MODULAREA ACTIVITĂMODULAREA ACTIVITĂŢŢII MEMBRANARE A II MEMBRANARE A

UNOR PEPTIDE ANTIMICROBIENE UNOR PEPTIDE ANTIMICROBIENE ŞŞI PORINII PORINI

DE CĂTRE PROPRIETĂ DE CĂTRE PROPRIETĂŢŢILE ELECTRICE ILE ELECTRICE ŞŞI I

MECANICE ALE MATRICEI LIPIDICEMECANICE ALE MATRICEI LIPIDICE

Conducător ştiinţific:

Prof. Univ. Dr. Tudor LUCHIAN

Universitatea ‘Al. I. Cuza’ IaşiFacultatea de Fizică, Şcoala doctoralăLaboratorul de Biofizică Moleculară şi Fizică Medicală

Rezumatul tezei de doctorat

Drd. MEREUŢĂ Loredana-Cristina

2010, Iaşi

1

Universitatea “ALEXANDRU IOAN CUZA” IAŞI

În atenţia

…………………………………………………………………...

Vă facem cunoscut că în data de 7 iunie 2010., ora 12.00, în

Sala de Conferinţe a Rectoratului, domnişoara MEREUŢĂ Loredana - Cristina

va susţine, în şedinţă publică, teza de doctorat:

“Modularea activităţii membranare a unor peptide antimicrobiene şi porini de

către proprietăţile electrice şi mecanice ale matricei lipidice”

în vederea obţinerii titlului ştiinţific de doctor în domeniul fundamental Ştiinţe

Exacte, domeniul Fizică.

Comisia de examinare a tezei:

Prof. Dr. Dumitru Luca Preşedinte

Decanul Facultăţii de Fizică

Universitatea “Alexandru Ioan Cuza“ Iaşi

Prof. Dr. Tudor LUCHIAN Conducător ştiinţific

Facultatea de Fizică

Universitatea “Alexandru Ioan Cuza “ Iaşi

Prof. Dr. Dorina CREANGĂ Referent

Facultatea de Fizică

Universitatea “Alexandru Ioan Cuza “ Iaşi

Prof. Dr. Dan MIHĂILESCU Referent

Facultatea de Biologie

Universitatea din Bucuresti

Conf. Dr. Dragoş GRIGORIU Referent

Facultatea de Medicină

Universitatea de Medicină şi Farmacie

“Gr.T.Popa” Iaşi

Vă invităm pe această cale să participaţi la şedinţa publică de susţinere a tezei.

2

CUPRINSUL TEZEI

Lista de abrevieri.....................................................................................................4 I. Peptide antimicrobiene - macromolecule biologice esenţiale pentru viabilitatea organismelor pluricelulare..................................................................5 II. Elemente structurale şi funcţionale ale peptidelor antimicrobiene...............9

1. Descrierea structurală a alameticinei........................................................13 2. Descrierea structurală a magaininei 2.......................................................17 3. Descrierea structurală a melitinei..............................................................20 4. Descrierea structurală a peptidei HPA3....................................................23

III. Descrierea moleculară a interacţiunilor dintre peptidele antimicrobiene şi membrane lipidice artificiale................................................................................25

1. Tipurile de interacţiuni moleculare manifestate între peptide antimicrobiene şi biomembrane................................................................26

2. Mecanisme de destabilizare a membranelor celulare de către peptide antimicrobiene...........................................................................................30

IV. Manifestări electrice ale membranelor biologice........................................ 36

1. Potenţialul transmembranar.......................................................................37 2. Potenţialul de suprafaţă.............................................................................39 3. Potenţialul de dipol membranar................................................................43

V. Elemente de mecanica bistratului lipidic membranar.................................48

1. Contribuţii elastice ale biomembranelor implicate în descrierea proceselor de inserţie a peptidelor antimicrobiene.....................................................48

2. Energia liberă de deformare a biomembranelor asociată proceselor de inserţie membranară .................................................................................50

3. Observaţii experimentale privitoare la influenţa proprietăţilor elastice ale lipidelor membranare asupra inserţiei peptidelor antimicrobiene.............57

VI. Metode de investigaţie a interacţiunilor dintre nanopori proteici şi membrane lipidice artificiale................................................................................60

1. Înregistrări electrofiziologice la nivel de ‘singură moleculă’. Metoda Montal-Muller de realizare a bistraturilor lipidice artificiale....................61

2. Tehnici de fluorescenţă.............................................................................67

3

3. Investigarea fluctuaţiilor de curent electric mediat de nanopori proteici iseraţi în biomembrane cu ajutorul analizei Fourier..................................70

4. Monitorizarea în timp real a diferenţei de potenţial de dipol a membranei lipidice artificiale.......................................................................................73

VII. Rezultate Experimentale. Modularea interacţiunilor dintre peptidele antimicrobiene şi membrane lipidice artificiale..................................................78

1. Influenţa alterării potenţialului de dipol membranar asupra inserţiei

alameticinei în bistraturile lipidice............................................................78 2. Studierea rolului jucat de alterarea potenţialului de dipol membranar în

procesele de inserţie membranară a magaininei 2 ...................................90 3. Studierea transportului ionic prin porii generaţi de magainină 2 în

membrane lipidice asimetrice, cu compoziţie lipidică variabilă, ce alterează controlabil sarcina electrică de suprafaţă şi în condiţii de pH diferit.........................................................................................................98

4. Cuantificarea alterării profilului de potenţial de suprafaţă şi de dipol membranar de către procesele de adsorbţie şi inserţie membranară a moleculelor de melitină în condiţii diferite de tărie ionică şi compoziţie lipidică variabilă......................................................................................102

5. Mecanisme moleculare de destabilizare a biomembranelor de către peptida antimicrobiană HPA3.................................................................111

6. Efectele induse de alterarea potenţialului de dipol membranar asupra interacţiunilor manifestate între moleculele de HPA3 şi membrane lipidice zwitterionice............................................................................................115

7. Studierea transportului ionic prin porii generaţi de HPA3 în membrane lipidice asimetrice, cu compoziţie lipidică variabilă, ce alterează gradul de împachetare a lanţurilor hidrocarbonate lipidice.....................................119

8. Determinarea coeficientului de difuzie a peptidei HPA3 prin membrana lipidică artificială.....................................................................................126

9. Modularea proceselor chimice ce au loc în interiorul porilor inseraţi în membrane artificiale, de către proprietăţile electrice ale membranei.....130

Bibliografie.........................................................................................................143 Lista de publicaţii..............................................................................................153

4

CAPITOLUL I. Peptide antimicrobiene - macromolecule biologice

esenţiale pentru viabilitatea organismelor pluricelulare

Peptidele antimicrobiene sunt macromolecule biologice sintetizate de

majoritatea organismelor vii şi sunt esenţiale în mecanismele de apărare chimică a

celulelor eucariote împotriva infecţiilor provocate de diferiţi agenţi patogeni

apăruţi în natură [1,2,3]. Printr-o abordare multidisciplinară, tema de cercetare de

faţă îşi propune să elucideze detaliile moleculare ale structurii, dinamicii şi

topologiei unor peptide antimicrobiene inserate în biomembrane, precum şi a

mecanismului de acţiune al acestora asupra membranelor celulare reconstituite. În

implementarea acestor obiective, se vor parcurge următoarele etape:

(a) investigarea prin metode de electrofiziologie a efectului litic al unor peptide

antimicrobiene cu proprietăţi citotoxice (de ex. magainină 2, melitină,) asupra

membranelor de tip bistrat reconstituit;

(b) idenţificarea mecanismelor care determină specificitatea acţiunii unor peptide

antimicrobiene asupra anumitor membrane celulare, ceea ce va permite ulterior

deducerea modului în care se poate amplifica şi lărgi spectrul proprietăţilor lor

litice (sau antimicrobiene - de distrugere a membranelor celulelor antimicrobiene);

în acest sens, se urmăreşte: (i) investigarea în detaliu a interacţiunilor moleculare

între peptidele antimicrobiene selecţionate şi membrane lipidice cu compoziţie

lipidică variabilă, ce alterează controlabil sarcina electrică de suprafaţă; (ii) efectele

induse de pH asupra interacţiunilor manifestate între peptidele antimicrobiene şi

membrane lipidice zwiterionice şi anionice; (iii) rolul jucat de modificarea

asimetrică a potenţialului de dipol membranar în procesele de inserţie membranară

a peptidelor antimicrobiene;

(c) caracterizarea electrofiziologică şi prin metode de fluorescenţă a cineticii şi a

proprietăţilor de transport ale unor peptide antimicrobiene în funcţie de

proprietăţile fizice şi mecanice ale membranelor lipidice reconstituite.

5

CAPITOLUL II. Elemente structurale şi funcţionale ale peptidelor

antimicrobiene

Între anii 1920 şi 1950, mulţi compuşi antimicrobieni au fost izolaţi,

prezentând o anumită selectivitate pentru bacterii Gram-pozitive şi Gram-negative.

În general aceste peptide antimicrobiene naturale sunt structuri bazice compuse din

12-50 de aminoacizi, existând astăzi peste 800 de asemenea compuşi descrişi în

bazele de date privind peptidele antimicrobiene (Tossi, A.

http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag2.htm).Structura primară, amfifaticitatea,

încărcarea cationică şi dimensiunile lor le permit acestora să se ataşeze şi să se

insere în membranele lipidice pentru a forma pori apoşi, ceea ce conduce la

distrugerea acestora şi lizarea celulei microbiene [4,5,6,7,8,9].

