RAPORTARE ȘTIINȚIFICĂ FINALAmedinsys.com/TUMORSENSE - RAPORT Tehnico-Stiintific FINAL.pdf ·...

46
SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE) Contract Nr: 12/2014 1 RAPORTARE ȘTIINȚIFICĂ FINALA SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE) Contract Nr: 12/2014

Transcript of RAPORTARE ȘTIINȚIFICĂ FINALAmedinsys.com/TUMORSENSE - RAPORT Tehnico-Stiintific FINAL.pdf ·...

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

1

RAPORTARE ȘTIINȚIFICĂ FINALA

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII

TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE) Contract Nr: 12/2014

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

2

Activitatea 1.1. Definirea specificatiilor tehnice ale sistemului TUMORSENSE Perioada 1 iulie. 2014 – 31 dec. 2014 În cadrul acestei etape s-a realizat un studiu al literaturii cu privire la subiectul tensiunilor tumorale, a stress-ului solid la nivel tisular și a mijloacelor de evaluare cantitativă și calitativa a acestuia. In continuare este prezentat sumar studiul de fezabilitate.

Presiunile din fluidul interstitial (IFP – isotropic stress) exercitate de către fluid, cu actiune uniformă in toate directiile si tensiunile mecanice interne (TMI) denumite solid-stress, exercitate de către componentele solide sunt jaloane ale micro-mediului mecanic al tumorilor solide (Jain, 05). În contrast cu valorile ridicate ale IFP, se cunoaște relativ puțin despre cauzele tensiunilor componentelor tumorale solide, consecințele valorilor ridicate sau a înlăturării acestora.

Se presune ca TMI se acumulează în tumori din cauză că celulele tumorale care proliferează într-un ritm crescut comparativ cu celulele normale provoaca o tensiune asupra elementelor structurale ale tumorii si a tesutului normal inconjurător. Unele TMI din tumoră se anuleaza reciproc prin fortele tesutului normal inconjurator; restul este înmagazinat la nivel celular și al componentelor matriceale ale tumorii, și astfel persistă și când tumora este extrasă și solicitările externe sunt îndepărtate. TMI sunt identificate ca și tensiuni solide reziduale ca urmare a creșterii celulare (Skalak, 96).

În 2009, o măsurare precisă a TMI a fost realizată: 28 mmHg (3.7 kPa) (Cheng, 09). Prin comprimarea vaselor sanguine și limfatice se crează hipoxia si hipertensiunea interstitială, in concluzie tensiunile interne contribuie la dezvoltarea tumorii si rezistenta acesteia la chimioterapie (Jain, 05).

Alte cercetari recente au confirmat ca TMI pot conduce la cresterea invaziei de celule canceroase, contribuind la progresia tumorii (Tse, 12). In urma studiilor in-vivo s-a confirmat că celulele canceroase pot comprima si colapsa propriile vase sanguine si limfatice, iar o distrugere a celulelor canceroase din jurul acestora poate conduce la deschiderea acestor vase.

Figura 1. Deschiderea tumorii ca urmare a TMI pentru diverse tipuri de tumori uman. Reprodus după

(Stylianopoulos, 12).

Pana la studiile recente efectuate de colaboratorul nostru, Laboratorul de Biologia Tumorilor Edwin L. Steele din cadrul Massachusetts General Hospital in Boston, USA, nu a existat nici o metoda de măsurare a TMI (solid-stress) in tumorile excizate. Acestia au dezvoltat o tehnica inteligentă de măsurare a TMI (introduse de cresterea celulara canceroasă haotică) in tesut uman proaspat excizat si tumori animale, si au investigat efectele pe care aceste tensiuni le au asupra vaselor limfatice si sanguine (Stylianopoulos, 12). Tehnica presupune masurarea relaxării dimensionale a tesutului dupa extragerea din corp (deci indepărtarea tensiunilor externe din zona

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

3

adiacenta) si sectionarea mediană, urmata de introducerea datelor intr-un model matematic pentru calculul TMI. Aceasta tehnica simplă a dovedit ca TMI din tesutul solid sunt mai mari pentru mai multe tipuri de tumori atat la murine cat si la oameni (Fig 1).

Aceasi tehnică se utilizează in present pentru identificarea componentelor cheie ale tumorii - cellule canceroase, celule stromale, colagen, hialuron - care contribuie la generarea si acumularea TMI in tumori si a unor terapii noi in oncologie.

Figura 2. Efectele tratamentului oncologic asupra deschiderii tumorii cauzata de TMI, avand ca

rezultat cresterea gradului de perfuzabilitate. Reprodus după (Stylianopoulos, 12).

Totodată, acelasi grup de cercetare a descoperit ca eliminarea terapeutică a fibroblastelor in carcinoma cu un inhibitor al caii hedgehog conduce la reducerea TMI, decompresia vaselor si cresterea perfuziei in tesutul tumoral (Fig. 2). Multe alte terapii oncologice vor rezulta din manipularea fiecăruia dintre acesti factori care contribuie la cresterea TMI in tesutul tumoral.

În concluzie, deși tensiunile interne (TMI) s-au dovedit a fi un biomarker important, un indicator al progresiei tumorii, singura metodă prin care pot fi evaluate este extragerea chirurgicală a tumorii si tăierea acesteia cu un bisturiu pentru a se măsura expandarea (Stylianopoulos, 12).

O astfel de abordare nu este posibilă in practica clinică; de aceea noi consideram absolut necesar dezvoltarea unei metode inovative de măsurare a valorilor TMI in diverse puncte in tumoră, minim-invaziv, prin intermediul unui cateter cu ac de biopsie, metoda care să poate fi aplicată in procedura standard de biopsie, obtinută endoscopic sau transcutanat.

Instrumentele anterioare, dezvoltate in Steele Lab (Jain, 07) precum si alte laboratoare (Tse, 12) masoară presiunea fluidului interstitial in tumori si in tesuturi moi (Stylianopoulos, 12). Instrumentul propus in acest proiect va complete gama, prin masurarea fortelor transmise de elementele structural solide ale tesutului in loc de presiunile fluidului. Astfel, caracterul inovativ al instrumentului propus constă in utilizarea unui micro-senzor piezorezistiv care să măsoare TMI din tesut separat de presiunea hidrostatică a fluidului. Tehnologia cu cateter va permite medicilor sa folosească acest dispozitiv impreună cu instrumentele curente de endoscopie, in timpul procedurilor clasice de biopsie pentru variate tipuri de cancer, precum cel de pancreas, stomac, ficat, etc. Pentru moment, după cunostiintele noastre, nimeni nu a mai dezvoltat un sensor de TMI tisulare, si in particular un sistem de tip cateter pentru măsurarea acestora in-vivo in timpul biopsiei tumorilor sau altor tesuturi moi.

Pentru ca sistemul propus incorporeaza o tehnologie specifica cateterelor care permite utilizarea in timpul procedurilor clasice de biopsie, nu este necesara modificarea protocoalelor clinice existente de diagnostic si tratament. Monitorizarea TMI tumorale va imbunatati semnificativ eficienta tratamentului oncologic prin reducerea curelor de citostatice care nu au efect major si prin optimizarea schemelor de tratament.

In cadrul acestei etape, activitatea de cercetare a grupului de cercetare din INFLPR Magurele (Partener I in cadrul acestui proiect) a fost legata de evaluarea diverselor posibilitati de a realiza obiectivele propuse in proiect si anume obtinerea unui material nanostructurat sub forma de strat subtire, activ din punct de vedere piezoelectric si integrarea sa intr-un senzor de deformare. In acest

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

4

scop, au fost realizate activitati specifice cum ar fi: pregatirea tintelor si suportilor necesari experimentelor ulterioare, adaptarea sistemelor experimentale de depunere de fime subtiri piezoelectrice. Au fost realizate primele experimente de depunere de straturi subtiri folosind tehnica de depunere laser pulsata pe suporti de siliciu metalizat. Deasemenea au fost intreprinse actiuni de documentare privind ultimele noutati publicate in literatura in ceea ce priveste proprietatile filmelor subtiri de ZnO si NBT-BT si a dispozitivelor de test pe baza de NBT-BT obtinute prin depunere laser pulsata.

Obtinerea de straturi subtiri de ZnO si NBT-BT (– (1-x)-Na0.5Bi0.5TiO3-xBaTiO3) cu proprietati piezoelectrice pentru integrare intr-un micro-senzor de deformare se va efectua cu ajutorul tehnicii de depunere laser pulsata- PLD. Scopul principal este de a obtine straturi subtiri cu dimensiuni sub-micronice care sa prezinte un raspuns piezoelectric cat mai mare. Tinand cont de acest lucru dar si de stoichiometria complicata a materialele alese pentru acest proiect in special in cazul NBT-BT, alegerea tehnicii de obtinere a straturilor subtiri este critica. Folosind avantajele native ale metodei PLD cum ar fi posibilitatea de a obtine structuri multistrat (heterostructuri) in cadrul unui singur experiment utilizand ablatia alternativa a mai multor tinte, se pot obtine filme subtiri cu proprietati (structurale, morfologice sau chimice) cerute de aplicatii ulterioare chiar la temperaturi de crestere relativ scazute comparativ cu alte tehnici de depunere de filme subtiri cum ar fi: HT-CVD (depunere chimica la temperatura inalta din faza de vapori), CVD (depunere chimica din faza de vapori), PECVD (depunere chimica din faza de vapori asistata de plasma), sol-gel etc.

Dezavantajele majore ale acestor tehnici sunt fie temperaturile mari de lucru, fie utilizarea de precursori scumpi si foarte corozivi (deci dificil de manevrat), fie tratamentele ulterioare termice si electrice de cristalizare si polarizare.

In continuare sunt prezentate caracteristicile pe care viitorul sistem Tumorsense le va include: Instrumentul pentru TMI tesut tumoral va contine senzor piezoelectric, care va fi creat prin

depunerea de straturi subtiri piezoelectrice pe placutele flexibile de nitinol si va utiliza unul dintre cele doua materiale biocompatibile:

1. oxidul de zinc, va fi utilizat ca si material de baza piezoelectric pentru senzorul TMI in ciuda coeficientului piezoelectric de valori relativ scazute (d33 = 12 pC/N) datorita proprietatilor excelente de biocompatibilitate. ZnO poate deveni un material standard pentru senzorii de tumori, si va fi depus prin tehnologii RF-PLD (radiofrequency beam assisted pulsed laser deposition).

2. al doilea tip de materiale ce urmeaza a fi studiate pentru constructia zonelor de achizitie a senzorilor vor fi barium titanate doped sodium si bismuth titanate (NBT-BT) – (1-x)-Na0.5Bi0.5TiO3-xBaTiO3 – ontinute prin procesare laser a unor tinte volumice (1-x)Na0.5Bi0.5TiO3-xBaTiO3. Filmele nanostructurate vor fi depuse cu un coeficient de dopaj intre 0.6 si 0.8.

O acoperire biocompatibila va fi aplicata folosind polyethylene glycol (PEG) cu rolul de a proteja zonele active piezoelectrice in timpul utilizarii sistemului. Uniformitatea si grosimea stratului de PEG de pe suprafata senzorilor precum si stabilitatea acestuia in mediul umed sunt factori importanti care pot influenta raspunsul senzorilor. Pentru a evita delaminarea si a avea o suprafata uniforma, in cadrul proiectului, pentru acoperirea senzorilor de TMI tisulare se va utiliza o tehnica de depune pe baza de laser denumita Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation. Pentru construirea electrozilor, pe suprafata stratului piezoelectric se va depune un strat de aur care va fi procesat 3D pentru obtinerea configuratiei dorite cu ajutorul unui sistem laser recent instalat in facilitatea CETAL.

Conectare si control cuprinde un data-loggerul realizat in cadrul proiectului. Cateterul cu senzori va trece prin canalul de lucru al acului de biopsie; odata introdus impreuna cu acul de biopsie in tumora, cateterul va veni in contact direct cu tesutul tumoral in urma retragerii acului, si va masura cu ajutorul senzorilor din material piezorezistiv, presiunea exercitata de tesut asupra lor, in timp de presiunea hidrostatica a fluidului care se formeaza inevitabil in timpul perforarii tesutului va fi egalizata in jurul senzorilor de fantele practicate pe lateralele lor. Deformatiile mecanice introduse de tesutul

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

5

care comprima elementele elastice vor fi convertite in semnal electric de catre stratul piezoelectric si va fi inregistrat, conditionat si analizat prin intermediul unui sistem de achizitie si analiza original (data-logger) special realizat in acest proiect.

