Microinmultirea plantelor

251

Click here to load reader

Transcript of Microinmultirea plantelor

Page 1: Microinmultirea plantelor

Florin Stănică

Microînmulţirea plantelor horticole

Editura INVEL-Multimedia Bucureşti, 2004

Page 2: Microinmultirea plantelor

Referenţi ştiinţifici: Prof. univ. dr. Corneliu Petrescu Prof. univ. dr. Alexandru Teodorescu © 2004 Versiune electronicã INVEL-Multimedia Toate drepturile rezervate. Nici un fragment din această publicaţie nu poate fi reprodus, stocat într-un sistem de recuperare a informaţiilor sau transmis sub orice formă sau prin orice mijloace electronice, mecanice, fotocopiere, înregistrare sau de altă natură, fără permisiunea prealabilă, în scris, a editurii şi autorului. INVEL-Multimedia din cadrul SC MAVI SERPICO TRADE SRL str. Fabrica de Chibrituri nr. 24-26, sector 5, Bucureşti Tel./Fax: 021/430.35.42, e-mail: [email protected] Colecţia www.teze_de_doctorat.ro ISBN 973-7753-07-0

Page 3: Microinmultirea plantelor

Dedic această lucrare studenţilor şi colaboratorilor mei

Page 4: Microinmultirea plantelor

4

Cuvânt înainte

Într-o eră în care progresul ştiinţei şi tehnicii a dus omul în cosmos, în adâncurile

oceanului, i-a permis să atingă viteze supersonice şi să dezvolte inteligenţa artificială, culturile

in vitro de celule şi ţesuturi vegetale au apărut, au evoluat şi s-au dezvoltat în acelaşi ritm.

Pătrunderea în universul celulei, în intimitatea proceselor fiziologice şi manipularea

materialului genetic sunt realizări comparabile cu cele prezentate mai sus, având aceeaşi

importanţă pentru umanitate.

Suntem în prezent în plină revoluţie biotehnologică, materializată printr-un volum

imens de aplicaţii practice ale culturilor in vitro în domeniul ştiinţelor agricole, biologice,

medicale, în farmacologie şi industria alimentară, în industria cosmetică, a coloranţilor naturali

şi a substanţelor bioactive.

Cercetările în biotehnologie vizează rezolvarea unor probleme majore ale omenirii cum

sunt: criza energetică, malnutriţia, valorificarea şi conservarea resurselor genetice, reciclarea

materiei organice, luarea în cultură şi valorificarea terenurilor degradate, reducerea poluării

mediului înconjurător.

Apărută dintr-o necesitate obiectivă, lucrarea “Microînmulţirea plantelor horticole”,

aflată la a doua ediţie, actualizată şi completată, tratează un domeniu care stă la baza oricărui

tip de producţie agricolă: obţinerea de material săditor şi semincer cu înaltă valoare biologică.

Concepută ca un instrument de lucru, “Microînmulţirea plantelor horticole” face în

prima parte, o prezentare amplă a dotărilor laboratorului de culturi in vitro., o trecere în revistă

a componentelor mediilor de cultură, pentru a insista în continuare, asupra modului de

preparare şi sterilizare a acestora.

Un capitol aparte este destinat sterilizării şi asepsiei în culturile in vitro.

Materialul abundă în informaţii utile, tabele ajutătoare, scheme de lucru şi fotografii

sugestive, utile organizării activităţii în domeniul culturilor in vitro.

În a doua parte a lucrării, sunt prezentate pe larg principalele tehnici folosite pentru

microînmulţirea plantelor in vitro. Sunt prezentate, în tabele sintetice, rezultatele cercetărilor

pe tipuri de culturi, la principalele specii horticole.

Page 5: Microinmultirea plantelor

5

Sunt prezentate, de asemenea alte tehnici de cultură in vitro cu aplicabilitate în

ameliorarea plantelor horticole, conservarea resurselor genetice, fitopatologie. O noutate în

literatura de specialitate românească este capitolul referitor la baby plant, o gamă de produse

decorative obţinute in vitro şi deosebit de apreciate pe piaţă.

Lucrarea se înscrie pe linia continuării tradiţiei învăţământului horticol bucureştean în

domeniul biotehnologiilor aplicate în horticultură şi este un instrument util la îndemâna

specialiştilor, cadrelor didactice, studenţilor, cercetătorilor şi tuturor celor care activează în

acest domeniu de vârf al ştiinţei.

Adresez cu această ocazie mulţumiri, colaboratorilor mei, şef lucrări dr. Monica

Dumitraşcu, şef lucrări dr. Adrian Peticilă, drd. ing. Oana Diaconescu şi drd. ing. Ruxandra

Gâlă, referenţilor ştiinţifici şi Editurii INVEL-Multimedia.

Tuturor celor care se vor apleca asupra acestei lucrări, o vor studia şi analiza critic, le

adresez mulţumirile mele şi invitaţia de a ne transmite opiniile lor la adresa

[email protected], ajutându-ne astfel, să îmbunătăţim ediţiile viitoare.

Bucureşti, august 2004

Conf. univ. dr. Florin STĂNICĂ

Page 6: Microinmultirea plantelor

6

CUPRINS CAPITOLUL 1. Istoricul culturilor in vitro CAPITOLUL 2. Laboratorul de culturi in vitro

2.1. Aspecte generale 2.2. Zona nesterilă

2.2.1. Camera de păstrare şi pregătire a materialului vegetal 2.2.2. Magazia de materiale 2.2.3. Magazia de substanţe chimice 2.2.4. Camera pentru pregătirea mediilor de cultură 2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultură şi

presterilizarea materialului vegetal 2.2.6. Magazia pentru medii de cultură 2.2.7. Camera de creştere 2.2.8. Camera (spaţiile) de aclimatizare 2.2.9. Sera şi solariile 2.2.10. Spălătorul

2.3. Zona sterilă CAPITOLUL 3. Mediile de cultură şi prepararea lor.

3.1. Constituenţi cu rol nutritiv 3.1.1. Constituenţi minerali

3.1.1.1. Macroelementele 3.1.1.2. Microelementele 3.1.2. Constituenţi organici

3.1.2.1. Carbohidraţii 3.1.2.2. Aminoacizii 3.1.2.3. Vitaminele

3.2. Constituenţi cu rol fitoregulator. 3.2.1. Auxinele 3.2.2. Citochininele 3.2.3. Giberelinele 3.2.4. Alte substanţe cu rol fitoregulator 3.3. Constituenţi cu rol stabilizator.

3.3.1. Apa 3.3.2. Agenţii de solidificare 3.3.3. Stabilizatorii osmotici şi de pH 3.3.4. Substanţele antioxidante şi absorbante

3.4. Concentraţii. Prepararea soluţiilor stoc. 3.5. Prepararea mediului de cultură 3.6. Probleme care apar la pregătirea şi folosirea mediilor de cultură.

CAPITOLUL 4. Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro.

4.1. Agenţi sterilizanţi 4.2. Sterilizarea vaselor de cultură şi a instrumentarului folosit 4.2.1. Închiderea vaselor de cultură 4.2.2. Sterilizarea vaselor de cultură 4.2.3. Sterilizarea instrumentarului

Page 7: Microinmultirea plantelor

7

4.3. Sterilizarea mediului de cultură şi a apei 4.4. Dezinfectarea materialului vegetal 4.5. Contaminările şi detectarea lor

CAPITOLUL 5. Microînmulţirea plantelor horticole

5.1. Consideraţii generale 5.2. Fazele microînmulţirii in vitro

5.2.1. Pregătirea materialului vegetal 5.2.2. Iniţierea şi stabilizarea 5.2.3. Multiplicarea 5.2.4. Înrădăcinarea

5.2.5. Aclimatizarea 5.3. Cultura de meristeme şi apexuri

5.3.1. Clasificarea meristemelor 5.3.2. Cultura de meristeme 5.3.3. Cultura de apexuri

5.4. Cultura de fragmente uninodale 5.5. Cultura de lăstari axilari

CAPITOLUL 6. Devirozarea plantelor horticole prin culturi in vitro

6.1. Devirozarea prin culturi de meristeme 6.2. Microaltoirea

6.2.1. Microaltoirea in vitro 6.2.2. Microaltoirea in vivo 6.2.3. Microaltoirea ex vitro

6.3. Producerea plantelor devirozate prin alte tehnici in vitro CAPITOLUL 7. Organogeneza in vitro

7.1. Organogeneza directă 7.1.1. Organogeneza adventivă de lăstari 7.1.2. Organogeneza adventivă de rădăcini

7.2. Organogeneza indirectă CAPITOLUL 8. Embriogeneza somatică

8.1. Formarea embrionilor somatici 8.2. Embriogeneza somatică directă 8.3. Embriogeneza indirectă 8.4. Poliembrionia nucelară 8.5. Încapsularea materialului vegetal in vitro

8.5.1. Sămânţa sintetică 8.5.2. Încapsularea unor organe şi ţesuturi in vitro

CAPITOLUL 9. Embriocultura in vitro la plantele horticole CAPITOLUL 10. Producerea haploizilor

10.1. Aspecte generale 10.2. Androgeneza in vitro 10.3. Fecundarea in vitro

Page 8: Microinmultirea plantelor

8

CAPITOLUL 11. Cultura de calus in vitro. 11.1. Cultura de calus 11.2. Cultura de protoplaşti şi hibridarea somatică 11.3. Regenerarea plantelor dintr-o singură celulă

CAPITOLUL 12. Baby plant 12.1. Consideraţii generale

12.2. Tipuri de produse şi materiale folosite la producerea de baby plant 12.2.1. Vase din sticlă

12.2.2. Alte materiale 12.3. Folosirea mediilor de cultură colorate

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Page 9: Microinmultirea plantelor

9

CONTENTS CHAPTER 1. History of in vitro cultures CHAPTER 2. In vitro culture laboratory

2.1. General aspects 2.2. Unsterile area

2.2.1. Biological material preparation room 2.2.2. Materials storage room 2.2.3. Chemical storage room 2.2.4. Culture media preparation room 2.2.5. Culture media and biological material sterilization room

2.2.6. Culture media storage room 2.2.7. Growth chamber 2.2.8. Acclimation room 2.2.9. Greenhouse and tunnels 2.2.10. Washing room

2.3. Sterile area CHAPTER 3. Culture media and their preparation

3.1. Nutrients 3.1.1. Mineral compounds

3.1.1.1. Macro elements 3.1.1.2. Microelements 3.1.2. Organic compounds

3.1.2.1. Carbohydrates 3.1.2.2. Amino acids 3.1.2.3. Vitamins

3.2. Growth regulators 3.2.1. Auxins 3.2.2. Cytokinins 3.2.3. Giberellins 3.2.4. Other growth regulators 3.3. Stabilization compounds

3.3.1. Water 3.3.2. Gelling compounds 3.3.3. Osmotic and pH stabilizers 3.3.4. Antioxidants and absorbents

3.4. Concentrations. Preparation of stock solution. 3.5. Culture medium preparation 3.6. Problems connected to the culture media preparation and use

CHAPTER 4. Sterilisation and asepsis for in vitro cultures

4.1. Sterilising agents 4.2. Culture vessels and tools sterilisation 4.2.1. Culture vessels closure 4.2.2. Culture vessels sterilisation 4.2.3. Tools sterilisation 4.3. Culture medium and water sterilisation

Page 10: Microinmultirea plantelor

10

4.4. Biological material disinfection 4.5. Contamination and their detection

CHAPTER 5. Horticulture plants micropropagation

5.1. General aspects 5.2. In vitro micropropagation stages

5.2.1. Biological material preparation 5.2.2. Initiation and stabilisation 5.2.3. Multiplication 5.2.4. Rooting 5.2.5. Acclimatisation

5.3. Meristem and apex culture 5.3.1. Meristem classification 5.3.2. Meristem culture 5.3.3. Apex culture

5.4. Single node culture 5.5. Axillary shoots culture

CHAPTER 6. Horticultural plants virus elimination using in vitro cultures

6.1. Virus elimination using meristem cultures 6.2. Micrografting

6.2.1. In vitro micrografting 6.2.2. In vivo micrografting 6.2.3. Ex vitro micrografting

6.3. Virus free plant obtaining using other in vitro techniques CHAPTER 7. In vitro organogenesis

7.1. Direct organogenesis 7.1.1. Adventitious shoot organogenesis 7.1.2. Adventitious root organogenesis

7.2. Indirect organogenesis CHAPTER 8. Somatic embryogenesis

8.1. Somatic embryo formation 8.2. Direct somatic embryogenesis 8.3. Indirect somatic embryogenesis 8.4. Nucellar poliembriony 8.5. In vitro encapsulation of biological material

8.5.1. Synthetic seed 8.5.2. In vitro encapsulation of tissues and organs

CHAPTER 9. In vitro embrioculture in horticultural plants CHAPTER 10. Haploid production

10.1. General aspects 10.2. In vitro androgenesis 10.3. Test-tube fertilisation

Page 11: Microinmultirea plantelor

11

CHAPTER 11. In vitro callus culture 11.1. Callus culture 11.2. Protoplast culture and somatic hybridisation 11.3. Plant regeneration from a single cell

CHAPTER 12. Baby plant

12.1. General considerations 12.2. Products and materials used for baby plant production

12.2.1. Glass ware 12.2.2. Other materials

12.3. Use of coloured culture media SELECTIVE REFERENCES

Page 12: Microinmultirea plantelor

12

Capitolul 1

Istoricul culturilor in vitro

Cultivarea in vitro a unor celule şi ţesuturi vegetale este o ramură a ştiinţelor

biologice ale căror începuturi corespunde cu începutul secolului XX.

Evoluţia sa de-a lungul timpului a fost demnă de secolul “vitezei” astfel încât, în

aceşti ultimi ani, vorbim de un ansamblu de tehnici şi metode in vitro grupate generic sub

numele de biotehnologii vegetale.

Teoria care a stat la baza acestei ştiinţe a fost lansată însă cu mult timp înainte. În

1838, Schleiden şi Schwan au afirmat că celulele vegetale sunt, într-o oarecare măsură,

autonome şi capabile să regenereze părţi din plante sau plante întregi. Această proprietate a

fost numită totipotenţă şi a reprezentat o adevărată provocare pentru un mare număr de

oameni de ştiinţă.

Primele încercări nereuşite de a cultiva ţesuturi vegetale in vitro s-au datorat lui

Haberlandt (1902). Au urmat apoi numeroase tentative care au deschis calea spre tot atâtea

domenii noi de cercetare.

Abia în 1939, după descoperirea rolului hormonilor în creşterea şi dezvoltarea

plantelor, Nobecourt, Gautheret şi White au obţinut primele succese reale prin cultivarea in

vitro timp de mai multe subculturi a calusului.

După al doilea război mondial, culturile in vitro s-au dezvoltat rapid datorită

multiplelor domenii de aplicabilitate: înmulţirea industrială a plantelor, genetică,

ameliorarea plantelor, inginerie genetică, conservarea resurselor genetice, producţia

industrială de substanţe utile. Trebuie adăugat şi rolul avut în dezvoltarea unor studii de

anatomie şi fiziologia vegetală, fitopatologie, etc.

Stadiul atins în prezent deschide perspective ample în zorii mileniului III în ceea ce

priveşte manipularea materialului genetic şi dirijarea proceselor de înmulţire, creştere şi

dezvoltare a plantelor în vederea obţinerii unor noi forme productive.

Speranţele umanităţii se îndreaptă spre găsirea unor soluţii pe termen lung pentru

asigurarea necesarului de hrană pentru o populaţie aflată în creştere rapidă.

Aceste soluţii pot fi căutate în multitudinea de posibilităţi pe care biotehnologiile in

vitro le au în ceea ce priveşte valorificarea superioară a resurselor genetice şi modelarea

Page 13: Microinmultirea plantelor

13

acestora în folosul omului. Pe lângă obiectivul creşterii productivităţii ecosistemelor

agricole, se urmăreşte obţinerea unor plante de cultură care să poată valorifica zonele

neproductive, deşertice, sărăturate, etc.

În acelaşi timp se are în vedere extinderea şi perfecţionarea tehnologiilor de

obţinere a unor noi produse de biosinteză, cu aplicabilitate în industria alimentară,

farmaceutică, în industria coloranţilor, zootehnie.

Cineva spunea parafrazându-l pe Malraux, că: ”Secolul XXI va fi un secol al

biotehnologiei sau nu va fi deloc”.

În tabelul 1.1. sunt prezentate cele mai importante etape din evoluţia

biotehnologiilor vegetale.

Tabelul 1.1. Istoricul culturilor vegetale in vitro

Anul Ipoteze, teorii, încercări, realizări Autorii 0 1 2

1838 Teoria totipotenţei celulare Schleiden şi

Schwan

1892 Plantele sintetizează substanţe care sunt distribuite polar Sachs

1902 Primele încercări de culturi de ţesuturi vegetale Haberlandt

1904 Prima încercare de embriocultură la crucifere Hönnig

1909 Prima fuziune de protoplaşti nereuşită Kuster

1922 Germinarea seminţelor de orhidee in vitro în absenţa

simbionţilor

Kundson

1922 Cultura in vitro a apexurilor de rădăcină Robbins

1925 Embriocultura aplicată în încrucişările interspecifice la

Linum

Laibach

1929 Folosirea embrioculturii pentru înlăturarea

incompatibilităţii la încrucişare

Laibach

1934 Primele încercări nereuşite de cultivare a ţesutului

cambial la arbori şi arbuşti

Gautheret

1934 Cultivarea in vitro a rădăcinilor de tomate White

1936 Embriocultura la diferite gimnosperme La Rue

Page 14: Microinmultirea plantelor

14

Continuare tabelul 1.1. 0 1 2

1939 Creşterea timp de mai multe subculturi a calusului

obţinut din ţesuturi vegetale

Nobecourt,

Gautheret, White

1940 Cultivarea ţesutului cambial de Ulmus şi studierea

formării lăstarilor adventivi

Gautheret

1941 Folosirea pentru prima dată a laptelui de cocos pentru

cultivarea embrionilor de Datura

Van Overbeek

1944 Prima cultură de Nicotiana tabacum pentru studierea

formării de lăstari adventivi (organogeneza directă)

Skoog

1945 Cultura unor specii de Asparagus in vitro Loo

1946 Obţinerea primelor plante de Lupinus şi Tropaeolum Ball

1948 Organogeneza directă de lăstari şi rădăcini la tutun sub

influenţa raportului auxină/adenină

Skoog şi Tsui

1950 Regenerarea unor organe din calus la Sequoia

sempervirens

Ball

1952 Obţinerea de plante de Dhalia devirozate prin culturi de

meristeme

Morel şi Martin

1952 Realizarea primelor microaltoiri Morel şi Martin

1953 Obţinerea calusului haploid la Gingko biloba din polen Tulecke

1954 Obţinerea unei plante întregi dintr-o singură celulă Muir şi colab.

1955 Descoperirea chinetinei Miller şi colab.

1956 Realizarea primelor culturi celulare în suspensie pentru

obţinerea de produşi secundari

Tulecke şi Nickell

1957 Descoperirea influenţei raportului citochinine/auxine

asupra proceselor de organogeneză

Skoog şi Miller

1958 Regenerarea in vitro a unor embrioni somatici din nucelă

la Citrus

Maheshwari şi

Rangaswamy

1958 Regenerarea de pro-embrioni din calus şi suspensii

celulare la Daucus carota

Reinert şi Steward

1959 Publicarea primei cărţi privind cultura de celule şi

ţesuturi vegetale

Gautheret

1960 Prima polenizare in vitro la Papaver rhoeas Kanta

Page 15: Microinmultirea plantelor

15

Continuare tabelul 1.1. 0 1 2

1960 Degradarea pereţilor celulari pentru obţinerea

protoplaştilor

Cocking

1960 Înmulţirea vegetativă a orhideelor prin culturi de

meristeme

Morel

1962 Formularea şi publicarea reţetei mediului de cultură

Murashige & Skoog

Murashige & Skoog

1964 Obţinerea primei plante haploide din grăunciori de polen

la Datura

Guha şi Maheswari

1964 Regenerarea de lăstari şi rădăcini din calus de Populus

tremuloides

Mathes

1965 Inducerea înfloririi în ţesutul de tutun cultivat in vitro Aghion-Prot

1967 Inducţia florală la Lunaria annua prin vernalizare in vitro Pierik

1969 Obţinerea plantelor haploide de tutun din grăunciori de

polen

Bourgin şi Nitsch

1969 Prima izolare reuşită de protoplaşti din suspensii celulare

la Hapopappus gracilis

Eriksson şi Jonassen

1970 Selecţia de mutanţi obţinuţi cu agenţi chimici in vitro Carlson

1970 Obţinerea haploizilor la ovăz prin embriocultură Kasha şi Kao

1970 Realizarea cu succes a fuziunii de protoplaşti Power şi colab.

1971 Regenerarea primei plante din protoplaşti Takebe şi colab.

1972 Realizarea hibridării interspecifice prin fuziunea de

protoplaşti la două specii de Nicotiana

Carlson şi colab.

1973 Folosirea citochininelor pentru întreruperea dormansului

la explante de capitul la Gerbera

Pierik şi colab.

1974 Inducerea lăstăririi axilare prin folosirea citochininelor în

cultura de apexuri la Gerbera

Murashige şi colab.

1974 Regenerarea de haploizi din protoplaşti la Petunia

hybrida

Binding

1974 Obţinerea de hibrizi prin fuziunea protoplaştilor haploizi Melchers şi Labib

1974 Transformarea genetică în cultura de ţesuturi vegetale Reinhard

Page 16: Microinmultirea plantelor

16

Continuare tabelul 1.1. 0 1 2

1974 Descoperirea rolului plasmei Ti în formarea tumorilor la

Agrobacterium tumefaciens

Zaenen şi colab.

Larebeke şi colab.

1975 Selecţia pozitivă în culturi de calus rezistente la

Helminthosporium maydis

Gengenbach şi Green

1976 Iniţierea culturilor din apexuri de lăstari crioconservaţi

la garoafă

Seibert

1976 Hibridarea somatică interspecifică prin fuziunea de

protoplaşti între Petunia hybrida şi Petunia parodii

Power şi colab.

1977 Integrarea plasmidei Ti de la Agrobacterium

tumefaciens în genomul plantelor

Chilton şi colab.

1978 Hibridarea somatică între tomate şi cartof Melchers şi colab.

1979 Folosirea co-cultivării pentru transformarea genetică a

protoplaştilor vegetali cu Agrobacterium tumefaciens

Marton şi colab.

1981 Introducerea termenului de variaţie somaclonală Larkin şi Scowcroft

1982 Introducerea de ADN pur în protoplaşti. Transformarea

cu ADN izolat devine posibilă

Krens şi colab.

1982 Fuziune de protoplaşti prin electrostimulare Zimmermann

1983 Hibridarea citoplasmatică intergenerică între ridiche şi

rapiţă

Pelletier şi colab.

1984 Transformarea celulelor vegetale cu plasmida ADN Paszkowski şi colab.

1985 Infecţia şi transformarea discurilor foliare cu

Agrobacterium tumefaciens şi regenerarea de plante

transformate

Horsch şi colab.

După

1985

Începe Era Organismelor Modificate Genetic

(OMG)

Page 17: Microinmultirea plantelor

17

Capitolul 2

Laboratorul de culturi in vitro

2.1. Generalităţi

Activitatea în domeniul culturilor in vitro se desfăşoară în laboratoare cu structură

şi dotare specifică.

Mărimea acestor laboratoare variază de la câţiva zeci de metri pătraţi, în cazul

structurilor cu finalitate didactică sau de cercetare, până la suprafeţe de mii de metri pătraţi

în cazul complexelor industriale de microînmulţire (foto 2.1.).

Foto 2.1. Complexul industrial de microînmulţire Vitroplant, Cesena, Italia

Dotarea laboratoarelor diferă în funcţie de volumul de material biologic care este

inoculat şi crescut in vitro. Diferenţele se referă în primul rând la capacitatea unei anumite

structuri din dotare şi nu la funcţiile acesteia.

