RAPORT ŞTIINŢIFIC ŞI TEHNIC – ETAPA 2/2013

Obiectivul etapei

Elaborarea modelului conceptual, obţinerea materialului biologic necesar aplicării

electroterapiei

Rezultate aşteptate

- aprecierea influenţei chimioterapicelor asupra culturilor de viţă-de-vie şi cartof prin

cuantificarea unor compuşi biochimici şi selecţia plantelor sănătoase;

- modelul experimental de eliminare a virusurilor la viţa-de-vie şi cartof prin electroterapie;

- iniţierea culturilor pe variantele experimentale (2 virusuri/specie)

Rezumat

Prezentul proiect propune utilizarea concomitentă a viricidelor ribavirină şi oseltamivir,

în vederea creşterii ratei de eliminare a virusurilor specifice viţei-de-vie şi cartofului, luate în

studiu. Efectul fitotoxic indus de prezenţa chimioterapicelor a fost cuantificat prin ratele de

multiplicare pe variantele experimentale precum şi prin monitorizarea concentraţiilor unor

elemente minerale şi compuşi biochimici ale explantelor cultivate pe mediu. Atât la viţa-de-vie

cât şi la cartof, ratele de multiplicare au scăzut comparativ cu martorul, pe variantele

experimentale şi, odată cu mărirea numărului de zile de tratament, fără a fi înregistrată

mortalitatea inoculilor. În ceea ce priveşte concentraţia unor elemente minerale, azotul şi implicit

proteina brută a crescut semnificativ la V1 comparativ cu martorul, la ambele specii. În mod

similar au evoluat hidraţii de carbon la viţa-de-vie, în timp ce polifenolii totali au înregistrat

valori mai scăzute comparativ cu martorul. Fiecare plantă de viţă-de-vie şi cartof, regenerată în

urma tratamentelor cu viricide a fost testată prin ELISA în vederea stabilirii eficienţei metodei de

devirozare. La viţa-de-vie s-a înregistrat eficienţă maximă în cazul eliminării virusului fleck în

timp ce la GLRaV-1 a fost înregistrată cea mai mare rată (13,3%) la V2 după două subculturi, iar

GFLV a fost eliminat în proporţie de 6,8% la V2 după prima subcultură de tratament. Infecţia

complexă a fost eliminată în proporţie de 100% la GFkV şi doar de 9% la GVA, astfel că a fost

obţinut un număr mic de plante libere de ambele virusuri. La cartof, chimioterapia a fost

eficientă cu o eliminare de 89,8% în cazul PVX1, 91,7% la PVX2, 95,4% la PVY1 la varianta

V3 (20mg/L ribavirină+80mg/L oseltamivir). Dimpotrivă, tratamentul cu chimioterapice nu a

condus la regenerarea de plante libere de virus în cazul infecţiei cu PVY2. Pe baza rezultatelor

obţinute de diverşi cercetători, a fost elaborat modelul experimental de aplicare a unei alte

metode de devirozare care utilizează acţiunea curentului electric. Stimularea electrică a avut loc

în cuva de electroforeză orizontală în tampon salin, cu curenţi de 40, 50, 100 mA, timp de 5, 10,

20 min. Materialul biologic a fost reprezentat atât la viţa-de-vie cât şi la cartof, de fragmente de

lăstari erbacei proveniţi de la plante infectate cu virusuri. Curentul electric nu a produs efecte

detrimentale asupra explantelor cultivate ulterior pe mediu, procesele de caulogeneză

declanşându-se pe toate variantele experimentale. Culturile vor fi monitorizate, iar plantele

regenerate vor fi testate serologic în vederea aprecierii eficienţei metodei.

Descrierea ştiinţifică şi tehnică

1. Desfăşurarea experimentului de chimioterapie in vitro la viţa-de-vie şi cartof: cuantificarea

unor compuşi biochimici - P1

Utilizarea chimioterapicelor în mediul de cultură in vitro în scopul regenerării de plante

de viţă-de-vie libere de virusuri a pus numeroase întrebări, în legătură cu posibilul efect fitotoxic

al acestora asupra explantelor cultivate pe mediu. Experimentele de eradicare a virusului

mozaicului castravetelui la banan (Musa spp.) prin cultură de meristem pe mediu cu virazol sau

DHPA au evidenţiat legătura dintre concentraţia chimioterapicului şi procentul de supravieţuire a

explantelor exprimată prin scăderea ratei de multiplicare (Heliot şi colab., 2001). Faccioli şi

Colombarini (1996) au raportat de asemenea efectul negativ al ribavirinei asupra meristemelor de

cartof, iar Stevenson şi Monette (1983) au observat o mare fitotoxicitate a DHPA la o

concentraţie mai mică de 10 mg/L, aplicată culturilor de ţesuturi de Vitis Vinifera. De

asemenea, fitotoxicitatea chimioterapicelor a fost studiată şi ca influenţă a diferitelor concentraţii

asupra explantelor sănătoase de viţă-de-vie cultivate pe mediu de cultură. Astfel, Panattoni şi

colab., în 2011 a pus în evidenţă o rată de mortalitate a explantelor de 100% începând de la o

concentraţie de 20 mg/L ribavirină, oseltamivirul înregistrând abia la o concentraţie de 40 mg/L

o rată de mortalitate de 11,1%.

Prezentul proiect propune utilizarea concomitentă a viricidelor ribavirină şi oseltamivir,

în vederea creşterii ratei de eliminare a virusurilor specifice viţei-de-vie, luate în studiu. La viţa-

de-vie, nu s-a înregistrat mortalitatea explantelor cultivate pe mediu suplimentat cu

chimioterapice, la nicio variantă experimentală. Procesele de caulogeneză s-au declanşat la

explantele tratate, pe toate variantele experimentale deşi, aspectul culturilor exprimat prin

elongaţia lăstarilor, culoare, este proporţional cu concentraţia chimioterapicelor şi numărul de

zile de tratament.

În cadrul experimentului, evaluarea efectului fitotoxic al viricidelor utilizate a fost

exprimat prin rata de multiplicare, care reprezintă numărul de formaţiuni (muguri adventivi +

primordii de lăstari + lăstari) specifice multiplicării/explant iniţiat.

La genotipul Tămâioasă românească 3-2-2 infectat cu GFkV rata de multiplicare scade

cu creşterea concentraţiei de viricide, comparativ cu martorul, la toate subculturile. Astfel, la V1,

rata de multiplicare înregistrează valori de 2,2 faţă de 3, martorul, la prima subcultură, 3,3

comparativ cu 3,8 la martor la subcultura a doua şi 2,6 faţă de 3,05 după trei subculturi de

tratament (Fig.1.1).

Fig. 1.1 Influenţa concentraţiei viricidelor şi a perioadei de tratament asupra ratei de multiplicare

la genotipul Tămâioasă românească 3-2-2 infectat cu GFkV. Valorile sunt medii, barele indică

deviaţiile standard, ratele de multiplicare nu sunt asigurate statistic

În cazul genotipului Burgund 63 Mn afectat de complexul viral alcătuit din GFkV şi

GVA, rata de multiplicare înregistrează la prima subcultură valorile cele mai mari la V1, scăzând

odată cu scăderea concentraţiei de viricide la V2, respectiv V3. La subcultura a doua ratele scad

aproximativ la jumătate la toate variantele fără a exista diferenţe funcţie de concentraţie. Acest

comportament ar putea fi explicat prin faptul că prezenţa viricidelor în mediu de cultură

determină o stimulare a formării de muguri adventivi care, la următoarea subcultură nu

evoluează în favoarea diferenţierii şi înălţării lăstarilor (Fig.1.2 şi 1.3).