In final, scopul studiilor de evaluare ale sistemului este acela de a demonstra fezabilitatea acestuia in utilizarea pentru determinarea tensiunilor interne. Diverse scenarii de testare vor fi reailzate pentru teste realizate impreuna cu personal medical specializat care este parte a acestui proiect. Bibliografie: [Cheng, 09] Cheng G, Tse J, Jain RK, Munn LL (2009) Micro-environmental mechanical stress controls tumor spheroid size and morphology by suppressing proliferation and inducing apoptosis in cancer cells. PLoS One 4:e4632. [Jain, 05] Jain RK (2005), “Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy”, Science 307:58–62. [Jain, 07] Jain RK, Tong RT, Munn LL (2007) Effect of vascular normalization by antiangiogenic therapy on interstitial hypertension, peritumor edema, and lymphatic metastasis: Insights from a mathematical model. Cancer Res 67:2729–2735. [Skalak, 96] Skalak R, Zargaryan S, Jain RK, Netti PA, Hoger A (1996) Compatibility and the genesis of residual stress by volumetric growth. J Math Biol 34:889–914. [Stylianopoulos, 12] Stylianopoulos T, Martin JD, Chauhan VP, Jain SR, Diop-Frimpong B, Bardeesy N, Smith BL, Ferrone CR, Hornicek FJ, Boucher Y, Munn LL, Jain RK. Causes, consequences, and remedies for growth-induced solid stress in murine and human tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Sep 18; 109 (38):15101-8. [Tse, 11] Tse JM, et al. (2011) Mechanical compression drives cancer cells toward invasive phenotype. Proc Natl Acad Sci USA 109:911–916. Activitatea 2.1. Cercetari asupra tehnologiilor inovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral (I) Perioada 1 ian. 2015 – 31 dec. 2015 În această etapă s-au realizat primele variante de design și primele operații tehnice de realizare practică a viitorului senzor de stress tumoral. S-au abordat astfel două variante constructive, una în curs de realizare în cadrul Medinsys SRL care este coordonatorul acestui proiect și o a doua în cadrul Institutului Național de Fizica Laserilor, Plasmei și Radiației, INFLPR, Măgurele.

1. Varianta constructivă I conține un ax de 0.8 mm diam cu două placuțe flexibile, pe care s-au montat două timbre tensometrice HBM LY11-0.3/120 de lațime 0.8 mm. Valorile acestor timbre se vor citi cu un sistem de achiziție de date HBM QuantumX840.

Designul axului cu placuțe flexibile s-a făcut în două variante (fig. 3). În ambele axul de nitinol sau

otel aliat s-a frezat pe o distanță de 8 mm, pe două fețe opuse și s-au sudat în zona frezată de diametru mai mic, două placuțe flexibile de nitinol, de lungime 8 mm, lațime 0.8 mm și grosime 0.2 mm într-o variantă și două placuțe de oțel aliat inoxidabil de grosime 0.1 mm în alt caz. S-au realizat două

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

6

versiuni, una cu placuțele sudate numai la un capat (figura 8, a) și alta cu placuțele sudate la ambele capete (figura 3, b). Sudarea s-a realizat pe un sistem Nd:YAG LASAG KLS 246.

a b Figura 3. Design ax cu placuțe flexbile pentru montaj timbre tensometrice HBM LY11-0.3/120.

a

b

c

Figura 4. Construcția acului cu timbre tensometrice în varianta de oțel (a) și nitinol (b) și montajul timbrelor tensometrice.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

7

2. Varianta constructivă II – senzori obtinuti prin depuneri de filme subtiri piezo-electrice

In cadrul laboratorului partenerului 2 (INFLPR) sunt disponibile trei sisteme complete de depunere laser pulsata, iar cel mai nou dintre acestea este dedicat obtinerii filmelor subtiri necesare realizarii acestui proiect. Sistemul de PLD este deasemnea prevazut cu o sursa de plasma in radiofrecventa, existand astfel posibilitatea de efectua experimente de ablatie asistate de o plasma rf. Sistemul de ablatie contine un laser pulsat cu Nd-YAG (CONTINUUM, SURELITE II-10) si unul cu excimeri COMPexPro 205(ArF) care emite la 193 nm, precum si un sistem de vid. Pentru laserul cu Nd-YAG, lungimea temporala a pulsului laser este de 5 nanosecunde, iar distributia de intensitate este gaussiana, cu o energie pe puls de 650 mJ (la 1064 nm), 300 mJ (la 532 nm), 155 mJ (la 355 nm) si 90 mJ (la 265 nm). Posibilitatea de a genera radiatie cu patru lungimi de unda distincte (din IR apropiat pana in UV) permite efectuarea de studii parametrice in raport cu lungimea de unda a radiatiei utilizate. S-a urmarit ca radiatia laser sa fie focalizata pe tinta montata in interiorul camerei de reactie, sub un unghi de incidenta de 45o.

S-au instalat doi suporti in interiorul camerei de iradiere, pentru tinta si substrat. Suportul de tinta este unul complex, multi-tinta, care permite folosirea mai multor tinte (maxim 4 tinte) in timpul depunerii si care s-a montat pe axul unui motor. In felul acesta tintele pot fi rotite si translatate in timpul procesului de iradiere, pentru a se evita formarea craterelor. Viteza de rotatie se poate varia din exterior, prin modificarea tensiunii aplicate pe motor. Suportul substratului este montat intr-un plan paralel cu cel al suprafetei tintei, intr-un sistem care permite varierea distantei tinta – substrat. El poate fi incalzit electric pana la temperaturi de 750-8000 Celsius. Pentru ambii suporti controlul exterior s-a realizat prin intermediul unor cabluri electrice conectate cu interiorul prin treceri speciale adaptate lucrului la presiuni joase. In figura 5 este redat schematic dispozitivul experimental realizat in scopul fabricarii de filme subtiri prin metoda de depunere cu laser pulsat Nd-YAG. Camera de iradiere astfel realizata si echipata a fost testata in vederea stabilirii conditiilor experimentale necesare realizarii unor presiuni initiale joase, inferioare valorii de 10–6 mbar.

In scopul cresterii reactivitatii speciilor care promoveaza depunerea filmelor subtiri a fost realizat si montat pe sistemul clasic de PLD un subansamblu de generare de specii active ale oxigenului. Subansamblul consta dintr-o descarcare de radiofrecventa generata la presiuni de ordinul 10-1–10 mbar sustinuta intre doi electrozi plan-paraleli situati intr-o incinta separata de incinta de depunere printr-o duza de ejectie. Plasma generata in oxigen expandeaza in incinta de depunere, speciile generate putand fi orientate catre substrat sau tinta supusa ablatiei laser.

Fig. 5. Sistem de depunere de filme subtiri prin metoda ablatiei laser asistata de descarcare de radiofrecventa.

In aceasta activitate au fost efectuate in avans primele experimente de depuneri de filme subtiri de ZnO prin depunere laser pulsata (PLD), folosind-se o tinta ceramica comerciala. S-au efectuat mai multe seturi de experimente folosind laserul cu Nd-YAG la a treia (355nm) si a patra

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

8

armonica (266nm). Prin acest studiu parametric s-a urmarit in primul rand stabilirea influentei presiunii partiale de oxigen, a fluentei laser si a temperaturii de depunere dar si a modului de incalzire/racire asupra proprietatilor morfologice si structurale ale filmelor de ZnO. S-au utilizat doua tipuri de substrate: siliciu acoperit cu platina Pt/ Si(100) si MgO (100) pentru a putea caracteriza atat din punct de vedere structural cat si morfologic straturile subtiri de ZnO astfel obtinute.

Pentru fiecare strat subtire de ZnO obtinut in conditii diverse (fluenta laser, temperatura substrat, etc) s-au efectuat deja masuratori preliminare de microscopie de forta atomica- AFM, devansand calendarul activitatilor din proiect. Imaginile de AFM pe filmele de MgO si Pt/Si sunt prezentate in figura 6.

a) b)

Figura 6. Imagini AFM obtinute pe filmele de ZnO : a) ZnO/MgO, b) ZnO/MgO

In concluzie, se poate afirma ca obiectivele primei etape au fost atinse avand in vedere

rezultatele prezentate in raport. De asemenea, se afla deja in desfasurare activitati aferente etapei din anul 2015, respectiv obtinerea de straturi subtiri de NBT-BT cu properietati piezoelectrice inalte.

In acesta activitate, proiectarea, tehnologia si materialele pentru dezvoltarea senzorilor au fost intocmite pe baza a numeroase studii de cercetare.

Avand ca scop obtinerea de straturi subtiri nanometrice cu un raspuns piezoelectric cat mai mare si integrarea lor in heterostructuri de test, in cadrul acestei activitati s-a utilizat un sistem PLD prevazut cu o sursa de plasma in radiofrecventa, existand astfel posibilitatea de efectua experimente de ablatie asistate de o plasma rf. Sistemul de ablatie contine un laser pulsat cu Nd-YAG (CONTINUUM, SURELITE II-10) si un sistem de vid, dupa cum am mentionat in etapa precedenta. Materialul piezoelectric ales a fost o solutie solida de BaTiO3 cu NaBiTiO3 (BT-NBT) S-au efectuat mai multe seturi de experimente de depunere de straturi subtiri de BT-NBT (– (1-x)-Na0.5Bi0.5TiO3-xBaTiO3) folosind laserul cu Nd-YAG la a treia (355nm) si a patra armonica (266nm). Prin acest studiu parametric s-a urmarit in primul rand stabilirea influentei presiunii partiale de oxigen, a fluentei laser si a temperaturii de depunere dar si a modului de incalzire/racire asupra proprietatilor morfologice si structurale ale filmelor de BT-NBT. S-au utilizat trei tipuri de substrate: siliciu acoperit cu platina Pt/ Si(100), Nb :STO (100) –STON si Pt/Kapton. Toate tipurile de substrate folosite sunt conductoare electric pentru a putea evalua proprietatile dielectrice si piezoelectrice. Suportul de Pt/Kapton este un suport flexibil care prezinta avantajul de putea fi integrat usor intr-un dispozitiv tip senzor de deformare. Dezavantajul acestui tip de substrat este acela ca nu rezista la temperaturi de depunere mai mari de 2000C, ceea ce limiteaza tipul de material piezoelectric care poate fi depus sub forma de film subtire cristalin pe acest tip de suport. Din acest motiv, straturile subtiri piezoelectrice de BT-NBT au fost depuse pe Pt/Kapton folosind tehnica MAPLE, dupa cum va fi detaliat mai jos.

In tabelul I sunt prezentate conditiile experimentale folosite pentru obtinerea straturilor subtiri piezoelectrice prin tehncia PLD. Analizele morfologice efectuate cu ajutorul microscopiei de forta

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

9

atomica (AFM- PARK XE-100), nu au aratat diferente notabile in valorile rugozitatii suprafetei in cazul probelor de BT-NBT/Pt/Si si cele de BT-NBT/STON.

Nr. crt

Tinta Suport Poxigen(mbar)

Uflash (kv)

νlaser

(Hz) Arie

Spot (mm2) Temperatura substr.

λ (nm)

1 BT-NBT 6

PtSi, STON

0.6 1.45 10 1 650 265

2 BT-NBT 6

PtSi, STON

0.6 1.46 10 1 650 265

3 BT-NBT 8

PtSi, STON

0.6 1.46 10 1 650 265

4 BT-NBT 6

PtSi, STON

0.6 1.46 10 1 700 265

5 BT-NBT 8

PtSi, STON

0.6 1.46 10 1 700 265

Tabel 1. Conditiile experimentale optimizate pentru straturile subtiri de BT-NBT depuse prin PLD

Figura 7. Straturi subtiri de BT-NBT/ STON (stanga, RMS= 21.2 nm) si BT-NBT/Pt/Si (dreapta,

RMS=20.1 nm)

Din analizele structurale efectuate folosind difractia de raze X (XRD- Panalytical X’PERT MRD), probele de BT-NBT/Pt/Si au aratat un caracter policristalin cu o usoara texturare pe directia cristalografica (110) - Figura 7. In functie de presiunea de oxigen utilizata in timpul depunerii se constata aparitia unei faze parazite piroclor la presiuni joasa. Probele de BT-NBT/STON sunt epitaxiale avand o simetrie tetragonala evidentiata de despicarea picurilor (001)/(100) si (002)/(200)- Figura 8,9. Nu se constata prezenta nici unei faze parazite, chiar si la valori ale temperaturii de depunere mai mici.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

10

Figura 8. Difractograma de raze x pentru o proba de BT-NBT/Pt/Si

Figura 9. Difractograma de raze x pentru o proba de BT-NBT/STON Evaluarea proprietatilor feroelectrice a fost efectuata folosind un analizor TF 2000 de la firma

AICXA, comportamentul feroelectric fiind descris de curba de histeresis, adica polarizare dielectrica (P) in functie de campul electric (E) aplicat. Comportamentul feroelectric se poate observa din forma curbei de histeresis, cu valori mai mici decat in forma bulk pentru polarizarea remanenta (10 µC/cm2) si a campul coerciv (3,74 kV/cm) - Figura 10.

