Prima Traducere

41
2 Drojdie Arhitectura Celulara și Funcție 2.1 Caracteristici generale ale celulei de drojdie Celulele de drojdie prezintă o mare diversitate în ceea ce privește dimensiunea celulei, forma și culoarea. Chiar și celulele individuale dintr-o anumită tulpină de drojdie a unei singure specii poate afișa heterogenitate morfologică și de culoare. Acest lucru se datorează în principal modificărilor condițiilor fizice și chimice din mediul înconjurător. Între diferite specii de drojdie, dimensiunea celulei poate varia foarte mult. În cele ce urmează ne vom concentra pe S. cerevisiae. Informații mai detaliate și trimiteri la citologia drojdie pot fi găsite în [Walker, 1998]. Celulele S. cerevisiae sunt în general de formă elipsoidală avand între 5 până la 10 μm la diametrul mare și 1 la 7 μm la diametrul mic. Adică volumul de celule este 29 sau 55 microni 3 pentru un haploid sau o celulă diploid, respectiv, dimensiunea celulei crește odată cu vârsta. Constituenții macromoleculari ai drojdiei cuprind: proteine, glicoproteine, polizaharide, polifosfați, lipide, și acizi nucleici (Tabelul 2-1). 2.2 Metode citologice Celulele de drojdie necolorate cu greu pot fi vizualizate prin microscopie optică. La 1000 de ori mărire, poate fi posibila vaderea vacuolei drojdie și a corpilor de incluziune a citosolului. Prin microscopie cu contrast de fază, împreună cu tehnicile de colorare adecvate, mai multe structuri celulare pot fi distinse. Coloranții Fluorochromic pot fi utilizati cu o microscopie fluorescenta pentru a evidenția caracteristicile interiorului celulelor, precum și suprafața celulei [Pringle et al., 1991]. Un instrument foarte convenabil pentru a localiza și chiar pentru a urmări mișcarea anumitor proteine in interiorul celulelor de drojdie este utilizarea de "proteina” verde fluorescentă (GFP) de la meduze (Aequorea victoria) ca o moleculă de raportor, și mai multi derivați de GFP cu

description

.

Transcript of Prima Traducere

Prima traducere

2 Drojdie Arhitectura Celulara i Funcie2.1 Caracteristici generale ale celulei de drojdie

Celulele de drojdie prezint o mare diversitate n ceea ce privete dimensiunea celulei, forma i culoarea. Chiar i celulele individuale dintr-o anumit tulpin de drojdie a unei singure specii poate afia heterogenitate morfologic i de culoare. Acest lucru se datoreaz n principal modificrilor condiiilor fizice i chimice din mediul nconjurtor. ntre diferite specii de drojdie, dimensiunea celulei poate varia foarte mult. n cele ce urmeaz ne vom concentra pe S. cerevisiae. Informaii mai detaliate i trimiteri la citologia drojdie pot fi gsite n [Walker, 1998]. Celulele S. cerevisiae sunt n general de form elipsoidal avand ntre 5 pn la 10 m la diametrul mare i 1 la 7 m la diametrul mic. Adic volumul de celule este 29 sau 55 microni 3 pentru un haploid sau o celul diploid, respectiv, dimensiunea celulei crete odat cu vrsta. Constituenii macromoleculari ai drojdiei cuprind: proteine, glicoproteine, polizaharide, polifosfai, lipide, i acizi nucleici (Tabelul 2-1).

2.2 Metode citologiceCelulele de drojdie necolorate cu greu pot fi vizualizate prin microscopie optic. La 1000 de ori mrire, poate fi posibila vaderea vacuolei drojdie i a corpilor de incluziune a citosolului. Prin microscopie cu contrast de faz, mpreun cu tehnicile de colorare adecvate, mai multe structuri celulare pot fi distinse. Coloranii Fluorochromic pot fi utilizati cu o microscopie fluorescenta pentru a evidenia caracteristicile interiorului celulelor, precum i suprafaa celulei [Pringle et al., 1991].Un instrument foarte convenabil pentru a localiza i chiar pentru a urmri micarea anumitor proteine in interiorul celulelor de drojdie este utilizarea de "proteina verde fluorescent (GFP) de la meduze (Aequorea victoria) ca o molecul de raportor, i mai multi derivai de GFP cu fluorescen spectrala mutata pe alte lungimi de und. Fuziunile de gene ce prezinta interes cu gena GFP (N-sau C-terminal), permite de asemenea, urmrirea destinului i a exprimarii proteinelor de fuziune urmate de microscopia fluorescenta [Niedenthal et al, 1996;.A se vedea, de asemenea, capitolul 4].Gama de funcii celulare vizualizate este cu mult crescut, atunci cnd anticorpii monospecifici produi impotriva proteinelor structurale sunt cuplai la colorani fluoresceni, cum ar fi izotiocianatul de fluorescein (FITC) sau Rodamin B.

Fluxul citometriei are mai multe aplicatii in studiile drojdiei. De exemplu, sortarea celulelor activate prin fluorescen (FACS) poate monitoriza progresia ciclului celular de drojdie, atunci cnd pereii celulari sunt etichetati cu Concanavalina A conjugat cu FITC i celule proteice cu izotiocianat tetrametil (TRITC). Aceste etichete permit colectarea de informaii cantitative cu privire la proprietile de cretere ale celulelor individuale de drojdie, in timpul progresului prin ciclul lor celular.

Ultrastructura i arhitectura macromoleculara a Organitului pot fi obinute numai cu ajutorul microscopiei electronica, care, n procedurile de scanare este utila pentru studierea topologiei de celule, n timp ce seciunile ultrasubtiri sunt eseniale n microscopia electronic de transmisie pentru a vizualiza structura fin intracelular. Microscopia cu for atomic poate fi aplicata la celulele neacoperite, nefixate de imagistica suprafeelor celulare ale diferitelor tulpini de drojdii sau de celule n condiii de cretere diferite.2,3 celulele organite mobile ale drojdiei si compartimentele eintr-o celula de drojdie idealizata (Figura 2-2), urmtoarele caracteristici ultrastructurale se pot observa (Figura 2-3): peretele celular, periplasma, membrana plasmatica, invaginare, cicatricea mugurelui, citosol, nucleu, mitochondrion, ER, reticul endoplasmatic; aparatul Golgi, vezicule secretorii, vacuole; peroxizom. n mod evident, celulele de drojdie mprtesc cele mai multe dintre caracteristicile structurale i funcionale cu eucariotele mai mari. Spre deosebire de celulele de mamifere, particularitile celulelor de drojdie sunt c ele sunt nconjurate de un perete celular rigid i dezvolta cicatrici la natere n timpul diviziunii celulare; vacuola corespunde lizozomilor n celulele mai mari. Tabelul 2-3 ofer o list de enzime de marcare care pot fi utilizate pentru a identifica n mod specific aceste structuri.

Structurile subcelulare din celulele de drojdie pot fi izolate de protoplaste sau de celulele intacte prin ruperea peretelui celular, nainte de centrifugarea diferenial.2.3.1 Celula InvelitoareCelul de drojdie invelitoare este o capsula protectoare, formata din trei constitueni majori (inauntru si afara): membrana plasmatica, spaiul periplasmic, si peretele celular. n S. cerevisiae, celula invelitoare are circa 15% din volumul total de celule i are un rol major n controlul proprietilelor osmotice i permeabile ale celulei.

Membrana plasmatica este de o grosime de aproximativ 7 nm, cu unele invaginari n citosol. Compoziia lipidica cuprinde n principal fosfatidilcolina i fosfatidiletanolamina, cu proporii mici de phosphaditylinositol, fosfatidilserina sau phosphadityl-glycerole, precum i steroli, n principal, ergosterol i zymosterol. Membrana de proteine a drojdiei include urmtoarele catagorii: (i) ancore citoschelet; (ii) enzime pentru sinteza peretelui celular;

(iii) proteine pentru transducia semnalului de transmembranare; (iv) proteine pentru transportul substanei dizolvate (permeases, canale, ATP); (v) facilitatori de transport, cum ar fi ABC (ATP caset de legare) proteine implicate ntr-un transport multidrog.

Astfel, funciile principale ale membranei celulelor de drojdie este de a oferi permeabilitate selectiva, adic de a controla ceea ce intr i ce iese din citosol. Cel mai important este rolul proteinelor membranare in reglarea nutritiei drojdiei, cum ar fi absorbia de carbohidrai, compui cu azot sau ioni, i extrudarea moleculei periculoase pentru celula. Alte aspecte importante sunt exo-i endocitoza de molecule de marf, reacii de stres, i sporulare.

Periplasma drojdiei este (35-45 A), un subire perete celular, regiune asociat extern membranei plasmatice i intern a peretelui celular. Aceasta conine n principal proteine secretate (manoproteine), care sunt n imposibilitatea de a ptrunde n peretele celular, dar ndeplinesc funcii eseniale n substraturi hidralizatoare care nu traverseaz membrana plasmatica: invertaza transform zaharoza n glucoz i fructoz, iar fosfataza acid catalizeaz eliberarea de fosfat liber de la compuii organici.2.3.2 peretele celular

Peretele unei celule de drojdie este o invelitoare remarcabil de groasa (100 pn la 200 nm) (Figurile 2-4 i 2-5), care conine aproximativ 15 pn la 25% din masa uscat a celulei. Majoritatea Constituenilor structurali ai peretelui celular sunt polizaharidele (80-90%), n principal glucani i mannan-uri, cu un procent mic de chitin. Glucanii (att -2, 6 i -glucani 1,3-glucani legati sunt reprezentati) asigur rezisten peretelui celular, formnd o reea microfibrilara. Mannan-urile sunt prezentate ca un miez -1,6-legat cu -1,2 - -1,3 i inlantuiri laterale. Chitina este un polimer de N-acetil glucozamina reprezentnd doar 2-4% din peretele celular i localizat n principal n cicatricile mugurilor. Poate fi interesant de observat c unele cretereri de drojdie filamentoase, cum ar fi Candida albicans, au un coninut mai ridicat de chitin, n timp ce chitina este absent din multe alte specii de drojdie. Alte componente ale peretelui celular sunt cantiti variabile de proteine, lipide, i fosfat anorganic. Dac celulele de drojdie sunt tratate cu enzime litice (de exemplu helicaza din sucurile digestive ale melcului; Zymolase sau Lyticase din surse microbiene) n prezena stabilizatorilor osmotici, peretele celular este eliminat ajutand formarea de spheroblasts, care pot fi vizualizati ca structuri globulare n microscop. Anterior formarea Spheroblast-ilor era adesea folosita pentru a facilita izolarea componentelor subcelulare. Remarcabil, spheroblasts menine potenialul de regenerare a peretelui celular (Figura 2-7).

