47 CHAPTER XI IDENTIFICATION OF DECLARED AUTHENTICITY/ ORIGIN OF MILK AND DAIRY PRODUCTS USING THE MAJOR MILK PROTEINS POLYMORPHISMS AS GENETIC MARKERS……………………………………………………...…..48 CHAPTER XII GENERAL CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS.........................49 SELECTIVE BIBLIOGRAPHY..........................................................................50



31

INTRODUCTION

Lactogenesis can be divided in two phases: Phase I - begins in the last stage of

gestation and is characterized by cellular, structural and functional differentiation

processes of the secretor epithelium; Phase I - begins immediately after birth and

involves the ending of cellular differentiation, which coincides with milk secretion and

it’s synthesis in significant quantities. These two phases are essential having as final

effect the beginning of milk production (the start of lactation).

In ruminants’ milk there are 6 major milk proteins types, which are coded by 6 non-

allelic genes specifically expressed in mammary epithelial cells during lactation: S1-

casein (S1-CN), -casein (-CN), S2-casein (S2-CN), K-casein (K-CN), -

lactoglobulin (-LG) and -lactoalbumin (-LA).

The mutations occurring in these genes structure during the years, lead to the

appearance of many alleles in these loci. These variations, named generically

polymorphisms, are caused by genes restructuration (substitution of a nucleotide with

another, deletions, insertions etc), which can have as effects: modification of genes

expression levels, inactivation of genes expression and modification in aminoacid

sequence of the proteins codified by these genes.

Some of these genetic variants from the 6 loci have a positive effect on milk casein

content, coagulation time, curd firmness and cheese making efficiency, others having a

negative effect on these parameters; some β-CN genetic variants (A1, B, C) were

associated with some illnesses in humans as Diabetes Mellitus type 1, Ischemic Heart

disease, Sudden Infant Death Syndrome, Schizophrenia and Autism; some of αS1-CN

genetic variants are incriminated for causing allergies in children, following milk

consumption.

Using of the information provided by the 6 major milk proteins genetic variants,

cannot be done without a characterization of Romanian farm species/breeds.



32

The characterization accomplished in my Ph.D. Thesis, provides extremely valuable

information about the alleles frequencies in the six milk proteins loci in local Romanian

species/breeds. This can open new possibilities of using these polymorphisms as genetic

markers in animal breeding, in manipulation of milk components by genetic selection in

order to create alternative milk formulas in order to overcome some illnesses, or as

genetic markers in authenticity/origin identification of dairy products.

PART I: BIBLIOGRAPHIC STUDY

CHAPTER I

COMPOSITION OF CATTLE, BUFFALO, SHEEP, GOAT MILK AND

MILK SYNTHESIS MECHANISM IN LACTATING MAMMARY GLAND

The scientific research established that milk has a complex composition, mainly

concerning the casein fraction, whey proteins, enzymes and antimicrobial components.

The milk represents a highly valuable food source containing more than 100 components

in suspension or emulsion needed for a normal development of humans and animals

(Banu et al., 1998).

The milk proteins are divided in two main groups according to their behaviour in

acid pH = 4,6:

1. The soluble fraction in acid pH (whey proteins), is composed of β-lactoglobulin (β-

LG), α-lactoalbumin (α-LA) and other minor proteins. In the cheese making process

by adding chimosin, this fraction remains in whey.

2. The insoluble fraction in acid pH (whole casein) is composed of αS1-casein (αS1-

CN), αS2-casein (αS2-CN), β-casein (β-CN) and K-casein (K-CN). The caseins are found

in fresh milk in a high number of solid particles in suspension, bounded by Ca9(PO4)6

molecules. These particles are named micelles.



33

The protein content of cattle milk is in average 3,3%, in buffalo milk 4,1%, in sheep

milk 5,3 % and in goat milk 3,7% (Iurcă et al., 1998). From the total milk proteins the

casein fraction represents 80% and whey proteins 20%.

The proportion of the casein fraction has a significant influence on milk

manufacturing properties, quantity and quality of obtained cheese, texture and flavour of

different cheeses and other dairy products (Buchberger et al., 2000).

The 6 major milk proteins are coded my 6 non allelic genes, which are specifically

expressed in mammary gland during lactation.

The Mendelian segregation analysis of the 4 non-allelic genes coding for the 4

casein types in ruminants, revealed that they are located on the chromosome pair 6 in the

following order: αS1-CN, β-CN, αS2-CN, K-CN (Threadgill et al., 1990; Hayes et al.,

1993a). The gene coding for β-LG was located on the chromosome pair 11 (Hayes et al.,

1993b) and that coding for α-LA was located on the chromosome pair 5 (Soulier et al.,

1989; Vilotte et al., 1987).

The endocrine system, mainly the pituitary gland, plays a central role in all aspects

involving growth and development of mammary gland (mamogenesis), starting of

lactation and milk synthesis (lactogenesis), maintaining of milk synthesis (galactopoesis)

and then it’s activity ending, by two major hormones: growth hormone or somatotroph

(GH or STH) and prolactin (PRL). The hormonal signals induce the transcriptional

activation of the genes coding for major milk proteins and specific protein synthesis.