Una din condiţiile esenţiale ale realizării unui laborator este asigurarea curăţeniei

impecabile. Acest lucru nu se referă doar la pardoseli şi pereţi, dar şi la aer. Acesta trebuie

să fie lipsit pe cât posibil de particule de praf şi bine-nţeles de spori de ciuperci sau

particule bacteriene care pot constitui surse de infecţie.

Page 18: Microinmultirea plantelor

18

Pentru realizarea unei “curăţiri” a aerului se recomandă folosirea unor instalaţii de

condiţionare prevăzute cu filtre de aer eficiente (ex. filtru HEPA). O soluţie alternativă ar fi

folosirea unor instalaţii de condiţionare a aerului cu presiune pozitivă care sunt însă ceva

mai costisitoare.

O altă grupă de facilităţi se referă la controlul temperaturii în laborator. Acest

lucru se realizează, pentru spaţiile comune, prin folosirea instalaţiilor de încălzire

controlată cu diferite tipuri de agent termic.

O atenţie deosebită se va acorda însă dirijării temperaturii în camerele de creştere,

în camerele de aclimatizare şi în seră. Sistemele care se vor folosi vor fi prevăzute cu

senzori şi sisteme de alarmare în caz de avarie pentru o reducere la minimum posibil riscul

pierderilor.

Laboratoarele industriale trebuie prevăzute şi cu grupuri electrogene care să facă

faţă rapid penelor de curent.

Nu vor lipsi în orice laborator sistemele de dublă protecţie, senzori de gaz, senzori

de temperatură (pentru depistarea incendiilor) şi sistemele de alarmare corespunzătoare,

lămpi de avarie, hidranţi, extinctoare etc.

Laboratoarele vor fi dotate cu truse de prim ajutor şi cu instrucţiuni precise

privind acordarea acestuia în caz de arsuri, intoxicaţii şi alte accidente posibile.

Nu în ultimul rând se vor prevedea sisteme de protecţie antiefracţie şi de protecţie

a datelor, informaţiilor şi tehnologiilor folosite.

Laboratoarele de tip industrial (figura 2.2.) au suprafeţe de lucru mult mai ample,

faţă de laboratoarele de cercetare sau didactice şi bine-nţeles, câteva structuri

caracteristice.

În toate cazurile suprafaţa unui laborator este împărţită în două zone:

- zona nesterilă;

- zona sterilă.

Page 19: Microinmultirea plantelor

19

camere aclimatizare camerătransfer

" "în vivo

camerărepaos

sală de şedinţă

camerămedii

camerăsterilă

camerăculturi

autoclave

magazie

spălător

cameră rece

birou

birou

microscopie

laboratorbiochimie

virusologie

cameră ambalare

rampă livrare

birou

seră

Figura 2.2. Structura unui laborator industrial de microînmulţire

(modificat după Gamborg, 1995)

2.2. Zona nesterilă

Zona nesterilă este reprezentată de totalitatea spaţiilor în care asepsia nu este

obligatorie. Această zonă este împărţită în mai multe încăperi care vor fi prezentate în

continuare.

2.2.1. Camera de păstrare şi pregătire a materialului vegetal

Pentru pregătirea materialului vegetal în vederea inoculării este nevoie de o

încăpere curată, cu pereţi faianţaţi şi pardosiţi cu gresie. Dotările obligatorii se referă la apa

curentă, canalizare şi curent electric (220 V, 50 Hz), iar cele opţionale la frigidere,

dulapuri, mese, etc.

În această încăpere, materialul vegetal iniţial provenit din câmp sau seră, este

sortat, curăţat (prin spălare), fasonat, parafinat, eventual sterilizat superficial prin folosirea

unor fungicide şi bactericide.

Page 20: Microinmultirea plantelor

20

În cazul păstrării mai îndelungate a materialului vegetal (bulbi, rizomi, tubero-

bulbi, tuberculi, sâmburi, seminţe, ramuri etc.) acesta este ambalat corespunzător şi trecut

în frigider la 3-4° C.

2.2.2. Magazia de materiale

În funcţie de amploarea activităţii desfăşurate în laborator este necesară existenţa,

în anumite situaţii, a unei magazii de materiale.

În această magazie se va păstra o gamă largă de materiale cum ar fi: sticlăria nouă,

folii din aluminiu, din polietilenă, ghivece noi, blocuri de repicat, tifon, vată, ambalaje

pentru livrarea materialului vegetal, etichete etc.

2.2.3. Magazia de substanţe chimice

Substanţele chimice folosite pentru prepararea mediilor de cultură, pentru

sterilizarea materialului vegetal, spaţiilor şi instrumentarului se vor păstra într-o magazie

special amenajată în acest scop.

O astfel de încăpere este dotată cu:

- rafturi pentru substanţele care se păstrează la temperatura camerei;

- dulapuri pentru păstrarea substanţelor la întuneric;

- frigidere şi congelatoare pentru păstrarea unor hormoni, vitamine, soluţii stoc

etc.

- balanţe şi inventar specific: scafe, spatule, vase pentru cântărire etc.

Foarte important este ca fiecare recipient cu substanţe să fie bine închis, corect

etichetat şi asigurat împotriva răsturnării, spargerii, deteriorării, etc.

Pentru a uşura căutarea unei anumite substanţe se recomandă numerotarea

recipienţilor şi anexarea pe uşa fiecărui dulap sau frigider a unui opis cu numerele de

identificare şi conţinutul acestora.

În acelaşi timp, substanţele puternic toxice, corozive, cancerigene, inflamabile,

într-un cuvânt, periculoase, vor fi amplasate separat în locuri marcate corespunzător cu

indicatoare de avertizare.

Acidul clorhidric concentrat (HCl) şi hidroxidul de amoniu (NH4OH) nu trebuie

păstrate în acelaşi loc, datorită riscului formării de NH4Cl toxic, prin combinarea vaporilor

de clor şi amoniac.

Page 21: Microinmultirea plantelor

21

Substanţele higroscopice trebuie păstrate în recipiente ermetic închise şi uneori în

esicatore.

Pentru a putea fi folosite substanţele păstrate în congelator se vor introduce de

asemenea în esicatoare până vor atinge temperatura camerei. Măsura este obligatorie

pentru enzime şi alte proteine şi are ca efect eliminarea condensării apei şi reducerea

pierderilor de substanţă activă.

Pentru cazurile când se lucrează cu substanţe volatile sau care emană gaze iritante

sau toxice se recomandă ca în această magazie să existe şi o nişă cu ventilaţie forţată a

aerului.

2.2.4. Camera pentru pregătirea mediilor de cultură

Pregătirea mediilor de cultură este o operaţie foarte importantă care presupune

existenţa unei camere prevăzută cu dotări specifice (Foto 2.3.)

Foto 2.3. Camera pentru prepararea mediilor de cultură la Vitroplant Cesena

În ceea ce priveşte dotările şi instalaţiile de bază, trebuie precizat că încăperea

trebuie să fie faianţată şi pardosită cu gresie sau materiale uşor lavabile. Mesele, de regulă

una aşezată central şi celelalte lângă pereţi, trebuie să fie faianţate şi prevăzute cu

minirafturi pentru sticlărie, etc. În cameră vor mai exista dulapuri pentru păstrarea sticlăriei

curate.

Page 22: Microinmultirea plantelor

22

Camera trebuie prevăzută cu instalaţii de apă curentă rece şi caldă (eventual cu un

boiler), chiuvete antiacid, canalizare, instalaţie de gaz natural sau butelie, instalaţie de

curent electric (220 V, 50 Hz). Toate instalaţiile de mai sus trebuie prevăzute cu sisteme de

protecţie, robinete suplimentare, vane, circuite de împământare, tablouri cu siguranţe

fuzibile, etc. conform normelor în vigoare.

Din inventarul camerei pentru pregătirea mediilor de cultură nu trebuie să

lipsească un aparat pentru distilat apă, un deionizator, plite cu agitator magnetic, plite

diverse, eventual becuri cu gaze, cuptor de microunde, sisteme de filtrare (Millipore etc.),

balanţă analitică cu patru zecimale, balanţă cu două zecimale, mixere, micropipete, pH-

metru, distribuitoare de mediu, cronometru de laborator etc.

Distribuitoarele de mediu pot fi simple de tipul unor seringi cu limitator gradat,

pentru volume de mediu cuprinse între 1 şi 10-15 ml (foto 2.4. şi 2.5.), sau de dimensiuni

mai mari de tipul unor cuve încălzite electric prevăzute cu pompe aspiro-respingătoare,

pentru volume de mediu cuprinse între 25-200 ml (foto 2.6.).

Foto 2.4. Distribuitor-dozator pentru mediul de cultură (volume reduse)

Foto 2.5. Seringă pentru repartizarea mediului de cultură

Page 23: Microinmultirea plantelor

23

Foto 2.6. Repartizarea mediului de cultură în vase mari,

în flux industrial (Vitroplant)

De asemenea, se foloseşte sticlărie specifică; pahare Berzelius, pahare

Erlenmayer, baloane cotate, cilindri gradaţi, pipete, biurete, vase pentru apă distilată.

După preparare mediul se repartizează în diferite tipuri de recipiente din sticlă sau

mase plastice speciale. Pentru volume reduse de mediu se folosesc fie eprubetele, fie

vasele Petri.

Pentru cantităţi mai mari de mediu se folosesc recipiente din sticlă sau material

plastic de forme şi mărimi diferite. Închiderea lor se face folosind diferite materiale şi

soluţii tehnice (vezi subcapitolul 4.2.1.).

2.2.5. Camera pentru autoclavarea mediilor de cultură şi presterilizarea

materialului vegetal

După prepararea mediului de cultură şi repartizarea în vase acesta este trecut în

camera de autoclavare. Această încăpere este dotată cu instalaţie de curent electric

(recomandabil 380 V), instalaţie de gaz, instalaţie de alimentare cu apă şi autoclave.

Page 24: Microinmultirea plantelor

24

Autoclavele sunt instalaţii complexe, prevăzute cu instrumente pentru controlul

temperaturii şi presiunii, temporizatoare şi dispozitive de siguranţă folosite pentru

sterilizare în mediu umed (autoclavare).

Parametrii de lucru a unui autoclav sunt în general 121°C, pentru temperatură şi

1,1 atmosfere, pentru presiune.

După sursa de energie autoclavele sunt de două feluri: electrice şi cu gaz, iar după

tipul constructiv sunt verticale sau orizontale (foto 2.7. şi 2.8.). Volumul util al unui

autoclav variază de la câţiva litri până la câteva sute de litri, în funcţie de cantitatea de

mediu care se autoclavează în mod uzual.

Foto 2.7. Autoclav orizontal de capacitate redusă

Foto 2.8. Autoclav vertical de capacitate medie

În complexele industriale de microînmulţire se folosesc autoclave orizontale de

mare capacitate prevăzute cu două uşi:

- una pentru umplere din camera pentru pregătirea mediului de cultură;

- una pentru golire din camera pentru păstrarea mediului sau din zona sterilă.

În autoclave, vasele cu mediu se introduc în coşuri speciale sau în pupinele.

În anumite situaţii în camera de autoclavare care se află în vecinătatea zonei

sterile se face şi o presterilizare a materialului vegetal pregătit pentru inoculare.

Presterilizarea se face prin imersarea acestuia în soluţii de fungicide şi/sau

bactericide urmând apoi sterilizarea propriu-zisă sub hota cu filtru laminar.

Page 25: Microinmultirea plantelor

25

2.2.6. Magazia pentru medii de cultură

După autoclavare, mediile de cultură trebuie să fie păstrate cel puţin 24 de ore

înainte de a fi folosite. Acest lucru se poate face într-o încăpere perfect curată situată în

vecinătatea camerei de inoculare.

Păstrarea trebuie făcută la întuneric pentru a preveni degradarea compuşilor

fotolabili sub influenţa luminii. În acelaşi timp, temperatura de păstrare se recomandă să

fie cât mai scăzută (ideal 3-4°C). Unele laboratoare industriale folosesc camere frigorifice

special amenajate pentru păstrarea mediului de cultură, dar şi pentru păstrarea vaselor cu

explante pentru eşalonarea producţiei de material vegetal în funcţie de cerinţe, comenzi,

anotimp, etc.

În laboratoarele mici păstrarea vaselor cu mediul de cultură se poate face în

dulapuri bine închise în apropierea camerei sterile.

Păstrarea mediului de cultură nu trebuie făcută pe o perioadă mai mare de 14 zile

întru-cât creşte riscul deteriorării caracteristicilor acestuia.

2.2.7. Camera de creştere

După inocularea explantelor pe mediul de cultură vasele sunt trecute în camera de

creştere. Ca şi celelalte încăperi ale laboratorului, aceasta trebuie să fie perfect curată,

faianţată şi să fie totodată dotată cu instalaţii specifice (Foto 2.9.).

Foto 2.9. Una din camerele de culturi ale firmei Vitroplant Cesena, Italia

Page 26: Microinmultirea plantelor

26

Întreaga cameră este ocupată cu rafturi pe care se aşează vasele de cultură.

Distanţa dintre două poliţe pe verticală este de minimum 40-50 cm, iar înălţimea totală în

jur de 2 m. Lăţimea unei poliţe este de 1-2 m.

Poliţele se realizează din materiale care să permită circulaţia aerului printre vase

evitându-se astfel supraîncălzirea mediului de cultură.

Pentru aşezarea eprubetelor pe rafturi se folosesc suporţi, de regulă înclinaţi, care

permit o mai bună iluminare a explantelor.

Un alt element important în camera de creştere este reprezentat de instalaţia de

iluminat. Realizată în general din tuburi fluorescente distanţate la 15-20 cm unele de altele,

această instalaţie trebuie să aibă nişte caracteristici tehnice bine stabilite.

Astfel, intensitatea luminoasă trebuie să fie de 3000-4000 de lucşi. Se cunosc

situaţii când se recurge la intensităţi mai reduse sau chiar la lipsa totală a luminii:

- timp de 3-4 zile după inocularea meristemelor pentru reducerea oxidărilor;

- în anumite culturi de calus;

- în embriogeneza somatică la conifere;

- în faza de inducţie înaintea fazei de organogeneză directă din limb foliar;

Frecvent este nevoie de lumină diferit colorată pentru obţinerea unor rezultate mai

bune la diverse tipuri de culturi.

Interesează apoi lungimea ciclurilor lumină-întuneric. De regulă durata “zilei”

este stabilită la 6-12 ore, restul până la 24 fiind ocupate de întuneric. Rezultatele obţinute

de Teodorescu Al. şi colab. (1994, 1995) la ICPP Piteşti-Mărăcineni au dovedit că prin

reducerea lungimii ciclurilor de lumină se realizează importante economii de energie. Pe

baza rezultatelor obţinute, autorii recomandă reducerea duratei de iluminare cu 4-6 ore pe

zi, respectiv realizarea unui fotoperiodism de 12-10 ore.

Un alt parametru care trebuie controlat este nivelul temperaturii în camera de

creştere. În general, temperatura folosită este 22-24°C±1°C, Trebuie precizat că în funcţie

de specie, tipul de cultură şi scopul urmărit temperatura poate să varieze între 10 şi 32°C.

În general, speciile provenite din zonele calde cresc bine la temperaturi mai ridicate (26-

28°C).

Umiditatea este un alt factor esenţial. Valoarea optimă a umidităţii aerului în

camere de creştere este de 80-85%, Scăderea umidităţii sub această valoare duce la

deshidratarea rapidă a mediului de cultură cu consecinţe grave asupra explantelor.

Page 27: Microinmultirea plantelor

27

Controlul factorilor de mediu în camera de creştere trebuie să fie făcut riguros,

acest lucru influenţând direct mersul culturilor. Pentru a urmări evoluţia temperaturii şi

umidităţii în camerele de creştere acestea sunt prevăzute cu termohigrometre.

Orice avarie trebuie semnalată imediat prin intermediul unor sisteme de avertizare

luminoase şi sonore.

2.2.8. Camera (spaţiile) de aclimatizare

Aclimatizarea este etapa cea mai dificilă în desfăşurarea procesului de

microînmulţire. Pentru reuşita acestei operaţii trebuie să se dispună de spaţii prevăzute cu

instalaţii eficiente de iluminare, încălzire şi umidificare a aerului.

În mod frecvent, în complexele industriale, aclimatizarea se face în solarii sau sere

speciale (Foto 2.10.).

Foto 2.10. Sera cu dubla protecţie, folosită la aclimatizarea

materialului microînmulţit (Vitroplant)

Cu cât controlul factorilor de mediu este mai bun, cu atât se reduc riscurile

pierderii de material în procesul aclimatizării. Dirijarea factorilor de mediu pe parcursul

fazei de aclimatizare este prezentată în subcapitolul 5.2.5.

Page 28: Microinmultirea plantelor

28

2.2.9. Sera şi solariile

Materialul aclimatizat este trecut apoi în solarii sau sere pentru a-şi desfăşura

primele faze de creştere înainte de livrare sau înainte de a fi folosit în câmp. Acest proces,

numit fortificare, are loc în structuri prevăzute cu sisteme de control al factorilor de

vegetaţie, în special umiditate şi temperatură (foto 2.11. şi 2.12.).

Mărimea suprafeţelor ocupate cu sere şi solarii depinde de cantitatea de material

înmulţit.

Foto 2.11. Seră folosită pentru fortificarea materialului aclimatizat (Vitroplant)

Foto 2.11. Viţă de vie în container fortificată într-un solar (Vitroplant)

Page 29: Microinmultirea plantelor

29

O soluţie economică de realizare a unei sere de dimensiuni mai reduse este

amplasarea acestei pe partea de sud a construcţiei care găzduieşte laboratorul. Acoperişul

se poate construi cu o singură pantă, unul din pereţi fiind reprezentaţi de peretele clădirii

(figura 2.2.).

2.2.10. Spălătorul

Spălătorul este o încăpere prezentă în orice fel de laborator de microînmulţire.

Aşa cum spuneam mai devreme de gardul de curăţenie depinde în bună măsură

sănătatea culturilor şi bunul mers al activităţii.

În spaţiul reprezentat de spălător se curăţă sticlăria şi celelalte componente ale

instrumentarului folosit pentru realizarea culturilor in vitro.

Încăperea trebuie să fie faianţată şi prevăzută cu instalaţii specifice de alimentare

cu apă, canalizare, alimentare cu curent electric şi eventual gaze.

În spălător trebuie să existe mai multe chiuvete (unele cu scurgător) alimentate cu

apă caldă sau rece. În lipsa unei instalaţii de apă caldă aceasta se poate obţine cu ajutorul

unui boiler electric sau cu gaze (tip Vaillant).

Pentru spălarea sticlăriei mai sunt necesare vase din plastic de diferite dimensiuni,

perii şi detergenţi.

Din spălător sunt nelipsite scurgătoarele de tot felul pentru vase mari, pentru vase

de cultură, pentru eprubete. Vor fi prezente şi recipiente cu amestec cromic folosit la

spălarea sticlăriei (atenţie, este puternic toxic şi coroziv, vezi subcapitolul 4.2.) şi

recipiente cu apă distilată folosită la clătire.

În laboratoarele de mari dimensiuni se folosesc perii electrice pentru uşurarea

spălării, sau chiar maşini şi instalaţii pentru spălat care efectuează toate operaţiile de

spălare, clătire şi uscare a sticlăriei.

După înlăturarea mediului de cultură din vase acestea se spală superficial în curent

de apă fierbinte şi se trec apoi într-un vas cu apă caldă cu detergenţi.

În cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea să fie autoclavate înainte

de a fi deschise pentru a se evita răspândirea infecţiei în laborator.

Vasele folosite pentru topirea mediului sau pentru distribuirea mediului cu agar

vor fi spălate imediat cu apă fierbinte pentru a se evita răcirea agarului şi fixarea pe pereţii

acestuia.

Page 30: Microinmultirea plantelor

30

Tehnologia modernă presupune şi existenţa unor maşini de spălat cu ultrasunete,

extrem de eficiente (foto 2.12.).

Foto 2.12. Maşină de spălat cu ultrasunete

După spălarea propriu-zisă, sticlăria se clăteşte în apă curentă şi este trecută într-

un alt vas cu apă distilată unde va fi lăsată timp de mai mult ore. Urmează apoi zvântarea

pe scurgătoare şi depozitarea în dulapuri speciale destinate acestui scop, până în momentul

folosirii.

Mediul de cultură şi celelalte resturi se vor colecta în pungi din plastic care se vor

lega şi duce în spaţii de colectare a gunoiului.

Pentru laboratoarele mici uneori spălătorul face parte integrată din camera de

pregătire a mediului de cultură

În aceleaşi situaţii, în spălător se poate face şi pregătirea materialului vegetal

pentru inoculare. Este vorba, în special de operaţiile de spălare, presterilizare şi eventual

fasonare a materialului.

În ceea ce priveşte organizarea activităţii de spălare a sticlăriei şi instrumentarului

în laborator trebuie precizat că în micile laboratoare nu există personal angajat special

pentru acest scop. De aceea trebuie instituită regula potrivit căreia fiecare din cei care

lucrează în laborator trebuie să lase în urma sa aşa cum a găsit, adică curat.

Fiecare îşi va spăla sticlăria folosită, o va depozita în locurile special destinate, în

ordine şi va curăţa spălătorul la terminarea activităţii.

Page 31: Microinmultirea plantelor

31

Tot în ansamblul de reguli după care trebuie organizată activitatea în laboratoarele

didactice şi de cercetare se înscrie şi planificarea acţiunilor pe zile şi persoane, realizându-

se astfel un flux continuu fără suprapuneri sau goluri.

2.3. Zona sterilă

"Inima" laboratorul de culturi in vitro este reprezentată de camera sterilă. În acest

spaţiu se execută toate operaţiile de sterilizare, inoculare şi transferuri pe mediul de cultură

în condiţii sterile.

Camera sterilă trebuie să fie ferită de orice sursă de praf şi murdărie. În acest sens

ferestrele vor fi prevăzute cu un sistem de filtrare iar dacă este posibil încăperea va avea la

intrare o cameră tampon.

Laboratoarele mai sofisticate au instalaţii de climatizare cu presiune pozitivă de

aer steril care împiedică pătrunderea prafului, sporilor sau altor forme ale agenţilor

patogeni din exterior.

În trecut sterilizarea spaţiului interior se realiza cu ajutorul unor lămpi cu

ultraviolete. Era apoi obligatorie aerisirea încăperii pentru eliminarea ozonului care se

formează. Cu această ocazie era posibil ca în încăpere să pătrundă din nou spori de

ciuperci, bacterii şi alte microorganisme, iar operaţia era ineficientă. În plus, ozonul este

toxic şi puternic mutagen şi creşte astfel riscurile expunerii personalului la accidente.

Componenta de bază a camerei sterile este hota (nişa) sterilă. Folosind un sistem

de filtrare complex hota creează, într-un spaţiu închis, un flux de aer steril care se

deplasează cu o anumită viteză spre operator.

Există mai multe tipuri constructive de hote care funcţionează pe acelaşi principiu:

împingerea cu ajutorul unor ventilatoare a aerului printr-o baterie de filtre, reţinerea

particulelor de praf şi a microorganismelor şi formarea unui flux de aer steril care iese din

incinta sterilă, "împiedicând în acelaşi timp pătrunderea aerului nesteril din exterior.

Cele mai folosite hote sterile sunt hotele cu flux laminar orizontal. Ele pot avea un

post de lucru, două sau mai multe (foto 2.13.)

Page 32: Microinmultirea plantelor

32

Foto 2.13. Hota sterilă cu flux laminar orizontal

Pentru lucrări în care se folosesc agenţi patogeni sau transformări cu

Agrobacterium tumefaciens se recomandă să se folosească hote sterile cu flux vertical care

împiedică răspândirea acestor microorganisme în exterior (foto 2.14.).

Foto 2.14. Hota sterilă cu flux vertical

În general, o hotă este alcătuită dintr-o baterie de ventilatoare în partea din spate,

prefiltre care reţin particulele de praf mai grosiere şi bateria de filtre bacteriologice care

reţine particule mai mari de 0,2 µm.

