Particularităţi ale interacţiei celulă vegetală - celulă fungică de

197

Particularităţi ale interacţiei celulă vegetală - celulă fungică de micorize

CARMEN MAXIMILIAN, AURELIA BREZEANU, MONICA CARASAN, ANA ROSU*

Institutul de Biologie al Academiei Române, Bucureşti *Facultatea de Biotehnologie, USAMV, Bucureşti

În jurul anului 1880, A.B. Frank a descris pentru prima dată relaţiile care se stabilesc între speciile lemnoase de arbori şi unele tulpini fungice din sol, denumindu-le "mykorhiza". Ulterior, studiile legate de biologia micorizelor, cu aplicaţiile lor în ecologie, au luat o mare amploare. Cercetări multiple privind structura, funcţionarea şi implicaţiile micorizelor în creşterea şi dezvoltarea plantelor au fost efectuate de către Rayner (1927), Kelly (1950), Harley (1959 şi 1971). A urmat apoi o explozie a descrierii asocierilor micorizale şi a naturii simbiozei dintre plante şi fungi. S-a dovedit că micorizele au o răspândire ubicuitară, existând în habitate naturale sau/şi în culturi agricole (Harley şi Smith, 1983). Asociaţiile micorizale reprezintă cea mai răspândită relaţie de tip simbiotic în lumea plantelor. Această simbioză presupune stabilirea unor interacţii strânse între celule fungice şi celule ale ţesutului radicular al plantelor vasculare. Asocierea de tip micorizal implică realizarea unor relaţii de interdependenţă strictă între cei doi simbionţi, planta gazdă primind nutrienţi minerali via miceliu fungic, prin aşa numitul proces de �micotrofism� în timp ce fungul, heterotrofic, primeşte de la gazdă componenta glucidică obţinută prin fotosinteză. Acestea asigură instalarea unui �dialog� permanent între genomul celor doi parteneri (Gianninazi-Pearson şi Gianninazzi, 1989a), ce culminează cu integrarea morfologică funcţională, condiţie fundamentală pentru stabilirea simbiozei (Gianninazi-Pearson, 1988). Studii numeroase au relevat rolul benefic al micorizelor în timpul perioadei de creştere şi dezvoltare a plantei, privind mărirea rezistenţei la secetă şi boli, precum şi amplificarea proceselor de absorbţie a nutrienţilor din sol (Stribley, 1987; Nelsen, 1987). În prezent se cunoaşte rolul şi importanţa ecto/endomicorizelor în creşterea şi dezvoltarea plantelor, fapt ce explică interesul deosebit de care se bucură studiul simbiozei micorizale (Bagyaraj, 1992). Deşi ecologii au ignorat mult timp importanţa acestor asocieri, Allen (1991) a publicat o excelentă revistă în care explică implicaţiile micorizelor în ecologie şi rolul lor în stimularea creşterii plantelor.

Micorizele stabilizează ecosistemele naturale şi artificiale care au fost afectate de factori cu origini diferite: climatici, geomorfici, paleotectonici, sau chiar de activităţile umane, factori care pot determina un declin al calităţii solului, având repercursiuni asupra dezvoltării plantelor. Acţiunea acestor factori implică modificarea structurii solului, creşterea eroziunii, micşorarea conţinutului în nutrienţi şi materii organice, eliminarea sporilor microbieni sau chiar stoparea activităţii microbiene (Sckujins şi Allen, 1986; Herrera, 1993). Irigarea intensivă, utilizarea îngrăşămintelor chimice şi a pesticidelor reprezintă factori ce periclitează stabilitatea sistemelor agricole. Alte fenomene, cum ar fi: salinizarea,


198

acidifierea sau alcalinizarea şi modificarea structurii solului, afectează buna funcţionare a ecosistemelor. Se ştie că micorizele, alături de alte microoorganisme din rizosferă şi aduc o contribuţie importantă în înlăturarea efectelor nocive mai sus menţionate şi în îmbunătăţirea stării fiziologice şi nutriţionale a plantelor (Bethlenfalvay, 1992; Zarnea, 1994). Clasificarea micorizelor s-a realizat pe baza raporturilor existente între hifele fungice şi celulele corticale ale rădăcinii şi tipul de micoriză dezvoltată. Conform acestor criterii micorizele se clasifică în: ectomicorize (ectotrofe), în care hifele pătrund intercelular, endomicorize (endotrofe), în care hifele se localizează intracelular, ectendomicorize, incluzând ambele tipuri, micorize peritrofe. Răspândirea micorizelor în natură este ubicuitară, existenţa unor plantelor lipsite de fungi micorizali este considerată mai degrabă o excepţie. Micorizele lipsesc la câteva familii de plante superioare cum ar fi Cruciferae şi Chenopodiaceae, care produc probabil unele substanţe antifungice, precum şi la plantele acvatice. Printre clasele fungice micorizale se numără: Basidiomicetes, Ascomicetes, Phycomicetes (ectomicorizale), Endogonaceae cu genurile Glomus, Sclerocistys, Gigaspora şi Acaulospora (micorize endotrofe).

1. Etapele colonizării celulei vegetale cu fungi micorizali După cum s-a menţionat asociaţiile de tip micorizal se încadrează, în principal, în două categorii: ectomicorize şi endomicorize. Pentru fiecare categorie în parte etapele colonizării se realizează prin mecanisme specifice. Ectomicorizele se stabilesc între celulele epiteliale ale rădăcinii şi miceliile dicariotice ale fungilor care provin prin fuziunea a două hife monocariotice germinate din spori. Simbioza ectomicorizală se evidenţiază prin prezenţa mantalei ce aderă la suprafaţa exterioară a celulelor radiculare, formând agregate ale hifei. Acest miceliu comunică cu hifa extramatriceală având funcţia de nutriţie minerală şi a apei la nivelul ţesutului implicat în simbioză. Câteva hife din zona interioară a mantalei penetrează celulele radiculare formând reţeaua Hartig unde are loc schimbul de metaboliţi. Hifele pot coloniza atât ţesutul epidermal (angiosperme) dar şi celulele corticale (gimnosperme). Simbioza endomicorizală a fost denumită şi vezicular arbusculară datorită structurilor caracteristice pe care le formează în cadrul interacţiei. Arbusculele sunt structuri hifale complicat ramificate înconjurate de invaginări ale membranei plasmatice şi se formează în interiorul celulelor corticale. Veziculele sunt structuri intracelulare fungice ce stocheză lipide şi nuclei, acţionând ca propagule. Este de menţionat că celula fungică nu contactează citoplasma celulei vegetale. La nivel microscopic se evidenţiază structurile arbusculare ce înconjoară nucleul celulei vegetale, fapt ce demonstrează relaţia intimă ce se stabileşte în cadrul asociaţiei. Procesul de colonizare micorizală a plantei debutează, ca orice tip de interacţie gazdă-celulă microbiană, printr-un schimb de semnale celulare între cei doi parteneri ai simbiozei urmată de aderarea şi pătunderea fungului în celula vegetală. Natura răspunsului oferit de celula gazdă orientează tipul interacţiei ce se va stabili. Interacţia dintre fungii micorizali şi rădăcină implică o serie de evenimente ce determină modificări importante în morfogeneză datorită formării unui apresorium, apariţia arbusculelor şi difenţierea veziculelor micorizale (VAM) respectiv a hifelor (ectomicorize) (figura 1).