Eliminarea virusurilor prin chimioterapie in vitro a fost încercată şi la alte specii horticole

precum cartoful, metodologia de lucru fiind identică. Efectul fitotoxic al viricidelor a fost

observat la utilizarea diferitelor concentraţii de substanţe. Astfel, la o concentraţie de 50 mg/L

ribavirină sau azacitidina s-a obţinut cel mai mare procent de plante libere de virus, în condiţiile

în care a scăzut procentul de supravieţuire al explantelor tratate (Nasir şi colab., 2010). Aceleaşi

rezultate au fost obţinute şi de AlMaarri şi colab., în 2012, când, concentraţia cea mai mare de

ribavirină (30 mg/L) a condus la cea mai mică rată de elongare.

În experimentul de faţă, efectul fitotoxic generat de utilizarea concomitentă a două

chimioterapice, ribavirină şi oseltamivir a fost evaluat prin rata de multiplicare exprimată prin

numărul de minibutaşi (fragmente uninodale) rezultate prin elongarea unui propagul iniţiat.

La prima subcultură pe chimioterapice indiferent de infecţia virală, genotipul Roclas s-a

comportat prin scăderea ratei de multiplicare la V1, comparativ cu martorul, cu valori chiar

semnificativ mai mici în cadrul infecţiei cu PVY2. Concentraţiile aferente variantelor V2 şi V3

au determinat creşterea ratelor de multiplicare comparativ cu martorul, valorile nefiind însă

asigurate statistic (Fig. 1.4 stg.).

La subcultura a doua, în cadrul tuturor infecţiilor virale, ratele de multiplicare au scăzut

semnificativ la V1 comparativ cu martorul, în timp ce la V2 şi V3 nu se înregistrează în general

diferenţe semnificative (Fig. 1.4 dreapta). Putem spune că la concentraţii până la 20 mg/L

ribavirina şi 80 mg/L oseltamivir, cartoful tolerează mai bine prezenţa chimioterapicelor.

Evaluarea ratei de multiplicare la V1, pe parcursul celor trei culturi succesive, la toate

infecţiile virale a pus în evidenţă rezultate diferite funcţie de tipul virusului. Astfel, la PVX1 rata

de multiplicare creşte cu numărul de zile de tratament, în timp ce la PVX2 scade.

Cele două izolate ale virusului Y al cartofului se comportă oarecum similar, cu o scădere

a ratei la subcultura a doua, după care aceasta creşte din nou (Fig. 1.5 şi 1.6). Aceste rezultate ne

conduc la concluzia că lumea vie se conduce după propriile reguli, fiecare individ, în cazul

Fig 1.2 Ratele de multiplicare la genotipul

Burgund 63 Mn infectat cu complexul viral

alcătuit din GFkV şi GVA

Fig. 1.3 Efectul fitofoxic la Burgund

63Mn. Stânga.- martor,

dreapta - V1 subcultura 3

nostru explantul iniţiat pe mediu de cultură suplimentat cu chimioterapice, se comportă singular

datorită genealogiei sale.

Metabolismul hidromineral prezintă o serie de particularităţi care îl deosebeşte de

metabolismul glucidelor, lipidelor şi protidelor. Elementele minerale nu sunt biosintetizate de

plante sau animale şi nici nu sunt catalizate în compuşi mai simpli. Concentraţia în interiorul şi

exteriorul celulelor se menţine în limite fiziologice normale relativ constante. Procesul complex

de menţinere constantă a compoziţiei chimice din interiorul celulelor poartă numele de

homeostazie.

Analiza elementală prin combusţie uscată (metoda DUMAS) a plantulelor supuse

chimioterapiei a pus în evidenţă, la fel ca la prima subcultură, şi la a doua, un dezechilibru între

concentraţiile în elementele, datorită prezenţei în mediul de cultură a viricidelor ribavirină şi

oseltamivir. Astfel, azotul a crescut semnificativ comparativ cu martorul la concentraţia cea mai

Fig. 1.4 Influenţa concentraţiei viricidelor şi timpului de tratament comparativ cu martorul,

asupra ratei de multiplicare, la prima (stg.) respectiv a doua (dreapta) subcultură a

genotipului Roclas infectat cu câte 2 izolate ale virusurilor PVX şi PVY. Valorile sunt

medii, barele indică deviaţia standard, steluţa indică semnificaţia diferenţei la P<0,05

Fig. 1.5 Rata de multiplicare indusă de cea mai

mare concentraţie de viricide (V1), pe parcursul a

trei subculturi consecutive, la genotipul Roclas

infectat cu câte două izolate ale PVX şi PVY

Fig. 1.6 Vitroplante de cartof, V1S3

(stânga) comparativ cu martorul

(dreapta), genotip Roclas infectat cu

PVX2

mare de viricide, carbonul şi sulful s-au menţinut la valori apropiate, în timp ce hidrogenul a

înregistrat variaţii proporţionale cu concentraţia chimioterapicelor (Fig. 1.7).

Fig.1.7 Concentraţia în elemente minerale la plantulele cultivate pe medii cu chimioterapice

aparţinând genotipului Fetească neagră 7Od, infectat cu GFLV, după două subculturi.

Valorile sunt medii, barele reprezintă deviaţiile standard, literele indică semnificaţiile

diferenţelor la P<0,05

Dozarea glucidelor solubile şi a amidonului (metoda cu antronă, Pánczél şi Eifert, 1960)

din plantulele de viţă-de-vie supuse chimioterapiei a pus în evidenţă o variaţie direct

proporţională a concentraţiilor acestor compuşi biochimici, cu concentraţia viricidelor utilizate în

mediul de cultură, la subcultura a doua şi a treia. Comparativ cu martorul, valorile acestor

compuşi au crescut pe variantele experimentale.

Patogenii induc un răspuns defensiv în plantele gazdă care le protejează împotriva

aceluiaşi sau altui agent infecţios. Răspunsul la infecţie este distribuit sistemic în plantă şi

produce o rezistenţă sistemică dobândită. Inducerea căilor fenilpropanoidelor pare să constituie

un rol important în răspunsul de rezistenţă. Activarea acestora produce acumularea metaboliţilor

fenolici care ar putea avea activitate antivirală (Kassemayer şi colab., 1997). Dozarea

polifenolilor totali (Singleton şi Rossi1965) şi a celor flavonoizi (Zhishen şi colab. 1999) a

condus indirect la aprecieri asupra polifenolilor neflavonoizi (stilbeni, resveratrol), care ar fi

responsabili cu rezistenţa la atacul agenţilor patogeni. Acest lucru nu se confirmă în cazul

experimentului de chimioterapie, concentraţia în polifenoli totali fiind mai mică pe variantele

experimentale, comparativ cu martorul, după 2-3 subculturi de tratament. În ceea ce priveşte

conţinutul în proteină brută acesta a crescut datorită creşterii conţinutului în azot (N total x 6,25),

în mod paradoxal, pe variantele cu chimioterapice, comparativ cu martorul netratat (Tabelul 1.1)

Bibliografie

Pánczél, M., Eifert, J., 1960 - Die Bestimung des Zuckerund Stärkegehaltes der Weinrebe

mittels Anthronreagens. Mitt. Klosterneuburg 10:102–110. Singleton VL, Rossi JA (1965) - Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-

phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic 16 (3):144-158. Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W (1999) - Research on antioxidant activity of flavonoids

from natural materials. Food Chem 64:555-559.

Tabelul 1.1

Concentraţia unor compuşi biochimici, sub influenţa chimioterapicelor după două respectiv trei

subculturi de tratament, la genotipul Fetească neagră 7Od infectat iniţial cu GFLV

Subcultura Varianta Glucide

solubile

% s.u.

Amidon

% s.u.

Polifenoli

totali

g acid galic/

100 g s.u.