Figura 10. Curba de histeresis P(E) pentru filmele de BT-NBT/PtSi

Pe baza rezultatelor obtinute in cadrul acestei activitati au fost determinate conditiile

experimentale optime de producere a straturilor subtiri de BT-NBT atat in forma policristalina cat si epitaxiala. Pentru dezvoltarea unui dispozitiv de test, am efectuat si depuneri de strat subtire de BT-NBT pe suport flexibil de Pt/Kapton prin tehnica MAPLE. Evaporarea Laser Pulsat Asistata de o Matrice (MAPLE) - Figura 11, oferă avantajul de a obtine o acoperire uniforma, control in grosime și aderenta la substrat. Principalul avantaj pentru procesul MAPLE este că interacțiunea cu laser se produce în principal cu moleculele de solvent, materialul de interes a fi transferat pe substrat ramanand nealterat de fasciculul laser. In aceasta etapa a fost utilizata o tinta formata din nanoparticule de BT-NBT intr-o matrice de alcool metilic.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

11

Figura 11. Schema experimentala a sistemului MAPLE Seria de probe de BT-NBT/Pt/Kapton a fost investigata morfologic si compozitional prin

microscopie electronica de baleiaj asistata de difractie de electroni (SEM-EDAX). Aceste analize au fost efectuate de catre conducatorul de proiect (CO) - Figura 12 .

Figura 12. Imagini SEM ale stratului subtire de BT-NBT depus prin MAPLE.

Activităţile cu caracter medical/clinic din cadrul prezentei etape au inceput cu realizarea unui studiu documentar aprofundat cu upgradarea ultimelor informaţii privind tehnologiile innovative pentru masurarea tensiunilor din tesutul tumoral. Rezultatele medicale obţinute a fost diseminate prin publicare (2 articole) şi comunicare (3 manifestari ştiinţifice internaţionale).

In studiul detaliat, sunt prezentate premisele studierii mecanicii intratumorale, factorii care influenţează rigiditatea tumorală cu detalieri asupra celulelor tumorale, matricei extracelulară si presiunii fluidului interstiţial. S-a prezentat modul de reglare moleculară a rigidităţii matricei extracelulare cu accent asupra utilităţii studierii rigidităţii tisulare. S-a prezentat detalat tehnicile aplicate pentru măsurarea rigidităţii celulare (Metoda măsurării indentaţiei celulare folosind microscopia atomică de forţă; Analiza citometrică microfluidică; Micropipetarea celulară automată; Metoda magnetic tweezer system; Tehnica traction force microscopy; Tehnica optical stretching) şi pentru măsurarea viscozităţii si elasticităţii tumorale (elastografia şi metoda acoustic radiation force impulse (ARFI)). A2.2. Dezvoltarea modelului artificial pentru testare (I)

Perioada 1 ian. 2015 – 31 dec. 2015

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

12

Pe baza rezultatelor obtinute in cadrul activitatii precedente au fost determinate conditiile experimentale optime de producere a straturilor subtiri de BT-NBT atat in forma policristalina cat si epitaxiala prin PLD. Deasemenea, am efectuat si depuneri de strat subtire de BT-NBT pe suport flexibil de Pt/Kapton prin tehnica MAPLE. Probele obtinute in conditii optime si caracterizate morfologic, structural si electric au fost selectionate si investigate din punct de vedere piezoelectric. Cu ajutorul unui sistem de microscopie de raspuns piezoelectric bazat pe un AFM PARK XE-100 au fost testate cu succes proprietatile piezoelectrice ale filmelor obtinute. Astfel, utilizand cantilevere de Pt a fost aplicat un camp dc pe proba, iar un semnalul de test ac a fost generat de un amplificator lock-in. Valorile coeficientului piezoelectric efectiv obtinute in functie de camplu dc aplicat sunt prezentate in figura 13. Probele de BT-NBT prezinta un raspuns piezoelectric mare, d33

efectiv= 80 pm/V, mult superioare chiar decat celor aratate de materiale pe baza de plumb - PbZrTiO3 sau PbTiO3.

Figura 13. Dependenta valorilor coeficientului piezoelectric efectiv de campul aplicat pentru straturile subtiri de BT-NBT

Fiind indeplinita cu succes aceasta importanta functionalitate a straturilor subtiri de BT-NBT,

urmatoarea activitate intreprinsa a fost de testa raspunsul biocompatibil al acestor straturi. Acest lucru este foarte important datorită tehnicii de aplicare invazive de monitorizare a micro-senzorului solid-stres. Au fost efectuate teste de proliferare de celule pe straturile subtiri obtinute. Celulele HEK 293 embrionare epiteliale umane din rinichi si celulele de melanomn malign uman A 375 au fost puse pe biomaterialul BT-NBT, pe lamele de sticla si direct pe 48 de Godeuri (Costar cu capac si fundul plat, sterile ), la o densitate initiala de 4×104 celule pe suport si respective 2×104 celule pe suport in 300 µl de DMEM suplimentat cu GlutaMax. Dupa 48 de ore in atmosfera umidificata cu 5% CO2 la 37°C, materialele au fost clatite de trei ori cu PBS pentru a se inlatura toate celeulele non-aderente si transferate in godeuri noi. In fiecare godeu a fost adaugat 200 µl de DMEM suplimentat cu GlutaMax (Gibco), urmat de 40 µl methyl tetrazole sulfate (MTS) (CellTiter 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, USA). Dupa 20 de minute de incubare, 100 µl din solutia de cultura a fost transferata in 96 de godeuri tranparente (Nunc, Thermo Scientific) si a fost masurata densitatea optica cu ajutorul unui cititor de placi (Mithras LB 940 DLReady) la 450 nm.

Desi celulele de melanomn malign uman A 375 au fost puse cu o densitate mai mica ( < 50%) de cat celulele HEK 293 embrionare epiteliale umane din rinichi, proliferarea celulelor maligne dupa 48 de ore de la depunere a fost cu 25% mai mare , comparativ cu celulele umane nomale depuse pe aceeasi suprafata (arie) de material. Rezultatele deasemenea sugereaza ca materialul senzoristic

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

13

BT-NBT a condus la o crestere a nivelului de proliferare comparativ lamelele de sticla borosilicata indiferent de linia celulara testate- Figura 8.

Celulele HEK 293 si celulele A375 puse pe biomaterialul BT-NBT pentru 48 de ore au fost spalate cu PBS si fixate cu 2.5 % in solutie tampon de glutaraldehidă timp de 20 de minute. Dupa aceea esantioanele au fost supuse unei dezhidratari si uscarii graduale in doua etape, a cate 15 minute fiecare, cu solutie de etanol si 50%, 75% hexametildisilazan (HDMS) si dupa in solutie pura de 100% HDMS. Imagistica SEM a fost facuta cu un microscop electronic cu emisie de câmp (Inspect S Electron Scanning Microscope, FEI Company) - Figura 14.

Figura 14. Imagini SEM ale celulelor HEK 293 si A 375, fixate pe senzorul din materialul BT-NBT

si pe suprafata acoperita cu sticla , dupa 48 de ore de la depunere la o marire de 1000x ( cu imagini inserate la 5000x). Scala de marime 50μm.

Imaginile SEM dovedesc (arata) ca materialul BT-NBT este compatibil la adeziunea celulara si mai mult, ca ambele linii celulare prezinta o sporire a proliferarii celulare pe materialul senzorului comparativ cu esantionul de control ( placate de sticla borosilicata). În această etapă s-au realizat si primele variante din versiunea 1 de senzor de stress tumoral, in care s-au utilizat timbre tensometrice din comert. Aceasta este varianta simpla a senzorului, realizata in scopul demonstrarii conceptului si care se va testa pe un model artificial. Aceasta varianta constructiva precum si un sistem original pentru achizitia semnalului de la acesti sensori s-a realizat in cadrul coordonatorului proiectului, Medinsys SRL precum si a partenerului P3 - IPA SA. O serie de studii medicale pentru o testa in urmatoarea etapa acesti senzori, in ambele variante, au fost realizate tot in cadrul acestei activitati, de catre partenerul P1 – Universitatea de Medicina si Farmacie din Cluj.

Varianta constructivă I, realizata in activitatea 1.1. din 2014 conține un ax de 0.8 mm diam cu două placuțe flexibile, pe care s-au montat două timbre tensometrice HBM LY11-0.3/120 de lațime 0.8 mm. Valorile acestor timbre s-au citit cu un sistem de achizitie dezvoltat special in cadrul acestei etape.

Designul axului cu placuțe flexibile s-a făcut în două variante (fig. 15). În ambele axul de nitinol sau otel aliat s-a frezat pe o distanță de 8 mm, pe două fețe opuse și s-au sudat în zona frezată de diametru mai mic, două placuțe flexibile de nitinol, de lungime 8 mm, lațime 0.8 mm și grosime 0.2 mm într-o variantă și două placuțe de oțel aliat inoxidabil de grosime 0.1 mm în alt caz. S-au realizat două versiuni, una cu placuțele sudate numai la un capat (figura 15, a) și alta cu placuțele sudate la ambele capete (figura 15, b). Sudarea s-a realizat pe un sistem Nd:YAG LASAG KLS 246.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

14

a b

c

Figura 15. Construcția acului cu timbre tensometrice în varianta de oțel (a) și nitinol (b) și montajul timbrelor tensometrice.

Sistemul de achizitie (Fig. 16.a) realizat in cadrul acestei etape, este format din 2 tipuri distincte de

echipamente:

- un modul de adaptare a semnalului responsabil de transformarea variatiei timbrului de masura (Fig. 16.b) in semnal unificat 4..20mA, curent ce este parte a unei punti de masura;

- un echipament de achizitie de semnale (curent, semnal unificat, 4..20mA) (Fig. 16.c).

a b

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

15

c Figura 16. Sistemul de achizitie original, realizat in cadrul acestei etape, utilizat impreuna cu prima varianta constructive de senzori. (a) Sistemul cu senzori si softul dezvoltat, care sunt conectate la

un PC pe care ruleaza un software dezvoltat tot in cadrul acestei etape de catre echipa proiectului, (b) module de adaptare, (c) echipament de achizitie

S-a ales aceasta solutie pentru ca este una flexibila si robusta din punct de vedere al perturbatiilor. Modulul de adaptare al semnalului are ca si componenta principala amplificatorul de instrumentatie

AD623, care este cu circuit usor de utilizat, de inalta performanta si care are ca si domenii principale de aplicatie:

- echipamente medicale de joasa putere; - interfete pentru traductoare; - amplificatoare pentru termocuple; - amplificatoare pentru interfete implicate in controlul proceselor; - amplificatoare diferentiale; - sisteme de achizitie de mica putere.

Figura 17. Schema electronica a modulului de adaptare a semnalului.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

16

Acest circuit poate fi alimentat atat unipolar cat si bipolar. O caracteristica importanta a amplificatorului AD623 este aceea ca iesirea sa poate varia pe intregul domeniu de alimentare. Castigul amplificatorului de instrumentatie AD623 poate fi setat, programat prin intermendiul unei singure rezistente, ceea ce constituie, de asemenea, un avantaj deosebit. In situatia in care circuitul nu este prevazut cu un astfel de rezistor, castigul este unitar (GAIN = 1). Cu rezistenta suplimentara, castigul poate fi programat pana la maxim 1000 (GAINMAX = 1000).

Consumul redus al acestui amplificator (1,5mW la 3V) il face ideal pentru aplicatiile ce necesita

alimentarea de la baterii. Puntea de masura este excitata cu ajutorul unei tensiuni de referinta obtinuta de la circuitul

specializat LT1009. In afara amplificatorului de instrumentatie si a referintei de tensiune, modulul este prevazut si cu

un amplificator neinversor de uz general, cu zgomot redus (OP07) care are rolul de a adapta dezechilibrul puntii de masura astfel incat sa poata fi transformat in semnal de curent unificat 4..20 mA. Aceasta conversie se face cu circuitul specializat AD694 care este un convertor tensiune – curent de inalta performanta. Prin conexiunile sale, circuitul este astfel setat incat sa transforme domeniul de tensiune 0..10V in semnal de curent unificat 4..20mA.

Modulul de adaptare a semnalului de la puntea de masura a fost proiectat astfel incat sa fie integrat intr-o carcasa robusta, de aluminiu.

Figura 18. Cablajul imprimat pentru adaptorul de semnal – amplasarea componentelor (scara 1:1)

Figura 19. Cablajul imprimat pentru adaptorul de semnal – fata cu componente (scara 1:1)

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

17

Figura 20. Cablajul imprimat pentru adaptorul de semnal – fata cu lipituri (scara 1:1)

Sistemul de achizitie de date a fost dezvoltat in jurul unui microcontroler RISC (PIC18F8722), un

microcontroler ale carui resurse il recomanda intr-un numar mare de aplicatii. In componenta echipamentului de achizitie, in afara microcontrolerului sunt o serie de componente

ce flexibilizeaza sistemul in ansamblu, el putand fi utilizat si in alte aplicatii. De fapt, aceasta caracteristica a stat la baza conceptiei initiale a echipamentului.

Microcontrolerul are integrat un convertor analog – digital, periferic ce a fost utilizat in aplicatia curenta. Intrarile analogice ale microcontrolerului accepta o variatie de tensiune cuprinsa intre 0 si 5Vcc (VREF), motiv pentru care a fost necesara integrarea in echipament a unui bloc de conversie curent – tensiune responsabil de adaptarea semnalului de curent unificat (4..20mA) in tensiune (0..5Vcc).