În partea din faţă hota prezintă o minicameră cu un perete liber alcătuit dintr-o

masă de lucru, acoperită cu tablă din inox, doi pereţi laterali transparenţi şi un sistem de

iluminare cu tuburi din neon în partea de sus.

Hotele de construcţie mai veche erau prevăzute şi cu lămpi de U.V. folosite pentru

sterilizare.

Page 33: Microinmultirea plantelor

33

În acelaşi timp hota prezintă una sau mai multe prize electrice pentru a asigura

sursa de curent pentru microscoape, lupe binocular, minibalanţe, incineratoare (Bacti-

Cinerator) sau sterilizatoare electrice pentru instrumentar (foto 2.15.).

Foto 2.15. Hotă modernă pentru lucrări de cercetare (Vitroplant)

Acolo unde există instalaţie cu gaz la hotă se ataşează 1-2 becuri Münsen cu gaz

pentru flambarea instrumentarului (foto 2.16.). Hota mai este dotată cu întrerupătoare

precum şi eventual cu un regulator de turaţie a ventilatorului care modifică viteza fluxului

de aer.

În timpul lucrului în hotă se vor găsi de asemenea, suporţi pentru instrumentar

steril, (ace, spatule, pense, bisturie etc.), un pulverizator cu alcool pentru dezinfecţia

exteriorului vaselor de cultură, a masei şi a mâinilor operatorului precum şi materiale

pentru închiderea vaselor de cultură (folie de aluminiu, folie autosigilantă, etc.).

Foto 2.16. Dotare minimală într-o hotă cu flux laminar steril

Page 34: Microinmultirea plantelor

34

În camera sterilă trebuie să mai existe scaune (eventual rotative, ergonomice, etc.)

măsuţe pentru depunerea vaselor cu medii, a vaselor folosite la sterilizarea materialului, a

sticlelor cu agenţi sterilizanţi şi apă, a materialului vegetal pregătit pentru sterilizare).

Foarte practice sunt măsuţele multietajate cu rotile care se pot deplasa uşor dintr-un loc în

altul (foto 2.17).

Foarte importante sunt lucrările de întreţinere a hotei. Acestea constau în primul

rând în curăţirea prefiltrelor cu ajutorul unor aspiratoare. Cele mai eficiente sunt cele care

funcţionează fără sac de praf, cu colectarea impurităţilor în apă (tip Rainbow).

În cazul folosirii intense, bateria de filtre trebuie schimbată anual.

Foto 2.17. Măsuţă multietajată cu rotile

În acelaşi timp, se va acorda o atenţie deosebită curăţeniei în camera sterilă. Zilnic

se va spăla podeaua cu apă şi detergenţi specifici, se vor şterge pereţii şi în general, se vor

înlătura orice surse posibile de praf.

La intrarea în camera sterilă se va schimba îmbrăcămintea şi încălţămintea,

aceasta din urmă fiind principala sursă de praf şi agenţi contaminanţi.

Înainte de începerea lucrului cu cel puţin 20-30 de minute, hota se porneşte pentru

a se steriliza interiorul incintei. De asemenea, se pulverizează alcool de 96% pe partea

interioară a acesteia şi pe vasele cu medii sau celelalte materiale care se introduc sub hotă.

Page 35: Microinmultirea plantelor

35

Capitolul 3

Mediile de cultură şi prepararea lor

Mediul de cultură reprezintă suportul fizic şi chimic necesar pentru creşterea şi

dezvoltarea explantelor in vitro.

Graţie unor cercetări minuţioase efectuate de-a lungul timpului un mare număr de

cercetători au formulat diferite reţete de medii folosite pentru diferite tipuri de culturi in

vitro la marea majoritate a speciilor vegetale.

Momentul de răscruce în acest domeniu l-a reprezentat anul 1962, când

T. Murashige şi F. Skoog au publicat reţeta de mediu care le poartă numele, realizată iniţial

pentru culturi de ţesuturi de tutun.

Acest mediu a fost apoi preluat cu succes în nenumărate situaţii, la cele mai diferite

specii, fiind în prezent cea mai folosită reţetă de mediu, alături de varianta modificată

Linsmaier&Skoog (LS, 1965). Diferenţa dintre cele două reţete constă în nefolosirea

acidului nicotinic, piridoxinei, glicinei şi creşterea concentraţiei de tiamină la 0,4 mg/l, în

cazul variantei modificate, LS.

Alte reţete de medii larg folosite sunt B5 (Gamborg şi colab. 1968), N6 (Chu,

1978), Nitsch&Nitsch (NN, 1969). Pentru cultura in vitro a speciilor pomicole dar şi a

altor plante lemnoase se folosesc mediile Quoirin&Lepoivre (QL, 1977), DKW

(Driver&Kuniyuki, 1984) şi WPM Lloyd and McCown, 1980).

Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură sunt:

- să corespundă cerinţelor nutritive şi hormonale ale speciei cultivate pentru faza în

care se găseşte (stabilizare, proliferare, calogeneză, înrădăcinare, etc.);

- să asigure condiţii optime de creştere şi dezvoltare în ceea ce priveşte presiunea

osmotică, pH-ul, umiditatea, etc.

- să fie echilibrat din punct de vedere ionic;

- să nu conţină ioni sau substanţe toxice;

- să fie uşor de preparat şi reproductibil;

- să fie stabil după autoclavare (să-şi menţină neschimbată compoziţia şi

caracteristicile fizico-chimice;

Page 36: Microinmultirea plantelor

36

- să fie ieftin şi să conţină cât mai puţini constituenţi naturali costisitori şi

neomogeni;

- eventual, să poată fi reciclat.

Mediile folosite la cultura in vitro a explantelor vegetale au în general o structură

complexă, fiind alcătuite dintr-un mare număr de constituenţi de natură diversă şi cu rol

diferit.

Aceşti constituenţi pot să fie grupaţi în:

- constituenţi cu rol nutritiv: elemente minerale: macro şi microelemente şi

elemente organice: zaharuri (ca sursă de carbon), aminoacizi (ca sursă de azot organic) şi

vitamine;

- constituenţi cu rol hormonal fitoregulator al creşterii şi dezvoltării explantelor in

vitro: auxine, citochinine, gibereline şi alte substanţe cu rol stimulator sau inhibitor: acid

abscisic, etilenă, colchicină, paclobutrazol, etc.

- constituenţi cu rol în stabilizarea mediului de cultură: apa, agenţi de solidificare,

stabilizatori osmotici şi de pH, antioxidanţi şi substanţe absorbante.

3.1. Constituenţi cu rol nutritiv

3.1.1. Constituenţi minerali

Substanţele minerale care intră în componenţa mediilor de cultură sunt săruri care

conţin cele 6 macroelemente fundamentale: azotul (N), fosforul (P), potasiul (K), calciul

(Ca), magneziul (Mg) şi sulful (S) precum şi un mare număr de microelemente: fier (Fe),

mangan (Mn), zinc (Zn), aluminiu (Al), bor (B), cupru (Cu), molibden (Mo), sodiu (Na),

cobalt (Co) şi iod (I).

3.1.1.1. Macroelementele

Concentraţia macroelementelor folosite variază în limite destul de largi, în mod

obişnuit, folosindu-se cantităţi de 1-40 mM, respectiv, 300-19.000 mg/l.

Microelementele se folosesc în concentraţii mult mai reduse de ordinul

micromolilor, respectiv 0,0025-0,5 mg/l.

În funcţie de concentraţia molară totală mediile de cultură se împart în trei

categorii:

- medii concentrate (36-50 mM): Murashige & Skoog, Quoirin & Lepoivre, Eriksson, etc.;

- medii cu concentraţie mijlocie (27-35 mM): Nitsch&Nitsch;

- medii cu concentraţie scăzută (7-26 mM): White, Heller;

Page 37: Microinmultirea plantelor

37

Foarte importantă este compoziţia ionică a mediilor de cultură ştiindu-se că în

soluţie sărurile disociază în ionii componenţi. Trebuie avut în vedere echilibrul acestor ioni

şi posibilitatea de a se combina şi de a forma compuşi toxici greu solubili sau insolubili.

În general toate mediile de cultură conţin următorii ioni: NH4+, K+, Ca2+, Mg2+,

Na+, NO3-, PO4

3-, SO42-, Cl-.

Prin folosirea preponderentă a sărurilor sub formă de cloruri creşte concentraţia

ionului Cl- care nefiind folosit în nutriţie, are efect toxic asupra explantelor determinând

clorozarea şi ulterior moartea acestora. Efecte similare are şi excesul de sodiu (Na+) din

mediul de cultură.

Dintre macroelemente un rol important este jucat de azot. Acesta este furnizat în

mediul de cultură prin folosirea azotaţilor de amoniu, potasiu, calciu, sodiu, etc.

În soluţie se găseşte atât azot sub formă nitrică (NO3-) cât şi sub formă amoniacală

(NH4+).

Rolul celor două forme de azot este diferit şi uneori cercetările efectuate au scos în

evidenţă rezultate contradictorii. Astfel, într-o primă fază, s.a afirmat că ionul amoniu

(NH4+) ar induce formarea embrionilor somatici la morcov spre deosebire de ionul nitrat

(NO3-) care nu ar avea acest efect (Halperin şi Wetherell 1967, citaţi de Cachiţă, 1987).

Totuşi experienţele lui Reinert şi colab. (1966), au dovedit că este posibilă

obţinerea de embrioni din ţesut de morcov pe un mediu care conţinea numai ioni nitrat

(NO3-).

Important este raportul în care se găsesc cei doi ioni în mediul de cultură. În marea

majoritate a reţelelor folosite, raportul NH4+/NO3

- este de 1/2-1/3, putând să ajungă la 1/5.

Azotul are un rol fiziologic deosebit de important, fiind indispensabil în

metabolismul proteic şi glucidic. Lipsa azotului sau carenţa acestuia determină acumularea

antocianilor în vacuole şi moartea rapidă a celulelor.

La salată, absenţa azotatului de amoniu din mediul de cultură a determinat formarea

calusului din cotiledoane fără a se obţine nici un fel de tip de regenerare.

Fosforul are şi el un rol important în metabolismul general al explantelor prin

formarea compuşilor nucleotizi cu valoare energetică ridicată (ADP şi ATP) care

realizează captarea, păstrarea şi eliberarea energiei chimice şi care sunt determinanţi în

biosinteza acizilor nucleici (Neamţiu şi colab. 1989).

Page 38: Microinmultirea plantelor

38

După azot, cea mai mare pondere o deţine potasiul (K). Acesta s-a dovedit a fi de

neînlocuit datorită rolului pe care-l are în reglarea permeabilităţii membranei celulare şi a

vâscozităţii protoplasmei. Este deosebit de activ în cadrul schimburilor de ioni la nivelul

membranelor celulare şi este cerut în cantităţi mai mari de către explantele tinere la nivelul

cărora determină activarea diviziunii celulare.

Carenţa potasiului se concretizează prin reducerea creşterii sau chiar involuţia

explantelor de tutun. La aceeaşi specie şi la viţa de vie, cultivarea pe medii bogate în

potasiu a avut ca efect stimularea creşterii explantelor (Heller 1947-1953, citat de Cachiţă,

1987).

Calciul este prezent în majoritatea mediilor de cultură sub formă de clorură de

calciu (CaCl2 .2H2O) sau azotatul de calciu (Ca(NO3)2 . 4H2O).

Alături de potasiu, calciul are un rol important în reglarea permeabilităţii

membranelor la nivel celular. Este cunoscut, de asemenea şi rolul antitoxic al calciului.

Având în vedere faptul că este solicitat în cantităţi mai mari în metabolismul

ţesuturilor senescente datorită acumulării în membrane, la culturile meristematice in vitro

nevoile de calciu sunt mult mai reduse.

Totuşi carenţa calciului determină necrozarea apexurilor la lăstarii cultivaţi in vitro

iar lipsa lui duce la moartea celulelor.

Mărirea concentraţiei de calciu din mediu prin adăugarea clorurii de calciu (CaCl2)

trebuie făcută cu discernământ pentru că peste anumite limite se manifestă toxicitatea

ionilor de clor (Cl-).

La cultivarea gutuiului pe un mediu Quiorin & Lepoivre (1977) bogat în calciu

apar uneori simptome de cloroză datorită blocării fierului (Stănică, 1996).

Magneziul intră în compoziţia clorofilei şi carenţa sa determină perturbări

importante în funcţionarea frunzei, ducând în final la moartea explantului.

Relaţia Ca-Mg este foarte strânsă, cele două macroelemente putându-se chiar

substitui în anumite reacţii metabolice.

Sulful intră în compoziţia multor aminoacizi esenţiali şi este nelipsit din mediile de

cultură unde se află în componenţa ionului sulfat (SO42-). Reducerea conţinutului de clor

din mediul de cultură prin înlocuirea clorurilor cu sulfaţi are ca efect o creştere a

concentraţiei sulfului.

Page 39: Microinmultirea plantelor

39

Anumite medii de cultură sunt foarte bogate în sulf: DKW pentru nuc (Driver şi

Kuniyuki, 1984), Litvay pentru conifere (Litvay şi Johnson, 1981).

3.1.1.2. Microelementele

Microelementele folosite în culturile in vitro sunt în număr mai redus faţă de cele

folosite în soluţiile nutritive complexe iar concentraţiile uzuale sunt asemănătoare pentru

majoritatea mediilor de cultură.

Dintre microelemente, fierul se administrează în cantităţi mai mari. Pentru a fi uşor

asimilabil se foloseşte chelatul de fier (NaFeEDTA) care se pregăteşte din sulfat feros

(FeSO4 . 7H2O) şi sare disodică a acidului etilen- diamino-tetraacetic (Na2EDTA . 2H2O).

Raportul dintre cei doi compuşi trebuie să fie de 1:2 adică, pentru 100 µM FeSO4 . 7H2O,

trebuie să se dizolve 200 µM de Na2EDTA.2H2O. Concentraţia uzuală a ionului Fe2+ este

în jur 100 µeq.

Excesul de fier bivalent (Fe2+) determină oxidarea acestuia la fier trivalent (Fe3+) şi

formarea de fosfat feric care precipită şi creşte turbiditatea mediului de cultură.

Fierul este catalizatorul multor procese redox şi are rol esenţial în fotosinteză, în

activitatea citocromilor respiratori şi în sinteza proteică.

Carenţa fierului se manifestă prin clorozarea ţesuturilor verzi şi blocarea

diviziunilor celulare în ţesuturile meristematice.

Manganul participă la o serie de activităţi enzimatice iar la conifere s-a dovedit că

poate înlocui într-o anumită proporţie, magneziul (Clarkson şi colab., 1980, citat de Enescu

V. şi colab. 1994). Are de asemenea un rol important în sinteza proteică.

Carenţa manganului determină blocarea sintezei ARN-ului în rădăcinile de mazăre.

Zincul este implicat în sinteza auxinei, a ARN-polimerazei şi a unor

dehidrogenaze. Lipsa acestuia determină dereglări în sinteza triptofanului (precursor al

auxinei endogene), îngălbenirea şi necroza ţesuturilor tinere.

Aluminiul folosit numai în anumite medii de cultură (Heller) în cantităţi foarte

mici are rol de catalizator al unor reacţii biochimice.

Borul este utilizat sub formă de acid boric (H3BO3) în concentraţii relativ ridicate

(1-10 mg/l). Rolul său preponderent se referă la reglarea proceselor de diviziune celulară şi

creştere.

Carenţa de bor se manifestă prin brunificarea şi necrozarea ţesuturilor.

Page 40: Microinmultirea plantelor

40

Cuprul participă la multe reacţii redox şi este foarte important în embriogeneză. Se

foloseşte sub formă de sulfat de cupru (CuSO4 . 5 H2O) în concentraţii de 0,025 mg/l (0,1

mM).

Molibdenul se pare că are un rol important în activitatea nitrat-reductazei. Alături

de iod intră în componenţa unor enzime şi participă la procesele nutriţionale ale

explantelor.

Cobaltul este folosit în concentraţii foarte scăzute sub formă de clorură de cobalt

(CoCl2 . 6H2O). Rolul său în metabolismul ţesuturilor vegetale in vitro este necunoscut, ca

de altfel cel al nichelului.

3.1.2. Constituenţi organici

3.1.2.1. Carbohidraţii

Carbohidraţii (zaharurile) sunt folosite în culturile in vitro ca sursă de carbon şi

energie, dat fiind faptul că explantele cultivate în astfel de condiţii au o nutriţie

preponderent heterotrofă.

Prin hidrolizarea carbohidraţilor celulele vegetale îşi procură cantitatea de energie

necesară desfăşurării proceselor vitale. Trebuie spus că glucidele produse prin fotosinteză

in vitro de către ţesuturile verzi nu satisfac nici pe departe nevoile energetice globale ale

acestora şi nevoia de componenţi structurali cum ar fi unele polizaharide (celuloza şi

amidonul).

Dintre zaharuri cel mai mult folosită este zaharoza în concentraţie de 2-3%. La

unele specii (Malus robusta) s-a folosit cu rezultate bune sorbitolul, în timp ce glucoza a

fost folosită tot la specii lemnoase în concentraţie de 3%. În diferite experimente s-au

folosit şi alte glucide cum ar fi: fructoza, maltoza, rafinoza sau chiar dextrina şi amidonul.

În cantităţi crescânde de la 1% la 3%, zaharoza a stimulat creşterea explantelor de

morcov (Gautheret, 1959), iar reducerea concentraţiei la 2-3%, a determinat alungirea

lăstarilor la pin, molid şi larice (Aitken, J. şi colab. 1981, citaţi de Enescu V. şi colab.

1994).

Trebuie precizat şi rolul important pe care îl au carbohidraţii în echilibrarea

presiunii osmotice a mediului de cultură. Creşterea concentraţiei de zaharoză peste anumite

limite are ca efect creşterea presiunii osmotice şi plasmolizarea celulelor explantelor.

Page 41: Microinmultirea plantelor

41

O serie de cercetători au pus problema faptului că mediile de cultură artificiale prin

concentraţia ridicată de carbohidraţi exercită o presiune osmotică "nenaturală" asupra

explantelor. De aici necesitatea unor studii privind posibilităţile de reducere a cantităţilor

de carbohidraţi din mediile de cultură precum şi găsirea altor substanţe cu rol similar

(ESNA WG4, Buşteni, 1996).

3.1.2.2. Aminoacizii

Aminoacizii sunt folosiţi în mediile de cultură şi ca surse suplimentare de azot

organic. Pe lângă aceasta s-a dovedit că ei au rol în diferite procese inductive.

Dintre aminoacizi, glicina este cel mai des folosită. Încă din 1939, White a subliniat

că glicina stimulează creşterea rădăcinilor de tomate (Cachiţă, 1987).

Gautheret (1959), de asemenea, subliniază rolul aminoacizilor în formarea

calusului. Alţi aminoacizi ca glutamina, arginina şi prolina stimulează proliferarea

calusului la pin (David H. şi colab. 1984).

S-a constatat că în cazul folosirii aminoacizilor, izomerii levogiri (L) sunt mai

eficienţi decât cei dextrogiri (D).

Dozele de folosire a aminoacizilor variază de la 2 mg/l pentru glicină, la 10 mg/l

pentru L-arginină şi cisteină şi până la 100 mg/l pentru asparagină şi L-tirozină.

3.1.2.3. Vitaminele

Vitaminele sunt substanţe organice cu rol catalitic indispensabile creşterii şi

dezvoltării explantelor in vitro.

Termenul de vitamină - amină vitală, a fost introdus pentru prima dată de către

Casimir Funk în 1911 şi ilustrează plastic importanţa deosebită pe care acest grup de

substanţe o are pentru organismele vii.

Spre deosebire de plantele din natură, ţesuturile şi organele cultivate in vitro nu au

capacitatea de a-şi sintetiza întreaga gamă de vitamine necesare desfăşurării în bune

condiţiuni a metabolismului.

La începuturile culturilor in vitro s-a constat că prin adăugarea în mediul de cultură

a unor substanţe naturale bogate în vitamine (lapte de cocos, sucuri de tomate şi banane,

extract de endosperm de cereale, lapte de porumb, extracte de drojdie)are loc stimularea

creşterii explantelor.

Page 42: Microinmultirea plantelor

42

Ulterior o serie de cercetători au realizat reţete proprii de vitamine prin combinarea

în diferite proporţii a vitaminelor cunoscute.

Trebuie precizat că majoritatea vitaminelor folosite sunt termosolubile iar prin

autoclavare are loc descompunerea acestora. Uneori produşii rezultaţi au la rândul lor un

efect favorabil asupra culturilor (Hoza D., 1996).

Ideal ar fi ca amestecurile de vitamine să se poate adăuga după autoclavarea

mediului folosind filtrarea sterilă. Pentru mediile solide acest lucru este însă neaplicabil,

fiind greu să se obţină difuzia vitaminelor în masa mediului.

Principalele vitamine folosite la prepararea mediilor de cultură sunt folosite solitare

sau, mai frecvent, în combinaţii mai mult sau mai puţin complexe.

Tiamina (vitamina B1, aneurina) este nelipsită din majoritatea reţetelor de vitamine

în concentraţii care variază de la 0,1 mg/l la amestecul de vitamine MS

(Murashige&Skoog), la 0,4 mg/l la amestecul Walkey 1 şi 2 până la 5 mg/l la amestecul

SH (Shenk şi Hidelbrandt), respectiv 10 mg/l la amestecul B5 (Gamborg).

În toate cazurile, agentul solubilizant al tiaminei este acidul clorhidric.

Acţiunea fiziologică a tiaminei constă în stimularea creşterilor vegetative şi deci

sporirea biomasei produse in vitro.

Piridoxina (vitamina B6) este de asemenea prezentă în marea majoritate a mediilor

de cultură. Concentraţiile folosite variază în general între 0,1-1 mg/l, folosindu-se şi de

această dată, ca agent de dizolvare acidul clorhidric. Se ştie că piridoxina este precursorul

unor coenzime importante catalizând reacţii de bază în metabolismul aminoacizilor.

Riboflavina (vitamina B2) este folosită doar în amestecurile de vitamine mai

complexe (ex. Jacquillot) în concentraţii de 0,1-1,0 mg/l. Este rezistentă la temperaturile

ridicate (se descompune la 280°C) şi la oxidanţi dar este sensibilă la radiaţiile U.V. Se

pare că acţionează ca inhibitor al creşterii rădăcinilor şi are rol important în metabolismul

celular.

Acidul pantotenic (vitamina B5) este mai puţin utilizat ca atare. Gautheret (1945)

precizează că acidul pantotenic stimulează creşterea calusului la salcie. O serie de

cercetători au folosit însă cu succes pantotenatul de calciu în concentraţii de 0,5-2,5 mg/l.

Acesta, este stabil termic până la temperaturi de 200°C şi nu este fotolabil.

Page 43: Microinmultirea plantelor

43

Cobalamina (vitamina B12) este mai rar folosită. În epoca de pionierat a culturilor

in vitro Reinert şi White (1956) citaţi de Gautheret (1959) au folosit-o cu bune rezultate la

creşterea ţesuturilor tumorale. Vitamina B12 stimulează sinteza nucleoproteidelor.

Acidul nicotinic (vitamina B3, niacina) aproape nelipsit din mediile de cultură,

este rezistent la temperaturi înalte (punct de topire 234-237°C). Este solubil în apă şi se

foloseşte în concentraţii de 0,5-5,0 mg/l. Are rol esenţial în metabolismul intermediar, în

reacţiile de oxido-reducere fiind component al dehidrogenazelor (NAD+ şi NADP+).

Biotina (vitamina H) este folosită în concentraţii reduse (0,1 mg/l). În soluţii acide

sau neutre este stabilă dar se descompune prin încălzire. Are rol de coenzimă intervenind

în numeroase procese metabolice. Stimulează creşterea ţesuturilor meristematice şi

proliferarea celulelor.

Acidul folic, folosit în concentraţii mici (0,01 mg/l în amestecul Jacquiot) are efect

stimulator asupra creşterii ţesuturilor la lumină. Acest lucru s-ar datora descompunerii sale

în acid para amino-benzoic. La întuneric acidul folic are efect toxic.

