Tehnici de histopatologie

Fragmentele de esut recoltate de la pacient n vederea diagnosticului trebuie procesate n laboratorul de histopatologie pentru a obine preparate permanente care vor fi examinate microscopic de ctre morfopatolog. Fragmentele de esut pot fi recoltate prin biopsie, prin exerez chirurgical i prin autopsie. Procesarea esuturilor n vederea diagnosticului histopatologic presupune o suit de operaiuni i tehnici care vor permite vizualizarea elementelor fungice intratisulare i / sau a leziunilor specifice determinate de acestea. Obinerea probelor Probele de esut primite n laboratorul de histopatologie trebuie s fie nsoite de un formular de cerere a examenului de laborator n care vor fi specificate datele pacientului i istoricul bolii, precum i descrierea zonei de origine a fragmentului de esut. Probelor primite li se va atribui un numr care va identifica fiecare prob pentru fiecare pacient. Acest numr va corespunde cu numrul de ordine din registrul laboratorului. Examenul macroscopic Examinarea macroscopic const n descrierea probelor, alegerea zonelor relevante pentru diagnostic i introducerea lor (total sau parial) n mici casete din plastic, unde vor sta pe toat durata procesrii iniiale, pn n momentul includerii n parafin. Iniial, casetele sunt plasate ntr-un fixator.Fixarea Fixarea are scopul de a conserva morfologia esuturilor aa cum se prezint ea n momentul recoltrii. Fixarea trebuie realizat ct mai curnd posibil dup prelevarea probelor de esut pentru a preveni autoliza. Nu exist un fixator perfect, dei formaldehida este considerat aproape un gold standard. Exist o varietate de fixatori, care se vor folosi n funcie de tipul de esut.Factorii care influeneaz procesul fixrii: -soluia-tampon; -penetrarea; -volumul piesei vs. volumul fixatorului; -temperatura; -concentraia fixatorului; -intervalul de timp. Fixarea trebuie realizat la un pH aproape de neutralitate, adic ntre 6 i 8. Datorit hipoxiei esuturilor, fixatorul trebuie s aib capacitatea de a tampona aciditatea acestora prevenind dehiscena lizozomal i autoliza tisular consecutiv acesteia. Aciditatea favorizeaz formarea de pigment hem - formol care apare colorat n negru, prin depuneri polarizate n esuturi. Soluiile-tampon includ fosfatul de sodiu, bicarbonatul de sodiu, cocodilatul de sodiu i veronalul. Formolul comercial este o soluie de formaldehid n tampon fosfat cu pH 7. Penetrarea esuturilor depinde de difuzibilitatea fiecrui fixator.Formolul i alcoolul penetreaz foarte bine, iar glutaraldehida foarte prost. Ceilali fixatori au un grad intermediar de penetrabilitate tisular. O posibilitate de a rezolva acest inconvenient este secionarea ct mai fin a esuturilor (2-3 mm grosime), deoarece penetrarea unei seciuni subiri va fi mult mai rapid dect cea a unei seciuni mai groase. Volumul de fixator este de asemenea extrem de important. Acesta trebuie s fie n raport de 10:1 (fixator-esut). Se recomand schimbarea fixatorului la diferite intervale de timp pentru a evita o eventual scdere a volumului acestuia. Agitarea probelor n fixator va intensifica fixarea. Creterea temperaturii, ca n cazul tuturor reaciilor chimice, va crete viteza de fixare, dar se va avea totui n vedere s nu degradeze esuturile. Formolul fierbinte va fixa esuturile mai repede i acesta este adesea primul pas n procesarea automatizat a esuturilor. Concentraia fixatorului va fi cea mai redus concentraie activ, acest fapt reprezentnd