Acest modul de conversie curent – tensiune are la baza o rezistenta de masura de 100Ω si doua etaje de amplificare realizate cu un amplificator diferential cu castig 1 dupa care imaginea curentului ce parcurge rezistenta de masura se transforma in tensiune ce variaza in gama 0,4 .. 2V si un amplificator neinversor ce amplifica semnalul de tensiune pana la atingerea limitei superioare de 5Vcc (castigul este de 2,5).

Figura 21. Modul conversie curent (4..20mA) – tensiune (1..5Vcc) – canalul analogic 0.

In afara canalelor de intrare analogica, in etapa de proiectare a echipamentului s-au prevazut

conectori si pe pinii portului de intrare / iesire PORTD, iar pe bitul cel mai putin semnificativ al portului H s-a integrat un tranzistor de comutatie ce poate fi utilizat ca si driver de mica putere.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

18

Figura 22. Microcontrolerul PIC18F8722

Alimentarea componentelor logice si a celor analogice se face prin intermediul unor convertoare

DC/DC ce admit la intrare o tensiune de 18 – 36 Vcc.

Figura 23. Convertoarele DC-DC ale echipamentului de achizitie

Comunicatia dintre echipamentul de achizitie si calculator se face printr-o interfata RS232,

semnalele specifice fiind obtinute cu ajutorul unui driver specializat.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

19

Figura 24. Driver TTL-RS232

Pentru programarea microcontrolerului s-e poate utiliza metoda de programare in sistem (ISP)

utilizand portul special prevazut.

Figura 25. Port programare microcontroler

Pentru a asigura buna functionare a echipamentului acesta a fost prevazut si cu un supraveghetor

al tensiunii de alimentare prin intermediul caruia microcontrolerul este resetat in cazul scaderii tensiunii de alimentare sub un anumit prag.

Figura 26. Circuit RESET si supraveghere alimentare

Cablajul imprimat a fost proiectat in 2 straturi si este special dimensionat pentru a intra intr-o

carcasa de aluminiu.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

20

Programarea microcontrolerului a fost facuta in limbaj de nivel inalt (C).

Figura 27. Cablajul imprimat al echipamentului de achizitie (1:1) – amplasarea componentelor

Figura 28 Cablajul imprimat al echipamentului de achizitie (1:1) – fata cu componente

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

21

Figura 29. Cablajul imprimat al echipamentului de achizitie (1:1) – fata cu lipituri

Codul aplicatiei software dezvoltata de echipa proiectului, care controleaza sistemul de achizitie de

date, si permite prezentarea vizuala si analiza grafica a lor, este prezentat in raportul etapei. Concluzii Mecanica intratumorală este rezultatul rigidităţii modificate la nivel celular şi la nivelul matricei

extracelulare, ceea ce influenţează presiunea interstiţială şi transportul inter- şi intracelular Rigiditatea matricei poate determina comportamentul celular, alterarea căilor de semnalizare

intracelulară, carcinogeneza, progresia tumorală şi răspunsul tumoral la terapie. Celulele tumorale, mai ales metastatice, sunt mai moi decât cele netumorale, cu indentaţia

măsurată prin microscopia de forţă atomică mai redusă şi mai heterogenă decât la celulele benigne.In plus, celulele maligne izolate sunt mai rigide decât acelaşi tip de celule din biopsii, probabil datorită influenţei mediului asupra tensiunii intracelulare.

Rigiditatea mai redusă a celulelor tumorale se datorează modificărilor citoscheletului, in special datorită reducerii cantităţii de actină iar măsurarea ei implică metode foarte sofisticate, inca experimentale

Măsurarea viscoelasticităţii tisulare se bazează pe măsurarea deformării tisulare in timpul examinării cu ultrasunete, dar specificitatea metodei elastografice este moderată, iar tehnica ARFI este inca in curs de evaluare pentru leziunile focale

Noi metode de măsurare a presiunii interstiţiale intratumorală ar putea reprezenta cheia pentru studierea rigidităţii tumorale, cu viză diagnostică a malignităţii şi de suport terapeutic oncologic.

A fost format lotul de pacienţi pentru lotul de studiu, cărora li s.-a solicitat şi obţinut acordul informat pentru includere în studiul TUMORSENSE, în conformitate cu normele UMF Cluj-Napoca

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

22

Activitatea 2.1. Cercetari asupra tehnologiilor inovative pentru masurarea

tensiunilor din tesutul tumoral (II) Perioada 1 ian. 2016 – 31 dec. 2016

Pe baza rezultatelor obtinute in cadrul etapei precedente au fost determinate conditiile

experimentale optime de producere a straturilor subtiri de BT-NBT atat in forma policristalina cat si epitaxiala prin PLD. Deasemenea, au fost efectuate si depuneri de strat subtire de BT-NBT pe suport flexibil de Pt/Kapton prin tehnica MAPLE. Valorile coeficientului piezoelectric efectiv- d33

efectiv, obtinute in functie de campul dc aplicat sunt egale sau superioare chiar decat celor aratate de materiale pe baza de plumb - PbZrTiO3 sau PbTiO3. Utilizarea unui suport flexibil (kapton, Pt/kapton, etc) pentru depunerea de straturi subtiri piezoelectrice reprezinta un avantaj in dezvoltarea si integrarea unui sensor de deformare in aplicatiile biomedicale, acesta fiind motivul pentru care au fost testat proprietatile functionale si pentru Ca, Zr-BaTiO3 care benficieaza de avantajul de a nu contine specii volatile cum ar fi Na si Bi din solutia solida BaTiO3-NaBiTiO3.

S-au efectuat mai multe seturi de experimente de depunere laser pulsata PLD de straturi subtiri de Ca, Zr-BTO (BCZT) folosind laserul cu Nd-YAG la a treia (355nm) si a patra armonica (266nm). S-au utilizat diverse tipuri de suporturi conductoare electric: siliciu acoperit cu platina Pt/ Si(100), Nb :STO (100) –STON si Pt/Kapton. Ca si in etapa precedenta, suportul de Pt/Kapton a fost utilizat pentru ca este un suport flexibil care prezinta avantajul de putea fi integrat usor intr-un dispozitiv tip senzor de deformare. Dezavantajul acestui tip de substrat este acela ca nu rezista la temperaturi de depunere mai mari de 2000C, ceea ce limiteaza tipul de material piezoelectric care poate fi depus sub forma de film subtire cristalin pe acest tip de suport. Din acest motiv , straturile subtiri piezoelectrice de Ca, Zr-BTO au fost depuse pe Pt/Kapton folosind si tehnica MAPLE. Caracterizarea morfologica si structurala a straturilor subtiri de BaTiO3 dopat cu Ca si Zr a fost efectuata comparativ, pentru a sublinia diferentele dintre straturile subtiri obtinute prin PLD (temepratura de depunere mare, 6500C) si MAPLE (temperatura de depunere mica, 200C).

Figura 30. Imagini AFM obtinute pe probele Ca, Zr-BTO obtinute prin PLD (stanga, RMS-1.1 nm)

si MAPLE (dreapta, RMS-41 nm.) Analizele morfologice s-au efectuat pe probele de Ca, Zr-BTO depuse prin PLD si MAPLE

utilizand microscopia de forta atomica si microscopia electronica de baleiaj. Din punct de vedere morfologic s-a constatat o diferenta majora a aspectului suprafetei si a valorii rugozitaii suprafetei intre probele MAPLE si PLD, dupa cum se poate vedea din figura 30 si 31.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

23

Figura 31. Imagini SEM obtinute pe probele Ca, Zr-BTO obtinute prin PLD(stanga) si MAPLE (dreapta.)

Analizele structurale au fost efectuate folosind difractia de raze X (difractometru Panalytical

X’PERT MRD), in geometrie Bragg-Brentano si cu ajutorul unui monocromator hibrid. In figura 3 sunt prezentate difractogramele de raze x ale straturilor subtiri obtinute prin PLD si MAPLE i comparatie cu tinta bulk Ca, Zr-BaTiO3. Difractograma de raze X a materialului bulk Ca, Zr-BaTiO3 indica o structura perovskitica pura, fara faze parazite, avand o simetrie romboedrala R3m., dupa cum era de asteptat pentru acest material - Figura 31. Pentru stratul subtire PLD, se remarca cresterea policristalina, cu o usoara texturare de-a lungul (111)c. Parametrii celulei elementare au fost calculati folosind parametrii structurali ai fazei romboedrale BaTiO3 (JCPDS file 04-007-9924) si sunt prezentati in Tabelul 1. Nu au fost identificate faze parazite in stratul subtire obtinut prin PLD.

Figura 32. Difractogramele de raze X pentru straturile subtiri de Ca, Zr- BaTiO3 obtinute prin PLD

si MAPLE.

Difractogramele straturilor subtiri obtinute prin MAPLE demonstreaza cresterea policristalina similara straturilor obtinute prin PLD si tintei bulk- Figura 32. Acest lucru este confirmat si de parametrii de retea calculati si prezentati in Tabelul 1, prezentand valori similare pentru ambele tipuri de straturi subtiri. In schimb, nu se observa o texturare preferentiala supa o anumita directie cristalografica, cum este cazul pentru PLD, ceea ce indica un mecanism de crestere diferit. De altfel, caracteristicile morfologice ganulare prezente in straturile MAPLE sunt deasemenea diferite de cele observate in cazul Straturilor PLD.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

24

Probe Date structurale Simetrie romboedrala (R3m) Simetrie pseudocubica a(Å) c(Å) ac (Å) D110 (nm)

PLD film 5.685(2) 6.962(2) 4.0198 53 MAPLE film 5.6862(9) 6.9608(8) 4.0201 34 BCZT tinta 5.680(2) 6.959(3) 4.0176 41

Tabelul 2. Parametrii structurali calculati pentru straturile subtiri de Ca, Zr-BaTiO3 obtinute prin PLD si MAPLE comparativ cu tinta volumica.

A3.2. Dezvoltarea modelului artificial pentru testare (II) In cadrul acestei activitati au fost testate proprietatile piezoelectrice functionale ale straturilor

subtiri de titanat de bariu dopat cu calciu si zirconiu, obtinute prin PLD si MAPLE. Deasemenea, au fost dezvoltate mai multe geometrii de heterostructuri pentru integrare in senzorul de deformare piezoelectric. Diverse tipuri de electrozi si configuratii de electrozi depuse pe straturile active piezoelectric au fost obtinute si testate.

Microscopia de raspuns piezoelectric a fost efectuata utilizand un microscop de forta atomica PARK Xe-100 modificat, la fel ca in etapa precedenta. Modul de lucru fost non-contact, iar cantileverele folosite prezinta un varf conductor din Pt sau Pt/Iridiu. Valorile coeficientului piezoelectric efectiv si comportamentul fazei semnalului piezoelectric la o valoare de pana la ± 7 V a campului electric DC aplicat sunt prezentate in figura 4 pentru straturile subtiri de Ca, Zr-BaTiO3 obtinute prin PLD.

Figura 33. Dependenta valorilor coeficientului piezoelectric efectiv de campul aplicat pentru

straturile subtiri de BCZT obtinute prin PLD (a, b). Comportamentul de comutare este evidentiat petru diverse polaritati ale campului dc: c-f).

Se poate observa comportamentul de comutare 0-1800 a polarizarii remanente evaluat la diverse

valori ale campului electric dc aplicat, fara sa apara domenii blocate care sa nu comute pe directia campului electric aplicat. Stratul de Ca, Zr-BaTiO3 obtinut prin PLD este activ din punct de vedere

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

25

pizoelectric la dimensiuni diverse (500 nm- 3 microni) ale ariei excitate de campul dc aplicat. Domeniile piezoelectrice au fost “scrise” de campul dc prin aplicarea acestuia intre electrodul inferior de Pt si varful conductor al catileverului. Cu ajutorului unui camp ac- 3V, 10kHz, au fost extrase raspunsurile piezoelectrice pentru diverse valori dc. Coeficientul piezoeletric efectiv d33 masurat pe aceste probe are o valoare de pana la 63 pm/V, in acord cu valorile raportate in literatura pentru acest tip de material.

Pentru probele obtinute prin MAPLE, se observa un comportament de comutare a polarizarii remanente echivalent cu probele PLD - Figura 34.

Figura 34. Dependenta valorilor coeficientului piezoelectric efectiv de campul aplicat pentru

straturile subtiri de BCZT obtinute prin MAPLE (a, b). Comportamentul de comutare este evidentiat petru diverse polaritati ale campului dc: c, d).

Valorile calculate ale coeficientului piezoelectric efectiv d33≈ 82 pm/V sunt usor mai mari decat in

cazul PLD, dupa cum se poate vedea din figura 5. Raspunsul piezoeletric „out-of-plane” este caracterizat de un contrast puternic- Figura 5 c, d, ceea ce inseamna ca materialul prezinta o orientare preferentiala a vectorului polarizare de-a lungul axei cristalografice c.