199

EVENIMENT PROCES Hife fungice din sol Rădăcină Chemotropism Contact hifă-suprafaţa celulară Recunoaştere

Aderarea hifei Compatibilitate

Modificări ale hifei celulelor fungale Modificări ale citoscheletului (formarea apresoriumului, ramificarea celulei fungale ectomicorizelor) Pătrunderea hifei printre celulele Sinteza enzimelor ţesutului radicular Alte modificări ale hifelor Alte modificări ale fungale (formarea arbusculelor, citoscheletului reţelei Hartig, mantalei celulelor fungice Alterări ale celulelor şi morfologiei Producerea hormonilor rădăcinii Iniţierea schimburilor de nutrienţi

Figura 1. Etapele colonizării celulei vegetale cu fungi micorizali (Peterson R. L. şi Farquahar M. I., 1994). Iniţierea colonizării începe prin germinarea sporilor VAM ce produc hife aseptate ce se vor dezvolta doar în prezenţa celulelor radiculare sau a exudatelor sintetizate de rădăcini (punct de control 1). Semnalele chimice ce vor determina iniţierea colonizării şi răspunsul celulei fungice includ o serie de flavonoizi şi compuşi fenolici (Douds şi colab., 1996; Harrison, 1997). Cercetări recente la nivel molecular demonstrează că extractele de acid abietic din Pinus induc germinarea sporilor micorizali la concentraţii foarte scăzute (10-7 M) şi efectul său pare a fi specific pentru genul Suillus ceea ce demonstrează specificitatea de acţiune a fungilor ectomicorizali în cadrul simbiozei (Fries et al., 1987). Mai mult, unii autori afirmă că prezenţa acestor semnale chimice sintetizate de celulele rădăcinii pot fi chemoatractanţi pentru miceliile micorizale (Horan şi Chilvers, 1990). Astfel, fenilpropanoizii (Weiss şi colab., 1997) şi flavonoizii ce se acumulează în rădăcinile diferitelor specii de molid sunt, se pare, semnale importante în stabilirea simbiozei ectomicorizale. Răspunsul celulei fungice se materializează prin sinteza unor compuşi indolici, cum ar fi hipaforina (Beguiristain şi colab., 1995) care, de altfel a fost purificat din P. tinctorius. Prezenţa acestui


200

compus determină modificări morfologice în rădăcinile de eucalipt şi alterări ale expresiei genei Egpar (controlată de acţiunea auxinei), însă rolul exact al acestui compus nu a fost pe deplin confirmat. Pentru procesul de colonizare cu VAM s-au propus două pattern-uri: �Arum� şi �Paris� (punctul de control 3). Primul presupune creşterea şi dezvoltarea intercelulară a fungului precum şi penetrarea cortexului radicular, urmat de colonizarea micorizală prin formarea arbusculelor. Cercetările moleculare s-au efectuat cu predilecţie pe acest tip de simbioză. Cel de-al doilea tip implică dezvoltare iniţială intracelulară a hifelor î ncolăcite prezentând foarte rar structuri arbusculare (Gallaud, 1995, citat de Smith şi Smith, 1997). Tipul de interacţie ecto/endomicorizală este determinată de specia gazdă, miceliul fungal colonizând celulele ţesutului epidermal sau ţesutul cortical. Acest fapt demonstrează că celula vegetală controlează creşterea şi dezvoltarea celulei fungale în cadrul simbiozei stabilite între cei doi parteneri, dar mecanismul molecular de acţiune rămâne necunoscut (Smith şi Smith, 1996, 1997). Pătrunderea fungilor ecto/endomicorizali este restricţionată de celulele ţesutului cortical (punct de control 6). Celula fungică nu conţine echipamentul enzimatic necesar pentru a degrada suberina şi lignina din pereţii celulelor endodermale (Bonfante şi Perotto, 1995) şi nu poate penetra stelul. Ectomicorizele prezintă agregate hifale ramificate ce contactează întreaga suprafaţă a rădăcinii. Contactul între cei doi parteneri ai simbiozei se produce în prezenţa/absenţa rizosferei şi în general, întreaga suprafaţă celulară este competentă pentru adeziunea celulei fungale. Acest fapt explică de ce interacţia ectomicorizală nu este specie specifică. Studiile biochimice efectuate pe parcursul procesului de colonizare a ectomicorizelor au relevat prezenţa unui grup de polipeptide acide cu rol în controlul mecanismelor implicate în realizarea simbiozei (Tagu şi Martin, 1996). Una dintre aceste polipeptide prezintă secvenţe omoloage cu adezinele de origine animală şi sunt situate la interfaţa dintre manta şi reţeaua Hartig. Mai mult, trei secvenţe genice situate la nivelul genomului P. tinctorius codifică trei hidrofobine diferite (Tagu şi Martin, 1996). Aceste proteine parietale sunt implicate în formarea corpilor de fructificaţie, în dezvoltarea apresoriumului (Wessels, 1996) deci în procesul de colonizare a celulelor ţesutului radicular. Toate aceste investigaţii sugerează că adeziunea celulei fungale este un proces foarte important în dezvoltarea şi coordonarea morfogenezei şi semnalizării celulare. Simbioza cu micorize presupune modificări în morfologia rădăcinii plantei dar şi alterări ale organizării citoplasmatice şi conformaţionale ale celulei fungice. Ectomicorizele determină alungirea celulelor radiculare în timp ce arbusculele implică reorganizarea totală citoplasmatică. Aceste modificări sunt conectate cu rearanjări ale citoscheletului (Timonen şi colab, 1993) celulei fungice. Un exemplu îl constituie gena ce codifică α-tubulina (Eg tub A1), a cărei activitate reglează procesele morfogenetice implicate în colonizarea ectomicorizală (Carnero Diaz şi colab., 1996). Un alt exemplu este cel al promotorului genei tub 3a, ce codifică α-tubulina de la porumb care amplifică activitatea celulelor arbusculare din rădăcinile transgenice de tutun (Bonfante şi colab., 1996). Procesul de colonizare micorizală presupune activarea unor procese enzimatice ce determină liza locală a lamelei mijlocii, cunoscută ca fiind un răspuns de apărare al plantei. Principalele enzime implicate se consideră a fi chitinazele, glucanazele, enzimele participante la biosinteza flavonoizilor şi fitoalexinelor. Pentru VAM se cunosc activări temporare ale acţiunii unor gene implicate în răspunsul de apărare al plantei, respectiv al biosintezei produşilor acestora şi prezenţei fitoalexinelor, dar până în prezent nu s-au putut identifica reacţii clare şi semnificative în inducerea acestor procese (Harrison, 1997). Elicitorii sintetizaţi de fungii ectomicorizali pot induce reacţii de apărare însă chitinazele plantei îi pot


201

inactiva cu uşurinţă (Salzer şi colab, 1997), fapt ce demonstreză că celula gazdă controlează mecanismele colonizării (figurile 2, 3).

Figura 2. Morfologia şi punctele de control ale simbiozei de tip vezicular-arbuscular Ep=celule epidermale; C=celule corticale; En=celule endodermice; s=spori;

eh=hifă extracelulară; ap=apresoriu; ih=hifă intercelulară; a=arbuscule; ic=buclă intracelulară; v=veziculă; A=tipul Arum, B=tipul Paris (după Barker şi colab., 1998).

Figura 3. Reprezentarea schematică a evoluţiei simbiozei ectomicorizale. Etapele de dezvoltare timpurie (stânga) şi respectiv maturitate (dreapta) a ectomicorizelor (după Barker şi colab., 1998).