i un avantaj economic. Formolul este cel mai activ la 10%; glutaraldehida este n general activ la concentraii de 0,25-4%. Concentraiile prea ridicate pot avea efect advers asupra esuturilor producnd artefacte asemntoare cu cele ale creterii temperaturii fixatorului. De asemenea, foarte important este intervalul de timp recomandat pentru meninerea probelor n afara fixatorului. Dup fixare, probele vor fi prelucrate rapid deoarece prin deshidratare se vor produce artefacte.esuturile meninute temporar n afara vasului cu fixator, se vor umezi cu ser fiziologic. Tipul fixatorului indicat este dat de tipul de esut i de detaliile histologice care urmeaz a fi vizualizate. Formolul este utilizat pentru toate esuturile recoltate chirurgical i necropsic, cnd se dorete obinerea unor preparate colorate H-E. Formolul este cel mai puin pretenios dintre toi fixatorii atunci cnd condiiile de fixare nu sunt cele ideale, el dunnd aproape neglijabil esutului respectiv. Pentru fixarea esuturilor n vederea procesrii lor pentru diagnosticul histopatologic al . Formol soluie 10% tamponat pH 6,8 se folosesc frecvent urmtorii fixatori: soluia de formol 10% tamponat pH 6,8, acest fapt reprezentnd i un avantaj economic. Formolul este cel mai activ la 10%; glutaraldehida este n general activ la concentraii de 0,25-4%. Concentraiile prea ridicate pot avea efect advers asupra esuturilor producnd artefacte asemntoare cu cele ale creterii temperaturii fixatorului. De asemenea, foarte important este intervalul de timp recomandat pentru meninerea probelor n afara fixatorului. Dup fixare, probele vor fi prelucrate rapid deoarece prin deshidratare se vor produce artefacte.esuturile meninute temporar n afara vasului cu fixator, se vor umezi cu ser fiziologic. Tipul fixatorului indicat este dat de tipul de esut i de detaliile histologice care urmeaz a fi vizualizate. Formolul este utilizat pentru toate esuturile recoltate chirurgical i necropsic, cnd se dorete obinerea unor preparate colorate H-E. Formolul este cel mai puin pretenios dintre toi fixatorii atunci cnd condiiile de fixare nu sunt cele ideale, el dunnd aproape neglijabil esutului respectiv. Pentru fixarea esuturilor n vederea procesrii lor pentru diagnosticul histopatologic al . Formol soluie 10% tamponat pH 6,8 se folosesc frecvent urmtorii fixatori: soluia de formol 10% tamponat.

ScopEste un fixator larg utilizat, cu pH 6,8ReactiviFosfat de sodiu monobazic ........................... 4,0 mgFosfat de sodiu dibazic ................................. 6,5 mgFormaldehid 37% ..................................... 100,0 mlAp distilat ............................................... 900,0 mlSe omogenizeaz, apoi se eticheteaz i se dateaz.Atenie! Carcinogen.Timpul de fixareFragmentele biopsice ar trebui fixate timp de minim 1-4 ore. Un timp maindelungat se recomand pentru piesele mai mari.Tehnica fixrii1. Piesele recoltate de chirurgi sunt pstrate n acest tip de fixator;2. Primele dou staii ale tuturor procesatoarelor de esuturi conin formol 10%;3. Probele pot fi pstrate n formol 10% indefinit sau sunt transferate n etanol70%.Note:1. Se lucreaz ntr-un spaiu ventilat. Se vor purta ochelari de protecie, mnui i halat.2. Formaldehida este puternic iritant pentru ochi i piele. Este sensibilizant (prin contact) pentru piele i aparatul respirator.Este toxic prin ingestie i inhalare.Are aciune coroziv i carcinogen. Se eticheteaz cu inscripia: ATENIE FORMALDEHID!

