raport tehnic parazitologie patologie

113
Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana 1 RAPORT TEHNIC ETAPA A III-A Iulie-decembrie 2007 Program sectorial contract 361 P.S. 4.3.1. METODE MODERNE PENTRU CONTROLUL UNOR BOLI PARAZITARE ALE ANIMALELOR CU IMPLICATII IN PATOLOGIA UMANA Director de Proiect: Dr. Dumitru MILITARU S.N. Institutul Pasteur

description

METODE MODERNE PENTRU CONTROLUL UNOR BOLIPARAZITARE ALE ANIMALELOR CU IMPLICATII IN PATOLOGIAUMANA

Transcript of raport tehnic parazitologie patologie

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    1

    RAPORT TEHNIC ETAPA A III-A

    Iulie-decembrie 2007

    Program sectorial contract 361 P.S. 4.3.1.

    METODE MODERNE PENTRU CONTROLUL UNOR BOLI

    PARAZITARE ALE ANIMALELOR CU IMPLICATII IN PATOLOGIA UMANA

    Director de Proiect: Dr. Dumitru MILITARU S.N. Institutul Pasteur

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    2

    RAPORT TEHNIC

    Etapa a III-a iulie-decembrie 2007

    Principalii paraziti intalniti la animale si implicati in patologia

    parazitara umana prin transmitere de la animale la om, sunt:

    - Toxoplasma gondii, parazitul avand gazda definitiva pisica si gazde

    intermediare rumegatoarele si porcul, sursa de contaminare a omului fiind

    reprezentata atat de pisica (materii fecale), cat si de ovine si porcine (carne

    insuficient prelucrata termic)

    - Trichinella spiralis, parazitul evoluand frecvent la porc, porcul

    mistret si urs, porcul fiind principala sursa de infestare pentru om;

    - Echinococcus granulosus care are drept gazda definitiva cainele, iar

    gazde intermediare, unde evolueaza sub forma larvara (chist hidatic), sunt

    rumegatoarele, porcul, dar si omul;

    Toxoplasmoza:

    Protozoonoz cu larg rspndire, deseori neglijat din punct de vedere

    a etiologiei, n stabilirea unui diagnostic corect, datorit lipsei de

    specificitate a manifestrilor clinice, toxoplasmoza la animale se manifest

    deseori prin tulburri de reproducie, avorturi i uneori manifestri nervoase.

    Totodat, fiind considerat o important zoonoz, infestaia cu

    Toxoplasma gondii pune probleme deosebite n ceea ce privete salubritatea

    produselor alimentare de origine animal (de exemplu prezena chisturilor

    parazitare n carne sau produse din carne crude).

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    3

    Toxoplasma gondii este un parazit protozoar obligatoriu intracelular,

    capabil sa infecteze pasarile si animalele cu sange cald. Parazitul T. gondii

    are un ciclu de viata complicat cu numeroase stadii de evolutie. Pisicile

    infectate (gazda definitiva) imprastie oochisturi prin fecale in mediul

    inconjurator, oochisturi care ingerate de animale sau oameni elibereaza

    sporozoitii in corpul gazdei contaminate. Tachizoitii, derivati din sporozoiti,

    invadeaza apoi organismul animalelor sau oamenilor contaminati, ciclul

    biologic incheindu-se prin formarea in musculatura si diferite organe de

    chisturi de T. gondii ce contin un numar mare de bradizoiti. Organismele

    parazitare (cum ar fi Toxoplasma gondii) pot cauza pierderi semnificative in

    fermele de porcine si ovine prin avorturi, afectare embrionara sau infertilitate

    maternala. Un raport din 2002 al Institutului de Stiinta si Cercetare a

    Mediului Inconjurator din Noua Zeelanda, mentioneaza seroprevalenta

    anticorpilor anti-T. gondii la animale. Astfel, in Tazmania din 160 miei

    testati, 16,9% erau pozitivi; din 145 oi, 61,7% erau pozitive; din 30 vieri,

    22,3% erau pozitivi; din 139 porci, 7,2% erau pozitivi. In Australia, din 1159

    de oi, 7,4-9,2% erau pozitive. In Canada din 2800 de porci, 8,6% au prezentat

    anticorpi anti-T. gondii. In Norvegia, 18% dintre oi, 5,1% din bovine si 2,5%

    din porcine aveau anticorpi anti-T. gondii. In SUA, din 3707 porci testati,

    32% au fost pozitivi; din 5936 ovine testate, 37% au fost pozitive si din 2449

    caprine, 23% erau pozitive. Studiile au aratat ca, la nivel mondial, din 73717

    porcine testate, 22% au fost detectate ca pozitive. Acelasi raport mentioneaza

    ca in Anglia, din 67 de probe de carne conservata, 1,5% erau pozitive (la

    testare prin PCR si pe culturi celulare); in SUA, din 50 probe tesut musular

    porc testate prin bioproba pe soricei, 24% au fost pozitive; iar din 86 probe

    tesut muscular ovine 9,3 % au fost pozitive. In SUA, intre 1983-1984, din

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    4

    11229 scroafe testate, 42% au fost pozitive, iar din 613 porci sacrificati pentu

    consum, 23% au fost pozitivi la T. gondii; in 1990, din 3479 scroafe testate,

    20% erau pozitive; in 1995, din 3236 scroafe testate, 15% au fost pozitive, iar

    din 4712 porci, 3,2% au fost pozitivi.

    Raportul Institutului National Veterinar din Suedia din 2002 catre

    Comisia Europeana mentiona ca in Suedia, in anul 1987, 20% dintre ovine si

    17,3% din porcii adulti prezentau anticorpi anti-T.gondii. De asemenea,

    supravegherea serologica a ovinelor in Norvegia, in anii 90 a condus la

    concluzia ca 18% dintre miei si 2% din porcine prezentau anticorpi anti-

    Toxoplasma gondii. In America de Nord, se estimeaza ca intre 16-40% dintre

    persoane sunt infectate cu Toxoplasma gondii. Din diferite studii

    epidemiologice din Norvegia s-a concluzionat ca intre 7-27% din femeile

    insarcinate erau seropozitive la T. gondii. S-a estimat ca aproximativ 30% din

    adultii din Marea Britanie si intre 50-80% din adultii din Europa au anticorpi

    anti-T. gondii. De asemenea, la nivel mondial, cazurile de toxoplasmoza

    congenitala se estimeaza ca fiind cuprinse intre 140900-1127200 (0,1-0,8%)

    anual. In SUA, 0,6% din populatie se infecteaza in fiecare an, acest procent

    reprezentand aproximativ 1500000 de cazuri. Numarul de cazuri de

    toxoplasmoza congenitala in SUA s-a estimat la 400 - 4000 cazuri anual in

    2000. In Franta prevalenta toxoplasmozei s-a situat in 1996 intre 42-84%, iar

    in SUA a fost de pana la 40%.

    Date de la Centrul pentru Controlul Bolilor din Canada au situat infectia

    cu Toxoplasma gondii pe locul trei (20,7%), dupa infectiile Salmonella

    (30,6%) si Listeria monocytogenes (27,6%). Un studiu european efectuat in

    anul 2000, pe 1110 femei insarcinate, a demonstrat prezenta infectiei ca fiind

    10% in Marea Britanie si Norvegia, 55% in Franta si Grecia. Din cazurile

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    5

    depistate pozitive, intre 30-63% din infectii au fost atribuite consumului de

    carne infestata.

    Controlul infestatiei cu Toxoplasma gondii la animalele de interes

    economic, inclusiv la suine si ovine, reprezinta o preocupare continua

    intrucat T. gondii determina o infectie zoonotica importanta, fiind una din

    cauzele majore a avorturilor la ovine si porcine.

    Datorita faptului ca in marea majoritate a cazurilor, toxoplasmoza

    evolueaza subclinic, preocuparea actuala este indreptata catre

    perfectionarea metodelor de diagnostic existente si elaborarea de metode

    noi de diagnostic care sa le inlocuiasca pe cele conventionale (testul pe

    culturi tisulare, biproba pe soricei), care nu sunt foarte sensibile si

    necesita consum mare de timp, cu metode moderne cum ar fi testele

    imunoenzimatice, testele imunohistochimice si moleculare (PCR).

    T. gondii cauzeaza o gama mare de manifestari la gazdele infectate.

    Cele mai multe tulpini de T. gondii sunt avirulente pentru soricei producand

    infectii cronice asimptomatice, in timp ce cateva sunt inalt virulente pentru

    soricei, producand toxoplasmoze acute care omoara soriceii la o concentratie

    de mai putin de 10 tachizoiti. La o asa diversitate biologica si epidemiologica

    a toxoplasmelor, ne putem astepta la o diversitate genetica mare, determinata

    de recombinarea meiotica in acest parazit produsa in timpul ciclului sexual al

    parazitului. Marea majoritate a izolatelor de T. gondii de la animale si

    oameni, studiate pana in prezent apartin numai originilor clonale 2 si 3,

    structurate ca tipurile I, II si III.

    Genomul T.gondii, asemenea celui al altor celule eucariote, este

    compus din acidul dezoxiribonucleic nuclear si cel al organitelor. T.gondii

    contine un genom nuclear de aproximativ 86Mb, un genom mitocondrial de 6

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    6

    kb si un genom epizomal de 35 kb. Diversitatea alelica identificata pentru cei

    mai multi dintre markerii T.gondii a fost foarte mica (2-4 alele). In aceasta

    situatie se afla markerii izoenzimatici ce compun 6 sisteme polimorfice

    enzimatice (aspartat aminotransferaza, glutation reductaza, amilaza,

    glucozofosfat izomeraza, acid fosfataza si propionilesteraza) si care prezinta

    numai 2-3 izoforme in populatia de izolate de T. gondii testate. O diversitate

    genetica foarte mica (2-4 alele) s-a intalnit si la genele care codifica

    antigenele majore ale parazitului (antigene de suprafata, antigenele produse

    de granulele dense, de organelele secretoare rhoptry sau antigenele matricei

    chisturilor), la genele care codifica sintetizarea altor produsi ai T.gondii (-tubulina, -tubulina, actina, dihidrofolat reductaza-timidilat sintetaza, nucleozid trifosfataza, alfa ADN polimeraza) sau genele cu functii

    necunoscute. S-a observat ca din 18 tulpini de T.gondii studiate, toate

    prezentau una sau alta din cele doua secvente in genele care codifica atat

    antigenele de suprafata cat si cele ale organitelor, fara a exista o variatie

    intratipica. Un polimorfism usor mai inalt (3-4 alele) a fost detectat la cativa

    microsateliti localizati in intronul genelor cunoscute (TUB 2 pentru -tubulina, TgM-A pentru miozina A) sau in secventele tag expresate

    (ESTW35487). De asemenea, au putut fi detectati ca avand un inalt

    polimorfism, copii multiple ale locilor, cu functii necunoscute. S-au descris

    pentru T. gondii mai mult de 50 de markeri: markeri genetici si fenotipici cu

    polimorfism scazut (2-4 alele) si markeri genetici cu polimorfism inalt.