CHAPTER II

MOLECULAR TECHNIQUES USED FOR MILK PROTEINS

POLYMORPHISMS STUDY

The studies accomplished from the early ’50 using paper electrophoresis (PE)

evidenced the milk proteins polymorphism, β-LG being the first protein in which a

polymorphism was identified by Aschaffenburg and Drewry (1955).



34

Due to the development of more advanced techniques for protein analysis as: SGE

(starch gel electrophoresis), AE (agarose gel electrophoresis), PAGE (polyacrylamide gel

electrophoresis), IEF (isoelectric focusing), HPLC (high performance liquid

chromatography), Maldi TOF-MS (mass spectrometry), the knowledge concerning the

polymorphisms of major milk proteins in farm species was enriched substantially.

The appearance of the DNA based techniques: PCR (polymerase chain reaction),

PCR-RFLP (restriction fragments length polymorphism), SSCP (single strand

conformation polymorphism), RT-PCR (real time polymerase chain reaction) and DNA

sequencing techniques, allowed the identification of many polymorphisms in the genes

structure, having repercussions on gene expression and aminoacid composition of milk

proteins.

CHAPTER III

CURRENT STAGE OF THE RESEARCH CONCERNING THE STUDY OF

MILK PROTEINS POLYMORPHISMS IN CATTLE, BUFFALO, SHEEP

AND GOAT

The mutations which appeared over the years in the structure of these genes coding

for the six major milk proteins, lead to the appearance of many genetic variants in these

loci.

These variations, named polymorphisms, indicate the fact that each milk protein is

found in several forms codified by autosomal codominant genes named alleles, meaning

that both alleles are expressed in heterozygous individuals.

Alpha S1-CN is a composed of 199 aminoacids, having a molecular weight of 23,

614 kDa. In cattle in αS1-CN locus 10 genetic variants were identified so far: A, B, C,

D, Eyak, Ebali, F, G, H, (Farrell et al., 2004) and IRV (Bâlteanu et al., 2007a; Bâlteanu et

al., 2008a, b). The IRV allele was renamed ISM because it was not evidenced in other

Romanian breeds, being specific to Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian variety (SM



35

= Moldavian variety). In buffalo, 3 genetic variants were identified so far: A, B

(Chianese et al., 2009) and BRV (Bâlteanu et al., 2007c; Bâlteanu et al., 2008c).

Following the characterization in αS1-CN locus of Romanian Buffalo populations it was

established that this genetic variant is specific to this breed, being renamed according to

the region in which it was identified αS1-CN BBT (BT = Transylvanian Buffalo). In

sheep, 9 genetic variants were identified so far: A, B, C, D, E, F, G, H, I (Pirisi et al.,

1999; Giambra et al., 2010). In goat, 17 genetic variants were identified so far: A, B1, B2,

B3, B4, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, 01 and 02 (Ramunno et al., 2004).

Beta-CN is a protein composed of 209 aminoacids, having a molecular weight of

23,983 kDa. In cattle in β-CN locus 14 genetic variants were identified so far: A1, A2,

A3, B, C, D, E, A3m, B2, A4, H, F, A5, G (Farrell et al., 2004). In buffalo, 3 genetic

variants were identified so far: A, B (Ferranti et al., 1998) and CRV (Bâlteanu et al.,

2007c; Bâlteanu et al., 2008c). Following the characterization of β-CN locus of

Romanian Buffalo populations it was established that this genetic variant is specific to

this breed, being renamed according to the region in which it was identified -CN CBT

(BT = Transylvanian Buffalo). In sheep there is no clear evidence of polymorphism at

the protein level (Chianese et al., 1995). In goat 8 genetic variants were identified so far:

A, A1, B, C, D, E, 0 and 0’ (Cosenza et al., 2005a; Caroli et al., 2006).

Alpha S2-CN is a protein composed of 207 aminoacids, having a molecular weight

of 25,150 kDa. In cattle in αS2-CN locus 4 genetic variants were identified so far: A, B,

C, D (Farrell et al., 2004). In buffalo, 3 genetic variants were identified so far: A, B, C

(Ferranti et al., 1998). In sheep, 2 genetic variants were identified so far: A, B (Rossi et

al., 1984; Mauriello et al., 1990). In goat, 9 genetic variants were identified so far:: A, B,

C, E, F, G, D, 0 and 0’ (Erhardt et al., 2002).

Kappa-CN is a protein composed of 169 aminoacids, having a molecular weight of

19,007 kDa. In cattle in K-CN locus 11 genetic variants were identified so far: A, B, C,

B2, E, F, G, Az, H, I, J (Farrell et al., 2004). In buffalo, 2 genetic variants were identified

so far: A, B (Mitra et al., 1998). In sheep, 1 genetic variant was identified so far

(Chianese et al., 1996; Ceriotti et al., 2004b). In goat, 16 polymorphic sites were



36

identified, corresponding to 13 protein variants and 3 silent mutations, involving 15

polymorphic sites just in exon 4: A, B, B', B", C, C', F, G, H, I, J, L, D, E, K, M (Jann et

al., 2004b).

Alpha-LA is a protein composed of 123 aminoacids, having a molecular weight of

14,175 kDa. In cattle in α-LA locus, 3 genetic variants were identified so far: A, B, C

(Farrell et al., 2004). In buffalo, 2 genetic variants were identified so far: A, B (Chianese

et al., 2004). In sheep, 2 genetic variants were identified so far: A, B (Dall’Olio et al.,

1989). In goat, 2 genetic variants were identified so far: A1 and A2 (Cosenza et al.,

2005b).