Timpul de fixareProbele de dimensiuni mici 2-4 ore, iar cele mai mari pn la 3 zile.6.4. Procesarea esuturilorOdat ce esuturile au fost fixate, ele trebuie nglobate ntr-o form care spermit manipularea i efectuarea unor seciuni seriate foarte subiri. Cel mai folosit material n acest scop este parafina. esuturile incluse n parafin pot fi secionate n fragmente cu grosimi de la 3 la 10 m, uzual 4-6 m. Tehnica de includere n parafin a esuturilor fixate se numete Procesarea esuturilor. Paii principali ai acestui proces sunt deshidratarea i clarificarea.- esuturile fixate umed (n soluii apoase) nu pot fi direct impregnate cu parafin deoarece aceasta nu este miscibil cu apa. De aceea, esuturile trebuiedeshidratate. Aceasta se realizeaz de obicei cu ajutorul unor soluii de etanol,de concentraii crescnde - 70%, 95% i 100%. Uneori, primul pas este tratareacu un amestec format din formol i etanol. Pot fi utilizai i ali deshidratani,dar unii prezint dezavantaje majore: acetona dei este foarte rapid, esteinflamabil, de aceea se poate utiliza doar pentru mici seturi de esuturi Tehnici de histopatologie procesate manual6.4.1. Deshidratarea1. Dac piesa de esut a fost imersat n ap dup scoaterea din fixator, ea trebuie s fie transferat n etanol 30%, 1-2 ore;2. Etanol 50%, 1-2 ore;3. Etanol 70%, 1-2 ore;4. Etanol 95%, 1-2 ore;5. Etanol 100%, 1-2 ore;6. Etanol 100%, 1-2 ore;7. esuturile deshidratate vor fi pregtite pentru clarificare, adic se scot pieselehistologice din etanol i se trec n toluen.Not: Etanolul absolut produce o deshidratare foarte rapid a esuturilor: pentru a avea aceast siguran, flacoanele cu etanol se vor pstra nchise etan.6.4.2. Clarificarea1. Se transfer piesele histologice din etanol 100% ntr-un amestec constituit din oparte toluen i 3 pri etanol 100%, 1 or;2. Se trec apoi n amestecul de 1:1 toluen-etanol 100%, 1 or;3. Apoi n amestecul de 3:1 toluen-etanol 100%, 1 or;4. Toluen 100%, 3-4 ore;5. Toluen 100%, 3-4 ore;6. Dup clarificare, esuturile sunt gata pentru impregnare cu parafin.Not:Agenii de clarificare, cum ar fi etanolul, trebuie introdui lent pentru a prevenidegradarea esuturilor. Aceste amestecuri de toluen i etanol permit n plus i ndeprtareaoricror urme de ap. Flacoanele se nchid etan. Apariia unei turbiditi a soluiilor sau aunor pete opace pe esuturi sunt indicatori siguri ai deshidratrii incomplete. n ambele cazuri,lamele cu seciuni se reintroduc n etanol 100% pentru o deshidratare suplimentar, apoi secontinu cu bile de toluen - etanol. Insuficienta ndeprtare a alcoolului va determinaimposibilitatea impregnrii cu parafin n zonele respective ale esutului, ceea ce va producedificulti de secionare. Actualmente, exist numeroi ageni de clarificare disponibilicomercial (Histosolve, Americlear etc.) care sunt mai puin toxici i au un miros mai plcutdect toluenul sau xilenul.6.4.3. Impregnarea cu parafin1. Se transfer esuturile din agentul de clarificare ntr-un nou flacon cu un amestecprenclzit de parafin - toluen 1:2. Se acoper etan flaconul i se las laetuv, la 45C, timp de 1 or;2. Se transfer esuturile ntr-un al doilea flacon care conine un amestec nclzit deparafin - toluen 1:2. Se acoper flaconul i se meine la 45C timp de 1 or;3. Se transfer piesele apoi n prima baie de parafin pur. Aceasta este un flaconcu parafin lichid care se menine n etuv setnd o temperatur superioarpunctului de topire al parafinei. Piesele se menin n aceast baie timp de 2-4ore;4. Se transfer piesele n a doua baie de parafin, unde se menin nc 2-4 ore;5. Se includ (pasul urmtor).Not:O alternativ a metodei de impregnare:1. Se introduce piesa histologic n agentul clarificator proaspt i apoi se adaug parafin pn la saturarea clarificatorului. Se las n repaus 1 or la 30C 60C, apoi se mai adaug parafin i se las peste noapte. n dimineaa urmtoare, se adaug parafin pn cnd amestecul conine aproximativ 75 % parafin, apoi se menine 1 or la 45C.2. Se trece piesa apoi direct prin 2 bi de parafin pur.6.4.4. Includerea

1. Se lubrifiaz interiorul casetelor sau al diferitelor tvie metalice cu un amestec de etanol 60% - glicerin 9:1. 2. Acesta va preveniaderarea parafinei la recipientul ce constituie forma de turnare a blocurilor.Acest lucru nu este necesar dac se utilizeaz matrie de hrtie.2. Se rcete matria prin meninerea prii sale inferioare pe ghea cteva minute.3. Se scoate recipientul cu parafin topit din etuv i se vars n matri.4. Se introduce esutul n matri cu ajutorul unei pense hemostatice nclzite i se verific dac piesa a fost orientat corect. n funcie de dimensiunea matriei,se pot include simultan mai multe piese (1-10) obinndu-se un numrechivalent de blocuri. Etichetele din hrtie sunt ataate n parafin, la margineamatriei, n dreptul piesei histologice.6.4.5. SecionareaDup includere, esuturile trebuie secionate pentru a putea fi etalate pe lam.Secionarea se realizeaz cu un microtom, la grosimi de 4-6 m. Pentru realizarea unor seciuni corespunztoare este necesar ca lama cuitului s fie perfect ascuit; se prefer utilizarea cuitelor single use. Odat obinute seciunile, acestea se depun pe suprafaa apei dintr-o baie de ap prenclzit, fapt care ajut la deplierea panglicii secionate.Fragmentele de panglic sunt recuperate cu ajutorul unei lame de microscopie. Lamacu seciunea etalat este apoi plasat ntr-o etuv timp de aproximativ 15 minute pentru ca, prin topirea parial a parafinei, seciunile s adere mai bine la lam.