Flocularea (agregare de celule asexuate) este un fenomen special de interes n fabricarea berii, deoarece celulele cu tulpini de drojdie de bere au tendina de a agrega ntr-o msur diferit. Drojdiile de la fund, utilizate n mod normal pentru fermentaii mai mari, au un grad mai mare de floculare (adic formarea de flocoane macroscopice de adeziune celular) dect drojdiile de top, care sunt utilizate pentru a face tipuri speciale de bere. Cel mai probabil, flocularea este o consecin a exprimrii difereniate a flocculinei, care interacioneaz cu receptorii de manoz pe peretele celular al celulelor nvecinate.2.3.3 Citosol i CytoskeletonCitoplasma drojdiei este un fluid coloidal acid ( pH = 5,25 ), care conine n principal ioni i compui organici cu mas molecular mic sau intermediara , i macromolecule solubile ( de exemplu proteine enzimatice , factori , glicogen ) . Enzimele citosolice de drojdie includ: ( i)calea glicolitica , ( ii)complexul sintazei de acid gras , i ( iii ) unele enzime pentru biosinteza proteinelor . Reeaua cytoskeletal garanteaza stabilitatea interna a celulei i furnizeaza organizare structural ce cuprinde microtubuli i microfilamente. Acestea sunt structuri dinamice care ndeplinesc funcia lor prin asamblare regulata i des- asamblare de subuniti individuale de proteine . Astfel , tubulinele i polimerizeaz monomeri ca heterodimeri pentru a da microtubuli , n timp ce monomerii globulari de G Actin polimerizeaza n microfilamente dublu - catenare ale F - Actin . Microtubulii i microfilamentele sunt de asemenea importante n mai multe procese dinamice care au loc n timpul mitozei i meiozei , septarii , i mobilitatea organicaCitoplasma drojdie conine mai multe categorii de microorganisme , care pot fi difereniate de substructurile organice :

(i) 80S ribozomi suspendati liberi (n contrast cu ER asociate i 60S ribozomi mitocondriali);

(II) particule lipidice, care ndeplinesc funcia de particule de depozitare sau pot servi in biosinteza membranei de drojdie;

(III) Proteazele, multi-subuniti complexe implicate n proteoliza proteinelor programate i n alte aspecte ale degradarii proteinelor sau ale transportului. 2.3.4 Nucleul i Elementele extracromozomiale Nucleul de drojdie este un organit rotund - lobat, aproximativ 1,5 m n diametru . Nucleoplasma este separata de citosol de o membran dubl care conine pori ntre 50 pn la 100 nm n diametru . De la distanta, SPBs-urile sunt conectate la microtubuli citosolici. Aceste elemente structurale joac un rol important n timpul diviziunii celulare , cytokinesis i formarea mugurilor . Spre deosebire de alte eucariote ,membrana nuclear n drojdie nu se dizolv n timpul mitozei .

n nucleu exist o regiune densa corespunztoare nucleolului care dispare n timpul mitozei i se reformeaza n timpul interfazei. Coninutul mare de nucleoplasma este reprezentata de AND-ul genomic care mpreun cu histone si non- histone este organizat n cromatina. Cromozomii de drojdie se formeaz i se inmultesc n timpul mitozei (sau meioz), dar se comport practic invizibil pentry tehnicile microscopice ( Figura 2-8) . n plus fa de materialul genomic, nucleele de drojdie conin utilaje pentru replicarea ADN-ului, repararea ADN-ului, transcriere i prelucrarea ARN mpreun cu substraturile necesare i factorii reglementori, i produse(precursoare) rezultate., precum i o parte din protezomii drojdiei.

Mai mult dect att, multe elemente genetice non-cromozomiale pot fi prezente n nucleul drojdie [Wickner, 1995].

(i) 2 m ADN este o plasmid ADN meninuta circular stabil, care se reproduce exact o dat n timpul fazei S. Aceste elemente pot fi prezente n numr mare de copii, i au fost utile n construcia de vectori de donare n tehnologia recombinanta a ADN-ului de drojdie. Nici o funcie nu a fost nc atribuita celor patru gene gsite n AND-ul 2 m.

(ii) ARN dublu catenar i ADN liniar se gsesc n tulpini de drojdie ucigae. Ele traiesc in gene pentru toxine, care vor fi periculoase pentru tulpinile non-ucigase.

(iii) Cele mai interesante elementele extracromozomiale sunt elementele Ty, singura clas de retrotransposons gsite n drojdie.

2.3.5 Sistemul de secretor i vacuoleleLa fel de comune pentru toate eucariotele, celulele de drojdie locuiesc ntr-un sistem de compartimente nconjurate de o membran, care sunt concepute pentru traficul de proteine n i n afara celulei. Reticulul endoplasmatic ( ER ) este locul de biosintez i modificare a proteinelor care urmeaz a fi exportate . Dup sinteza polysom-urilor asociate ER-ului situate pe suprafaa membranei ER , proteinele precursoare sunt translocate n lumenul ER. Din ER , proteinele sunt ndreptate de vezicule spre aparatul Golgi. Ulterior pot avea loc in Golgi modificari ale proteinelor de catre catenele laterale carbohidrate, de exemplu mannosylation . Transportul retrograd din Golgi la ER a fost stabilit ca un control al calitii pentru proteinele exportate.

Proteinele livrate de la Golgi sunt direcionate ctre diferite destinaii din interiorul celulei sau la exterior prin diferite vezicule secretoare. Aceste destinaii includ : ( i)vacuolele , (ii )regiunea mugurului n timpul mitozei orientate ctre transportul mediat de actin , (iii ) membrane plasmatica , ( iv )periplasma. n mod natural , doar cteva proteine sunt exportate n periplasm i la abunden sczut . Cu toate acestea , secvenele de semnal care sunt prezente n aceste proteine au fost fuzionate pentru a recombine proteinele heterologe cu valoare terapeutic , care sunt apoi secretate cu succes din celulele de drojdie .

Organetul cheie din drojdie implicat n traficul intracelular de proteine sunt vacuolele. Poate fi privit ca o form de component integrant a sistemului intramembranous. Rolul principal al acestui compartiment-Lizozom cum este clivajul proteolitic nespecific proteinelor, care implic o varietate de enzime litice intravacuolare: endopeptidaze, aminopeptidases i carboxipeptidaze.

Alte funcii fiziologice ale vacuolelor drojdiei includ: depozitarea de aminoacizi bazici, polifosfai i anumii ioni metalici; homeostaza concentraiilor de ioni citoplasmatici; osmoregulation.

2.3.6 peroxisomelePeroxisomele efectuiaza o varietate de functii metabolice in celule eucariote. n drojdie, peroxisomele (Figura 2-10) conin mai multe oxidaze care servesc n utilizarea oxidativa de surse specifice de carbon i azot. Organitele se dezvolta din peroxisome mici prezente n celulele glucozei crescute ca rezultat al sintezei rapide a enzimelor peroxisome, cum ar fi catalaza i oxidaza alcool-ului. Cele mai multe gene implicate n biogeneza peroxizomilor (gene PEX) au fost caracterizate pn n prezent in S. cerevisiae. Cum mitocondriile de drojdie duc lipsa de oxidare - peroxisomele sunt locul de degradare a acidului gras (Figura 2-11).2.3.7 MitocondriileCelulele de drojdie conin mitocondrii care seamn structural cu aceste organite gsite n toate eucariotele. Prin urmare, mitocondriile drojdiei au servit drept modele pentru a studia intens structura mitocondrial, activitatea i biogeneza [Glick i Pon, 1995]. Cu toate acestea, mitocondriile drojdiei prezint o varietate de caracteristici importante, care sunt absente de la omoloagele lor din organisme mai mari, n special celulele de mamifere.

Caracteristicile structurale generale ale mitocondriilor (Figura 2-12) includ:

(i) o membran exterioar - care conine enzime implicate n metabolismul lipidic,

(ii) spaiul intermembranar(iii) o membran interioar - care conine NADH i dehidrogenaze succinat, componentele lanului respirator i sintaza ATP, i diferite proteine de transport membranare integrale,

(iv) matricea mitocondriala - care conine enzime de oxidare a acizilor grai, ciclul acidului citric, ADN-ul mitocondrial mpreun cu transcripia mitocondriala i proteinele utilajelor de sinteza (inclusiv 60S ribozomii mitocondriali i mitocondriale ARNt).

Mitocondriile drojdiei sunt structuri dinamice a cror dimensiune, form i numr poate varia foarte mult n funcie de tulpina de specificitate, de faza ciclului celular, i condiiile de cretere, n care factori importani sunt: presiunea parial a oxigenului, concentraia de glucoz, prezena substraturilor nefermentabile, disponibilitatea de steroli i acizi grai , i a anumitor ioni metalici (Mg + +) n condiii aerobe , mitocondriile drojdiei sunt implicate n sinteza ATP-ului cuplat la fosforilrile oxidative. Activitile ciclului acidului citric i lanul respirator vor depinde n mare msur de speciile de drojdie i expresia efectului Crabtree . n condiii anaerobe , mitocondriile par a fi dispensabile cel puin pentru funcia respiratorie . De fapt , aa-numita , mutanti mici, care nu dispun de mitocondriile funcionale sunt viabile . Cu toate acestea, mitocondriile pot ndeplini i alte funcii n fiziologia celulei de drojdie , implicnd c mitocondriile sunt relevante pentru metabolismul celular intact chiar i n condiii anaerobe :

- Sinteza i desaturarea acizilor grai i lipidelor,

- Biosinteza ergosterolului ,

- Reacii la stres i adaptarea la stres ,

- Enzime pentru sinteza anumitor aminoacizi i acizi dicarboxilici , pyrimididice i bazele purinice, porfirin i pteridine ,

- Mobilizarea de glicogen ,

- Producia de arom " a componentelor.