202

2. Analiza stabilirii simbiozei cu micorize prin tehnici electronomicroscopice

În ciuda numeroaselor studii efectuate asupra acestui tip de simbioză, mecanismele implicate în interacţiile de tip micorizal nu sunt pe deplin cunoscute, iar informaţiile de care dispunem, sunt uneori contradictorii. Tehnicile citohistochimice şi electronomicroscopice reprezintă instrumente facile pentru inţelegerea proceselor fundamentale ale acestei interacţii care permit surprinderea modificărilor anatomice şi citofiziologice implicate. 2.1.Particularităţi ultrastructurale ale simbiozei cu ectomicorize

Micorizele ericoide se caracterizează prin faptul că penetrarea celulelor se realizează fără formarea apresoriului, remarcându-se prezenţa unor zone interfaciale între fungul endofit şi gazdă şi a unui material electronodens în vacuolele gazdei ce înconjoară hifa. Această zonă interfacială este constituită din material fibrilar asociat cu peretele celular al endofitului. Sunt colonizate numai celulele epidermale. La micorizele arbustoide (intermediare între ectomicorize şi micorizele ericoide), iniţierea colonizării începe prin formarea reţelei Hartig. Hifa reţelei Hartig se ramifică şi formează un ţesut compact asemănător unui labirint. Pereţii acestei hife au aspect electrono-dens (aproximativ 160 nm grosime) şi este distinct de peretele adiacent al celulei gazdă. Reţeaua Hartig î nconjoară celulele epidermale dar nu penetrează cortexul rădăcinii. Ulterior, prin dezvoltarea reţelei Hartig, hifa penetrează peretele celulelor epidermale şi are aspect electrono-dens. Hifa intracelulară, care are pereţii între 25-35 nm grosime, este î nconjurată de plasmalema celulei gazdă şi de un matrix de aproximativ 100 nm grosime. Se consideră că acest matrix este de origine vegatală, datorită inexistenţei sale la nivelul hifei extracelulare şi este contiguu cu peretele gazdei. Structura acestui matrix variază la diferite specii ectomicorizale conducând la ideea originii sale vegetale. De exemplu, la Pyrola minor matrixul este granular omogen situat între peretele fungal şi plasmalema celulei gazdă, în timp ce la Pyrola secunda are aspectul unui fagure de miere. Alte aspecte ultrastructurale ce caracterizează colonizarea cu micorize sunt: prezenţa a numeroase hife intracelulare, citoplasma celulei gazdă densă, bogată în mitocondrii, dictiozomi, plastide, ribozomi, reticul endoplasmatic. Citoplasma fungică are o densitate mărită faţă de cea a gazdei în care abundă mitocondrii, nuclei şi uneori corpi multiveziculari. Se pot observa cu uşurinţă prezenţa depozitelor fungale de glicogen, lipide, granule de polifosfaţi. Senescenţa, instalată într-o regiune localizată a celulei, determină modificări la nivelul citoplasmei celulei gazdă. Aceasta devine mai electrono-densă, pierzând integritatea structurală a organitelor prezente. În acest stadiu hifa fungală şi matrixul au o dezvoltare normală. Rareori, în cadrul interacţiei, s-a observat o hifă fungală degenerată alături de citoplasmă funcţională. În mod normal degenerarea hifei se produce după dizolvarea citoplasmei celulei gazde. Degenerarea începe în centrul celulei epidermale sau uniform în toată masa celulei. Prin distrugerea pereţilor hifali matrixul se dispersează în zona golită de conţinut existentă între peretele fungal şi plasmalema gazdei. Senescenţa determină ca transferul nutrienţilor să se facă de-a lungul zonei interfaciale dintre gazdă şi hifa intracelulară, când citoplasma ambilor participanţi are aspect fin granular. Ectomicorizele prezintă unele aspecte structurale specifice care includ: mantaua fungică, reţeaua Hartig şi hifele externe. Teaca sau mantaua fungică formează un ţesut fungic gros ce acoperă radicelele plantei-gazdă. Este alcătuită dintr-un sistem complicat, ramificat dezvoltat din hifele care pătrund între celulele epidermice şi, uneori, chiar între celulele cortexului radicular. Rolul


203

fiziologic al acestei structuri se pare că ar fi, în opinia lui Kotke şi Oberwinkler (1987), schimbul bidirecţional de nutrienţi, în timp ce Lei şi Dexheimer (1988), folosind tehnici indirecte de evidenţiere a enzimelor, au afirmat că pereţii fungali adiacenţi dintre ramificaţiile fungale sunt responsabile de acest proces. În perioada iniţierii colonizării, mantaua fungică şi hifele reţelei Hartig prezintă nuclei şi vacuole cu depozite dense. Unul sau doi nuclei, ca şi mitocondriile şi reticulul endoplasmatic, sunt prezenţi în fiecare compartiment al hifei intracelulare. Funcţie de planul de secţionare, unele hife ale reţelei Hartig apar ramificate. În zona proximală a reţelei Hartig, compartimentele hifale prezintă unul sau doi nuclei mai puţin electrono-denşi. Hifele reţelei Hartig prezintă numeroase vacuole, mitocondrii şi depozite electrono-dense, probabil polifosfaţi. Nucleul fungului este asociat cu numeroşi microtubuli, într-o zonă senescentă. Reţeaua Hartig, formată în urma ramificării hifei fungale (Nylund şi Unestam, 1982), împrejmuieşte celulele corticale, traversând lamela mijlocie. Hifele din reţeaua Hartig prezintă particular, depozite bogate de glicogen, în timp ce ectomicorizele formate de specia Endogone au conţinut lipidic. Celula gazdă nu pare a fi afectată în urma colonizării, ci prezintă doar o orientare transversală a celulelor cortexului şi epidermale, în locul celei longitudinale normale. Nu au fost evidenţiate alterări ale citoplasmei, granulele de amidon au dimensiuni reduse dar amiloplastele se prezintă intacte (Marks şi Foster, 1973), pereţii celulari au structură identică cu cei ai rădăcinilor normale. 2.2. Particularităţi ultrastructurale ale simbiozelor cu endomicorize

Endomicorizele vezicular-arbusculare reprezintă cel mai complex grup de micorize în care hifele colonizează celulele cortexului radicular. Hifele se ramifică în sol, la suprafaţa extraradiculară, apoi se răspândesc, longitudinal, iniţial intercelular, apoi intracelular astfel: hife intracelulare ce formează bucle, adesea prezente în straturile externe ale parenchimului cortical; hife intercelulare; hife intracelulare cu ramificaţii multiple, cunoscute sub numele de arbuscule; hife hipertrofiate situate intra sau intercelular, denumite vezicule. Informaţiile privind dezvoltarea morfologică a arbusculelor sunt multiple însă, se cunoaşte destul de puţin aspecte privind miceliul extern şi structurile necesare pătrunderii hifei în interiorul celulelor radiculare. Este cunoscut faptul că, fungul formează o structură denumită apresoriu (Bonfante-Fasolo, 1978). Pereţii hifali au ultrastructură diferită de cea a hifelor intraradiculare (Holley şi Peterson, 1979). Hifa pătrunde în celula gazdă străbătând spaţiile goale dintre celule, contactând apoi primul strat de celule corticale. Uneori hifele separă pereţii celulelor corticale şi devin intracelulare ajungând la stratul secundar. Hifele intercelulare nu se mai ramifică în acestă zonă dar formează bucle. Aceste bucle conţin toate organitelor celulare majore precum şi acumulări de glicogen şi lipide. Hifa suferă constricţii în urma penetrării peretelui celulei gazdă şi determină impingerea plasmalemei acesteia, formând o regiune interfacială între peretele fungal şi plasmalema gazdei. În apropierea punctului de penetrare se evidenţiază un matrix continuu. Au fost sesizate modificări ale lamelei mijlocii (Kinden şi Brown, 1975), sugerând că penetrarea peretelui celulei vegetale este un proces mediat enzimatic nu doar mecanic. Colonizarea se produce apoi rapid, trecând de la o celulă la alta (Grippiolo, 1981). În stratul intern al parenchimului cortical, hifa pricipală prezintă dezvoltare intercelulară şi formează arbuscule intracelulare. Acestea se ramifică lateral în celula gazdă şi determină invaginarea plasmalemei. Hifa se va ramifica progresiv formând un sistem de hife mai mici. Ulterior arbusculele se golesc de conţinut datorită diferenţierii progresive a septului subapical care va separa aceste structuri (Scannerini şi colab., 1975).