Acidul para aminobenzoic, întâlnit în câteva amestecuri complexe de vitamine, se

foloseşte în concentraţii de 1,0 mg/l. Este coenzima tirozinazei şi stimulează biosinteza

acidului pantotenic şi a biotinei.

Acidul ascorbic (vitamina C) se foloseşte în concentraţii ridicate (1,0-100,0

mg/l) de regulă ca agent antioxidant al polifenolilor eliminaţi de anumite specii la cultura

in vitro: stejar, măr, dafin (Stănică şi colab. 1994), fistic, etc.

Prin autoclavare, vitamina C se distruge în bună parte. Rolul fiziologic al vitaminei

C este complex, fiind un activator general al metabolismului celular.

Vitamina E (tocoferolul) favorizează reacţiile de fosforilare şi formare a

compuşilor macroergici, participând la numeroase sinteze enzimatice. În culturile in vitro,

vitamina E măreşte sensibilitatea celulelor la auxine (Enescu V. şi colab., 1994).

Inozitolul (mio-inozitol, mezo-inozitol, m-inozitol, hexahidroxi-ciclohexan) este

un aditiv esenţial al mediilor de cultură fiind considerat de unii autori, vitamină, iar de

către alţii, glucid.

Se foloseşte de regulă în concentraţii de 100 mg/l dar se cunosc şi situaţii când a

fost folosit în concentraţii de până la 1000 mg/l.

Deşi nu se cunoaşte prea bine rolul fiziologic al inozitolului, se pare că acesta ar

stimula diviziunea celulară. Folosit în concentraţii mari (250 mg/l) a stimulat creşterea

Page 44: Microinmultirea plantelor

44

calusului de Fraxinus pensylvanica (Wolter K.E. şi Skoog F. 1966, citaţi de Enescu V şi

colab. 1994).

Aditivii naturali, folosiţi la început ca substanţe complexe stimulatoare în culturile

in vitro (lapte de cocos, malţ, extracte din fructe, drojdie, endosperm, etc.), au fost

abandonaţi între timp. Acest lucru se datorează faptului că era imposibil de a se obţine o

compoziţie constantă a produselor respective, care să permită repetabilitatea mediilor de

cultură.

Un alt aditiv natural este cazeina hidrolizată, care nu este altceva decât un

complex de aminoacizi, putând fi încadrată în rândul substanţelor folosite ca sursă de azot

organic. Este folosită în concentraţii de 250 mg/l.

3.2. Constituenţi cu rol fitoregulator

Hormonii vegetali, regulatorii de creştere, stimulatorii sau substanţele de creştere

sunt compuşi organici, sintetizaţi de către plante în cantităţi foarte mici. Aceşti compuşi

stimulează, inhibă sau modifică creşterea şi dezvoltarea unor organe.

La plantele in vitro fitohormonii endogeni produşi de către explante sunt completaţi

şi complexaţi cu hormoni exogeni introduşi în mediul de cultură.

În funcţie de scopul urmărit se aleg tipurile de hormoni şi concentraţia optimă şi se

determină astfel, sensul evoluţiei explantului respectiv, ca rezultantă a acţiunii concertate a

acestora.

Istoria descoperirii hormonilor de creştere este oarecum paralelă cu cea a culturilor

in vitro. Descoperirea hormonilor şi studierea efectului lor asupra creşterii şi dezvoltării

plantelor a modificat radical evoluţia cercetărilor in vitro.

Primul care a intuit faptul că în plante ar exista substanţe care să controleze

metabolismul acestora a fost Charles Darwin. Abia în anul 1931 Kögl şi Haagen-Smit au

izolat din urina umană o substanţă pe care au denumit-o “auxina A”. Aceeaşi cercetători şi

folosind aceeaşi sursă au purificat apoi (1934) o altă substanţă denumită hetero-auxina,

care s-a dovedit a fi de fapt acidul α indolil acetic (AIA).

Ulterior, la sfârşitul anilor ‘30, Gautheret, Nobecourt şi White au studiat rolul pe

care îl are auxina în creşterea ţesuturilor in vitro.

Prima citochinină izolată a fost chinetina (6 furfurilaminopurina) obţinută din

spermă de heringi de către Miller şi colab. (1955). Doi ani mai târziu, Skoog şi Miller au

Page 45: Microinmultirea plantelor

45

publicat date despre efectul raportului citochinină/auxină asupra proceselor de

organogeneză.

După descoperirea şi izolarea primilor hormoni de creştere s-a trecut la etapa

următoare de sinteză a noi compuşi cu structură şi efect fiziologic asemănător.

În prezent, se cunosc cinci grupe mari de hormoni de creştere: auxine, citochinine,

gibereline, acid abscisic şi etilena.

3.2.1. Auxinele

Auxinele sunt, în marea lor majoritate, compuşi naturali sintetizaţi de către plante şi

acumulaţi în diferite organe, în concentraţii reduse. Auxinele sunt prezente mai ales în

mugurii terminali, frunze tinere şi vârfuri de lăstari. Paralel cu izolarea compuşilor auxinici

naturali s-au realizat compuşi de sinteză cu acţiune asemănătoare ca derivaţi ai iodului,

naftalenului, acidului fenoxiacetic şi acidului benzoic.

Acţiunea auxinelor este deosebit de complexă:

- intervin în procesele de diviziune şi elongaţie a celulelor, în concentraţii mici

stimulând diviziunea celulară, iar în concentraţii mari, alungirea;

- modifică permeabilitatea membranelor celulare modificându-le în acelaşi timp,

alte caracteristici fizice şi chimice;

- influenţează pozitiv sinteza proteică prin stimularea sintezei ARN-ului ribozomal;

- controlează procesele de dominanţă apicală, determinând inhibarea activităţii

mugurilor axilari;

- stimulează procesele de calusare şi ulterior determină formarea rădăcinilor.

- în doze ridicate determină apariţia de hipertrofii (simple deformări) sau

hiperplastii (tumori)

Principalele auxine folosite în culturile in vitro sunt prezentate în tabelul 3.2.1.

Sunt prezentate de asemenea, substanţele folosite pentru dizolvarea şi diluarea acestora,

temperaturile de păstrare şi limitele concentraţiilor uzuale.

Page 46: Microinmultirea plantelor

46

Tabelul 3.2.1.

Principalele auxine folosite în culturile in vitro

Specificaţie Masă molec. Solvent Diluant Păstrare

produs Păstrare soluţie

Conc. mg/l

AIA Acid β

indolilacetic

175,2

etanol NaOH

1N

apă

0°C

0°C

0,01-3,0

AIA-L- Acid aspartic

290,3 NaOH 0,5N

apă 0°C 0°C 0,01-5,0

AIA-L- Alanină 246,3 NaOH 0,5N

apă 0°C 0°C 0,01-5,0

AIA-L- Fenil-alanină

322,4 NaOH 0,5N

apă 0°C 0°C 0,01-5,0

AIA-L- Glicină 232,2 NaOH 0,5N

apă 0°C 0°C 0,01-5,0

IBA Acid

indolilbutiric

203,2

etanol NaOH

1N

apă

-

-0°C

0,1-10,0

K-IBA Acid indolil-

butiric, sare de K

241,3

apă

-

0-5°C

0-5°C

0,1-10,0

ANA Acid α naftilacetic

186,2

NaOH 1N

apă

temp. cam.

0-5°C

0,1-10,0

4-CPA Acid 4 clor-fenoxiacetic

186,6

etanol

apă

temp. cam.

0-5°C

0,1-10,0

Dicamba Acid 2 metoxi-

3,6-diclorbenzoic

221,0

etanol/

apă

apă

0-5°C

0-5°C

0,01-10,0

2,4-D Acid 2,4 diclor-

fenoxiacetic

221,0

etanol NaOH

1N

apă

temp. cam.

0-5°C

0,01-5,0

2,4,5 T Acid 2,4,5 triclor-

fenoxiacetic

255,5

etanol

apă

temp. cam.

0-5°C

0,01-5,0

Picloram Acid 4-amino-3,5,6-tricloro-

picolinic

241,5

DMSO*

apă

temp. cam.

0-5°C

0,01-10,0

* DMSO – dimetilsulfoxid

Aşa cum rezultă din tabelul 3.2.1. solvenţii folosiţi pentru dizolvarea auxinelor sunt

etanolul şi hidroxidul de sodiu (NaOH) 0,5-1,0 N. Temperaturile de păstrare a substanţelor

şi respectiv a soluţiilor stoc sunt prezentate în acelaşi tabel.

Stabilitatea auxinelor variază destul de mult. Astfel, AIA şi o bună parte din restul

auxinelor, sunt fotolabile, în timp ce ANA şi 2,4 D sunt mai stabile.

Page 47: Microinmultirea plantelor

47

3.2.2. Citochininele

Citochininele sunt substanţe deosebit de active, cu rol fitoregulator al proceselor de

creştere şi dezvoltare la plante.

Prima citochinină descoperită (Skoog, 1956) a fost izolată din spermă de heringi şi

denumită chinetină (6-furfuril-amino-purină). Aproximativ în aceeaşi perioadă s-a

descoperit rolul stimulator al laptelui de cocos asupra formării de noi plantule in vitro.

Ulterior s-a constatat că acest lucru se datorează faptului că laptele de cocos era bogat în

citochinine naturale.

Efectele citochininelor asupra explantelor cultivate in vitro sunt multiple:

- stimulează diviziunea celulară;

- au rol esenţial în formarea şi creşterea lăstarilor;

- au rol important în procesele de regenerare adventivă a lăstarilor (organogeneză

directă);

- formarea rădăcinilor este în general inhibată sub acţiunea citochininelor;

- stimulează de asemenea formarea lăstarilor axilari şi creşterea ratei de

multiplicare;

- întârzie procesele de senescenţă şi determină creşterea conţinutului de clorofilă în

explante.

Acţiunea citochininelor se corelează cu cantitatea de auxine prezente în mediu.

Astfel spus, este esenţial raportul auxine:citochinine în determinarea şi reglarea unor

procese vitale de creştere şi dezvoltare a explantelor.

Principalele citochinine şi substanţe cu efect similar folosite în culturile in vitro

sunt prezentate în tabelul 3.2.2.

Dintre acestea BAP (6 benzil-amino-purină) sau BA (benziladenina) este cel mai

mult folosită.

Zeatina, produs bioactiv izolat din porumb, are o activitate fitoregulatoare

importantă. La actinidia a stimulat formarea unui număr mare de lăstari adventivi din

explante de rădăcină, internod, frunză (organogeneză directă) şi calus (organogeneză

indirectă).

Efecte asemănătoare are şi 2 iP (2 izopentiladenina), DPU (difenil ureea),

tidiazuronul (1 fenil-3-(1,2,3, tiadiazolpentil) uree), CPPU (N-2-cloro 4 piridil N-fenil-

urea), care la fel ca şi zeatina sunt substanţe foarte costisitoare.

Page 48: Microinmultirea plantelor

48

Toţi aceşti derivaţi ai fenil-ureei determină lăstărirea adventivă puternică la diferite

tipuri de explante şi specii, efectul fiind mult mai puternic decât al citochininelor “clasice”,

chiar la concentraţii inferioare.

Datorită efectelor spectaculoase a devenit chiar o modă folosirea tidiazuronului în

cercetări cât se poate de diverse.

Există şi autori (Horgan, 1986) citat de Pierik (1987) care susţin că derivaţii fenil-

ureei (DPU) inhibă de fapt activitatea citochinin oxidazei şi în acest fel concentraţia

citochininelor rămâne ridicată iar activitatea este mai intensă.

Adenina a fost folosită pentru prima dată de Skoog şi Tsui în 1948, observându-se

efectul de stimulare a formării lăstarilor adventivi pe explante de tulpină de tutun.

Concentraţia la care este folosită variază destul de mult între 2-120 mg/l. Frecvent adenina

este înlocuită cu hemisulfatul de adenină care este mult mai solubil în apă.

Sunt prezentate de asemenea, substanţele folosite pentru dizolvarea şi diluarea

acestora, temperaturile de păstrare şi limitele concentraţiilor uzuale.

Tabelul 3.2.2.

Principalele citochinine folosite în culturile in vitro

Specificaţie Masă molec. Solvent Diluant Păstrare

produs Păstrare soluţie

Conc. mg/l

Adenină 135,1 apă Na temp. cam.

0-5°C 50-250

Adenină sulfat

184,2 apă Na temp. cam.

0-5°C 50-250

BAP (BA) 6-Benzil-

aminopurină (Benziladenină)

225,3

NaOH

1N

apă

temp. cam.

0-5°C

0,1-5,0

BAR Benzilamino-purină ribozid

357,4

NaOH

1N

apă

0°C

0°C

0,01-5,0

BPA N-benzil-9-

(2-tetrahidro-piranil)-adenină

309,4

NaOH

1N

apă

0°C

0°C

0,1-5,0

Chinetină 6 furfuril-

aminopurină

215,2

NaOH

1N

apă

0°C

0°C

0,1-5,0

KR Chinetină ribozid

347,3 NaOH 1N

apă 0-5°C 0-5°C 0,01-5,0

4 CPPU N-2-clor-4-piridil-N-feniluree

247,7

DMSO*

apă

0-5°C

0-5°C

0,001-0,1

DPU Difeniluree

212,3 DMSO apă temp. cam.

0-5°C 0,1-1,0

Page 49: Microinmultirea plantelor

49

Tabelul 3.2.2. continuare Specificaţie Masă

molec. Solvent Diluant Păstrare

produs Păstrare soluţie

Conc. mg/l

2 iP 2 izopentil-

adenină

203,2

NaOH

1N

apă

0°C

0°C

1,0-30,0

2 iPR 2 izopentil-

adenină ribozid

335,4

NaOH

1N

apă

0°C

0°C

0,01-10,0

Specificaţie Masă molec.

Solvent Diluant Păstrare produs

Păstrare soluţie

Conc. mg/l

Tidiazuron 1 fenil-3-(1,2,3-tidiazolpentil)

uree

220,2

DMSO

apă

temp. cam.

0-5°C

0,001-0,05

Zeatină 219,2 NaOH 1N

apă 0°C 0°C 0,01-5,0

* DMSO – dimetilsulfoxid

3.2.3. Giberelinele

Giberelinele sunt substanţe hormonale mai puţin folosite în culturile in vitro.

Prima giberelină a fost descoperită în 1926 de către Kurosawa ca produs al

ciupercii Giberella fujikuroi. În prezent se cunosc un număr mare de gibereline

(aproximativ 50) notate cu GA1…….GAn.

Dintre acestea cel mai mult folosit este acidul giberelic – GA3 (tabelul 3.2.3). Prin

autoclavare, 90% din activitatea biologică a GA3 se pierde, motiv pentru care este nevoie

ca sterilizarea acestuia să se facă prin filtrare.

Rolul fiziologic al giberelinelor nu este pe deplin cunoscut. Se ştie că ele au ca

efect:

- stimularea alungirii lăstarilor, fiind recomandate în acest sens după stabilizarea

culturii de meristeme pentru formarea noilor lăstari;

- înlăturarea dormansului la seminţe şi embrioni şi stimularea germinării;

- reglarea formării auxinelor endogene;

- controlul proceselor de formare a florilor dar şi a fructelor partenocarpice etc.;

- inhibarea formării lăstarilor şi rădăcinilor adventive.

Page 50: Microinmultirea plantelor

50

Tabelul 3.2.3.

Gibereline şi alţi fitoregulatori folosiţi în culturile in vitro

Specificaţie Masă molec. Solvent Diluant Păstrare

produs Păstrare soluţie

Conc. mg/l

GA3 - Acid giberelic

246,4 etanol apă temp. cam.

0-5°C 0,01-5,0

ABA - Acid abscisic

264,3 NaOH 1N

apă 0°C 0°C 0,1-10,0

Acid t-cinamic 148,2 etanol/acetonă

apă temp. cam.

0-5°C 0,1-10,0

Acid succinic 160,2 apă Na 0-5°C 0-5°C 0,1-10,0 Floro-glucinol 126,1 apă Na temp.

cam. 0-5°C <162,0

Triacontanol 438,8 eter/ benzen

apă 0-5°C 0-5°C

Colchicină 399,4 apă Na temp. cam.

0-5°C

3.2.4. Alte substanţe cu rol fitoregulator

Pe lângă auxine, citochinine şi gibereline se cunosc o gamă largă de substanţe cu

rol fitoregulator, dintre care o bună parte sunt folosite şi în culturile in vitro.

În tabelul 3.2.3. se prezintă câteva dintre aceste substanţe.

Acidul abscisic este cunoscut ca inhibitor al creşterii şi dezvoltării plantelor,

determinând intrarea acestora în repaus.

Folosirea lui la culturile in vitro este limitată datorită efectelor negative pe care le

are. Există totuşi situaţii când, utilizat în concentraţii reduse, poate regla creşterea şi

dezvoltarea explantelor în primele faze ale embriogenezei somatice.

Etilena este produsă de celulele, ţesuturile şi organele cultivate in vitro. În mod

normal nu se folosesc tehnici prin care acest gaz (C2H4) să fie introdus din exterior în

vasele de cultură.

Problema care se pune însă este tocmai reducerea cantităţii de etilenă care se

acumulează în atmosfera vaselor de cultură prin folosirea unor sisteme de închidere care să

permită difuzia acesteia în exterior.

Efectele etilenei în cele mai multe situaţii sunt negative:

- determină oprirea creşterii explantelor;

- induce fenomenul de senescenţă şi determină căderea frunzelor;

- determină inhibarea procesului de embriogeneză somatică.

Există totuşi numeroase studii care au dovedit că etilena poate stimula anumite

procese biologice sau că, creşterea concentraţiei de etilenă din vasele de cultură a coincis

Page 51: Microinmultirea plantelor

51

cu inducţia sau stimularea acestora. Astfel, se ştie că după divizarea calusului cantitatea de

etilenă produsă este mai mare.

La calusul de tutun odată cu creşterea concentraţiei de etilenă la lumină, a avut loc

şi formarea de lăstari adventivi (organogeneza indirectă).

La explantele de bulbi de crin prin creşterea concentraţiei de etilenă s-a stimulat

diferenţierea de bulbi adventivi (organogeneza directă). De asemenea, prin mărirea

concentraţiei de CO2 şi etilenă s-a constatat o creştere a numărului de lăstari adventivi pe

cotiledoane de Pinus radiata.

Se pare că o anumită concentraţie de etilenă este necesară şi pentru inducţia

diviziunii în suspensiile celulare la Acer. Se cunoaşte că etilena este implicată în

transportul auxinelor. Totodată, 2,4 D induce formarea etilenei în timp ce azotatul de

argint, poate fi folosit pentru inhibarea sintezei de etilenă.

Acidul 2 cloretilfosfonic (ACEP) se descompune în etilenă şi acid fosforic. În

horticultură este folosit sub denumirea comercială de Ethrel sau Ethephon cu 40%

substanţă activă.

Cercetările privind efectele ACEP asupra culturilor in vitro sunt numeroase

(Cachiţă, 1987). În general această substanţă este folosită în mediul de cultură pentru rolul

de precursor de etilenă pe care îl are.

Folosind ACEP în culturile de meristeme la garoafe în concentraţii de 0,1 şi 1,0

mg/l s-a observat formarea unui mare număr de muguri dintr-un singur meristem (Cahiţă,

1987). Efecte stimulatoare au fost observate de către aceeaşi autoare la minibutaşii de

crizanteme, gerbera, cartof şi protocormul de Cymbidium.

Floroglucinolul este un compus fenolic folosit de regulă ca inhibitor al auxin

oxidazei (AIA-oxidazei). Aplicat împreună cu auxinele determină stimularea formării

rădăcinilor adventive datorită efectului sinergic care apare. În lipsa auxinelor,

floroglucinolul stimulează formarea lăstarilor adventivi.

Colchicina se foloseşte în special atunci când se urmăreşte mărirea gradului de

ploidie prin dublarea numărului de cromozomi.

Amestecurile de substanţe de origine vegetală au fost folosite mai frecvent la

începuturile perioadei moderne a culturilor in vitro.

Amestecuri ca: laptele de cocos, sucul de tomate, portocale, ananas, seva de

mesteacăn, piureul (praful) de banane, extractele de drojdie, de endosperm de cereale etc.,

Page 52: Microinmultirea plantelor

52

au dovedit efecte stimulatoare asupra creşterii şi dezvoltării explantelor in vitro datorită

compoziţiei complexe pe care le au.

Principalul inconvenient pe care îl prezintă aceste amestecuri este compoziţia

variabilă de la caz la caz, fapt care face ca rezultatele obţinute să nu fie repetabile în alte

condiţii.

Firmele producătoare oferă astfel de amestecuri condiţionate sub formă de praf,

suspensii sau soluţii. De exemplu, pudra de banane poate fi folosită în concentraţii de 40

g/l, în timp ce laptele de cocos în concentraţii de 5-20%.

Laptele de cocos poate fi obţinut şi în laborator printr-o pregătire sumară după

extragerea din nuci. Astfel, după o prealabilă filtrare se face sterilizarea acestuia prin

autoclavare timp de 15 minute la 121°C. Se lasă apoi să se răcească şi a doua zi este din

nou filtrat şi păstrat, până în momentul folosirii, în congelator la –20°C. Eventualele

proteine care precipită sunt îndepărtate ulterior prin filtrare.

3.3. Constituenţi cu rol stabilizator

3.3.1. Apa

Apa este unul dintre componenţii cei mai importanţi ai mediilor de cultură, ea

reprezentând în jur de 95% din volumul acestora. Element vital, apa mediază majoritatea

proceselor metabolice care au loc în explantele cultivate in vitro.

În vasele de cultură, apa urmează un circuit relativ închis, în sensul că este

preluată de către explante, eliminată prin transpiraţie în atmosferă, se condensează în bună

parte pe pereţii vaselor sau la suprafaţa mediului şi reintră în circuit.

Condensarea apei pe capace şi pe pereţii vaselor de cultură este mai accentuată în

camerele de creştere în care poliţele rafturilor sunt încălzite de lămpile fluorescente aflate

dedesubt (în caz de izolare necorespunzătoare).

Pierderile de apă din vasele de cultură sunt ceva mai mari în camerele de creştere

neclimatizate şi cu umiditatea aerului redusă. În acest caz, se constată în timp o

deshidratare a mediului vizibilă prin scăderea pronunţată de volum şi apariţia de crăpături

în mediu.

Page 53: Microinmultirea plantelor

53

Acest lucru este cu atât mai periculos cu cât, în

paralel, are loc creşterea concentraţiei în săruri şi zaharuri

a mediului şi deci creşterea presiunii osmotice a

mediului.

Apa folosită pentru prepararea mediilor de

cultură trebuie să fie în mod obligatoriu distilată. Mai

mult, se recomandă folosirea apei bidistilate care prezintă

un grad de puritate superior. Distilarea trebuie făcută în

distilatoare din sticlă (tip Pyrex) întru-cât distilatoarele

metalice pot elibera diferiţi ioni (Cu2+, Pb2+) în procesul

de distilare (foto 3.1.).

Chiar distilatoarele din sticlă trebuie spălate

foarte bine când sunt noi şi de regulă, apa rezultată din

primele 2-3 distilări nu se foloseşte.

În timpul exploatării, periodic, se va proceda la

spălarea cu acurateţe a distilatorului cu apă deionizată.

Apa deionizată se obţine cu ajutorul unor aparate speciale numite deionizatoare,

prevăzute cu cartuşuri filtrante speciale care reţin ioni existenţi în apa de robinet.

Pentru o deionizare mai eficientă debitul de apă lăsat să treacă prin deionizator

trebuie să fie cât mai mic posibil. Se impune, de asemenea, înlocuirea periodică a filtrelor.

Trebuie spus că pe lângă deionizare şi distilare, există şi alte procedee de

purificare a apei, cum ar fi de exemplu, osmoza inversă. Ideal este însă să se combine toate

cele trei proceduri.