1. Blocurile de parafin cu piesele incluse, se secioneaz rectangular pe lngesut, lsndu-se civa milimetri de parafin pe fiecare fa a blocului;2. Urmeaz o nou fasonare a blocului cu ajutorul unei lame de ras. Se va ndeprta mai nti parafina de pe faa de secionare la microtom, ct mai aproape de esutul din bloc. Urmtoarele secionri se vor face pe celelalte fee ale blocului, n aa fel ca acestea s devin paralele una cu alta. Se va lsasuficient parafin la baza blocului astfel nct acesta s poat fi ataat laobiectiv. Tierea bazei blocului se va face n aa fel nct ea s fie paralel cufaa de secionare;3. Se ataeaz blocul de parafin la discul obiectiv. Se depune un mic fragment de parafin pe discul obiectiv i se modeleaz cu o spatul nclzit prin flambare la un bec de gaz. Se las ca stratul de parafin s se rceasc, apoi se pregtesc cele dou suprafee (baza blocului i suprafaa obiectului) n vederea aderrii prin topirea stratului superficial de parafin (se ating cele dou suprafee timp de cteva secunde cu spatula bine nclzit). Se preseaz apoi blocul de parafin pe discul obiectiv i se las n repaus pentru solidificare;4. Se fixeaz discul obiectiv cu blocul ataat n mandrina microtomului, seajusteaz poziia n aa fel ca blocul s fie paralel cu tiul cuitului demicrotom;5. Ajustarea unghiului cuitului se face prin ncercri succesive. Unghiul diedruformat de faa cuitului i faa blocului trebuie s fie de aproximativ 5 grade.6. Se alege grosimea de secionare (4-6 m pentru majoritatea esuturilor) i sencepe secionarea cu vitez moderat. Se manevreaz panglica rezultat prinnlnuirea seciunilor cu ajutorul unui penson, preferabil din pr de cmil. Sesecioneaz aproximativ 25 de seciuni, apoi se ndeprteaz panglica de lacuit i se depune pe o coal de hrtie colorat n negru.7. Dac se vor practica seciuni mai subiri (de 2-4 m) sau dac esutul este dur, se pot obine rezultate superioare prin rcirea blocului de parafin i a cuitului. n acest scop, se ia un cub de ghea i se las s se topeasc n aa fel ca gheaatopit s se preling peste partea frontal a blocului. Alt cub de ghea se punepe faa anterioar a cuitului. Se va folosi un material absorbant (lavete,prosoape de hrtie) pentru colectarea apei rezultate n urma topirii gheii ircirii piesei / cuitului. Cuburile de ghea se vor menine cca. 1-2 minute,apoi se ndeprteaz orice pictur de ap de pe cuit i bloc cu ajutorul unuiprosop de hrtie i se ncepe secionarea. Rcirea blocului de parafin se poateface i prin meninerea sa timp de cteva minute n congelator.8. Microtomul i cuitul de secionare se toaleteaz dup fiecare utilizare. Niciodat nu se las fixat cuitul n microtom cnd nu este folosit.6.4.6. Etalarea seciunilorAlbumina BakerAlbu de ou .................................................. 50,0 mlAp distilat ................................................. 50,0 mlNaCl ................................................................. 0,5 gp-hidroxibenzoat de sodiu1 ............................... 0,1gn apa distilat nclzit la 90C, se dizolv clorura de sodiu i conservantul (phidroxibenzoatul de sodiu). Dup rcire se adaug albuul, se centrifugheaz pn cnd supernatantul devine clar, se filtreaz prin vat ori se las n repaus pn cnd stratul superior devine clar. Ca adeziv, se utilizeaz numai supernatantul clar.Pentru o bunconservare, acesta se pstreaz la frigider.