Flavonoide

totale

g catechina/

100 g s.u.

Proteina

bruta

%

S 2 V1 8,8 3,6 2,6 0,7 42,2

V2 5,6 2,4 5,4 2,3 34,4

V3 5,3 1,9 5,6 2,4 32,8

Martor 4,7 2,0 6,2 2,7 30,8

S 3 V1 5,6 3,1 9,1 2,7 33,7

V2 5,8 2,5 8,9 2,7 36,2

V3 3,5 3,0 11,2 2,9 29,8

Martor 4,1 3,0 11,6 2,7 29,8

2. Evaluarea acţiunii chimioterapicelor asupra dezvoltării plantulelor de cartof pe parcursul

subculturilor prin cuantificarea unor compuşi biochimici - P2

Nutriţia minerală a plantelor este un proces fiziologic de aprovizionare a plantelor cu

substanţe nutritive. Plantele verzi absorb în mod predominant substanţele minerale, din care, prin

asimilaţie clorofiliană, sunt sintetizate substanţele organice.

Elementele chimice, din nutriţia plantelor cu substanţe anorganice sau cu substanţe

organice, devin elemente de constituţie ale unor substanţe care participă la structura

protoplasmei şi a pereţilor celulari. De asemenea, aceste elemente intră şi în structura chimică a

unor substanţe energetice, dintre care cele mai importante sunt hidraţii de carbon, grăsimile şi

proteinele, care, prin degradare aerobă sau anaerobă, furnizează energia necesară proceselor

vitale.

Azotul este un element plastic. Este unul dintre elementele fundamentale ale vieţii

plantelor. Necesarul de azot al diferitelor specii de plante este variabil; astfel, sfecla de zahăr,

cartoful, cânepa, varza, tomatele, cerealele necesită mari cantităţi de azot. Cât priveşte sulful, el

intră în constituţia chimică a unor aminoacizi, a unor enzime şi a unor coenzime.

Analiza elementelor în plantulele de cartof tratate cu chimioterapicele ribavirină şi

oseltamivir a dorit să evalueze un posibil efect fitotoxic al viricidelor asupra dezvoltării

explantelor, în vederea stabilirii dozelor de tratament care să permită supravieţuirea culturilor,

coroborată implicit cu eliminarea infecţiei virale. Astfel, concentraţia cea mai mare în ribavirina

(V1) a condus la ambele izolate ale virusului X al cartofului, la scăderea conţinutului în azot

după prima subcultură, urmată de creşterea acestuia la subculturile doi şi trei, comparativ cu

martorul. În ceea ce priveşte concentraţia de sulf, valorile sunt în general mai mici comparativ

cu martorul la ambele suşe virale (Tabelul 2.1).

Comparaţii ale concentraţiilor în proteina brută, la plantulele infectate cu cele două

izolate ale virusului X, supuse acţiunii chimioterapicelor, au evidenţiat valori descrescătoare

odată cu scăderea concentraţiei viricidelor, dar mai mari comparativ cu martorul, la subcultura a

doua (Fig. 2.1).

Tabelul 2.1

Concentraţia în elemente minerale în plantulele de cartof pe parcursul a două subculturi,

sub influenţa celei mai mari concentraţii de chimioterapice, la genotipul Roclas infectat artificial

cu două izolate ale PVX

Virus Element Varianta Subcultura1 Subcultura 2 Subcultura 3

PVX 1

N % V1 8,26 11,08 11,42

M 9,22 9,04 10,19

C % V1 36,65 32,97 33,07

M 34,90 35,03 33,80

S % V1 0,61 0,97 0,58

M 0,72 0,67 0,81

H % V1 5,23 4,82 4,98

M 5,02 4,533 5,18

PVX 2

N % V1 8,96 10,91 10,51

M 9,12 9,11 9,22

C % V1 35,42 32,60 33,98

M 32,12 34,36 34,26

S % V1 0,38 0,49 0,64

M 0,58 0,60 0,82

H % V1 4,95 5,14 5,26

M 5,16 4,87 5,04

După trei subculturi consecutive pe medii suplimentate cu chimioterapice, explantele

infectate cu PVX s-au comportat prin creşterea conţinutului în proteină brută la V1 comparativ

cu martorul, în timp ce la explantele infectate cu PVY a scăzut concentraţia în proteină (Fig. 2.2).

Fig. 2.1 Influenţa viricidelor asupra

conţinutului în proteină brută la explantele

de cartof infectate cu PVX1 şi PVX2 după

două subculturi

Fig. 2.2 Influenţa viricidelor asupra

conţinutului în proteină brută

la explantele de cartof infectate cu PVX

şi PVY după trei subculturi de tratament

3. Actualizarea cercetărilor privind eradicarea virusurilor specifice viţei-de-vie şi cartofului

prin electroterapie -CO

Tehnicile tradiţionale de însănătoşire la plante au eşuat în producerea unor cantităţi

suficiente de material sănătos la cele mai multe specii. Deşi din punct de vedere teoretic

fenomenul nu este bine cunoscut, tratamentele care utilizează curentul electric ar putea deveni un

mod de a rezolva această problemă. Electroterapia poate fi explicată ca o termoterapie la nivel

celular, cu temperatură controlată, la care are loc inactivarea nucleoproteinei virale. Probabil

inactivarea preferenţială a particulelor are loc în timpul transportului lor prin spaţiul apoplastic şi

nu în timpul şederii lor în interiorul celulei. De asemenea, pulsurile electrice au fost folosite

pentru stimularea organogenezei și creșterii.

Black (1971) a demonstrat relaţia între stimularea creşterii la plantele de tomate tratate cu

curent electric de joasă densitate (3-15 µA/plantă) timp de 4, 5, 24 ore. Blanchard (1974)

aplicând pulsuri de 1-4 A DC, la 6500 V/oră, după 2-3 zile a observat absenţa microflorei în

ţesuturile tratate. Aceste rezultate stau la baza conceptului de electroterapie. Efectele curentului

electric a fost studiat la butaşi de portaltoi de viţă-de-vie lungi de 30 cm plasaţi orizontal şi

traversaţi de un curent de 30, 60 V, timp de 3, 6, 9 ore. A fost studiată rata de înrădăcinare,

numărul şi greutatea rădăcinilor în funcţie de tratamente. La un curent de 30 V toţi parametrii au

crescut cu creşterea duratei de tratament, în timp ce la 60 V au scăzut când timpul a depăşit 3

ore. Tratamentul cu 60 V - 3 ore a prezentat cea mai mare rată de înrădăcinare (122%) şi număr

de rădăcini (100%) comparativ cu martorul. Aceste rezultate indică posibilitatea îmbunătăţirii

propagării la portaltoii care prezintă dificultăţi de înrădăcinare (Köse, 2007).

Electroterapia a fost aplicată pentru eradicarea PVX din diferite clone infectate (Lozoya–

Saldana și colab., 1996). Utilizând un aparat de electroterapie realizat în Cuba (Patent Cuba

37/95 AO IC/08 1524/97), Hernández şi colab.,1995 au tratat usturoiul (Allium sativum L),

trestia de zahăr (Sacharum sp. hibrido L), cartoful (Solanum tuberosum L) şi araceas

(Xanthosomas şi Colocasia) pentru eliminarea Potyvirusurilor, Carlavirusurilor şi

Luteovirusurilor. În cazul bananului (Musa sp., soiul Bungulan), Hernández şi colab., 1997 au

raportat eliminarea BSV la aproximativ 40-80% din plantele regenerate.