Importana mitocondriilor drojdiei este cel mai bine ilustrat de faptul c aproximativ 8- 10% din genele de drojdie nucleare sunt implicate n biogeneza acestor organite i meninerea funciilor lor . Marea majoritate a acestor proteine sunt sintetizate de ribozomii din citosol i ajung sa fie importate n mitocondriile drojdie , care au potenialul de a biosintetiza doar 12 proteine diferite ( subuniti cytocromoxidaze , citocromul b , cele ase subuniti de NADH dehidrogenaza , factori de splicing ) pe lng mitocondrialul rRNAs ( 15S i 26S subuniti ) i complementul ARNt a mitocondrialelor . Biogeneza mitocondriilor, care implic cooperativitate genetic ntre genele nucleare i genomul mitocondrial , a fost studiat pe larg n S. cerevisiae , deoarece mai multe tipuri de mutaii pot fi utilizate n acest model de organism . 5 genomul de Drojdie

5.1 Proiectul ordonarii genomului de drojdie

n 1989, sa decis initierea unui proiect de secveniere a drojdie n cadrul programelor de biotehnologie ale UE. Bazat pe o abordare de reea, iniial, aproximativ 35 de laboratoare europene au devenit implicate n aceast ntreprindere [Vassarotti & Goffeau, 1992]. Cromozomul III a fost primul cromozom finalizat n 1992 [Oliver et al.,1992]. n 1994, cromozomii XI i II au fost publicati de proiectul UE. La scurt timp, o serie de alte laboratoare s-au alturat proiectului i au fost de accord cu o colaborare internaional care s permit finalizarea ntreagii secvene a genomului de drojdie n 1995. n cele din urm, mai mult de 600 de oameni de stiinta din Europa, America de Nord i Japonia au devenit implicati n acest efort [Levy, 1994]. Diagrama (Figura 5-1) enumer laboratoarele implicate n proiectul de colaborare din care a fost lansata ntreaga secven, n aprilie 1996.

5.1.1 Clonarea i cartografierea ProceduriiSuccesiunea cromozomului III a pornit de la o colecie de suprapuneri de plasmid sau clone fage lambda, care au fost distribuite de ctre coordonatorul de ADN la laboratoarele de contractare . Cu toate acestea, curnd a devenit evident c bibliotecile cosmide comandate au fost mult mai avantajoase pentru a ajuta secventiere la scar larg. Mai multe dintre aceste libaries au fost construite [de exemplu Stucka & Feldmann, 1994; Thierry et al, 1995; . .Riles et al, 1993] i folosite pentru restul cromozomilor de drojdie. Avantajele evidente ale clonarii segmentelor de ADN n cosmide, care primesc n mod normal 35-45 kb de ADN , au fost :( i) gene mai mari ar putea fi obinute pe o singur clon recombinanta, (ii ) mai multe gene legate pot fi izolate mpreun cu regiunile lor ; intergenice ( iii ) mai puine colonii trebuie s fie meninute i analizate pentru a izola o clon de interes ; ( iv ) clonele cosmid s-au dovedit a fi stabile timp de muli ani n condiii de depozitare normale . Nu in mod surprinzator, izolarea secveniala a clonelor cosmid suprapuse ( exemplul prezentat n figura 5-2 ) a permis legtura fizic i caracterizarea larg de gene de la diferite organisme .

Pentru a construi o bibliotec cu o acoperire ct mai complet si cu ct mai puine clone posibil, fragmente ADN clonate trebuie distribuite aleatoriu pe ADN. n aceste condiii, numrul de clone (N) dintr-o bibliotec reprezentnd fiecare segment genomic cu o anumit probabilitate (P) este N = ln (1-P) / ln (1-f) unde f este lungimea inseriei exprimat ca fracie de mrimea genomului [Clarke & carbon, 1976].

5.1.2 Strategii de secventiere, secven de asamblare i de control al calitii

5.1.2.1 Strategii de secveniere

n reeaua european, clonele au fost distribuite la laboratoarele colaboratoare n conformitate cu un sistem elaborat de ctre coordonatorii ADN. Fiecare laborator contractat a fost liber sa aplice strategii de secveniere i propriile tehnici, cu condiia ca secvenele sa fie determinate n ntregime pe ambele catene i sa fie obinute citiri clare. Dou abordri principale au fost folosite pentru prepararea de subclone pentru secveniere: ( i) generarea de sublibraries prin utilizarea unor serii de enzime de restricie adecvate sau de deleii ale subfragmentelor corespunztoare, formulate de exonucleaza III , (ii ) generarea de biblioteci rapide formate din cosmide ntregi sau fragmente de subclona prin impartirea aleatoare a ADN-ului . Secvenierea prin tehnica Sanger a fost facuta fie manual, etichetata cu [ 35S ] dATP fiind metoda preferata de monitorizare, fie prin dispozitive automate, urmand diversele protocoale stabilite . Au fost folosite dou tipuri de dispozitive de detectare on-line cu etichetarea fluorescent: Applied Biosystems ABI373A i Pharmacia, ALF. Un laborator a folosit sistemul de exterminare directa a electroforezei de companie GATC ( Konstanz ). Proceduri similare au fost aplicate la succesiunea de cromozomi din afara reelei europene. Laboratoarele americane s-au bazat n mare parte pe secventierea la scar larg de catre mainrii.

5.1.2.2 Secventierea Telomerelor

Cromozomi Telomerii ai drojdie au prezentat o anumit problem. Datorit substructuri lor repetate i lipsa de locuri restrictive adecvate au putut fi clonai prin proceduri convenionale, cu doar cteva excepii. Secvenele au fost apoi determinate de clone de plasmid specifice obinute prin " capcan clonarii telomerilor", o strategie elegant dezvoltata de E. Louis la Oxford [Louis, 1994, Louis & Borts, 1995].

5.1.2.3 Secvena de asamblare i de control al calitii

n cadrul reelei europene, toate secvenele originale au fost depuse de ctre laboratoarele care colaboreaz la Institutul Martinsried de Secvente a Proteinelor (MIPS), care a acionat ca un centru de informatic.

Secvenele au fost inute ntr-o bibliotec de date, asamblate n succesiuni ce creteau progresiv, i actualizate n timpul desfurrii proiectului prin aplicarea criteriilor corespunztoare ntr-un numr de controale de calitate, ncepnd cu cromozomul XI [Vassarotti et al., 1995]. n colaborare cu coordonatorii ADN-ului secvenele cromozomiale finale au fost derivate.

5.1.3 Ordonarea Analizei

mpreun cu declaraiile de date oferite de ctre laboratoarele singure, i n cele din urm atunci cnd secvenele complete au fost disponibile, datele au fost supuse unei analize prin diveri algoritmi . Secvenele au fost interpretate utiliznd urmtoarele principii :

(i) Toate locurile de imbinare ale intronilor ce constau in modele special definite [ Kalegoropoulos , 1995 ; Kleine & Feldmann , nepublicat ] au fost listate .

( ii) Orice ORF care conine cel puin 100 de codoni nvecinati ca sens i care nu sunt cuprinsi n ntregime ntr- un ORF sau in vreo suvita de ADN a fost enumerat ( aceasta lista include si ORF-uri parial suprapuse ).

( iii ) Cele dou liste au fost fuzionate i toate perechile cu locuri de mbinare ale intronilor / puncte ramur ce apar n interiorul unui ORF dar n orientare opus au fost luate n considerare.

( iv ) regiunile centromerelor i telomerilor, precum i genele ARNt i elementele Ty sau rmie ale acestora au fost cercetate n comparaie cu seturile de date caracterizate anterior de astfel de elemente [ Kleine & Feldmann , nepublicate ] inclusiv nregistrrile bazei de date introduse ntr-o biblioteca de gene ARNt i ARNt actualizat permanent [ Sprinzl et al . , 1996 ] , i prin aplicarea programului de scanare ARNt [ Fishent & Burke , 1991 ] .

5.2 Genomul Drojdie: Viaa cu 6000 de gene

5.2.1 Proteomele Drojdiei: Cadrul citirii deschise i Functia GenelorTermenul "Proteome" a fost inventat pentru a descrie un set complet de proteine sintetizate de o via celulara [Wilkins i colab., 1996]. Odat cu finalizarea succesiunii genomului de drojdie, pentru prima dat, a devenit posibil s se defineasc proteomul unei celule eucariote.

Dimensiunile majoritarelor cadre deschise citii ( ORF) din drojdie variaz ntre 100 i peste 4000 de codoni . Mai puin de 1 % dintre ORF este estimata a fi mai mic de 100 codoni; cele mai mici peptide mature care au fost caracterizate sunt cei doi feromoni de mperechere(respectiv 11 i 13 aminoacizi,).

Este de remarcat faptul c numrul de gene de drojdie pentru care funciile pot fi atribuite prin comparaii cu intrrile de baze de date de la mai multe alte organisme , care s-a dezvoltat destul de exponenial n ultimii ani, nu a crescut substanial . O observaie similar a fost deja fcut , atunci cnd genomul complet de procariote mici , cum ar fi Haemophilus influenzae ( 1,8 Mb ) [ Fleischman et al . , 1995 ] , Mycoplasma genitalium ( 0,6 Mb ) [ Fraser i colab . , 1995 ] , sau Archeon Methanococcus jannaschii ( 1,7 Mb ) [ . Bult et al , 1996 ] au fost determinate : o mare parte a genelor au avut omologii din alte organisme . Prin urmare , probabil c, avem de a face cu un fenomen general deoarece se pare c multe dintre funciile noi necesit doar o transcriere tranzitorie sau cu nivel sczut ntr-un organism, sau sunt n primul rnd - ncrengturi specifice .

mpreun cu raportul ntreagii secvene genomice , o clasificare a genelor de drojdie a fost stabilit la MIPS i a fost folosita ca baz pentru clasificarea genelor de la alte organisme . Unul dintre cele mai utile inventare de proteine de drojdie a fost alcatuit n Baza de date a Proteinelor de Drojdie ( YPD ) [ Garrels et al . , 1996 ] i sunt actualizate n mod regulat . (Cu toate acestea , n prezent aceast informaie este disponibila doar comercial ) . 5.2.2 Suprapunerea ORF , Pseudogene i IntroniCteva cazuri au fost constatate acolo unde suprapuneri de ORF chiar exist ntr-adevr n drojdie i sunt exprimate. Intr-un caz special, s-a mai artat c exprimarea celor doua ORF-uri are loc n diferite etape ale creterii drojdiei. O ntrebare interesant a fost ct de multe pseudogene ar putea fi prezente n genomul drojdiei. Din studii anterioare, s-a anticipat c acest numr n drojdie ar trebui s fie redus n comparaie cu acela din genomul mamiferelor. n general, aceast ipotez pare s fie adevrata pentru cea mai mare parte de cromozomi de drojdie, dar cromozom I s-a dovedit a fi o excepie de la aceast regul [ Bussey et al . , 1995 ] .