Bibliografie selectiv1. Bancroft J, Stevens A (1982) - Theory and Practice of HistologicalTechniques, 2nd ed., Churchill Livingstone, N.Y.2. Bancroft, J D, Stevens A (1982) - Theory and practice of histologicaltechniques 2nd ed., Churchill Livingstone, Edinburgh & London, UK.3. Carson F (1990) - Histotechnology: A Self-Instructional Text, 1st ed., ASCP,III.4. Crookham J, Dapson R (1991) - Hazardous Chemicals in the HistopathologyLaboratory, 2nd ed., Anatech.5. Culling C F A (1974) - Handbook of histopathological and histochemicaltechniques; 3nd ed., Butterworth, London, UK.

6. Gray P (1954) - The Microtomist's Formulary and Guide. The BlakistonCo. Robert E. Krieger Publishing.7. Humason G L (1967) - Animal tissue techniques, 2nd ed., W H Freeman &Company, San Francisco, Ca, USA.8. Lillie R D (1954) - Histopathologic technique and practical histochemistry 2nded., Blakiston, New York, USA.9. Lillie R D, Glenner G G (1957) - Journal of Histochemistry andcytochemistry; 5:311.10. Luna L (1968) - Manual of Histologic Staining Methods of the AFIP, 3nd ed.,McGraw-Hill, NY.11. McManus J F A, Mowry R W (1960) - Staining Methods Histologic andHistochemical; Harper & Row, New York, NY, USA.12. Sheehan D, Hrapchak B (1980) - Theory and practice of Histotechnology; 2nded., Battelle Press, Ohio.

Mod de lucruProcedura 11. Se degreseaz lamele i lamelele prin imersia lor n alcool acidifiat 95% (1 mlHCl concentrat la 100 ml etanol) i se terg energic cu o pnz curat din bumbac. Seciunile nu vor adera la lam dac acestea nu sunt completdegresate. Se evit contactul degetelor cu suprafaa lamelor;2. Se plaseaz seciunile pe lam cu ajutorul unor ace de disociere. Acestea vorpluti la adugarea ctorva picturi de albumin diluat la marginea panglicii.Ne vom asigura c seciunile au fost montate pe faa lamei cu captul mat i nupe faa cu captul lucios;3. Seciunile se plaseaz pe lama nclzit cu ajutorul unei platine nclzitoarereglat la o temperatur cu aproximativ 5-10C sub punctul de topire alparafinei;4. Seciunile se vor ntinde i netezi rapid. Excesul de fluid se va ndeprta prinnclinarea lamei, meninnd panglica cu seciuni cu ajutorul unor ace dedisociere;5. Se transfer lamele cu seciuni n etuv, la 30-40C i se las peste noapte pentrua se asigura deshidratarea complet a acestora.

Procedura 21. Se utilizeaz lame degresate ca mai sus; se adaug o pictur de adeziv nediluat pe lam i se etaleaz cu pulpa degetului mic prin micri circulare. Excesul se terge cu pulpa degetului inelar. Degetele vor fi degresate n prealabil cu alcool acidifiat 95 %;2. Se plaseaz una sau dou seciuni pe suprafaa apei ntr-o baie reglat la otemperatur cu 5-10C sub punctul de topire a parafinei. Se las cteva minutepentru ntinderea seciunilor;3. Se introduce lama n baie, sub seciune i folosind un ac de disociere se prinde i se fixeaz fragmentul de panglic pe lam, dup care aceasta se scoate dinbaie; fragmentul de panglic va adera la lam;4. Se las lamele cu seciuni n etuv peste noapte pentru uscare. Dezlipireaseciunilor de pe lam n timpul colorrii este o problem frecvent ntlnit lahistotehnicienii debutani. Dac lamele sunt curate i seciunile suntntotdeauna uscate complet dup etalare, aceste incidente vor fi rare.ColorareaProcesul de includere n parafin, necesar secionrii pieselor, trebuie urmat dedeparafinarea seciunilor etalate pe lam astfel nct s fie permis penetrareacoloranilor hidrosolubili. Lamele cu seciuni se deparafineaz prin trecerea succesivn bi de xilen (sau nlocuitori), alcool etilic i ap. Tehnicile de colorare sunt diverse i se selecteaz n funcie de abilitatea lor de a colora diferite componente celulare i esuturi. Coloraia de rutin este Hematoxilin-Eosin (HE), celelalte metode de colorare sunt coloraii speciale, pentru c se utilizeaz n situaii specifice conform nevoilor de diagnostic.