Principalele caracteristici care stau la baza activităţii şi specificităţii

peptidelor antimicrobiene sunt:

Secvenţa primară

Sarcina electrică netă

Structura secundară – majoritatea peptidelor antimicrobiene nu au o structură

secundară bine definită în soluţii apoase dar, la nivelul membranelor celulare îşi

pot asuma o varietate de structuri secundare cum ar fi structuri α-helix (cele mai

răspândite în natură), β- sheet sau structuri ciclice;

Hidrofobicitatea – reprezintă procentul de reziduuri aminoacidice hidrofobe

existente în secvenţa primară a peptidei şi în general pentru peptidele

antimicrobiene este de ~ 50%;

Amfifaticitatea – reprezintă proprietatea peptidelor antimicrobiene de a

prezenta o succesiune de aminoacizi hidrofili şi aminoacizi hidrofobi dispuşi de o

parte şi de cealaltă a structurii de α-helix;

Unghiul polar – reprezintă o măsură a proporţiei relative a părtii polare a unei

structuri α- helix, faţă de partea hidrofobă;

CAPITOLU III. Descrierea moleculară a interacţiunilor dintre peptidele

antimicrobiene şi membrane lipidice artificiale

Deşi au existat încercări de a explica mecanismul lor de acţiune prin

modele de tipul porilor transmembranari clasici, a porilor toroidali sau de inserţie

membranară şi distrugere a membranelor, există încă discuţii privind modalitatea

exactă de acţiune asupra microorganismelor în vivo. Este general acceptat faptul că

peptidele antimicrobiene ucid celula microbiană prin “invazia” membranei

celulare, deşi mecanismele care sunt implicate în acest proces nu sunt cunoscute în

detaliu. Modelul acceptat astăzi, prin care peptidele antimicrobiene îşi manifestă

funcţionalitatea, implică existenţa mai multor etape succesive cum sunt: asocierea

peptidelor pe suprafaţa membranară, asamblarea peptidelor în structuri secundare

definite la nivelul suprafeţelor membranare, inserţia peptidelor în biomembrane şi

în final, formarea porilor transmembranari, aşa cum sunt sugerate în figura III.1.

agregare pori

transmembranarinsertie

membranara asocierea

membranara

in solutie

Figura III.1. Reprezentarea schematizată a etapelor succesive de asociere, inserţie şi

formare a porilor transmembranari de către majoritatea peptidelor antimicrobiene[6].

Destabilizarea membranelor prin mecanismele enumerate anterior, poate

fi urmată de procesul de translocare al anumitor peptide pe partea internă a

membranei celulare, ceea ce permite interacţiunea acestora cu ţinte intracelulare,

alterând anumite procese intracelulare [10,11,12,13,14].

6

7

CAPITOLUL IV. Manifestări electrice ale membranelor biologice

Membranele biologice sunt structuri supramoleculare alcătuite în

principal din lipide şi proteine, cu rol esenţial în menţinerea integrităţii celulare

prin aceea că se constituie în bariere de permeaţie foarte selective între mediile

intra - şi extracelular. În general, se poate spune că profilul electric al

biomembranelor se constituie din contribuţia a trei componente majore: potenţialul

transmembranar, potenţialul de dipol şi potenţialul de suprafaţă [15,16,17]. Spre

deosebire de potenţialul transmembranar, (Ψeq.), care apare ca o consecinţă a

proprietăţii de semipermeabilitate a membranei celulare pentru difuzia pasivă a

unor specii ionice, potenţialul de suprafaţă, (Ψs), apare drept consecinţă a

existenţei unei sarcini electrice nete de încărcare a interfeţelor membrană biologică

- soluţie electrolitică [85,86]. Cea de-a treia componentă de potenţial, ce are rol în

stabilirea diferenţei de potenţial transmembranar totale pentru o membrană

biologică, se numeşte potenţial de dipol membranar, (Ψd). Studii structurale ale

biomembranelor au relevat faptul că originea potenţialului de dipol este dată de doi

factori principali şi anume: pe de o parte orientarea grupărilor dipolare localizate în

moleculele lipidice: dipolul corespunzator grupării carbonil din legatura esterică

(P~1.8 D) şi dipolul capătului terminal P—N+ (P~3.5÷9.5 D), pe de altă parte

momentele dipolare corespunzatoare moleculelor de apă situate la interfaţa

membrană-soluţie apoasă (P~1.83 D).

Parametru

electric

Ψs ( mV) Ψd (mV) Ψeq. (mV)

Membrana celulară - (15÷30) -(200÷300) -70 (≤ 200)

Bistrat lipidic ≤ - 200 -(300÷800) ≤ ± 300

Tabel IV.1. Valorile medii reprezentative pentru potenţialul de suprafaţă, Ψs,

potenţialul transmembranar, Ψeq., şi potenţialul de dipol, Ψd, în funcţie de sistemul

fizic în care se manifestă.

În concluzie, contribuţia celor trei tipuri de potenţial electric la nivelul

membranelor biologice poate fi reprezentată sugestiv în figura IV.1. În funcţie de

compoziţia membranei, natura şi tăria ionică a mediului extracelular, sistemele

biologice pot avea valori destul de diferite ale componentelor ce contribuie la

profilul electric biomembranar. În tabelul IV.1. sunt date valorile medii

reprezentative pentru potenţialul de suprafaţă, potenţialul transmembranar şi

potenţialul de dipol, în funcţie de sistemul fizic în care se manifestă, şi anume

membrană biologică şi bistrat lipidic reconstituit artificial.

8

Figura IV.1. Reprezentarea profilului electric ce caracterizează membranele celulare:

potenţialul transmembranar, Ψeq, potenţialul de dipol, Ψd, şi potenţialul de suprafaţă,

Ψs.

Astfel, se poate spune că celulele au dobândit evolutiv abilitatea de a

detecta, descifra, procesa şi genera semnale electrice periodice, ceea ce implică

faptul că acestea sunt capabile de a produce câmpuri electrice periodice şi pot

răspunde la variaţii de câmp electric sau magnetic externe.

xex 0

o

--

- -+

I II+

+

-

-

P ~ 3.5 – 9.5

P ~ 1.83

P ~ 1.8

Ψd .ln eq

II

IIII V

C

C

Fz

RTVV

CAPITOLUL V. Elemente de mecanica bistratului lipidic membranar

Un factor extrem de important pentru funcţionalitatea proteinelor

membranare, îl constituie diversitatea lipidelor ce intră în alcătuirea membranelor

biologice. Proprietăţile elastice ale membranei, influenţează susceptibilitatea

acesteia faţă de anumite peptide antimicrobiene chiar în primele etape ale

mecanismelor de asociere a acestora, întrucât inserţia unor peptide în membrana

celulară determină o modificare a proprietăţilor mecanice ale membranei [18,19].

Pentru a estima diferenţa de energie liberă asociată proceselor de partiţie a unor

peptide în membranele celulare, trebuie să luam în calcul contributia termenilor

energetici la energia liberă asociată acestor procese de inserţie membranară

[20,21].

0000 ln bilayersolvqEppartitie GGGKRTG (1)

Figura V.1. Reprezentarea alterării profilului forţelor intermoleculare manifestate în

bistratul lipidic, ca urmare a proceselor de inserţie membranară a unor

peptide; d0 ~ 30 Å, d0 reprezintă grosimea hidrofobă a bistratului lipidic

nedeformat iar l reprezintă lungimea moleculei peptidice inserate în

membrană [21].

Inserţia unei peptide în bistratul lipidic, va determina o deformare a

bistratului indusă de manifestarea unor forţe de compresie şi curbare a celor două

9

monostraturi lipidice, aşa cum este sugerat în figura V.1. Diferenţa de energie

liberă asociată deformării bistratului lipidic ca urmare a proceselor de inserţie a

unor peptide în membrana biologică, G0bilayer (kcal mol-1), depinde în mare

măsură de proprietăţile elastice ale bistratului cuantificate prin intermediul

densităţii de energie pe unitatea de suprafaţă, asociată deformării bistratului lipidic,

wdeformation.

compresionbendingndeformatiobilayer wwwG 0 (2)

Această densitate de energie de deformare membranară este dată în

principal de contribuţia a doi termeni: wbending – densitatea de energie liberă, pe

unitatea de suprafaţă, asociată proceselor de încovoiere a monostratului lipidic,

care depinde de modificarea curburii intrinseci a monostratului lipidic c0 (nm-1) şi

de modulul de încovoiere membranară, Kc (pN nm); şi wcompresion - densitatea de

energie liberă pe unitatea de suprafaţă, asociată proceselor de compresie (subţiere)

locală a bistratului lipidic, care depinde de modificarea grosimii bistratului lipidic

(u), şi de modulul de compresibilitate, Ka (pN nm-1), Studii din literatura actuală au

permis determinarea valorilor parametrilor Ka (modulul de compresibilitate

membranară) şi Kc (modulul de incovoiere membranară), pentru diferite sisteme

lipidice şi, aşa cum se observă din tabelul V.1, există diferenţe semnificative între

valorile acestora în funcţie de compoziţia lipidică a unui sistem membranar, ceea

ce indică faptul că procesele de inserţie memnbranară a unor peptide sunt

influenţate de proprietăţile elastice ale membranei.

Sistem lipidic Ka (10-3 · N/m) Kc (N · m)

SOPC 235 0.90 DOPC 265 0.85

SOPC:Chol 660 2.46

Tabel V.1. Valori ale modulelor de compresibilitate (Ka) şi încovoiere (Kc)

membranară, corespunzatoare membranelor reconstituite cu compoziţie lipidică

variabilă [21].

10

11

CAPITOLUL VI. Metode de investigaţie a interacţiunilor dintre

nanopori proteici şi membrane lipidice artificiale

În implementarea acestei teze s-au folosit tehnici recunoscute din

domeniile biofizicii, electrofiziologiei moleculare (electrofiziologia canalelor

ionice, tehnici de înregistrare la nivel de singură moleculă (un singur canal ionic) şi

metoda compensării câmpului electric intern (IFCM) pentru măsurători ale

potenţialului de dipol membranar), spectroscopiei de fluoresecenţă pentru a descrie

pe deplin mecanismele interacţiunii dintre peptide antimicrobiene selectate şi

membrane lipidice reconstituite.

În implementarea acestui proiect, am utilizat ca metodă de realizare a

membranelor lipidice artificiale, metoda Montal-Muller (1972), care are la bază

caracterul amfifatic al moleculelor fosfolipidice din care se poate reconstitui o

membrană artificială, utilizând analogi ai lipidelor întâlnite în membranele

biologice naturale. În completarea studiilor electrofiziologice au fost implementate

tehnici de spectroscopie de fluorescenţă, prin care se poate urmări cinetica

proceselor de translocare, prin membranele lipidice reconstituite, a unor peptide

antimicrobiene ce conţin în secvenţa lor primară aminoacidul triptofan.