Beta-LG is a protein composed of 162 aminoacids, having a molecular weight of

18,277 kDa. In cattle in β-LG locus 13 genetic variants were identified so far: A, B, C,

D, Dr, Dyak, E, F, G, W, H, I, J (Farrell et al., 2004). In buffalo, 2 genetic variants were

identified so far: A, B (Chianese et al., 2004). In sheep, 3 genetic variants were identified

so far: A, B (Kolde et al., 1983; Schlee et al., 1993) and C (Erhardt et al., 1989). In goat

2 genetic variants were identified so far: A and B (Yahyaoui et al., 2000).

CHAPTER IV

THE IMPORTANCE OF MAJOR MILK PROTEINS POLYMORPHISMS

STUDY BY THEIR POSSIBLE USE IN ANIMAL BREEDING AND DAIRY

PRODUCTS TRACEABILITY

The influence of major milk proteins genetic variants on milk quantity

In cattle the influence of major milk proteins genetic variants on milk quantity was

evaluated in several studies. The BB genotypes form S1-CN locus, A2A2 from -CN

locus, AA from -LG locus and AA (+15) genotype from α-LA locus, were associated

with a higher milk quantity (Bovenhuis et al., 1992; Bleck et al., 1993b; Ikonen et al.,

1999, Ng-Kwai-Hang et al., 2006).



37

In sheep the studies concerning the influence of β-LG genotypes on milk quantity

are contradictory. Bolla et al. (1989) and Caroli et al. (1995) observed in Sarda sheep that

BB genotype is associated with a higher milk quantity. In another study made on a

Sicilian sheep breed, Di Stasio et al. (1992) observed that AB genotypes had the highest

milk production. In Valle del Belice breed, Giaccone et al. (2000) observed that AA

genotype is associated with a higher milk quantity.

In goat Kumar et al. (2006) observed that individuals with AA genotypes at the β-

LG locus had a higher milk production when compared to other genotypes.

The influence of major milk protein genetic variants on milk quality, milk

manufacturing properties and cheese making efficiency

In cattle the CC genotype from αS1-CN locus, the BB genotype from K-CN locus

and the BB genotype from β-LG locus were associated with a higher casein and whole

protein content in milk (Jakob et al., 1994; Fitzgerald et al., 1997; Lunden et al. 1997).

The BB genotype from β-LG locus was correlated with a higher fat content in milk

(Wedholm et al., 2006; Heck et al., 2009). The milk from CC genotypes in αS1-CN, the

BB genotypes from β-CN locus and BB genotypes from K-CN has a shorter coagulation

time (Delacroix - Buchet et al., 1994; Fitzgerald et al., 1997; Kubarsepp et al., 2005). The

BB genotype from K-CN locus has a positive influence on cheese yield, in comparison

with AA genotypes, the observed differences being situated between 2,7-15% ,

depending on the cheese type produced (Van den Berg et al., 1992; Fitzgerald et al.,

1997; Walsh et al., 1998).

The effects of S1-CN polymorphism on goat milk quality were studied in French

breeds (Mahe et al., 1993; Delacroix et al. 1996, Manfredi et al., 2000). The results

obtained indicated that A allele in comparison with E and F has a significant effect

(positive) on protein and fat content and milk manufacturing properties. In cheese making

experiments the following differences were obtained concerning the cheese quantity:

+7,4% between AA and EE genotypes, +6,9% between EE and FF and +14,8% between



38

AA and FF genotypes. The cheese obtained from AA genotypes had a weak specific goat

flavour (because of a weaker lipolysis), in comparison with FF genotypes which had a

more pronounced goat flavour (because of a higher lipolysis). Similar results were

obtained in Spanish breeds (Sanchez et al., 1998), Italian breeds (Meggiolaro et al.,

2000), Norwegian breeds (Vegarud et al., 1999) and SUA (Clark et al., 2000).

In sheep the CC genotype from αS1-CN locus has a positive influence on milk

composition and cheese yield. In cheese making experiments the following differences

were obtained concerning the cheese yield, +3,5% and +8,6% respectivelly, between the

CC genotype, in comparison with CD and DD genotypes (Pirisi et al., 1999). The BB

genotype from β-LG locus was associated with a higher fat content in milk and lower in

lactose, having a favorable effect on cheese yield (Celuk et al., 2006).

The use of major milk protein polymorphism as genetic markers in

authenticity identification of milk and dairy products

At international level a high number of methods were proposed for the identification

of possible adulteration caused by undeclared inter-specific milk mixtures. In most cases

dairy products authenticity identification is based on major milk protein polymorphism

analysis: a) Polyacrylamide gel electrophoresis in native conditions (Kaminarides et

al., 2002); b) Polyacrylamide gel electrophoresis in denaturant conditions (Veloso şi

colab., 2002); c) Isoelectric focusing electrophoresis (Addeo et al., 1990; Anonymous,

2001; Bâlteanu, 2005; Bâlteanu et al., 2007b,c,d; Vlaic et al., 2008; Bâlteanu et al.,

2008c); d) Capilarity electrophoresis (Lee et al., 2001); e) Immunochemical methods

- ELISA (Hurley et al., 2004); f) Reverse phase high performance liquid

chromatography (Veloso et al., 2002); g) Mass spectrometry (Siciliano et al., 2000); h)

DNA based techniques (Bottero et al., 2002).