Butaşi de viţă-de-vie proveniţi de la plante infectate cu GFLV au fost supuşi la 34 V/cm

timp de 3 ore. De asemenea, plantele au fost supuse la 1 V/cm şi au fost prelevate probe de

frunze după 1, 5,10, 20, 30, 40, 50, 60 de zile. Evaluarea ELISA a arătat că valorile citirilor

obţinute din probe de plante mamă infectate supuse la 1 V/cm descresc cu creşterea timpului de

tratament, numai până la 60 de zile de aplicare a câmpului electric după care s-au stabilizat.

Totuşi, plantele regenerate din butaşii care au fost supuşi curentului electric au rămas pozitive

pentru GFLV (Burger, 1989).

În experimentele privind eliminarea GVA prin electroterapie, cele mai bune rezultate

(40% plante de viță-de-vie libere de virusuri), s-au obținut la 30 mA – 15 min (Bayati și colab.,

2011).

La noi în ţară a fost iniţiat un număr restrâns de cercetări privind utilizarea curentului

electric în obţinerea de plante libere de virusuri sau studii privind comportamentul plantelor în

câmp electric.

Câmpul electric aplicat plantelor de viță-de-vie infectate cu GLRaV-3 a condus la

obținerea unor rate mari de devirozare (57,1%-100%), fără corelații directe între perioada de

expunere și eficiența tratamentului (Guță și colab, 2008) .

Utilizarea electroterapiei cu curent electric alternativ, urmată de cultura in vitro a fost

investigată ca tehnică alternativă pentru eliminarea virusurilor la vița-de-vie cu infecții simple

sau mixte. Studiul a avut în vedere cele mai păgubitoare virusuri la vița-de-vie: GFLV, ArMV,

GLRaV-1, GLRaV-3, GFkV. Curent electric de 1000 și 10 000 kHz a fost aplicat la capetele

butașilor erbacei de viță-de-vie; mugurii axilari tratați au fost inoculați pe mediul de bază M&S

conținând regulatori de creștere. Analiza ELISA a plantelor regenerate și aclimatizate a prezentat

rezultate încurajatoare privind eliminarea virusurilor filamentoase GLRaV-1 și GLRaV-3 (12,5

% eliminare la 100 kHz și respectiv 4,5% la 10 000 kHz, după 10 min de tratament). Rezultatele

nu au fost reproductibile în cazul GLRaV-1 pentru eliminarea din plante cu infecțiile mixte. Nu

s-au obținut rezultate satisfăcătoare privind eliminarea virusurilor izodiametrice (GFLV, GFkV)

în infecții simple sau mixte (Guță și colab., 2011; Guță și Buciumeanu, 2012).

În literatura de specialitate din ultimele trei decenii există numeroase referiri la metode

inedite de devirozare a materialului biologic provenit din plante infectate prin utilizarea culturilor

in vitro a plantelor supuse unor tratamente electroterapice şi apoi multiplicate pe medii cu

diferite concentraţii de viricide. Astfel, în 1983, Klein şi Livingstone specificau că virusurile

cartofului PVX şi PVY au fost eliminate din microplante prin chimioterapie utilizând Ribavirin

sau Virazole (1-β-D-ribofurasonyl-1,2,4 triazone-3-carboxamide), dar timpul necesar pentru

regenerarea plantelor a fost mult mai lung decât la controalele netratate. Alţi cercetători

(Griffiths şi al. 1990) au remarcat o scădere a concentraţiei virusurilor X şi Y ale cartofului prin

aplicarea combinată a electroterapiei şi chimioterapiei la cartof. Ei au folosit doar ribavirina ca

viricid (concentraţii de 20mg/L, 40mg/L şi 60mg/L), iar pentru electroterapie au utilizat variante

în care intensitatea curentului era de maxim 80mA, iar durata maxima 15 minute. Danci şi colab.

(2012) au efectuat de asemenea cercetări prin care urmăreau creşterea gradului de devirozare la

microplantele de cartof prin chimioterapie şi electroterapie, rezultatele prezentate fiind

deocamdată preliminare. Lozoya-Saldana şi colab., în 1996 au remarcat o mărire substanţială a

gradului de devirozare a materialului inoculat cu virusul X al cartofului, efectul fiind benefic în

special în variantele care vizau intensităţi mari ale curentului (40 mA, respectiv 60 mA) şi la

durate mari ale tratamentelor (30 minute). Din păcate, procentul plantelor care au supravieţuit

acestor electroterapii a fost scăzut, ceea ce a condus la o scădere drastică a eficienţei

electroterapiei. Mahmoud şi colab. (2009) au efectuat cercetări pentru eliminarea virusului Y din

plantele de cartof aplicând chimioterapia, electroterapia şi termoterapia. Ca variante pentru

electroterapie, ei au folosit 5mA, 10mA şi 15 mA, iar duratele de tratament au fost 5, 10

respectiv 15 minute. Aplicând doar electroterapia, gradul de regenerare a fost de 53.8, 72.7 şi

87.5% pentru durata cea mai mare de tratament. Aplicate simultan, chimioterapia si

electroterapia eficienţa devirozării a fost mai mare, procentul plantelor identificate ca libere de

virus fiind 66.7% cu 5 mA, 90.0% cu 10 mA şi 100.0% la 15 mA.

Bibliografie

Bayati Sh., Shams-Bakhsh M., Moieni A., 2011 - Elimination of Grapevine Virus A (GVA) by

Cryotherapy and Electrotherapy. J. Agr. Sci. Tech. 13, 443-450.

Danci M., Danci O., Mike L., Baciu A., Olaru D., Petolescu C., Berbentea F., David I., 2012.-

Production of virus free potato plantlets, Journal of Horticulture, forestry and

Biotechnology 16(1), 232-238.

Griffiths H.M., Slack S.A, Dodds J.H., 1990 - Effect of chemical and heat therapy on virus

concentrations in in vitro potato plantlets. Canadian Journal Botanic, 68, 1515-1521.

Guţă I.C. și Buciumeanu E.C., 2012 - Chemotherapy and electrotherapy: environmental friendly

methods for virus elimination in grapevine. Paper and abstract proceedings - 14th

Serbian congress of fruit and grapevine producers with international participation,

Vrnjačka Banja, Serbia, 9-12.10.2012, 207 [ISBN 978-86-7834-163-2].

Guță I.C., Buciumeanu E.C., Oprescu B., Tătaru L., 2011 - Effect of direct electric current on

virus elimination in grapevine. Proceedings of the 4th International Symposium New

Researches in Biotechnology Simp BTH 2011 (ISSN 124-7774), Bucharest, 41-50, (Al

IV-lea Simpozion Internațional de Biotehnologii – Simp BTH 2011.

Guţă C., Buciumeanu E., Vişoiu E., Teodorescu Al., Liţă I., 2008 – The effect of electric field

on in vitro regenerative processes and grapevine virus elimination. Simpozion aniversar:

A 10-a aniversare a specializării de״ ,״A 60-a aniversare a Facultăţii de Horticultură״

peisagistică23 ,״ mai 2008, Bucureşti. Lucrări ştiinţifice, UŞAMV, Seria B – LI -2008-

Horticultură, 481-486.

Klein R.E. and Livingston C.H., 1983 - Eradication of potato viruses X and S from potato shoot

tip cultures with ribavirin. Phytopathology, 73, 1049-1050.

Kleinhempel D., Schenk G., Bittner H., Gase G., Kurzinger B., 1990 - Determination of virus

resistance under in vitro conditions. Potato Research 5, 341-342.

Lozoya-Saldana H., Abello F.J., Garcia G.R., 1996 - Electrotherapy and shoot tip culture

eliminate potato virus x in potatoes. Am. J. Potato Res. 73, 149-154.

Mahmoud S.Y.M, Hosseny M.H., Abdel-Ghaffar M.H., 2009 - Evaluation of some therapies to

eliminate Potato Y Potyvirus from potato plants, International Journal of Virology 5, 64-

76

Panattoni A., Luvisi A., Triolo E, 2013 - Elimination of viruses in plants: twenty years of

progress. Spanish Journal of Agricultural Research 11(1), 173-188.