Pentru a evalua interdependenţa dintre peptidele antimicrobiene şi

caracteristicile electrice ale membranelor lipidice (în principal potenţialele de dipol

şi de suprafaţă), am utilizat Metoda compensării câmpului electric intern (IFCM) ,

care foloseşte binecunoscuta dependenţă dintre capacitatea membranei şi diferenţa

de potenţial aplicată, prin intermediul mediului grafic LabVIEW. Un protocol

eficient pentru cuantificarea diferenţei potenţialului de dipol dintre cele două

monostraturi ale membranei lipidice este acela prin care membrana lipidică se

supune unei diferenţe de potenţial sinusoidale ce variază în timp, ce conţine şi o

componentă constantă (U0 ) ‘dc bias’:

U = U0 + U1 sin(2πυt) (1)

12

La aplicarea unei astfel de diferenţe de potenţial, este uşor de demonstrat

că valoarea curentului capacitiv rezultat prin membrana, ca răspuns la diferenţa de

potenţial aplicată (U), la care se adaugă şi diferenţa potenţialui de dipol al

biomembranei (Δp), constă în trei componente armonice periodice (i.e., având

frecvenţele ν, 2ν şi 3ν). Cu o relevanţă directă pentru implementarea metodei IFC,

este expresia ce descrie componenta celei de a doua armonici a curentului

capacitiv: I2 = 3αC0 (U1)2 (U0 +Δp) (2πυ) sin(4πυt) (2)

Din analiza acestei formule, se observă că prin variaţia continuă în sensul

corect al tensiunii dc bias (U0) aplicate, se va ajunge la situaţia în care (U0 +Δp) =

0, care va conduce la atingerea valorii nule a lui I2. Într-o asemenea situaţie, se

poate afirma că diferenţa potenţialului de dipol (Δp) a membranei lipidice studiate

este egală şi de semn contrar cu diferenţa de potenţial dc bias (-U0). Principiul de

lucru al metodei pentru monitorizarea automată, în timp real, a diferenţei

potenţialului de dipol (Δp) a membranei lipidice este descrisă în figura VI.1.

Tensiuna dc bias precum şi componenta sinusoidală a diferenţei de potenţial (U =

U0 + U1 sin (2πυt), ν = 220 Hz, U1 = 60 mV) au fost aplicate membranei lipidice

din exterior printr-un canal D/A al cartelei de achiziţie. Urmărind o analiză

spectrală în timp real, trei componente armonice, egal depărtate una de alta, au fost

vizualizate în power-spectrum-ul curentului electric înregistrat. În funcţie de

amplitudinea celei de-a doua armonice din curentul electric transmembranar,

valorii iniţiale a tensiunii bias (U0) i-au fost adăugate (sau scăzute) digital valori de

ordinul a 2 mV, urmărindu-se scăderea progresivă pentru amplitudinea celei de-a

doua armonice a curentului electric rezultat prin membrană. Imediat ce această

armonică scade sub o valoare critică, A(4πν) ≤ δ (figura VI.1), codul va opri

întreaga secvenţă de iteraţii descrisă mai sus, iar ultima valoare a deviaţiei de

potenţial inregistrată de canalul de ieşire D/A va reprezenta diferenţa de potenţial

de dipol (Δp) a membranei. Alternativ, pentru a înregistra doar modul în care

diferenţa de potenţial de dipol se comportă în timp ca rezultat al unor interacţiuni

specifice dintre biomembrană şi diferiţi compuşi chimici exogeni, valoarea bias a

semnalului de tensiune aplicat este păstrată constantă (de obicei 0 pentru

membrane simetrice formate doar din fosfatidilcolină), şi se înregistrează evoluţia

în timp a amplitudinii armonicei a doua, care devine proporţională cu valoarea

diferenţei de potenţial de dipol transmembranar.

Figura VI.1. Diagrama-bloc reprezentând instrumentul virtual folosit la monitorizarea

automată, în timp real, a diferenţei potenţialului de dipol (Δp) a membranei. Diferenţa

de potenţial (U) a fost aplicată membranei printr-un canal output D/A al unei plăci de

achiziţie, iar curentul electric rezultat (I) a fost reintrodus într-un canal A/D al

cardului PCI. Paşii simultani A/D şi D/A, analiza spectrală şi manipularea datelor au

fost implementate cu ajutorul limbajului de programare grafică LabView. Panelul (i)

reprezintă diferenţa de potenţial din interiorul membranei datorată diferenţei de

potenţial de dipol din cele două monostraturi (Δp); când deviaţia „dc” a diferenţei de

potenţial aplicată (U0) compensează (Δp), amplitudinea celei de-a doua armonice din

(I) atinge valoarea minimă.

13

14

CAPITOLUL VII. REZULTATE EXPERIMENTALE ŞI DISCUŢII

Modularea interacţiunilor dintre peptidele antimicrobiene şi

membrane lipidice artificiale

VII. 1. Influenţa alterării potenţialului de dipol membranar asupra inserţiei

alameticinei în bistraturile lipidice

Una din paradigmele considerate importante în acest studiu, a fost cea

referitoare la interacţiunile manifestate între câmpul electric dipolar membranar şi

oligomerii de alameticină inseraţi în membranele lipidice artificiale. Am încercat

astfel să monitorizez cantitativ maniera în care inserţia monomerilor de

alameticină modulează valoarea potenţialului de dipol membranar. Ţinând cont de

momentul de dipol mare al monomerilor de alameticină, şi anume (40 ÷ 80) D, am

argumentat că este foarte probabil ca momentul de dipol al monostratului lipidic

cis din partea unde a fost adăugată alameticina să sufere schimbări dependente de

timp, care pot reflecta repartizarea alameticinei între faza apoasă şi monostratul

lipidic. Pentru a explica rezultatele prezentate în figura VII.1.1, panelul a, se poate

apela la ipoteza unei continue variaţii a momentelor dipolare ale monostratului cis,

cauzată de monomerii de alameticină interfaciali. Pentru a cuantifica modificarea

momentului de dipol pentru monostratul cis, am realizat schimbări incrementale

mici (5 mV) a componentei dc a diferenţei de potenţial electric aplicată. Din figura

VII.1.1, panel b, se observă că potenţialul electric pozitiv de ~ 85 mV în partea

trans a membranei lipidice conduce la o anulare aproape completă a amplitudinii

celei de a doua componente armonice a curentului capacitiv prin membrană. Printr-

o analiza simplă, se observă că pătrunderea parţială a monomerilor de alameticină

în monostratul cis creşte momentul de dipol al acestuia. Dacă modificările

incrementale ale componentei dc au fost făcute în domeniu negativ de potenţial

electric, efectul de anulare a amplitudinii celei de a doua componete armonice nu a

mai fost observat iar peak-ul acestei componente a devenit mai mare.

Figura VII.1.1. (a) Evoluţia în timp a amplitudinii componentei celei de a doua

armonici (măsurată la 440 Hz) a curentului capacitiv mediat prin membrana

artificială, în condiţia în care diferenţa de potenţial sinusoidală aplicată dc bias este

nulă. (b) Schimbările incrementale ale componentei dc a diferenţei de potenţial

aplicată, semnal care reduce amplitudinea armonicii a doua la ~ 85 mV, arată o

creştere a momentului de dipol, corespunzătoare unei diferenţe de potenţial

de aproximativ aceeaşi magnitudine, al monostratului lipic unde au fost

adsorbiţi monomerii de alameticină.

Urmărind influenţa exercitată de scăderea potenţialului de dipol

membranar asupra activităţii alameticinei inserate într-o membrană lipidică

artificială, din datele experimentale indicate în figura VII.1.2, se observă că, prin

comparaţie cu situaţia ‘control’, interacţiunea moleculelor de phlorizin cu

membrana artificială conduce la creşterea vizibilă a activităţii cinetice a

oligomerilor de alameticină inseraţi în membrana lipidică. În aceste condiţii, am

propus ipoteza conform căreia activitatea alameticinei în membrane artificiale

creşte în prezenţa phloridzinului, datorită faptului că monomerii de alameticină ce

urmează a fi partiţionaţi în bistratul lipidic vor ‘simţi’ un câmp electric membranar

dipolar mai redus; astfel, în virtutea inserţiei lor vectoriale, concentraţia acestora în

planul membranei artificiale va fi mai mare prin comparaţie cu situaţia ‘control’, în

care nu se utilizează phlorizin.

15

Figura VII.1.2. (a) Înregistrări electrice ale activităţii alameticinei (10 nM) inserate

întro membrană lipidică artificială, în absenţa (‘control’) şi prezenţa moleculelor de

phlorizin (500 µM). Starea ‘închis’ a alameticinei este indicată de ‘C’; (b şi c)

Reprezentări ‘mărite’ ale activităţii oligomerilor de alameticină măsurate la - 80 mV,

în cazurile menţionate anterior, împreună cu histogramele de amplitudini ale

curenţilor electrici prin alameticină în absenţa şi prezenţa a 500 µM phlorizin.

Concluzii:

Procesele de adsorbtie si insertie membranara a peptidei antimicrobiene

alameticina induc alterarea potentialului de dipol membranar.

Alterarea profilului de potenţial electric membranar – cauzat în principal

de modificarea asimetrică a potenţialului de dipol membranar – conduce

la modificarea proprietăţilor de transport ionic al canalelor de alameticină.

Modificand controlabil semnul şi magnitudinea potenţialului de dipol

membranar, se poate modula gradul de inserţie membranară a peptidelor

antimicrobiene.

16

VII.2. Studierea rolului jucat de alterarea potenţialului de dipol membranar

în procesele de inserţie membranară a magaininei 2

În continuarea studiilor ce vizează influenţa potenţialului de dipol

membranar asupra activităţii membranare a unor peptide, o următoare etapă a fost

studierea inserţiei peptidei antimicrobiene magainină 2 în membrane lipidice, în

diferite condiţii fiziologice. Astfel, într-un prim set de experimente, am evaluat

calitativ influenţa exercitată de alterarea potenţialului de dipol transmembranar

asupra inserţiei magaininei 2 în bistraturi lipidice zwitterionice. formate din L - α-

Phosphatidylcholină.

Figura VII.2.1. Înregistrări electrofiziologice la nivel de ‘singură moleculă’ ce

evidenţiază creşterea fluctuaţiilor de curent electric mediat de canalele de magainină2,

în urma interacţiunii membranei lipidice cu 200 µM phloretin, la o valoare a diferenţei

de potenţial externe aplicate membranei de -190 mV.