204

Celula gazdă prezintă un conţinut citoplasmatic dens, cu nuclee cu mai mulţi nucleoli şi sistem Golgi hiperactivat. Plastidele sunt blocate în faza de proplastid (Strullu, 1976) sau se transformă în cromoplaste, sugerând modificări ale metabolismului glucidelor prezente în celula gazdă. La Vitis apar amiloplaste de dimensiuni foarte reduse a căror prezenţă demonstrează că fungul nu poate determina prevenirea acumulării amidonului în totalitate.

În timpul colonizării vacuolele mari se dezagregă formând unele de dimensiuni reduse. După degradarea fungului, când din peretele celular al acestuia rămân doar câteva fragmente, vacuolele gazdei vor ocupa din nou zona respectivă. Deşi aceste vezicule au fost studiate în detaliu (Kinden şi Brown, 1975; Protsenko şi Shemakanova, 1974) stadiile de dezvoltare nu au fost determinate experimental datorită dificultăţilor metodelor şi tehnicilor mai puţin adecvate. Aceste structuri fungale se găsesc de-a lungul rădăcinii micorizale atăt în interiorul cât şi între celule. În interiorul vacuolei fungice se acumulează lipide, în unele cazuri acumularea glicogenului este urmată de creşterea conţinutului lipidic (Kinden şi Brown, 1975). Între zona extramatriceală şi cea fin arbusculară sunt prezente numeroase vacuole ce conţin granule dense cu diametru de 60-160 nm. Acestea lipsesc în zonele fără conţinut celular. Polifosfaţii au fost identificaţi doar la speciile: Glycine max, Allium cepa (Cox şi colab, 1980) şi Taxus baccata (Strullu, 1984). Mulţi fungi endomicorizali, prezintă în citoplasmă, unele bacterii sub forma unor structuri asemănătoare vacuolelor. Aceste bacterii se divid (Scannerini, 1975; Bonfante-Fasolo, 1978) şi nu determină simptome citopatice celulei gazdă. Matrixul interfacial format între fung şi gazdă poate avea aspect amorf (Allium- Cox şi Sanders, 1974 şi tutun- Kaspari, 1975), granulat (Glycine- Carling, 1977) şi uneori stratificat, compact şi electrono-dens la Vitis (Bonfante-Fasolo, 1978). Matrixul interfacial conţine glicoproteine. Originea matrixului nu este cunoscută, dar uneori continuitatea cu peretele celular al gazdei remarcată prin electronomicroscopie sugerează provenienţa sa. Aceşti compuşi pot fi identificaţi prin tehnici adecvate de ultracitochimie şi au demonstrat că aceleaşi proteine şi polizaharide se găsesc şi în peretele celulei gazdă (Scannerini şi Bonfante-Fasolo, 1982). Recent s-a evidenţiat prezenţa calciului în matrixul arbuscular de la Taxus baccata, fapt ce confirmă indirect prezenţa pectinelor.

Figura 4a. Hifa (Glomus epigeus) ce penetrează spaţiul intercelular al celulei gazdă (Vitis vinifera) 4b. Arbuscule ramificate în diferite stadii de dezvoltare prezente în celulele micorizale (Vitis vinifera)

colonizate cu fungi Glomus fasciculatus (Scannerini şi Bonfante-Fasolo, 1982).


205

Cercetările efectuate de noi, pe speciile Glycine max, Allium cepa şi Zea mais au evidenţiat că hifele se asociază, într-o etapă iniţială, strâns la ţesutul gazdă prin mecanisme neelucidate, traversează spaţiile intercelulare, se răspândesc apoi printre celulele stratului cortical pe care le penetrează şi ulterior cresc în interiorul acestora formând aşa-numitele complexe hifale (hife încolăcite, etc). Mulţi autori consideră că �infecţia� celulei vegetale se realizează îndeosebi prin acest proces de penetrare a peretelui celular şi în mai mică măsură prin răspândire superficială de la o celulă la alta. Observaţiile noastre confirmă această ipoteză. Modul de traversare a peretelui celular poate varia în funcţie de anatomia rădăcinii dar se presupun două căi posibile, mecanice şi enzimatice. Unele hife rămân localizate în spaţiul intercelular . Prin ramificări dihotomice repetate hifele formează structuri tridimensionale asemănătoare coroanei arborilor denumite �arbuscule�. Aceste ramificaţii arbusculare realizează o suprafaţă largă de contact între cei doi simbionţi facilitând schimbul de metaboliţi. Se remarcă de asemenea prezenţa a numeroase vezicule, azigospori şi celule anexe. Proliferarea fungilor veziculari-arbusculari se produce numai în interiorul cortexului radicular şi nu în ţesutul epidermal, hipodermal sau exodermal, unele hife sunt extinse şi neramificate formând asocieri încolăcite. Studiile de microscopie electronică cu transmisie au adus informaţii suplimentare surprinzându-se etape ale invaziei celulei fungale în celulele plantei precum şi ale dezvoltării intracelulare a hifelor. Astfel în zona de penetrare a peretelui celulei gazdă se remarcă septarea hifei (figura 5), apariţia unui manşon electrono-dens care poate fi compact sau difuz, prezenţa în zona interfacială a numeroase vezicule şi acumularea la nivelul plasmalemei şi a tonoplastului vacuomului celulei plantei a unor depozite electronodense, presupuse de unii autori drept compuşi polifenolici (taninuri) şi acumulări de lipide şi/sau glicogen, granule de polifosfaţi. În momentul străpungerii peretelui celular hifa suferă o uşoară constricţie, împinge uşor plasmalema celulei gazdă, iar între peretele fungal şi plasmalemă se creează o zonă interfacială. Sunt de asemenea remarcate alterări ale lamelei mijlocii ceea ce sugerează implicarea unor procese enzimatice în această fază a colonizării. Citoplasma celulei gazdă suferă pe parcurs o serie de modificări ale structurii principalelor organite componente (în particular a plastidelor şi a vacuomului). În etapa finală a colonizării se remarcă prezenţa unei vacuole centrale voluminoase în interiorul căreia sunt evidenţiate profile ale celulelor fungale în faze diferite de dezvoltare. Prezenţa lomasomilor pe care uneori se află localizat material electronodens susţine ideea conform căreia hifele pot secreta material extracelular posibil de natură polizaharidică cu implicaţii î n liza locală a peretelui celular (figura 6). Asociaţiile de tip vezicular-arbuscular sunt extrem de dinamice aşa încât în ţesut pot fi observate hife cu o structură celulară variabilă, aflate în faze diferite de dezvoltare, unele sunt puternic vacuolizate cu semne de senescenţă avansată (figura 7, 8) în timp ce altele conţin o citoplasmă densă cu nuclei voluminoşi, organite celulare tipice (figura 8). Fibrilele glicoproteice produse de către fung, dezvoltate în prezenţa celulei gazdă pot reprezenta un răspuns de recunoştere celulară între cei doi parteneri, fapt ce este confirmat şi de alte cercetări (Esquerre-Tugaye şi colab, 1979; Albersheim şi Anderson-Prouty, 1975). În faze avansate ale colonizării citoplasma celulei gazdă capătă un aspect puternic granular, conţine un număr redus de organite, vacuom voluminos la nivelul căruia pot apare corpi globulari sau simple depuneri electronodense. Ulterior, apar fenomene degenerative avansate atât în celulele fungice cât şi în celulele plantei. Au fost descrise procese de �digestie�, �liză� sau �autoliză� a complexelor hifale. Sunt frecvent remarcate asocieri de celule fungice cu conţinut lizat, în interiorul celulelor gazdă cu citoplasmă necrotică şi organite celulare degenerate. Indiferent de natura acestor procese se presupune că în cursul