    Markerii genetici si fenotipici cu polimorfism scazut (2-4 alele) sunt compusi

    din izoenzime (aspartat aminotransferaza, amilaza, propionilesteraza,

    glucozofosfat izomeraza, glutation reductaza, acid fosfataza), gene ce

    codifica antigenele majore (antigene de suprafata: SAG1, SAG2, SAG3,

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    7

    SAG4, MAG1, BSR4, SRS1, SRS2, SRS3; antigene ale organitelor: GRA1,

    GRA2, GRA3, GRA4, GRA6, ROP1 si nucleozidtrifosfataza NTP; gene cu

    functii cunoscute: actina ACT1, -tubulina (TUB1), -tubulina (TUB2), B10, dihidrofolat reductaza (FOL1), ADN polimeraza alfa (POL1); gene cu functii

    necunoscute: 850, L328, 62B, 226, C19, B1 si microsateliti: -tubulina (TUB2), miozina A (TgM-A), EST W35487. Markerii genetici cu

    polimorfism inalt sunt formati din secvente repetate in genom (BS, TGR,

    REP) si din microsateliti (EST: N60608, N82375, N83021, N61191,

    AA519150 si loci: M6, M33, M48, M95, M102, M163). Inalta putere

    discriminatorie a 8 markeri ai microsatelitilor poate avea o utilitate foarte

    mare in studiile epidemiologice ale Toxoplasmei gondii, dar si pentru

    genotipizarea tulpinilor si detectarea infectiilor mixte. Tipizarea

    microsatelitilor este considerata a fi superioara celei a multilocusurilor care

    nu poate distinge infectiile mixte din probe.

    Concluzionand, au fost stabilite trei genotipuri principale ale

    Toxoplasmei gondii, in functie de cateva dintre caracteristicile sale biologice:

    tipul I (izolate rar aproximativ 10% din tulpinile de colectie din Europa si

    SUA, sunt in principal de origine umana; tulpini inalt virulente pentru soricei

    determinand moartea soriceilor inoculati cu mai putin de 10 tachizoiti; in

    vitro prezinta o rata inalta de multiplicare si o interconversie tachizoit-

    bradizoit redusa); tipul II (izolate foarte des aproximativ 80% din tulpinile

    de colectie din Europa si SUA, sunt de origine umana sau izolate de la

    porcine, ovine; sunt tulpini nevirulente pentru soricei determinand infectii

    cronice cu persistenta in tesuturi a chisturilor; in vitro prezinta o rata scazuta

    de multiplicare si interconversie tachizoit-bradizoit usoara, cu formare de

    chisturi) si tipul III in care sunt cuprinse tulpinile de T. gondii cu genotipuri

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    8

    recombinate si genotipuri neobisnuite cu alele atipice (au fost intalnite foarte

    rar in izolatele din Europa si SUA, sunt mult mai des intalnite in izolatele de

    la animalele salbatice din regiuni geografice indepartate si de la bolnavi

    atipici; aceste tulpini sunt de obicei mai virulente decat cele de tip II).

    Descoperirea acestor markeri s-a realizat prin dezvoltarea unor proiecte

    de cercetare a genomului parazitului. Rezultatele cercetarilor (mai mult de

    73000 de gene ale T. gondii si secventele tag expresate (EST)) sunt

    disponibile acum in GeneBank si pot fi analizate prin paginile web ale

    genomului T. gondii.

    Scopul general al proiectului este reprezentat de dezvoltarea unor

    instrumente de diagnostic, profilactice si terapeutice destinate controlului

    bolilor parazitere cu caracter zoonotic.

    Directiile majore pe care se vor desfasura cercetarile constau in:

    - studii epidemiologice privind emergenta si distributia parazitilor

    zoonotici, luati in studiu, circulanti in efectivele de animale in

    Romania, comparativ cu cei intalniti in cazuistica din medicina umana;

    - studiul modalitatilor de transmitere a parazitilor de la gazda definitiva

    la om;

    - dezvoltarea instrumentelor de diagnostic prin crearea unor metodologii

    bazate pe utilizarea tehnicilor imunologice (teste imunoenzimatice-

    ELISA, imunohistochimice, nanotehnologice) si de biologie

    moleculara (PCR/tehnologia ADN recombinant) pentru stabilirea

    diagnosticului la gazdele definitive, respectiv la gazdele intermediare;

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    9

    - dezvoltarea unor produse de interventie: vaccinuri si produse

    antiparazitare utilizabile in profilaxia si tratamentul parazitozoonozelor

    luate in studiu;

    - derularea de actiuni suport pentru diseminarea rezultatelor cercetarilor.

    Obiectivul pricipal al etapei a III-a a constat in: Stabilirea

    metodologiilor de diagnostic precoce si discriminatoriu privind

    infestatiile cu Toxoplasma gondii la animale.

    Obiective operaionale:

    stabilirea conditiilor de lucru in tehnicile de diagnostic imunoenzimatice si imunohistochimice;

    validarea metodelor elaborate pe probe cunoscute si pe probe din teren; elaborarea metodelor moleculare de detectie a Toxoplasma gondii

    (teste PCR elective si metodologii de obtinere a matritelor ADN din

    probe cunoscute);

    validarea metodelor moleculare pe probe cunoscute si pe probe din teren.

    diseminarea rezultatelor obinute n publicaii de specialitate i cu ocazia comunicrilor tiinifice.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    10

    1.1. Stabilirea conditiilor de lucru in tehnicile de diagnostic imunoenzimatice si imunohistochimice. Validarea metodelor

    elaborate pe probe cunoscute si pe probe din teren.

    1.1.1. Reagentii preparati in etapa anterioara au fost utilizati pentru

    stabilirea conditiilor de reactie in tehnicile imunoenzimatice de detectie a

    anticorpilor anti-Toxoplasma gondii din seruri provenite de la ovine si

    porcine.

    ELI-Tox-O: Set de diagnostic al toxoplasmozei la ovine

    Ansamblu de componente pentru detectia anticorpilor de tip IgG anti-

    Toxoplasma gondii din serul sanguin de la ovine prin tehnica

    imunoenzimatica (ELISA varianta indirecta).

    Scopul utilizarii: Diagnosticul toxoplasmozei (detectarea anticorpilor

    de tip IgG) pe seruri provenite de la ovine prin tehnica ELISA-varianta

    indirecta.

    Forma de prezentare: Trusa cu componente necesare pentru 90 probe,

    180 probe sau 450 probe.

    Componentele produsului: Trusa ELI-Tox-O cuprinde urmatoarele

    componente, ambalate individual, in cantitati corespunzatoare necesarului de

    lucru: Nr.

    crt.

    Component U/M Cantitate

    pentru 90

    probe

    Cantitate

    pentru 180

    probe

    Cantitate

    pentru 450

    probe

    1. Microplaca ELISA peliculizata cu antigen

    Toxoplasma gondii

    buc. 1 2 5

    2. Martor pozitiv 10X ml 0,1 0,2 0.5

    3. Martor negativ 10X ml 0,1 0,2 0.5

    4. Conjugat anti-IgG oaie marcat cu peroxidaza ml 0,125 0,250 0.600

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    11

    5. Substrat de perhidrol in tampon citrat ml 11 25 60

    6. Cromogen (solutie ABTS) ml 0,6 1,2 3

    7. Diluant pentru seruri si conjugat ml 100 120 240

    8. Solutie de spalare 10 X ml 50 60 150

    9. Reactiv de stopare NaF g 0,09 0,18 0.45

    10. Instructiuni de folosire a trusei buc. 1 1 1

    a) Microplaca ELISA este peliculizata (captusita) cu antigen purificat

    stabilizat de Toxoplasma gondii, spalata si uscata, ambalata in folie

    de plastic sau metalizata, gata de utilizare.

    b) Martorul pozitiv este obtinut de la oi imunizate cu antigen

    Toxoplasma gondii purificat. Se prezinta ca un lichid clar, alb-

    galbui si contine stabilizator. Se dilueaza 1/10 pentru lucru.

    c) Martorul negativ este recoltat de la oi libere de toxoplasmoza. Se

    prezinta ca un lichid clar, alb-galbui si contine stabilizator. Se

    dilueaza 1/10 pentru lucru.

    d) Conjugatul anti-IgG oaie este reprezentat de IgG iepure anti-IgG de

    oaie, cuplata cu peroxidaza. Se prezinta ca un lichid clar, de culoare

    brun-roscata, concentrat de 100 de ori. Contine stabilizator. Se

    dilueaza pentru lucru.

    e) Substratul este o solutie de perhidrol (H2O2) in tampon citrat. Se

    prezinta ca un lichid clar, incolor.

    f) Cromogenul este o solutie concentrata de ABTS. Se prezinta ca un

    lichid clar, de culoare verde si este gata de utilizare.

    g) Diluantul pentru seruri si conjugat este reprezentat de un tampon

    fosfat cu adaos de albumina serica bovina si conservant. Se prezinta

    ca un lichid clar de nuanta verzuie si este gata de utilizare. Prin

    agitare produce spuma.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    12

    h) Solutia de spalare se prezinta ca un lichid clar care prin agitare

    produce spuma. Este concentrat de 10 ori. Se dilueaza pentru lucru.

    i) Reactivul de stopare (NaF) este o pulbere cristalina de culoare alba. Se dizolva in apa distilata pentru lucru.

    Conditii de pastrare : Trusa ELI-Tox-O se pastreaza la 2 - 8 oC, in

    ambalajul original.

    Valabilitate : 6 luni de la data fabricatiei, in conditiile mentionate mai

    sus.

    Informatii generale despre boala : Toxoplasmoza este o zoonoza care

    afecteaza omul si numeroase specii de animale homeoterme si pasari, fiind

    raspandita pe tot globul. Rezervorul de infestare are doua componente si

    anume: abiotica- unde se dezvolta oochisturile si biotica- reprezentata de

    toate speciile de mamifere din genul Felix si Lynx- gazde definitive ale

    parazitului Toxoplasma gondii. Gazdele intermediare sunt reprezentate de

    om si alte homeoterme care se pot manifesta si pot fi si surse de infestare

    cu Toxoplasma gondii. Toxoplasmoza poate fi considerata ca fiind una

    dintre cele mai importante zoonoze, prin impactul social deosebit pe care-l

    are, contaminarea femeii gravide soldandu-se cu avortul sau moartea

    fatului.

    Prin detectarea serologica a toxoplasmozei la ovine se reduc prevalenta

    infestatiei parazitare la acestea, pierderile economice reprezentate de

    avorturi, fatari de produsi neviabili, dar scad si sursele de infestare pentru

    om.