Utilizând 200 µM phloretin, adăugat în aceeaşi cuvă în care a fost

adăugată iniţial şi soluţia peptidică, am observat o creştere accentuată a activităţii

canalelor de magainina 2 inserate în membrana artificială, cuantificată prin

fluctuaţiile de curent electric mediate de porii transmembranari de magainina 2

17

inseraţi în membrana artificială. Astfel, după cum poate fi observat în figura

VII.2.1, spre deosebire de cazul ‘control’, în absenţa moleculelor de phloretin, în

urma adăugarii phloretinului, interacţiunea dintre moleculele de phloretin şi

membrana lipidică artificială facilitează inserţia membranară a moleculelor de

magainina 2, fapt ce este reflectat de creşterea fluctuaţiilor curentului ionic

înregistrat prin canalele de magainina 2.

Un alt compus chimic care poate modula potenţialul de dipol membranar,

este agentul chimic RH 421, un compus din clasa detergenţilor, care, prin adsorbţia

şi orientarea în monostratul lipidic, conduce la creşterea potenţialului de dipol

membranar, întrucât momentul de dipol asociat acestor molecule de RH421 este de

~ 10 Debye.

Figura VII.2.2. Înregistrări electrofiziologice reprezentative care evidenţiază efectele

induse de RH421 asupra fluctuaţiilor de curent electric mediate de canalele de

magainină 2 inserate în membrana lipidică zwitterionică (phosphatidilcolină),

înregistrate la o diferenţă de potenţial aplicată extern membranei de -180 mV.

Ţinând cont de raţionamentul propus anterior, am putea face presupunerea

că, în urma adsorbţiei moleculelor de RH421 în monostratul lipidic, ceea ce ar

conduce la creşterea potenţialului de dipol membranar, inserţia magaininei2 în

18

19

membrană să fie defavorizată, fapt ce nu a fost evidenţiat din datele experimentale.

Dimpotrivă, datele experimentale din figura VII.2.2, demonstrează faptul că,

adăugarea agentului chimic RH421 în soluţia fiziologică, determină creşterea

activităţii canalelor de magainină2 inserate în membrana artificială. Un parametru

relevant din punct de vedere statistic pentru studierea activităţii canalelor de

magainină2 inserate în membrana lipidică, îl reprezintă analiza deviaţiilor standard

a fluctuaţiilor de curent ionic mediate de porii de magainină 2, σ. Astfel, deviaţia

standard a fluctuaţiilor de curent ionic avea o valoare mult mai mica σ = 8.3 pA,

înainte de adăugarea agentului chimic RH-421 în aceeaşi cuvă în care a fost

adăugată şi soluţia de peptidă, faţă de valoarea de σ = 39.1 pA, obţinută în urma

interacţiunii moleculelor de phloretin cu bistratul lipidic. O ipoteză a datelor

obţinute este aceea că intensificarea activităţii canalelor de magainină2 formate în

membrana artificială, în urma adăugării agentului chimic RH 421, este datorată în

principal de creşterea razei de curbură a monostratului lipidic în care se adsorb

moleculele de RH421, factor determinant în procesele de formare a porilor

transmembranari de tipul celor toroidali.

Este esenţial astfel mecanismul prin care peptide antimicrobiene

destabilizează membrane celulare cu diferite compoziţii, existând o

interdependenţă între structura, dinamica şi funcţia unor macromolecule şi

activitatea membranară a unor peptide antimicrobiene.

Concluzii:

Scăderea momentului de dipol membranar indusă de moleculele de

phloretin conduce la facilitarea adsorbţiei moleculelor de magainina 2 în

membrană.

Adsorbţia moleculelor de RH421 în monostratul lipidic facilitează

procesul de formare a porilor toroidali de magainina 2 în membrana

lipidică, prin mărirea razei de curbură a monostratului lipidic în care se

adsorb.

VII.3. Studierea transportului ionic prin porii generaţi de magainină 2 în

membrane lipidice asimetrice, cu compoziţie lipidică variabilă, ce alterează

controlabil sarcina electrică de suprafaţă a membranei şi

în condiţii de pH diferit

Interacţiunile electrostatice între peptidele antimicrobiene cationice şi

componentele anionice ale membranei sunt un factor major ce explică acţiunea

selectivă asupra celulelor microbiene, aşa cum a fost detaliat într-un capitol

anterior. În acest sens, un obiectiv propus a fost de a studia transportul ionic mediat

de porii de magainină2 inseraţi în membrane artificiale cu compoziţie lipidică

variabilă. Astfel, utilizând membrane artificiale formate din lipide zwiterionice PC

(L-α- Phosphatidylcholine) şi lipide anionice DOPG (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-

[Phospho-rac-(1-glycerol)]), am putut altera controlabil sarcina electrică de

suprafaţă a membranei artificiale reconstituite.

Figura VII.3.1. Date experimentale reprezentative, ce evidenţiază fluctuaţiile de curent

electric mediate de canalele de magainină 2 (0.4µM) la valori pozitive (panel b şi c) şi

respectiv negative (panel a şi c) ale diferenţei de potenţial aplicate (+100 mV,

-100 mV), în condiţiile în care bistratul lipidic este constituit din lipide neutre din

punct de vedere electric (fosfatidilcolina - panel b şi d) şi încărcate electric negativ

(DOPG - panel c şi d)

20

Următorul obiectiv abordat în acest capitol a fost studierea efectelor

exercitate de pH-ul soluţiei fiziologice asupra procesului de inserţie a magaininei2

în membrane artificiale constituite din lipide anionice.

Figura VII.3.2. Experimente de electrofiziologie la nivel de ‘singură moleculă’, ce

evidenţiază fluctuaţiile de curent electric mediate de canalele de magainină 2 la diferite

valori ale diferenţei de potenţial aplicate (+100 mV, -100 mV), în condiţii de pH diferit.

21

Astfel, scăderea tăriei interacţiunilor electrostatice dintre moleculele de

magainină 2 şi capetele polare ale lipidelor determină o acumulare a moleculelor

peptidice adsorbite pe suprafaţa membranei într-o concentraţie mult mai mică, ceea

ce defavorizează inserţia acestei peptide în membrana artificială şi implicit

formarea porilor transmembranari.

Concluzii

Membranele lipidice anionice favorizează procesul de inserţie

membranară a monomerilor de magainină 2, ceea ce indică faptul că

interacţiunile electrostatice reprezintă un factor determinant în procesele

de adsorbţie membranară a peptidelor antimicrobiene, întrucât implică

creşterea concentraţiei acestora la interfaţa membrană-mediu fiziologic.

Procesul de inserţie a magaininei 2 în membranele lipidice anionice, este

defavorizat de valori acide ale pH-ului soluţiei fiziologice.

VII.4. Cuantificarea alterarii profilului de potenţial de suprafaţă şi de dipol

membranar de către procesele de adsorbţie şi inserţie membranară a

moleculelor de melitină în condiţii diferite de tărie ionică

şi compoziţie lipidică variabilă.

În continuare, am urmărit studierea posibilei corelaţii existente, din punct

de vedere electric, între potenţialul de suprafaţă şi de dipol membranar şi peptida

antimicrobiană melitina, inserată în membrane artificiale, utilizând metoda

compensării câmpului electric intramembranar .

a) b)

Figura VII.4.1. a) Înregistrările reprezentative ale schimbărilor în timp real ale

potenţialului de suprafaţă şi de dipol (Δp) al membranei lipidice zwitterionice, care

apar ca rezultat al adăugării a 70 nM soluţie peptidică în cuva cis, în condiţii de 0.1M

NaCl; b) Schimbările negative incrementale ale componentei dc a diferenţei de

potenţial aplicată, semnal care anulează amplitudinea celei de a doua armonici la

~ - 22 mV, ceea ce arată o schimbare cantitativă comparativă a momentului de dipol al

monostratului lipidic unde au fost adsorbite moleculele peptidice.

Păstrând ‚dc bias’ (U0) a semnalului tensiunii aplicate la zero, evoluţia în

timp a amplitudinii componentei celei de a doua armonici măsurată la 440 Hz,

reflectă cu precizie dependenţa în timp a modificării termenului Δp datorată

adsorbţiei monomerilor de melitină în monostratul lipidic. Astfel se poate

concluzionă că, schimbările negative incrementale ale componentei U0 a diferenţei

22

de potenţial electric aplicată, semnal care egalează amplitudinea celei de a doua

armonici la ~ - 22 mV, arată o scădere a momentului de dipol al monostratului

lipidic unde a fost adaugată soluţia peptidică.

În continuare, am urmărit cuantificarea alterării profilului electric

membranar în urma adiţiei soluţiei de melitină cu aceeaşi concentraţie utilizată în

experimentele anterioare, 70 nM, dar în condiţiile în care tăria ionică a mediului

fiziologic a fost mai mare faţă de cazul anterior, şi anume NaCl 0.5 M.

a) b)

Figura VII.4.2. (a) Evoluţia în timp real a celei de-a doua componente spectrale a

curentului ionic capacitiv măsurat prin bistratul lipidic, după adăugarea a 70 nM

soluţie de melitină, în condiţii fiziologice de 0.5 M NaCl; (b) Dependenţa amplitudinii

celei de-a doua componente spectrale a curentului ionic măsurat prin bistratul lipidic,

în funcţie de U0, ce arată o schimbare cantitativă comparativă a momentului de dipol

al monostratului lipidic unde au fost adsorbite moleculele peptidice, de ~ - 37.5 mV.

Evoluţia în timp real a amplitudinii componentei celei de a doua armonici

(măsurată la 440 Hz) a curentului capacitiv prin membranele artificiale, în

condiţiile în care diferenţa de potenţial sinusoidală aplicată ‘dc bias’ (U0) este nulă,

după adăugarea melitinei în concentraţie de 70 nM, reflectă alterarea în principal a

momentului de dipol al monostratului lipidic unde monomerii de melitină au fost

adsorbiţi, aşa cum a fost explicat anterior. Modificarea incrementală a componentei

U0 a diferenţei de potenţial aplicată, până la obţinerea unui semnal care reduce

amplitudinea armonicii a doua la ~ - 37 mV, (figura VII.4.2-b), arată o scădere a

23

24

momentului de dipol mult mai accentuată în cazul de faţă, când s-a folosit o tărie

ionică mai mare a mediului fiziologic. Este cunoscut faptul că în prezenţa sărurilor,

reziduurile cationice de la nivelul peptidei antimicrobiene melitină, concurează cu

cationii din soluţia fiziologică pentru aceleaşi situsuri de la nivelul membranei

lipidice. Faptul că în final, rezultă o alterare mai accentuată a potenţialului de dipol

membranar şi de suprafaţă, cuantificată la valoarea de ~ -37 mV, în condiţii de

tărie ionică mai mare, poate avea sens dacă se consideră că diminuarea

potenţialului de suprafaţă în condiţii de 0.5 M are un rol hotărâtor în alterarea

profilului electric membranar.