39

PART II: PERSONAL RESEARCH

CHAPTER V

THE RESEARCH AIM AND OBJECTIVES

The study of major milk protein polymorphisms in local species / breeds had as a

goal the evaluation of the possibility of using this information in several directions as:

- improving milk quality (especially of casein content), its manufacturing properties and

cheese making efficiency;

- obtaining of a hypoallergenic milk by selection of individuals with no αS1-CN in milk,

which is the main milk allergen;

- obtaining of a healthier milk which is containing β-CN genetic variants which don’t

have a negative effect on human health;

- authenticity / origin identification of milk and dairy products.

The using of information provided by these genetic markers cannot be done without

the knowledge of genetic polymorphisms occurring in the six loci in cattle, buffalo, sheep

and goat local breeds. This characterization can provide extremely valuable information

about the allele frequencies in the four casein loci and the two whey protein loci in local

breeds.

In the context of actual research knowledge in this research field, the proposed

project has as major objectives research directions with importance on international level,

but little or not known at the national level:

- Setting up of a FISH protocol (fluorescence in situ hybridisation) using BAC probes

(bacterial artificial chromosome), in order to map on metaphase chromosomes and

interphase nuclei the genes coding for major milk proteins;

- The characterization of genetic polymorphisms in the 6 loci coding for the 6 major milk

proteins in some cattle breeds: Romanian Simmental, Romanian Black and White,

Brown, Red Holstein, Transylvanian Pinzagau, Romanian Grey Steppe cattle;



40


proteins in Romanian Buffalo;


proteins in Carpathian goat;

- The characterization of genetic polymorphisms in the 6 loci coding for the 6 major

milk proteins in some local ovine breeds: Turcana, Carabasa, Tigaie, Rusty Tigaie, Cluj

Merinos and Botosani Karakul;

- The molecular characterization of new discovered allele (renamed S1-casein ISM) in

Romanian Grey Steppe Cattle, Moldavian variety, in order to study the possibility of

using it as biodiversity genetic marker;

- The molecular characterization of new discovered alleles in Romanian Buffalo breed

renamed S1-casein BBT and β-casein CBT;

- The study of the possibility to use milk proteins polymorphisms from native farm

species/ breeds milk, to identify authenticity and origin of milk, cheeses and other dairy

products, considering also the 2 new casein allele identified in Romanian Buffalo.

CHAPTER VI

CHROMOSOME MAPPING OF THE GENES CODING FOR MAJOR

MILK PROTEINS BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDISATION

(FISH)

In these experiments I used two detection systems of the hybridised probe: a

system with a single antibody labelled with a red fluorophore (TRITC), antibody

recognising specifically the digoxigenin, which was used to label one of the BAC probes

(the probe containing WAP gene), and a double system, in which a primary antibody is

specifically recognising the biotine (used to label the second probe containing the casein

cluster), which is further recognised by a secondary antibody labelled with a green

fluorophore (FITC).



41

The hybridising with mentioned probes was done on metaphase chromosomes,

obtained from rabbit fibroblasts cell cultures and mouse mammary tumour cells HC11.

The hybridisation was also done on bi-dimensional and three-dimensional interphase

nuclei with a preserved structure, prepared from HC11 cells. In all cases were obtained

specific hybridisation signals, which allowed a correct mapping on the chromosomes and

specific chromosomes territories of studied genes.

CHAPTER VII

THE STUDY BY PCR-RFLP OF THE TWO GENES POLYMORHISM

CODING FOR K-CASEIN AND β-LACTOGLOBULIN IN CATTLE

BELONGING TO ROMANIAN SIMMENTAL BREED

The study of K-CN şi β-LG genes polymorphism had a goal testing some PCR-

RFLP protocols, which two allow the identification of the two common A and B allele

from these loci. In the case of K-CN a 350 bp fragment was amplified and digested with

Hinf I, three restriction profiles being observed corresponding to AA, AB and BB, from

this locus. In the case of β-LG, a 262bp fragment was amplified and digested with Hae

III, three restriction profiles being observed corresponding to AA, AB and BB, from this

locus. The calculation of genotypes frequencies in K-CN locus, revealed a higher

frequency of AB genotype, in comparison with the other two. The calculation of genes

frequencies this locus revealed a higher frequency of A allele, in comparison with B

allele. The calculation of genotypes frequencies in β-LG locus revealed a higher

frequency of AB genotype, in comparison with the other two. The calculation of genes

frequencies this locus revealed a higher frequency of B allele, in comparison with A

allele.

The obtained results are indicating that the two DNA tests can be used in

identification of the common A and B allele from the two loci, allowing a precocious

genotyping of cattle for the two genetic markers.



42

CHAPTER VIII

COMPARATIVE STUDY BY IEF AND PCR-RFLP OF MAJOR MILK

PROTEINS GENETIC POLYMORPHISMS IN CATTLE BELONGING TO

ROMANIAN SIMMENTAL BREED

The study was done on 14 individuals belonging to Romanian Simmental breed,

which were comparatively genotyped in K-CN and β-LG loci by PCR-RFLP and IEF.