206

degradării fungului sunt eliminaţi nutrienţi care trec spre celulele necolonizate ale ţesutului gazdă (Read, 1983; Scannerini şi Bonfante Fasolo, 1983; Azeon-Aguilar şi Barea, 1997; Hambleton şi Currah, 1997). Patternul colonizării şi al dezvoltării intracelulare a fungului micorizal a fost acelaşi în cazul tuturor speciilor analizate de noi şi este similar cu cel descris pentru alte asocieri de tip vezicular-arbuscular. Diferenţe au apărut în ceea ce priveşte reactivitatea faţă de infecţia fungală, specia Zea mays dovedindu-se în condiţiile noastre experimentale cea mai reactivă, iar Glycine max cea mai puţin sensibilă.

Figura 5. Zona de penetrare a peretelui celulei gazdă (Zea mays) de către fungii din genul Glomus.

Figura 6. Lomasoni aflaţi în apropierea peretelui celular la Zea mays colonizat cu fungi de micorize.

Figura 7. Asociaţii de tip veziculo-arbuscular aflate în diferite faze de dezvoltare.


207

Figura 8. Celule fungice cu citoplasmă densă şi nuclei voluminoşi prezenţi in interiorul celulei gazdă.

3. Evidenţierea simbiozei de tip micoriză prin analize citohistochimice

Folosirea tehnicilor citohistochimice permite investigarea unor aspecte importante legate de: 1) Structura şi aria de răspândire a simbiozei; 2) Evidenţierea activităţii fiziologice a simbionţilor; 3) Folosirea tehnicilor ultracitochimice pentru studiul modificărilor survenite la nivel celular şi subcelular 3. 1) Structura şi aria de răspândire a simbiozei Observaţii pertinente privind interacţia endomicorizală s-au efectuat utilizând tehnici bazate pe folosirea radiaţiilor UV (Ames şi colab, 1982). Tehnicile histologice sunt limitate pentru studiul ţesutului radicular tânăr în care se localizează arbusculele. Tehnicile ce utilizează coloraţia cu tripan blue (figura 9) sau clorazol black (figure 10) şi liza alcalină cu KOH (Phillips şi Hayman, 1970; Brundrett şi colab, 1983) evidenţiază hifele superîncolăcite intracelulare (endomicorize ericoide şi cele aparţinând speciei Orchidacea) sau vezicule şi arbuscule (micorize vezicular-arbusculare). Aceste preparate pot fi semipermanente şi evidenţiază aria de distribuţie a colonizării micorizale în interiorul sistemului radicular (Phillips şi Hayman, 1970; Giovanetti şi Mosse, 1980; Trouvelot, 1986; McGonigh şi colab, 1990). Tehnicile menţionate oferă o informaţie bogată privind influenţa celulei gazde asupra morfologiei fungului. De exemplu, la plantele erbacee, fungii VAM formează arbuscule repetat încolăcite provenind dintr-o singură hifă compunând o reţea intercelulară ramificată. La alte specii nu se formează miceliu intercelular, arbusculele sunt greu de vizualizat datorită dezvoltării directe sub forma unor hife cu structură foarte fină, formând o reţea intracelulară de micelii laxă, puţin încolăcită ce se intinde de la o celulă la alta. Prin secţiunile transversale efectuate pe preparatele infiltrate în răşină sau pe squash-uri, colorate cu tripan blue sau toluidină se poate vizualiza modul în care are loc proliferarea fungilor VAM, formarea arbusculelor şi veziculelor în interiorul cortexului şi nu în ţesutul epidermal, hipodermal sau exodermal.


208

Figura 9. Evidenţiere histochimică a fungilor de micorize din genul Glomus prin coloraţie cu Tripan Blue. (Mărire directă X 200).

Figura 10. Evidenţiere histochimică a fungilor de micorize din genul Glomus prin coloraţie cu Chlorazol Black. (Mărire directă X 200).


209

3. 2. Evidenţierea activităţii fiziologice a simbionţilor Pentru explicarea proceselor colonizării endomicorizale este necesar să se utilizeze tehnicile de colorare pentru localizarea activităţii unor enzime (cu coloranţi vitali), care reflectă eventualele modificări fiziologice apărute în urma colonizării sau semnalarea prezenţei unor compuşi chimici (cu coloranţi citohistologici). A) Ţesutul fungic Tehnica de colorare ce presupune şi liza ţesutului radicular colonizat de fungi endomicorizali nu oferă informaţii privind etapele fiziologice ale colonizării sau influenţa factorilor de mediu asupra acestora. Dintre coloranţii citohistochimici ce se utilizează cel mai frecvent în microscopia fotonică pentru detectarea unor compuşi din miceliul endomicorizal (Jensen, 1962; Nemec, 1981) cei mai uzuali sunt cei ce evidenţiază lipidele şi polifosfaţii. Astfel, prezenţa lipidelor indică faptul că fungul acumulează activ carbonul rezultat din procesele metabolice ale celulei vegetale, în timp ce polifosfaţii reprezintă forma chimică în care fungul stochează fosfatul înaintea eliberării sale de către plantă şi sugerează că miceliul fungic transferă fosfatul în ţesutul rădăcinii (Callow şi colab., 1978). Coloranţii vitali sunt utilizaţi pentru a determina localizarea activităţii unor enzime (Pearse, 1978). De exemplu, succinat dehidrogenaza este o enzimă mitocondrială participantă la ciclul Krebs (MacDonald şi Lewis, 1978). Evidenţierea sa prin metode histochimice estimează cantitativ miceliul fungal ce colonizează rădăcina plantei. Pe secţiunile transversale efectuate prin rădăcini micorizale se evidenţiază arbusculele funcţionale ce pot fi uşor diferenţiate de cele senescente. Colorarea cu tripan blue precum şi localizarea activităţii succinat dehidrogenazei oferă date asupra eficacităţii metabolice a colonizarii cu micorize. Folosind aceste metode citohistochimice a fost posibilă testarea efectului unor pesticide asupra activităţii celulelor fungice în stadiile incipiente ale dezvoltării micorizale (6-8 săptămâni). Colorarea cu tripan blue estimează infecţia activă, fapt relevat şi de prezenţa succinat dehidrogenazei (Ocampo, 1982; Kough şi colab., 1987; Smith şi colab., 1990; Smith şi Gianinnazzi-Pearson, 1990; Abdel-Fattah, 1991). Coloranţii vitali sunt deosebit de utili şi pentru determinarea distribuţiei activităţii fosfatazei alcaline (figura 11A), enzimă implicată în metabolismul fosfatului în celula fungică (Gianinnazzi-Pearson şi Gianinnazzi, 1978, 1983, 1988). Studii de microscopie fotonică, privind activitatea acestei enzime, relevă deseori că aceasta nu a fost detectată în hifa ce provine din proliferarea sporilor, unde activitatea sa este limitată în zona subapicală. B) Ţesutul vegetal Modificările morfologice ce apar la nivelul celulelor ţesutului radicular colonizat cu endomicorize nu sunt evidente prin microscopia fotonică. Totuşi, utilizând coloranţii vitali este posibilă evidenţierea activităţii peroxidazei (figura 11C) asociată celulelor ţesutului epidermal şi hipodermal care poate fi mărită în rădăcinile endomicorizale. Totuşi, peroxidazele sunt asociate cu reacţiile de apărare ale ţesutului vegetal (Kuc, 1982), contribuind la mărirea rezistenţei celulelor endomicorizale la diverşi patogeni (Bagyaraj, 1984). Lipsa activităţii peroxidazice în celulele parenchimatice colonizate indică faptul că activitatea enzimatică nu este indusă de colonizarea fungică (Spanu şi Bonfante-Fasolo, 1988). Aceasta confirmă şi alte observaţii ce sugerează că micorizele dezvoltă foarte slab reacţii de apărare din partea celulei vegetale (Gianinazzi şi Gianinnazzi-Pearson, 1990). 3. 3. Folosirea tehnicilor ultracitochimice pentru studiul modificărilor survenite la nivel