Simpkins I., Walkey D.G.A, Neely H.A., 1981 - Chemical supression of virus in cultured plant

tissues. Ann. Applied Biol. 99, 161-169.

http://students.nri.org/exstudents/bene/chapter 2.pdf [accesat 15.05.2013]

4. Obţinerea plantelor de viţă-de-vie necesare aplicării electroterapiei ca metodă de devirozare

- P1

Plantele de viţă-de-vie selecţionate din materialul amelioratorului, infectate cu virusuri au

lărgit colecţia de plante virozate a Institutului, constituind material de studiu în experimentele de

devirozare. Stimularea electrică în cuva de electroforeză orizontală necesită o cantitate

apreciabilă de lăstari erbacei pentru a acoperi toate variantele experimentale. De aceea a fost

necesară obţinerea loturilor de plante prin butaşi de un ochi care să asigure materialul biologic

util.

Plantele mamă infectate parcurg fenofazele de vegetaţie în sera ce adăposteşte colecţia de

plante virozate. Astfel, sunt protejate de temperaturile scăzute din timpul iernii, care ar putea

afecta viabilitatea mugurilor principali ai ochiului de iarnă. Cu toate că mediile valorilor minime

ale temperaturilor înregistrate la staţia meteo a Institutului au înregistrat cele mai mici valori în

luna ianuarie (- 4,10C), pentru siguranţă, a fost verificat gradul de maturare al coardelor utilizate

la înmulţire.

Prin secţiuni transversale în ochiul de iarnă a fost apreciată viabilitatea complexului

mugural, dozarea conţinutul în zaharuri solubile şi amidon realizându-se prin metoda cu antronă

(Pánczél şi Eifert, 1960).

Determinările au fost realizate pe coarde recoltate de la plante de viţă-de-vie aparţinând

genotipurilor Tămâioasă românească 3-2-2 infectată cu GFkV şi Frâncuşă 15 Od infectată cu

GLRaV-1.

Viabilitatea mugurilor verificaţi a fost de 100% la ambele genotipuri, iar în ceea ce

priveşte conţinutul în hidraţi de carbon, valorile au fost cuprinse între 6,5-7,9 % s.u. zaharuri

solubile şi între 5,9-6,6 % s.u. amidon. Aceste rezultate au arătat că plantele de viţă-de-vie au

parcurs în condiţii bune perioada de iarnă şi mugurii pot fi utilizaţi la obţinerea de noi plante prin

butaşi de un ochi.

Coardele recoltate de la plantele mamă au fost fragmentate în porţiuni uninodale care au

fost umectate, parafinate, stratificate şi în final plantate la ghiveci pe substrat nutritiv, conform

tehnologiei de înmulţire.

Astfel, au fost obţinute noi plante care au constituit sursa de lăstari necesară aplicării

electroterapiei, în vederea regenerării de noi plante libere de virus.

Bibliografie

Pánczél M., Eifert J., 1960. Die Bestimung des Zuckerund Stärkegehaltes der Weinrebe mittels

Anthronreagens. Mitt. Klosterneuburg 10, 102–110.

5. Obţinerea plantelor de cartof necesare aplicării electroterapiei ca metoda de devirozare - P2

S-a ales un soi românesc, brevetat în ultimii ani, mediu rezistent la virusul Y al

cartofului: ROCLAS creat la INCDCSZ Braşov. S-a realizat inocularea manuală, utilizând praf

de carborundum şi suc de la infectori specifici. Infectorii folosiţi pentru inoculare au fost

- pentru virusul Y al cartofului, plante din izolatul Ackersegen (infecţie secundară)

IZOLAT 2 (PVYN)

- pentru virusul X cartofului, plante din soiul Bintje (infecţie secundară) IZOLAT 2

Pentru testarea virotică a materialului, prelevarea sucului s-a făcut doar din frunze,

conform protocolului următor: materialul vegetal se presează într-o presă specială cu valţuri

netede, sucul se colectează într-o fiolă şi se diluează în proporţie de 1:4 cu soluţie tampon de

extracţie. Din această fiolă, sucul diluat este transferat automat (multipipeta SUMAL AD96) pe

microplăcile de polistiren (MaxisorpNunc) căptuşite în prealabil cu anticorpii specifici.

Toate soluţiile tampon (de spălare, de diluare IgG, conjugat, tampon substrat) au fost

preparate în cadrul laboratorului de virologie. Tot în cadrul INCDCSZ Braşov au fost obţinute şi

IgG+conjugatul –kit-urile necesare pentru diagnosticarea virusurilor X, S, M, Y). Pentru testarea

virusurilor A şi virusul răsucirii frunzelor s-au folosit kit-uri provenite de la Bioreba (Elveţia), iar

diluţiile folosite în cazul tuturor virusurilor au fost 1:1000, cu excepţia testării virusurilor X şi S,

caz în care diluţia a fost de 1: 1500. Citirea absorbanţelor la 405nm s-a făcut cu ajutorul

cititorului Tecan (software Magellan), iar cut-off s-a calculat prin dublarea mediei valorilor

obţinute pentru controalele negative.

Menţionăm că probele au fost testate pentru toate cele 6 virusuri pentru a păstra doar

materialul sănătos. Numai acest material a fost inoculat cu virusurile X şi Y (câte 2 infectori

pentru fiecare virus). După inoculare (34 zile), probele au fost retestate pentru a identifica

materialul virozat, necesar pentru multiplicare şi pentru experimentarea viricidelor.

6. Stabilirea variantelor experimentale (caracteristicile curentului electric, timp de expunere,

genotipuri, virusuri/complexe virale – CO

Bolile virale sunt produse atât la animale cât şi la plante de particule microscopice al

căror material genetic conţine ADN sau ARN în interiorul unei proteine de căptuşire. Odată ce

au infectat o plantă, virusurile au capacitatea de a se multiplica pe baza modificării

metabolismului celulei gazdă care, în loc să sintetizeze compuşi proprii, produce constituienţi

virali. Plantele infectate nu se pot însănătoşi, ci prin diverse metode, (cultura de meristem şi/sau

termoterapia, chimioterapia, electroterapia, crioterapia), poate fi blocată multiplicarea virală şi

pot fi regenerate plante sănătoase, de regulă prin culturi de ţesuturi.

Electroterapia este una din metodele de devirozare care poate conduce la obţinerea de

plante libere de virus. Curentul electric a fost utilizat sub diferite forme în scopul degradării

nucleoproteinei virale la diverse specii horticole: câmp electric uniform, stimulare directă cu

curenţi electrici de înaltă frecvenţă a butaşilor erbacei sau lemnoşi, stimulare electrică în cuva de

electroforeză orizontală a fragmentelor de lăstari.

Electroterapia în cuva de electroforeză este o tehnică simplă, care nu necesită un

echipament costisitor. Metoda a mai fost utilizată pentru eliminarea virusului mozaicului comun

al fasolei, materialul biologic supus tratamentului fiind reprezentat de fragmente nodale erbacee

provenite de la plante infectate de fasole. Indicele de eficienţă al terapiei a arătat că cele mai

bune rezultate s-au obţinut la un curent electric de 15 mA timp de 10 min (Hormozi şi colab.,

2010). De asemenea, aplicarea unui curent de 15 mA lăstarilor de cartof a condus la regenerarea

de plante libere de PVY în proporţii cuprinse între 76-81%, funcţie de genotip (AlMaarri şi

colab., 2012). La viţa-de-vie această metodă a dat rezultate bune (40% eliminare a virusului A)

în urma stimulării electrice cu un curent de la 30 mA – 15 min (Bayati și colab., 2011).