Atunci când se ştie că apa de la reţea este încărcată cu ioni de tot felul (Pb2+, Ca2+,

Mg2+ etc.), chiar cu germeni, sau că ea provine din foraje şi este bogată în săruri, se

recomandă ca la intrarea în laborator să se monteze o instalaţie de filtrare. O astfel de

instalaţie presupune montarea unei baterii de cartuşe filtrante alese în funcţie de

compoziţia chimică a apei şi conţinutul acesteia în suspensii, germeni etc. Există filtre

pentru săruri de Ca, de Mg, filtre cu cărbune pentru germeni, etc.

Pe lângă faptul că intră în componenţa mediilor de cultură, apa mai este folosită în

procesul de sterilizare a materialului vegetal înainte de inoculare.

În acest scop se foloseşte apa bidistilată care se autoclavează în prealabil şi care se

foloseşte la clătirea materialului vegetal după dezinfecţia cu diferiţi agenţi sterilizanţi.

Foto 3.1. Aparat din sticlă

pentru bidistilarea apei

Page 54: Microinmultirea plantelor

54

De asemenea după clătire, explantele rămân în recipiente cu apă distilată sub hotă

până în momentul inoculării.

Atunci când se lucrează cu explante provenite de la specii care emit uşor fenoli se

recomandă dizolvarea în apă distilată sterilă a unor substanţe antioxidante. Frecvent se

foloseşte polivinilpirolidona (PVP) în concentraţie de 0,1%.

În încheiere trebuie precizat că apa deioniozată şi bidistilată produsă în laborator

trebuie păstrată în recipiente din plastic etichetate şi închise. Sticla obişnuită nu se

recomandă pentru că ea elimină ioni nedoriţi de plumb, sodiu, arsenic, etc.

3.3.2. Agenţii de solidificare

Mediile de cultură folosite pentru creşterea explantelor in vitro se pot realiza sub

formă lichidă sau solidă (de fapt semisolidă).

Mediile solide necesită adăugarea unor agenţi de solidificare care leagă apa şi

absorb celelalte componente ale mediului.

Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească un bun agent de solidificare sunt:

- să fie inert şi să nu fie contaminat; să permită circulaţia (difuzia) substanţelor

minerale, apei, gazelor; să fie stabil după autoclavare; să aibă un punct de

solidificare scăzut; să fie ieftin; eventual, să poată fi recuperat şi refolosit.

Dintre agenţii de solidificare, agarul este cel mai larg folosit la culturile in vitro şi

nu numai.

Agarul este un polizaharid obţinut din alga roşie Gelidium amansii care trăieşte în

Oceanul Indian şi Marea Chinei.

Se prezintă sub formă unei pulberi galbenă murdară care se topeşte în apă la o

temperatură apropiată de 100°C, soluţia devenind translucidă şi se întăreşte la o

temperatură de 32-35°C. Se foloseşte în concentraţie de 0,6-1,0%. Cel mai bun agar este

cel produs de firma Difco Bacto (Noble agar). Există şi sortimente speciale cum ar fi

agarul bacteriologic, agarul tip A, E, M, agarul purificat, agarul spălat, folosite în lucrări

speciale de microbiologie, culturi de celule şi protoplaşti.

În lipsa agarului pulvis se poate folosi şi agarul sub formă de solzi sau plăci care

trebuie înmuiat în apă şi spălat repetat cu apă bidistilată, întru-cât este mai puţin pur.

Agaroza este formată tot din coloizi marini, prezintă un grad înalt de purificare şi

este folosită pentru culturi de protoplaşti sau de celule. Gelifică la mai puţin de 30°C (26-

30°C) fiind utilizată la prepararea mediilor cu compuşi termolabili.

Page 55: Microinmultirea plantelor

55

Acidul alginic este un acid poliuronic (acidul anhidro β-D-manuronic) care are

capacitatea de a se gelifica. Este ideal pentru culturi de protoplaşti şi suspensii celulare dar

şi pentru încapsularea embrionilor somatici sau a explantelor de diferite feluri în vederea

obţinerii seminţelor artificiale. Soluţiile apoase de acid alginic se gelifică la temperatura

camerei în prezenţa unor cationi (în special a calciului). Lichefierea mediului gelificat se

poate realiza prin adăugarea unor agenţi de chelatare (ex. citraţii).

Formarea capsulelor de alginat pentru încapsularea protoplaştilor sau embrionilor

somatici se face prin adăugarea în prealabil a acidului alginic (1,75-4,00%) într-o soluţie

cu concentraţie scăzută de calciu (2mM). După amestecare se face sterilizarea prin filtrare

(0,45 µm) sau autoclavarea.

Odată obţinut alginatul, se introduc explantele timp de 1-2 secunde, după care una

câte una acestea sunt trecute într-o soluţie de CaCl2 (50 mM) unde vor rămâne timp de 45

de minute pentru formarea capsulei.

Phytagelul (Gelrite) este un heteropolizaharid natural obţinut prin purificare dintr-

un substrat bacterian şi format din acid glucuronic, ramnoză şi glucoză. Este cunoscut şi

sub numele de gumă Gellan. Produce un gel dens, perfect limpede, la o concentraţie de

doar 1,5-2,0%. Se gelifică în soluţie apoasă la 27-31°C. Uneori determină apariţia

vitrificării

Agargelul este un amestec agar + phytagel care îmbină calităţile celor doi

componenţi. În concentraţie de 0,35-0,50% produce un gel semitransparent mult folosit

pentru detectarea contaminărilor. În acelaşi timp este cunoscut pentru reducerea

vitrificărilor. Este mai ieftin ca agarul normal. Se gelifică la 26-28°C.

Transfergelul conţine hidroxietilceluloză şi se obţine prin sinteză. Este folosit în

concentraţie de 2,5% pentru încapsularea embrionilor somatici, a minibutaşilor şi

apexurilor precum şi în tehnicile de “seed drilling” (semănare în flux lichid). Împreună cu

soluţiile nutritive cu care se amestecă formează un amestec vâscos care se autoclavează.

Prin autoclavare pH-ul soluţiei scade cu 0,5-1 unităţi. Pentru autoclavare trebuie folosite

recipiente cu volum de 4 ori mai mare decât cel al soluţiei care conţine Transfergel.

Pe lângă substanţele prezentate mai sus se mai pot folosi şi alţi agenţi solidificanţi

de tipul gelatinei (10%), biogelurilor (Biogel P 200), silicagelurilor sau gelurilor de

poliacrilamidă folosite în tehnicile de electroforeză a proteinelor. Nici unul din aceste

Page 56: Microinmultirea plantelor

56

produse nu pot concura însă agarul. Compoziţia chimică a câtorva agenţi solidificanţi este

prezentată în tabelul 3.3.1. (Sigma Plant Culture, 1994, Catalogue).

Tabelul 3.3.1.

Compoziţia chimică a câtorva agenţi solidificanţi (%)

Cenuşă Ca Mg K P Na

Agar 2-5 0,30 0,10 0,01 0,01 0,5

Agar bacteriologic 3-7 0,17 0,09 0,80 - 3,1

Agar tip A 5-6 0,01 0,01 0,1 0,17 1,8

Agar tip E 3-4 0,02 0,02 0,07 0,13 1,2

Agar tip M 3-6 0,09 0,14 0,07 0,01 1,4

Agar consistent 3-4 0,03 0,00 0,07 0,09 0,72

Agar purificat 2,0 0,02 0,01 0,01 0,01 0,35

Agar spălat 2,2 0,15 0,08 - - 0,38

Agaroză <1 - - - - -

Acid alginic - 0,17 0,01 2,3 - 10,1

AgargelTM 4-5 0,25 0,06 0,04 0,08 1,05

PhytagelTM 9,5 0,85 0,35 1,70 0,15 0,45

3.3.3. Stabilizatorii osmotici şi de pH

Prin combinarea unor cantităţi diferite de substanţe minerale şi organice (în

special zaharuri) se obţin medii de cultură care au potenţiale osmotice diferite.

Calcularea potenţialului osmotic al unui mediu de cultură este destul de dificilă

fiind nevoie de o cunoaştere exactă a maselor moleculare şi gradului de disociere a

sărurilor folosite. Mult mai simplă este însă măsurarea potenţialului osmotic şi eventual

corectarea acestuia.

Zaharurile au în general o pondere mai mare în determinarea potenţialului osmotic

al unui mediu faţă de sărurile minerale.

Yoshida şi colab. (1973), citat de Pierik (1987), a demonstrat cât de diferită este

contribuţia celor două grupe de compuşi la formarea potenţialului osmotic al mediului de

cultură (tabelul 3.3.2.).

Page 57: Microinmultirea plantelor

57

Tabelul 3.3.2. Ponderea sărurilor minerale şi zaharurilor în realizarea

potenţialului osmotic al mediului de cultură Potenţialul osmotic

Săruri minerale Zaharuri Mediul de cultură bari % din total bari % din

total White 0,43 22,75 1,46 77,25 Hildebrandt 0,67 31,45 1,46 68,55 Heller 0,96 19,16 4,05 80,84 Murashige&Skoog 2,27 50,78 2,20 49,21

Dacă potenţialul osmotic depăşeşte valoarea de 3 bari, activitatea explantului

încetează datorită imposibilităţii folosirii apei din mediu.

Creşterea potenţialului osmotic al mediului, atunci când este necesar, poate fi

făcută prin adăugarea de manitol, iar mai nou, de polietilenglicol (PEG), până la atingerea

valorii dorite.

Un alt element important al mediului de cultură este pH-ul acestuia. În mod

obişnuit pH-ul mediului de cultură trebuie să aibă valoarea 5,5. Oricum se pot folosi şi

medii de cultură cu valori ale pH-ului cuprinse între 5,0-6,5.

Scăderea valorii pH-ului sub 5,0 aduce după sine o serie de probleme:

- mediul nu se solidifică;

- AIA şi GA3 devin instabile;

- vitamina B1 şi acidul pantotenic se descompun;

- anumite săruri precipită.

Nici pH-ul prea ridicat (peste 7,0) nu este admisibil datorită blocării fierului,

apariţiei clorozei şi altor dezechilibre fiziologice.

Oricum rolul valorii pH asupra creşterii şi dezvoltării explantelor in vitro este mai

puţin cunoscut. Într-o experienţă de calogeneză şi organogeneză indirectă la specii şi

hibrizi din genul Actinidia s-au obţinut rezultate superioare pe mediul cu pH-7 faţă de

varianta cu pH 5,5 (Stănică F. şi colab., 1994, Stănică F., 1998).

Se ştie că în urma autoclavării valoarea pH a mediului scade cu 0,3-0,5 unităţi. De

asemenea, valoarea pH poate scădea în timpul unei subculturi cu 0,5 unităţi (Skirvin şi

colab. 1986, citat de Pierik 1987).

Page 58: Microinmultirea plantelor

58

Ţinând cont de aceste modificări la prepararea mediului de cultură valoarea pH

trebuie corectată prin titrare cu soluţii de baze (NaOH, KOH 0,1N) sau de acizi (HCl sau

acizi organici 0,1N) până la valoarea dorită.

Corectarea valorii pH se va face după aducerea la volum cu apă distilată a

mediului înaintea adăugării agarului şi zaharozei. Unii autori recomandă corectarea pH-

ului după introducerea zaharozei şi înainte de introducerea agarului.

3.3.4. Substanţele antioxidante şi absorbante

Una din problemele care apar în timpul cultivării in vitro a explantelor vegetale

este emisia de fenoli şi oxidarea rapidă a acestora având ca efect brunificarea mediului de

cultură şi blocarea creşterii.

Pentru prevenirea acestui fenomen la speciile cu predispoziţie, se recurge la

folosirea unor substanţe antioxidante, fie pentru tratarea explantelor înainte de inoculare,

fie chiar pentru introducerea în mediul de cultură.

Acidul ascorbic (vitamina C) intră mai rar în compoziţia unor amestecuri de

vitamine, fiind însă folosit ca antioxidant în doză de 1-100 mg/l. Prin autoclavare acidul

ascorbic se descompune şi de aceea el se va steriliza numai prin filtrare (0,22 µm).

Acidul citric se foloseşte frecvent ca antioxidant în cantitate de 150 mg/l în

amestec cu acidul ascorbic. Soluţia astfel obţinută poate fi folosită pentru îmbăierea

explantelor timp de 5-30 minute după secţionare şi înainte de inoculare.

Polivinilpirolidona (PVP) este un antioxidant larg folosit în culturile in vitro.

Acest polimer are capacitatea de a absorbi substanţele din grupa fenolilor reducând astfel

oxidarea acestora. PVP se poate introduce în mediul de cultură în cantitate de 250-1000

mg/l sau poate fi adăugat în apa distilată sterilă la clătirea explantelor în procesul

sterilizării şi la păstrarea acestora până la inoculare (0,1%).

DIECA (dietil-ditiocarbonat) este folosită de asemenea în apa de clătire a

explantelor în concentraţii de 2 g/l pentru reducerea oxidării. DIECA este nelipsită de la

protejarea împotriva oxidării a zonelor secţionate la realizarea microaltoirii in vitro sau “ex

vitro” (vezi subcapitolul 6.2.).

Efect antioxidant au şi alte substanţe cum ar fi tioureea şi diferiţi aminoacizi: L-

cisteina, glutamina, arginina şi aspargina care însă sunt mai puţin folosite în acest scop.

Page 59: Microinmultirea plantelor

59

Cărbunele activ este obţinut prin carbonizarea la temperaturi ridicate a lemnului

în prezenţa aburului. Se obţine astfel o structură microporoasă caracterizată printr-o

capacitate foarte mare de a absorbi o serie de compuşi din mediul de cultură. Cărbunele

vegetal are o mare capacitate de reţinere a 5 hidroximetilfurfurolului (inhibitor de creştere

care apare datorită descompunerii zaharozei în timpul autoclavării), a unor fenoli sau

tanini (care sunt responsabili de procesul de brunificare), a unor auxine, citochinine, a

etilenei, a unor vitamine şi a chelaţilor de Fe şi Zn.

Acţiunea pozitivă a cărbunelui activ a fost observată în special la conifere în

procesele de alungire a lăstarilor la pinul maritim, Sequoia, dar şi la Clematis (Gâlă şi

colab. 2003) (foto 3.2.). De asemenea, s-au obţinut rezultate superioare la folosirea

cărbunelui activ, în embriogeneza somatică la Anemone şi Nicotiana.

Foarte frecvent, cărbunele activ este folosit în faza de înrădăcinare a explantelor

pe medii fără hormoni, în concentraţie de 0,2-0,3%, datorită efectului benefic materializat

prin absorbţia unor produşi de secreţie dar mai ales prin crearea întunericului în zona

formării noilor rădăcini.

Foto 3.2. Mediu de cultură cu cărbune activ la Clematis

Page 60: Microinmultirea plantelor

60

3.4. Concentraţii. Prepararea soluţiilor stoc

Aşa cum am afirmat până aici mediile de cultură au o compoziţie complexă care se

modifică în funcţie de specii, tipul de explant (organ), vârsta explantului, scopul urmărit

etc.

Conţinutul în elemente nutritive, fitoregulatoare şi cu rol stabilizator este mult

diferit de la caz la caz.

Fiecare component are o anumită pondere în realizarea mediului final. De aceea,

compoziţia mediului este dată de tipul substanţelor şi de concentraţia acestora.

De la caz la caz, concentraţia unui component poate fi exprimată în:

- % de volume: ex. 5% reprezintă 50 ml din produsul respectiv adăugaţi la 950 ml apă;

- % de masă: pentru agar, zahăr sau alte componente solide: ex. 2%, reprezintă 2 g în 100

ml de mediu sau 20 g în 1000 ml mediu preparat. Acest mod de exprimare a concentraţiei

este notată în literatura de specialitate de limbă engleză w/v, adică: weight/volume;

- miligram/litru (mg/l; mg.l-1) reprezintă 0,001 g/litru. Frecvent pentru acest tip de

concentraţie se foloseşte exprimarea cu ajutorul puterilor, astfel:

1 g/l= 1 . 10-3

1 mg/l = 1 . 10-6

- microgram/litru (µg/l; (µg . l-1) reprezintă 0,001 mg/l sau 1 . 10-9;

- părţi pe milion (ppm). 1 ppm reprezintă o parte dizolvată într-un milion de părţi de

acelaşi ordin de mărime, de ex. 1 mg în 1000 ml (1.000.000 µl) este echivalent cu 1 ppm.

În concluzie:

1 mg/l = 1 . 10-6 = 1 ppm şi 1 g/l = 1 . 10-3 = 1000 ppm

- moli. Conform Asociaţiei Internaţionale de Fiziologia plantelor, cel mai corect mod de

exprimare a concentraţiilor într-un mediu de cultură o reprezintă concentraţia molară.

Acest lucru permite o comparare corectă a două substanţe diferite.

Ştiind că 1 mol este reprezentat de o cantitate de substanţă egală cu masa

moleculară, este mai corect să se compare de exemplu, efectul unui mol de IBA (203,2) cu

al unui mol de ANA (186,2) decât să se compare efectul unei cantităţi de câte 1 mg/l din

fiecare hormon de mai sus. Acelaşi lucru este valabil atunci când se compară concentraţiile

totale ale sărurilor din două medii diferite.

Cunoscând masa moleculară a unei substanţe (de exemplu 225,3 pentru BAP)

concentraţia molară se poate exprima astfel:

Page 61: Microinmultirea plantelor

61

- 1 mol de BAP este echivalent cu o concentraţie de 225,3 g/litru;

- 1 mM de BAP este echivalent cu o concentraţie de 0,2253 g/litru;

- 1 µM de BAP este echivalent cu o concentraţie de 0,0002253 g/litru = 0,2253 mg/l;

Transformarea din concentraţie molară (M) în concentraţie exprimată în unităţi de

masă (g/l) se face folosind următoarea formulă:

concentraţia molară (M) . masa moleculară = X g/l.

concentraţia molară (mM) . masa moleculară = X mg/l.

De exemplu, dacă concentraţia dată de BAP este de 2,2 µM, concentraţia

echivalentă exprimată în mg/l va fi:

2,2 µM . 225,3 = 495,66 µg/l ≈ 0,5 mg/l

Invers, dacă iniţial concentraţia a fost exprimată în unităţi de masă se poate afla

concentraţia molară împărţind valoarea respectivă la masa moleculară.

În tabelul 3.4.1. sunt prezentate masele moleculare ale substanţelor folosite la

prepararea mediilor de cultură.

Tabelul 3.4.1. Masele moleculare ale substanţelor folosite la prepararea

mediilor de cultură

Substanţa Formula chimică

Masa moleculară

Macroelemente Azotat de amoniu NH4NO3 80,04Sulfat de amoniu (NH4)2SO4 132,15Clorură de calciu CaCl2

.2H2O 147,02Azotat de calciu Ca(NO3)2

.4H2O 236,16Sulfat de magneziu MgSO4

.7H2O 246,47Clorură de potasiu KCl 74,55 Azotat de potasiu KNO3 101,11Difosfat de potasiu KH2PO4 136,09Difosfat de sodiu NaH2PO4

.2H2O 156,01Microelemente Acid boric H3BO3 61,83Clorură de cobalt CoCl2

.6H2O 237,93Sulfat de cupru CuSO4

.5H2O 249,68Sulfat de mangan MnSO4

.4H2O 223,01Iodură de potasiu KI 166,01Molibdat de sodiu Na2MoO4

.2H2O 241,95Sulfat de zinc ZnSO4

.7H2O 287,54Sodiu EDTA Na2EDTA.2H2O 372,25Sulfat de fier (feros) FeSO4

.7H2O 278,03

Page 62: Microinmultirea plantelor

62

Tabelul 3.4.1. continuare

Substanţa Formula chimică

Masa moleculară

Zaharuri Fructoză C6H12O6 180,15Glucoză C6H12O6 180,15Manitol C6H14O6 182,17Sorbitol C6H14O6 182,17Zaharoză C6H22O11 342,31Vitamine şi aminoacizi Acid para-aminobenzoic 137,0Acid ascorbic (C) C6H12O6 176,12Acid folic (vit. Bc, vit. M) C19H19N7O6 441,40Acid nicotinic (B3) C6H5NO2 123,11Biotină (H) C10H16N2O3S 244,31Cianocobalamină (B12) C63H90CoN14O14P 1357,64Glicină C2H5NO3 75,07Inozitol C6H12O6 4180,16L-Cisteină HCl C3H7NO2S.HCl 157,63L-Glutamină C5H10N2O3 146,15Pantotenat de calciu (C9H16NO5)2Ca 476,53Piridoxină (B6) C6H11NO3

.HCl 205,64Riboflavină 376,37Tiamină (B1) C12H17ClN4OS.HCl 337,29Auxine 2,4-D- acid 2,4 diclorfenoxiacetic C8H6O3Cl2 221,04AIA- acid 3 indolil acetic C10H9NO2 175,18 ANA- acid α naftil acetic C12H10O2 186,20ANOA- Acid β naftoxiacetic C12H10O2 202,20IBA- acid 3 indolil butiric C12H13NO2 203,23PCAA- Acid paraclorfenoxiacetic C8H7O3Cl 186,59Citochinine AD – Adenină C5H5N5

.3HO 189,13AdSO4- Sulfat de adenină (C5H5N5)2

.H2SO4.2H2O 404,37

BA sau BAP (6-benziladenină sau 6 benzilaminopurină

C12H11N5 225,20

6 Furfurilaminopurină C10H9N5O 215,21SD 8339 - C17H19N5O 309,40Zeatină C10H13N5O 219,20Gibereline GA3-Acid giberelic C19H22O6 346,37Alte componente Acid abscisic C15H20O4 264,31Colchicină C22H25NO6 399,43Floroglucinol C6H6O3 126,11

Page 63: Microinmultirea plantelor

63

Pentru substanţe mai complexe a căror masă moleculară nu este cunoscută,

aceasta se calculează prin adunarea maselor atomice ale elementelor care o compun

(Tabelul 3.4.2.). Se va ţine cont dacă substanţa respectivă se află în stare hidratată sau nu

(“sic”) pentru a adăuga valoarea masei moleculare a apei.

În tabelul 3.4.2. este prezentat conţinutul în săruri minerale a mediilor

Murashige&Skoog şi Gamborg (B5) având concentraţia exprimată în mg/l, respectiv mM,

pentru macroelemente şi µg/l, respectiv µM, pentru microelemente.

Tabelul 3.4.2. Conţinutul în săruri minerale a mediilor de cultură

Murashige&Skoog şi Gamborg (B5)

Se observă, în final, că cele două medii diferă atât în ceea ce priveşte compoziţia

cât şi în ceea ce priveşte concentraţia totală.

Revenind la necesitatea folosirii concentraţiilor molare, printr-un calcul simplu se

observă că în cazul concentraţiei exprimate în mg/l, mediul MS este doar cu 142,5% mai

concentrat decât mediul B5. Cât despre concentraţia molară, se constată că de fapt diferenţa

este de 157,46%.

Aşa cum reiese din tabelul de mai sus pentru prepararea unui mediu este nevoie, în

medie, de 4-5 săruri conţinând macroelemente, de 7-8 săruri cu microelemente, de chelat

de fier, de amestecuri de 2 sau mai multe vitamine, de aminoacizi şi de un număr mai mare

Substanţa Murashige & Skoog Gamborg B5 Macroelemente mg/l mM mg/l mM

NH4NO3 1.650 20,6 - - (NH4)2SO4 - - 134 1,0 KNO3 1.900 18,8 2500 24,7 CaCl2

. 2H2O 440 3,0 150 1,0 MgSO4 . 7H2O 370 1,5 250 1,0 KH2PO4 170 1,25 - - NaH2PO4 - - 150 1,0

Total 4.530 45,15 3.184 28,7 Microelemente µg/L µM µg/L µM

KI 830 5,0 750 4,5 H3BO4 6.200 100,0 3.000 48,8 MnSO4

. H2O 16.000 94,6 10.000 59,1 ZnSO4

. 7H2O 8.600 30,0 2.000 7,0 Na2MoO4

. 2H2O 250 1,0 250 1,0 CuSO4

. 5H2O 25 0,1 25 0,1 CoCl2

. 6H2O 25 0,1 25 0,1 Total 31.930 230,8 16.050 120,6

Total general 4.561,93 45,38 3.200,05 28,82

Page 64: Microinmultirea plantelor

64

sau mai mic de hormoni de creştere. La toate acestea se adaugă zaharoza, agarul şi

eventual cărbunele activ.