Păstrând tăria ionică a soluţiei fiziologice de 0.5 M şi aceeaşi concentraţie

a soluţiei peptidice folosite, 70 nM, datele experimentale au arătat faptul că

prezenţa colesterolului în membrana lipidică (30% w/w în L-α-

phosphatidylcholine) induce o alterare mai mică a potenţialului de dipol

membranar, cuantificată la valoarea de ~ -30 mV, faţă de experimentele realizate

cu membrane lipidice lipsite de colesterol.

Concluzii

Adsorbţia moleculelor de melitină pe suprafaţa membranei lipidice induce

atât creşterea potenţialului de suprafaţă cât şi diminuarea, mult mai

accentuată, a potenţialului de dipol al monostratului în care se adsorb.

În condiţii diferite de tărie ionică, în prezenţa sărurilor, reziduurile

cationice de la nivelul peptidei antimicrobiene melitina, concurează cu

cationii din soluţia fiziologică pentru aceleaşi situsuri de la nivelul

membranei lipidice.

Prezenţa colesterolului în membrana lipidică reduce efectul monomerilor

de melitină de a scădea potenţialul de dipol membranar şi diminuează

activitatea porilor transmembranari de melitină.

VII. 5. Mecanisme moleculare de destabilizare a biomembranelor de către

peptida antimicrobiană HPA3

Prin experimente de elecrofiziologie la nivel de ‚singură moleculă’ am reuşit

evidenţierea modului de acţiune al peptidei antimicrobiene HPA3, care este un

analog al peptidei HP(2-20) produsă de bacteria Gram-negativă Helicobacter

pylori (implicată esenţial în patologia bolilor gastrointestinale precum gastrite sau

ulcer), şi care, prin proprietăţile sale antimicrobiene oferă respectivei bacterii un

avantaj competitiv faţă de alte bacterii din fluidul gastrointestinal.

Figura VII.5.1. Date experimentale ce evidenţiază amplitudinea curenţilor electrici

mediaţi de canalele de HPA3 inserate în membrana artificială, la diferite valori ale

diferenţei de potenţial aplicate, împreună cu histogramele de amplitudini ale curenţilor

ionici, corespunzătoare activităţii canalelor de HPA3 în condiţii electrofiziologice de 0.5

M NaCl, 10 mM Bis Tris Propane, pH ~ 7. Diagrama curent tensiune ce caracterizează

proprietăţile de transport mediate de prima stare conductivă a canalelor de HPA3

inserate în membrana lipidică zwitterionică, indicata prin ‘o1’.

25

Valorile reproductive ale conductanţelor corespunzătoare destabilizării

membranei celulare induse de asocierea monomerilor de HPA3 în membrane

zwitterionice, la diferite valori ale potenţialelor aplicate membranei, au demonstrat

existenţa porilor transmembranari formaţi prin asocierea peptidelor la nivelul

membranelor lipidice. Scăderea în timp, după 30 minute, a raportului deviaţiilor

standard corespunzătoare fluctuaţiilor curentului ionic mediat de porii

transmembranari de HPA3 în condiţiile aplicării membranei a unor diferenţe de

potenţial electric negative (-100 mV) şi pozitive ( +100 mV), indica faptul că

monomerii de HPA3 translocă prin membrana lipidică.

Figura VII.5.2. Înregistrări electrofiziologice la nivel de ‘singură moleculă’ care

evidenţiază evoluţia în timp a fluctuaţiilor de curent ionic mediate de porii de HPA3

(5 µM) inseraţi în membrana lipidică, în condiţiile în care s-au aplicat membranei

valori pozitive (panel A,C) şi negative (panel B, D) ale diferenţei de potenţial electric.

Concluzii:

Datele experimentale obţinute susţin ipoteza conform căreia mecanismul

molecular de acţiune al peptidei antimicrobiene HPA3, este dat de

formarea porilor transmembranari tranzienţi urmat de translocarea

monomerilor peptidici prin membrana biologică iar aceste procese sunt

facilitate electroforetic de către diferenţe de potenţial electric trans-

negative aplicate membranei.

26

27

VII. 6. Efectele induse de alterarea potenţialului de dipol membranar asupra

interacţiunilor manifestate între moleculele de HPA3 şi membrane lipidice

zwitterionice

Aşa cum aminteam în capitolul de materiale şi metode implementate în

acest studiu, un alt mod de a investiga mecanismele de interacţiune a peptidei

HPA3 cu membranele lipidice, poate fi realizat prin studierea influenţei exercitate

de modularea potenţialului de dipol membranar asupra activităţii canalelor de

HPA3 inserate în membrane lipidice zwitterionice. În acest sens am evaluat

calitativ influenţa exercitată de alterarea potenţialului de dipol transmembranar

asupra inserţiei peptidei antimicrobiene HPA3 în bistraturi lipidice zwitterionice,

formate din fosfatidilcolină.

Utilizând 200 µM phloretin, am observat că, spre deosebire de cazul

‘control’ (în absenţa phloretinului), în cazul interacţiunii dintre moleculele de

phloretin şi membrana lipidică artificială, este facilitată inserţia membranară a

moleculelor de HPA3, fapt reflectat de creşterea fluctuaţiilor curentului ionic

înregistrat prin canalele de HPA3, această accentuare a inserţiei membranare a

peptidei HPA3, fiind vizibilă atât în condiţiile aplicării membranei a unor diferenţe

de potenţial electric pozitive cât şi la valori negative ale diferenţei de potenţial

electric aplicate membranei lipidice. Explicaţia poate fi dată prin prisma faptului

că, în urma procesului de micşorare a potenţialului de dipol membranar de către

adsorbţia moleculelor de phloretin în zona hidrofilă a membranelor lipidice,

moleculele de HPA3 din soluţia apoasă vor resimţi un camp electric asociat

potenţialului de dipol membranar, avand o amplitudine mai mica şi astfel vor putea

penetra mai facil prin respectiva zona hidrofila. Aceasta ipoteza este sustinuta de

faptul ca, imediat după adaugarea phloretinului în partea cis a membranei,

abilitatea monomerilor de HPA3 de a forma pori devine mult mai accentuată şi la

tensiuni electrice pozitive aplicate membranei, induse de acumularea monomerilor

peptidici pe partea trans a membranei ca urmare a translocării acestora.

Figura VII.6.1. Înregistrări electrofiziologice la nivel de ‘singură moleculă’ ce

evidenţiază creşterea fluctuaţiilor de curent electric mediat de canalele de HPA3, în

urma interacţiunii membranei lipidice cu 200 µM phloretin, la pH = 7.2 şi la o valoare

a diferenţei de potenţial electric aplicate de + 80 mV ( panel A şi C) şi – 80 mV (panel B

şi D). Adăugarea a 200µM phloretin a fost realizată în partea cis a membranei lipidice,

la o valoare a diferenţei de potenţial electric aplicate de – 100 mV (panel E)

Concluzii

Diminuarea potenţialului de dipol al monostratului lipidic în partea cis a

membranei, unde este adăugată soluţia peptidică, facilitează în mod

semnificativ inserţia şi formarea porilor transmembranari de HPA3, ceea

ce inseamnă, în condiţii ‘in vivo’ o creştere a toxicităţii acestei peptide la

concentraţii mai mici a peptidei în mediul extracelular.

28

V II. 7. Studierea transportului ionic prin porii generaţi de HPA3 în

membrane lipidice asimetrice, cu compoziţie lipidică variabilă, ce alterează

gradul de împachetare a lanţurilor hidrocarbonate lipidice.

În continuarea acestui studiu am urmărit importanţa gradului de nesaturare

al lanţurilor hidrocarbonate ale lipidelor ce intră în componenţa biomembranei,

asupra interacţiunilor manifestate între peptida antimicrobiană HPA3 şi membrana

lipidică. Importanţa acestor studii este susţinută de informaţiile insuficiente până la

ora actuală legate de mecanismele clare prin care peptidele antimicrobiene, şi în

particular HPA3, îşi manifestă selectivitatea faţă de membranele celulare cu

compoziţie lipidică variabilă.

Figura VII.7.1.a) Reprezentarea structurală a moleculelor lipidice utilizate în

experimentele de electrofiziologie din acest studiu: POPC şi DOPC. b) Diagramele

curent-tensiune ce caracterizează din punct de vedere macroscopic proprietăţile de

transport ale porilor de HPA3 inseraţi în membrana artificială formată din lipide care

conţin un lanţ hidrocarbonat cu o singură nesaturare (POPC) şi membrana formată

din lipide ce conţin două lanţuri hidrocarbonate mononesaturate (DOPC).

Experimente de electrofiziologie realizate pe membrane artificiale

reconstituite din fosfatidilcolină cu unul (POPC) sau cu două (DOPC) lanţuri

hidrocarbonate mono - nesaturate, au demonstrat faptul că gradul mai mic de

împachetare al lanţurilor hidrocarbonate lipidice dat de prezenţa unui număr mai

29

mare de nesaturări (cum este molecula lipidică DOPC), facilitează activitatea

electrică a porilor de HPA3 inseraţi în membrana lipidică. Diagramele curent-

tensiune din figura VII.7.1 -b), înregistrate pe membrane realizate din lipide ce

conţin unul (POPC) sau două lanţuri hidrocarbonate mononesaturate (DOPC), pun

în evidenţă facilitarea mecanismelor de formare a porilor de către membranele

formate din DOPC. Aşa cum se poate observa în figura VII.7.2, în absenţa peptidei

în soluţia fiziologică (control), curentul electric înregistrat prin membrană, reflectă

doar contribuţia zgomotului termal, iar adiţia ulterioară a 1 µM HPA3 în soluţia

fiziologică, induce formarea unor agregate moleculare de tipul porilor în

membrana lipidică formată din POPC.