Ca urmare, în vederea creşterii ratei de devirozare, atât la viţa-de-vie cât şi la cartof,

proiectul propune creşterea intensităţii curentului electric precum şi a timpului de tratament.

Modelul experimental cuprinde 3 intensităţi ale curentului şi trei timpi de expunere, după

modelul parcelelor subdivizate (Tabelul 6.1 şi 6.2).

Tabelul 6.1

Model experimental de electroterapie în cuva de electroforeză

I1= 40 mA I2 = 50 mA I3 = 100 mA

T1

5 min

T2

10 min

T3

20 min

T1

5 min

T2

10 min

T3

20 min

T1

5 min

T2

10 min

T3

20 min

Referinţele indică utilizarea în cuva de electroforeză a diferitelor medii: soluţie NaCl 1m

(Helliot şi colab., 2001), tampon TAE (Hormozi şi colab., 2010), soluţie NaCl 1N (AlMaarri şi

colab., 2012). În prezentul experiment vom utiliza ca mediu lichid soluţia salină 1m.

La viţa-de-vie electroterapia va fi aplicată genotipurilor Tămâioasă românească 3-2-2

infectat cu GFkV şi Frâncuşă 15Od infectat cu GLRaV -1.

La cartof vor fi stimulate electric fragmente de lăstari aparţinând genotipului Roclas

infectat cu izolatul 2 al virusului X şi izolatul 2 al virusului Y.

În cadrul experimentului, fiecare fragment uninodal supus tratamentului electric pe

variantele experimentale constituie repetiţie.

Tabelul 6.2

Variante experimentale

Varianta Intensitate curent electric

mA

Timp expunere

min

V0 0 0

V1 40 5

V2 40 10

V3 40 15

V4 50 5

V5 50 10

V6 50 15

V7 100 5

V8 100 10

V9 100 15

Bibliografie

AlMaarri K., Massa R., AlBiski F., 2012 – Evaluation of some therapies and meristem culture to

eliminate Potato Y potyvirus from infected potato plants. Plant Biotechnology 29,237-

243.

Bayati Sh., Shams-Bakhsh M., Moieni A., 2011 - Elimination of Grapevine Virus A (GVA) by

Cryotherapy and Electrotherapy. J. Agr. Sci. Tech. 13, 443-450.

Emami M., Mozafari J., Babaeiyan N. şi Rahimian H., 2011 – Application of electrotherapz for

the elimination of potato potyviruses. J. Agr. Sci. Tech. 13, 924-927.

Helliot B., Panis B., Hernandez R., Lepoivre P., Frison E., 2001 – Development of in vitro

techniques for the elimination of cucumber mosaic virus from banana (Musa spp). Acta

Horticulture (ISHS) 560, 535-538.

Hormozi-Nejad M.H., Mozafari J. Rakhshandehroo F., 2010 – elimination of Bean common

mosaic virus using electrotherapy technique. J. Plant Dis. Prot. 117 (5), 201-205.

7. Iniţierea culturilor in vitro pe variantele experimentale în vederea devirozării prin

elecroterapie la viţa-de-vie - P1

Fragmente de 8-10 cm de lăstari erbacei recoltaţi de la plante de viţă-de-vie infectate au

fost spălaţi sub jet de apă rece timp de 60 minute, după care au fost imersaţi în soluţie salină de

NaCl 1m, în cuva de electroforeză şi supuşi acţiunii curentului electric, pe variantele

experimentale. După tratamentul electric, lăstarii au fost divizaţi în fragmente uninodale care au

fost sterilizate cu hipoclorit de calciu 6%, timp de 4 min. Spălarea materialului biologic de

agentul sterilizant a fost realizată prin clătiri succesive (3 - 4), cu apă distilată sterilă.

După dezinfecţia materialului vegetal, s-au prelevat în condiţii sterile la hota cu flux de

aer laminar, apexuri intens regenerative (0,2-0,3 cm) şi fragmente uninodale, care au fost

utilizate ca explante pentru iniţirea culturilor in vitro.

Mediul de cultură folosit a avut la bază mediul Murashige - Skoog (M&S, 1962), cu

adaos de citochinine, 1 mg/L benzilaminopurină (BAP) şi 0,5 mg/L acid -indolilacetic (-AIA).

Ca sursă de carbon s-a folosit zaharoza (20 g/L), iar pentru solidificarea mediilor de cultură s-a

utilizat agar-agar (0,8%) (Vişoiu şi colab. 2002).

Conform recomandărilor generale pentru multiplicarea in vitro a viţei-de-vie, pH-ul

mediilor a fost ajustat la 5,7 –5,8, înainte de autoclavare. Sterilizarea vaselor cu mediile de

cultură s-a făcut prin autoclavare la 1200C (1 atm.), timp de 20 minute.

Culturile au fost crescute în camere de creştere la temperatura de 25 10C, fotoperioada

şi iluminarea în limitele de 16 ore lumină şi 3000-3500 lx.

Primele observaţii asupra lăstarilor de viţă-de-vie supuşi tratamentelor electrice nu au pus

în evidenţă efecte vizibile de tipul petelor, necrozelor, densităţii ţesuturilor. Atât apexurile cât şi

fragmentele nodale cultivate pe mediu steril au declanşat procese de multiplicare in vitro.

Bibliografie

Murashige T. şi Skoog F., 1962 - A revised medium for rapid growth and bioassays with

Tabacco tissue culture. Physiol. Plant. 15, 473-49

Vişoiu E., Dumitriu I.C., Tiţa I., Popa C., Buciumeanu E., Bejan C., Alecu D., Smaranda Gh.,

Stănescu Gr., Popescu C.F., Cujbescu I., Tămagă A., Teodorescu A., 2002 – Viticultura

cu bazele producerii materialului săditor de valoare biologică ridicată. Ed. Phoenix,

Braşov.

8. Iniţierea culturilor in vitro pe variantele experimentale în vederea devirozării prin

electroterapie la cartof - P2

Din materialul existent în seră, în faza de plantă în vegetaţie, s-a recoltat manual,

material biologic din partea aeriană a plantelor, care a fost supus experimentării.

După îndepărtarea frunzelor, materialul biologic recoltat a fost supus următoarele etape:

sterilizarea materialului vegetativ – acesta presupune spălarea câteva minute sub jet de apă,

dimensionarea explantelor. Pentru varianta martor materialul biologic a fost sterilizat 3 minute

în alcool 960, apoi 10 minute în soluţie Domestos 20%, după care explantele sunt trecute sub

hota cu flux laminar, în trei vase cu apă bidistilată 5, 10 şi 5 minute. Celelalte variante (V1-V9)

după ce s-a efectuat spălarea materialului vegetativ şi dimensionarea explantelor, înainte de

sterilizare, explantele sunt introduse în soluţia NaCl 1M din cuva aparatului pentru electroforeză;

sunt tratate la trei nivele ale intensităţii curentului electric (40, 50, 100 mA) şi trei durate de timp

(5, 10, 20 min) apoi trecute printr-un vas cu apă distilată şi sterilizate (urmând etapele specificate

mai sus).

Camera pentru inocularea explantelor este sterilizată, cu hotă cu flux laminar de aer steril;

sterilizarea eprubetelor se efectuează în etuvă, la 1800C, iar mediul de cultură, în care sunt

inoculate explantele, se sterilizează în autoclav, la 1200C.

După inocularea explantelor în eprubete, conţinând mediu de multiplicare Murashige-

Skoog, acestea sunt plasate în camera de creştere la 200C, cu o fotoperioadă de 16 ore lumină şi 8

ore întuneric.