Figura 35. Heterostructura de test bazata pe un strat subtire de BCZT depus prin PLD

cu traductori interdigitali IDTpe suprafata. IDT: lungime digit 20μ, distanta interdigit 20μ.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

26

Pe baza acestor straturi active piezoelectric, au fost dezvolatate mai multe geometrii ale dispozitivului de test tip senzor de deformare . In cazul straturilor subtiri obtinutye prin PLD, beneficiind de o rugozitate a suprafetei foarte mica, au fost utilizati electrozi interdigitali depusi pe suprafata filmelor subtiri. S-au obtinut heterostructuri cu dimensiuni de pana la 400 μ2, dupa cum se poate vedea din figura 35.

Heterostructurile de test bazate pe straturi subtiri obtinute prin PLD au fost testate ulterior la diverse valori ale campului electric dc aplicat. La analiza SEM ulterioara s-a constatat ca au aparut zone delaminate ale filmului subtire, probabil din cauza efectelor termice sau a aderentei reduse a electrozilor IDT- Figura 36 stanga.

Figura 36. Imagini SEM ale heterostructurii de test piezoelectrica cu traductori IDT pe suprafata.

In cazul probelor obtinute prin tehnica MAPLE, din cauza valorilor mari ale rugozitatii suprafetei- Figura 35, 36, au fost preferate alte geometrii electrod-strat activ. S-au obtinut doua tipuri de heterostructuri utilizand stratul activ depus prin MAPLE - Figura 37.

Figura 37. Heterostructura de test bazata pe un strat subtire de BCZT depus prin MAPLE cu electrozii depusi anterior pe Kapton (stanga) si siliciu (dreapta).

Aceste heterostructuri de test au fost testate prin aplicarea unui camp dc de pana la 40 V,

nefiind observata nici o problema de delaminare sau crapaturi in film sau electrod.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

27

Pentru testarea biocompatibilitatii senzorilor si a influentei caracteristicii piezo asupra mediului de cultura, este necesara excitarea mecanica a acestora pe un interval de timp relativ mare, si anume minim 30 de zile, intr-un incubator biologic. Pentru aceasta s-a realizat urmatorul montaj automat, actionat de un motor electric. Dispozitivul a fost proiectat in SolidWorks si realizat din material plastic (nylon) prin prototipare pe o imprimanta 3D Stratasys Fortus 450mc.

a b

c d Fig. 38. Dispozitiv pentru deformarea mecanica a senzorului, automatizat, cu frecventa si amplitudine

variabila, in scopul testarii biocompatibilitatii acestuia in mediu de cultura. a) piezele realizate pe o imprimanta 3D, Stratasys Fortus 450, b) sania cu rumenti, c) motorul electric cu mecanism cu cama,

d) dispozitivul asamblat.

In scopul testarii senzorilor pe tumori extrase din pacienti s-au s-au colectat date de la pacienţi diagnosticaţi cu cancer pancreatic în perioada ianuarie 2015 - iunie 2016. Pacienţii au fost înrolaţi de la Institutul Regional de Gastroenterologie si Hepatologie "O. Fodor "din Cluj-Napoca. Diagnosticul pacienţilor cu cancer pancreatic a fost confirmat histopatologic prin eco-endoscopie cu puncţie fin aspirativă sau chirurgical. Toţi subiecţii şi-au dat consimţământul informat înainte de a fi înrolaţi în studiu. Studiul a fost aprobat de comitetul de etică al spitalului. S-au colectat informaţii cu privire la: datele demografice, diagnostic, stadializare, terapie şi supravieţuire. Datele demografice au inclus vârsta şi sexul pacienţilor. Datele referitoare la cancerul pancreatic au inclus: data diagnosticului, extinderea bolii, localizarea tumorii primare, tipul histologic şi nivelul de CA 19-9 la momentul diagnosticului. Diagnosticul şi stadializarea cancerului pancreatic au fost bazate pe teste imagistice, incluzând tomografia computerizată (CT) şi eco-endoscopia (EUS). S-a făcut distincţia între tumora primară rezecabilă, avansată loco-regional şi boala metastatică.

Supravieţuirea a fost definită ca numărul de luni de la data diagnosticului şi data decesului. Data diagnosticului a fost definit ca intervalul de timp de la prima investigaţie imagistică (CT, RMN sau EUS) confirmând diagnosticul de cancer pancreatic. Probele de sânge au fost izolate din sânge

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

28

venos al pacienţilor la momentul diagnosticului, împreună cu consimţământul informat al pacienţilor (lotul de studiu) şi controalele (lotul martor), care au fost prelucrate în termen de 24 ore de la colectare şi depozitate la -80 °C până la utilizare. Pentru determinarea western blot a anticorpilor anti-ezrin au fost folosite probele de plasmă.

Concentraţia proteinei a fost determinată folosind un kit de determinare proteică - Quick StartTM Bradford Protein Assay (Bio Rad Laboratories, Inc.). O cantitate de 60 μg de proteină totală din fiecare probă de plasmă a fost încărcată pe godeu pe un gel de poliacrilamidă 5/12%. Electroforeza a fost realizată la 100 mV şi apoi fracţiunile proteice au fost electrotransferate pe o membrană de nitroceluloză la 100 mV timp de 1 oră. Membranele au fost blocate în decurs de 3 ore, cu 5% lapte praf fără grăsime (Bio Rad Laboratories, Inc.) în soluţie Tris salină conţinând 0,1% Tween 20 (TBS T), şi 1% BSA sub agitare constantă la temperatura camerei. Membranele au fost apoi incubate cu anticorpul primar la diluţie de 1: 250 în TBST peste noapte la 4 °C cu anticorpul policlonal primar ezrin IgG anti-iepure (HPA 021616, Sigma-Aldrich) şi apoi spălate cu tampon TBS-T o dată timp de 15 min şi din nou de două ori timp de 5 minute de fiecare dată.

După spălare cu TBST, membrana a fost incubată cu anticorpul secundar conjugat horseradish peroxidase (HRP) de capră anti-iepure IgG H & L (Abcam) la diluţii de 1: 10000 la 1 h la temperatura camerei şi apoi spălată cu TBS-T o dată timp de 20 minute şi de două ori timp de 5 minute. Pentru controlul de încărcare, s-a folosit anticorpul policlonal GAPDH de iepure (Abcam), într-o concentraţie de 0,8 pg / ml, cu lapte praf degresat în soluţie TBS T. Expresia totală a ezrinului a fost normalizată prin împărţirea unităţilor ezrin la cele GAPDH pentru fiecare bandă.

Proteinele au fost detectate prin sistemul de chemiluminiscenţă (BioRad Laboratories, Inc.). Toate imunobloturilor au fost incubate separat, folosind un kit Clarity Western ECL (BioRad Laboratories, Inc.), membranele au fost expuse la sistemul Chemidoc Imaging (Bio Rad Laboratories, Inc.) şi analizate folosind ImageLab Software versiunea 5.2.1 pentru Windows (Bio Rad Laboratories, Inc.).

Pentru analiza statistica s-au utilizat programele: Microsoft Excel pentru introducerea şi managementul datelor şi SPSS (versiunea 23 SPSS) pentru analiza statistică. Cu ajutorul Testului t şi ANOVA s-au examinat diferenţele în expresie ale diferitelor molecule între pacienţii cu adenocarcinom şi controalele (lotul martor) , şi au fost estimate valorile lui p.

Datele de supravieţuire au fost estimate folosind curba Kaplan-Meier şi testul logrank. Valorile sunt exprimate ca medii ± deviaţia standard (SD). O valoare p <0,05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.

Au existat 45 de pacienţi incluşi în studiu. Vârsta medie a populaţiei a fost de 61 de ani (DS 10,2, interval: 37-87 ani). Au existat mai mulţi bărbaţi decât femei (56% vs. 44%) (tabelul 3). Histologic, 24 de cazuri (53%) au avut adenocarcinom ductal (tabelul 2), în timp ce 4 pacienţi (9%) au avut leziuni premaligne. Au fost 7 cazuri (16%) de pancreatită cronică şi 10 persoane sănătoase (22%).

Tabel 3. Caracteristicile pacienţilor incluşi în studiu Cancer pancreatic Control N N Total 24 21 Vârstă Media 62,3 60,2 DS 10,2 10,3 Interval 37-87 41-77 Sex Femei 10 10 Bărbaţi 14 11

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

29

Tabel 4. Caracteristicile clinice ale pacienţilor cu adenocarcinoma pancreatic Caracteristici N % Sex Bărbaţi 14 58 Femei 10 42 Vârsta Media 62,3 - Interval 37-87 - Stadiu I 0 0 IIA 1 4 IIB 6 26 III 2 9 IV 14 61 Gradul de diferenţiere Nu e raportat 22 92 1 - - 2 1 4 3 1 4 Localizarea primară Cap 12 33 Corp 8 22 Coadă 4 11 Proces uncinat 1 3 Istm 5 14 Localizări multiple 6 17 Rezecţia chirurgicală curativă Da 1 4 Nu 23 96 CA 19-9 Evaluabile 18 Media 2429 - Mediana 400 - Interval 1-29584 -

Pentru a valida prezenţa anticorpului ezrin la pacienţii AP, au fost comparate probele de

plasma de la: 24 de pacienţi cu adenocarcinom pancreatic, 10 subiecţi sănătoşi (SA), 4 pacienti cu leziuni premaligne şi 7 cu pancreatită cronică (CP), folosind analiza Western blot.

Mai mult de jumătate dintre pacienţi au avut expresie Ezrin pe western blot (tabelul 5)

Tabel 5. Frecvenţa expresiei ezrin în grupurile analizate

Adenocarcinom ductal pancreatic n=24 Alte n=22

Ezrin

71% (n=15)

29% (n=6) Leziuni premaligne n=4

Pancreatită cronică n=7

Control n=10

14% (n=3)

5% (n=1)

10%(n=2)

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

30

Supraexpresia proteinei Ezrin a fost semnificativ corelată cu stadiul clinic al adenocarcinomului pancreatic (AP) (p <0,05). Pentru stadiile clinice, rata ezrin pozitivă a fost de numai 20% (3/7) în stadiile I-II din AP, şi a fost semnificativ mai mare în stadiile III-IV (80%, 12/16), diferenţa a fost semnificativă statistic (p = 0,03). Rata ezrin pozitivă a fost mai mare la pacienţii cu mărimea tumorii ≥ 3 cm (80%, 12/17), decât la pacienţii cu o dimensiune a tumorii <3 cm (20%, 3/5). Cu toate acestea, nivelul expresiei proteinei ezrin nu a fost corelată cu vârsta pacienţilor, sexul şi mărimea tumorii (P> 0,05) (tabelul 6).

Table 6. Relaţia între supraexpresia proteinei ezrin si caracteristicile clinicopatologice în

adenocarcinomul pancreatic Caracteristici Număr pacienţi Cazuri pozitive (%) p-value Sex Bărbaţi Femei

14 10

9 (56%) 7 (44%)

0.3

Vârsta (ani) ≤50 >50

3

21

2 (13%)

13 (87%)

0.5

Mărimea tumorii(cm) <3 ≥3 Nu s-a raportat

5

17 2

3 (20%)

12 (80%)

1 0.5

Stadializarea TNM I-II III-IV

7

16

3 (20%)

12 (80%)

0.1 0.03

Pentru a confirma în continuare rolul expresiei ezrin în progresia adenocarcinomului

pancreatic, s-a analizat rata de supravietuire globala la 24 de cazuri cu AP folosind metoda Kaplan-Meier, şi nu s-a determinat nicio diferenţă la pacienţii cu AP cu expresie crescută a ezrinului şi pacienţii cu PDAC cu expresie scăzută a ezrinului (p>0,05) (Fig. 39).

Fig 39. Curba de supravieţuire Kaplan-Meier la 24 de pacienţi cu adenocarcino

pancreatic şi expresia proteinei Ezrin Ezrin este implicat într-o varietate de funcţii celulare, cum ar fi organizarea citoscheletală,

motilitatea celulară şi a morfogenezei celulare. Niveluri ridicate de exprimare a ezrinului în liniile celulare ale cancerului endometrial, colorectal şi ale adenocarcinomului pancreatic cu potenţial

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

31

metastatic ridicat au sugerat faptul că expresia acesteia este asociată cu evenimente care pot promova adeziunea şi migrarea celulară şi pot fi legate de metastazarea tumorală.

Rezultatele obţinute arată că proteina ezrin este mai puternic exprimată la pacienţii cu adenocarcinom ductal pancreatic decât la pacienţii cu pancreatită cronică şi la persoanele sănătoase (figura 39). Pe baza acestei constatări s-a corelat expresia Ezrinului cu statutul clinicopatologic şi prognosticul pacienţilor cu cancer pancreatic.

Pentru a descoperi relaţia dintre expresia ezrin şi parametrii clinicopatologici, în prezenta etapă s-a efectuat analiza Western blot a ezrinului în 24 de cazuri de adenocarcinom pancreatic şi 22 de controale (7 cazuri de pancreatită cronică, 4 cazuri de leziuni premaligne şi 10 cazuri de voluntari sănătoşi). Studiul nostru a constatat ca proteina ezrin a arătat expresie mai mare in adenocarcinom pancreatic (71%, 15/24) (P = 0,009), comparativ cu lotul martor (29%, 6/22).