    Principiul metodei : Anticorpii anti Toxoplasma gondii, de tip IgG

    din ser, sunt detectati prin testul ELISA varianta indirecta. In test,

    anticorpii reactioneaza specific cu antigenul Toxoplasma gondii fixat pe

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    13

    imunosorbent (microplaca) si apoi cu conjugatul anti IgG de oaie marcat

    cu peroxidaza. Complexul antigen-anticorp specific- anti IgG oaie

    peroxidaza format, este evidentiat prin actiunea enzimei asupra substratului

    specific (H2O2), cu modificarea culorii unui cromogen (ABTS) care se

    oxideaza, intensitatea culorii fiind determinata fotometric la 405 nm si

    exprimata in unitati densitate optica (DO). Reactia se interpreteaza in

    raport cu valorile DO ale martorilor pozitiv si negativ. Pentru detectia

    anticorpilor din ser anti- Toxoplasma gondii, trusa ELI-ToxO utilizeaza

    un antigen solubil total.

    Instructiuni de folosire:

    Principiul metodei : Anticorpii anti-Toxoplasma gondii, de tip IgG, din ser,

    sunt detectati prin tehnica ELISA, varianta indirecta. In test, anticorpii

    reactioneaza specific cu antigenul Toxoplasma gondii fixat pe

    imunosorbent (microplaca) siapoi cu conjugatul anti-IgG oaie marcat cu

    peroxidaza. Complexul antigen-anticorp specific- anti-anticorp-peroxidaza

    format, este evidentiat prin actiunea enzimei asupra substratului specific

    (H2O2), cu modificarea culorii unui cromogen (ABTS) care se oxideaza,

    intensitatea culorii fiind determinata fotometric la 405 nm. Reactia se

    interpreteaza in raport cu valorile densitatilor optice ale martorilor pozitiv

    si negativ.

    Probe de examinat : Probe de seruri prelevate dupa coagularea sangelui

    recoltat de la ovine. Tuburile cu probe de testat trebuie sa fie inchise

    ermetic pentru a se evita impurificarile de orice fel. Pana la utilizare in test,

    probele se pastreaza la congelator la 20oC.

    Modul de lucru :

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    14

    Materiale necesare in dotarea laboratorului:

    - apa distilata/ deionizata; pipete mono- si multicanal, reglabile si fixe, 2-1000 l; - pipete sticla 10 ml; eprubete/ tuburi polietilena 1-2 ml si sticla 10-20 ml;

    - hartie absorbanta (filtru/sugativa); alcool sanitar;

    - incubator prevazut cu agitare pentru placi ELISA;

    - aparat de spalare automata pentru placi ELISA;

    - fotometru multicanal (uv/vis) cu cititor de placi ELISA la 405 nm si imprimanta.

    Prepararea reagentilor

    Echilibrarea termica a reagentilor:

    Componentele trusei, cu exceptia conjugatului 100X se aduc la temperatura

    camerei cu cel putin 30 minute inainte de lucru. Dupa echilibrare termica se

    agita usor pentru omogenizare. Se vor efectua dilutii conform celor de mai

    jos pentru fiecare placa din trusele ELI-Tox-O.

    Diluarea martorilor de reactie:

    Martorii de reactie, pozitiv si negativ se dilueaza 1/10 in diluantul pentru ser

    si conjugat in modul urmator:

    25 l martor pozitiv 10X + 225 l diluant 25 l martor negativ 10X + 225 l diluant Diluarea probelor de testat:

    Probele de testat (seruri prelevate dupa coagularea sangelui recoltat de la oi)

    se dilueaza 1/100 in diluant pentru ser si conjugat in doua etape in modul

    urmator:

    dilutie 1/10: 10 l proba + 90 l diluant pentru ser si conjugat, dilutie 1/10: 20 l proba diluata 1/10 + 180 l diluant pentru ser si conjugat. Diluarea conjugatului anti - IgG oaie marcat cu peroxidaza:

    Conjugatul anti IgG de oaie marcat cu peroxidaza se dilueaza 1/100 in

    diluant pentru ser si conjugat in modul urmator:

    100 l conjugat + 9,9 ml diluant pentru ser si conjugat.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    15

    Diluarea solutiei de spalare 10X:

    Solutia de spalare se dilueaza 1/10 cu apa distilata in modul urmator:

    30 ml solutie de spalare 10X + 270 ml apa distilata.

    Modul de executare a testului:

    Reactia cu serul:

    Martorul de reactivi: se pipeteaza 100 l diluant pentru ser si conjugat in godeul A1.

    Martorii de reactie (pozitiv si negativ) diluati se distribuie in dublet, cate 100

    l/godeu. Probele de testat (diluate conform instructiunilor de mai sus) se distribuie fiecare in cate un godeu, cate 100 l/godeu (90 probe/placa). Se incubeaza placa 60 minute la 37 oC, cu agitare.Se spala placa de trei ori cu

    250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita usor. Dupa ultima spalare, placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de filtru.

    Reactia cu conjugatul imunoenzimatic:

    Se adauga in toate godeurile cate 100 l conjugat diluat (1/100 in diluant pentru ser si conjugat). Se incubeaza 60 minute la 37 oC, cu agitare.

    Se spala placa de trei ori cu 250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita usor. Dupa ultima spalare, placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de

    filtru.

    Reactia cu substratul specific enzimei:

    Se prepara substratul: peste 11 ml substrat de perhidrol in tampon citrat se

    adauga 0,45 ml solutie ABTS si se agita usor pentru omogenizare. Se

    distribuie in fiecare godeu cate 100 l. Placa se lasa la intuneric, la temperatura camerei. Intre timp, se prepara reactivul de stopare: se dilueaza

    agentul de stopare (NaF) in 6 ml apa distilata.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    16

    Dupa 30 minute placa se citeste la fotometru multicanal, fata de martorul de

    reactivi, la 405 nm si:

    - daca parametrii de validare sunt indepliniti, reactia se stopeaza imediat cu

    50 l/godeu din solutia de stopare - daca parametrii de validare nu sunt indepliniti, se lasa placa pana la 60

    minute dupa care se stopeaza ca mai sus si se citesc valorile finale ale DO

    fata de martorul de reactivi.

    Criterii de validare :

    - Valoarea DO (media) martorului negativ: mai mica de 0,200;

    - Valoarea DO (media) martorului pozitiv: mai mare de 0,800.

    Interpretarea rezultatelor :

    Se calculeaza valoarea S/P pentru fiecare proba conform formulei:

    S/P = (DOproba - DO martor negativ)/ (DOmartor pozitiv - DO martor negativ)

    a) probele pentru care valorile S/P 0,25 sunt considerate pozitive;

    b) probele pentru care valorile S/P < 0,15 sunt considerate negative;

    c) probele pentru care 0,15< S/P 0,25 sunt considerate dubioase si animalele de la care provin trebuie retestate dupa 30 zile.

    Norme de preparare a setului de diagnostic ELISA Eli-Tox-O :

    Prepararea componentelor setului :

    Microplaci ELISA peliculizate/captusite cu antigen

    Microplaci ELISA cu 96 godeuri captusite cu antigen Toxoplasma gondii

    care recunoaste si fixeaza anticorpii specifici din probe de seruri prelevate

    dupa coagularea sangelui recoltat de la oi.

    Modul de preparare:

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    17

    Prepararea antigenului somatic total de Toxoplasma gondii: Antigenul

    somatic total este utilizat pentru captusirea microplacilor de reactie care intra

    in componenta trusei ELI-Tox O.

    Pentru prepararea antigenului Toxoplasma gondii utilizat in tenica ELISA,

    varianta indireacta s-au utilizat paraziti recoltati din exsudatul peritoneal de la

    soareci infestati cu tulpina RH de Toxoplasma gondii.

    Prepararea antigenului se realizeaza in mai multe etape:

    - recoltarea exsudatului peritoneal, cu parazitul sub forma de trofozoid de la

    soarecii inoculati anterior cu tulpina RH de Toxoplasma gondii; recoltarea

    efectuandu-se la 4-5 zile de la inocularea intraperitoneala a soarecilor;

    - reluarea exsudatului peritoneal recoltat de la soareci, pe tampon fosfat salin

    0,01M (PBS) steril, pH=7,4;

    - filtrarea suspensiei parazitare obtinute printr-un filtru de 3mm;

    - prelucrarea suspensiei parazitare filtrate prin 3 cicluri de inghetare -

    dezghetare, urmate de ultrasonicare de 10 ori, 35W/30 sec./ciclu;

    - ultracentrifugarea suspensiei obtinute anterior la 10000 rpm, 40 min la 4 oC;

    - supernatantul reprezinta antigenul solubil total utilizat in tehnica ELISA.

    Continutul de proteina (determinat prin metoda Lowry) al antigenului

    Toxoplasma gondii trebuie sa fie mai mare de 1 mg/ml.

    Antigenul Toxoplasma gondii se depoziteaza la congelator la 20 oC pana ce

    este utilizat la captusirea placilor ELISA.

    Captusirea/peliculizarea placilor cu antigen:

    Antigenul Toxoplasma gondii se dilueaza in hidroxid de sodiu 0,1M si se

    distribuie cate 100 l in godeurile microplacii. Se incubeaza placa timp de 60 minute la 37 oC, cu agitare. Dupa incubare, placile se spala, se trateaza cu

    solutie stabilizatoare si se usuca la 30 oC in curent de aer.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    18

    Controlul peliculizarii cu antigen:

    Se efectueaza prin sondaj, de catre producator, prin tehnica ELISA.

    Modul de ambalare a placilor peliculizate cu antigen:

    Microplacile captusite / peliculizate cu antigen se ambaleaza individual, in

    folie de plastic sau metalizata, etichetata/inscriptionata cu: denumirea

    producatorului;

    denumirea produsului; seria; valabilitatea.

    Conservarea placilor peliculizate cu antigen: La 2 8 oC, in ambalajul

    original.

    Valabilitatea placilor peliculizate cu antigen: 6 luni de la data prepararii, in

    conditiile mentionate mai sus.

    Martor pozitiv anti - Toxoplasma gondii.

    Martorul pozitiv este ser sanguin de oaie obtinut prin imunizarea acesteia cu

    antigen Toxoplasma gondii.

    Modul de preparare:

    Oi adulte sunt imunizate prin inoculare cu trofozoiti de Toxoplasma gondii,

    intraperitoneal, cu 400 000 trofozoiti/ml de inocul.

    Controlul martorului pozitiv:

    Martorul pozitiv trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, de culoare alb-

    galbuie sau slab rosiatica.

    Stabilirea titrului anticorpilor anti Toxoplasma gondii se realizeaza prin

    tehnica ELISA . Densitatea optica a martorului pozitiv trebuie sa fie mai

    mare de 0,800.

    Ambalare si etichetare:

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    19

    In trusa ELI-Tox-O, martorul pozitiv se livreaza prediluat, ambalat in

    flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand cantitatea necesara

    pentru lucru.