9. Selecţia plantelor de viţă-de-vie libere de virusuri în urma chimioterapiei in vitro - P1

Plantele de viţă-de-vie regenerate în urma tratamentelor cu chimioterapicele ribavirină şi

oseltamivir au fost analizate serologic prin metoda DAS-ELISA (Clark şi Adams, 1977), în

vederea stabilirii eficienţei tratamentelor în eliminarea virusurilor specifice. Diagnosticul viral a

implicat utilizarea kiturilor specifice de reactivi Bioreba, Elveţia, materialul de analiză fiind

constituit din ţesut foliar. Plantele au fost analizate individual, în două repetiţii. Eficienţa

chimioterapiei a fost apreciată prin rata de devirozare, pe variantele experimentale, ca număr de

plante ELISA negative raportat la numărul de plante regenerate.

Virusul răsucirii frunzei serotip 1 a fost eliminat cu rate destul de mici, cuprinse între 5 –

13,3%, cea mai mare înregistrându-se la V1 subcultura a doua. Pe subculturi, ratele au fost mai

bune la varianta cu concentraţia cea mai mare de ribavirină. Scurtnodarea a fost eliminată de

asemenea, în proporţii de până la 6,6%, cu rate diferite pe variantele experimentale. În ceea ce

priveşte virusul fleck eficienţa chimioterapiei a fost maximă indiferent de concentraţiile

chimioterapicelor şi numărul de zile de tratament (Tabelul 9.1).

Tabelul 9.1

Evaluarea ratei de devirozare la plantele de viţă-de-vie regenerate în urma chimioterapiei in vitro

Subcultura Varianta GLRaV-1 GFLV GFkV

Analizate/

ELISA

negative

dev.% Analizate/

ELISA

negative

dev.% Analizate/

ELISA

negative

dev.%

S1 V1 30/2 6,6 29/1 3,4 25/25 100

V2 38/0 0 29/2 6,8 28/28 100

V3 35/0 0 30/1 3,3 30/30 100

S2 V1 45/6 13,3 26/1 3,8 30/30 100

V2 40/2 5 28/1 3,6 26/26 100

V3 23/2 5,5 27/0 0 28/28 100

S3 V1 26/2 7,2 19/1 5,2 29/29 100

V2 30/2 6,6 23/0 0 32/32 100

V3 28/0 0 30/2 6,6 25/25 100

Deoarece în natură sunt destul de frecvente infecţiile complexe la viţa-de-vie, proiectul

şi-a propus studiul eliminării concomitente a virusurilor prin chimioterapie. Astfel, genotipul

Burgund 63 Mn selecţionat infectat cu GVA şi GFkV, supus acţiunii viricidelor a condus la

eliminarea totală a virusului GFkV şi numai în proporţie de până la 9% a virusului A al viţei-de-

vie. Aşadar, GFKV se elimină în totalitate sub influenţa chimioterapicelor, atât în infecţii simple

cât şi complexe, fiind suficiente doze de 20 mg/L ribavirină şi 40 mg/L oseltamivir.

Plantele regenerate în urma chimioterapiei selecţionate pozitive din punct de vedere al

prezenţei virusului au manifestat totuşi, o scădere a densităţii optice citite la spectrofotometru

(Fig. 9.1). Această constatare împreună cu ratele mici de devirozare la virusurile GFLV,

GLRaV-1 şi GVA ne îndreptăţeşte să concluzionăm că utilizarea viricidelor poate fi o variantă

eficientă de regenerare de plante sănătoase, trebuie găsiţi parametrii experimentali care să

eficientizeze metoda.

Fig.9.1 Media ±dst densităţilor optice la plantele regenerate ELISA pozitive, prin chimioterapie

in vitro, pe variantele experimentale, genotipul Frâncuşă infectat cu GLRaV-1

Chimioterapia in vitro cu utilizarea simultană a viricidelor ribavirină şi oseltamivir a

condus la regenerarea de plante de viţă-de-vie ELISA negative în proporţie de 100% la virusul

fleck, 13,3% la GLRaV-1, 6,8% la GFLV şi 9% GVA. În perioada următore, plantele libere de

virus vor fi retestate, pentru stabilirea menţinerii statutului fitosanitar dobândit.

10. Selecţia plantelor de cartof libere de virusuri in urma chimioterapiei in vitro - P2

Varianta experimentală V1 (cultivarea explantelor infectate pe mediu cu adaus de

ribavirină 40mg/L+ oseltamivir 40mg/L) a fost aplicată timp de 1-2-3 culturi succesive cu

viricide (subculturi consecutive S1, S2, S3), fiecare subcultură fiind apoi urmată de câte o

subcultură pe mediu obişnuit. Variantele V1 şi V2 (în care s-a folosit viricidele în alte

concentraţii: ribavirina 20mg/L+ oseltamivir 40mg/L, respectiv ribavirina 20mg/L+ oseltamivir

80mg/L) au fost aplicate timp de 1-2 subculturi succesive (S1, S2), după care multiplicarea s-a

realizat pe mediu Murashige-Skoog (1962). Fiecare subcultură a fost evaluată individual,

rezultatele privind absorbanţele optice înregistrate aplicând tehnica DAS ELISA (Clark si

Adams, 1977).

În figurile 10.1 şi 10.2 sunt prezentate valorile medii ale absorbanţelor (DO la 405nm) la

plantele (soiul Roclas) inoculate cu două izolate ale virusului Y şi multiplicate pe medii cu

diferite concentraţii de viricide (alese pentru experimentarea variantelor din aceasta etapă).

Plantele din care s-au obţinut explante cultivate pe diferite medii au fost diagnosticate ca

virozate, având valori ale pragului mai mari decât dublul valorii mediei controalelor negative.

Din aceleaşi plante infectate s-au multiplicat şi explante pe mediu fără viricide, acestea

constituind probele martor.

Interesantă a fost comportarea total diferită a celor două tipuri de material biologic

(infectat cu doua izolate diferite de PVY). Astfel, în cazul chimioterapiei aplicate microplantelor

infectate cu suşele necrotice ale virusului Y (RY2), valorile absorbanţelor au crescut semnificativ

de la o subcultură la alta, de fiecare dată înregistrându-se o accentuare a intensităţii infecţiei, în

nici una din variante nu s-a găsit nici măcar o probă negativă. Probabil, aceste tulpini necrotice

deosebit de agresive, pe măsură ce întâlnesc un factor de constrângere acţionează puternic, iar

concentraţia înregistrează o creştere semnificativă. Pentru a putea verifica aceste ipoteze, ne

propunem ca în etapa viitoare să repetăm aceste cercetări. Prin aplicarea simultană şi a altor

metode de devirozare (electroterapie, tratamente cu uleiuri esenţiale), poate că va fi posibilă

mărirea gradului de devirozare al materialului infectat cu acest agent patogen. Comparativ cu

martorul, doar în varianta V1 s-a observat o scădere a valorii absorbanţelor la subcultura 1 şi 2,

dar gradul de devirozare a fost tot nul. Spre deosebire de materialul infectat cu izolatul necrotic

al virusului Y al cartofului, plantele inoculate cu celălalt izolat (RY1) au prezentat în toate

variantele valori ale DO la 405nm mai scăzute faţă de martor. Valoarea cea mai scăzută s-a

înregistrat în cazul subculturii 3 la varianta V1 (Fig. 10.1A) Totodată, această variantă V1 a

condus la obţinerea de rezultate semnificative şi în ceea ce priveşte gradul de devirozare (91,7%)

(Fig. 10. 3), precum şi referitor la eficienţa chimioterapiei (64,5%) (Fig. 10. 4) O altă variantă în

care s-au înregistrat rezultate interesante a fost V3 (varianta care se distinge prin valorile cele

mai mari ale concentraţiei de oseltamivir). În acest caz, faţă de martor, în ambele subculturi,

valorile medii ale DO la 405nm au fost semnificativ mai scăzute (Fig. 10.1B), gradul de

devirozare a fost cel mai ridicat (95,4%) iar eficienţa chimioterapiei a fost de 61,1%.