Coloraia Hemalaun EozinScopAceasta este cea mai comun coloraie histologic i histopatologic utilizatpentru studierea de ansamblu a citoarhitectonicii tisulare.Hemalaun-Eozin este o metod de colorare de rutin, dar care necesit o execuie atent pentru a asigura obinerea unor rezultate corecte i uniforme.FixatorSe obin rezultate excelente, comparabile, folosind diveri fixatoriTehnica de secionareSeciuni cu grosimea de 4-5 m, din fragmente de esut incluse n parafinEchipamentSticlrie de laborator, timer de laboratorReactiviHematoxilina Ehrlich (1886)Hematoxilin ...................................................... 2 gEtanol 95% ................................................... 100 mlAp distilat .................................................. 100 mlGlicerin ....................................................... 100 mlAlaun de potasiu, n exces ..................... aprox. 20 gAcid acetic ...................................................... 10 mlHematoxilina HarrisHematoxilin ................................................... 5,0 gEtanol 95% .................................................. 50,0 mlAlaun de potasiu .......................................... 100,0 gAp distilat ................................................ 1000 mlOxid de mercur ................................................ 2,5 gSe dizolv hematoxilina n etanol i alaunul n ap cu ajutorul cldurii. Seamestec cele dou soluii. Amestecul se aduce la fierbere ct mai repede posibil i apoi se adaug oxidul de mercur. Se continu fierberea pn cnd apare o culoare purpurie intens (rou-nchis, violet), apoi se introduce recipientul ntr-o baie de appn la rcirea complet. Dup rcire, se adaug 40 ml de acid acetic glacial.Cnd se observ o strlucire aurie a soluiei, aceasta se filtreaz. Dac aceast strlucire nu apare, coloraia va fi de calitate inferioar.Hematoxilina MayerHematoxilin ................................................... 5,0 gAp distilat ............................................... 700,0 mlAlaun de potasiu ............................................ 50,0 gGlicerin .................................................... 300,0 mlIodat de sodiu .................................................. 0,4 gAcid acetic glacial ....................................... 20,0 mlSe dizolv hematoxilina ntr-o cantitate redus de ap, apoi alaunul naproximativ 650 ml de ap distilat. Se amestec cele dou soluii i se completeaz pn la 700 ml. Se adaug iodatul de sodiu n soluie, dup care aceasta se nclzete blnd pentru a grbi oxidarea hematoxilinei.Soluia se las la rcit pentru o jumtatede or, se filtreaz, apoi se adaug acidul acetic glacial i glicerina. Soluia poate fiutilizat imediat i este stabil 2-3 luni.Tehnica de colorare1. Deparafinarea i hidratarea cu ap distilat a seciunilor;2. Se imerseaz preparatele ntr-una din soluiile de hematoxilin, un timp variabil, conform variantei de hematoxilin ntrebuinate: 5-10 minute pentruhematoxilina Mayer, 5 minute pentru hematoxilina Harris i 15 minute pentruhematoxilina Ehrlich;3. Se spal lamele cu ap distilat, apoi se introduc n soluia de albstrire Scottpentru 1-2 minute. Se cltesc n ap distilat i se examineaz la microscop.Seciunea trebuie s fie supracolorat;4. Se difereniaz cu alcool - acid 0,5% pentru a ndeprta excesul de colorant din fond, lsnd colorai numai nucleii;5. Cltire cu ap distilat i apoi reimersare n soluia de albstrire Scott pentrunc 1-2 minute;6. Se reexamineaz la microscop i dac seciunile sunt suficient decolorate secontinu cu pasul