Referat master parazitologie

download Referat master parazitologie

of 28

  • date post

    27-Jun-2015
  • Category

    Documents

  • view

    1.092
  • download

    3

Embed Size (px)

Transcript of Referat master parazitologie

Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar Cluj-Napoca Facultatea de Medicin Veterinar Disciplina: Zoonoze transmise prin alimente de origine animal

Metode biotehnologice de diagnostic al protozoarelor parazitare

Masterand: Ficu Ioana Maria An I: Controlul i Expertiza Produselor de Origine Animal

Cuprins:

1. 2. 3. 4.

Rolul biologiei moleculare n parazitologia veterinar.......................... Toxoplasmoza ............................................................................................ Giardioza .......................................................

3 8 15

Criptosporidioza......................................................... 21 27

Bibliografie........................................................................................................................

2

1. Rolul biologiei moleculare n parazitologia veterinar Biologia molecular const n manipularea ADN i ARN n laborator i opereaz prin mijloace specifice ca: enzime de restricie, recombinarea i clonarea ADN, ADN complementar, secvenierea ADN, reacia n lan a polimerazei (PCR) etc. PCR este implicat n: a) depistarea, identificarea, compararea speciilor, suselor, varietilor, hibrizilor de parazii; b) studiul ciclului vital; c) epidemiologia parazitozelor; d) imunitatea antiparazitar; e) studiul rezistenei gazdei i paraziilor, f) precizarea diagnosticului; g) controlul parazitozelor, etc. n a doua jumtate a secolului trecut oamenii de stiin au recunoscut paraziii ca excelente sisteme model pentru descoperirea principiilor de baz a biologiei eukariotelor. Un numr de descoperiri au stimulat intens cercetri similare ale altor sisteme, cum ar fi biochimia, biologia molecular, imunologia parazitar. O semnificativ schimbare n parazitologie a marcat-o introducerea tehnologiilor moderne din biologia molecular. Biologia molecular este un termen general, ce se refer la manipularea ADN i ARN n laborator. Aceast manipulare este deja aplicat n producia de vaccinuri, n diagnostic, n detectarea purttorilor de gene duntoare i n terapia genetic. n viitor va fi foarte dificil de a gsi domenii n medicina veterinar i n producia animalelor care s nu fie substanial beneficiare ale acestei tehnologii. Biologia molecular opereaz cu cteva mijloace specifice ca: enzime de restricie, recombinarea i clonarea ADN, ADN complementar, secvenierea ADN, reacia n lan a polimerazei (PCR) etc. 3

n 1970 s-a descoperit c bacteriile produc enzime capabile de a degrada ADN strin ajuns intrabacterian. Activarea acestor enzime joac un rol cheie n fenomenul cunoscut ca ,,restricia gazdei (ce const n autoprotecia bacteriilor fa de virusuri, prin fragmentarea ADN-ului viral), ele sunt denumite enzime de restricie sau enzime restrictive. Azi sunt cunoscute sute de asemenea enzime. Aceste enzime se fixeaz pe secvenele specifice ale ADN, fenomen denumit ,,recunoaterea secvenelor i fiecare enzim scindeaz ADN ntr-un loc specific de clivaj, localizat de obicei n secvena recunoscut. Cnd o enzim de restricie este fixat pe ADN, acesta este clivat n mai multe locuri i astfel ADN este fragmentat. Dac locurile de clivaj nu sunt poziionate la intervale regulate, de-a lungul moleculei de ADN, fragmentele rezultate au lungimi i greuti diferite. Electroforeza pe gel a acestor fragmente evideniaz migrarea fragmentelor cu o rat invers proporional cu logaritmul greutii lor. Astfel de enzime bacteriene obinute n laborator sunt, de exemplu: enzima BamHI, din Bacillus amyloliquefaciens, susa H i I (prima enzim obinut), EcoRI din Escherichia coli, Hind III din Haemophilus influenzae, etc. Un alt mijloc prin care opereaz biologia molecular este producia unui numr nelimitat de copii ale unui anumit segment de ADN. Aceast producie de mas, a unui segment de ADN este o condiie necesar pentru determinarea secvenei de baz a segmentelor i pentru multe alte tehnici moleculare. Obinerea copiilor se poate realiza pe dou ci: a) clonarea genelor sau clonarea ADN; b) reacia n lan a polimerazei (PCR). Clonarea ADN se realizeaz prin sudarea ADNului ce urmeaz a fi clonat (numit ADN strin, sau ADN inserat) cu un vector capabil de replicare ntr-o gazd. Cerina iniial pentru acest proces este ca ADN inserat i ADN vector s aib capete compatibile (obinute cu ajutorul unei enzime restrictive adecvat). Cnd ADN inserat i ADN vector sunt puse n contact direct cu o enzim, ADN-ligaza, capetele celor dou tipuri de ADN se unesc printr-un proces de legare sau mbinare (ligation sau splicing). Molecula ADN rezultat este un exemplu de ADN recombinat (termenul se aplic legrii a dou segmente de ADN din diferite surse). Exist o clas de virusuri a cror 4