    Fiecare flacon va purta o eticheta pe care sunt inscriptionate: numele

    producatorului; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.

    Conditii de pastrare:Martorul pozitiv se pastreaza la 28oC, in ambalajul

    original.

    Valabilitate: Martorul pozitiv este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in

    conditiile de pastrare mentionate mai sus.

    Martorul negativ de oaie utilizat in Eli-Tox-O :

    Martorul negativ este ser sanguin provenit de la ovine libere de

    toxoplasmoza, oi provenite dintr-un efectiv in care nu s-au inregistrat avorturi

    de origine parazitara.

    Controlul martorului :

    Martorul negativ trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, de culoare alb-

    galbuie sau slab rosiatica.

    Stabilirea titrului anticorpilor anti Toxoplasma gondii se realizeaza prin

    tehnica ELISA. Densitatea optica a martorului negativ trebuie sa fie mai mica

    de 0,200.

    Ambalare si etichetare:

    In trusa ELI-Tox-O, martorul negativ se livreaza prediluat, ambalat in

    flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand cantitatea necesara

    pentru lucru.

    Fiecare flacon va purta o eticheta pe care sunt inscriptionate: numele

    producatorului; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    20

    Conditii de pastrare: Martorul negativ se pastreaza la 2 8 oC, in ambalajul

    original.

    Valabilitate: Martorul negativ este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in

    conditiile de pastrare mentionate mai sus.

    Conjugatul imunoenzimatic anti-IgG oaie 100X

    Definitia produsului:

    Conjugatul imunoenzimatic anti IgG oaie este o imunoglobulina de iepure

    anti IgG oaie, cuplata cu peroxidaza, utilizata la determinarea concentratiei

    de anticorpi specifici fata de un antigen patogen, prin testul ELISA, varianta

    indirecta. Produsul se prezinta sub forma unei solutii clare sau usor

    opalescente, de culoare brun-roscata, fara miros.

    Modul de preparare: reagent preparat in S.N. Institutul Pasteur S.A.

    Peroxidaza (produs comercial) se dizolva in solutie de bicarbonat de sodiu si

    se trateaza cu o solutie alcoolica de 2,4-dinitrofluorbenzen 1N la temperatura

    camerei. In continuare, se adauga o solutie de periodat de sodiu si, dupa 30-

    60 minute, etilenglicol 0,16M. Amestecul se dializeaza fata de tampon

    carbonat pH= 9,5. Se adauga imunoglobulina de iepure anti IgG oaie si

    amestecul se tine 2 ore la 20 oC. Conjugatul se stabilizeaza cu borohidrura de

    sodiu, apoi se dializeaza fata de tampon fosfat. Produsul se utilizeaza

    nepurificat. In final, conjugatul obtinut se amesteca cu o solutie

    stabilizatoare.

    Controlul conjugatului:

    Control organoleptic: Produsul trebuie sa fie clar, brun-roscat, fara miros.

    Identificare: Se adauga o picatura de conjugat peste 1 ml solutie de substrat

    (perhidrol in tampon citrat cu cromogen ABTS). Apare imediat o culoare

    intensa, verde, de cromogen oxidat.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    21

    Controlul calitatii conjugatelor s-a efectuat prin determinarea urmatoarelor

    criterii de calitate: raportul absorbantelor proteinei marcate la 403 nm si 280

    nm, specificitatea de specie si capacitatea de anticorp.

    Raportul absorbantelor proteinei marcate reflecta gradul de marcare al

    anticorpului cu enzima (peroxidaza). Acest raport este limitat de capacitatea

    maxima de legare a peroxidazei (sase molecule de peroxidaza la o molecula

    de anticorp), avand valori intre 0,3 0,5.

    Dupa prepararea conjugatelor, acestea sunt diluate 1/10 in tampon fosfat

    0,1M. Citirea absorbantelor se face la un spectrofotometru la lungimile de

    unda de 403 si 280 nm.

    Determinarea specificitatii de specie si a capacitatii de anticorp a

    conjugatului:

    Reactivi: tampon carbonat 0,1 M, pH 9,6; albumina serica bovina (BSA);

    lichid de diluare; ser normal de pasare; ser normal de cal; ser normal de bou;

    ser normal de oaie; ser normal de porc; ser normal de iepure; substrat:

    perhidrol in tampon citrat; cromogen: solutie ABTS; lichid de spalare; solutie

    de stopare.

    Efectuarea determinarii: Se peliculizeaza obisnuit o placa ELISA cu ser

    normal de pasare, de cal, de bou, de oaie, de porc, de iepure, in dilutii 1/100

    in tampon carbonat (cel putin un rand de godeuri pentru fiecare ser de

    specie).

    Dupa spalare, se adauga conjugatul IgG de iepure anti IgG oaie, diluat la

    dilutia de lucru in PBS cu tween si 1% BSA si se incubeaza o ora la 37 oC.

    Dupa spalare, se adauga substratul si cromogenul in conformitate cu

    instructiunile de folosire a trusei.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    22

    Conjugatul se considera specific si cu capacitate de anticorp satisfacatoare

    pentru Ig din specia recomandata omologa daca are DO de cel putin 10 ori

    mai mare decat DO corespunzatoare serurilor heterologe.

    Alegerea dilutiei de conjugat pentru varianta indirecta a testului se face prin

    analiza rezultatelor ELISA obtinute pe placi peliculizate cu antigen

    Toxoplasma gondii si seruri martor de reactie, in sistem analitic complet,

    similar cu cel de diagnostic. S-a ales dilutia de 1/100 pentru conjugat in

    diluantul pentru ser si conjugat.

    Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-O, conjugatul se ambaleaza in

    flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, in cantitate corespunzatoare pentru

    lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii

    producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.

    Conditii de conservare: La 2 8 oC, ferit de lumina, in ambalajul original.

    Valabilitate: 12 luni de la data prepararii, in conditiile de conservare

    mentionate mai sus.

    Prepararea substratului (solutie perhidrol in tampon citrat): Substratul este o

    solutie de peroxid de hidrogen in tampon citrat 2,3%, pH 4. Se utilizeaza

    conform instructiunilor din trusa ELI-Tox-O.

    Caracteristici: Substratul se prezinta ca un lichid clar, incolor, cu pH 4.

    Modul de preparare: Se cantaresc 6,9 g acid citric (C6H8O7 x H2O) si se

    dizolva in 2,5 l apa distilata. Se ajusteaza pH-ul la 4 cu o solutie de NaOH

    30%. Se completeaza cu apa distilata pana la un volum final de 3 l. Se

    controleaza pH-ul final care trebuie sa fie 4. Se adauga cantitatea necesara de

    perhidrol si se sterilizeaza prin filtrare.

    Conditionare: Solutia se conditioneaza in flacoane brune la volume de 11 ml,

    25 ml si 60 ml.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    23

    Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-O, substratul, ambalat in flacoane

    inchise ermetic, se afla in cantitatea necesara pentru lucru. Fiecare flacon va

    purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea

    produsului; numarul seriei; termenul de valabilitate.

    Conditii de pastrare: Substratul se pastreaza la 2 8 oC, ferit de lumina.

    Valabilitate : Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile

    de pastrare mentionate mai sus.

    Prepararea si controlul cromogenului (solutie de ABTS) : Cromogenul este o

    solutie apoasa de ABTS (2,2Azinodi(3-etil) benztiazolin sulfat) 1,5%. Se

    utilizeaza conform instructiunilor din trusa.

    Caracteristicile produsului: Solutie limpede de culoare verde.

    Modul de preparare: Se cantaresc 2,25 g ABTS si se dizolva in 0,15 l apa

    distilata.

    Se sterilizeaza prin filtrare.

    Controlul cromogenului: Solutia de cromogen trebuie sa fie limpede, de

    culoare verde.

    Conditionare: Solutia de cromogen se fioleaza in flacoane, in volume de 0,6

    ml, 1,2 ml sau 3 ml.

    Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-O, cromogenul se ambaleaza in

    cantitatile necesare pentru lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta

    inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea produsului;

    numarul seriei; termenul de valabilitate.

    Conditii de pastrare: Solutia de cromogen se pastreaza la 2 8 oC, ferita de

    lumina, in ambalajul original.

    Valabilitate: Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile

    de conservare mentionate mai sus.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    24

    Prepararea diluantului pentru ser si conjugat : Diluantul pentru ser si conjugat

    este reprezentat de tampon fosfat salin 0,01M cu 1% albumina serica bovina,

    0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si pH 7,2 7,4. Se utilizeaza conform

    instructiunilor din trusa.

    Caracteristicile produsului: Lichid clar cu nuanta verzuie si pH 7,27,4. La

    agitare produce spuma.

    Modul de preparare:

    Solutia A: 12,78 g Na2HPO4 anh.

    76,5 g NaCl

    ad. 9000 ml apa distilata.

    Solutia B: 1,38 g NaH2PO4 x H2O

    8,5 g NaCl

    ad. 1000 ml apa distilata.

    Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 7,2 7,4.

    Se adauga 1% albumina serica bovina, 0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si

    colorantul. Se sterilizeaza prin filtrare si se conditioneaza in flacoane de

    sticla/plastic inchise ermetic la volume de 60 ml, 100 ml, 120 ml.

    Control pe flux: Diluantul pentru ser si conjugat trebuie sa se prezinte ca o

    solutie limpede de nuanta verzuie, cu pH 7,2 7,4.

    Ambalare si etichetare: In trusa, produsul se ambaleaza in cantitate

    corespunzatoare necesarului de lucru.

    Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii

    producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; termenul de valabilitate.

    Conditii de pastrare: Diluantul pentru ser si conjugat se pastreaza la 28 oC,

    in ambalajul original.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    25

    Valabilitate: Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile

    de conservare mentionate mai sus.

    Prepararea solutiei de spalare 10X: Solutia de spalare 10X este reprezentata

    de tampon fosfat salin 0,1M, pH 6,86,9 cu 0,5% tween 20 si 0,01%

    thiomersal. Se utilizeaza la spalarea placilor, conform instructiunilor din

    trusa.

    Caracteristicile produsului: Se prezinta ca un lichid clar care prin agitare

    produce spuma. Daca solutia de spalare 10X prezinta un depozit cristalin, se

    aduce la temperatura camerei si se agita ca toate cristalele sa se dizolve, iar

    apoi se dilueaza conform instructiunilor din trusa.

    Mod de preparare:

    Solutia A: 14,2 g Na2HPO4 anh.

    85 g NaCl

    ad. 1000 ml apa distilata.

    Solutia B: 13,8 g NaH2PO4 x H2O

    85 g NaCl

    ad. 1000 ml apa distilata.

    Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 6,8 6,9. Se adauga

    0,5% tween 20 si 0,01% thiomersal. Solutia se sterilizeaza prin filtrare si se

    conditioneaza in flacoane de 50 ml si 60 ml.