This experiment had as a goal the evaluation of genotyping efficiency at the DNA level

(by PCR-RFLP) and at the expression level directly from milk (by IEF), in the loci

coding form major milk proteins.

Following the comparative analysis were identified in K-CN and β-LG loci the

same genotypes by PCR-RFLP and IEF. Moreover by IEF were identified in the same gel

the genotypes in the other 4 loci coding for αS1-CN, αS2-CN, β-CN and α-LA, allowing

a correct identification of all allele, even of those which are very rare.

The obtained results are evidencing the fact that IEF technique allows to establish

more precisely the genotypes in the 6 loci, even of the rare allele, difficult and costly

identifiable by PCR.

CHAPTER IX

THE CHARACTERIZATION OF MAJOR MILK PROTEINS

POLYMORPHISMS IN SOME ROMANIAN CATTLE, BUFFALO, SHEEP

AND GOAT BREEDS BY IEF TECHNIQUE

În cattle were genotyped by IEF in the 6 loci coding for major milk proteins a

number of 693 individuals belonging to 7 breeds, as follows: Romanian Simmental (236

individuals), Romanian Black and White (230 individuals), Red Holstein (13

individuals), Brown (134 individuals), Transylvanian Pinzgau, black variety (26



43

individuals) and red variety (30 individuals) and Romanian Grey Steppe cattle,

Moldavian variety (24 individuals).

In αS1-CN locus two common genetic variants were identified, namely B and C.

The frequency of B allele was 0,9 in improved breeds in direction of higher milk

production, the highest frequency being observed in Red Holstein breed. The lowest

frequency was observed in Black Pintzgau. The frequency of C variant, associated in

many cattle breeds with a higher milk processing quality, was the biggest in Black

Pintzgau (0,308), this allele being absent in Red Holstein breed. In αS1-CN casein locus

a new allele, renamed ISM, was identified in Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian

variety, with an isoelectric point between those of B and C genetic variants. The

frequency of this new allele, identified by IEF, was 0,041 in analysed populations.

In β-CN locus five genetic variants were identified: A1, A2, A3, B, C. The

frequency of ancestral allele A2 was the highest in almost all breeds (over 0,5) in

comparison with the others allele. The exception was observed in Red Pintzgau, in which

the frequency of A1 variant was higher (0,483), in comparison with the other alleles. The

A3 variant was detected only in one individual belonging to Romanian Simmental breed.

The B variant, associated in many cattle breeds with a higher milk processing quality, has

an extremely reduced frequency in all breeds (between 0,039-0,117). The C variant was

detected with a very low frequency in Romanian Simmental, Brown and Pinzgau, black

variety, breeds. In Grey Cattle the presence of C variant was detected only in individuals

from Tazlau şi Tupilati, this being a proof of infusion with Brown breeds. It was not

detected in individuals, considered pure breed, from SCDCB Dancu.

In αS2-CN locus only one genetic variant was identified, namely A variant, with

the frequency 1.

In K-CN locus three genetic variants, named A, B and C, were identified. The

highest frequency of A variant was observed in Black and White breed (0,835) and of B

variant was observed in Brown (0,619). In Romanian Simmental breed the frequency of

A allele is very high (0,679). The C variant was detected with a low frequency in

Romanian Simmental and Brown breeds.



44

In α-LA locus only one genetic variant was identified, namely B, with the

frequency 1.

In β-LG locus three genetic variants were identified: A, B and C. The frequency of

A variant was the highest in Romanian Simmental and Grey Steppe cattle (over 0,5). The

frequency of B allele is high in all breeds, in Red Holstein breed being 0,769.

In buffalo were genotyped by IEF in the 6 loci coding for major milk proteins a

number of 139 individuals belonging to Romanian Buffalo. In αS1-CN and β-CN loci

were identified with a 0,86 frequency two common allele: A in αS1-CN and B in β-CN

locus. Two new genetic variants, named αS1-CN BSM and β-CN CSM, were identified

with a frequency of 0,14. They were observed in linkage on chromosome 6. In the other

four loci just one allele was identified with the frequency 1.

In sheep were genotyped by IEF in the 6 loci coding for major milk proteins a

number of 282 individuals belonging to six breeds, as follows: Turcana (44 individuals),

Carabasa (40 individuals), Tigaie (45 individuals), Rusty Tigaie (28 individuals), Cluj

Merinos (35 individuals), Botosani Karakul, black variety (15 individuals), dark grey

variety (15 individuals), brown variety (15 individuals), light grey variety (15

individuals), pink variety (15 individuals), white variety (15 individuals).

In all six ovine breeds genotyped, the milk proteins polymorphisms was very

reduced, the only polymorphic locus being β-LG, in which two genetic variants were

identified A and B. The A variant had the highest frequency (over 0,5) in Turcana,

Carabasa, Cluj Merinos, and Karakul respectively, having the highest frequency in

Karakul, white variety. The B allele had a higher frequency in comparison with A allele

in Tigaie and Rusty Tigaie breeds.

In αS1-CN, β-CN, αS2-CN, K-CN and α-LA just one allele was identified in each

locus with the frequency 1. The presence of C allele in αS1-CN locus has a positive

meaning, because this allele was associated in many studies with higher milk processing

parameters and higher cheese yield.

In goat were genotyped by IEF in the 6 loci coding for major milk proteins a

number of 283 individuals belonging to Carpathian goat.