Cromozomul I este cel mai mic cromozom nuclear eucariotic funcional care se intampla n mod natural caracterizat pn acum. Centrala 165 kb seamn cu alti cromozomi ai drojdiei att n densitatea naltimii cat i in distribuia de gene. n contrast, secvenele rmase flancand acest ADN ( cele dou capete ale cromozomului ) au o densitate mult mai mica de gene, n mare parte nu sunt transcrise , nu conin gene eseniale pentru creterea vegetativ , i conin patru pseudogene aparente i o secven redundant 15 kb .

Aceste regiuni terminale repetitive constau intr-o repetare telomerica, flancata de AND-ul care este n strns legtur cu FLO1 , o gen de drojdie implicata n floculare de celule i care codific o serina. Pseudogenele sunt legate de gene de drojdie cunoscute, dar aucodoni interni de oprire. Grij extrem a fost luat n astfel de cazuri pentru a reconfirma secvenele din regiunile amintite de laboratoarele independente.

Numai o mic parte a genelor de drojdie, n jur de 4% din total, sunt prezise (sau deja demonstrate experimental) ca vor fi ntrerupte de introni. Pn n prezent doar dou cazuri au fost ntlnite n care doi introni sunt prezenti:, locus-ul MAT pe cromozomul III i o gena proteica ribozoma, RPL6A, pe cromozomul VII. n acesta din urm, al doilea intron codific un ARN mic. In general, intronul dintr-o anumit gen este situat la extrema captului 5 'al fiecarei gene, uneori chiar precede regiunea de codificare. Populaia predominant de gene care conin introni este recrutata de cele care codific proteinele ribozomale. Semnificaia funcional a intronilor nu este deloc clara, i n ciuda numrului mic de gene de drojdie ce conin introni, continua sa se dezvolte i sa menina un mecanism deosebit de sofisticat si complex pentru despicare.

5.2.3 Membrana Proteinelor , Proteine mitocondriale

Algoritmul ALOM [ Klein et al . , 1985 ] poate fi aplicat pentru a prezice deschiderea membranei putative . O prim estimare pentru cromozomul III a artat c aproximativ 38% din genele "reale" poate codifica pentru proteine transmembranare care conin ntre 1 i 14 membrane potenial transversabile[ Goffeau et al . ,1993a ]. O figur la fel de mare ( 142 ORF din 410 ), a fost gasita pentru cromozomiul II [ Feldmann i colab. , 1994 ] . Datele ordonate sistematic, obinute de la alti cromozomi ai drojdiei, sugereaz c acest lucru pare s se aplice, ca regul general, la drojdie [ Goffeau et al , 1993b ; . . Nelissen et al , 1995 ] . Chiar dac algoritmul poate da o estimare destul de mare, este posibil ca o treime din proteinele de drojdie sa trebuiasca s fie considerate ca fiind asociate cu structuri de membran .

Examinarea ORF pentru apariia secvenelor de semnal int a mitocondriilor putative este dificil datorit caracterului complex al acestor semnturi [ Hartl et al . , 1989 ] acest lucru ar putea fi realizat numai prin inspecie vizuala. Din moment ce nu toate proteinele care particip la biogeneza mitocondriilor sunt importate prin anumite secvene semnal , numrul exact de proteine implicate in mentinerea functiei mitocondriale, in drojdia de bere rmne necunoscut n prezent . O estimare aproximativ 8-10 % este c unele proteine de drojdie pot fi implicate n biogeneza mitocondriilor . 5.2.4 Alte entiti genetice

Pe lng genele care codific proteinele, informaii detaliate fost obinut despre organizarea genele pentru ARNt si alte RNAs mici, de Retrotranspozoni a drojdiei (elemente Ty denumite) , precum si secvene telomerice i centromerice . Genele pentru ribozomele RNAs sunt grupate n aproximativ 100 de copii pe braul drept al cromozomului al-XII-lea , n timp ce, cele mai multe copii ale genelor tARN sunt gsite mprtiate n ntreagul genom.

5.2.4.1 Genele Drojdie ribozomal

Genele ribozomale ARN sunt situate n cromozomul XII al drojdiei, unde formeaz o matrice de aproximativ 100 de uniti de transcripie aranjate tandem, fiecare cuprinznd secvenele de 28S , 5.8S i 18S ARNr . Numrul de uniti poate varia uor ntre tulpini ( Figura 5-8 ) .

5.2.4.2.2 Familii tARN , Redundana Genelor tARN , i variante de Gene tARN

Efectuand analiza de ansamblu a genomului de S. cerevisiae S288C folosind ajutor computerizat ar putea fi identificate cele 274 de gene ARNt nucleare intacte, codificate i o gena ARNt de pe cromozomul suplimentar XIV ntrerupt de un element de Ty1 aproape de captul 5 '

Dupa mai multe criterii , cele 274 de gene tARN de drojdie pot fi considerate gene active i grupate n 42 de familii ( Tabelul 5-1 ) de specificitate codon distincta. Cele dou isoacceptoare de metionin sunt atribuite familiilor distincte, in calitate de iniiator tRNAMeti i de elongator tRNAMet3, se disting n mod clar , att prin structura cat i prin funcie. n majoritatea cazurilor, copiile unice a unei familii impart secvente identice

in partea structural a ARNt-ului. Cu toate acestea, unele familii, pot s cuprind copii ale genei cu secvene puin variate care dau natere la perechi alternative de baze din tulpini sau nucleotide alternative la locurile unice de ARNt . De asemenea , variaii ale secvenelor de introni pot fi observate ntre diferiti membrii a unei familie. n total, variante de secvene ( inclusiv variantele intron ), exist n 11 familii de gene tARN. Secvenele de gene tRNASer3 reprezint cazuri speciale : n dou dintre ele , primul C lipsete n bucla anticodon ( n mod normal, citirea 5'CTGCTAA3 " ) . n cazul n care aceast "pierdere" nu este pur i simplu din cauza erorilor de secventiere, tARN rezultat ar trebui s fie o variant real, care are doar ase nucleotide n bucla anticodon . Genele pentru nonsens sau supresoare tRNAs missense pot fi incluse n familiile lor "mam", deoarece ele rezulta din mutatii special, din copii de gene individuale ale acestei familii .

Mai mult dect att, n tulpina S288C nu au fost detectate gene pentru trei ( variant) tRNAs-uri, structurile primare din care au fost raportate n literatura de specialitate : tRNAHis1 , tRNASer1 i tRNAThr1b . Dou explicaii sunt oferite : (i ) aceste ARNt sunt codificate de genele suplimentare care pot fi prezente n alte tulpini de drojdie, ( ii ) acestea (i poate altele ) variante de structuri ARNt sunt generate de editarea ARN . Prima posibilitate este susinut de faptul c ARN-ul " solubil " din diferitele tulpini au servit drept materie prim n purificarea ARNt-ului specific pentru secveniere . Mai mult dect att, au existat numeroase indicii din profilele tARN-ului n diferite tulpini de drojdie ( inclusiv tulpinile haploide sau diploide , cu diferite tipuri de imperechere ), c numrul i amplasarea anumitor isoacceptors a fost variabil . A doua presupunere este dificil de dovedit n prezent. Potrivit cunostintelor noastre, editarea ARN-ului nuclear a drojdiei de bere nu a fost raportata pn acum .

5.2.4.2.3 Introni i Procesare de precursori tRNAs

Secvene care intervin n genele eucariote tARN au fost descrise pentru prima data de tRNATyr-ul drojdiei [ Goodman et colab . , 1977 ] . Cu disponibilitatea secvenelor suplimentare, reguli pentru localizarea intronilor n cadrul secvenelor de codificare au fost stabilite, iar mecanismul de despicare a intronilor n drojdie a fost elucidat , iar componentele implicate n acest proces au fost caracterizate .

Surprinzator , intronii sunt gsiti n doar 10 familii nucleare de gene tARN ( Tabelul 5-1 ), dar oricare membru dintr-o anumit familie poate purta un intron . In general, intronii pentru o anumits specie tARN sunt identici sau demonstreza o secven similara foarte ridicata. Cu toate acestea, in cateva cazuri, intronii au lungimea variabil ( + / - o nucleotid ), precum i n succesiune .

Asa cum a fost studiat n anumite supresoare tRNAs , unele activiti de modificare par s necesite coninuturi de introni tRNAs in calitate de substraturi . n special, intronii pot fi obligai s introduc modificri anticodon la prima de baz n timpul prelucrarii a anumitor pre- tRNAs-uri astfel nct ARNt-urile mature sunt capabile sa citeasca codoni selectati. Cu toate acestea, aceast cerin a fost demonstrat c nu este universala, precum i modificrile la alte poziii n secvena ARNt nu necesit precursoare tRNAs ca substraturi, dei multe dintre modificri au loc n mod normal la nivelul precursorilor .

O observaie interesant a fost c intronii pot fi amestecati ntre genele omoloage ARNt [ Olson i colab . , 1981 ] . Putine informaii sunt disponibile despre modul n care secvene ce intervin ar putea afecta nivelul expresiei genice ARNt.

5.2.4.2.4 Multiplicitatea ARNt i Capacitatea Codon n drojdie

Studiile anterioare au aratat ca drojdia de bere , ca i alte organisme , are isoacceptoare nucleare codate pentru majoritatea dintre cei 20 de aminoacizi , de preferin, pentru a satisface degenerarea codului genetic . A devenit evident c " wobbling " n interaciunile : codon-anticodon permite reducerea numrului de tRNAs-uri necesare pentru a ine cont de ntreaga capacitate de decodare a unui organism [ Crick , 1966 ] i c "finetuning-urile ", interaciunilelor codoni- anticodonilor sunt mediate prin modificri de baz anticodon foarte precise n special tRNAs-uri . Regulile wobble particulare pentru poziia a treia a perechii codon - anticodon propuse pentru S. cerevisiae a dus la predicia a aproximativ 46 de ARNt-uri diferite [ Guthrie & Abelson , 1982 ] .