Pentru prepararea unui litru de mediu ar fi nevoie în jur de 20-25 de cântăriri şi tot

atâtea dizolvări, diluări etc. ceea ce înseamnă un volum considerabil de muncă. Lucrurile

s-ar complica şi mai mult atunci când este vorba de microelemente care s-ar cântări în

cantităţi de ordinul microgramelor. Creşte în plus, riscul de apariţie a unor erori şi de

nerespectarea reţetelor.

Pentru înlăturarea acestor neajunsuri se recurge la prepararea unor soluţii stoc

concentrate formate din amestecuri de macro şi microelemente, vitamine care în momentul

preparării mediilor se diluează corespunzător concentraţiei şi reţetei de mediu folosite.

Diverşi autori recomandă să se folosească 5-6 soluţii stoc diferite pentru prepararea

unui mediu:

- soluţie stoc de macroelemente;

- soluţie stoc de microelemente;

- soluţie stoc de chelat de fier;

- soluţie stoc de vitamine;

- soluţie stoc de aminoacizi;

- soluţie stoc de hormoni.

Concentraţia acestor soluţii stoc variază între 10 X şi 1000 X (cu X se notează

concentraţia normală). De exemplu, o soluţie stoc de macroelemente Murashige&Skoog cu

o concentraţie 10 X va conţine de 10 ori mai mult azotat de amoniu (16.500 mg/l) decât o

soluţie cu concentraţia normală X (1.650 mg/l). Acelaşi lucru este valabil şi pentru

celelalte săruri care alcătuiesc soluţia de macroelemente.

Atunci când compuşii sunt mai stabili şi în laborator se prepară cantităţi mari de

mediu, se folosesc soluţii stoc cu concentraţii ceva mai mari (100 X, 1000 X). Frecvent

soluţia stoc de macroelemente are concentraţia 10 X, iar celelalte (microelemente şi

vitamine) concentraţia de 100 X.

Page 65: Microinmultirea plantelor

65

Pentru a afla ce cantitate din soluţia stoc se va folosi pentru a prepara un anumit

volum de mediu se aplică formula:

volumul de soluţie stoc = concentraţia cerută . volumul de mediu concentraţia soluţiei stoc

De exemplu, pentru a afla ce cantitate din soluţia stoc de vitamine, care are o

concentraţie 100 X este necesară pentru a prepara 2 l de mediu calculul este:

Y ml de soluţie stoc = X . 2 l = 0,02 l = 20 ml 100 X

Tabelul nr. 3.4.3. este un tabel ajutător pentru a afla cantitatea de soluţie stoc

necesară pentru a prepara un anumit volum de mediu cu concentraţia cunoscută (X).

Tabelul 3.4.3. Calculul diluţiei pentru trecerea de la o anumită soluţie stoc la

soluţia normală Nr. ml din soluţia stoc necesari pentru un mediu cu

concentraţia normală X Concentraţia soluţiei stoc 0,250 l 0,500 l 1 l 2 l 3 l 10 l

1 X 250 500 1.000 2.000 3.000 10.000

10 X 25 50 100 200 300 1.000

100 X 2,5 5 10 20 30 100

200 X 1,25 2,5 5 10 15 50

1000 X 0,25 0,5 1 2 3 10

Prepararea soluţiilor stoc

Cunoscând concentraţiile finale (normale) în diferite componente ale unui mediu de

cultură se poate trece la prepararea soluţiilor stoc.

Acest lucru este posibil prin mai multe căi. Una dintre ele ar fi cântărirea pentru

fiecare tip de mediu şi component a unor cantităţi de 10, 100 sau 1000 de ori mai mari

decât concentraţia normală, dizolvarea, amestecarea soluţiilor şi adăugarea de apă

bidistilată până la volumul de 1 litru. S-ar obţine astfel o soluţie stoc de 10, 100 sau 1000

de ori mai concentrată de macro şi microelemente sau vitamine.

Atunci când însă, într-un laborator se folosesc frecvent 4-5 medii de cultură diferite

şi se prepară zilnic cantităţi mari de mediu se poate apela la o soluţie mai practică şi mai

Page 66: Microinmultirea plantelor

66

puţin laborioasă. Aceasta constă în primul rând în simplificarea operaţiilor de cântărire şi

permite o folosire mai judicioasă a substanţelor, evitându-se învechirea soluţiilor stoc.

Metoda presupune existenţa a două tipuri de soluţii stoc:

- soluţiile mamă;

- soluţiile stoc propriu-zise.

Soluţiile mamă se obţin prin cântărirea, pentru fiecare sare în parte, a unei cantităţi

constante (de exemplu 100 g pentru macroelemente şi 10 g sau 1 g pentru microelemente).

După dizolvare volumul soluţiei se aduce la un litru obţinându-se astfel o soluţie cu

concentraţia 100 g/l, respectiv 10g/l, sau 1 g/l.

Soluţiile obţinute se păstrează în sticle etichetate aşezate în ordine. Soluţiile stoc

propriu-zise de concentraţie 10 X, 100 X sau 1000 X se obţin prin diluarea unui anumit

volum din fiecare soluţie mamă corespunzătoare sărurilor care intră în componenţa

soluţiilor stoc respective.

Calculul volumului de soluţie mamă necesar pentru a obţine 1 l de soluţie stoc este

următorul:

Y ml soluţie mamă = concentr.soluţiei normale (mg/l) . concentr.soluţiei stoc concentraţia soluţiei mamă (g/l)

Exemplu: Dacă soluţia normală a mediului Murashige&Skoog conţine 1650 mg/l

NH4NO3 şi concentraţia soluţiei mamă de NH4NO3 este de 100 g/l, să se calculeze câţi ml

de soluţie mamă vor fi necesari pentru a obţine un litru de soluţie stoc de macroelemente

cu concentraţia 10 X.

Y ml de soluţie mamă NH4NO3 = 1650 mg/l NH4NO3 . 10(X) = 165 ml 100 g/l NH4NO3

În tabelele 3.4.4. şi 3.4.5. sunt prezentate cantităţile (ml) de soluţii mamă necesare

pentru prepararea unui litru de soluţie stoc de macroelemente (10X) şi respectiv, de

microelemente (100X), la câteva dintre mediile de cultură cele mai folosite.

O problemă care poate apărea la prepararea soluţiilor stoc din soluţii mamă este

apariţia precipitaţilor insolubili. Principala cauză este formarea unor compuşi insolubili în

calciu, ionul fosfat şi magneziu.

Pentru a evita acest lucru este indicat să se respecte o anumită ordine la adăugarea

soluţiilor. Astfel se vor introduce prima fată soluţiile cu azot apoi cele cu magneziu,

Page 67: Microinmultirea plantelor

67

urmează cele cu calciu şi în final cele cu fosfor. Este de la sine înţeles că fiecare sare

trebuie în prealabil integral dizolvată în soluţia mamă.

Riscul apariţiei precipitaţiilor se poate evita şi prin prepararea unor soluţii stoc de

concentraţie mai redusă (10X).

Un alt compus de bază al mediului de cultură este chelatul de fier. Fierul nu este

accesibil plantelor decât dacă este legat de un agent de chelatare. În cazul mediilor pentru

culturile in vitro, agentul de chelatare folosit este Na2EDTA, sarea disodică a acidului

etilendiaminotetraacetic (C10H14N2O8Na2.2H2O).

Ca sursă de fier se foloseşte sulfatul feros hidratat cu 7 molecule de apă

(FeSO4.2H2O).

De regulă se foloseşte o soluţie stoc 200X de chelat de fier care se prepară astfel:

- se cântăresc 7,45 g de Na2EDTA.2H2O şi se dizolvă în 900 ml de apă distilată până

devine perfect limpede. La nevoie se încălzeşte uşor;

- se cântăresc 5,52 g sulfat feros şi se dizolvă în restul de apă;

- se amestecă cele două soluţii obţinându-se 1 l de soluţie 200x de chelat de fier de

culoare galbenă.

La prepararea unui litru de mediu de cultură din soluţia stoc de chelat de fier se vor

lua 5 ml (pentru 1 l de mediu) cantitate care conţine 27,8 mg de sulfat feros (100 µM) şi

respectiv 37,25 mg Na2EDTA (200 µM).

Page 68: Microinmultirea plantelor

68

Tabelul 3.4.4.

Prepararea unui litru de soluţie stoc de macroelemente (10X) din soluţiile mamă la câteva medii de cultură

Murashige & Skoog Gamborg B5

Quoirin & Lepoivre

Schenk & Hildebrandt Nitsch & Nitsch

Substanţa

Conc. sol.

mamă (g/l)

Conc.sol. normale

mg/l

Soluţie mamă

ml.

Conc.sol. normale

mg/l

Soluţie mamă

ml.

Conc.sol. normale

mg/l

Soluţie mamă

ml.

Conc.sol. normale

mg/l

Soluţie mamă

ml.

Conc.sol. normale

mg/l

Soluţie mamă

ml. NH4NO3 100 1650 165 - - 400 40 - - 720 72,0

KNO3 100 1900 190 2500 250 1800 180 2500 250 950 95,0

CaCl2 · 2H2O 100 440 44 150 15 - - 200 20 166 16,6

MgSO4 · 7H2O 100 370 37 250 25 360 36 400 40 90,3 9,03

KH2PO4 100 170 17 - - 270 27 - - 68 6,8

Ca(NO3)2 · 4H2O 100 - - - - 1200 120 - - - -

(NH4)2SO4 100 - - 134 13,4 - - - - - -

NaH2PO4 · H2O 100 - - 150 15 - - - - - -

NH4H2PO4 100 - - - - - - - - - -

Page 69: Microinmultirea plantelor

69

Tabelul 3.4.5.

Prepararea unui litru de soluţie stoc de microelemente (100X) din soluţiile mamă la câteva medii de cultură

Murashige & Skoog Gamborg B5

Quoirin & Lepoivre

Schenk & Hildebrandt Nitsch & Nitsch

Substanţa

Conc. sol.

mamă (g/l)

Conc.sol. normale

mg/l

Soluţie mamă

ml.

Conc.sol. normale

mg/l

Soluţie mamă

ml.

Conc.sol. normale

mg/l

Soluţie mamă

ml.

Conc.sol. normale

mg/l

Soluţie mamă

ml.

Conc.sol. normale

mg/l

Soluţie mamă

ml. KI 10 0,83 8,3 0,75 7,5 0,08 0,80 1,0 10,0 - -

H3BO3 10 6,20 62,0 3,00 30,0 6,20 62,0 5,0 50,0 10,0 100,0

MnSO4 · H2O 10 16,00 160,0 10,00 100,0 0,76 7,60 10,0 100,0 18,9 189,0

ZnSO4 · 7H2O 10 8,60 86,0 2,00 20,0 8,60 86,0 1,0 10,0 10,0 100,0

Na2MoO4 · 2H2O 1 0,25 25,0 0,25 25,0 0,250 25,0 0,1 10,0 0,25 2,5

CuSO4 · 5H2O 1 0,025 2,5 0,025 2,5 0,025 2,50 0,2 20,0 0,025 2,5

CoCl2 · 6H2O 1 0,025 2,5 0,025 2,5 0,025 2,50 0,1 10,0 - -

Page 70: Microinmultirea plantelor

70

Tabelul 3.4.6. Amestecuri de vitamine folosite frecvent la prepararea mediilor de cultură

Concentraţia normală (X) Necesar pt. 100 ml soluţie 100 X

Amestec mg/l µM mg Murashige&Skoog

Acid nicotinic 0,5 4,0 5,0 Piridoxină - HCl 0,5 2,4 5,0

Glicină 2,0 26,6 20,0 Tiamina - HCl 0,1 0,3 1,0

Walkey 1 Acid nicotinic 0,5 4,0 5,0

Piridoxină - HCl 0,5 2,4 5,0 Glicină 5,0 66,6 50,0

Tiamina - HCl 0,4 1,2 4,0 Walkey 2

Inozitol 100,0 560,0 1000,0 Tiamina - HCl 0,4 1,2 4,0

Jacquillot Acid nicotinic 1,0 8,1 10

Acid folic 0,01 0,02 0,1 Acid p-aminobenzoic 1,0 7,3 10,0

Biotina 0,1 0,4 1,0 Pantotenat de calciu 0,5 1,0 5,0

Riboflavina 0,1 0,26 1,0 Tiamina - HCl 1,0 3,0 10,0

Gamborg B5 Acid nicotinic 0,1 8,1 10,0

Piridoxină - HCl 1,0 4,9 10,0 Tiamina - HCl 10,0 29,6 100,0

Aşa cum se poate observa, raportul dintre cele două componente trebuie să fie de

1:2 pentru ca soluţia să fie stabilă. Orice exces de fier bivalent (Fe2+) duce la oxidarea

acestuia în Fe trivalent (Fe3+) urmată de formarea fosfatului feric care precipită.

Soluţiile de vitamine care se folosesc la prepararea mediilor de cultură sunt

amestecuri mai mult sau mai puţin complexe, diverşi autori propunând reţeta proprie.

Concentraţiile soluţiilor stoc variază în general între 100x şi 1000x. Păstrarea

acestor soluţii se face de regulă în frigider la 0-5°C, uneori fiind necesară păstrarea în

congelator (amestecul Kao&Michayluk – cod Sigma K-3129).

În tabelul 3.4.6. sunt prezentate reţetele câtorva amestecuri de vitamine folosite mai

frecvent la prepararea mediilor de cultură.

Page 71: Microinmultirea plantelor

71

Mai trebuie reţinut că piridoxina şi tiamina se dizolvă cu câteva picături de acid

clorhidric în timp ce acidul folic, bistina şi acidul nicotinic se dizolvă mai uşor la cald (nu

se vor depăşi 35-37°C).

Cum marea majoritate a vitaminelor sunt termolabile nu s-ar recomanda

introducerea lor în mediu înainte de autoclavare. Soluţia este sterilizată prin filtrare,

folosind filtre bacteriologice de 0,2 µm şi introducerea în mediul autoclavat înainte de

răcirea acestuia.

Soluţiile de hormoni

Aşa cum am precizat în capitolul 3.2. mediul de cultură trebuie să conţină şi o serie

de substanţe fitoregulatoare care practic determină sensul evoluţiei explantelor.

În funcţie de tipul de explant, de tipul de cultură şi de scopurile urmărite se

apelează la o anumită combinaţie de hormoni. De regulă, se urmăreşte realizarea unui

raport auxine: citochinine optimal dar în acelaşi timp pot fi adăugaţi şi alţi hormoni cu

acţiune stimulatoare.

Pentru fiecare tip de hormon se prepară soluţii stoc concentrate care în momentul

folosirii se diluează până la concentraţia precizată în protocol. Date despre solvenţii

folosiţi, modul de diluare şi temperatura de păstrare a soluţiilor stoc se regăsesc în tabelele

3.2.1; 3.2.2.; 3.2.3 şi 3.2.4.

Cel mai frecvent se prepară soluţii stoc care conţin 1 mg din hormonul respectiv

într-un ml de soluţie. În acest sens, se dizolvă 100 mg de hormon folosind câţiva ml de

solvent după care se dizolvă în apa distilată până se ajunge la volumul de 100 ml. După

etichetare soluţia stoc se păstrează aşa cum am precizat mai devreme.

1 mg/ml = 1000 mg/l = 1.10-3

În mediile de cultură concentraţia hormonilor variază, în general, între 0,1 şi 10,0

mg/l.

Pentru a prepara un anumit mediu se aplică formula de mai jos sau se face un

raţionament simplu:

Volum de soluţie stoc necesar = Concentraţia hormonului în mediul normal . Volum de mediu Concentraţia soluţiei stoc

Volum de soluţie stoc de BAP necesar = 0,5mg/l . 3 l = 1,5 l = 1,5 ml soluţiei stoc BAP 1000 mg/l 1000

Page 72: Microinmultirea plantelor

72

În tabelul 3.4.5. sunt calculate câteva diluţii în funcţie de concentraţia dorită de

hormoni, volumul de mediu de preparat şi concentraţia soluţiei stoc.

Tabelul 3.4.5. Cantitatea de soluţie stoc necesară pentru a prepara un anumit volum de mediu

cu concentraţia hormonilor cunoscută

Concentraţia dorită (finală) - mg/l Soluţia stoc de hormoni

250 ml 500 ml 1000 ml 2 litri 10 litri Concentraţia mg/l

Necesar ml

0,004 0,002 0,001 0,0005 0,0001 0,01 0,1 0,02 0,01 0,005 0,0025 0,0005 0,5 0,04 0,02 0,01 0,005 0,001 1,0

0,4 0,2 0,1 0,05 0,01 10,0 0,04 0,02 0,01 0,005 0,001 0,10 0,1

0,2 0,1 0,05 0,025 0,005 0,5 0,4 0,2 0,1 0,05 0,01 1,0 4,0 2,0 1,0 0,5 0,01 10,0 0,4 0,2 0,1 0,05 0,1 1,0 0,1 2,0 1,0 0,5 0,25 0,05 0,5 4,0 2,0 1,0 0,5 0,1 1,0

40,0 20,0 10,0 5,0 1,0 10,0 4,0 2,0 1,0 0,5 0,1 10,0 0,1

20,0 10,0 5,0 2,5 0,5 0,5 40,0 20,0 10,0 5,0 1,0 1,0

400,0 200,0 100,0 50,0 10,0 10,0

Atunci când concentraţia soluţiei hormonale se exprimă cu ajutorul puterilor,

raţionamentul este acelaşi: 1 mg/l = 1 . 10-6

Dacă concentraţia dorită de hormoni este, de exemplu 0,5 .10-6 şi se prepară 3 l de

mediu având o soluţie stoc cu concentraţia de 1.10-3 se vor folosi 1,5 ml de soluţie stoc.

Volumul de soluţie stoc necesar = 0,5.10-6 . 3 l = 1,5.10-3 l = 1,5 ml soluţie stoc 1.10-3 Frecvent se prepară soluţii stoc hormonale cu concentraţia 1.10-4 şi mai rar 1.10-3.

3.5. Prepararea mediului de cultură

Prepararea mediului de cultură constă dintr-o suită de etape.

După analizarea reţetei care se va folosi, se scot sticlele cu soluţiile stoc din frigider

sau alte locuri de păstrare şi se aliniază în ordinea de pe reţetă.

Alăturat propunem spre exemplificare modelul de reţetă de la Facultatea de

Agricultură din Perugia, Italia (Standardi, A.), care conţine mediul folosit pentru faza de

menţinere a actinidiei (tabelul 3.5.1.).

Page 73: Microinmultirea plantelor

73

Într-un pahar Berzelius de dimensiuni corespunzătoare se pun aproximativ 400 ml

de apă bidistilată după care se adaugă pe rând cantităţile (volumele) stabilite pentru fiecare

soluţie stoc în parte, măsurate cu cilindri gradaţi sau pipete.

Este indicat ca vasul cu mediu să fie plasat pe o plită cu agitator magnetic,

uşurându-se astfel dizolvarea şi amestecarea componentelor.

Fiecare substanţă introdusă se marchează pe reţetă pentru a evita omisiunile sau

folosirea de două ori.

După ce s-au introdus toate substanţele cu excepţia agarului se aduce la semn cu

apă bidistilată şi se trece la corectarea pH-ului amestecând continuu. În funcţie de valoarea

pH măsurată se titrează cu soluţie 0,1 N de KOH (NaOH) sau respectiv HCI, până la

valoarea dorită.

Se adaugă apoi agentul gelificant cântărit în prealabil şi se pregăteşte mediul pentru

autoclavare.

Din acest moment, se cunosc două practici diferite. Una dintre ele presupune

autoclavarea mediului în vase de mare capacitate (1-2 l), urmată de repartizarea mediului

topit în vasele de cultură sub hota sterilă. Vasele de cultură au fost în acest caz, sterilizate

în prealabil prin autoclavare, în etuvă, sau la producător (în cazul vaselor de unică

folosinţă).

Avantajul acestei metode ar fi că necesită volume de spaţiu mai mici pentru

autoclavare dar, după părerea noastră, este mai laborioasă întrucât necesită sterilizarea

prealabilă a vaselor de cultură, creşte riscul infectării mediului în timpul distribuirii şi nu

este aplicabilă la cantităţi mari de mediu (pe scară industrială).

A doua posibilitate constă în topirea agarului în vasul iniţial cu mediu prin agitare

pe o plită electrică sau baie marină. Agarul este topit când mediul devine limpede şi are

culoare albă gălbuie. Acest lucru are loc când începe să apară primele bule de aer pe

fundul vasului, semn că în scurt timp mediul dă în clocot.

Page 74: Microinmultirea plantelor

74

U.Ş.A.M.V. – Bucureşti Tabelul 3.5.1. Facultatea de Horticultură

FIŞA DE PREPARARE A MEDIULUI DE CULTURĂ

Mediul (nr./sigla): S 2,5 , preparat în 25/08 , pentru faza: multiplicare ,

specia: actinidia , ml de mediu necesari: 100, recipiente: vase sticlă ,

ml/recipient: 100 , pH măsurat: 4,32 , pH dorit: 5,5 , pH corectat cu 2,5 ml

de NaOH 0,1 N.

Componente Conc. dorită

Conc. sol. mamă

Cant. totală ml (g)/l

ml (g) ptr. ml

Săruri minerale Macroelemente Quoirin&Lepoivre X 10X 100 Microelemente Quoirin&Lepoivre X 1000 X 1 Chelat de fier X 200 X 5

Vitamine / Aminoacizi Amestec Walkey 2 X 100 X 10 Inozitol

Gibereline GA-3 10-6 10-6 1 Altele

Auxine ANA; AIA; IBA Altele

Citochinine Benziladenina (BAP) 10-6 10-7 10 Altele

Diverse

Zaharuri Zaharoza 2,5 % 25 Altele

Substanţe gelificante Agar 0,7 % 7 Altele

Cantitatea totală de soluţii mamă ml: 127 Apa distilată pentru aducere la volum ml: 850

Substrat preparat de: ..............................................

Page 75: Microinmultirea plantelor

75

În continuare, mediul este repartizat în vasele de cultură fie direct, fie cu ajutorul

unor dispozitive care măsoară repetitiv şi debitează acelaşi volum de mediu. În eprubete se

introduc în general 5-8 ml de mediu.

În laboratoarele industriale, mediul este topit în cuve din inox prevăzute cu pompe

aspiro-respingătoare cu debit reglabil.

După repartizare vasele de cultură se închid (vezi subcapitolul 4.2.1.), se

etichetează, precizând pe fiecare sigla mediului (eventual varianta) şi data preparării.

Urmează apoi sterilizarea prin autoclavare.

Atunci când se folosesc substanţe termolabile a căror sterilizare se face prin filtrare

(0,2 µm), acestea se vor introduce în mediu după autoclavare, înainte de solidificarea

acestuia. Mediul trebuie să fie cald dar nu fierbinte (35-37°C). Se va amesteca continuu

pentru o cât mai bună omogenizare.

O altă situaţie se întâlneşte la folosirea mediului de cultură în dublu strat. Acest tip

de mediu prezintă un strat solid (cam 75-80% din volum) iar la suprafaţă are un strat de

mediu lipsit de agentul gelificant.

Pentru prepararea acestui mediu care prezintă multe avantaje (Stănică şi colab.,

1996) înainte de introducerea agarului se separă cam 20-25% din volumul total şi se

autoclavează separat. Mediul lichid se va repartiza după autoclavare şi răcirea

(solidificarea) stratului bazal, sub hotă, în condiţii sterile.

Pentru a reduce numărul de manipulări şi riscul infecţiilor, acest lucru se poate face

şi în momentul inoculării, practic, după inocularea explantelor pe mediul solid.

3.6. Probleme care apar la pregătirea şi folosirea mediilor de cultură

Prima problemă care poate apărea la prepararea mediilor de cultură este formarea

unor precipitate insolubile. Aşa cum am mai precizat, cauza este nerespectarea ordinii la

amestecarea unor compuşi, iar efectul este formarea fosfaţilor insolubili.