celular şi subcelular Modificările simbionţilor endomicorizali sunt asociate cu schimbări în organizarea celulară precum şi la nivel macromolecular. Acestea se pot observa prin tehnici de microscopie electronică care presupun fixarea structurilor celulare, în filtrarea ţesutului în


210

răşină, colorarea secţiunilor ultrafine cu agenţi de contrastare. Informaţii specifice privind structura macromoleculelor şi activităţile fiziologice asociate cu componentele celulare pot fi obţinute folosind tehnici relativ simple (evidenţierea unor polizaharide şi proteine sau a activitaţii unor enzime, Hall, 1978; Aldrich, 1986). A) Componenţii structurali În urma colonizării, în celulele fungice apar modificări la nivelul peretelui celular fungic (Bonfante-Fasolo şi Spanu). Organizarea ultrastructurală a simbiontului fungal suferă modificări importante după colonizarea celulei vegetale. Aceste particularităţi sunt evidente la fungii micorizali ericoizi ce se dezvoltă în jurul şi interiorul celulei gazdă. Hifa extraradiculară produce o masă fibrilară, abundentă evidenţiată prin teste ultracitochimice cu proteinat de Ag al acidului tiocarbohidrazid periodic (PATAg) şi reacţia Swift şi cu acid fosfotungstic PTA şi anume: polizaharidele, proteinele, glicoproteinele. Producerea materialului fibrilar este esenţială pentru o eficienţă crescută a procesului colonizării, probabil datorită adeziunii hifei externe de suprafaţa rădăcinii celulei gazde (Gianinnazzi-Pearson, 1986). După ce are loc colonizarea celulelor, planta gazdă exercită control asupra sintezei fibrilelor astfel încât hifa intracelulară nu mai produce material fibrilar.

Figura 11. Evidenţierea histochimică a activităţii fosfatazei alcaline (A), fosfatazei acide (B) şi peroxidazelor (C) î n celule de Zea mays colonizate cu fungi de micorize. (Mărire directă X 200).


211

Modificările survenite î n metabolismul peretelui celular fungic sunt mai puţin drastice î n cazul micorizelor VA şi anume: subţierea graduală a acestuia conduce î n final la simplificarea structurii macromoleculare (Gianinnazzi-Pearson 1981, Bonfante-Fasolo şi Grippiolo 1982, Jacquelinet-Jeanmougin 1987). Miceliul extraradicular şi hifa din ţesutul epidermal sau hipodermal prezintă perete celular multistratificat cu textură fibrilară. Distribuţia polizaharidelor (testul PATAg) variază î n fiecare strat al peretelui celular, î n timp ce proteinele (reacţia Swift) sunt răspândite ubiquitar. PATAg şi reacţia Swift indică totodată că invadarea celulelor fungice se realizează numai în celulele corticale ale gazdei, pereţii celulari ai hifelor arbusculare rămân monostratificaţi, având o structură amorfă. Această structură simplificată, similară cu cea a vârfurilor hifelor, conduce la creşterea plasticităţii peretelui fungilor VA, acest fapt contribuind la modificări în morfogeneză (formarea arbusculelor). În celula gazdă apar modificări structurale numeroase (creşterea volumului citoplasmatic, a numărului organitelor, extinderea sistemului membranar) comune la mai multe tipuri de endomicorize. Există multe cercetări privind schimbările survenite în celula vegetală gazdă însă, foarte puţine investighează interfaţa intracelulară dintre cei doi simbionţi. Odată cu iniţierea colonizării, membrana celulei gazdă ce provine din extinderea plasmalemei, înconjoară matrixul şi peretele celular fungal. (Dexheimer, 1979; Scanerini şi Bonfante-Fasolo, 1979; Bonfante-Fasolo şi Gianinazzi-Pearson,1982; Serrigny, 1985). Acesta este omogenă, cu structură asemănătoare peretelui celular primar. Similitudinea celor două structuri a fost confirmată prin test chimice (cu dimetilsulfoxid, acid etilendiaminotetraacetic) sau enzimatice (folosind celulaze, pectinaze, proteaze) alături de reacţiile de identificare a polizaharidelor şi proteinelor (PATAg, reacţia Swift). Pe măsură ce hifa intracelulară se dezvoltă, totuşi depozitele situate la interfaţa dintre gazdă şi celula fungică scad. Acestă interfaţă membranară care este în continuă proliferare şi activitate, nu prezintă modificări structurale, citochimice sau în activitatea enzimatică (Gianinazzi-Pearson, 1984), facilitând schimburi de nutrienţi şi asigură un sistem de semnalizare între cei doi simbionţi. B) Aspecte morfofuncţionale Moleculele ce prezintă semnificaţie funcţională în fiziologia asociaţiilor endomicorizale pot fi localizate la nivel celular folosind tehnici citochimice sau citoenzimologice. Localizarea enzimei prin tehnici de microscopie electronică necesită imobilizarea enzimei cu păstrarea activităţii sale în timpul etapelor preliminare de prelucrare a ţesutului vegetal. Determinarea activităţii fosfatazelor se bazează pe captarea lor in situ şi precipitarea ionilor metalelor grele (Pb, Ce) din fosfaţii clivaţi din substrat. Endomicorizele ericode prezintă activitate fosfatazică (inhibată de fluoruri sau molibdaţi) intensă, asociată materialului fibrilar hifal ce se dezvoltă în apropierea rădăcinii. Explicaţia o reprezintă faptul că activitatea enzimatică sau sinteza enzimei este stimulată de prezenţa ţesutului gazdă sau de unele nivele scăzute de fosfat. Totuşi, colonizarea fungilor ericoizi nu determină activarea fosfatazei acide şi prezenţa ei este semnalată în cantităţi foarte reduse pe suprafaţa celulei fungice. (Gianinazzi-Pearson şi colab, 1986; Lemoine şi colab, 1990). Ca şi în sinteza fibrilelor hifale, planta îşi exercită controlul specific asupra activităţii fiziologice a celulei fungice. Folosind metode de citochimie electronomicroscopică alături de cele de microscopie electronică clasică s-a demonstrat că micorizele VA acumulează fosfat şi prezintă activitate fosfatazică (alcalină). Aceste caracteristici s-au semnalat în vacuolele hifei fungice. Localizarea fosfatului în sistemul vacuolar (granule osmofile pe preparatele electrono-microscopice) a condus la concluzia că vacuolele fungice joacă un rol esenţial în transportul activ al fosfatului de-a lungul hifei (Tinker, 1978; Gianinazzi-Pearson şi Gianinazzi, 1983, 1988). Prezenţa fosfatazei alcaline în sistemul vacuolar şi asocierea sa frecventă cu