Figura VII.7.2. Înregistrări reprezentative care ilustreaza fluctuaţiile de curent ionic

mediate prin membrana lipidică reconstituită din POPC şi DOPC, în absenţa şi

prezenţa moleculelor peptidice în soluţia fiziologică.

În completarea studiilor electrofiziologice, am urmărit cinetica proceselor

de translocare a peptidei antimicrobiene HPA3 prin membrane lipidice cu

compoziţie lipidică diferită, utilizând tehnici de spectroscopie de fluorescenţă.

Astfel, măsurând intensitatea maximă a spectrelor de emisie în fluorescenţă a

triptofanului, conţinut în secvenţa primară a peptidei studiate, putem evalua

concentraţia peptidei care translocă prin porii formaţi în membrana lipidică.

30

Figura VII.7.3. Reprezentarea spectrelor normalizate de emisie în fluorescenţă a

reziduului aminoacidic triptofan din componenţa HPA3, înregistrate pe soluţia

fiziologică din cuva cis unde s-a adăugat soluţia peptidică în concentraţie de 1 µM, şi

pe soluţia din cuva trans, după promovarea inserţiei şi translocării peptidei prin

membrana formată din POPC.

31

Datele bazate pe spectroscopia de fluorescenţă, înregistrate din patru

experimente independente în care s-au utilizat membrane lipidice diferite, au

demonstrat că procentul relativ de peptidă HPA3 ce translocă prin membrană este

de 4.6 ± 1.7 în cazul membranelor lipidice reconstituite din DOPC şi 3.6 ± 1.9

pentru membrane reconstituite din POPC, demonstrând astfel procesul de facilitare

a interacţiunii dintre monomerii peptidici de HPA3 şi membrane reconstituite din

lipide cu un grad mai mare de nesaturare. Evaluarea concentraţiei relative de

peptidă HPA3, în cuvele cis şi trans după 5 minute, în care peptida a translocat prin

membrană, s-a realizat prin calcularea procentuală a maximului spectrului de

emisie în fluorescenţă a acestor probe, raportată la valoarea maximului de emisie în

fluorescenţă a spectrului înregistrat pe soluţia ‚buffer’ ce conţinea concentraţia

iniţială de peptidă adaugată la începutul fiecărui experiment, la aceeaşi lungime de

undă.

Figura VII.7.4. Reprezentarea spectrelor normalizate de emisie în fluorescenţă a

reziduului aminoacidic triptofan din componenţa HPA3, înregistrate pe soluţia

fiziologică din cuva cis unde s-a adăugat soluţia peptidică în concentraţie de 0.5 µM, şi

pe soluţia din cuva trans, după promovarea inserţiei şi translocării peptidei prin

membrana formata din DOPC.

Concluzii

Experimente de electrofiziologie realizate pe membrane artificiale

reconstituite din fosfatidilcolină cu unul sau cu două (lanţuri

hidrocarbonate mono-nesaturate, au demonstrat faptul că gradul mai mic

de împachetare al lanţurilor hidrocarbonate lipidice dat de prezenţa unui

număr mai mare de nesaturări (cum este cazul lipidei DOPC), facilitează

activitatea electrică a porilor de HPA3 inseraţi în membrana lipidică.

În plus, experimente de spectroscopie de fluorescenţă au permis analiza

cantitativă a proceselor de translocare a peptidei HPA3 prin membranele

lipidice reconstituite din lipide cu grade diferite de nesaturare,

demonstrând faptul că prin membranele formate din DOPC, cantitatea

netă de peptidă care translocă este cu ~ 22% mai mare decât în cazul

membranelor formate din POPC.

32

VII. 8. Determinarea coeficientului de difuzie al peptidei antimicrobiene

HPA3 prin membrana lipidică artificială

Pentru a determina coeficientul de difuzie a peptidei antimicrobene HPA3

prin membrana lipidica, D ( m2/s), am urmărit un raţionament simplu care are la

bază următoarele considerente: se presupune un bistrat lipidic având aria totală S

(m2) şi grosimea mieziului hidrofob δ (m), format între doua medii apoase

fiziologice fiecare de volum V (m3), cis sau trans, volume în care se va afla peptida

înainte (cis) şi după (trans) translocarea acesteia prin membrană. Presupunând dN -

numărul de molecule peptidice care translocă prin membrana lipidică în intervalul

de timp dt (s), se poate deduce, expresia fluxului de molecule peptidice prin

membrană ca fiind numărul de monomeri peptidici ce translocă prin suprafaţa dS

în unitatea de timp dt (parametrii dS şi dt fiind cunoscuţi); se consideră că fluxul de

monomeri ce tranlocă prin suprafaţa dS este omogen, iar procesul de difuzie

unidirecţional. În acelaşi timp însă, fluxul poate fi scris matematic şi prin

intermediul gradientului de concentraţie a moleculelor peptidice între partea cis şi

trans a membranei şi a coeficientului de difuzie D şi utilizând datele numerice din

experimentele de fluorescenţă şi valorile cunoscute pentru: δ, V, r, t, se poate

determina coeficientul de difuzie al peptidei prin membrana lipidică dată de

expresia (1):

1

12

transbulk

cisbulk

C

Ctr

dVD

şi (1) )/(105,12 2113 smDHPA

Concluzii

Evidenţierea proceselor de translocare membranară indică în mod indirect,

faptul că peptida antimicrobiană HPA3 îşi poate exercita rolul toxic, nu

doar prin alterarea transportului ionic intermembranar şi prin formarea

porilor transmembranari, dar şi prin mecanisme ne-litice ce afectează ţinte

non-membranare intracelulare.

33

34

VII. 9. Modularea proceselor chimice ce au loc în interiorul porilor inseraţi în

membrane artificiale, de către proprietăţile electrice ale membranei

În ceea ce priveşte studierea influenţei modificărilor proprietăţilor

electrice ale membranei asupra fenomenelor de transport prin porinele din clasa

OmpF, ce se găseşte în membrana externă a bacteriei Escherichia Coli, am abordat

inţial problematica interesantă a posibilei interacţiuni electrostatice între

biomembrana în care se găseşte inserată porina şi grupările ionizabile din zona sa

de constricţie, ce joacă un rol esenţial în procesele de transport a antibioticelor

beta-lactamice prin aceste porine [22]. Aşa după cum este ştiut din literatură, una

din cele mai importante regiuni de aminoacizi din structura porinei OmpF este cea

din zona domeniului L3, unde doi aminoaicizi acidici (Glu 117 şi Asp 113) sunt

situaţi faţă în faţă cu aminoaicizi bazici din structura porinei (Arg 42, Arg 82 şi

Arg 132) iar la un pH neutru al soluţiei fiziologice în care aceste proteine sunt

studiate este de remarcat prezenţa unui câmp electric transversal în raport cu axa

longitudinală a proteinei, cauzat de încărcările electrice net negative şi pozitive ale

acestor seturi de aminoacizi. Aşa după cum este de aşteptat, încărcarea electrică

netă a acestor aminoacizi este puternic dependentă de pH-ul soluţiei fiziologice, şi

aceasta se datorează faptului că reacţiile de protonare-deprotonare ale

aminoacizilor mai sus amintiţi depind puternic de concentraţia ionilor de hidrogen

din soluţie (valoarea pKa-ului aminoacizilor acidici este de ~3, iar a celor bazici de

~10).

Datele experimentale au evidenţiat faptul că, scăderea potenţialului de

dipol membranar în urma interacţiunii membranei artificiale cu 500 μM phlorizin,

conduce la o creştere vizibilă a zgomotului electric printr-un singur trimer de

OmpF inserat în biomembrană, aşa după cum este vizibil din figura VII.9.1. Astfel,

valoarea estimată a deviaţiei standard a fluctuaţiilor de curent electric măsurate

prin porină a fost de 26 pA înainte, şi respectiv 37 pA, după interacţiunea

biomembranei cu moleculele de phlorizin.

Figura VII.9.1. Înregistrări electrofiziologice la nivel de ‘singură moleculă’ ce

evidenţiază creşterea fluctuaţiilor de curent electric înregistrate într-un porin din clasa

OmpF, în urma interacţiunii membranei lipidice ce conţine porinul cu un compus

chimic ce scade valoarea potenţialului de dipol membranar (phlorizin). Aceste

înregistrari au fost făcute la pH = 3, soluţie fiziologică 1M NaCl şi o valoare a

diferenţei de potenţial aplicate membranei de +100 mV.

Asa după cum este ştiut, zgomotul de curent electric printr-un por de

OmpF are formă Lorentziană, este pH-dependent şi reflectă procesele reversibile

de protonare-deprotonare ale aminoacizilor acidici ce concură la generarea zonei

de constricţie a respectivului porin. Astfel, evenimentele tranziente (durata de

~ < 10 ms) ce marchează scăderea parţială a conducţantei porinului OmpF

corespund acelor stări moleculare în care proteina OmpF este deprotonată (ne

referim aici la aminoacizii Asp-113 şi Glu-117 din zona de constricţie).

Astfel, concluzia cu privire la aceste rezultate experimentale este că drept

urmare a scăderii valorii potenţialului de dipol membranar – fenomen indus de

interacţiunea biomembranei cu moleculele de florizin – valoarea concentraţiei

locale a protonilor în interiorul porinului, în zona apropiată de aminoacizii GLU

117 şi ASP 113 va creşte corespunzător. Drept urmare, având în vedere că reacţiile

35

de protonare a acestor aminoacizi sunt de ordinul II, cu rate de reacţie de protonare

depinzând de valoarea pH-ului, se va manifesta pregnant procesul de interacţiune

tranzitorie al ionilor de hidrogen cu respectivii aminoacizi; prin intermediul

interacţiunilor electrostatice de tip ‘long range’, faptul că zona de constricţie a

porinului este protonată (sarcina electrică a respectivului aminoacid egală cu 0) sau

deprotonată (sarcina electrică a respectivului aminoacid egala cu -1) va conduce la

alterări ale fluxurilor de cationi şi anioni prin proteină, iar aceasta se va manifesta

macroscopic prin alterarea fluctuaţiilor de curent electric mediate de porină .