urmtor. Dac seciunea este insuficient difereniat atunci serepet paii 4 i 5;7. Splare n ap de robinet 5-10 minute;8. Colorare cu eozin alcoolic (se las lamele cu seciuni n soluia de colorarepn cnd acestea sunt uor supracolorate);9. Cltire n 2 bi de etanol 95%;10. Difereniere n alcool absolut pn cnd se obine o coloraie optim;11. Deshidratare ntr-o baie de alcool absolut;12. Clarificare n cteva bi de xilol;13. Montarea lamelelor cu balsam de Canada, Xam sau alte medii neutre demontare care sunt miscibile cu xilolul.Rezultatul colorriiNucleii albastru purpuriuHematiile rouCelulele musculare roz intensFibrele de colagen rozNot:Pentru realizarea coloraiei Hematoxilin-Eozin, se poate folosi oricare din soluiile de hematoxilin prezentate la reactivi.6.5. MontareaMontarea presupune n prealabil deshidratarea i clarificarea seciunilor.nainte de introducerea lamelor cu seciuni n prima baie de etanol, acestea seusuc prin compresare uoar cu hrtie de filtru pe ambele fee. De asemenea, lamele se terg pe verso cu un tifon curat pentru a ndeprta resturile de colorant.Urmeaz deshidratarea:1. Etanol 95 %, 5 minute;2. Etanol 95 %, 5 minute;3. Etanol 100 %, 5 minute;4. Etanol 100%, 5 minute;5. Toluen, 10 minute.Dac seciunile nu sunt complet deshidratate, la introducerea lor n toluen vaapare o turbiditate albicioas. Aceasta va limita conservabilitatea preparatelor.Medii de montareBalsamul de CanadaEste o rin a coniferului Abies balsamea, dizolvat n proporie de 55 % nxilol. Prin nvechire capt o coloraie glbuie, iar unele coloraii nu se conservcorespunztor (ex. coloraiile cu fucsin acid, verde luminos).Pe lama umectat cu toluen se pune o pictur de mediu de montare, iardeasupra se aeaz o lamel:1. Lamela se aeaz pe lam, sub o inciden de 45, atingnd cu marginea pictura de mediu de montare; dup ce pictura s-a extins pe toat lungimea marginii ce formeaz unghiul diedru cu lama, aceasta se preseaz uor2. Se depune o pictur de mediu de montare pe lam i una pe lamel, apoiacestea se aduc paralel pn cnd cele dou picturi conflueaz, apoi lamela sepreseaz uor.Se ndeprteaz eventualele bule de aer de sub lamel cu ajutorul unui ac dedisociere. Excesul de mediu de montare se ndeprteaz cu ajutorul unui tifon mbibat n benzen.Preparatele histologice astfel obinute se menin n poziie orizontal la temperatura camerei, timp de 2-3 zile.6.6. Etichetarea i arhivareaDup ce excesul de mediu de montare este ndeprtat, preparatele se poteticheta. Preparatele histologice se eticheteaz prin plasarea unor mici etichetedreptunghiulare adezive la captul mat al lamei. Aceast etichet se completeaz cuajutorul unei tu rezistent la ap i va cuprinde instituia, numrul din registrul laboratorului, anul, natura probei, coloraia etc. Arhivarea preparatelor histologice trebuie s asigure n primul rnd protejareaacestora de ocuri mecanice, de lumin, umiditate i praf. Dup interpretareamicroscopic i fotografierea aspectelor morfologice de interes, preparatele histologice permanente se arhiveaz n cutii speciale n ordinea seriei, n fante numerotate, iar cutiile se introduc n sertarele histotecii. Blocurile de parafin se vor pstra n plicuri care vor avea aceleai nsemnri ca i preparatele i vor fi depozitate n rafturile unor dulapuri special destinate acestui scop. n registrul de laborator, n dreptul fiecrei probe de esut, se vor nota datele de identificare i locul de depozitare al preparatelor i blocurilor (Histoteca nr., sertarul nr, cutia nr.., rndul nr...). Ele se menin minim 10 ani i sunt refcute cnd este necesar.