Figura 10.1 Evaluarea acţiunii viricide a chimioterapiei la plantele infectate cu virusul Y

al cartofului (PVY).Valorile medii ale absorbanţelor la plantele regenerate din plante infectate,

inoculate cu izolat 1 (suşe virale PVYO)(A) şi cu izolat 2 (suşe necrotice PVY

N) (B) Valorile

care nu sunt urmate de aceeaşi literă sunt semnificativ diferite (P=0,05) conform testului Duncan.

NPT=număr plante testate (plante care au supravieţuit) NPM=număr plante multiplicate

NPLV=număr plante libere de virus (devirozate)

RY1

Regenerare Devirozare

NPT*/

NPM

% NPLV/

NPT*

%

V1

S1 4/5 80 .4 / 4 100

S2 7/14 50 6/7 85,7

S3 38/48 79,2 .34/38 89,5

V2 S1 2/6 33,3 1/2 50

S2 17/19 89,5 17/17 100

V3

S1 4/6 66,7 4/4 100

S2 11/18 61,1 10/11 90,9

RY2

Regenerare Devirozare

NPT*/

NPM

% NPLV/

NPT*

%

V1

S1 4/5 80 0 / 4 0

S2 7/9 77,8 0/7 0

S3 12/32 37,5 0/12 0

V2

S1 4/6 66,7 0/4 0

S2 20/21 95,2 0/20 0

V3 S1 0/14 0 0 0

S2 12/14 85,7 0/12 0

Figura 10.2 Evaluarea acţiunii viricide a chimioterapiei la plantele infectate cu virusul X

al cartofului (PVX).Valorile medii ale absorbanţelor la plantele regenerate din plante infectate,

inoculate cu izolat 1 (Ostara infecţie secundară)(A) şi cu izolat 2 (Bintje infecţie secundară) (B)

Valorile care nu sunt urmate de aceeaşi literă sunt semnificativ diferite (P=0,05) conform testului

Duncan. NPT=număr plante testate (plante care au supravieţuit) NPM=număr plante multiplicate

NPLV=număr plante libere de virus (devirozate

RX1

Regenerare Devirozare

NPT*/

NPM

% NPLV/

NPT*

%

V1

S1 4/6 66,7 .4 / 4 100

S2 2/10 20,0 .1/2 50,0

S3 40/48 83,3 .40/40 100

V 2 S1 1/5 20,0 .1/1 100

S2 8/12 66,7 .4/8 50,0

V 3 S1 1/5 20,0 .1/1 100

S2 12/14 85,7 .11/12 91,7

RX2

Regenerare Devirozare

NPT*/

NPM

% NPLV/

NPT*

%

V1

S1 4/4 100 .4 / 4 100

S2 0/12 0 0/0 0

S3 31/31 100 .31/31 100

V 2 S1 5/6 83,3 2/5 40

S2 10/15 66,7 7/10 70

V 3 S1 6/7 85,7 5/6 83,3

S2 6/11 60 6/6 100

Figura 10.3 Gradul de devirozare la plantele inoculate cu cele doua izolate ale virusului X al

cartofului (PVX) şi cu unul din izolatele virusului Y al cartofului (PVY), material biologic

multiplicat pe medii cu adaus de viricide (V1- RBV 40mg/L+OSMV 40mg/L; V2- RBV

20mg/L+OSMV 40mg/L; V3- RBV 20mg/L+OSMV 80mg/L) RBV= ribavirin;

OSMV=oseltamivir.

Figura 10.4 Eficienta chimioterapiei calculată conform Lozoya-Saldana (1996) la plantele

inoculate cu cele doua izolate ale virusului X al cartofului (PVX) şi cu unul din izolatele

virusului Y al cartofului (PVY), material biologic multiplicat pe medii cu adaus de ribavirin şi

oseltamivir (semnificaţia V1, V2, V3 este prezentată în figura anterioară).

Izolatul 1 folosit în cazul inoculării materialului (RY1) se distinge prin existenţa unor

tulpini mai puţin agresive (PVYO), care nu prezintă aceeaşi mobilitate-recombinare genetică ca şi

cele necrotice (izolatul 1). Probabil aceasta a fost cauza pentru care în acest caz, gradul de

devirozare a fost mult mai ridicat (chiar mai mare decât cel înregistrat la materialul inoculat cu

virusul X ) (Fig. 10. 3) O altă cauza ar putea fi concentraţia mai scăzută de virus a plantelor din

care s-a făcut iniţierea culturilor.

În cazul tratamentelor cu viricide aplicate explantelor prelevate din plante infectate cu

virusul X al cartofului, varianta V2 a condus la obţinerea unor valori medii ale absorbantelor

semnificativ mai ridicate comparativ cu cele înregistrate în celelalte variante experimentale.

Indiferent de suşa virală folosită pentru inoculare, toate variantele de chimioterapie s-au dovedit

a avea un efect semnificativ asupra concentraţiei de virus comparativ cu martorul netratat (Fig.

10. 2 A şi B). Procentul de devirozare cel mai ridicat s-a observat la varianta 3 la ambele suşe

virale 89,8% la devirozarea plantelor infectate cu izolatul 1, respectiv 91,7% la cele inoculate cu

izolatul 2 (Fig. 10. 3). Rezultatele bune înregistrate in cazul variantelor V1 şi V2 reies şi din

valorile calculate pentru eficienţa chimioterapiei (Fig. 10. 4). Variantele 1 şi 3 s-au dovedit a fi

cele mai indicate pentru continuarea cercetărilor deoarece în cazul tuturor microplantelor testate,

eficienţa a fost cea mai ridicată. Astfel, eficienta chimioterapiei în cazul variantei 1 s-a

concretizat prin valorile 53,3% şi 66,7% la materialul biologic RX1, respectiv RX2, pe când

valorile obţinute pentru microplantele RX1 şi RX2 tratate conform variantei V3 au fost de

46,4%, respectiv 65,7% (Fig. 10. 4).

În literatura de specialitate (Danci şi colab.,2012; Klein şi Livingston, 1983, Mahmoud şi

colab. 2009) sunt specificate rezultate asemănătoare cu cele obţinute până în prezent în

experimentele întreprinse în această etapă, cu excepţia variantei RY2, caz în care chimioterapia

nu a avut nici un efect benefic (din contră, s-a observat o creştere a concentraţiei de virus de la o

multiplicare la alta).

Bibliografie

Clark M.F. and Adams, A.N., 1977 - Characterization of the microplate method of the enzyme-

linked immunosorbent assay for the detection of plant virus. J. Gen. Virol., 34: 475-483.

Danci M., Danci O., Mike L., Baciu A., Olaru D., Petolescu C., Berbentea F., David I. - 2012

Production of virus free potato plantlets, Journal of Horticulture, Forestry and

Biotechnology, 16(1), 232-238

Klein R.E. and Livingston C.H., 1983 - Eradication of potato viruses X and S from potato shoot

tip cultures with ribavirin. Phytopathology 73,1049-1050.

Lozoya-Saldana H., Abello F.J., Garcia G.R., 1996. Electrotherapy and shoot tip culture

eliminate potato virus X in potatoes. Am. J. Potato Res.73, 149-154

Mahmoud S.Y.M, Hosseny M.H., Abdel-Ghaffar M.H., 2009 - Evaluation of some therapies to

eliminate Potato Y Potyvirus from potato plants, International Journal of Virology 5, 64-

76

Murashige T. and Skoog F., 1962 - A revised medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15,473-497.