    Control pe flux: Solutia de spalare trebuie sa se prezinte ca un lichid clar cu

    pH- ul cuprins intre 6,86,9. Dupa diluare 1/10 in apa distilata, pH-ul devine

    7,2 7,4.

    Ambalare si etichetare: In trusa, produsul se ambaleaza in cantitate

    corespunzatoare necesarului de lucru.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    26

    Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii

    producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; termenul de valabilitate.

    Conditii de pastrare: Solutia de spalare 10X se pastreaza la 28 oC, in

    ambalajul original.

    Valabilitate: Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile

    de conservare mentionate mai sus.

    Reactivul de stopare : Reactivul de stopare este NaF care se utilizeaza in trusa

    ca solutie 1,5%.

    Se cantaresc 0,09 g/flacon, 0,18 g/flacon sau 0,45 g/flacon.

    Produsul este ambalat in flacoane de sticla/plastic, in cantitate

    corespunzatoare pentru lucru.

    Norme tehnice de control :

    Determinarea intensitatii raspunsului probelor martor

    Intensitatea raspunsului probelor martor se executa prin tehnica ELISA,

    varianta indirecta. Titrurile martorilor de reactie (la dilutia mentionata in

    instuctiunile de folosire a trusei) trebuie sa corespunda normelor tehnice:

    DOn < 0,200 DOp > 0,800

    Aceste valori reprezinta criteriile de validare ale trusei.

    Variabilitate inter-godeuri:

    Martor pozitiv (MP)

    Martor negativ (MN)

    dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, cate 4 godeuri/ser,

    in patru zone ale placii.

    conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    27

    Coeficientul de variabilitate (deviatia standard a replicatelor/media

    replicatelor) trebuie sa fie sub 0,2.

    Variabilitate inter-placii:

    Martor pozitiv (MP)

    Martor negativ (MN)

    dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, 5 placi, cate 4

    godeuri/ser/placa, in patru zone ale placilor.

    conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.

    Coeficientul de variabilitate (deviatia standard a replicatelor/media

    replicatelor) trebuie sa fie sub 0,2.

    Detectabilitatea : Curba de titrare a serului martor pozitiv, aplicat in 9 dilutii

    (1/10; 1/15; 1/20; 1/25; 1/30; 1/35; 1/40; 1/45; 1/50) trebuie sa releve

    proportionalitatea dintre titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si

    valoarea DO. Valoarea limitei de pozitivare (cut-off pozitiv) trebuie sa fie

    mai mica decat valoarea DO a serului martor pozitiv la dilutia 1/20.

    Specificitatea: Determinarea specificitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor

    testa 10 seruri prelevate de la oi confirmate ca fiind negative printr-un alt test

    (testul de imunofluorescenta indirecta).

    Cele 10 seruri trebuie sa fie negative si prin testare cu trusa ELI-Tox-O.

    Sensibilitatea : Determinarea sensibilitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor

    testa 10 seruri negative si 10 seruri pozitive confirmate printr-un alt test

    (testul de imunofluorescenta indirecta).

    Cele 10 seruri negative trebuie sa fie intotdeauna negative si cele 10 seruri

    pozitive sa fie intotdeauna pozitive prin testare cu trusa ELI-Tox-O.

    Reproductibilitatea

    Controlul reproductibilitatii intraplaca:

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    28

    Se vor testa in duplicat 10 seruri negative si 10 seruri pozitive confirmate

    printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).

    Coeficientii de variatie ai densitatilor optice trebuie sa se situeze sub 20%.

    Controlul reproductibilitatii interplaci:

    Se vor testa, pe cate doua placi, 10 seruri negative si 10 seruri pozitive

    confirmate printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).

    Coeficientii de variatie ai densitatilor optice trebuie sa se situeze sub 20%.

    Valabilitate

    Toti parametrii calitativi trebuie sa se reproduca in perioada de valabilitate, in

    conditiile de conservare specificate in normele tehnice.

    Performantele produsului

    Limita de detectie:

    Serurilor martor (pozitiv si negativ) au fost titrate, stabilindu-se limita de

    detectie a testului.

    Curba de titrare a martorului pozitiv, aplicat in 9 dilutii (1/10; 1/15; 1/20;

    1/25; 1/30; 1/35; 1/40; 1/45; 1/50) trebuie sa releve proportionalitatea dintre

    titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si valoarea DO. Rezultate:

    30 min

    dilutie Mp Mn 60 min

    dilutie Mp Mn

    1/10 1.443 0.075 1/10 2.217 0.108

    1/15 1.257 0.057 1/15 1.996 0.078

    1/20 1.068 0.047 1/20 1.690 0.065

    1/25 1.013 0.043 1/25 1.629 0.055

    1/30 0.980 0.038 1/30 1.526 0.048

    1/35 0.924 0.036 1/35 1.447 0.046

    1/40 0.825 0.031 1/40 1.287 0.043

    1/45 0.802 0.029 1/45 1.252 0.041

    1/50 0.759 0.024 1/50 1.168 0.039

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    29

    Controlul valorii de diagnostic al testului ELISA s-a realizat prin efectuarea

    de teste comparative cu alte teste, pe probe din teren (probe de seruri

    provenite de la oi). Astfel, au fost testate 69 probe, iar ca teste comparative

    s-a utilizat testul de imunofluorescenta indirecta (IFI).

    Rezultate: Probele pozitive testate prin IFI au fost pozitive la ELISA, iar cele

    negative s-au prezentat la ELISA ca fiind negative .

    Sensibilitate: (10 probe de la oi, IFI pozitive)

    Martor pozitiv (MP)

    Martor negativ (MN)

    dilutii:

    - pentru martorii de reactie: 1/10 in diluant pentru ser si conjugat

    - pentru probele de testat: 1/100 in diluant pentru ser si conjugat.

    Conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.

    REZULTATE: DO: 1,621 S/P = (1,621 0,075)/(1,443-0,075) = 1,546/1,368 = 1,13

    1,257 S/P = (1,257 0,075)/(1,443-0,075) = 1,182/1,368 = 0,864

    1,033 S/P = (1,033 0,075)/(1,443-0,075)= 0,958/1,368 = 0,700

    0,602 S/P = (0,602 0,075)/(1,443-0,075)= 0,527/1,368 = 0,385

    1,526 S/P = (1,526 0,075)/(1,443-0,075)= 1,451/1,368 = 1,060

    0,454 S/P = (0,454 0,075)/(1,443-0,075)= 0,379/1,368 = 0,277

    1,822 S/P = (1,822 0,075)/(1,443-0,075)= 1,747/1,368 = 1,277

    1,610 S/P = (1,610 0,075)/(1,443-0,075) = 1,535/1,368 = 1,122

    0,509 S/P = (0,509 0,075)/(1,443-0,075)= 0,434/1,368 = 0,317

    0,770 S/P = (0,770 0,075)/(1,443-0,075)= 0,695/1,368 = 0,508

    Mp: 1,443

    Mn: 0,075

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    30

    Valorile S/P seruri testate > 0,25 Concluzie: toate probele testate sunt pozitive.

    Specificitate: (10 probe de la oi, IFI negative)

    Martor pozitiv (MP)

    Martor negativ (MN)

    dilutii:

    - pentru martorii de reactie: 1/10 in diluant pentru ser si conjugat

    - pentru probele de testat: 1/100 in diluant pentru ser si conjugat.

    Conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.

    Rezultate:

    DO: 0,143 S/P = (0,143 0,075)/(1,443-0,075)= 0,068/1,368 = 0,049

    0,254 S/P = (0,254 0,075)/(1,443-0,075)= 0,179/1,368 = 0,130

    0,146 S/P = (0,146 0,075)/(1,443-0,075)= 0,071/1,368 = 0,052

    0,171 S/P = (0,171 0,075)/(1,443-0,075)= 0,096/1,368 = 0,070

    0,155 S/P = (0,155 0,075)/(1,443-0,075)= 0,080/1,368 = 0,058

    0,154 S/P = (0,154 0,075)/(1,443-0,075)= 0,079/1,368 = 0,057

    0,193 S/P = (0,193 0,075)/(1,443-0,075)= 0,118/1,368 = 0,086

    0,271 S/P = (0,271 0,075)/(1,443-0,075)= 0,196/1,368 = 0,143

    0,134 S/P = (0,134 0,075)/(1,443-0,075)= 0,059/1,368 = 0,043

    0,239 S/P = (0,239 0,075)/(1,443-0,075)= 0,164/1,368 = 0,119

    Mp: 1,443

    Mn: 0,075

    Valorile S/P seruri testate < 0,25 Concluzie: toate probele testate sunt negative. Repetabilitate:

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    31

    Au fost testate, din punct de vedere al repetabilitatii, serurile martor si s-au

    obtinut urmatoarele valori ale coeficientilor de variabilitate inter-godeuri:

    Placa 1: citire 30 min. godeu 1 godeu 2 godeu 3 godeu 4 Coef. variab. (%)

    Mp 1.485 1.452 1.432 1.459 1.502 Mn 0.075 0.075 0.072 0.072 2.356 Mp 1.449 1.438 1.463 1.458 0.756 Mn 0.074 0.071 0.069 0.075 3.811 Mp 1.410 1.436 1.428 1.432 0.804 Mn 0.078 0.075 0.075 0.077 1.967 Mp 1.428 1.461 1.435 1.451 1.038 Mn 0.073 0.072 0.077 0.075 2.986

    Placa 2: citire 7 min. godeu 1 godeu 2 godeu 3 godeu 4 Coef. variab. (%)

    Mp 1.465 1.466 1.450 1.458 0.507 Mn 0.076 0.079 0.078 0.077 1.665 Mp 1.436 1.455 1.463 1.463 0.875 Mn 0.078 0.074 0.072 0.079 4.361 Mp 1.399 1.421 1.419 1.430 0.922 Mn 0.079 0.076 0.076 0.081 3.140 Mp 1.413 1.432 1.436 1.445 0.941 Mn 0.075 0.074 0.071 0.075 2.566

    Au fost testate, din punct de vedere al repetabilitatii, serurile martor si

    s-au obtinut urmatoarele valori ale coeficientilor de variabilitate inter-placi: Rezultate: citire 30 minute

    Placa 1 Placa 2 Placa 3 Placa 4 Coef. variab. (%) 1.448 1.470 1.459 1.456 0.624 1.450 1.440 1.452 1.439 0.463 1.443 1.396 1.397 1.399 1.623

    0.0735 0.07225 0.07625 0.07425 2.262 0.0775 0.07575 0.078 0.07375 2.525

    0.07625 0.078 0.078 0.07625 1.604

    Valoarea de diagnostic a testului ELISA, comparativ cu alte teste :

    Valoarea de diagnostic a testului ELISA cu trusa ELI-Tox-O a fost stabilita

    comparativ cu IFI (testul de imunofluorescenta indirecta).