5.2.4.2.6 Redundana genelor ARNt i selecia Codon n drojdie

Studiile la nceputul anilor 1980 au artat deja o corelaie puternic ntre abundena tRNAs-urilor drojdiei i apariia codoniilor respectivi n genele proteinelor : gene care au fost cunoscute ca fiind puternic exprimate s-au dovedit a fi mai mult prtinitoare dect gene cu un nivel mai sczut de exprimare [ Ikemura , 1982; Bennetzen i Hall , 1982 ] . Aceste constatri au fost confirmate intr-un studiu usor de inteles care a investigat corelarea dintre redundana genei tARN i selecia translationala in drojdie utiliznd un eantion de 1756 de secvene proteice distinct codificate: o co-adaptare semnificativ mai puternic ntre alegerea codonului i numrul de copii a genei tARN a fost observat n gene extrem de exprimate [ Percudani i colab . , 1997 ] . Cuantificri exacte ale tuturor componentelor individuale ale populaiei ARNt-urilor nu sunt disponibile. O estimare a coninutului celular de 21 din 24 serii de tRNAs-uri, dateaz din 1982 [ Ikemura , 1982 ] i nu include nici unul dintre ARNt-urile rare . ntr-un studiu recent, Percudani et al . [ 1997 ] a constatat c numrul de copii de gene pentru speciile individuale de tARN-uri se coreleaz bine cu coninutul intracelular msurat anterior a celor 21 de specii ARNt . Aceasta , mpreun cu constatarea c exist o legtur strns ntre redundana genei ARNt i compoziia global de aminoacizi a proteinelor drojdiei indic c nivelurile intracelulare de ARNt n celulele de drojdie ce cresc normal, sunt determinate n principal de numrul de copii a genei.Cu toate acestea , variaia coninutului de tARN in drojdia de bere , la rate de cretere diferite, nu a fost studiat n detaliu cum a fost fcut , de exemplu , n E. coli [ Dong et al . , 1996 ] . Numai pentru anumite ARNt-uri de drojdie , cum ar fi isoacceptors serin , abundena relativ a fost gsita variind n celule care creteau la viteze diferite [ Heyman i colab . , 1994 ] . Studiile in vitro au sugerat c att TFIIIB70 i TFIIIC joac un rol n coordonarea transcrierii nivelului polimerazei III cu rata de cretere a celulelor [ Sethy i colab . , 1995 ] .

De asemenea, trebuie remarcat faptul c s-au observat variaii n numrul de copii de gene majore ARNt n diferite tulpini de drojdie, dar par a fi tolerate . Aceste constatari sugereaza faptul ca trebuie sa existe mecanisme mai complicate care permit coninutului tARN-urilor s fie adaptate prin reglementarea copiilor expresiei unice a genei tARN. Cu toate acestea, problema cu privire la modul in care expresia genelor individuale ARNt este reglementat in vivo este nc o problem datorit redundanei genele ARNt .5.2.4.2.7 Organizarea genomica a genelor ARNt ale drojdiee i aspecte evolutive

37 din cele 42 de familii de drojdie tARN sunt reprezentate de mai multe copii ale genei mprtiate de-a lungul genomului. Aliniamente ale secvenelor genei ARNt-uri isoacceptoare codificate arat c copiile individuale au o particularitate in comun cu genele care codific proteinele: n majoritatea cazurilor, puine , dac nu chiar aproape deloc, omologia nu este vzut n regiunile adiacente dintre membrii diferii ai unei familii, si de asemenea nu este vzut nici ntre membrii din diferite familii de gene . Poate doar, unele de 10 sau cam asa ceva perechi de baze sunt conservate n cadrul regiunilor imediat urmatoare a diferiilor membrii ai unei familii de gene ARNt. Exist cteva excepii n care similitudini mai extinse n regiunile adiacente sunt vzute ( de exemplu , pentru cele dou gene tRNAIle1 , i pentru dou copii de gene ale tRNAPro1 pe Cromozomii XII i respectiv XIII), sugernd c dispersia acestor exemplare de gene care s-au format prin duplicare a avut loc numai recent .

n ceea ce privete bazele transcrierii genei tARN, care este reglementata de secvene promotorii interne, secvena divergenei n regiunile adiacente nu este att de surprinztoare .

Cu toate acestea , avnd n vedere faptul c factorul de transcriere TFIIIB se leaga de secvente care preced partea structural a genelor tARN , " ajustarea " expresiei genelor tARN ar trebui s depind de caracterul acestor secvene [ de exemplu , Kassavetis i colab . , 1990 ] .

n timp ce ntreinerea multiplicitatii genei tARN este uor de explicat prin conversia genei interlocus [ Amstutz i colab. , 1985 ] , ntrebri cu privire la stabilirea mecanismului ce sta la baza multiplicitatii genelor tARN rmn n mare parte nerezolvate . Un proces mediat de transcriere invers pare plauzibil: conservarea de introni nu nltura aceast ipotez deoarece despicarea este un pas mai trziu n maturarea tARN i precursorii ARNt pot fi considerati substraturi pentru retrotranscriptie [ Olson , 1991 ] . Alte mecanisme de dispersie, cum ar fi evenimentele mediate de retrotransportori, au fost propuse pentru a fi implicate n amplificarea genei ARNt [ Warmington et al . , 1987 ] , dar cunotinele noastre actuale privind organizarea dintre genele ARNt de drojdie confer aceast posibilitate improbabila .

Compararea ntregilor secvene de cromozomi releva apariia aa-numitelor regiuni omologii Cluster ( CHRs ), n care genele omoloage sunt aranjate n aceeai ordine , cu aceeai orientare transcripional relativ , pe doi sau mai multi cromozomi. Wolfe i Shields (1997 ) au definit 55 de astfel de blocuri i au sugerat un model destul de convingtor care explic omologiile extinse vzute n drojdia de astzi facute de ( allo - sau auto) - tetraploidizarea dintre dou tulpini vechi de S. cerevisiae , urmate de translocari reciproce i stergeri de 85 % din genele duplicate .

Este evident ca cele mai mari CHRs-uri mprtesc o serie de " perechi " de gene tARN, att n aceeai locaie relativ cat i in orientare . Modelele observate implica faptul c aceste gene particulare ARNt au fost copiate mpreun cu proteinele ce se ocupau de codificarea genelor vecine . Presupunnd c genele ARNt sunt o achiziie veche ce a evoluat, i lund n considerare faptul c regiunile de flancare ale acestor perechi de gene tARN s-au despartit complet, constatarile nostra sunt intru-totul de acord cu ideea ca CHRs-urile au fost generate de suprapunerile genelor vechi. Cu toate acestea, avnd n vedere faptul c o mare varietate de exemplare de gene duplicate, codificari de gene precum i gene tARN , se gsesc mprtiate de-a lungul mai multor locatii in genomul drojdie, sunt necesare postulari de mecanisme suplimentare de amplificare a genei i de dispersie . n special pentru genele tARN , dintre care majoritatea ( 232/274 ) se afl n afara CHRs-irilor , ar trebui s invoce dou tipuri diferite de mecanisme prin care sa fie generate duplicri : ( i) co - evoluia de mari segmente cromozomiale care conin att codarea proteinelor cat i genele ARNt ; ( ii ) introducerea " duplicarii" copiilor de gene ARNt de la locurile singulare din alti cromozomi , un proces care ar fi putut deveni operativ dup speciaie/ specificatie .5.2.4.3 Drojdie Ty Elemente

Cinci tipuri diferite de elemente Ty care prezint omologie substanial la retrovirusuri i retrotranspozonii de plante i animale sunt prezente n genomul de drojdie: Ty1, Ty2, i Ty4 aparin clasei "COPIA" a retrotransposonilor, n timp ce Ty3 este un membru al familiei "igan" [revizuire, Sandmeyer, 1992]. S288C conine 32 Ty1 i 13 Ty2 elemente complete, n timp ce Ty4 este prezent la doar trei locaii i Ty3 are loc n dou exemplare. Ty5, gsit n cromozomul III, a aprut ca o noua clasa de transpozoni n drojdii.5.2.5 Genomul: Arhitectur i Organizaia

5.2.5.1 Densitatea Genelor i Amenajarea de gene care codific proteine

Din numrul de gene i dimensiunea total a genomului drojdiei se ajunge la o densitate a genei de aproximativ 2 kb pe cadru de citire deschis. Acesta a stabilit c densitatea genelor n toti cromozomii drojdiei este destul de asemntoare . Cu excepia ORF-urilor contribuite de elementele Ty , ORF-urile ocup o medie de 70 % din secvenele . Acest lucru las doar un spaiu limitat pentru regiunile intergenice care pot fi gndite s poarte elemente de reglementare majore, implicate n ntreinerea cromozomilor, replicarea i transcrierea ADN-ul.

Natura compacta a genomului S.cerevisiae se poate observa n comparaie cu sistemele eucariote mai complex. De exemplu, genomul elegans C. conine o poteniala gena ce codific proteinele numai la 5-6 kb [ Hodgkin i colab . , 1994 ] . n genomul uman , densitatea genelor fusese estimata a fi de numai o singur gen n 30 kb [ Olson , 1993 ] , dup ce proiectul de ordine este disponibil , aceast figura este o gena in aproximativ 100 kb .

Diferena dintre cele dou gene de drojdie pare a se datora faptului c , n drojdia de fisiune cca 40 % din gene conin introni , n timp ce numai o fraciune mic (mai puin de 5 % )din genele care codific proteine din S. cerevisiae sunt prezise ( sau deja demonstrate experimental ) ca vor fi ntrerupte de introni[ Dujon , 1996 ] .

n ceea ce privete transcrierea genelor care codific proteine, o varietate de elemente au fost identificate si caracterizate , care sunt operative n iniierea transcrierii , de reglementare i terminare . Nu toate genele de drojdie sunt precedate de o caset TATA canonic , i rmne nc deschis ce tip de secvene AT - bogate sau alte elemente pot aciona ca niste locuri de iniiere in transcriptie. In unele cazuri , secvenele terminale au fost definite , dar nici un consens general secvenele pot fi deduse ., De asemenea, elemente de reglementare negative ( secvene de reprimare din amonte ; URS ), s-a dovedit ca controleaza exprimarea unor gene . Cu toate acestea , n doar cteva cazuri , idei precise privind interaciunea intima dintre diferitele componente de reglementare care mediaz expresia genelor au nceput s evolueze .