45

In αS1-CN four allele categories, associated with four expression levels were

identified. The results indicate a 0,569 frequency of high expression allele in αS1-CN (A,

B, C) and a frequency of 0,431 in the case of medium, low expression and null alleles. If

we consider that in Romania there are 700.000 goats and the calculated frequency of E, F

and 0 allele is 43,1%, we can deduce that a number of 301.700 of Carpathian goat are

producing a milk with a low protein content, which are significantly affecting milk

quality and cheese making efficiency. These results can explain the heterogeneity of

Carpathian goat concerning some milk quality parameters. In αS1-CN locus, two new

possible alleles were identified, named αS1-CN 0 and αS1-CN X. The first was identified

with a 0,021 frequency and is characterised by the absence of αS1-CN in milk. It was

observed always in linkage with an unknown profile in β-CN locus, proving the linkage

of the two alleles on the same chromosome. The second genetic variant, αS1-CN X, was

observed just in one individual in a heterozygous condition with B allele. Based on the

electrophoresis profile, it seems to present in the sequence a major restructuration,

probably caused by an exon skipping phenomenon as that found in F allele. Based on the

electrophoresis bands colour intensity, was concluded that this variant belongs to high

expression alleles category.

In β-CN locus three genetic variants were identified. The common A and C

variants were identified with a 0,979 frequency. They were not differentiated by IEF due

to the same isoelectric point. In some individuals was identified, with a frequency of

0,021, an unknown genetic variant named β-CN X, always in linkage with αS1-CN 0.

In αS2-CN locus three genetic variants were identified. The variant C of αS2-CN

had the highest frequency (0,553), in comparison A variant (0,431), the E allele having a

low frequency (0,016).

In K-CN locus two genetic variants were identified. The A variant was

predominant (0,912), the B variant having a low frequency (0,088). The presence of B

variant in Carpathian goat has a positive significance, as long as this allele was associated

in different studies with a high milk processing quality.

In β-LG şi α-LA, just one allele was identified in each locus with the frequency 1.



46

CHAPTER X

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF THE NEW ALLELES

IDENTIFIED IN αS1-CASEIN AND β-CASEIN LOCI IN ROMANIAN

GREY STEPPE CATTLE, MODAVIAN VARIETY AND ROMANIAN

BUFFALO

In Romanian Grey Steppe cattle

A new genetic variant in cattle αS1-CN locus, renamed ISM, was identified in

Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian variety, being complete characterized using a

combined methodology of protein, cADN and DNA sequencing.

By Maldi Tof-MS analysis, a substitution in the position 192 of mature protein

was identified. In this region ISM variant is containing Gly as C variant and not glutamic

acid, present in B variant. The other substitutions which are making the difference

between ISM variant and B or C were not clearly identified by Maldi Tof-MS analysis.

Comparative analysis of chromatograms obtained following sequencing (with the

forward and reverse primer, respectively) of the 2 samples carriers of αS1-CN ISM (BISM,

CISM) and 2 reference samples (BB, CC), revealed the mutations characterizing this new

genetic variant: substitution of an adenine from C and B allele (exon 11, nucleotide 297,

codon 99 gaA coding for Glu) with a thymine in the ISM allele (gaT coding for Asp);

substitution of an adenine from the B allele (exon 17, nucleotide 620, codon 207 gAa

coding for Glu) with guanine in C and ISM alleles (gGa coding for Gly). This last

substitution was confirmed at the protein level by Maldi Tof-MS analysis.

There are 2 additional substitutions observed in the B, C and ISM alleles (sequenced

from Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian variety), that differ from some sequences

published in GenBank, with no effect on aminoacid sequence of protein.

Based of the substitution of an adenine from position 21 of exon 11 from C allele

(adenine found in B allele too), with a timine in ISM allele, a PCR-RFLP test was

developed based on the amplification and restriction with BseGI enzyme of a 422 base



47

pairs (bp) fragment from αS1-CN gene, including entire exon 11. Because the presence

of this new αS1-CN allele was noticed only in pure breed individuals, its origin in this

breed is unquestionable. This theory is also sustained by the high frequency of this allele

in the genotyped Grey Steppe cattle population: 0,128, frequency relatively high for a

new genetic variant. This suggests that ISM variant had an even higher frequency at the

time when this breed and its progenitors were the only ones existing in Romania.

Based on similarities and differences observed at the molecular level, between αS1-

CN B, C and ISM allele, was concluded that this new allele was issued directly from the

ancestral C allele, bringing the first molecular clue about phylogenetic relationships

among the Romanian Grey Steppe cattle and Bos genus representative breeds from Africa

and Asia.

In Romanian Buffalo

The cADN sequencing of αS1-CN A (common allele) and BSM alleles from

Romanian Buffalo, revealed two point mutations characterizing BSM allele, different from

the other known allele in Mediterranean and Indian Buffalo. The deletion of entire exon 6

is a very interesting type of restructuration, shortening the sequence of mature protein

with 8 aminoacids, in comparison with the normal protein which has 199 aminoacids.

Three further mutations were identified, which are similar or different from those found

in common allele.

The cADN sequencing of β-CN B (common allele) and CBT alleles, leaded to

identification of four further mutations differentiating the two variants and affecting the

predictable protein sequence. Furthermore two additional silent substitutions were

identified with no effect on protein sequence, as long the resulting codons are coding for

the same aminoacids.