Figura VII.9.2. Înregistrări la nivel de ‘singură moleculă’ la diferite valori ale

potenţialului electric aplicat membranei şi în condiţii de pH =2.8 al soluţiei fiziologice,

ale fluctuaţiilor de curent mediat de un canal deschis de OmpF, care reflectă procesele

de protonare reversibile ale aminoacizilor aspartat 113 şi glutamat 117 existenţi în

zona de constricţie a OmpF.

Din date experimentale, se constată faptul că procesele reversibile de

protonare ale aminoacizilor Glu 117 şi Asp 113 din regiunea de constricţie a

36

porinei OmpF sunt potenţate atât de valoarea absolută a diferenţei de potenţial

membranar aplicată membranei, dar şi de semnul acesteia. Astfel, în condiţii de

2M NaCl, este vizibil în figura VII.9.2, faptul că aceste procese de protonare-

deprotonare sunt mai pregnant vizibile atunci când valoarea diferenţei de potenţial

aplicată membranei este de -150 mV.

Într-un alt set de experimente, am utilizat ca metodă de investigare a

proprietăţilor porinei OmpF, analiza Fourier a fluctuaţiilor de curent electric

mediat de trimerul OmpF inserat în biomembrane, utilizând acelaşi protocol de

lucru ca şi cel folosit pentru experimentele anterioare.

Figura VII.9.3. Reprezentarea densităţilor de putere spectrală normalizată a

fluctuaţiilor curentului electric printr-un singur canal deschis OmpF în condiţii de 2 M

NaCl, la valori ale potenţialelor electrice aplicate de +100 mV; −100 mV în inset sunt

reprezentate, la o scară de timp mai mare, fluctuaţiile curentului ionic indus de

reacţiile de protonare a reziduurilor acidice din zona de constricţie a trimerului OmpF,

la +100 mV. Liniile solide reprezintă fitările spectrelor de putere cu o funcţie

Lorenziană.

Pentru evaluări cantitative, am utilizat un algoritm de fitare neliniară de

tip Lorenz a funcţiei de putere spectrală (‘power - spectrum’) a fluctuaţiilor

curentului macroscopic înregistrat, urmarind parametrul fc (‘corner frequency’)

37

care reprezintă un parametru important derivat din analiza numerică a funcţiei

spectrului de puteri care, prin definiţie, este frecvenţa la care valoarea puterii

spectrale a semnalului scade la jumătate şi care dă informaţii directe despre ratele

de protonare-deprotonare ale aminoacizilor din regiunea de constricţie.

Figura VII.9.4. Reprezentarea densităţilor de putere spectrală normalizată a

fluctuaţiilor curentului electric printr-un singur canal deschis OmpF în condiţii de 2 M

NaCl, la valori ale potenţialelor electrice aplicate de +150 mV; −150 mV. Liniile solide

reprezintă fitările spectrelor de putere cu o funcţie Lorenziană şi sunt evidenţiate

modificările parametrului fc- o măsură a timpului de relaxare caracteristic a

proceselor reversibile de protonare, la +150mv şi -150mV.

Pentru a obţine mai multe detalii despre posibila influenţă exercitată de

profilul de potenţial electric prin porină asupra proceselor reversibile de protonare

ale aminoacizilor din zona de constricţie, am realizat experimente în care am

modificat tăria ionică a soluţiei precum şi sensul şi amplitudinea diferenţei de

potenţial aplicate membranei. După cum poate fi observabil din figurile VII.9.3 şi

VII.9.4, valori mari ale parametrului fc la potenţiale mai negative reflectă creşterea

concentraţiei locale de ioni de hidrogen, ceea ce implică creşterea ratelor de

protonare a reziduurilor aminoacidice, ipoteză susţinută şi de datele anterioare.

38

Figura VII.9.5. Reprezentarea normalizată a densităţilor de putere spectrală a

fluctuaţiilor curentului ionic mediat de trimerul de OmpF la -100 mV, în condiţii

diferite de tărie ionică.

Este interesant de remarcat faptul că atât valori reduse ale tăriei ionice cât

şi valori mari şi negative ale diferenţei de potenţial aplicate conduc la creşterea

coeficientului ‘fc’, fapt ce întăreşte observaţiile anterioare privitoare la potenţarea

activitiăţii cinetice a porinei OmpF în asemenea condiţii. Din teoria Debye–Hückel

şi formalismul Poisson-Boltzmann, este cunoscut faptul că, în cazul în care tăria

ionică a soluţiei este redusă, datorită ecranării mai reduse a sarcinilor electrice din

interiorul porinei, fenomenele de interacţiune electrostatică sunt potenţate, fapt

demonstrat şi de datele experimentale prezentate în figura VII.9.5, din care se

observă că în condiţii fiziologice de 0.5 M NaCl, parametrul fc creşte cu ~ 33% faţă

de 2 M NaCl, ceea ce reflectă că tăria ionică mai mică induce creşterea

concentraţiei locale a ionilor de hidrogen în zona de constricţie a porinului unde se

găsesc reziduurile aminoacidice. Astfel, am emis ipoteza că, acelaşi efect de

modificare a concentraţiei locale de protoni la nivelul zonei de constricţie a porinei

OmpF, se poate obţine şi prin alterarea potenţialului de dipol în ambele

monostraturi lipidice, utilizând agentul chimic phloretin.

39

Figura VII.9.6. Reprezentarea dependenţei frecvenţei fc a densităţii de putere spectrale

a fluctuaţiilor curentului ionic mediat de canalul OmpF induse de reacţiile de

protonare reversibile, în funcţie de diferenţa de potenţial aplicată, în absenţa şi

prezenţa a 200 µM phloretin.

Astfel, scăderea potenţialului de dipol transmembranar prin adiţia

phloretinului are ca efect creşterea concentraţiei de [H+] la nivelul porului de

OmpF şi implicit a ratei de protonare a reziduurilor ionizabile ceea ce induce o

accentuare a fluctuaţiilor de curent ale canalului de OmpF.

Concluzii

Valori mari şi negative ale diferenţei de potenţial aplicate membranei,

tăria ionică mai mică a mediului fiziologic precum şi scăderea

potenţialului de dipol membranar prin adiţia phloretinului, conduc la

creşterea concentraţiei de [H+] la nivelul porului de OmpF şi implicit a

ratei de protonare a reziduurilor ionizabile ceea ce induce o accentuare a

fluctuaţiilor de curent ale canalului de OmpF.

40

41

CONCLUZII FINALE

*

Rezultatele obţinute au vizat analiza detaliată şi înţelegerea unora din

factorii chimci, biologici şi fizici, ce guvernează potenţialul litic precum şi

specificitatea unor peptide antimicrobiene şi predicţia de novo a unor noi

structuri moleculare polimerice cu potenţial litic antimicrobian ridicat, mai mare

decât al antimicrobienelor clasice.

*

Studierea cantitativă şi calitativă a efectului unor peptide antimicrobiene

asupra unor membrane microbiene şi eucariote, prin tehnici de electrofiziologie

şi biologie moleculară, precum şi analiza cantitativă a adsorbţiei membranare şi

a cineticii de inserţie a unor peptide antimicrobiene prin tehnici de fluorescenţă

şi tehnici ‘voltage-clamp’, au permis evaluarea calitativă a energiilor de

interacţiune dintre peptidele antimicrobiene utilizate şi membrane celulare, şi

evaluarea conductanţei electrice a porilor formaţi de peptidele selectate.

*

Datele experimentale obţinute, subliniază şi evidenţiază odată în plus

posibilitatea practică prin care, modificând controlabil profilul electric

membranar precum şi condiţiile fiziologice în care au loc procesele de inserţie

membranară, tăria ionică, compoziţia bistratului lipidic, se pot obţine detalii

precise privind mecanismele moleculare ce determină efectul litic al unor

peptide antimicrobiene selectate.

*

Rezultatele derivate din implementarea acestor studii ar putea permite

ulterior dezvoltarea unor aplicaţii în industria farmaceutică creând oportunităţi

pentru obţinerea unor terapii inovante în domeniul tratamentelor infecţiilor

microbiene.

42

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

[1] K.V.R. Reddy, R.D. Yedery, C. Antimicrobial peptides: premises and

promises, Aranha International J. of Antimicrobial Agents 24 (2004) 536–547

[2] H. G. Boman, Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts.

Journal of Internal Medicine 2003; 254: 197–215

[3] J.B. McPhee, R.E. Hancock, Function and therapeutic potenţial of host

defence peptides, J. Pept. Sci. 11 (2005) 677-687.

[4] Shahar Rotem, Amram Mor, Antimicrobial peptide mimics for improved

therapeutic properties, BBA – Biomembranes, Accepted date: 21 October 2008

[5] Hari Leontiadou, Alan E. Mark, Siewert J. Marrink,J., Antimicrobial Peptides

în Action, Am. Chem. Soc. 2006, 128, 12156-12161

[6] Richard M. Epand, Hans J. Vogel, Review: Diversity of antimicrobial peptides

and their mechanisms of action, Biochimica et Biophysica Acta 1462 (1999) 11^28

[7] Erik Strandberg, Pierre Tremouilhac, Parvesh Wadhwani, Anne S. Ulrich,

Synergistic transmembrane inserţion of the heterodimeric PGLa/magainin 2

complex studied by solid-state NMR, BBA - Biomembranes (2009),

doi:10.1016/j.bbamem.

[8] Sarah R. Dennison, Leslie H.G. Morton, Frederick Harris, David A. Phoenix,

The impact of membrane lipid composition on antimicrobial function of an α-

helical peptide, Chemistry and Physics of Lipids xxx (2007) xxx–xxx

[9] Richard L. Gallo, MD, Masamoto Murakami, Takaaki Ohtake, Mohamed

Zaiou, Biology and clinical relevance of naturally occurring antimicrobial

peptides, J Allergy Clin Immunol, 2002, V.110, No. 6

[10] R. Jayaraman, Antibiotic resistance: an overview of mechanisms and a

paradigm shift, Current Science, VOL. 96, NO. 11, 10 JUNE 2009

[11] Senthil K. Kandasamy, Ronald G. Larson, Binding and inserţion of α-helical

anti-microbial peptides în POPC bilayers studied by molecular dynamics

simulations, Chemistry and Physics of Lipids 132 (2004) 113–132.