Fig. 40. Imunohistochimia proteinei ezrin în leziunile pancreatice. (A) Ezrin este negativă în

ţesuturile pancreatice normale. (B & C) Ezrin este puternic pozitivă în citoplasma celulelor canceroase cu metastaze limfatice. (D) Celulele canceroase au aratat imunoreactivitate mai intensă în membrana celulelor canceroase. (E & F) Ezrin este slab pozitiv în citoplasma celulelor canceroase fără metastaze limfatic.

În studiul nostru, am arătat că expresia proteinei ezrin a fost strâns legată de stadiul clinic, dar

nu a fost legată de vârstă, sex, mărimea tumorii. Rezultatele prezentului studiu indică faptul că ezrin pare să aibă un rol important în invazia şi metastazarea AP. Am investigat în continuare relaţia dintre expresia proteinei ezrin şi prognosticul la pacienţii cu PDAC. Rezultatele noastre au arătat că pacienţii cu AP cu expresie crescută a ezrinului au avut aceeaşi supravietuire ca şi pacienţii cu expresie scăzută a ezrinului. Acest lucru poate constitui o limitare a studiului nostru, datorat numărului mic de pacienţi incluşi în studiu. Expresia crescută a ezrinului în ţesutul tumoral a fost un factor independent de prognostic negativ în PDAC cu un HR ajustat de 2,16 (95% CI 1.38-3.39).

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

32

A3.3. Cercetari asupra unei metode inovative de creare a hartii tensiunilor in tesutul tumoral (I)

Pe baza heterostructurilor obtinute in activitatea precedenta au fost realizate teste de determinare

a conversiei incarcarii mecanice in semnal electric, pentru implementarea acestora in dispozitivul de test tip senzor de deformare.

Figura 41 a) Raspunsul piezoelectric pentru o proba de of BCZT/Pt/Si la aplicarea unui tren de

deformare mecanica. Intarzierea dintre aplicarea deformarii si raspunsul in voltaj este datorat timpului necesar trenului de unda pentru a ajunge pe proba de la sursa. b) si c) Transformata Fourier al semnalului aplicat si al raspunsului, aratand ca frecventa raspunsului in tensiune electrica este aceeasi cu a undei de deformare aplicata (2.15 MHz).

Straturile subtiri de Ca, Zr-BatiO3 convertesc cu succes deformarea mecanica in semnal electric, dupa cum se poate vedea din figura 41. Au fost utilizate ambele tipuri de straturi subtiri, obtinute atat prin PLD cat si prin MAPLE. Raspunsul piezoelectric al straturilor subtiri a fost obtinut prin aplicarea unor trenuri de deformare mecanica prin metoda clasica de masura a activitatii piezoelectrice directe (Piezoelectric Probing Technique).

Au fost testate deasemenea raspunsurile piezoelectrice locale ale probelor de Ca, Zr-BaTiO3 la diverse deformari mecanice inprimate de un cantilever cu varf conductor de Pt- Figura 8, 9. Răspunsul piezoelectric local este determinat cu un microscop de forță atomică astfel:

- pe vârful AFM conductor (de platină), aflat în contact cu suprafața probei, se aplică o tensiune electrică alternativă. Câmpul electric alternativ, existent între vârful AFM și substratul conductor, duce la apariția unei oscilații locale a materialului datorită efectului piezoelectric invers. Această oscilație locală este detectată cu ajutorul vârfului AFM. Concomitent se poate aplica și un câmp electric local continuu, tot intre vârful AFM și substrat, care să modifice starea de polarizare locală a materialului.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

33

Figura 42. Amplitudinea raspunsului piezoelectric obtinut la diverse valori ale fortei de apasare.

Se remarca o variatie aproape liniara a valorii coeficientului piezoelectric efectiv cu forta de

apasare a cantileverului pe suprafata probei. Aceste masuratori denota convertirea unui stimul mecanic, chiar si de valoare foarte mica, in raspuns electric local.

Figura 43. Variatia valorii coeficientului piezoelectric efectiv obtinut la diverse valori ale fortei de

apasare.

A fost măsurat răspunsul piezoelectric la diferite valori ale câmpului electric continuu și, de asemenea, la diferite valori ale presiunii mecanice aplicate prin intermediul vârfului AFM. Se observă o creștere a amplitudinii răspunsului piezoelectric cu creșterea apăsării.

La calcularea forței de apăsare s-a folosit valoarea nominală a constantei elastice a vârfului AFM specificată de producător (8 N/m), care poate să difere semnificativ de valoarea reală. De aceea, valorile respective trebuie considerate ca fiind relative.

Rezultatele obtinute in aceasta etapa au fost sintetizate in lucrarea “Lead-Free Piezoelectric (Ba,Ca)(Zr,Ti)O3 Thin Films for Biocompatible and Flexible Devices” trimisa la revista ACS APPLIED Materials and Interfaces (ISI 6.7), care este in curs de revizuire. Rezultatele au fost deasemenea diseminate la conferinta “2nd International Congress on Biomaterials & Biosensors” (BIOMATSEN 2016) 1 - 3 June 2016 İstanbul/Turkey prin lucrarea “Biocompatibility studies on piezoelectric (Ba1−xCax)(ZryTi1−y)O3 thin films growth by Matrix Assisted Pulsed Evaporation” by Nicu Doinel Scarisoreanu, Adrian Bercea, Valentina Dinca, Valentin Ion, Maria Dinescu (Abstract ID: 47 - Poster Presentation).

40 60 80 100 120 140 160

0.0120

0.0125

0.0130

0.0135

0.0140

0.0145

0.0150

0.0155

d33 efectiv

d33

efec

tiv (n

m/V

)apasare (nN)

40 60 80 100 120 140 160

0.024

0.025

0.026

0.027

0.028

0.029

0.030

0.031 amplitudine raspuns piezo

ampl

itudi

ne ra

spun

s pi

ezo

(nm

)

apasare (nN)

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

34

Activitatea 4.1.Cercetări asupra unei metode inovative de creare a hărţii tensiunilor în ţesutul tumoral (II)

Pe baza rezultatelor obtinute in cadrul etapei precedente au fost determinate conditiile

experimentale optime de producere a straturilor subtiri piezoelectrice atat in forma policristalina cat si epitaxiala prin PLD. Pentru masurarea raspunsului piezoelectric au fost efectuate experimente de depunere laser pulsata PLD de straturi subtiri de Ca, Zr-BTO folosind laserul cu excimer ArF (193 nm). Filmele subtiri de Ca, Zr-BaTiO3 au fost depuse pe subtraturi de sticla cu electrozi interdigitali de aur- Figura 1. Suportii de sticla au depusi pe suprafata electrozi interdigitali in forma de cercuri concentrice de Aur cu grosime de 150 nm si distanta intre electrozi de 50 microni.

Figura 44. Structuri IDT de test pentru integrarea nanostructurilor piezoelectrice

Figura 45. Imagini AFM pentru proba 429 Ca, Zr-BaTiO3 50 depusa la T=4000C.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

35

Dezavantajul acestui tip de substrat este acela ca nu rezista la temperaturi de depunere mai mari de 4500C, ceea ce limiteaza tipul de material piezoelectric care poate fi depus sub forma de film subtire cristalin pe acest tip de suport. Experimentele de ablatie laser au fost efectuate in conditii de temperatura si compozitie variabile (tabelul de mai jos). Lungimea de unda folosita a fost de 193 nm cu o rata de repetitie de 5 Hz. Distanta dintre tinta si substrat a fost de 4 cm si pastrata constanta pentru toate experimentele. Depunerea filmelor s-a facut in atmosfera de oxigen (0.1 mbar). Datorita limitarii date de substrat, depunerile au fost facute doar la temperaturile de 350 si 4000 C.

Caracterizarea morfologica astraturilor de BaTiO3 dopat cu Ca si Zr a fost efectuata cu ajutorul microscopiei de forta atomica- Figura 3, pentru a se determina influenta temperaturii de depunere si a numarului de pulsuri asupra proprietatilor piezo-electrice. De asemenea au fost scanate si suprafetele electrozilor interdigitali inainte de depunere. Rugozitatile straturilor de Ca, Zr-BaTiO3 au fost de ordinul nanometrilor (~5-10 nm). Grosimile estimate ale probelor au fost de aproximativ 400 nm pentru probele depuse la un numar de 45.000 de pulsuri si aproximativ 600 nm pentru cele depuse la 60.000 pulsuri. Dupa cum se poate observa din Figura 2, texturarea suprafetei filmelor subtiri apare numai in cazul utilizarii temperaturii de depunere de 4000C.

Figure 46. | Harta 2D stresului solid in tumori. a, Tumora proaspata a fost inclusa in 2% agarose

(lichid la 40°C) si apoi gelat in apa cu gheata. Constructul tumora – agarose a fost taiat la ca sa se elibereze stresul solid. Aceasta a rezultat in intr-un camp de deformatie dδz(x,y) cu respect cu planul

de referinta; δz si geometria tumorii a fost caracterizata cu un ultra sunete de inalta rezolutie.b,

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

36

Folosin un model de element finit, σzz, stresul mechanic in directia z, si W, energia elestica stochata de stresul solid au fost estimate din deformatia δz si modulul lui Young’s al tesutului pe baza legii

Hooke’s law. c, Deformarea indusa de stres δz a fost uniforma si neglijabila in tesuturi normale, fara stress (de exemplu rinichi (sus) si ficat (jos)). d, Imagini de sonografie representative care arata

deformatia indusa de stres si linia de referinta de la gelul agarose (linia galbena intrerupta), campurile de deformare 2D δz, 2D campus de stress σzz, si profile de stress representative de-a lungul

diametrului tumorii, toate pentru modelul murin de tumora de san (MMTV-M3C), tumora pancreatica de adenocarcinoma de duct (AK4.4) si tumori la greier (glioblastoma, U87).e, Degradarea enzimatica

a colagenului in tumora de san (MMTV-M3C) a rezultat intr-o reducere notabila in stresul solid si densitatea de energie elastic (control, n = 5 soareci; tratat cu colagenaza, n = 4 mice; mean Å

standard error of the mean; *P < 0.05). A representative ultrasound image and a solid-stress map are pentru control si specimenele tratate cu colagenaza. Reprodusa din Nia et al, 2016.

Impreuna cu colaboratorul nostru de la Universitatea Harvard, Dr. Lance Munn si cu un grup

de cercetatori de la Laboratorul de Biologia Tumorilor Edwin L. Steele, Harvard Medical School, USA am folosit metode biologice inovative pentru a determina o harta a stresului solid in tumori care este descrisa in detaliu in figura 46.

Pentru creerea unei harti a tensiunilor solide in interiorul unei tumori, in paralel cu creearea unui senzor de tumori, am creat si un algoritm sistem de orientare in tumori pentru determinarea precisa a locatiei de unde se va masura tensiunea cu Tumorsense. Schema acestui sistem de navigatie in tumori este ilustrata in figura 47 de mai jos si descrisa in detaliu in articolele noastre.

Figura 47. Diagrama functionala pentru sistemul realizare a hartii de stress tumoral, cu sistemele

referinta intre care se aplica transformarile de sisteme de coordonate pentru image registration si componentele hardware: sistem de tracking electromagnetic Aurora, cateter de biopsie cu senzor de

tensiune si senzor de pozitie electromagnetic, computer care ruleaza aplicatia dezvoltata Algoritmul de software face o inregistrare intre tomografia tumorii si punctele in care se preia

tensiunea tumorala in timpul procedurii de eco-endoscopie spre exemplu, pentru a identifica cu precizie pozitia punctului de masurare a tensiunii inauntrul tumorii, si a crea o harta a valorilor pentru o serie de masuratori efectuate in mai multe puncte din tumora. Aceasta ofera o intelegere mai buna a distributiei tensiunilor interne in tumora si o mai buna evaluare a raspunsului tumorii la diferite tratamente. Pentru a crea aceasta harta de masuratori, sunt necesare operatii de calcul complexe

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

37

precum registrare, segmentare si reconstructia 3D, care au fost implementate in aplicatia software a sistemului TumorSense care a fost dezvoltata in aceasta etapa.

In scopul corelarii cu harta tesutului tumoral s-a realizat un studiu biomolecular pentru determinarea biomarkerilor cancerului pancreatic:

Pentru acest studiu s-au colectat date de la pacienţi diagnosticaţi cu cancer pancreatic în perioada ianuarie 2016 - iunie 2017. Pacienţii au fost înrolaţi de la Institutul Regional de Gastroenterologie si Hepatologie "O. Fodor "din Cluj-Napoca. Diagnosticul pacienţilor cu cancer pancreatic a fost confirmat histopatologic prin eco-endoscopie cu puncţie fin aspirativă sau chirurgical. Toţi subiecţii şi-au dat consimţământul informat înainte de a fi înrolaţi în studiu. Studiul a fost aprobat de comitetul de etică al spitalului. S-au colectat informaţii cu privire la: datele demografice, diagnostic, stadializare, terapie şi supravieţuire. Datele demografice au inclus vârsta şi sexul pacienţilor. Datele referitoare la cancerul pancreatic au inclus: data diagnosticului, extinderea bolii, localizarea tumorii primare, tipul histologic şi nivelul de CA 19-9 la momentul diagnosticului. Diagnosticul şi stadializarea cancerului pancreatic au fost bazate pe teste imagistice, incluzând tomografia computerizată (CT) şi eco-endoscopia (EUS). S-a făcut distincţia între tumora primară rezecabilă, avansată loco-regional şi boala metastatică. Supravieţuirea a fost definită ca numărul de luni de la data diagnosticului şi data decesului. Data diagnosticului a fost definit ca intervalul de timp de la prima investigaţie imagistică (CT, RMN sau EUS) confirmând diagnosticul de cancer pancreatic.