Cunoaterea ntreagii secvene a genomului combinata cu puternice instrumente genetice disponibile pentru

drojdie ar trebui s ncurajeze, acum, cercetarea de-a lungul acestor linii .n general , ORF-urile par a fi mai degrab distribuite n mod egal ntre cele dou componente ale cromozomilor singuri . In unii cromozomi ( ex. I , II , VIII ) , exist un mic exces de capacitate de codificare pe una dintre catene ,a carei semnificaie nu este cunoscut .

Compoziia de baz medie a AND-ului de drojdie este de 38,4 % ( G + C ) . Cum era de ateptat ,proteina regiunilor de codificare are un coninut GC mai mare , n medie ( 40,2 % ) dect n regiunile non- codare ( 35,1 %) . In ferestrele glisante, regiunile de codificare pot fi discriminate din regiunile intergenice , deoarece " tranziiile " din coninutul GC sunt destul de agere la frontierele lor . O distribuie aproape simetric a frecvenelor dinucleotidice se poate observa peste ntregul cromozom, n timp ce compoziia de baz a ORF-ului prezint un exces semnificativ de perechi omopurine pe catena de codificare . n mod normal, regiunile de codificare sunt n mod egal distribuite ntre cele dou componente . Mrimea medie a ORF-ului este de 1450 bp . Dimensiunile medii a inter-regiunilor ORF variaz ntre 630 i 945 pb pentru diferiti cromozomi , sunt 618 pb , n medie, pentru " promotori divergenti " ( 36,2% GC ) i 326 pb pentru " terminatori convergenti " ( 29,3 % GC ) , n timp ce " combinaiile promotor - terminator " ( 34,2 % GC) sunt n medie,517 pb n lungime.

5.2.5.2 Compoziia de baz i Densitatea Genelor

Compoziia medie de baz a fost gsita a fi simetrica de-a lungul ntregului cromozom ( simetria fiind i mai evident in frecvenele dinucleotidice ) , dar acest lucru reflect doar un numr aproape egal de ORF-uri codificate pe fiecare fir de ADN a celor mai multi cromozomi ai drojdie , compoziia de baza a ORF-urilor arata un exces semnificativ de perechi omopurine pe suvita codificare [ Dujon et al . , 1994 ] .

Variaii regionale a compoziiei de baz cu amplitudini similare s-au observat mai nti de-a lungul cromozomului III [ Sharp & Lloyd , 1993 ] , cu vrfuri majore GC - bogate n mijlocul fiecarui bra . Rezultatele cromozomului XI au confirmat aceast constatare, dar din cauza dimensiunilor sale mai mari , a dezvaluit o periodicitate aproape regulata a coninutului GC , cu o succesiune de segmente GC - GC - bogate i srace . O observaie si mai interesanta a fost c periodicitatea compoziional coreleaz cu densitatea genelor locale , ajungnd la mai mult de 85 % n regiunile bogate n GC , urmate de segmente gene cu densitatea comparabil mai mic ( 50-55 % ) , n regiunile ATrich [ Dujon et al . , 1994 ] . 5.2.5.3 Elementele funcionale ale cromozomilor de drojdie

5.2.5.3.1 centromeri

Centromerii sunt locurile de formare a kinetoforilor i locul de ataament cromozomal al axelor mitotice i meiotice [ Lechner i Ortiz , 1996 ] . Din toate secvenele de ADN centromeric cromozomii drojdiei mprtesc o structur comun , care se extinde doar peste aproximativ 200 pb , contrar centromerilor mult mai mari n S. pombe sau celule de mamifere , n cazul n care se ocup aproximativ 200 kb .

5.2.5.3.3 Telomeres

Organizarea telomerilor drojdiei a devenit clara din lucrarea lui E. Louis i a colaboratorilor su n combinatie cu secvenele cromozomiale .

n schema din figura 5-16 , terminatiile primilor trei cromozomi ce erau s fie finalizate sunt comparate . Secvene repetitive cu similitudine ridicata la nivel de nucleotide sunt indicate de ctre triunghiurile lumplute . ORF-urile sunt reprezentate prin sgei . Secvenele telomerice consens sunt afiate n negru , infrastructura lor [ Louis & Borts , 1995 ] este indicat n inserie ( nu trase la scar ) .

Toti cromozomii drojdiei mprtesc caracteristici telomerice i structuri subtelomerice.

Comparaiile dintre terminalele cromozomilor a artat c , n plus fa de repetrile subtelomerice comune, ele au similitudini extinse n regiunile subtelomerice : redundana genetica este regula de la capetele de cromozomi ai drojdie . Regiunilor " duplicat " conin copii ale genelor cu funcii cunoscute sau previzibile , precum i mai multe produse ORF care prezint asemnare mai mare , dar funciile lor rmn neclare deoarece nici-un omolog dintr-o funcie cunoscut nu a fost gsit n bazele de date .

Din cauza structurii lor "deschise " , telomerii trebuie s fie stabilizati i replicati de ctre un Sistemul telomeric specializat . Telomerii drojdiei sunt formati din produsele genelor a trei gene EST ( EST1 , EST2 , EST3 ) , prin care Est2p acioneaz ca subunitate catalaytica , si o component RNA ( TLC1 ) care este folosita ca o matrice n sinteza ADN-ului telomeric . In plus , replicarea telomerilor este dependenta de:

( i)complexul TRF1 , constnd din Ku70 ( HDF1 ) i Ku80 ( HDF2 ), proteine i interacioneaz cu Cdc13p , care este , de asemenea, crucial pentru suvitele reparatoare ale AND-ului dublu non- omolog si protejeaza telomerii fa de nucleaze i recombinaze ,

( ii ) un numr de proteine RAD ( RAD50 , RAD51 , RAD52 ) ,

( iii ) Sgs1p , o helicaz , prevenind din recombinarea de letirious ntre secvenele telomerice ,

( iv ) i un numr de alte proteine .

n celulele telomere, telomerii progreseaza incet ( n aproximativ 60 de generaii ) si conduc la o scurtare a telomerilor si a senescentei crescute . Zakian ( 1996) a discutat extrapolarea informaiilor despre AND-ul telomeric al drojdie la mbtrnirea celulele umane. Datele de la S.cerevisiae , de asemenea, sugereaza ca abilitatea de a mentine lungimea telomerilor poate fi critica pentru starea tumoroasa a celulelor de mamifere . Activitatea telomerilor este modificat n cele mai multe tipuri de cancer .

5.2.5.4 Repetri complexe i simple

n general, genomul de drojdie este extrem de srac n secvene repetate. Constelaia unica de secvene repetitive la cele dou capete ale cromozomului I a fost deja subliniata. Aproximativ 30 kb din fiecare regiune subtelomerica transporta gene similare ( dar neeseniale ) i o repetare de 15 kb. Aceste caracteristici sunt n concordan cu ideea c aceste regiuni terminale reprezint echivalentul drojdiei cu heterochromatina i apariia acestui tip de ADN sugereaz c prezena sa d acestui cromozom lungimea critic necesar pentru stabilitatea i funcionarea corect . Regiunea 30 kb poate fi ndeprtat din fiecare capt, fr a afecta creterea vegetativ , dei stabilitatea cromozomului este redusa considerabil . Cel mai probabil, aceste regiuni repetate care au fost observate ca contribuie la dimensiunea polimorfisma a cromozomului I [ Bussey i colab . , 1995]. Pe lng elementele Ty, ADNr-urile de pe cromozomul XII sunt cele care contribuie cel mai mult la caracterul repetitiv . Un grup de aproximativ 15 repetiii n tandem ( 2 KB fiecare ) coninnd gena CUP1 i care contribuie la variaia polimorf se gaseste pe cromozomul VIII [ Johnston et al . , 1994 ] .

Exista intinderi repetate de oligonucleotide scurte. Acestea includ tractele polilor ( A ) sau polilor (T), alternnd tracturile polilor ( AT ) sau polilor ( TG ), i repetri lungi directe sau inversate . Chiar si intinderile scurte a secvenei se repeta simplu ( TG1 - 3 ) n , n mod normal " etanarea " capetelor cromozomiale, au fost uneori ntlnita in interiorul unor cromozomi . Acest tip de repetiii interne sunt, probabil, relicve a unor evenimente din timpul ruperii i vindecarii de cromozomi .

Prin aplicarea programului Pythia [ Milosavljevic & Jurka , 1993 ] pentru a cuta repet simplu , am detectate cel puin 12 seturi de trinucleotide repetate n mod regulat de-a lungul cromozomului II , reprezentnd codoni repetati pentru anumiti aminoacizi, formnd astfel ntinderi homopeptide . n unele cazuri, au rezultat modele de aminoacizi chiar mai complexe ( Tabelul 5-3 ) . Un studiu sistematic privind distribuia i variabilitatea repetarilor trinucleotidei in genomul drojdiei a fost efectuat [ Richard & Dujon , 1997 ] .

Repetri perfecte i imperfecte , de la patru la 130 de tripleti au fost recunoscute i repartizarile unor combinatii triplet diferite s-a dovedit ca difera ntre ORF i regiunile intergenice . Examinarea diverselor tulpini de laborator evideniaz o variaie de mrime polimorfa pentru toate repetri perfecte, comparativ cu o

lipsa de variaie pentru cele imperfecte . Aceste constatari sunt deosebit de interesante n ceea ce privete faptul c mai multe boli genetice umane sunt cauzate de expansiune trinucleotidelor. Sistemul de drojdie poate oferi acum o abordare experimental pentru a studia mecanismele de expansiune a lor .

5.2.5.5 Comparatie intre hrile fizice i genetice

Harta genetic de S. cerevisiae [ Mortimer i colab . , 1992 ] a avut o valoare considerabil pentru biologi molecule de drojdie nainte ca hrile fizice sa devena disponibile . Pe lng extinderea local sau contracia hrii genetice, i faptul c frecvena global a recombinarii meiotice creste cu scurtarea dimensiunii cromozomului, ordinea genelor poziionate pe cromozomii de cartografiere genetic i fizic sunt extrem de acord. Astfel, compararea hrii fizice i genetice arat c cele mai multe dintre legturi au fost stabilite pentru a da ordinea corecta a genelor , dar ca, n multe cazuri, distanele relative derivate din cartografierea genetica sunt imprecise .