As long as these new identified allele are specific to Romanian Buffalo they could

be easily used as genetic markers for Romanian Buffalo cheeses authenticity/origin

identification.



48

CHAPTER XI

IDENTIFICATION OF DECLARED AUTHENTICITY/ORIGIN OF MILK

AND DAIRY PRODUCTS USING THE MAJOR MILK PROTEINS

POLYMORPHISMS AS GENETIC MARKERS

If in other EU countries, products adulteration cases are quite rare, in Romania

undeclared cow milk (produced at a lower price and in higher quantities), is often added

into buffalo, goat or ewe milk, normally fated to produce ,,authentic’’ dairy products,

especially in the case of industrial processed milk.

The official European methodology for cheeses authenticity identification is based

on the IEF analysis of gamma casein fractions, resulting from the hydrolysis of β-CN by

plasmin, having the disadvantage that it cannot be differentiated goat and sheep milk.

Up-to-date in Romania there is no identification methodology of undeclared inter-

specific milk addition in dairy products.

The researches described in this Chapter had as a main goal the study of

possibility to use milk proteins polymorphisms, found in whole six loci from native farm

species studied, as genetic markers to identify authenticity and origin of dairy products.

Also, the study of possibility of using the two alleles identified in Romanian Buffalo -

CN CSM and S1-CN BSM, as genetic markers for origin/authenticity identification of

Romanian Buffalo cheeses, was another goal of this research.

The authenticity analysis concerning the possible identification of undeclared

inter-specific milk mixtures was done on 12 cheese types form Romanian market, as

follows: 2 types of cattle cheeses, 3 types of buffalo cheeses, 3 types of sheep cheeses

and 4 types of goat cheeses.

In the case of cattle cheeses it was found that these were produced only form cattle

milk. This is not surprising because the using of other milk types in cattle cheese

production in less probable. In the case of buffalo cheeses, it was observed that the

majority of them were produced exclusively from cattle milk. In the case of sheep



49

cheeses it was observed that two of them were produced exclusively from sheep milk,

and one had a 50% cattle milk. In the case of goat cheeses it was observed that three of

them were exclusively produced from goat milk, the forth one being falsified 100% with

cow milk.

The comparison between two buffalo cheeses types, a Mozzarella type produced

form Italian buffalo milk from Campania region, Italy and a salty cheese produced from

Romanian Buffalo from Transylvania, clearly revealed that they can be differentiated by

the presence in salty cheese of the αS1-CN BSM and β-CN CSM genetic variants, which are

absent in Italian Buffalo. Therefore the possibility of using these genetic variants (which

were not observed so far in other European or Asian buffalo breeds), as genetic markers

for authenticity origin and traceability identification of Romanian buffalo cheeses is

possible immediately.

CHAPTER XII

GENERAL CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS

1. The cytogenetic experiments allowed a correct mapping on metaphase chromosomes

and specific chromosome territories of the four caseins and WAP gene. As a consequence

I recommend these protocols for mapping of genes on specific chromosomes territories,

the study of linkage, crossing over and of the karyotype, in order to identify deletions,

duplications, inversions, translocations, which are not visible by classical cytogenetic

methods.

2. Following the comparative analysis were identified in K-CN and β-LG loci the same

genotypes by PCR-RFLP and IEF. Moreover by IEF were identified in the same gel the

genotypes in other 4 loci coding for αS1-CN, αS2-CN, β-CN and α-LA, allowing a

correct identification of all alleles, even of those which are very rare.

3. Were genotyped by IEF in the 6 loci coding for major milk proteins a number of 693

individuals belonging to 7 cattle breeds, 139 individuals belonging to a local buffalo

breed, 282 individuals belonging to six local sheep breeds and 283 individuals belonging



50

to a local goat breed. Following genotyping alleles and genotypes frequencies, in the 6

loci coding for major milk proteins, were calculated.

4. As a consequence I recommend the PCR-RFLP technique for precocious genotyping

of cattle for the two markers and the IEF technique for genotyping in the 6 milk protein

loci, to a more precisely genotyping and for the evaluation of alleles expression levels.

5. There were identified and molecular characterized 3 new genetic variants, one in

Romanian Grey Steppe cattle in αS1-CN locus and two in αS1-CN and β-CN loci in

Romanian Buffalo. In Carpathian goat breed were identified 3 new possible genetic

variants, two in αS1-CN locus and one in β-CN, which are in progress of

characterization.

6. Using a combined analysis for detection of casein fraction and whey proteins

polymorphisms found in Romanian farm species, were rapidly identified the species in

the bulk milk samples and analysed cheeses. It can be concluded that the genetic variants

of major milk proteins found in Romanian farm species (the majority of them being

found in all world breeds), can be successfully used as genetic markers in identification

of authenticity/ origin dairy products.

SELECTIVE BIBLIOGRAPHY

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia

A., Bocca A., 1990. Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine

milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of 2 γ-caseins.