Datele de supravieţuire au fost estimate folosind curba Kaplan-Meier şi testul logrank. Valorile sunt exprimate ca medii ± deviaţia standard (SD). O valoare p <0,05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.

222 de pacienţi incluşi în studiu (61% bărbaţi vs. 39% femei).Vârsta medie a populaţiei a fost de 61,4 de ani (DS 11.5, interval: 27-88 ani). Histologic, 107 de cazuri (48%) au avut adenocarcinom ductal, în timp ce 7 pacienţi (3%) au avut leziuni premaligne. Au fost 31 cazuri (14%) de pancreatită cronică şi 77 persoane sănătoase (35%).Expresia proteinei activin a fost cuantificată la 47 pacienți cu PDAC, 2 pacienți cu leziuni premaligne, 12 pacienți cu pancreatită cronică și 36 de control, iar proteina midkine la 89 pacienți cu PDAC, 8 pacienți cu leziuni pemaligne, 28 cu pancreatită cronică și 59 de control.

Supraexpresia proteinei activin a fost semnificativ corelată cu stadiul clinic al pacienților cu PDAC (p <0,05). Pentru stadiile clinice, rata activin pozitivă a fost de numai 47% (10/22) în stadiile I-II ale PDAC și a fost mai mare în stadiile III-IV (53%, 24/25), diferența a fost statistic semnificativă (p = 0,002).

Rata activin pozitivă a fost mai mare în cazurile cu dimensiunea tumorii ≥3 cm (75%, 33/38) decât în cazurile cu dimensiunea tumorii <3 cm (25%, 3/4). Cu toate acestea, nivelul expresiei proteinei activin nu a fost corelat cu vârsta pacienților, sexul și dimensiunea tumorii (p> 0,05). De asemenea, prezența metastazelor și a diabetului a fost semnificativ corelată cu exprimarea proteinei activin (p <0,05).

Supraexpresia proteinei midkine a fost semnificativ corelată cu stadiul clinic al pacienților cu PDAC (p <0,05). Pentru stadiile clinice, rata midkine pozitivă a fost de numai 28% (9/37) în stadiile I-II ale PDAC și a fost mai mare în stadiile III-IV (72%, 23/52), diferența a fost statistic semnificativă (p = 0,05). Rata midkine pozitivă a fost mai mare în cazurile cu dimensiunea tumorii ≥3 cm (78%, 18/68) decât în cazurile cu dimensiunea tumorii <3 cm (13%, 3/14). Cu toate acestea, nivelul expresiei proteinei midkine nu a fost corelat cu vârsta pacienților, sexul și dimensiunea tumorii (p> 0,05). De asemenea, prezența metastazelor a fost semnificativ corelată cu exprimarea proteinei midkine (p <0,05).

Pentru a confirma în continuare rolul expresiei proteinelor activin și midkine în progresia

adenocarcinomului pancreatic, s-a analizat rata de supraviețuire globală la 47 de cazuri cu PDAC

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

38

(pentru activin), 89 de cazuri (pentru midkine) folosind metoda Kaplan-Meier, și am constatat că pacienții cu PDAC cu expresie crescută a activinului au avut un timp de supraviețuire mai scurt față de pacienții cu PDAC cu expresie scăzută a activinului (Log-rank = 4,35, p = 0,03) şi nu s-a evidențiat nicio diferenţă la pacienţii cu PDAC cu expresie crescută a midkine față de pacienţii cu PDAC cu expresie scăzută a midkine (p>0,05).

Pentru a descoperi relația dintre expresia proteinelor activin și midkine și parametrii clinicopatologici, am efectuat cuantificarea Western blot a proteinei activin din probele de plasmă în 47 de cazuri de PDAC și în 51 de controale, precum și exprimarea poteinei midkine în 89 de cazuri de PDAC și în 95 subiecți sănătoși. În acest studiu, am constatat că activin și midkine sunt mai exprimați la pacienții cu adenocarcinom ductal pancreatic față de persoanele sănătoase (fig.5). Apoi am corelat expresia activinului cu starea clinicopatologică și prognosticul pacienților cu cancer pancreatic. Studiul nostru a constatat că proteina activin a prezentat o pozitivitate mai mare la PDAC (63%, 34/47) (P = 0,001) comparativ 20/51). De asemenea, proteina midkine a fost puternic pozitivă în PDAC (96%, 32/89) (P <0,001).

Figura 48. Analiza Western blot a activin și midkine la pacienții cu PDAC și martori. GAPDH a

fost folosit ca și control

Proteina activin a fost, de asemenea, corelată statistic semnificativ cu stadiul tumoral, diabetul și prezența metastazelor, iar expresia proteinei midkine a fost corelată semnificativă cu stadiul tumoral avansat și cu metastazele.

Am investigat în continuare relația dintre expresia activin și midkine și prognosticul pacienților cu PDAC. Rezultatele noastre au arătat că pacienții PDAC cu expresie crescută a activinului au avut rate de supraviețuire mai scăzute decât la pacienții cu expresie scăzută a activinului. Prin urmare, tratarea cașexiei și stabilizarea greutății poate fi crucială pentru pacienții cu cancer pancreatic și poate prelungi supraviețuirea lor.

În concluzie, Activin ar putea fi un biomarker potențial eficient pentru prezicerea prognosticului slab al pacienților cu PDAC și ar putea fi un marker terapeutic nou pentru țintirea selectivă a celulelor canceroase. Prin urmare, sunt necesare studii suplimentare pentru a explora mecanismul de funcționare a activin și midkine și pentru a investiga potențialul său ca țintă terapeutică în progresia PDAC.

A4.2 Dezvoltarea prototipului Tumorsense si testarea pe model artificial

In cadrul acestei activitati au fost integrate in structuri de test straturile subtiri de titanat de

bariu dopat cu calciu si zirconiu, obtinute prin PLD si MAPLE. Au fost dezvoltate mai multe geometrii de heterostructuri pentru integrare in senzorul de deformare piezoelectric. Masuratorile functionale au fost efectuate cu ajutorul unui sistem Keitley 6513B –(Fig. 6). A fost masurata sarcina electrica in functie de forta aplicata pe suprafata probei. In Fig. 7 de mai jos sunt prezentate raspunsurile probelor de Ca, Zr-BaTiO3 la aplicarea de greutati cu mase diferite. Pana la o masa aplicata de 10 mg raspunsul electric a fost relativ mic, de pana in 6-10 pC.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

39

Figura 49. Schema sistemului de masura pentru variatia raspunsului electric obtinut la diverse

valori ale fortei de apasare.

Crescand masa aplicata in pas de 1 mg a fost obtinut un raspuns liniar pentru atat pentru probele de Ca, Zr-BaTiO3 50 obtinute la temperaturi 3500C cat si pentru cele crescute la 4000 Celsius. Asa cum se poate observa din figura Figura 50, comportamentul probelor 429 si 428 este asemanator, diferenta apare doar la valoarea indicata de sistemul Keitley. Un raspuns mai bun a fost obtinut in cazul probei depusa la 4000 C cu o valoare masurata de ~450 pC la masa aplicata de 22 mg. In cazul probei de Ca, Zr-BaTiO3 55 nu a fost obtinut un raspuns liniar. De asemenea valorile maxime ale sarcinii masurate au fost de aproximativ 150 pC pentru masa maxima aplicata de 22 mg.

a) b)

Figura 50. Variatia raspunsului electric obtinut la diverse valori ale fortei de apasare pentru structuri de test bazate pe a) Ca, Zr-BaTiO3 55% si b)Ca, Zr-BaTiO3 50%.

Figura 51. Variatia raspunsului electric obtinut la diverse valori ale fortei de apasare pentru

structuri de test bazate pe Ca, Zr-BaTiO3 50% obtinute la 4000C. In scopul miniaturizarii dispozitivului de test, au fost obtinuti pixeli micronici de material

piezoelectric prin LIFT. Pentru realizarea pixelilor de Ca, Zr-BaTiO3 cu acttivitate piezolectrica prin tehnica LIFT au fost depuse initial filme subtiri de Ca, Zr-BaTiO3 pe un substraturi de cuart,

10 12 14 16 18 20 22-200

-150

-100

-50

0

50

100

427 BCTZ55 (3500 C)

Q (p

C)

Masa (mg)10 12 14 16 18 20 22

-500

-400

-300

-200

-100

0

100

428 BCTZ50 (3500 C)

Q (p

C)

Masa (mg)

10 12 14 16 18 20 22-500

-400

-300

-200

-100

0

100

429 BCTZ50 (4000 C)

Q (p

C)

Masa (mg)

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

40

transparent la radiatia laser. Pentru depunere au fost folosite tinte ceramice de Ca, Zr-BaTiO3 50% . Lungimea de unda folosita a fost de 193 nm (ArF) iar fluenta laser a fost de 2 J/cm2 cu o rata de repetitie de 5 Hz. Substratul a fost montat la distanta de 4 cm de tinta. In timpul procesului de depunere, in camera de reactie a fost introdus oxigen la presiunea de 0.1 mbar. Numarul de pulsuri a fost de 36.000. In timpul depunerilor, tinta au fost rotita si translatata evitandu-se astfel deteriorarea acestora. Grosimea stratului, determinata cu ajutorul microscopiei de forta atomica a fost de aproximativ 400 nm.

Probele de LIFT a fost realizate cu ajutorul unui laser cu excimeri ArF ce opereaza la lungimea de unda de 193 nm, cu o durata a pulsului de 15 ns si un profil flat-top al pulsului. Aria spotului laser a fost reglata prin intermediul unui sistem (Fig. 52) format din:

Ø Calculatorul (PC)= Controleaza pozitia deschis/inchis a Sutter-ului, indicatorul laser si camera video si masutele motorizate.

Ø Shutter = Permite trecerea unui singur puls laser, indiferent de frecventa laserului. Ø Atenuator =Permite reglarea foarte exacta a energiei fascicului laser Ø Apertura ajustabila= Regleaza dimensiunea fascilului laser Ø Lentila convergenta=Mediu optic tarnsparent marginit de doi dioprti sferici sau conbinatii de

dioptri sferici si plani ce tranforma un fascicul parale intr-unul convergent. Creaza imaginea aperturii ajustabile pe suprafata stratului (donorului) ce urmeaza a fi transferat.

Ø Indicator laser si Camera video= Faciliteaza selectarea unei anumite zone din stratul donor, zona ce se doreste a fi transferata.

Ø Suport esantion si masute motorizate= Permit fexarea fixarea probei si deplasarea acesteia pentru a transdera cat mai mult din stratul donor insa fara modifica caracteristicile fascicului laser sau aria pe care acesta interactioneaza cu stratul donor.

Figura 52. Sistemul experimental de obtinere a pixelilor de Ca, Zr-BaTiO3 cu activitate

piezoelectrica.

Deschiderea aperturii a fost de 3.2 mm, distanta focala a lentilei convergente de 200 mm, distanta lentila-apertura (100 mm), distanta lentila-donor au fost calculate astfel incat in planul imagine spotulul laser sa aiba o arie de 0.6 mm2 pe suprafata donorului.

Fluenta utilizata la transferul pixelilor prezentati in Figura 53 este de aproximativ 0.1 J/cm2 si fiecare pixel a fost transferat cu un singur puls laser. Utilizarea aceste fluente a condus la un transfer intact al materialului donor pe suportul de Pt, in timp ce utilizarea unor fluente mai mici sau mai mari a condus de fiecare data la fragmentarea pixelilor si/sau la o aderenta scazuta a lor la suportul de Pt. Este vizibil faptul ca pixeli de Ca, Zr-BaTiO3 50 nu prezinta discontinuitati sau alte defecte majore. Transferul intact al pixelilor se realizeza doar pentru o anumita combinatie intre fluenta de transfer si grosimea donorului.

z y

x

Atenuator Shutt

er

Aperturaajustabila

Indicatorlaser Camera

video

Masutemotorizate

Suportesantion

Laser

Lentila

Calculator

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

41

Figura 53. Imagini SEM pentru pixeli de Ca, Zr-BaTiO3 50 transferati prin tehnica LIFT.

Raspunsul piezoelectric local a fost determinat cu un microscop de forță atomica astfel: pe varful

AFM conductor (de platina), aflat in contact cu suprafata probei, s-a aplicat o tensiune electrică alternativa. Campul electric alternativ, existent intre varful AFM și substratul conductor, duce la aparitia unei oscilatii locale a materialului datorita efectului piezoelectric invers. Această oscilatie locala este detectata cu ajutorul varfului AFM. Concomitent se poate aplica și un camp electric local continuu, tot intre varful AFM și substrat, care să modifice starea de polarizare locala a materialului. Valoarea masurata a raspunsului piezoelectric a fost de d33 eff= 75 pm/V.