    Au fost testare un numar de probe 69, seruri prelevate de la oi si s-au

    obtinut urmatoarele rezultate:

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    32

    ELI-Tox O IFI

    Probe testate 69 69

    Probe pozitive 43 45

    Probe negative 23 24

    Probe dubioase 3 -

    ELI-Tox-P: Set de diagnostic al toxoplasmozei la porcine

    ELI-Tox P: Ansamblu de componente pentru detectia anticorpilor de tip

    IgG anti-Toxoplasma gondii din serul sanguin de la porcine prin tehnica

    imunoenzimatica (ELISA varianta indirecta).

    Scopul utilizarii : Diagnosticul toxoplasmozei (detectarea anticorpilor de

    tip IgG) pe seruri provenite de la porcine prin tehnica ELISA-varianta

    indirecta.

    Forma de prezentare : Trusa cu componente necesare pentru 92 probe, 184

    probe sau 460 probe.

    Componentele produsului : Trusa ELI-Tox-P cuprinde urmatoarele

    componente, ambalate individual, in cantitati corespunzatoare necesarului

    de lucru: Nr.

    crt.

    Component U/M Cantitate

    pentru 92

    probe

    Cantitate

    pentru 184

    probe

    Cantitate

    pentru 460

    probe

    1. Microplaca ELISA peliculizata cu

    antigen Toxoplasma gondii

    buc. 1 2 5

    2. Martor pozitiv 10X ml 0,1 0,2 0.5

    3. Martor negativ 10X ml 0,1 0,2 0.5

    4. Conjugat anti-IgG porc marcat cu

    peroxidaza

    ml 0,125 0,250 0.600

    5. Substrat de perhidrol in tampon citrat ml 11 22 55

    6. Cromogen (solutie ABTS) ml 0,6 1,2 3

    7. Diluant pentru seruri si conjugat ml 100 120 240

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    33

    8. Solutie de spalare 10 X ml 50 60 120

    9. Reactiv de stopare NaF g 0,09 0,18 0.45

    10. Instructiuni de folosire a trusei buc. 1 1 1

    a) Microplaca ELISA este peliculizata (captusita) cu antigen purificat

    stabilizat de Toxoplasma gondii, spalata si uscata, ambalata in folie de

    plastic sau metalizata, gata de utilizare.

    b) Martorul pozitiv este obtinut de la porci imunizati cu antigen

    Toxoplasma gondii purificat. Se prezinta ca un lichid clar, alb-galbui si

    contine stabilizator. Se dilueaza 1/10 pentru lucru.

    c) Martorul negativ este recoltat de la porci liberi de toxoplasmoza. Se

    prezinta ca un lichid clar, alb-galbui si contine stabilizator. Se dilueaza

    1/10 pentru lucru.

    d) Conjugatul anti-IgG porc este reprezentat de IgG capra anti-IgG de

    porc, cuplata cu peroxidaza. Se prezinta ca un lichid clar, de culoare brun-

    roscata, concentrat de 100 de ori. Contine stabilizator. Se dilueaza pentru

    lucru.

    e) Substratul este o solutie de perhidrol (H2O2) in tampon citrat. Se prezinta

    ca un lichid clar, incolor.

    f) Cromogenul este o solutie concentrata de ABTS. Se prezinta ca un lichid

    clar, de culoare verde si este gata de utilizare.

    g) Diluantul pentru seruri si conjugat este reprezentat de un tampon fosfat

    cu adaos de albumina serica bovina si conservant. Se prezinta ca un lichid

    clar de nuanta verzuie si este gata de utilizare. Prin agitare produce spuma.

    h) Solutia de spalare se prezinta ca un lichid clar care prin agitare produce

    spuma. Este concentrat de 10 ori. Se dilueaza pentru lucru.

    i) Reactivul de stopare (NaF) este o pulbere cristalina de culoare alba. Se

    dizolva in apa distilata pentru lucru.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    34

    Conditii de conservare : Trusa ELI-Tox-P se pastreaza la 2-8 oC, in

    ambalajul original.

    Valabilitate : 12 luni de la data fabricatiei, in conditiile mentionate mai sus.

    Informatii generale despre boala : Toxoplasmoza este o zoonoza care

    afecteaza omul si numeroase specii de animale homeoterme si pasari, fiind

    raspandita pe tot globul. Rezervorul de infestare are doua componente si

    anume: abiotica- unde se dezvolta oochisturile si biotica- reprezentata de

    toate speciile de mamifere din genul Felix si Lynx- gazde definitive ale

    parazitului Toxoplasma gondii. Gazdele intermediare sunt reprezentate de

    om si alte homeoterme care se pot manifesta si pot fi si surse de infestare

    cu Toxoplasma gondii. Toxoplasmoza poate fi considerata ca fiind una

    dintre cele mai importante zoonoze, prin impactul social deosebit pe care-l

    are, contaminarea femeii gravide soldandu-se cu avortul sau moartea

    fatului.

    Prin detectarea serologica a toxoplasmozei la porcine se reduc prevalenta

    infestatiei parazitare la acestea, pierderile economice reprezentate de

    avorturi, fatari de produsi neviabili, dar scad si sursele de infestare pentru

    om.

    Principiul metodei :

    Anticorpii anti Toxoplasma gondii, de tip IgG din ser, sunt detectati prin

    testul ELISA varianta indirecta. In test, anticorpii reactioneaza specific cu

    antigenul Toxoplasma gondii fixat pe imunosorbent (microplaca) si apoi

    cu conjugatul anti IgG de porc marcat cu peroxidaza. Complexul antigen-

    anticorp specific- anti IgG porc peroxidaza format, este evidentiat prin

    actiunea enzimei asupra substratului specific (H2O2), cu modificarea culorii

    unui cromogen (ABTS) care se oxideaza, intensitatea culorii fiind

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    35

    determinata fotometric la 405 nm si exprimata in unitati densitate optica

    (DO). Reactia se interpreteaza in raport cu valorile DO ale martorilor

    pozitiv si negativ.

    Pentru detectia anticorpilor din ser anti- Toxoplasma gondii, trusa ELI-

    ToxoP utilizeaza un antigen solubil total.

    Instructiuni de folosire trusa Eli-Tox-P pentru diagnosticul

    imunoenzimatic al toxoplasmozei la porcine:

    Scopul utilizarii : Eli-Tox-P este o trusa de diagnostic, bazata pe tehnica

    ELISA, varianta indirecta, utilizata in detectarea anticorpilor de tip IgG

    anti-Toxoplasma gondii din seruri de porcine.

    Anticorpii specifici anti-Toxoplasma gondii din serurilerecoltate de la

    porcine recunosc antigenul T. gondii utilizat la captusirea microplacilor.

    Principiul metodei : Anticorpii anti-Toxoplasma gondii, de tip IgG, din ser,

    sunt detectati prin tehnica ELISA, varianta indirecta. In test, anticorpii

    reactioneaza specific cu antigenul Toxoplasma gondii fixat pe

    imunosorbent (microplaca) si apoi cu conjugatul anti-IgG de porc marcat

    cu peroxidaza. Complexul antigen-anticorp specific-anti-anticorp-

    peroxidaza format este evidentiat prin actiunea enzimei asupra substratului

    specific (H2O2), cu modificarea culorii unui cromogen (ABTS) care se

    oxideaza, intensitatea culorii fiind determinata fotometric la 405 nm.

    Reactia se interpreteaza in raport cu valorile densitatilor optice ale

    martorilor pozitiv si negativ.

    Probe de examinat: Probe de seruri prelevate dupa coagularea sangelui

    recoltat de la porcine. Tuburile cu probe de testat trebuie sa fie inchise

    ermetic pentru a se evita impurificarile de orice fel. Pana la utilizare in test,

    probele se pastreaza la congelator la 20oC.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    36

    Modul de lucru :

    Materiale necesare in dotarea laboratorului: apa distilata/ deionizata;

    pipete mono- si multicanal, reglabile si fixe, 2-1000 l; pipete sticla 10 ml; eprubete/ tuburi polietilena 1-2 ml si sticla 10-20 ml; hartie absorbanta

    (filtru/sugativa); alcool sanitar; incubator prevazut cu agitare pentru placi

    ELISA; aparat de spalare automata pentru placi ELISA; fotometru

    multicanal (uv/vis) cu cititor de placi ELISA la 405 nm si imprimanta.

    Prepararea reagentilor

    Echilibrarea termica a reagentilor:

    Componentele trusei, cu exceptia conjugatului 100X se aduc la temperatura

    camerei cu cel putin 30 minute inainte de lucru. Dupa echilibrare termica

    se agita usor pentru omogenizare. Se vor efectua dilutii conform celor de

    mai jos pentru fiecare placa din trusele ELI-Tox-P.

    Diluarea martorilor de reactie:

    Martorii de reactie, pozitiv si negativ se dilueaza 1/10 in diluantul pentru

    ser si conjugat in modul urmator:

    25 l martor pozitiv 10X + 225 l diluant 25 l martor negativ 10X + 225 l diluant Diluarea probelor de testat:

    Probele de testat (seruri prelevate dupa coagularea sangelui recoltat de la

    porci) se dilueaza 1/400 in diluant pentru ser si conjugat in doua etape in

    modul urmator:

    dilutie 1/20: 10 l proba + 190 l diluant pentru ser si conjugat, dilutie 1/20: 10 l proba diluata 1/20 + 190 l diluant pentru ser si conjugat.

    Diluarea conjugatului anti - IgG porc marcat cu peroxidaza:

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    37

    Conjugatul anti IgG de porc marcat cu peroxidaza se dilueaza 1/100 in

    diluant pentru ser si conjugat in modul urmator:

    100 l conjugat + 9,9 ml diluant pentru ser si conjugat. Diluarea solutiei de spalare 10X:

    Solutia de spalare se dilueaza 1/10 cu apa distilata in modul urmator:

    30 ml solutie de spalare 10X + 270 ml apa distilata.

    Modul de executare a testului:

    Reactia cu serul:

    Martorii de reactie (pozitiv si negativ) diluati se distribuie in dublet, cate

    100 l/godeu. Probele de testat (diluate conform instructiunilor de mai sus) se distribuie fiecare in cate un godeu, cate 100 l/godeu (92 probe/placa). Se incubeaza placa 60 minute la 37 oC, cu agitare.Se spala placa de trei ori

    cu 250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita usor. Dupa ultima spalare, placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de filtru.

    Reactia cu conjugatul imunoenzimatic:

    Se adauga in toate godeurile cate 100 l conjugat diluat (1/100 in diluant pentru ser si conjugat). Se incubeaza 60 minute la 37 oC, cu agitare.

    Se spala placa de trei ori cu 250 l lichid de spalare diluat/godeu. Se agita usor. Dupa ultima spalare, placa se usuca bine prin scuturare pe o hartie de

    filtru.