Milchwissenschaft, 45:708–711;

2. Aschaffenburg R., Drewry J., 1955. Occurrence of different beta-lactoglobulins in

cow's milk. Nature, 176:218-219;

3. Bâlteanu V.A., Pop F.D., Vlaic A., Carsai T.C., Creangă Şt., Rusu A.R., 2010a.

Characterization of the αS1-casein IRV allele provides evidence for phylogeny of the

ancient Romanian Grey Steppe cattle, Moldavian strain. Lucrări Ştiinţifice Seria

Zootehnie Iaşi, 53: 315-320;



51

4. Bâlteanu V.A., Vlaic A., Pop F.D., Carşai T.C., Pascal C., Creangă Şt., Zaharia N.,

Pădeanu I., Voia O.S., Sauer M., Sauer I.W., 2010b. The study of αS1 casein genetic

marker polymorphism in Carpathian goat breed: synthesis of 2009 research (Project PN II

52104/2008). Lucrări Ştiinţifice Seria Zootehnie Iaşi, 53: 321-325;

5. Bâlteanu V.A., Pop F.D., Vlaic A., Rusu A.R., Creangă S., 2008b. Molecular

characterization of αS1-CN IRV allele discovered in Romanian Grey Steppe cattle and it's

frequency in this breed. Bulletin of USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 2008b , 65:

477;

6. Bâlteanu V.A., Pop F.D, Vlaic A.Rusu A.R. , 2008c. Multiple mutations events are

characterizing alpha s1 casein BRV and beta casein CRV alleles discovered in Romanian

Buffalo breed. Bulletin of USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 65: 477;

7. Bâlteanu V.A., Vlaic A., Pop F.D., Rusu A. R., Odagiu A., Cighi V., Creanga S.,

2007d. αS1-casein alleles frequency in Carpathian goat. Bulletin of USAMV-CN, Anim.

Sci. and Biotech., 63-64/2007: 527;

8. Chianese L., Garro G., Mauriello R., Laezza P., Ferranti P., Addeo F., 1996.

Occurrence of five αs1 casein variants in ovine milk. J. Dairy Res., 63: 49-59;

9. Farrell H. M., Jimenez-Flores R., Bleck G. T, Brown. E. M.,. Butler J. E, Creamer L.

K., Hicks C. L., Hollar C. M., Ng-Kwai-Hang K. F., Swaisgood H. E., 2004.

Nomenclature of the Proteins of Cows’ Milk-Sixth Revision. J. Dairy Sci., 87:1641–1674;

10. Giaccone P., Di Stasio L., Macciotta N.P.P., Portolano B., Todaro M., Cappio-

Borlino A., 2000. Effect of betalactoglobulin polymorphism on related traits of dairy

ewes’ milk analysed by repeated measures design. J. Dairy Res., 67: 443-448;

11. Heck J. M. L, Schennink A., Valenberg H. J. F., Bovenhuis H., Visker M. H.,

Arendonk J. A. M, Hooijdonk A. C. M, 2009. Effects of milk protein variants on the

protein composition of bovine milk, J. Dairy Sci., 92:1192-1202;

12. Mahé M.F., Miranda G., Queval R., Bado A., Zafindrajaona P.S., Grosclaude F.,

1999. Genetic polymorphism of milk proteins in African Bos taurus and Bos indicus

populations. Characterization of variants αs1-Cn H and k-Cn J. Genet. Sel. Evol., 31:

239-253;



52

13. Ng-Kwai-Hang, K. F., 2006. Genetic variants of milk proteins and their effects on the

yield 484 and quality of cheese. Nutrition and Natural Resources, 56: 1-11;

14. Siciliano R.A., Rega B., Amoresano A., Pucci P., 2000. Modern mass spectrometric

methodologies in monitoring milk quality. Analytical Chemistry, 72: 408-415;

15. Threadgill D.W., Womack J.E., 1990. Genomic analysis of the major bovine milk

protein genes. Nucleic Acids Research, 18: 6935-6942;

16. Veloso A.C.A., Teixeira N., Ferreira I.M., 2002. Separation and quantification of the

major casein fractions by reverse-phase high-performance liquid chromatography and

urea-polyacrylamide gel electrophoresis. Detection of milk adulterations. Journal of

Chromatography, 967: 209-218;

17. Vlaic A., Bâlteanu V.A., F.D. Pop, 2008. Molecular methods used in detection of

cattle milk in buffalo, ewe and goat in dairy products. Lucrări Ştiinţifice Seria Zootehnie,

Iasi, 51: 1016-1021;

18. Vlaic, A., D.C. Pamfil, Ioana Gaboreanu, B. Vlaic, R. Renaville, 2003. Increasing

milk production in cattle using DNA marker assisted selection (Pit-1). Bulletin of

USAMV-CN, Anim. Sci. and Biotech., 59:188-191;

19. Vlaic A., Ciobanu D.C., Oroian T., Handoca E., 2002.Variantele genetice ale k-

cazeinei determinate prin tehnica PCR – RFLP şi asocierea acestora cu însuşirile

producţiei de lapte la rasa Brună. „Cercetări de genetică vegetală şi animală”, ASAS

Bucureşti şi ICCPT Fundulea, vol. VII;

20. Wedholm A., Larsen L B., Lindmark-Månsson H., Karlsson A. H., Andrén A.,

2006. Effect of Protein Composition on the Cheese-Making Properties of Milk from

Individual Dairy Cows. J. Dairy Sci., 89: 3296-3305.

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT · Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte...

Documents

Transcript of REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT · Studiul polimorfismelor genetice ale proteinelor majore din lapte...