212

tonoplastul fungic poate reflecta o implicare posibilă a acestei enzime în mecanismele de transport al fosfatului. În transportul fosfatului sunt implicate două tipuri de enzime membranare şi anume: fosfatazele neutre (considerate a fi asociate cu situsul de producere a precursorilor peretelui celular) şi ATP-azele (generatoare de energie, Marx şi colab., 1982; Jeanmaire şi colab., 1985; Gianinazzi-Pearson, 1984, 1991). Aceste enzime nu sunt implicate în extensia celulelor parenchimului cortical deoarece acest proces este finalizat şi nu necesită aport de energie. Activitatea ambelor enzime a fost intens studiată de-a lungul membranei perisimbiotice ce înconjoară hifa intracelulară a fungilor endomicorizali ce se dezvoltă în ţesuturile rădăcinii. Activitate ATP-azelor este considerabil crescută, fiind detectată citochimic de-a lungul plasmalemei fungice şi a membranei celulei gazdă precum şi în zona matrixului interfacial asociat hifelor tinere, în diferite simbioze endomicorizale (Marx şi colab., 1982; Gianinazzi-Pearson şi colab, 1984; Serrigny şi Dexheimer, 1985). Activitatea enzimatică dispare odată cu instalarea proceselor de senescenţă a hifei intracelulare. Unii cercetători au concluzionat, comparând efectul ATP-azei şi al inhibitorilor nespecifici fosfatazei din VAM (Gianinazzi-Pearson şi colab., 1991), că H+-ATP-aza din plasmalemă este componentă a sistemului enzimatic activat în membrana celulei vegetală şi fungice. Interfaţa dintre cei doi simbionţi este considerat a fi locul de trafic a celor două căi de transport membranar al nutrienţilor şi compuşilor fotosintetizaţi din plantă (fosfatul trece din fung spre celula gazdă). Acest transport bidirecţional este susţinut energetic de prezenţa enzimei H+-ATP-aza. Fosfataza neutră a fost evidenţiată în zona matrixului interfacial în care nu există depozite de material fibrilar (Gianinazzi-Pearson şi colab, 1984; Serrigny şi Dexheimer, 1985; Jean-maire şi colab., 1985). Aceasta sugerează că de fapt, are loc sinteza precursorilor peretelui celular în timpul dezvoltării hifei intracelulare, dar asamblarea lor este impiedicată întrucâtva. Această interpretare este confirmată de localizarea imunocitologică a precursorilor peretelui celular la interfaţa celor doi parteneri simbiotici. Membrana interfacială posedă un sistem enzimatic generator de energie (H+ATP-aza) pentru transportul activ transmembranar ce facilitează schimbul nutrienţilor. Procesul este în contrast cu cel prezent în reacţiile de patogenitate, unde există o inhibare a ATP-azei din plasmalema celulei gazde în prezenţa fungului şi transportul nutrienţilor este unilateral, către parazit (Gay, 1984; Woods şi Gay, 1987).

4. Aspecte biochimice ale simbiozei de tip micorizal Numeroase experienţe au demonstrat influenţa simbiontului fungic, heterotrof, asupra produşilor fotosintetizaţi ai gazdei. Fungii micorizali realizează o deviaţie metabolică prin conversia glucidelor existente la nivelul celulei vegetale gazdă (glucoză, fructoză, zaharoză) în forme glucidice tipice fungului, absente în plantă (glicogen, trehaloză, manitol). Astfel fungii micorizali intervin în metabolismul glucidic al plantei mărind translocarea acestora în rădăcină şi stimulând circulaţia glucidelor fotosintetizate (Zarnea, 1994). Necesităţile plantei faţă de fosfor şi insuficienţa sa relativă în sol conduc la acumularea fosforului în plantele micorizale printr-un mecanism mai puţin cunoscut, fapt ce a condus la studiul rolului micorizelor în absorbţia fosfaţilor (Calleja şi colab., 1980). Printre ipotezele formulate pentru explicarea acestui mecanism cele mai des întâlnite în literatură au fost următoarele: - creşterea absorbţiei fosfaţilor datorată extinderii sistemului radicular micorizal şi exploatarea mai eficientă a solului către acesta (Bowen, 1968); - preluarea fosfaţilor insolubili sau puţini solubili din sol de către complexele micorizale.


213

Simbioza endomicorizală este asociată cu apariţia unei noi fosfataze alcaline, localizată la nivelul vacuolelor fungului (Glomus mossae). Această enzimă este implicată în transportul fosfaţilor din hifa micorizală către celula gazdă, fapt susţinut şi de prezenţa polifosfaţilor în miceliu (Gianinazzi şi Gianinazzi-Pearson 1976, 1978, 1979). Printre enzimele ce constituie markeri biochimici în analiza proceselor metabolice ce însoţesc dezvoltarea miceliului în rădăcinile micorizale se numără şi esterazele implicate în metabolismul lipidelor. În vederea evidenţierii modificărilor datorate colonizării rădăcinilor de porumb cu fungi simbionţi din genul Glomus, în experimentele noastre s-a realizat prin analize electroforetice studiul biochimic al asocierii micorizale. Rezultatele obţinute au evidenţiat variaţia spectrului proteic în ţesutul radicular colonizat comparativ cu cel normal. Aportul suplimentar de fosfor adăugat în sol a determinat diferenţe în spectrul proteic şi enzimatic. Numărul benzile electroforetice corespunzătoare spectrului proteic şi enzimatic este prezentat în tabelul 2 următor:

Tabel 2. Analiza comparativă a spectrului proteic şi enzimatic rezultat în urma colonizării radiculare cu fungi micorizali:

Proteină/Enzimă Număr benzi-M Număr benzi-Mz Număr benzi-PMz

Esteraze 4 4 4 Fosfataze alcaline

pH 8,7 2 3 -

Fosfataze acide pH 5

4 5 4

Peroxidaze 6 6 6 Proteine totale 16 9 9

M= martor, extracţie din rădăcini de porumb normale; Mz=extract din rădăcini de porumb colonizate cu fungi micorizali; Pmz= extract din rădăcini de porumb colonizate cu fungi micorizali+aport de KH2PO4 În vederea optimizării metodei de lucru extracţia proteinelor şi enzimelor s-a efectuat în două tampoane diferite: Tris-citrat 0,5M, pH 8,3 + glutation 0,1+ 10PVP şi respectiv Tris 0,05 M, pH 6,8+mercaptoetanol 10%+ 10% PVP + inhibitor proteazic (Diizopropil fluorofosfat). S-a observat o extracţie mai eficientă a proteinelor şi enzimelor în tampon Tris pH 6,8, claritatea benzilor fiind superioară faţă de primul tampon. Izoenzimele esterazice sunt în număr mai mare ceea ce indică un metabolism intens al acizilor graşi, aceste izoenzime putând fi un indicator în analiza miceliului metabolic activ ce colonizează rădăcinile (figura 12.2). Spectrul fosfatazei alcaline prezintă un număr mai mare de benzi (3) în extractul din rădăcini micorizale faţă de martor. Apariţia benzilor fosfatazei alcaline indică implicarea fosfatazelor în transportul fosfatului în cadrul simbiozei de la celula fungică în celula vegetală care îl eliberează din combinaţiile organice folosindu-l pentru sinteze metabolice proprii (figura 13). Numărul benzilor peroxidazice este identic pentru martor şi pentru extractul din rădăcini colonizate cu fungi micorizali. Acest rezultat este în concordanţă cu datele din literatură (Gianinazzi-Pearson şi Gianinazzi, 1976) care au evidenţiat diferenţe ale spectrului peroxidazelor numai î n cazul parazitismului şi nu î n cazul simbiozei micorizale (figura 12.1). Aceste enzime constituie markeri ai etapelor succesive de dezvoltare a simbiozei