Pentru testarea in laborator a Tumorsense s-a creeat un amplificator de semnal bazat pe urmatoarea schema:

Circuitul electric a fost inchis intr-o cutie metalica customizata pentru aceasta aplicatie

si conectata la un osciloscop RIGOL DS2072A:

Asa cum se vede pe ecranul osciloscopului, la aplicarea repetata a unei forte mecanice, sensorul

Tumorsense a avut un raspuns usor detectabil si repetabil. Pentru ultima varianta a senzorului Tumorsense, s-a creat un circuit electric de amplificare

alimentat de 2 baterii pentru a se evita interferenta cu sursa de alimentare de la priza din varianta precedenta.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

42

Pentru testarea senzorului, s-a folosit o seringa medicala de 1cc cu greutate de 1.6gr si diametrul de 7mm. La aceste dimensiuni, presiunea pe sensor este de 3mmHg deci in limita ceruta de aplicatia medicala de masurare a unei presiuni solide din interiorul tumorii de 0-5mmHg.

Urmatoarele teste au fost derulate:

Test 1. Se aplica pe senzorul Tumorsense 445 BCTZ45/IDE Sticla 400C 45,000 puls o seringa de

1cc cu capat de cauciuc in greutate de 1.6gr, se ridica si apoi se aplica din nou. Test 2. Se aplica acelasi test la un sensor piezoelectric comercial. Apoi se aplica o greutate de

2gr. Se constata ca senzorul simte chiar si miscarea de respiratie. S-a incercat si cu fara greutate. S-a schimbat senzorul 445 cu senzorul 444 BCTZ45/IDE Sticla 400C 45,000 puls si s-au conectat firele de contact direct la sensor.

Test 3. Senzorul commercial, siringa singura aplicata de 5 ori si cu repetitii de 10 cicluri. Test 4. Senzorul commercial. O greutate vs. 2-4 greutati. Test 5. TS (tumorsensor) 444. Siringa + siringa si greutate de ¼”. Intai s-au testat conexiunile electrice. S-a pus senzorul TS444 in cutia de plastic si s-a aplicat

seringa de 1cc pe portiunea circular a senzorului. Seringa are un capat de cauciuc uniform. TS444 a raspuns la seringa dar nu si la adaugarae greutatilor. TN444 a raspuns la apararea cu degetul nu la saiba.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

43

Rezultatele acestui experiment vor fi prezentate in cadrul conferintei internationale ale

Societatii de Inginerie Bioedicala de pe data 11-15 Octombrie in Phoenix, Arizona.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

44

Activitatea 3.3. Diseminare si patentare. Articole stiintifice rezultate in urma cercetarilor din cadrul acestui proiect: 1. Seicean A, Badea R, Moldovan-Pop A, Vultur S, Botan EC, Zaharie T, Săftoiu A, Mocan T,

Iancu C, Graur F, Sparchez Z, Seicean R. Harmonic Contrast-Enhanced Endoscopic Ultrasonography for the Guidance of Fine-Needle Aspiration in Solid Pancreatic Masses, Ultraschall Med. 2015 Aug 14.

2. Seicean A, Petrusel L, Seicean R. New targeted therapies in pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 2015 May 28;21(20):6127-45.

3. V. Dinca, A. Bercea, M. Icivezi, A. Roseanu, L. Gruionu, R. Birjega, M. Dinescu, N. D. Scarisoreanu, BCZT thin films based-bio interfaces obtained by MAPLE technique, Applied Surface Science, submitted, 2015.

4. Seicean A, Badea R, Moldovan-Pop A, Vultur S, Botan EC, Zaharie T, Săftoiu A, Mocan T, Iancu C, Graur F, Sparchez Z, Seicean R. Harmonic Contrast-Enhanced Endoscopic Ultrasonography for the Guidance of Fine-Needle Aspiration in Solid Pancreatic Masses, Ultraschall Med. 2015 Aug 14.

5. Seicean A, Petrusel L, Seicean R. New targeted therapies in pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 2015 May 28;21(20):6127-45.

6. V. Dinca, A. Bercea, M. Icivezi, A. Roseanu, L. Gruionu, R. Birjega, M. Dinescu, N. D. Scarisoreanu, BCZT thin films based-bio interfaces obtained by MAPLE technique, Applied Surface Science, submitted, 2015.

7. Seicean A, Mosteanu O, Seicean R. Maximizing the endoscopic ultrasonography. World J Gastroenterology 2016; in press.

8. Seicean A, Jinga M. Harmonic contrast-enhanced endoscopic ultrasound fine needle aspiration: fact or fiction? Endoscopic Ultrasound 2016; in press.

9. Seicean A, Mosteanu O, Seicean R. Maximizing the endoscopic ultrasonography. World J Gastroenterology 2017;23(1):25-41

10. Seicean A, Jinga M. Harmonic contrast-enhanced endoscopic ultrasound fine needle aspiration: fact or fiction?Endoscopic Ultrasound 2017; 6(1):31-36

11. Petrusel L, R. Suharoschi, R. Seicean, A. Seicean. The cytoskeleton and cachexia involvement in the local spread of pancreatic ductal adenocarcinoma.- Submitted to Pancreas.

12. N. D. Scarisoreanu, F. R. Craciun, V. Ion, R. Birjega, A. Bercea, V. Dinca, M. Dinescu, L. E. Sima, M. Icriverzi, A. Roseanu, L. G. Gruionu, G. Gruionu, “Lead-Free Piezoelectric (Ba,Ca)(Zr,Ti)O3 Thin Films for Biocompatible and Flexible Devices” ACS Appl. Mater. Interfaces, 9 (1), pp 266–278, 2017, DOI: 10.1021/acsami.6b14774. Factor de impact: 7.504

Presentări – poster la conferinte nationale si internationale, rezultate in urma cercetarilor

din cadrul acestui proiect: 1. “EUS-plus” – the role of contrast harmonics, elastography and nCLE. 6th European EUS

Congress,11-12 November 2015, Edinburgh, Scotland, UK. 2. Operabilitatea în cancerul de pancreas. Ecoendoscopia (EUS). AL XXXV-LEA Congres

National de Gastroenterologie , Hepatologie si Endoscopie Digestiva Iasi 2015. 3. “EUS-plus” – the role of contrast harmonics, elastography and nCLE. 6th European EUS

Congress,11-12 November 2015, Edinburgh, Scotland, UK. 4. Operabilitatea în cancerul de pancreas. Ecoendoscopia (EUS). AL XXXV-LEA Congres

National de Gastroenterologie , Hepatologie si Endoscopie Digestiva Iasi 2015.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

45

5. “2nd International Congress on Biomaterials & Biosensors” (BIOMATSEN 2016) 1 - 3 June 2016 İstanbul/Turkey “Biocompatibility studies on piezoelectric (Ba1−xCax)(ZryTi1−y)O3 thin films growth by Matrix Assisted Pulsed Evaporation” by Nicu Doinel Scarisoreanu, Adrian Bercea, Valentina Dinca, Valentin Ion, Maria Dinescu (Abstract ID: 47 - Poster Presentation).

6. A. Seicean. Contrast media in biliopancreatic endoscopic ultrasonography. EUS-ERCP connection. Turin, Italy 2016

7. A. Seicean, Endoscopic ultrasound fine needle aspiration (EUS-FNA) in bilio-pancreatic pathology. Romanian- German Symposium, Timisoara mar 2016.

8. A. Seicean. Cancerul de pancreas- dificultati de diagnostic. AL XXXVI-LEA Congres National de Gastroenterologie , Hepatologie si Endoscopie Digestiva Cluj-Napoca 2016

9. A. Seicean. Fiziopatologia durerii pancreatice. AL XXXVI-LEA Congres National de Gastroenterologie , Hepatologie si Endoscopie Digestiva Cluj-Napoca 2016.

10. Nicolae Scarisoreanu, Lucian G. Gruionu, Gabriel Gruionu, Tumor Solid-Stress Sensor for Cancer Treatment Monitoring, 2016 BMES/FDA Frontiers in Medical Devices Conference "Innovations in Modeling and Simulation: Patient-Centered Healthcare." May 23-25, 2016, Washington, DC, USA.

11. - EMRS spring meeting, 22-26 Mai Strasbourg, Franta prin lucrarea “Biocompatibility studies of lead free (Ba1−xCax)(ZryTi1−y)O3 thin films obtained by pulsed laser-based techniques; V. Ion, M. Dinescu, M. Icrivezi, A. Andrei , A.I. Bercea, R. Birjega , A. Bonciu, V. Dinca, A. Roseanu, N.D. Scarisoreanu (poster - X.P_1.57) ;

12. - 4th Central and Eastern European Conference on Thermal Analysis and Calorimetry (CEEC-TAC4), 28-31 August, Chisinau, Republica Moldova cu lucrarea: “Epitaxial thin films of (Ba1−xCax)(ZryTi1−y)O3 obtained by Pulsed Laser Deposition (PLD) (poster) - - EMRS fall meeting, 17-21 Septembrie 2017, Varsovia, Polonia cu lucrarea:

13. Biocompatible studies on piezoelectric active (Ba1-xCax)(ZryTi1-y)O3 thin films; V. Ion, N.D. Scarisoreanu, A. Bonciu, A. Moldovan, V. Dinca, M. Dinescu, L.E. Sima, M. Icriverzi, A. Roseanu (poster N.4.49)

14. A. Seicean. CH-EUS and EUS-E for the guidance of EUS-FNA: fact or fiction? The 4th EUROPEAN WORKSHOP on EUS Image Enhancement Techniques, 4-5 oct 2017 , Bologna, Italy

15. A. Seicean. Endoscopic ultrasound fine needle aspiration (EUS-FNA) in bilio-pancreatic pathology. Romanian- German Symposium, Timisoara mar 2016.

16. A. Seicean. Contrast media in biliopancreatic endosonography. AL XXXVII-LEA Congres National de Gastroenterologie , Hepatologie si Endoscopie Digestiva Bucuresti 2017

17. A. Seicean. Pancreas. Endoscopic ultrasound technique. XXXVII-LEA Congres National de Gastroenterologie , Hepatologie si Endoscopie Digestiva Bucuresti 2017

18. A. Seicean. EUS guided fine needle aspiration: how do I increase the yield in pancreatic diseases? Endoscopy live Cluj-Napoca 2017.

19. Petrusel L, R. Suharoschi, R. Seicean, A. Seicean. Cachexia involvement in the local spread of pancreatic ductal adenocarcinoma. United European Gastroenterology Week 2017, Barcelona, Spain.

20. Petrusel L, R. Suharoschi, R. Seicean, A. Seicean. The cytoskeleton and cachexia involvement in the local spread of pancreatic ductal adenocarcinoma. United European Gastroenterology Week 2017, Barcelona, Spain

21. 3. A. Seicean, A. Samargitan, M. Gheorghiu et al. A randomized control trial assessing the contrast enhanced guided fine needle aspiration in solid pancreatic neoplasms. United European Gastroenterology Week 2017, Barcelona, Spain.

SISTEM MEDICAL INOVATIV PENTRU MONITORIZAREA TENSIUNILOR INTERNE IN TESUTUL TUMORAL IN SCOPUL IMBUNATATIRII TRATAMENTULUI ONCOLOGIC – (TUMORSENSE)

Contract Nr: 12/2014

46

22. Nicolae Scarisoreanu, Lucian Gruionu, Gabriel Gruionu. Novel Biocompatible Piezoelectric Microsensor for Cancer and Soft Tissue Treatment Monitoring. BMES Annual Meeting, Phoenix, AZ, SUA.

Prezentari orale la conferinte nationale si internationale, rezultate in urma cercetarilor din

cadrul acestui proiect: 1. Core-histology obtained during endoscopic ultrasonography for pancreatic masses by using a

standard 22G needle. 6th European EUS Congress,11-12 November 2015, Edinburgh, Scotland, UK.

2. Core-histology obtained during endoscopic ultrasonography for pancreatic masses by using a standard 22G needle. 6th European EUS Congress,11-12 November 2015, Edinburgh, Scotland, UK.

3. Petrusel L, Zaharie T, Badea R, Pojoga C, Seicean R, Seicean A. Factorii de risc şi supravieţuirea în adenocarcinomul pancreatic. AL XXXVI-LEA Congres National de Gastroenterologie, Hepatologie si Endoscopie Digestiva Cluj-Napoca 2016.

4. Petrusel L, Zaharie T, Badea R, Pojoga C, Seicean R, Seicean A. Factorii de risc şi supravieţuirea în adenocarcinomul pancreatic. Scoala Națională de vară de Gastroenterologie Paltinis 2017.

Patente: Cerere de brevet de inventie: „Metoda de printare de pixeli cu activitate piezoelectrica din

materiale ecologice pe baza de titanat de bariu dopat”, A/00739/27-09-2017.

Director Proiect, Dr. Gabriel Gruionu