43

[12] Yechiel Shai, Review: Mechanism of the binding, inserţion and destabilization

of phospholipids bilayer membranes by α-helical antimicrobial and cell non-

selective membrane-lytic peptides, Biochimica et Biophysica Acta 1462 (1999)

[13] Marek Langner, Krystian Kubica, The electrostatics of lipid surfaces

Chemistry and Physics of Lipids 101 (1999) 3–35

[14] Sarah R. Dennison, Leslie H.G. Morton, Frederick Harris, David A. Phoenix,

The impact of membrane lipid composition on antimicrobial function of an α-

helical peptide, Chemistry and Physics of Lipids xxx (2007) xxx–xxx

[15] S. McLaughlin: “The electrostatic properties of membranes”, Annu. Rev.

Biophys. Biophys. Chem., Vol. 18, (1989), pp. 113–136.

[16] G. Cevc: “Membrane electrostatics”, Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1031,

(1990), pp. 311–382.

[17]D.L. Nelson and M.M. Cox: “Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth

Edition”, W. H. Freeman, (2004)

[18] P. O’Shea, Physical landscapes în biological membranes: physico-chemical

terrains for spatio-temporal control of biomolecular interactions and behaviour,

Phil. Trans. R. Soc. A. 363 (2005) 575–588.

[19] A. M. Nesbitt, K. Diraviyam, J. Wang, S. Singh, P.Murray, Z. Li, L. Rogers,

N. Mirkovic, D. Murray, The role of electrostatics în protein–membrane

interactions Biochimica et Biophysica Acta. 1761 (2006) 812–826.

[20] Daniel Allende, Adriana Vidal, Sidney A. Simon, Thomas J. McIntosh,

Bilayer interfacial properties modulate the binding of amphipathic peptides,

Chemistry and Physics of Lipids 122 (2003) 65_/76

[21] Olaf S. Andersen and Roger E. Koeppe, Bilayer Thickness and Membrane

Protein Function: An Energetic Perspective, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.

2007.36:107–30

[22] E.M. Nestorovich, T.K. Rostovtseva, S.M. Bezrukov, Residue ionization and

ion transport through OmpF channels, Biophys. J. 85 (2003) 1–12.

44

LISTA DE PUBLICAŢII

Articole indexate ISI:

1. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, A virtual instrumentation based protocol

for the automated implementation of the inner field compensation method,

Central European Journal of Physics 4(3), 2006, 405-416

2. Tudor Luchian, Loredana Mereuţă, Phlorizin- and 6-ketocholestanol-

mediated antagonistic modulation of alamethicin activity în phospholipid

planar membranes, Langmuir 22(20), 2006, 8452-8457, citat în:

Olga S. Ostroumova, Valery V. Malev, Andrey N. Bessonov, Jon Y.

Takemoto, and Ludmila V. Schagina, Altering the Activity of Syringomycin

E via the Membrane Dipole Potenţial, Langmuir, 24 (7), 2008, 2987 -2991

Ostroumova, O.S., Kaulin, Y.A., Gurnev, P.A., Schagina, L.V, Effect of

agents modifying the membrane dipole potenţial on properties of

syringomycin e channels, Langmuir 23 (13), 2007, 6889-6892

Asandei A, Luchian T, Ion selectivity, transport properties and dynamics of

amphotericin B channels studied over a wide range of acidity changes

COLLOIDS AND SURFACES B-BIOINTERFACES Volume: 67 Issue: 1

Pages: 99-106 Published: NOV 15 2008

Luchian T, Dipole potenţial-induced modulation of the interactions between

reconstituted lipid membranes and certain pore forming peptides REVUE

ROUMAINE DE CHIMIE Volume: 54 Issue: 6(2009)455-463

3. Loredana Mereuţă, Roxana Chiriac, Tudor Luchian, Activity modulation of

certain ion-pore forming proteins by electric properties of artificial lipid

membranes, Journal of Optoelectronic and Advanced Materials 10 (7),

2008,1837 – 1842

45

4. Alina Asandei, Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, -‘Influence of membrane

potenţials upon reversible protonation of acidic residues from the OmpF

eyelet’, Biophysical Chemistry 135, 2008, 32–40, citat în:

Mobasheri, H., Shafiee, A., Foroumadi, A., Effects of novel antituberculosis

agents on OmpF channel activity, Mahdiuni, H., Biochemical and

Biophysical Research Communications 376 (1), 2008,174-179

Lopez ML, Aguilella-Arzo M, Aguilella VM, et al., Ion Selectivity of a

Biological Chanel at High Concentration Ratio: Insights on Small Ion

Diffusion and Binding, Journal of Physical Chemistry B113(25),2009,8745-

8751

5. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Yoonkyung Park and Kyung-Soo Hahm,

Single-molecule investigation of the interactions between reconstituted planar

lipid membranes and an analogue of the HP(2–20) antimicrobial peptide,

Biochemical and Biophysical Research Communications 373 (4), 2008,

467-472

6. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Yoonkynung Park and Kyung-Soo

Hahm, The role played by lipids unsaturation upon the membrane interaction

of the Helicobacter pylori HP(2–20) antimicrobial peptide analogue HPA3,

Journal of Bioenergetics and Biomembranes 41, 2009, 79–84 citat în:

The membrane inserţion of helical antimicrobial peptides from the N-

terminus of Helicobacter pylori ribosomal protein L1, Tzong-Hsien Lee,

Kristopher N. Hall, Marcus J. Swann, Jonathan F. Popplewell, Sharon Unabia,

Yoonkyung Park, Kyung-Soo Hahm, Marie-Isabel Aguilar, Biochimica et

Biophysica Acta MEM-80183;2010 No. of pages: 14; 4C:

7. Aurelia Apetrei, Loredana Mereuţă, Tudor Luchian The RH 421 styryl dye

induced, pore model-dependent modulation of antimicrobial peptides activity

în reconstituted planar membranes, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -

General Subjects 1790 (8), 2009, 809-816

46

Participări conferinţe naţionale şi internaţionale

1. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Dipole moment-indeced modulation of ion channels activity în phospholipid planar membranes, The 5th International Conference on Global Research and Education, 25-28 September 2006, Iasi, Inter-Academia 2006

2. Alina Asandei, Roxana Chiriac, Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Ergosterol-induced modulation of transport and kinetic activity of alamethicin în artificial lipid membranes, A IX-a Conferinta Nationala de Biofizica (cu participare internationala)dedicata savantului George Emil PALADE, 11-13 Mai 2007, Bucuresti

3. Roxana Chiriac, Alina Asandei, Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, pH modulation of ion transport through alamethicin channels formed în phosphatidylcholine artificial membranes, A IX-a Conferinta Nationala de Biofizica (cu participare internationala) dedicata savantului George Emil PALADE, 11-13 Mai 2007, Bucuresti

4. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Membrane dipole potenţial-induced modulation of current fluctuaţions through the OmpF porin, International Conference on Fundamental and Applied Research în Physics 2007, 25-28 october 2007, Iasi

5. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, pH and electric-induced modulation of magainin 2 activity in reconstituted lipid membranes, The 8th International Conference on Physics of Advanced Materials (ICPAM-8) JUNE 04-07, 2008, IASI, ROMANIA

6. A. Asandei, L. Mereuţă, R. Chiriac, T. Luchian, The Influence of Superficial Charge and Ionic Strength Upon The Interaction Between Β-Lactam Antibiotics and Ompf Porins, The Annual InterNational Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, BUCHAREST, 29 – 31 May, 2008

7. R.Chiriac, A. Asandei, L. Mereuţă, T. Luchian, Rafts-Induced Modulation of Transport and Kinetic Properties of Certain Antimicrobial Peptides, The Annual InterNational Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, BUCHAREST, 29 – 31 May, 2008

8. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, pH and electric induced modulations of magainin 2 activity în reconstituted membranes, The 8th International Conference on Physics of Advanced Materials (ICPAM-8) June 04-07, 2008, Iasi, Romania

9. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, The influence of lipid unsaturation upon the interaction between HPA3 antimicrobial peptide and reconstituted lipid membranes, German Biophysical Society Meeting 2008 – GBSM 2008 Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Biophysik Berlin, September 28 - October 1

47

10. A. Apetrei, L. Mereuţă, T. Luchian The study of the modulatory effect of melittin inserţion upon membrane surface and dipole potenţials, IEEE ROMSC, Iasi, 6-9 iunie, 2009

11. L. Mereuţă, T. Luchian, The modulatory role played by lipids packing upon the membrane - antimicrobial peptides interaction, International Workshop NanoRomania, Iasi, iunie 2009

12. Aurelia Apetrei, Loredana Mereuţă, Tudor Luchian Activity of antimicrobial peptides în reconstituted planar lipid membranes under the influence of membrane dipole moment modulatory agents, International Workshop NanoRomania, Iasi, 2-5 iunie 2009 (premiul I)

13. Loredana Mereuta, Aurelia Apetrei, Yoonkynung Park, Kyung-Soo Hahm, Tudor Luchian, Mechanisms of modulation of α-helical antimicrobial peptides activity în reconstituted planar membranes, Asia-Pacific Peptide Symposium în November Korea 2009

14. Loredana Mereuţă, Tudor Luchian, Yoonkynung Park, Kyung-Soo Hahm,

Investigation of interactions between reconstituted planar lipid membranes and antimicrobial peptide HPA3, National Conference of Biophysics (CNB 2009) Cluj-1-3 October, (premiul I)

15. Mereuţă L, Asandei A, and Luchian T, "Influence of Membrane Electrostatics upon Reversible Protonation Reactions Taking Place on the Constriction Region of the Ompf Porin", The Annual InterNational Conference of the Romanian Society of Biochemistry and Molecular Biology, BUCHAREST, 29 – 31 May, 2008

16. Tudor Luchian, Aurelia Apetrei, Loredana Mereuţă, Roles of lipids and electric heterogeneity of lipid membranes în shaping antimicrobial peptides activity, NanoRomania, Iasi, 2-5 iunie 2009

*

Experimentele prezentate în cadrul acestei teze s-au realizat parţial

cu sprijinul financiar obţinut din Granturile de cercetare

CEEX 239/2006 şi PN-2 61-16 /2007 coordonate de prof. dr.

Tudor Luchian.

*