214

micorizale deschizând perspective noi în explicarea mecanismelor ce guvernează procesele metabolice ce însoţesc acest tip de asociere. (1) (2) (3)

Figura 12. Spectrul electroforetic al izoperoxidazelor (1), esterazelor (2) şi proteinelor totale (3). M=martor Mz= rădăcini Zea mays colonizate cu micorize Pmz= rădăcini de Zea mays colonizate cu micorize+ aport fosfor


215

(1) (2)

Figura 13. Spectrul electroforetic al fosfatazei acide (1) şi alcaline (2) M=martor Mz= rădăcini Zea mays colonizate cu micorize Pmz= rădăcini de Zea mays colonizate cu micorize+ aport fosfor


216

Bibliografie selectivă 1. Allen M. F. �The ecology of mycorrhizae. Cambridge University Press, 1991. 2. Azcon �Aguilar C., J.M. Barea- Applying mycorrhiza biotechnology to horticulture:

significance and potentials, Scientia Horticulturae, 68, 1-24, 1997. 3. Bagyaraj J. B.-%n VA Mycorrhiza (C. L. Powell şi J. B. Bagyaraj, eds., 131-154. CRC

Press, Boca Raton, FL, 1984. 4. Barker S. J., Tagu D., Delp G.-Regulation of Root and Fungal Morphogenesis in

Mycorrhizal Symbiosis. Plant Physiol. 116: 1201-1207, 1998. 5. Beguiristain T., Cote R., Rubini P., Jay-Allemand C., Lapeyrie F.- Hypaphorine

accumulation in hyphae of the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius . Phytochemistry, 40, 1089-1091, 1995.

6. Bethlenfalvay G. J., Linderman R. G.- Mycorrhizae in Sustainable Agriculture. ASA Spec. Publ., Madison, WI, 124, 1992.

7. Bonfante P., Bergero R., Uribe X., Romero C., Rigau J., Puidomenech P. -Transcriptional activation of a maize α-tubulin gene in mycorrhizal maize and transgenic tobacco plants. Plant J 9: 737-743, 1996.

8. Bowen G. D. - Phosphate uptake by mycorrhizas and uninfected roots of Pinus radiata in relation to root distribution. Trans Int. Congr. Soil Sc., the 9 th, 2, 219, 1968.

9. Cox G., Sanders F.-Ultrastructure of the host-fungus interface in a vesicular-arbuscular mycorrhiza. New Phytol. 73, 901-912, 1974.

10. Douds D. D. Jr., Nagahashi G., Abney G. D.,-The differential effects of cell wall associated-phenolics, cell walls, and cytosolic phenolics of host and non-host roots on the growth of two species of of AM fungi. New phytol 133:289-294, 1996.

11. Gianinnazzi-Pearson V., Dexheimer J., Gianinazzi S., Jeanmaire C.-Z. Pflazenphysiol.,114, 201-205, 1984.

12. Gianinnazzi-Pearson V., Morandi D., Dexheimer J. Gianinazzi S.-New Phytol., 88, 633-638, 1981,

13. Giovanetti M., L. Avio, C. Sbrana, A. S. Citernesi-Factors affecting apressorium development in the vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mossae, New Phytol., 123, 115-122, 1993.

14. Harley J.L �� The Biology of Mycorrhizas� Leonard Hill , London, 1959. 15. Hayman D. - Endomycorrhizae. In interactions between nonpathogenic soil

microorganisms in plants. Edited by Y. R. Domergues and S. V. Krupa. Elsevier, Amsterdam,401-442,1978.

16. Horan D. P., Chilvers G.A.-Chemotropism; the key to ectomycorrhizal formation? New Phytol 116: 297-30, 1990.

17. Jensen W. A. -Botanical Histochemistry, Principles and Practice, Freeman, San Francisco, 1962.

18. Kotke I., Oberwinkler F.-The cellular structure of the Hartig net: coenocytic transfer cell-like organization, nord. J. Bot., 7, 85-95,1987.

19. Kuc J. - %n Active Defense Mechanisms in Plants (R. K. S. Wood, ed.), NATO ASI Series, Vol A37, 157-178. Plenum Press, New York, 1982.

20. Nester E. W., Kosuge T.-Plasmids specifing plant hyperplasias, Ann Rev. Microbiol., 35, 531-565, 1981.

21. Nylund J.E., Unestam T.- Structure and phisyology of ectomyccorhiza I. The process of mycorrhiza formation in Norway spruce in vitro. New Phytol., 91:65-79, 1982


217

22. Ocampo J. A., Barea J. M.-%n Les Mycorhizes, Partie Integrante de la Plante: Biologie et Perspectives d�Utilisation, Les Colloques de l�INRA nr. 13, (Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. şi A. Trouvelot, eds.), 267-271, INRA, Paris, 1982.

23. Read D.J.-The biology of mycorrhiza in the Ericales, Can. J. Bot., 61, 985-1004, 1983. 24. Salzer P., Hubner B., Sirrenberg A., Hager A.- Differential effect of purified spruce

chitinases and β-1,3-glucanase on the activity of elicitors from ectomycorrhizal fungi. Plant Physiol 114, 957-968, 1997.

25. Scannerini S., Bonfante Fasolo P.-Can. J. Bot, 61, 917-943, 1983. 26. Sckujins J., Allen M. F..�Use of mycorrhizae for rehabilitation�, MIRCEN J., 2, 161-

176,1986. 27. Serrigny J., Dexheimer J.-Cytologia 50, 779-788, 1985. 28. Smith S.E., Read D.J. - Mycorrhizal Symbiosis, Ed 2. Academic Press, Londra, 1997 29. Stribley D. P.-Ecophysiology of VA mycorrhizal plants (G. R. Safir),59-70. CRC. Press,

Boca Raton, FL,1987. 30. Tinker P. B.-Physiol. Veg. 16, 743-751, 1978. 31. Trouvelot A., Kough J. L., Gianinazzi-Pearson V.-%n Physiological and Genetical

Aspects of Mycorrhizae (Gianinazzi-Pearson V., Gianinazzi S. eds), 217-221, INRA, Paris, 1986.

32. Weiss M, Mikolajewski S., Peipp H., Schmitt U., Schmidt J., Wray V., Strack D-Tissue specific and development-dependent accumulation of phenylpropanoids in larch mycorrhizas. Plant Physiol 114, 15-27, 1997.

33. Wessels J.G.H.-Fungal hydrophobins: proteins that function at an interface,1996. 34. Zarnea G- Tratat de microbiologie generala, Ed. Acad. Rom., 367, 1994.

Particularităţi ale interacţiei celulă vegetală - celulă fungică de

Documents

Transcript of Particularităţi ale interacţiei celulă vegetală - celulă fungică de