Evident imprecizia hrilor genetice se poate datora faptului c diferite tulpini de drojdie au fost utilizate n stabilirea legturilor. Este chiar posibil ca unele tulpini folosite n experimentele de cartografiere genetica arat inversiuni sau transferuri care apoi ar putea contribui la discrepane dintre hrile fizice i cele genetice. In mod clar, acurateea cartografierii genetice va depinde de abordrile experimentale utilizate. Cu toate acestea, un fenomen mai rspndit, care poate duce la imprecizie hrilor genetice sunt polimorfismele tensometrice cauzate de secvenele repetitive extinse sau genele subtelomerice duplicate dup cum sa menionat mai sus, i n special de elementele Ty . n total, experiena acumulat de la proiectul genomului de drojdie arat c hrile genetice furnizeaza informaii valoroase , dar ca cartografierile fizice independente i determinarea secvenelor complete este necesar pentru a delimita n mod clar toate genele de-a lungul cromozomilor . n acelai timp, diferenele constatate ntre diferite tulpini de drojdie demonstreaz necesitatea de a utiliza o tulpina speciala ca un sistem de referin.

5.2.5.6 Organizarea Genomumui i Aspecte evolutive

5.2.5.6.1 Redundana genetic n drojdie

ntruct o estimare a similaritatii secvenei ( att la nivel de aminoacizi i nucleotide ) este acum posibil , ea rmne inca dificil de corelat fizic complet la redundana funcional , deoarece chiar i funciile genei de drojdie au fost definite cu precizie ntr-o msur limitat . nelegerea adevratei naturi a redundantei va ajuta la elucidarea rolului biologic a fiecarei gena de drojdie.

In multe cazuri, secvenele duplicate sunt limitate la aproape ntreaga regiune de codificare a acestor gene i nu se extind n regiunile intergenice . Astfel, produsele genei corespunztoare mprtesc similaritatea ridicat n termeni de secven de aminoacizi sau , uneori sunt chiar identice i , prin urmare , pot fi funcionali excesivi . Cu toate acestea, dup cum indic diferenele de secven din cadrul regiunile promotor , expresia genelor ar trebui s varieze n funcie de natura elementelor de reglementare sau alte constrngeri ( de reglementare ) . Acest lucru a fost demonstrat experimental n numeroase exemple ( Tabelul 5-4 ) .

Se poate foarte bine ca o copie a genei sa fie foarte exprimata in timp ce o alta este exprimata umil. Deschiderea sau oprirea expresiei a unei copii special din cadrul unei familii de gene poate depinde de starea difereniat celulei ( cum ar fi tipul de mperechere , spori, etc ) . Studiile biochimice , de asemenea, au relevat faptul c , n cazuri speciale proteinele " redundante " se pot substitui reciproc , astfel fiind lamurit faptul c o mare parte din perturbrile genelor singure din drojdia de bere nu afecteaz creterea sau provoca fenotipuri " anormale " . Acest lucru nu implic, totui , c aceste gene redundante erau dispensabile prioritar . Mai degrab au aprut prin necesitatea de a ajuta celule de drojdie sa se adapteze la anumite condiii de mediu . Aceste noiuni sunt de importan practic in efectuarea i interpretarea experimentelor de ntrerupere a genei .

5.2.5.6.1.1 Genele dublate n regiunile subtelomerice

Exemple clasice de gene redundante n regiunile subtelomerice sunt drojdiile MEL , Suc , MGL i Genele MAL , care au fost menionate anterior . De fapt, tulpinile de drojdie difer de prezena sau absena seturilor speciale ale acestor gene . De exemplu , trei gene mapate pe cromozomul II, tulpinile de tip slbatic , MEL1 , SUC3 , i MGL2 , sunt absente de la tulpina S288C . O comparaie la nivel molecular a S288C cu tulpina de drojdie de bere C836 a artat n mod clar c genele SUC sunt prezente pe cromozomul II din ultima tulpinia . n ceea ce privete genele implicate n metabolismul carbohidrailor, prezena multiplelor copii ale genei pot fi atribuite presiunii selective indus de domesticire uman , aa cum se pare c acestea sunt n mare parte dispensabile n tulpinile de laborator ( cum ar fi S288C ) care nu mai sunt utilizate n procesele de fermentaie . Procesele de recombinare non- omoloage pot fi responsabile pentru dublarea acestora i a altor gene care locuiesc n regiunile subtelomerice [ de exemplu, Michels i colab . , 1992 ] , care reflect structura dinamic a telomeriilor drojdiei n general [ Dershowitz & Newlon , 1993 ] . Am menionat deja faptul c regiunile subtelomerice a multor cromozomi ai drojdiei impart segmente foarte conservate, n unele cazuri pn la 30 kb , care transporta genele duplicate ale cror funcii sunt n mare msur necunoscute .

5.2.5.6.1.2 Genele de dublare interne ctre Cromozomii

In plus , exist o mare varietate de gene interne cromozomilor care par s fi aprut din dublari , aa cum e sugerat de analizele cromozomilor individuali. nainte ca secvenele complete a cromozomilor sa devina disponibile , o mare varietate de gene au fost cunoscute s apar n dou sau mai multe copii identice sau aproape identice localizate la diferiti cromozomi , cum ar fi genele histone , genele ribozomale de proteine , genele pentru transportatorii ATP / ADP , pentru enzimele caii glycolytic , pentru zahr i transportori de aminoacizi , i pentru multe alte proteine . Numeroase exemple pot fi acum adugate , atunci cnd cromozomii finalizate sunt cutati pentru similitudini la nucleotide , precum i la nivelul proteinelor . Acestea includ familiile dispersate cu gene nrudite , dar non- identice mprtiate individual peste muli cromozomi . Cea mai mare astfel de familie cuprinde 23 de gene PAU care specific aa-numitele seripauperine [ Viswanathan et al. , 1994 ] , un set de proteine serin- saraci aproape identice cu funcie necunoscut . Genele PAU locuiesc n regiunile sub- telomerice . Familii de gene cluster sunt mai puin frecvente , dar o mare familie de acest tip se produce pe cromozomul I unde ase gene nrudite codifica un set de proteine membranare cu funcie necunoscut [ Viswanathan et al . , 1994 ] . Alti 10 membrii ai aceastei familii au loc pe cinci cromozomi suplimentari , uneii sunt grupati , altii sunt mprtiati individual , nc altii sunt situati n regiunile sub- telomerice .

5.2.5.6.1.3 Genele dublate n Clustere

Remarcabil , gene duplicate au fost , de asemenea, gsite n clustere . Exist cel puin trei exemple de acest gen n cromozomul II [ Feldmann i colab. , 1994 ] . Un alt caz este un grup de trei gene hexoz transportate pe cromozomul VIII [ Johnston et al . , 1994 ] , care par a fi rezultatul unei duplicari de gen mai recenta. Mai degrab cazuri unice ale dublri de gene sunt reprezentate de o mare familie de gene grupate ( tandem ) de proteinele cu membrana pe cromozomul I , i un grup mare de pe cromozomul VIII lng CUP1 . Gena de codificare, metalotioneina de cupru CUP1, este coninut ntr-o repetare de 2 kb, care include , de asemenea, un ORF cu functie necunoscuta . Regiunea repetat a fost estimat sa se deschida la un interval de 30 kb de tulpina S288C , care ar putea cuprinde 15 repetari , dar numrul de repetri variaz printre tulpinile de drojdie .

5.2.5.6.1.4 Regiunile omoloage Cluster ( CHRs )

Un fenomen cu att mai surprinztor a devenit evident , atunci cnd secvenele de cromozomi completi au fost comparate ntre ele , dezvluind c exist mari segmente cromozomiale n care genele omoloage sunt aranjate n aceeai ordine , cu aceeai orientri transcripionale relative , pe doi sau mai multi cromozomi . Apariia unor astfel de regiuni omoloage Cluster ( CHRs ) este acum manifestata intr-o mare parte a genomului de drojdie i ar putea reprezenta pentru unele 30-40 % din redundana total [ Goffeau et al , 1995; . Heumann & Mewes , 1996 ] . Pentru a analiza msura i modelul redundanei genomului de drojdie , o structur de date puternica ,HPT , a fost dezvoltata la MIPS , permitand o comparaie toate - contra - toate a blocurilor de dimensiuni fixe ale nuclotidelor rezultate care pot fi vizualizate prin o interfa grafic care arat similariti att la nucleotide cat i la nivelul de proteine . Figura 5-18 prezint un exemplu din aceast analiz.

Cromozomi II i IV mprtesc cel mai lung CHR , care cuprinde o pereche de regiuni pericentrice de 170 i respectiv , 120 kb , care mprtesc 18 perechi de gene omoloage . Genomul a continuat s evolueze de cand aceast dublare veche a avut loc : a avut loc introducerea sau eliminarea de gene , elemente Ty i intronii au fost pierdute i acumulate ntre cele dou seturi de secvene . In total, cel puin 10 CHR-uri ( comune cu cromozomi II , V , VIII , XII , XIII i ) pot fi recunoscute pe cromozomul IV .

Remarcabil , ntreagul cromozom XIV poate fi mprit n mai multe segmente care sunt gsite duplicate pe alti cromozomi .

O examinare mai atent a celor mai mari apte CHR-uri a artat c acestea sunt compuse din "uniti " (scurte) fiecare coninand una sau dou gene omoloage de codificare de proteine adiacente unei gena ARNt . Acest lucru ar putea sugera c astfel de uniti au fost asamblate nainte duplicarii ntregilor blocuri. S-ar putea chiar sa se aibe n vedere posibilitatea ca astfel de uniti sa fi contribuit la suprapuneri de-a lungul evoluiei . Mai izbitor, este faptul ca exist un astfel de exemplu de susinere a unui astfel de regim. Cromozomul XIV poarta doua copii ale genei tRNAIle2 n legtur cu dou gene care codific proteina extrem de conservate , cu domiciliul n dou segmente inversate de 4.2 kb, segmente separate cu24 kb de secvena non- repetitive . In termeni de evolutie , acesta dublare , trebuie s fi avut loc recent , deoarece aceste segmente impart o secven identical de 99 %. Din moment ce o mare parte din al XIV-lea cromozom , inclusiv una dintre copiile genei tRNAIle2 este duplicata pe cromozomul IX [ Philippsen et al . , 1997 ] , am verificat dac regiunea adiacenta acestei gene ARNt pe cromozomul IX a fost asemntoare regiunii de 4,3 kb de pe cromozomul XIV . Acest lucru nu a fost sugerat, ca aceasta copie a genei tRNAIle2 a fost amplificata n mod independent.