    Reactia cu substratul specific enzimei:

    Se prepara substratul: peste 11 ml substrat de perhidrol in tampon citrat se

    adauga 0,45 ml solutie ABTS si se agita usor pentru omogenizare. Se

    distribuie in fiecare godeu cate 100 l. Placa se lasa la intuneric, la temperatura camerei. Intre timp, se prepara reactivul de stopare: se dilueaza

    agentul de stopare (NaF) in 6 ml apa distilata. Dupa 30 minute reactia se

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    38

    stopeaza imediat cu 50 l/godeu din solutia de stopare si placa se citeste la fotometru multicanal la 405 nm.

    Criterii de validare : - Valoarea DO (media) martorului negativ: mai mica de 0,300;

    - Valoarea DO (media) martorului pozitiv: mai mare de 0,800. Interpretarea rezultatelor :

    Se calculeaza valoarea S/P pentru fiecare proba conform formulei:

    S/P = (DOproba - DO martor negativ)/ (DOmartor pozitiv - DO martor negativ)

    - probele pentru care valorile S/P 0,25 sunt considerate pozitive;

    - probele pentru care valorile S/P < 0,15 sunt considerate negative;

    - probele pentru care 0,15< S/P 0,25 sunt considerate dubioase si animalele de la care provin trebuie retestate dupa 30 zile.

    Norme tehnice de preparare :

    Microplaci ELISA peliculizate/captusite cu antigen

    Definitia produsului: Microplaci ELISA cu 96 godeuri captusite cu antigen

    Toxoplasma gondii care recunoaste si fixeaza anticorpii specifici din

    probe de seruri prelevate dupa coagularea sangelui recoltat de la porci.

    Modul de preparare: Prepararea antigenului somatic total de Toxoplasma

    gondii: Antigenul somatic total este utilizat pentru captusirea microplacilor

    de reactie care intra in componenta trusei ELI-Tox P. Pentru prepararea

    antigenului Toxoplasma godii utilizat in tenica ELISA, varianta indireacta

    s-au utilizat paraziti recoltati din exsudatul peritoneal de la soareci infestati

    cu tulpina RH de Toxoplasma gondii.

    Prepararea antigenului se realizeaza in mai multe etape:

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    39

    - recoltarea exsudatului peritoneal, cu parazitul sub forma de trofozoid de la

    soarecii inoculati anterior cu tulpina RH de Toxoplasma gondii; recoltarea

    efectuandu-se la 4-5 zile de la inocularea intraperitoneala a soarecilor;

    - reluarea exsudatului peritoneal recoltat de la soareci, pe tampon fosfat salin

    0,01M (PBS) steril, pH=7,4;

    - filtrarea suspensiei parazitare obtinute printr-un filtru de 3 mm;

    - prelucrarea suspensiei parazitare filtrate prin 3 cicluri de inghetare -

    dezghetare, urmate de ultrasonicare de 10 ori, 35W/30 sec./ciclu;

    - ultracentrifugarea suspensiei obtinute anterior la 10000 rpm, 40 min. la 4 oC;

    - supernatantul reprezinta antigenul solubil total utilizat in tehnica ELISA.

    Continutul de proteina (determinat prin metoda Lowry) al antigenului

    Toxoplasma gondii trebuie sa fie mai mare de 1 mg/ml.

    Antigenul Toxoplasma gondii se depoziteaza la congelator la 20 oC pana ce

    este utilizat la captusirea placilor ELISA.

    Captusirea/peliculizarea placilor cu antigen: Antigenul Toxoplasma gondii

    se dilueaza in hidroxid de sodiu 0,1M si se distribuie cate 100 l in godeurile microplacii. Se incubeaza placa timp de 60 minute la 37 oC, cu agitare. Dupa

    incubare, placile se spala, se trateaza cu solutie stabilizatoare si se usuca la 30 oC in curent de aer.

    Controlul peliculizarii cu antigen: Se efectueaza prin sondaj, de catre

    producator, prin tehnica ELISA.

    Modul de ambalare a placilor peliculizate cu antigen: Microplacile captusite

    / peliculizate cu antigen se ambaleaza individual, in folie de plastic sau

    metalizata, etichetata/inscriptionata cu: denumirea producatorului; denumirea

    produsului; seria; valabilitatea.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    40

    Conservarea placilor peliculizate cu antigen: La 28 oC, in ambalajul

    original.

    Valabilitatea placilor peliculizate cu antigen: 12 luni de la data prepararii, in

    conditiile mentionate mai sus.

    Martor pozitiv anti-Toxoplasma gondii: Martorul pozitiv este ser sanguin

    de porc obtinut prin imunizarea acestuia cu antigen Toxoplasma gondii.

    Modul de preparare:

    Porci adulti sunt imunizati prin inoculare cu trofozoiti de Toxoplasma gondii,

    intraperitoneal, cu 400 000 trofozoiti/ml de inocul.

    Controlul martorului pozitiv: Martorul pozitiv trebuie sa se prezinte ca un

    lichid clar, de culoare alb-galbuie sau slab rosiatica.

    Stabilirea titrului anticorpilor antiToxoplasma gondii se realizeaza prin

    tehnica ELISA. Densitatea optica a martorului pozitiv trebuie sa fie mai mare

    de 0,800.

    Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, martorul pozitiv se livreaza

    prediluat, ambalat in flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand

    cantitatea necesara pentru lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta pe care

    sunt inscriptionate: numele producatorului; denumirea produsului; numarul

    seriei; valabilitatea.

    Conditii de pastrare: Martorul pozitiv se pastreaza la 28 oC, in ambalajul

    original.

    Valabilitate: Martorul pozitiv este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in

    conditiile de pastrare mentionate mai sus.

    Martor negativ de porc : Martorul negativ este ser sanguin provenit de la

    porcine libere de toxoplasmoza, porci proveniti dintr-un efectiv in care nu s-

    au inregistrat avorturi de origine parazitara.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    41

    Controlul martorului :

    Martorul negativ trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, de culoare alb-

    galbuie sau slab rosiatica.

    Stabilirea titrului anticorpilor antiT. gondii se realizeaza prin tehnica

    ELISA. Densitatea optica a martorului negativ trebuie sa fie mai mica de

    0,300.

    Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, martorul negativ se livreaza

    prediluat, ambalat in flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, continand

    cantitatea necesara pentru lucru.

    Fiecare flacon va purta o eticheta pe care sunt inscriptionate: numele

    producatorului; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.

    Conditii de pastrare:Martorul negativ se pastreaza la 28 oC, in ambalajul

    original.

    Valabilitate: Martorul negativ este valabil 12 luni de la data fabricatiei, in

    conditiile de pastrare mentionate mai sus.

    Conjugatul imunoenzimatic anti-IgG porc 100X : Conjugatul imunoenzimatic

    anti IgG porc este o imunoglobulina de caprare anti IgG porc, cuplata cu

    peroxidaza, utilizata la determinarea concentratiei de anticorpi specifici fata

    de un antigen patogen, prin testul ELISA, varianta indirecta. Produsul se

    prezinta sub forma unei solutii clare sau usor opalescente, de culoare brun-

    roscata, fara miros.

    Modul de preparare: Peroxidaza (produs comercial) se dizolva in solutie de

    bicarbonat de sodiu si se trateaza cu o solutie alcoolica de 2,4-

    dinitrofluorbenzen 1N la temperatura camerei. In continuare, se adauga o

    solutie de periodat de sodiu si, dupa 30-60 minute, etilenglicol 0,16M.

    Amestecul se dializeaza fata de tampon carbonat pH= 9,5. Se adauga

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    42

    imunoglobulina de capra anti IgG porc si amestecul se tine 2 ore la 20 oC.

    Conjugatul se stabilizeaza cu borohidrura de sodiu, apoi se dializeaza fata de

    tampon fosfat. Produsul se utilizeaza nepurificat. In final, conjugatul obtinut

    se amesteca cu o solutie stabilizatoare.

    Controlul conjugatului:

    Control organoleptic: Produsul trebuie sa fie clar, de culoare brun-roscata,

    fara miros.

    Identificare: Se adauga o picatura de conjugat peste 1 ml solutie de substrat

    (perhidrol in tampon citrat cu cromogenABTS). Apare imediat o culoare

    intensa, verde, de cromogen oxidat.

    Controlul calitatii conjugatelor s-a efectuat prin determinarea urmatoarelor

    criterii de calitate: raportul absorbantelor proteinei marcate la 403 nm si 280

    nm, specificitatea de specie si capacitatea de anticorp.

    Raportul absorbantelor proteinei marcate reflecta gradul de marcare al

    anticorpului cu enzima (peroxidaza). Acest raport este limitat de capacitatea

    maxima de legare a peroxidazei (sase molecule de peroxidaza la o molecula

    de anticorp), avand valori intre 0,3 0,5.

    Dupa prepararea conjugatelor, acestea sunt diluate 1/10 in tampon fosfat

    0,1M. Citirea absorbantelor se face la un spectrofotometru la lungimile de

    unda de 403 si 280 nm.

    Determinarea specificitatii de specie si a capacitatii de anticorp a

    conjugatului:

    Reactivi: tampon carbonat 0,1 M, pH 9,6; albumina serica bovina (BSA);

    lichid de diluare; ser normal de pasare; ser normal de cal; ser normal de bou;

    ser normal de oaie; ser normal de porc; ser normal de iepure; substrat:

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    43

    perhidrol in tampon citrat; cromogen: solutie ABTS; lichid de spalare; solutie

    de stopare.

    Efectuarea determinarii: Se peliculizeaza obisnuit o placa ELISA cu ser

    normal de pasare, de cal, de bou, de oaie, de porc, de iepure, in dilutii 1/100

    in tampon carbonat (cel putin un rand de godeuri pentru fiecare ser de

    specie).

    Dupa spalare, se adauga conjugatul IgG de capra anti IgG porc, diluat la

    dilutia de lucru in PBS cu tween si 1% BSA si se incubeaza o ora la 37 oC.

    Dupa spalare, se adauga substratul si cromogenul in conformitate cu

    instructiunile de folosire a trusei.

    Conjugatul se considera specific si cu capacitate de anticorp satisfacatoare

    pentru Ig din specia recomandata omologa daca are DO de cel putin 10 ori

    mai mare decat DO corespunzatoare serurilor heterologe.

    Alegerea dilutiei de conjugat pentru varianta indirecta a testului se face prin

    analiza rezultatelor ELISA obtinute pe placi peliculizate cu antigen

    Toxoplasma gondii si seruri martor de reactie, in sistem analitic complet,

    similar cu cel de diagnostic. S-a ales dilutia de 1/100 pentru conjugat in

    diluantul pentru ser si conjugat.

    Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, conjugatul se ambaleaza in

    flacoane de sticla/plastic, inchise ermetic, in cantitate corespunzatoare pentru

    lucru.

    Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii

    producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; valabilitatea.

    Conditii de conservare: La 2 8 oC, ferit de lumina, in ambalajul original.

    Valabilitate: 12 luni de la data prepararii, in conditiile de conservare

    mentionate mai sus.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    44

    Prepararea substratului (solutie perhidrol in tampon citrat) : Substratul este

    o solutie de peroxid de hidrogen in tampon citrat 2,3%, pH 4. Se utilizeaza

    conform instructiunilor din trusa ELI-Tox-P.

    Caracteristicile produsului: Substratul se prezinta ca un lichid clar, incolor,

    cu pH 4.

    Modul de preparare: Se cantaresc 6,9 g acid citric (C6H8O7 x H2O) si se

    dizolva in 2,5 l apa distilata. Se ajusteaza pH-ul la 4 cu o solutie de NaOH

    30%. Se completeaza cu apa distilata pana la un volum final de 3 l. Se

    controleaza pH-ul final care trebuie sa fie 4. Se adauga cantitatea necesara de

    perhidrol si se sterilizeaza prin filtrare.

    Contro: Produsul trebuie sa se prezinte ca un lichid clar, incolor, cu pH 4.

    Conditionare: Solutia se conditioneaza in flacoane brune la volume de 11 ml,

    22 ml si 55 ml.

    Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, substratul, ambalat in flacoane

    inchise ermetic, se afla in cantitatea necesara pentru lucru.

    Fiecare flacon va purta o eticheta inscriptionata cu: denumirea unitatii

    producatoare; denumirea produsului; numarul seriei; termenul de valabilitate.

    Conditii de pastrare: Substratul se pastreaza la 2 8 oC, ferit de lumina, in

    ambalajul original.

    Valabilitate : Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile

    de pastrare mentionate mai sus.

    Prepararea si controlul cromogenului (solutie de ABTS) : Cromogenul este o

    solutie apoasa de ABTS (2,2 Azino di (3-etil) benztiazolin sulfat) 1,5%.

    Se utilizeaza conform instructiunilor din trusa.

    Caracteristicile produsului: Solutie limpede de culoare verde.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    45

    Modul de preparare: Se cantaresc 2,25 g ABTS si se dizolva in 0,15 l apa

    distilata. Se sterilizeaza prin filtrare.

    Controlul cromogenului: Solutia de cromogen trebuie sa fie limpede, de

    culoare verde.

    Conditionare: Solutia de cromogen se fioleaza in flacoane, in volume de 0,6

    ml, 1,2 ml sau 3 ml.

    Ambalare si etichetare: In trusa ELI-Tox-P, cromogenul se ambaleaza in

    cantitatile necesare pentru lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta

    inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea produsului;

    numarul seriei; termenul de valabilitate.

    Conditii de pastrare: Solutia de cromogen se pastreaza la 2 8 oC, ferita de

    lumina, in ambalajul original.

    Valabilitate: Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile

    de conservare mentionate mai sus.

    Prepararea diluantului pentru ser si conjugat : Diluantul pentru ser si conjugat

    este reprezentat de tampon fosfat salin 0,01M cu 1% albumina serica bovina,

    0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si pH 7,2 7,4. Se utilizeaza conform

    instructiunilor din trusa.

    Caracteristicile produsului: Lichid clar cu nuanta verzuie si pH 7,2 7,4. La

    agitare produce spuma.

    Modul de preparare:

    Solutia A: 12,78 g Na2HPO4 anh.

    76,5 g NaCl

    ad. 9000 ml apa distilata.

    Solutia B: 1,38 g NaH2PO4 x H2O

    8,5 g NaCl

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    46

    ad. 1000 ml apa distilata.

    Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 7,2 7,4. Se adauga 1%

    albumina serica bovina, 0,05% tween 20, 0,01% thiomersal si colorantul. Se

    sterilizeaza prin filtrare si se conditioneaza in flacoane de sticla/plastic

    inchise ermetic la volume de 60 ml, 100 ml, 120 ml.

    Control pe flux: Diluantul pentru ser si conjugat trebuie sa se prezinte ca o

    solutie limpede de nuanta verzuie, cu pH 7,2 7,4.

    Ambalare si etichetare: In trusa, produsul se ambaleaza in cantitate

    corespunzatoare necesarului de lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta

    inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea produsului;

    numarul seriei; termenul de valabilitate.

    Conditii de pastrare: Diluantul pentru ser si conjugat se pastreaza la 2 8 oC, in ambalajul original.

    Valabilitate: Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile

    de conservare mentionate mai sus.

    Prepararea solutiei de spalare 10X : Solutia de spalare 10X este reprezentata

    de tampon fosfat salin 0,1M, pH 6,8 6,9 cu 0,5% tween 20 si 0,01%

    thiomersal. Se utilizeaza la spalarea placilor, conform instructiunilor din

    trusa.

    Caracteristicile produsului: Se prezinta ca un lichid clar care prin agitare

    produce spuma. Daca solutia de spalare 10X prezinta un depozit cristalin, se

    aduce la temperatura camerei si se agita ca toate cristalele sa se dizolve, iar

    apoi se dilueaza conform instructiunilor din trusa.

    Mod de preparare:

    Solutia A: 14,2 g Na2HPO4 anh.

    85 g NaCl

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    47

    ad. 1000 ml apa distilata.

    Solutia B: 13,8 g NaH2PO4 x H2O

    85 g NaCl

    ad. 1000 ml apa distilata.

    Se adauga solutia B peste solutia A pana la un pH de 6,8 6,9. Se adauga

    0,5% tween 20 si 0,01% thiomersal. Solutia se sterilizeaza prin filtrare si se

    conditioneaza in flacoane de 50 ml si 60 ml.

    Control: Solutia de spalare trebuie sa se prezinte ca un lichid clar cu pH- ul

    cuprins intre 6,86,9. Dupa diluare 1/10 in apa distilata, pH-ul devine 7,2

    7,4.

    Ambalare si etichetare: In trusa, produsul se ambaleaza in cantitate

    corespunzatoare necesarului de lucru. Fiecare flacon va purta o eticheta

    inscriptionata cu: denumirea unitatii producatoare; denumirea produsului;

    numarul seriei; termenul de valabilitate.

    Conditii de pastrare: Solutia de spalare 10X se pastreaza la 28 oC, in

    ambalajul original.

    Valabilitate:Produsul este valabil 12 luni de la data prepararii, in conditiile de

    conservare mentionate mai sus.

    Prepararea reactivului de stopare : Reactivul de stopare este NaF care se

    utilizeaza in trusa ca solutie 1,5%.

    Mod de preparare: Se cantaresc 0,09 g/flacon, 0,18 g/flacon sau 0,45

    g/flacon. Produsul este ambalat in flacoane de sticla/plastic, in cantitate

    corespunzatoare pentru lucru.

    Norme tehnice de control :

    Determinarea intensitatii raspunsului probelor martor : Intensitatea

    raspunsului probelor martor se executa prin tehnica ELISA, varianta

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    48

    indirecta. Titrurile martorilor de reactie (la dilutia mentionata in instuctiunile

    de folosire a trusei) trebuie sa corespunda normelor tehnice:

    DOn < 0,300 DOp > 0,800

    Aceste valori reprezinta criteriile de validare ale trusei.

    Variabilitate inter-godeuri:

    Martor pozitiv (MP)

    Martor negativ (MN)

    dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, cate 4 godeuri/ser,

    in patru zone ale placii.

    conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.

    Coeficientul de variabilitate (deviatia standard a replicatelor/media

    replicatelor) trebuie sa fie sub 0,2. Variabilitate inter-placi:

    Martor pozitiv (MP)

    Martor negativ (MN)

    dilutie de lucru: 1/10 in diluant pentru seruri si conjugat, 5 placi, cate 4

    godeuri/ser/placa, in patru zone ale placilor.

    conditii de reactie: conform instructiunilor trusei.

    Coeficientul de variabilitate (deviatia standard a replicatelor/media

    replicatelor) trebuie sa fie sub 0,2.

    Detectabilitatea

    Curba de titrare a serului martor pozitiv, aplicat in 9 dilutii (1/10; 1/15; 1/20;

    1/25; 1/30; 1/35; 1/40; 1/45; 1/50) trebuie sa releve proportionalitatea dintre

    titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si valoarea DO. Valoarea limitei

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    49

    de pozitivare (cut-off pozitiv) trebuie sa fie mai mica decat valoarea DO a

    serului martor pozitiv la dilutia 1/20.

    Specificitatea

    Determinarea specificitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor testa 10 seruri

    prelevate de la porci confirmati ca fiind negativi printr-un alt test (testul de

    imunofluorescenta indirecta).

    Cele 10 seruri trebuie sa fie negative si prin testare cu trusa ELI-Tox-P.

    Sensibilitatea

    Determinarea sensibilitatii se realizeaza prin ELISA. Se vor testa 10 seruri

    negative si 10 seruri pozitive confirmate printr-un alt test (testul de

    imunofluorescenta indirecta).

    Cele 10 seruri negative trebuie sa fie intotdeauna negative si cele 10 seruri

    pozitive sa fie intotdeauna pozitive prin testare cu trusa ELI-Tox-P.

    Reproductibilitatea

    Controlul reproductibilitatii intraplaca:

    Se vor testa in duplicat 10 seruri negative si 10 seruri pozitive confirmate

    printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).

    Coeficientii de variatie ai densitatilor optice trebuie sa se situeze sub 20%.

    Controlul reproductibilitatii interplaci :

    Se vor testa, pe cate doua placi, 10 seruri negative si 10 seruri pozitive

    confirmate printr-un alt test (testul de imunofluorescenta indirecta).

    Coeficientii de variatie ai densitatilor optice trebuie sa se situeze sub 20%.

    Performantele produsului :

    Limita de detectie:

    Serurilor martor (pozitiv si negativ) au fost titrate, stabilindu-se limita de

    detectie a testului.

  • Contract nr. 361/8.12.2006 RAPORT TEHNIC ETAPA III Metode moderne pentru controlul unor boli parazitare ale animalelor cu implicatii in patologia umana

    50

    Curba de titrare a martorului pozitiv, aplicat in 9 dilutii (1/10; 1/15; 1/20;

    1/25; 1/30; 1/35; 1/40; 1/45; 1/50) trebuie sa releve proportionalitatea dintre

    titrul de anticorpi anti Toxoplasma gondii si valoarea DO. Rezultate:

    30 min dilutie

    Mp Mn

    1/10 1.443 0.175 1/15 1.257 0.157 1/20 1.068 0.147 1/25 1.013 0.143 1/30 0.980 0.138 1/35 0.924 0.136 1/40 0.825 0.131 1/45 0.802 0.129 1/50 0.759 0.124

    Controlul valorii de diagnostic al testului ELISA s-a re