ntreg genom este format numai din ARN. Deoarece ARN nu este capabil de replicare, singura cale posibil de replicare a acestor virusuri este ca ele s-i propage propriul ARN, prin reconversia lui n ADN, motiv pentru care se numesc ,,retrovirusuri. ADN-ul se replic i acioneaz ca un ablon pentru sinteza unei cantiti mai mari de ARN. Enzimele care catalizeaz transcripia invers a ARN n ADN sunt numite ,,revers transcriptaze. Aceste enzime sunt extrem de importante n biologia molecular pentru c permit izolarea rapid a regiunilor codificate ale genelor. Un esut care produce polipeptide conine relativ o mare concentraie de ARN mesager (mARN) pentru aceste polipeptide. Dac mARN este extras din acel esut i sunt adiionate (adugate) nucleotidele i enzima revers transcriptaza, poate fi sintetizat un lan complementar de ADN (ADN complementar, sau copie ADN, cADN). Ulterior, prin adugarea mai multor nucleotide i enzime ADN-polimeraze, un singur cADN poate fi replicat ntr-un dublu cADN. Acesta corespunde genelor care au fost active n esut n momentul cnd mARN a fost extras. Fragmentele de ADN pot fi clonate la rndul lor crendu-se o adevrat bibliotec cADN. Una din cele mai importante realizri ale biologiei moleculare a fost dezvoltarea metodelor pentru o rapid secveniere a fragmentelor de ADN. Aceast separare a fost folosit n scop diagnostic i s-a realizat prin dou metode: a) metoda Sanger, sau dideoxy (chain-terminating) i b) metoda Maxam-Gilbert, sau metoda chimic. Prima este folosit mai des n practic. Pe aceast cale se alctuieste genomul unei specii. Astfel se ajunge la stabilirea genomului paraziilor si al altor ageni patogeni. Genomul poate fi un nou potenial mijloc de control al acestor organisme. Reacia n lan a polimerazei (Polymerase chain reaction - PCR) Unul din cele mai importante instrumente de lucru n biologia molecular este PCR, folosit larg n prezent pentru cercetare i diagnostic n detectarea genelor particulare (att benefice ct i duntoare) la animalele domestice. n viitor se va extinde folosirea acestei metode n multe domenii ale practicii veterinare. ADN-ul pe care se execut PCR (numit ADN ablon, model) poate fi ADN genomic (extras din celulele albe sangvine, sau din splin,

5

ori alte esuturi), sau un fragment de ADN din orice alt surs. Prin PCR s-au creat aproximativ un milion de copii ale unor segmente mici de ADN ablon, suficient pentru a permite ca segmentul s fie clonat sau analizat. Cerina de baz este cunoaterea secvenei fragmentului sau ordinea la fiecare capt al segmentului pe care dorim s-l amplificm. Folosind aceast informaie sunt sintetizate dou lanuri de nucleotide (numite oligonucleotide sau oligo, prescurtat), fiecare cu o lungime de 20 de baze, unul este complementar captului al treilea al segmentului ce trebuie amplificat, iar altul este complementar unui alt capt trei al altui segment. Deoarece rolul acestor oligonucleotide este de a amorsa sinteza de noi lanuri (strands) de ADN, ele sunt numite ,,primeri. ADN ablon este plasat ntr-un tub mpreun cu primerii, cu o cantitate de deoxinucleotide i cu ADN-polimeraz. Amestecul este nclzit pn la 95C pentru a separa (denatura) cele dou lanuri de ADN ablon (ADN polimeraza este stabil termic, aa c ea rezist la temperaturi mari din faza de denaturare). O form obinuit folosit este Taqpolimeraza, numit aa pentru c provine din bacteria termofil Thermus aquaticus. Temperatura este apoi sczut la 50-60C pentru a permite primerilor s se lege la secvenele lor complementare din ADN ablon (de exemplu la captul segmentului care dorim s l amplificm). Odat ce primerii s-au legat, temperatura este crescut la 70C, aceasta find optim pentru ADN-polimeraz, care adun nucleotidele specifice la captul 3 al fiecrui primer, extinznd, astfel, lanurile de ADN. Dup ce a trecut suficient timp pentru ca noile lanuri s fie sintetizate, temperatura va crete din nou la 95C, ncepnd astfel un nou ciclu de denaturare, legare i extensie. Lungimea unui ciclu (numit ciclu de amplificare) este de 5 minute: 15 secunde pentru denaturare, 30 secunde pentru sudare, 90 secunde pentru extensie, plus timpul minim necesar schimbrii temperaturii ntre faze (30-60 secunde pentru fiecare schimbare). Ciclul se poate repeta de 30-35 ori ntr-un automat (thermal cyclers) care poate fi programat exact pentru fiecare faz. Teoretic se pot realiza 230-235 copii identice (numit PCR product) ale segmentului. n practic amplificarea exponenial nu este perfect. Este posibil s se repete de 1x106 cicluri si s se obin 1 g de PCR product. Limita i puterea PCR sunt remarcabile. De exemplu, produii PCR pot fi obinui din ADNul microorganismelor vii,

6

din produsele animale (carne, ou), sau din specimenele din muzee sau arheologice. Probele pot fi la fel de mici ca un spermatozoid, sau un folicul pilos. Produii PCR pot fi obinui chiar din lapte, deoarece laptele conine celule somatice. Exist mai multe variaii ale PCR de baz. De exemplu, cteva perechi de primeri pot fi inclui ntr-o reacie PCR multiplex. O alt variant este cea care d natere la ADN polimorfic amplificat la ntmplare (RAPD) (polimorfic se refer la existena a mai mult dect un tip de form). La cteva specii RAPD sunt o surs util de markeri ADN pentru hrile genetice sau (n cazul paraziilor) pentru identificarea spe