Frecvent sărurile cu calciu se dizolvă şi se folosesc pentru prepararea unor soluţii

stoc, separate de cele de macroelemente şi se adaugă doar în momentul preparării

mediului.

S-a mai observat formarea de precipitat atunci când se adaugă calciul şi fosforul şi

mediul are pH-ul în jur de 5,6. Pentru reducerea riscului precipitării se recomandă folosirea

unor soluţii stoc mai diluate de macroelemente (10X).

Page 76: Microinmultirea plantelor

76

O altă problemă este nesolidificarea mediului de cultură după răcirea acestuia.

Dintre cauze amintim:

- cantitate prea mică de agar, sub 5-6 g/l;

- depăşirea temperaturii la autoclavare;

- ph-ul prea mic al mediului de cultură (sub 5,5);

- agar foarte vechi.

Mediile de cultură sunt amestecuri nutritive complexe şi constituie un suport ideal

pentru instalarea şi dezvoltarea rapidă a unor microorganisme de tipul bacteriilor şi

ciupercilor.

Sursele de infecţii şi cauzele apariţiei acestora în mediile de cultură sunt multiple:

- soluţii stoc învechite, infectate cu bacterii şi ciuperci;

- vase de cultură provenite din culturi infectate puternic, nespălate şi

nedezinfectate corespunzător;

- curăţenie deficitară în laborator;

- autoclavare necorespunzătoare fie prin nerespectarea timpului, fie a

temperaturii şi presiunii recomandate;

- închiderea necorespunzătoare a vaselor de cultură şi infectarea după

autoclavare;

- hotă necorespunzătoare care nu asigură sterilizarea totală a aerului în timpul

inoculărilor;

- tehnică de lucru deficitară, operatorul putând fi principalul vector al unor agenţi

contaminanţi;

- material biologic infectat şi deci sterilizat necorespunzător;

- condiţii de curăţenie necorepunzătoare în camera de creştere;

- o serie de acarieni, tripşi etc. pot pătrunde în vasele de cultură şi transporta

agenţi contaminanţi.

În general în mediile de cultură se întâlnesc două tipuri de infecţii. Cele de origine

bacteriană se caracterizează prin apariţia în jurul explantelor, la suprafaţa mediului sau în

interior, a unui halou translucid de culoare albă-gălbuie sau divers colorat (foto 3.3. a). În

mediile lichide creşte turbiditatea acestora. Infecţiile bacteriene sunt însoţite frecvent de un

miros puternic, neplăcut.

Page 77: Microinmultirea plantelor

77

Infecţiile micotice se recunosc prin formarea unor reţele miceliene pe care pot

apărea fructificaţii de diferite culori (negre la Aspergillus sp., verzi-albăstrui la Penicillium

etc.) (foto 3.3. b). Prezenţa fructificaţiilor creşte riscul răspândirii infecţiei în vasul de

cultură dar şi în afara lui.

a b

Foto 3.3. Infecţii mixte cu bacterii şi ciuperci în faza de iniţiere-stabilizare in vitro

Dacă o infecţie este depistată în fază incipientă şi ea a afectat un singur explant

dintr-un vas se poate încerca salvarea celorlalte explante, mai ales dacă este vorba de un

material valoros.

În acest sens, se vor repasa de urgenţă explantele aparent sănătoase în eprubete şi se

va urmări evoluţia lor. O altă soluţie este sterilizarea explantelor aparent sănătoase şi

repasarea lor, individual, pe un mediu nou.

a b

Foto 3.4. Infecţii în faza de multiplicare in vitro (a– bacterii, b-Penicillium)

Mediul poate de asemenea să-şi schimbe culoarea devenind brun ca urmare a

emiterii de fenoli de către explante (foto 3.5.); prin oxidare aceşti fenoli determină

Page 78: Microinmultirea plantelor

78

brunificarea mediului. Întrucât schimburile explantelor cu mediul se reduc drastic, se

impune de urgenţă înlăturarea zonelor brunificate şi pasarea pe un mediu nou.

Foto 3.5. Emisie de fenoli în faza de iniţiere la mesteacăn (Betula pendula Laciniata)

Pentru reducerea brunificărilor în continuare se poate apela la introducerea în

mediu a unor substanţe antioxidante:

- PVP (250-1000 mg/l); cărbune activ (0,2-3,0%); acid citric, acid ascorbic,

tiouree, etc.; aminoacizi: L-cisteină, glutamină, arginină şi asparagină.

Atunci când mediul este păstrat timp îndelungat înainte de a fi folosit sau

închiderea vaselor de cultură este defectuoasă şi/sau umiditatea din camera de cultură este

foarte scăzută, se constată deshidratarea mediului. Acest lucru este sesizat printr-o scădere

puternică de volum şi eventual, prin apariţia de crăpături în mediu (foto 3.6.) .

Foto 3.6. Deshidratarea şi crăparea mediului la Gasteria sp.

Explantele, în aceste condiţii, suferă datorită lipsei apei şi concentrării sărurilor şi

zaharurilor (creşte mult presiunea osmotică). Se impune de urgenţă pasarea pe un alt

mediu.

Page 79: Microinmultirea plantelor

79

În anumite situaţii, la cultivarea unor explante pe mediu se observă că ţesuturile

acestora cresc neuniform şi au un aspect vitros. Fenomenul denumit vitrificare sau

sticlozitate este determinat de un ansamblu de factori care ţin în primul rând de mediul de

cultură dar, uneori şi de materialul biologic înmulţit.

Transformările pe care le suferă explantele vitrificate sunt multiple şi ele afectează

cloroplastele, membranele şi mezofilul frunzelor, meristemele etc. Se constată o reducere a

conţinutului în clorofilă şi o creştere a cantităţii de apă din frunză (aceasta ocupă până şi

ţesuturile lacunare, Cachiţă, 1987) (foto 3.3.).

Foto 3.7. Lăstari vitrificaţi, regeneraţi din peţiol de kiwi (Actinidia sp.)

Cauzele producerii acestui fenomen sunt legate de deficitul de agar, excesul de

etilenă, excesul ionilor de NH4+, excesul de citochinine, în special BAP etc.

Pentru salvarea explantelor vitrificate se impun o serie de măsuri:

- reducerea concentraţiei de săruri a mediului;

- creşterea conţinutului de agar (determină reducerea capacităţii proliferative);

- folosirea agarului hidrolizat reduce la minimum riscul apariţiei vitrificării;

- folosirea unor inhibitori ai producerii de etilenă: ioni de argint, CaCl2,

dinitrifenolul;

- creşterea dozei de zaharoză.

Vitrificarea rămâne o problemă controversată şi se impun noi cercetări pentru

elucidarea tuturor faţetelor acestui fenomen negativ.

Page 80: Microinmultirea plantelor

80

Capitolul 4

Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro

4.1. Agenţi sterilizanţi

Sterilizarea şi asepsia în culturile in vitro se realizează prin folosirea unor mijloace

fizice şi chimice. Mijloacele chimice sunt reprezentate de un număr mare de agenţi

sterilizanţi cu origine şi compoziţie diversă.

Alcoolul etilic este folosit de regulă în concentraţie de 70%, deoarece alcoolul

absolut (96%) determină deshidratarea rapidă a materialul vegetal.

Calculul diluţiei alcoolului de 96% se face după schema de mai jos:

Cunoscând concentraţia iniţială a alcoolului (96% volume alcool) se scade

concentraţia dorită (70% volume alcool) şi se obţine, pe linia apei, cantitatea în ml, sau

numărul de părţi de apă folosite la diluţie.

Repetând apoi acelaşi lucru pe a doua diagonală, se obţine pe linia alcoolului

cantitatea de alcool concentrat care va fi folosită, exprimată în ml sau părţi.

În general, timpul de sterilizare în alcool este scurt (30-60 de secunde) însă se poate

prelungi atunci când explantele sunt protejate de solzi, catafile etc. După introducerea în

alcool, explantul se va spăla rapid prin plonjare în apa distilată.

Sterilizarea în alcool este urmată frecvent de o sterilizare cu hipoclorit de sodiu sau

calciu.

Pentru fructe uscate, sâmburii, seminţele de orhidee sau unele plante puternic

contaminate (muşcată), sterilizarea se face prin introducerea explantelor în alcool de 96%,

flambarea rapidă şi răcirea în apă distilată sterilă.

alcool 96% 70 ml alcool

70%

apă 0% 26 ml apă

Page 81: Microinmultirea plantelor

81

Hipocloritul de sodiu (NaClO, apa de Javel) este folosit ca agent înălbitor pentru

rufe. Majoritatea produselor comerciale conţin 10-20% substanţă activă. Pentru sterilizare

se foloseşte însă o soluţie cu o concentraţie de 1,0-2,0%. Rareori concentraţia ajunge la

8,0%.

Trebuie reţinut că hipocloritul de sodiu se descompune uşor şi nu poate fi păstrat o

perioadă îndelungată.

Hipocloritul de calciu (Ca(ClO)2) se foloseşte în situaţiile în care hipocloritul de

sodiu se dovedeşte a fi toxic. Hipocloritul de calciu este condiţionat sub formă de pudră

care se dizolvă destul de dificil în apă.

Pentru prepararea soluţiei dezinfectante se dizolvă 35-100 g hipoclorit într-un litru

de apă. Se face apoi filtrarea soluţiei prin vată sau hârtie de filtru cu pori mari pentru a

înlătura particulele nedizolvate. Acestea, provoacă de regulă necrozarea ţesuturilor.

Timpul de sterilizare variază între 5 şi 30 de minute, în funcţie de tipul de explant.

După dezinfectarea cu hipoclorit de calciu, care este puternic alcalin, se recomandă

introducerea în prima apă de spălare a unei cantităţi reduse de acid clorhidric pentru

extragerea ionilor toxici de Cl-. Operaţia este urmată de 4-5 spălări succesive cu apă

distilată.

Trebuie precizat că suprafeţele secţionate ale explantelor se înălbesc sub acţiunea

clorului. Aceste zone vor fi eliminate în momentul pregătirii explantului pentru inoculare

întrucât celulele sunt moarte.

Hipocloritul de calciu în soluţie este ceva mai stabil şi poate fi păstrat o perioadă

îndelungată.

Clorura mercurică (sublimatul, HgCl2) este o otravă puternică care se foloseşte

sub formă de soluţie în concentraţie de (0,01-0,1%) timp de 2-15 minute. Concentraţia şi

timpul de sterilizare se vor reduce în cazul organelor şi ţesuturilor tinere. Efectul sterilizant

este puternic şi după folosire, sunt necesare 2-3 clătiri cu apă distilată sterilă.

Apa oxigenată (perhidrolul) se poate folosi cu succes la sterilizarea materialului

vegetal în concentraţie de 10-12%. De regulă, este folosită pentru prima sterilizare timp de

5-15 minute.

Are avantajul că pătrunde în profunzime şi curăţă materialul vegetal prin

efervescenţa pe care o produce. Apa oxigenată nu se recomandă să fie folosită la

dezinfectarea explantelor provenite de la speciile cu conţinut ridicat de polifenoli deoarece

determină oxidarea rapidă a acestora şi deci, brunificarea ţesuturilor.

Page 82: Microinmultirea plantelor

82

Apa bromată (1-2%) se foloseşte timp de 2-10 minute şi are un efect sterilizant

foarte bun.

Azotatul de argint (1%) se foloseşte timp de 4-30 minute.

Antibioticele preparate în soluţii de 4-100 mg/l pot fi folosite ca agenţi sterilizanţi

mărind eficacitatea sterilizării. Pentru amestecul penicilină + streptomicină (1 mg/l) durata

sterilizării este de 2 ore.

În tabelul 4.1.1. sunt prezentate câteva dintre antibioticele şi substanţele

antimicotice folosite mai frecvent ca agenţi sterilizanţi la dezinfectarea explantelor sau

mediului de cultură. Prezenţa antibioticelor în mediu poate să determine apariţia unor

mutaţii mai ales la culturile susceptibile în acest sens: culturi de calus, culturi de celule,

etc. Din acest motiv, folosirea lor este relativ limitată.

În anumite situaţii, se apelează însă la antibiotice pentru înlăturarea unor infecţii

latente periculoase, dacă acestea au afectat un material biologic valoros.

Pregătirea soluţiilor de antibiotice este relativ simplă. În marea lor majoritate

antibioticele se prezintă sub formă de pulberi solubile în apă sau în câţiva solvenţi (DMSO,

DMF, etanol, HCl, NaOH etc.). Fiecare preparat are marcată pe etichetă şi activitatea

biologică exprimată în µg/mg sau unităţi/mg. În funcţie de aceasta se va calcula

concentraţia soluţiei care se va prepara, respectiv cantitatea de antibiotic care se va folosi,

astfel:

cantitatea de antibiotic = volumul de mediu x concentraţia dorită activitate

După solubilizarea în solventul corespunzător, antibioticul se va dilua cu apă

distilată până la volumul dorit. Păstrarea soluţiei se face de regulă în frigider la 0-5°C, iar

perioada de păstrare variază de la o zi până la trei luni sau chiar la un an.

Majoritatea antibioticelor sunt termolabile motiv pentru care se recomandă

sterilizarea lor prin filtrare prin membrane speciale (acetat de celuloză).

Alte substanţe care pot fi folosite pentru sterilizare sunt clorura de var (de uz

sanitar), cloramina, formolul, permanganatul de potasiu, etc.

Page 83: Microinmultirea plantelor

83

Tabelul 4.1.1.

Principalele antibiotice şi antimicotice folosite în culturile in vitro

Specificaţie Masă molec. Solvent Diluant Păstrare

produs Concentraţia

folosită Amfotericină B 924,1 DMSO, DMF apă 0-5°C 2,5 mg/l

Ampicilină 371,3 apă apă 0-5°C 100 mg/l Cicloheximidă 281,4 etanol apă 0-5°C 10 µg/l Cloramfenicol 264,3 apă + NaOH apă temp. cam. 5 µg/l Eritromicină 148,2 HCl, etanol apă temp. cam. 100 mg/l

Gentamicină sulfat 160,2 apă apă 0-5°C 50 mg/l Kanamicină 582,6 apă apă temp. cam. 100 mg/l

Neomicin sulfat 908,9 apă apă temp. cam. 50 mg/l Nistatin 926,1 suspensie/apă apă -0°C 50 mg/l

Penicilină G 372,5 apă apă temp. cam. 100.000 U/l Streptomicină sulfat 1457,4 apă apă 0-5°C 100 mg/l

Tetraciclină 444,4 apă Na -0°C 10 mg/l

4.2. Sterilizarea vaselor de cultură şi a instrumentarului folosit

4.2.1. Închiderea vaselor de cultură

Vasele de cultură trebuie prevăzute cu dopuri şi capace adecvate care să prevină

deshidratarea mediului de cultură, pătrunderea unor agenţi contaminaţi din exterior şi

acumularea unor gaze nocive în atmosfera vasului (CO2, etilenă etc.). În acelaşi timp,

acestea trebuie să permită aprovizionarea cu oxigen din exterior.

Principalele mijloace şi materiale folosite pentru închiderea vaselor de cultură sunt:

- dopurile din vată. De regulă, se realizează prin învelirea vatei cu tifon după o

prealabilă presare a acesteia. Aceste dopuri au dezavantajul că nu pot fi sterilizate prin

flambare în momentul folosirii.

O altă variantă este reprezentată de dopurile din vată învelite într-o folie de

aluminiu care înlătură în bună măsură dezavantajele primelor.

Având în vedere că la prima sterilizare dopurile de vată elimină o substanţă toxică,

înainte de folosirea dopurilor noi, se va face autoclavarea acestora. Periodic, este necesar

ca această autoclavare de siguranţă să se repete.

- dopurile din plută pot fi folosite pentru eprubete, vase Erlenmayer şi alte vase de

cultură cu deschiderea îngustă. Este necesară de asemenea autoclavarea lor, iar în cazul în

care provin de la vase cu mediu infectat, se vor lua măsuri suplimentare de sterilizare (foto

4.1.).

- dopurile din cauciuc, sunt practice pentru că se pot spăla şi dezinfecta uşor în

alcool. Sterilizarea prin flambare în momentul inoculării este contraindicată şi trebuie

Page 84: Microinmultirea plantelor

84

realizată rapid pentru a evita aprinderea cauciucului şi degajarea gazelor toxice în

atmosfera vasului de cultură (foto 4.2.).

Foto 4.1. Dopuri din plută

Foto 4.2. Dopuri din cauciuc

- dopurile din steristop sunt realizate dintr-o celuloză poroasă. Acestea trebuie de

asemenea, protejate cu folie de aluminiu pentru a le face mai practice.

- capacele metalice trebuie să aibă un sistem adecvat de fixare la gura vasului de

cultură. Sunt opace şi necesită pentru etanşare folosirea foliei de aluminiu sau a foliei de

plastic autosigilante. În acelaşi fel, se pot utiliza capace din plastic rezistent la autoclavare.

În cazul capacelor prevăzute cu filet se va avea grijă ca la închidere să nu se

înşurubeze prea tare, pentru a se evita vidarea interiorului prin autoclavare şi pentru a

permite circulaţia aerului după inoculare.

- capacele din sticlă au avantajul că permit pătrunderea luminii pe la partea

superioară a vasului de cultură. Necesită sisteme suplimentare pentru fixare şi etanşare. În

anumite situaţii, pentru acoperirea vaselor de cultură se pot folosi vase Petri.

- folia de aluminiu este mult folosită la închiderea vaselor de cultură. Poate fi

refolosită dar are dezavantajul că uneori permite pătrunderea agenţilor patogeni din

exterior şi infectarea mediului de cultură.

- folia din material plastic (Parafilm, Vitafilm, folia din PVC, folia din

polipropilenă) poate fi folosită ca atare sau de regulă este folosită pentru etanşarea

corespunzătoare a altor sisteme de închidere prezentate anterior. Etanşarea trebuie să evite

deshidratarea mediului de cultură dar să permită schimbul activ de gaze între atmosfera

interioară şi exterior.

La alegerea sistemului şi materialului pentru închiderea vaselor de cultură (Pierik,

1987), trebuie ţinut cont de faptul că:

Page 85: Microinmultirea plantelor

85

- dacă vasul este închis ermetic nu este posibilă schimbarea de CO2, O2 şi etilenă cu

exteriorul. Acumularea CO2 şi etilenei în interior precum şi lipsa oxigenului au consecinţe

nefaste. De regulă, polipropilena şi folia de aluminiu subţire etanşează perfect nepermiţând

realizarea acestor schimburi gazoase.

Cultivarea explantelor de Magnolia soulangeana în vase de cultură ermetic închise

a determinat clorozarea plantelor datorită acumulării excesive de CO2 şi etilenă. În aceste

situaţii se impune folosirea unor substanţe speciale absorbante ale etilenei (Ethy-sorb).

În prezent se realizează capace din polipropilenă prevăzute cu membrane

semipermeabile care înlătură aceste neajunsuri.

- anumite materiale sintetice folosite pentru realizarea vaselor de cultură, a

dopurilor sau capacelor elimină etilena care se poate acumula astfel în atmosfera interioară

şi poate declanşa simptome de toxicitate.

- în cazul unui vas de cultură închis etanş, evaporarea apei din interior este blocată.

În acest caz, umiditatea foarte ridicată determină apariţia vitrificării.

- sistemele de închidere opace reduc accesul luminii în interiorul vasului de cultură.

Pentru eprubete situaţia se poate rezolva prin aşezarea acestora în camera de cultură, în

poziţie înclinată, pe suporţi speciali. Prin răcirea mediului ţinând eprubetele înclinate, se

realizează în plus mărirea suprafeţei de contact a acestuia cu atmosfera vasului şi uşurarea

schimburilor gazoase.

4.2.2. Sterilizarea vaselor de cultură

Recipientele din sticlă trebuie supuse unei sterilizări prealabile. După spălarea

acestora se autoclavează pentru eliminarea unor compuşi toxici înainte de folosire pentru

cultură.

Vasele de cultură folosite trebuie spălate cu atenţie cu apă caldă şi detergent, clătite

repetat cu apă distilată sau apă deionizată şi zvântate cu grijă.

Spălarea se face manual sau mecanic, folosind dispozitive simple cu perii rotative

sau maşini de spălat performante. Există şi dispozitive speciale de spălat cu ultrasunete

(foto 2.7.).

Pentru vasele care se curăţă greu se recomandă folosirea amestecului cromic în

care vasele se menţin timp de patru ore.

Amestecul cromic se obţine din bicromat de potasiu şi acid sulfuric. Pentru început

se prepară 100 ml de soluţie saturată de bicromat de potasiu prin dizolvarea la cald a 30 g

Page 86: Microinmultirea plantelor

86

de bicromat de potasiu în 70 ml apă distilată. Se adaugă apoi treptat (agitând balonul în apă

rece), 300 ml de acid sulfuric concentrat.

Preparatul are o culoare brună-portocalie, este foarte toxic, coroziv şi oxidant. După

folosire se recuperează şi se poate refolosi. Când se uzează culoarea devine verde. Vasele

spălate cu amestec cromic se vor clăti cu atenţie, fără a face stropi care bine-nţeles sunt

corozivi.

În cazul vaselor de cultură cu medii puternic infectate, după o spălare

corespunzătoare se impune sterilizarea acestora în etuvă la 160°C, timp de cel puţin 3 ore.

Se va evita depăşirea temperaturii de 180°C pentru a se evita deteriorarea calităţii

sticlei.

Celelalte obiecte de sticlărie care se folosesc, se ambalează în hârtie sau folie de

aluminiu şi se sterilizează în etuvă la 120°C, timp de 1-2 ore.

Sterilizarea se poate face şi la umed în autoclav la 120-121°C, reducând timpul de

autoclavare la 30-40 de minute. În acest caz, se recomandă folosirea foliei de aluminiu, a

foliei autosigilante sau a unor pupinele speciale pentru autoclavare.

Dopurile şi capacele, în funcţie din materialul din care sunt confecţionate, se spală

şi se sterilizează prin autoclavare.

În cazul în care culturile sunt sănătoase, pentru reducerea cheltuielilor şi a

pierderilor de timp se va face sterilizarea vaselor de cultură şi a mediului prin autoclavare,

după repartizarea acestuia.

În prezent, se folosesc o serie de recipiente de cultură sau auxiliare de diferite

forme şi mărimi de unică folosinţă. Acestea se livrează în pungi din polietilenă etanşe care

se deschid în momentul folosirii, sub hota cu flux laminar.

La producător, recipientele din plastic se sterilizează prin radiaţii gamma (2000 r)

sau mai frecvent, cu oxid de propilenă.

4.2.3. Sterilizarea instrumentarului

Instrumentarul metalic folosit la secţionarea explantelor şi la pasarea lor pe mediu

(bisturie, ace spatulate, pense etc.) trebuie sterilizat frecvent. Acest lucru se face de regulă,

înaintea şi în timpul lucrului, prin flambare. În acest sens sub hotă va exista un recipient cu

spirt (96% vol. alcool) în care instrumentele respective se introduc. Se face apoi flambarea

propriu-zisă la flacăra unui bec de gaz sau a unei spirtiere şi aşezarea pe un suport pentru a

Page 87: Microinmultirea plantelor

87

se răci. Se recomandă ca, după fiecare explant manipulat, să se facă sterilizarea prin

flambare a instrumentelor şi schimbarea acestora cu altele sterile.

Foarte importantă este înlocuirea periodică a alcoolului folosit pentru flambare,

deoarece prin evaporare, concentraţia sa scade, arderea este necorespunzătoare. Există

astfel riscul ca sterilizarea să fie ineficientă, infecţia transmiţîndu-se prin intermediul

instrumentelor.

Un alt mijloc folosit pentru sterilizarea instrumentelor este sterilizatorul

(incineratorul) electric (foto 4.3.). Acesta prezintă un corp găurit din cărămidă refractară în

interiorul căruia, cu ajutorul unor rezistenţe electrice, temperatura creşte până la

aproximativ 871°C. Timpul de sterilizare este de 1 minut.