Dup cum sa menionat deja , Wolfe i Shields [ 1997 ] au definit 55 de blocuri de suprapunerile gene de cluster i au sugerat un model destul de convingtor care explic omologiile extinse vzute n drojdia de astzi prin( allo sau auto ) - tetraploidizare ntre dou tulpini vechi de S. cerevisiae , urmate de translocatii reciproce i stergeri de gene duplicate in proportii de 85 %. Acest punct de vedere a fost confirmat prin compararea genomului Ashbya gossypii a genei S. cerevisiae [ Dietrich et al . , 2004 ] i a unei analize noi a duplicarilor din S. cerevisiae [ Woodfit & Wolfe , 2005 ] .

5.2.5.6.1.5 Redundana i Organizaia Genelor

Cu toate acestea, ne putem imagina dou moduri in care se poate sa fi aprut suprapunerile. n primul rnd , unele dintre genele duplicate ar putea reprezenta genele prelucrate care au fost inserate n genomul relativ recent , o vedere care este n concordan cu conservarea secvenei numai n regiunile de codificare . Cu toate acestea, toate aceste cazuri par s fi creat prin integrarea intregului AND complementar , pentru c nici unul nu pare s fie pseudo gene , iar acest lucru este neateptat n acest model . In plus , o parte din perechile de gene omoloage includ introni n ambele gene , ceea ce sugereaz c cel puin aceste gene nu au fost dublate de acest mecanism .

n al doilea rnd , gruparea de gene duplicate i apariia de zone similitudine extinse ne oblig s luam n considerare ideea c regiunile genomice ntregi au fost dublate . Mai multe dintre acestea evenimente duplicatoare par a fi vechi [ Wolfe & Shields , 1997 ] , pentru c secvena de AND a deviat n mod clar n afara regiunilor de codificare , n plus , astfel de grupuri par sa imparta chiar i un numr de genele ARNt, ambele n acelai loc i orientare . Cu toate acestea , suprapunerile pot aprea n orice moment in timpul evoluiei [ Richard i Dujon , 1998 ] .

Oricare ar fi termenele i mecanismele de suprapunere relativ , aceste evenimente urmate de mutaii care afecteaz proprietile funcionale da o ans de a duce la mbuntirea sanatatii mediului . Pe de alt parte ,densitatea mare de gene in drojdie indic o tendin puternic de a menine un genom compact , Prin urmare, mecanismele de compensare trebuie s existe pentru a elimina copiile genelor nefuncionale sau de prisos .

O problem interesant strns legata de evoluie este originea modelului de organizare a genelor care s-a manifestat pn n prezent. Am putea , de exemplu , gsi orice criteriu , fie structural sau funcional n natura , care sa guverneze aranjamentul regional al unor gene speciale ? Cu alte cuvinte , este acolo de-a lungul cromozomilor drojdie o " grupare ordonata " de gene sau ne-a rmas o succesiune aleatorie din majoritatea genelor ? n prezent , nu avem multe indicii pentru a rspunde la aceste ntrebri . Cu toate acestea , in ceea ce privete unele gene, avem indicii supra unei anumite locaii sau grup de gene , i cteva exemple au fost deja menionate mai sus . n mai multe cazuri, gene extrem de exprimate sunt gsite asociate cu Elementele ARS , astfel nct s-ar putea specula c replicarea i transcrierea eficient sunt strns cuplate . n cromozomul XI , se pare c genele foarte exprimate apar n " clustere " n regiuni preferate [ Dujon , pers . Commun . ] . In mod clar ,MAL i loci SUC , si locusul GAL reprezint exemple , n care genele legate funcional implicate ntr-o anumit cale metabolic sunt strns asociate ntre ele .

5.2.5.6.1.6 Variaia Sequence Printre tulpini de drojdie

ntrebarea: n ce msur tulpinile de drojdie difer n ceea ce privete coninutul lor genetic implicit a fost deja atinsa. Am discutat o serie de caracteristici care contribuie la formarea polimorfismelor n diferite tulpini de drojdie : ( i) numr variabil de copii de gene de la familii de gene repetate ; ( ii ) modele individuale cauzate de prezena sau absena anumitor elemente Ty ; ( iii ) plasticitate cromozomului se termina . n toate aceste cazuri, polimorfismul de asemenea, devine manifestat prin lungimi diferite intre cromozomii corespunztri. n plus, excizii sau inversiuni speciale ale regiunilor genei au fost observate pentru a da natere la polimorfisme . Ruperea cromozomului a fost gsita n drojdia de bere , care rezult n karyotipul ce se abat de la imaginea de "normal" . Cu toate acestea, variaiile secvenei n regiunile de codare de gene individuale par a fi rare , n msura n care putem spune in urma comparaiilor secvenelor omoloage obinute din diferite tulpini .

5.2.6 Familiile Genelor Drojdiei

5.2.7 Compararea genomului de drojdie cu alti genomi

Disponibilitatea secventei completa a genomului de drojdie nu numai c a permis introspecia n organizarea i evoluia genomul n drojdiea de bere , dar se extinde catalogul de gene noi detectate n acest organism [ Stucka , 1992 ] . Multe dintre acestea pot avea o valoare deosebit numai pentru biologii molecule de drojdie , dar de interes general pot fi acelea care sunt omoloage cu genele care ndeplinesc funcii difereniate n organisme multicelulare sau care ar putea fi relevante pentru malignitate . Dei rolul acestor gene trebuie nc s fie clarificat , drojdia , n unele cazuri, a servit ca un sistem experimental util in identificarea funciei lor . Pe de alt parte, bogia de informaii care urmeaz s fie ateptata cere n mod clar ca noile rute sa fie explorate pentru a investiga functiile genelor noi .

5.2.7.1 Conexiunea om- drojdie

Prin compararea catalogului de secvene umane disponibile n bazele de date cu ORF-uri asupra cromozomilor drojdiei realizate la nivelul aminoacizilor se estimeaz c peste 30 % din genele de drojdie de bere au omologi printre genele umane . Cum era de ateptat , cele mai multe dintre genele cu funcia cunoscut, clasificata n acest fel reprezint funcii de baz n ambele organisme. Mai multe asemnri devin evidente , cnd EST-uri sunt incluse n analiz . Fr ndoial, protagonistele cele mai convingtoare printre aceste omoloage sunt genele drojdiei care poart similitudini substaniale cu " genele bolii " umane .

Studii comparative de-a lungul acestor linii au fost publicate [ Basset et al . , 1996 ] i sunt actualizate n mod regulat .

5.2.7.2 Alte organisme model

nainte de a elibera secvena complet a genomului de drojdie , dou genomuri bacteriene complete au fost publicate , cele de H. influencae i M. genitalium [ Fleischman et al , 1995; . . Fraser et al , 1995 ]; un alt genomului procariot , cea Methanococcus jannaschii , a fost lansat n acelai an [ Bult et colab . , 1996 ] . Intre timp , secvenele unor multitudine de genoame bacteriene i genoame archeal , precum si genoamele mai multor eucariote inclusiv Schizosaccharomyces pombe , Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster , Arabidopsis thaliana , i Homo sapiens sunt disponibile .

Fr ndoial, informaiile acumulate de la aceste proiecte ofer o baz important pentru afla mai multe despre msura n care diferite procese sunt conservate ntre organisme n diferite linii [ Miklos i Rubin , 1996] .

O caracteristic remarcabil printre genele de specii diferite a devenit evidenta destul de devreme n timpul diferitelor proiecte de secventiere . Cnd gene intregi au fost supuse la cutri similaritate asistate computerizate ntre cadrele de citire deschise , s-a constatat c toate mprtesc un procent ridicat de gene orthologous ( Figura 5-19 ) i c redundanta genetica intraspecifica a fost de aproximativ 30 % la minim , dar ar putea deveni la fel de mare ca 60 % , de exemplu, n C. elegans ( Figura 5-20 ) .

5.3 genomul Drojdie mitocondriale

De la descoperirea lui Ephrussi n 1949 a citoplasmaticelor ereditare a mutanilor Petite ", cu deficit respirator, Saccharomyces cerevisiae au fost n centrul geneticii mitocondriale. Genele mitocondriale i structura lor mozaic intronic au fost identificate pentru prima dat n S. cerevisiae i primele gene mitocondriale esalonate au fost de la acest organism .

Genomul mitocondrial copiat multiplu de la S. cerevisiae este caracterizat de o densitate sczut a genei i coninut ridicat de A + T . Compoziia sa de baz este foarte eterogen , n timp ce coninutul de G+ C al genelor este aproximativ 30 % , distanierele intergenice sunt compuse din cvasi - pure ntinderi A + T ale mai multor sute de perechi de baza , ntrerupte de peste 150 ( G+ C) clustere bogate , variind de 10-80 pb n lungime . Aceste trsturi explic de ce oamenii de stiinta au structurat genele i neglijat regiunea intergenic.

Secvena complet a genomului mitocondrial de drojdie a fost determinat de Foury i colab. [1998]. Genomul ( figura 5-21 ) conine genele pentru subunitile citocrom c al oxidazei I , II i III ( cox1 , COX2 i cox3 ) , ATP subunitile sintaz 6 , 8 i 9 ( atp6 , atp8 i atp9 ) , apocytochrome b ( cytb ) , o proteina ribozomala ( var1 ) i mai multe cadre de citire deschise legate de intronul ( ORF) . COX1 i genele cytb conin mai multi introni , dintre care unele sunt traduse , independent sau n cadru cu exoni lor n amonte, n plus , genomul mitocondrial conine originele replicilor ( ORI) elemente de replicare i codificare 21S i 15S ARN ribozomal , 24 tRNAs care pot recunoaste toti codonii , i ARN-ul 9S componenta de RNaz P. Toate genele sunt transcrise din aceeai catena , cu excepia tRNAthr1 . Aproximativ 10 000 de nucleotide sunt secvene noi , compuse n esen de + lungi T ntrerupte de mai multe grupuri de G+ C genele atp6 , atp9 , COX2 , cox3 i tARN apar ca mici insule G+ C - mbogite n mijloc de regiuni cluster bogat in A + T i P C. Celelalte vrfuri de densitate mare G + C corespunde Clusterelor G+ C , limea lor fiind n funcie de numrul acestora situate aproape una de alta .