Foto 4.3. Sterilizator electric pentru instrumentar

O altă variantă o reprezintă sterilizatorul cu bile din sticlă (foto 4.4.) între care se

introduc instrumentele de sterilizat. Şi în acest caz, temperatura de sterilizare este în jur de

250°C, iar timpul de sterilizare de 10-15 secunde. În nici un caz instrumentele nu se vor

lăsa în interior mai mult de 1 minut, chiar dacă sterilizatorul este prevăzut cu un termostat.

Timpul de răcire este de aproximativ 30-60 de secunde.

Foto 4.4. Sterilizator electric cu bile din sticlă

Page 88: Microinmultirea plantelor

88

Sterilizatoarele prezentate sunt foarte eficiente împotriva germenilor rezistenţi la

căldură (flambare) şi la alcool. Este vorba de bacterii din genul Bacillus, aşa-numitele

“bacterii curate”, care supravieţuiesc sterilizării obişnuite prin flambare.

Pe lîngă instrumentele cu care se lucrează, este nevoie să se sterilizeze la

introducerea sub hota sterilă, lupele binocular, microscoapele, vasele cu mediu proaspăt

sau cele provenite din camera de culturi şi în general, orice obiect care se introduce din

afară.

Sterilizarea se face în acest caz prin pulverizarea obiectelor respective cu alcool

(96% vol. alcool) şi prin ştergere cu vată îmbibată în alcool.

4.3. Sterilizarea mediului de cultură şi a apei

Întrucât mediul de cultură reprezintă un suport ideal pentru creşterea unor bacterii

şi ciuperci nedorite se impune sterilizarea acestuia înainte de folosire.

În cazul în care se poate face autoclavarea mediului în aceeaşi zi, după corectarea

pH-ului, acesta se va păstra în frigider, urmând ca zaharoza şi agarul să fie adăugate înainte

de autoclavare.

Pentru a repartiza mediul de cultură în vase, după ce s-a făcut corectarea pH-ului şi

s-au adăugat agarul, zaharoza şi eventual cărbunele activ, se aşează recipientul cu mediu pe

o plită electrică cu agitator magnetic pentru solubilizarea agarului.

Foto 4.5. Plită electrică cu agitator magnetic

Page 89: Microinmultirea plantelor

89

Operaţia este încheiată când mediul devine perfect transparent şi dispar particulele

de agar aflate în suspensie. Acest lucru este marcat şi de apariţia primelor bule de aer la

fundul vasului, indicând începutul fierberii.

Pentru dizolvarea agarului în mediul de cultură se folosesc şi recipienţi speciali din

oţel inoxidabil, prevăzuţi cu rezistenţe electrice şi agitare magnetică.

Pentru repartizarea mediului de cultură în vase se pot folosi seringi dozatoare de

mică capacitate (1-10 ml) care permit reglarea volumului de mediu distribuit (foto 2.4. şi

2.5.) precum şi dozatoare cu pompe aspiro-respingătoare pentru volume mai mari de mediu

(50-100 ml/vas) (foto 2.6.).

După repartizarea mediului vasele de cultură se închid şi se etichetează precizând

sigla mediului şi data preparării.

Autoclavarea se face în autoclave speciale electrice sau cu gaz, prevăzute cu

instrumente pentru controlul temperaturii şi presiunii, temporizatoare şi dispozitive de

siguranţă.

Timpul de sterilizare este corelat cu volumul de mediu existent în vasele de cultură

variind în general de la 15 minute la 30-40 de minute.

Timpul minim de autoclavare este compus de fapt din timpul necesar mediului de

cultură pentru a ajunge la temperatura de 121°C, la care se adaugă 15 minute de sterilizare

propriu-zisă la aceeaşi temperatură.

Temperatura optimă pentru autoclavare este de 121°C în prezenţa aburilor ceea ce

corespunde cu o presiune de 1 atm (1,05 kg/cm2). Alţi autori (Gautheret, 1959)

recomandau autoclavarea mediilor la 115°C timp de o oră (volume de 3-5 litri) şi repetarea

autoclavării după 24 ore. Această tehnică ar reduce degradarea unor componenţi

termolabili.

În lipsa unor autoclave speciale, sterilizarea mediului se poate face şi în oale de

gătit sub presiune (tip Kukta). Şi în acest caz se va face sterilizarea mediului introducând în

oală un strat corespunzător de apă pentru formarea aburilor.

Timpul de sterilizare se va măsura din momentul în care ies primii aburi din supapa

de siguranţă.

Page 90: Microinmultirea plantelor

90

Tabelul 4.3.1. Corelaţia dintre timpul minim de sterilizare şi volumul de mediu existent

în vasul de cultură Volumul de mediu din vas

ml Timpul minim de autoclavare

min 25 20 50 25 100 28 250 31 500 35 1000 40 2000 48 4000 63

În toate cazurile, pentru a se realiza răcirea rapidă a mediului, autoclavele vor fi

deschise numai după ce s-a realizat depresurizarea incintei.

Substanţele termolabile: giberelinele, zeatina, ureea, piridoxina, tiamina, glutamina,

etc. se vor steriliza prin filtrare, după autoclavarea mediului de bază.

Sterilizarea prin filtrare se poate realiza şi pentru întreaga cantitate de mediu (fără

agar). Acest lucru este posibil folosind nuci filtrante din sticlă cu porozitate de 1 micron

(filtru Jena tip F şi Pyrex tip 5H) sau filtre de unică folosinţă tip Millipor (foto 4.6.) cu

porozitate de 0,5-0,2 microni.

În primul caz se folosesc seringi şi vase din sticlă în timp ce sistemul Millipor

presupune folosirea unor seringi de unică folosinţă. Filtrele Millipor trebuie spălate înainte

de folosire cu apă distilată sterilă pentru a îndepărta urmele de detergent pe care le conţin.

Sterilizarea prin folosirea la rece este o metodă greoaie şi poate fi aplicată doar

pentru mediile lichide.

Uneori pentru uşurarea filtrării se folosesc dispozitive de filtrare care se racordează

la pompa de vid (foto 4.7.).

Foto 4.6. Filtre de unică folosinţă

Foto 4.7. Sistem de filtrare sub vid

Page 91: Microinmultirea plantelor

91

Sterilizarea “la rece” a unor substanţe termolabile, se poate face şi prin amestecarea

acestora (dizolvarea) cu alcool etilic, eter etilic, acetonă în incintele sterile. După

evaporarea substanţelor sterilizante, substanţa termolabilă se repartizează în mediu.

O altă practică folosită, este introducerea unor substanţe sterilizante în mediul de

cultură. Aceste substanţe împiedică dezvoltarea ciupercilor şi bacteriilor. Ca agenţi

sterilizanţi se foloseşte o gamă largă de antibiotice (penicilină, streptomicină,

cloranfenicol), conservanţi alimentari (salicilat, etc.) sulfamide, oxid de propilenă (1 ml, la

20 ml mediu).

Apa folosită pentru diferite faze ale culturilor in vitro, dar mai ales pentru clătirea

explantelor după sterilizare, trebuie să treacă şi ea printr-un proces de sterilizare.

Acest lucru se realizează prin autoclavare în recipiente din sticlă. Închiderea vaselor

nu se va face etanş, pentru a se permite aburilor sub presiune să intre în interior.

Frecvent, în apa folosită pentru sterilizare se introduc substanţe antioxidante (PVP,

0,1%).

4.4. Dezinfectarea materialului vegetal

Înaintea folosirii pentru culturile in vitro, materialul vegetal trebuie pregătit cu

minuţiozitate. Această pregătire diferă în funcţie de provenienţa materialului respectiv:

câmp sau spaţii protejate.

Materialul vegetal provenit din câmp are un grad de infecţie sporit, motiv pentru

care înainte de a fi folosit trebuie supus unor operaţii suplimentare de pregătire:

- mugurii se vor folosi înainte de a se deschide şi când sunt încă protejaţi de catafile;

- dacă materialul este reprezentat de ramuri cu muguri acestea se vor parafina la vârf şi

vor fi puse în vase cu apă pentru forţare. În prealabil, se recomandă îmbăierea lor într-o

soluţie de fungicid (Topsin 0,1%; Ronilan, Rovral, Benlate);

- dintre lăstari se vor alege întotdeauna lăstarii cei mai tineri şi porţiunile finale ale

lăstarilor;

- dacă este posibil, plantele se vor transfera din câmp în containere, în sere sau camere

de creştere şi se vor folosi numai părţile crescute ulterior.

Reducerea gradului de infecţie a materialului iniţial provenit din spaţii închise (sere,

solarii) se poate face prin:

- reducerea atacului de insecte vectoare care pot transporta agenţi patogeni;

Page 92: Microinmultirea plantelor

92

- prevenirea atacului de bacterii şi ciuperci prin aplicarea tratamentului cu fungicide

sistemice şi de contact;

- irigarea plantelor folosind sisteme de udare la sol: picurare, scurgerea la suprafaţă etc.

- păstrarea la valori scăzute a umidităţii în sere;

- zvântarea plantelor înainte de dezinfectare.

Tipul de organ folosit pentru inoculare este de asemenea determinant pentru alegerea

modului de dezinfectare şi a agentului sterilizant.

În general, bulbii, tuberculii, rădăcinile tuberizate şi alte organe subterane, au un

grad ridicat de infecţie. Dacă este posibil, aceste organe vor fi puse în prealabil la forţare

pentru a obţine noi creşteri (lăstari) care vor fi folosite apoi pentru inoculare. Dacă însă se

urmăreşte inocularea unor muguri, fragmente de disc, catafile etc., se va spăla foarte bine

materialul şi se vor lua măsuri suplimentare de dezinfectare.

Mugurii pubescenţi, ramurile cu lentile numeroase, tulpinile, lăstarii sau frunzele

pubescente se dezinfectează greu datorită fixării germenilor pe formaţiunile respective şi

datorită dificultăţii cu care agentul sterilizant pătrunde la suprafaţa organului respectiv.

Reducerea tensiunii superficiale a lichidului dezinfectant se face prin adăugarea

câtorva picături de detergent lichid (Tween 20 sau 80).

Pentru a favoriza pătrunderea dezinfectantului în profunzime, sub solzi sau printre

perişori, se poate face şi dezinfectarea sub vid folosind un vas ataşat la o pompă de vid

(foto 4.7.).

Metoda de dezinfectare folosită va ţine seama întotdeauna de natura suprafeţelor

care urmează să fie dezinfectate. Se va lua în calcul de asemenea, permeabilitatea

epidermelor sau învelişurilor pentru agentul sterilizant şi se va ţine cont de modul în care

acesta poate afecta viabilitatea ţesutului ţintă.

La dezinfectarea unor explante aflate în organe de rezervă, rizomi, bulbi,

tuberculi, a unor muguri (atunci când se urmăreşte prelevarea meristemelor, a unor sâmburi

şi seminţe protejate de endocarp sau tegumente puternice, a unor fructe uscate etc., se pot

folosi concentraţii ridicate şi timpi de dezinfecţie mari.

Pentru îmbunătăţirea efectului dezinfectant se recomandă câteva măsuri:

- înlăturarea părţilor exterioare ale organelor: solzi protectori, catafile, etc.

- spălarea intensă cu apă a materialului vegetal înainte de dezinfectare;

Page 93: Microinmultirea plantelor

93

- scufundarea explantelor pentru câteva secunde în alcool de 70% înaintea

dezinfectării chimice. Operaţia are ca scop eliminarea bulelor de aer de la suprafaţa

explantului şi uşurarea pătrunderii agentului chimic;

- adăugarea unor detergenţi (Tween 20 sau 80) în soluţia de dezinfectat în

concentraţie de 0,08-0,12% pentru reducerea tensiunii superficiale a acesteia;

- agitarea în timpul dezinfectării, manual, sau cu un agitator magnetic;

- folosirea dezinfectării sub vid pentru o mai bună impregnare a explantului cu

agentul dezinfectant.

4.5. Contaminările şi detectarea lor

Cauzele apariţiei infecţiilor în vasele de cultură pot fi multiple:

- dezinfectarea ineficientă a inoculilor iniţiali;

- infecţii interne;

- tehnică de lucru necorespunzătoare: mâini murdare, masă de lucru nesterilizată, unelte

nesterilizate, îmbrăcăminte murdară, instrumentar nesterilizat corespunzător etc.

- hotă improprie: filtre îmbâcsite cu praf, flux de aer necorespunzător ca uniformitate şi

viteză, orificii în filtre sau la locurile de îmbinare etc.

- alcool pentru flambarea instrumentarului contaminat. Prin folosirea îndelungată sub

hotă alcoolul se evaporă şi scade concentraţia;

- vasele de cultură au pe pereţii exteriori agenţi patogeni (păstrare în spaţii neadecvate);

- camera de inoculare murdară, nespălată şi nedezinfectată periodic;

- camera de inoculări nu este sterilă;

- accesul persoanelor străine neechipate corespunzător;

- pătrunderea în vasele de cultură a unor vectori (acarieni etc.) etc.

În anumite situaţii culturile sunt aparent sterile dar în momentul divizării explantelor şi

trecerii pe un alt mediu, sau prin pasarea pe un mediu bogat, se constată o infecţie

masivă.

Acest lucru se datorează faptului că agentul patogen se află în ţesuturi sau nu se

dezvoltă pe un mediu sărac.

Infecţiile latente (interne) reprezintă o problemă serioasă pentru culturile in vitro.

Ele se datorează unor agenţi patogeni aflaţi în interiorul plantei şi care nu pot fi distruşi

prin dezinfecţie exterioară.

Page 94: Microinmultirea plantelor

94

Pentru rezolvarea acestei probleme ar fi posibilă cultura de meristeme şi folosirea

antibioticelor în mediul de cultură. Acestea din urmă însă, au deseori efecte fitotoxice.

În mod normal, se folosesc combinaţii de antibiotice diferite pentru a obţine un

efect acceptabil. Unii autori afirmă că folosirea antibioticelor stimulează creşterea

explantelor.

Pentru identificarea infecţiilor latente se recomandă cultivarea unor explante pe

medii bogate care conţin peptone sau triptone (2-3%) sau folosirea unor soluţii pentru

incubat care devin tulburi în prezenţa bacteriilor.

Există bacterii Bacillus licheniformis, B. subtilis rezistente la mijloacele comune

de sterilizare care terorizează laboratoare întregi (în laboratoarele din S.U.A. au fost

denumite “Fantoma albă” - “White ghost”).

Tabelul 4.5.1. Medii folosite pentru identificarea infecţiilor bacteriene latente

Substanţa A

g/l B g/l

C g/l

D g/l

PPLO (Difco) 21,0 - - - Triptone 10,0 - 15,0 - Glucoză 1,0 1,0 - 24,0 Fructoză 1,0 - - - Zaharoză 10,0 - - - Sorbitol 70,0 - - - Extract de drojdie (soluţie 25%)

100,0 (ml)

5,0 - 2,4

Ser de cal 200,0 - - - Roşu de fenol 25,0 - - - Peptone de cazeină - 5,0 - - Peptone de soia - - 5,0 - Agar - 15,0 15,0 - NaCl - - 5,0 1,2 NH3PO4 - - - 1,2 K2HPO4 - 1,0 - 1,2 MgSO4 . 7H2O - - - 0,48

Page 95: Microinmultirea plantelor

95

Capitolul 5

Microînmulţirea plantelor horticole

5.1. Consideraţii generale

Microînmulţirea plantelor in vitro prezintă o serie de avantaje (Pierik, 1987) care

au impus-o în faţa celorlalte metode de înmulţire: generativă şi vegetativă clasică:

- înmulţirea in vitro este mult mai rapidă decât in vivo, într-un an dintr-un explant fiind

posibil să se obţină peste 1 milion de exemplare;

- multe specii care nu pot fi înmulţite in vivo sau care se înmulţesc greu, pot fi

înmulţite in vitro în urma parcurgerii unui proces de juvenilizare;

- creşterea plantelor înmulţite in vitro este mai puternică fapt datorat juvenilizării şi

devirozării. La căpşun, Cameron şi colab. (1986) a observat că, creşterea mai puternică a

explantelor obţinute in vitro se datorează modificărilor survenite în schimburile gazoase

ale acestora;

- este posibilă obţinerea şi înmulţirea plantelor libere de virusuri cu toate avantajele

care decurg de aici;

- plantele cultivate in vitro pot fi transportate în condiţii de siguranţă fitosanitară

desăvârşite putând fi schimbate, exportate sau importate;

- pentru iniţierea unui culturi in vitro este nevoie de o cantitate redusă de material

biologic. Pentru amelioratori acest lucru este foarte important încât se poate realiza o

selecţie drastică a materialului biologic şi în plus, se pot înmulţi indivizi deosebiţi obţinuţi

prin hibridări sau mutante apărute;

- se realizează importante economii de teren, spaţiu, energie şi combustibil;

- oferă posibilitatea controlului total al factorilor de mediu, fapt ce duce la creşterea

productivităţii şi eficienţei culturilor şi la înlăturarea periodicităţii producţiei determinată

de anotimpuri. Se poate, de asemenea planifica producţia de plante obţinute in vitro în

funcţie de necesităţile concrete ale pieţii;

- înmulţirea in vitro permite obţinerea plantelor pe rădăcini proprii, înlăturând altoirea

cu toate dezavantajele pe care aceasta le presupune;

- materialul produs in vitro poate să fie conservat prin diferite metode şi folosit în

momentul în care este cerut;

Page 96: Microinmultirea plantelor

96

- pentru ameliorarea plantelor microînmulţirea in vitro oferă avantaje suplimentare:

• se scurtează timpul necesar producerii şi lansării unui soi;

• se pot obţine şi înmulţi clone homozigote care să fie folosite pentru producerea

hibrizilor F1;

• prin utilizarea agenţilor mutageni în diferite faze şi tipuri de culturi in vitro se pot obţine

şi selecţiona mutante valoroase. Procedeul este folosit mai ales la cultura de calus şi la

regenerarea de lăstari adventivi din mezofil;

• prin cultura explantelor in vitro în condiţii extreme, se poate realiza stres-selecţia

genotipurilor noi (ex. rezistenţa la sărături);

• manipulările genetice de tipul hibridărilor somatice nu se pot concepe fără folosirea

culturilor de celule şi protoplaşti in vitro;

• anumite plante necesită înmulţire vegetativă exclusivă: haploizii, mutantele sterile,

liniile mascule sterile folosite la hibridări, aneuploizii sau heterozigoţii deosebiţi;

• materialul genetic valoros poate fi conservat în bănci de gene sub formă de explante in

vitro.

Folosirea microînmulţirii in vitro este limitată uneori de anumite dezavantaje:

- în anumite situaţii, stabilitatea genetică a materialului înmulţit in vitro este redusă;

- plantele înmulţite in vitro prezintă uneori defecte caracteristice şi după ce sunt

trecute in vivo: juvenilitate accentuată manifestată prin frunze necaracteristice, prezenţa

spinilor etc., lăstărire adventivă, fructificare întârziată, vigoare exagerată, pierderea

caracterului dominant;

- uneori înrădăcinarea explantelor înmulţite in vitro este greoaie sau imposibilă. De

regulă, rădăcinile formate in vitro au o funcţionalitate redusă, ele fiind înlocuite de alte

rădăcini în faza de aclimatizare;

- aclimatizarea plantelor obţinute in vitro este foarte dificilă datorită unor modificări

morfo-anatomice şi fiziologice care apar pe durata cultivării in vitro. Pentru realizarea

aclimatizării trebuie construite structuri speciale, sere, solarii dotate cu dispozitive de

control al factorilor de mediu;

- clonarea exagerată favorizează creşterea riscurilor de distrugere în masă a unor clone

de către rase virulente de boli şi dăunători apărute ulterior. Pentru evitarea acestor situaţii

se va opta pentru varianta înmulţirii şi plantării multiclonale;

- capacitatea regenerativă a explantelor poate să se reducă sau să se piardă prin culturi

repetate, după un număr mare de subculturi;

Page 97: Microinmultirea plantelor

97

- în anumite situaţii, sterilizarea totală a materialului iniţial este dificilă sau imposibilă;

- microînmulţirea in vitro presupune existenţa unor structuri specializate şi a unei forţe

de muncă calificate.

5.2. Fazele microînmulţirii in vitro

5.2.1. Pregătirea materialului vegetal

Prima fază a microînmulţirii in vitro este o fază importantă mai ales pentru speciile

lemnoase care trebuie să treacă printr-o fază de juvenilizare. Juvenilizarea materialului

biologic ce urmează să fie înmulţit in vitro, se poate realiza prin:

- tăieri repetate, puternice, fiind stimulate astfel creşterile noi;

- prin butăşire;

- prin altoiri repetate sau microaltoire.

Materialul biologic juvenil se poate obţine şi prin germinarea sâmburilor şi

seminţelor atunci când este posibil.

În acelaşi timp, faza de pregătire presupune cultivarea plantelor destinate prelevării

de explante, în spaţii închise pentru prevenirea sau reducerea contaminărilor sau pentru

efectuarea unor tratamente fitosanitare eficiente. Se recomandă cultivarea plantelor în

sistem hidroponic sau alte sisteme „hors sol”.

Pentru iniţierea culturii, în perioada de repaus, ramurile sunt forţate în camera de

creştere în vederea umflării mugurilor şi pornirii în creştere a lăstarilor (foto 5.1.)

Foto 5.1. Ramuri anuale de fag puse la forţare

Page 98: Microinmultirea plantelor

98

5.2.2. Iniţierea şi stabilizarea

Faza de iniţiere şi stabilizare a culturilor in vitro presupune, sterilizarea materialului

vegetal, izolarea explantelor (meristeme, apexuri, fragmente uninodale, seminţe, frunze

etc.) şi inocularea acestora pe un mediu de iniţiere (foto 5.2., 5.3.).

Foto 5.2. Apexuri de lăstari de fag în faza de iniţiere şi stabilizare

Mediile de iniţiere sunt în general variante ale mediilor obişnuite, recomandate

pentru specia respectivă, având însă concentraţia de săruri redusă la jumătate. Frecvent în

această fază, se folosesc reţete de medii lipsite de hormoni.

Foto 5.3. Plantulă de cicoare (Cichorium intybus) obţinută prin germinare in vitro

(Diaconescu O., 2002)

Page 99: Microinmultirea plantelor

99

De asemenea, este importantă realizarea culturii aseptice şi începerea creşterii

explantelor. Pentru depistarea infecţiilor latente sunt necesare teste suplimentare pe medii

bogate în zaharuri, peptone, etc.

5.2.3. Multiplicarea

Faza de înmulţire (multiplicare) se întinde pe mai multe subculturi cu o durată de 3-

4 săptămâni. În această fază, scopul principal este creşterea ratei de multiplicare în

condiţiile menţinerii stabilităţii genetice a materialului. Creşterea ratei de multiplicare se

poate obţine prin stimularea lăstării axilare (foto 5.4.), prin stimularea alungirii lăstarilor,

sau prin ambele metode simultan (foto 5.5., 5.6.).

a b

Foto 5.4. Multiplicarea prin lăstărire axilară la cicoare (a) şi hosta (b)

Foto 5.5. Începerea multiplicării la

Hakonechloa aureola-graminee ornamentală

Foto 5.6. Multiplicarea la măr – soiul Fuji

Page 100: Microinmultirea plantelor

100

Acest deziderat se realizează, în general, prin creşterea cantităţii de citochinine din

mediu sau, prin realizarea unui balanţe hormonale înclinate în favoarea citochininelor.

Numărul de subculturi trebuie să fie limitat (variază cu specia) şi orice prelungire a

fazei respective necesită verificări suplimentare a stabilităţii genetice a materialului.

5.2.4. Înrădăcinarea

Faza de înrădăcinare sau de pregătire a materialului pentru trecerea in vivo este o

fază importantă care constă în reducerea lăstăririi axilare, stimularea alungirii lăstarilor,

inducerea formării rădăcinilor sau chiar formarea rădăcinilor (foto 5.7.).

Foto 5.7. Rozete de Gasteria înrădăcinate in vitro

Frecvent în această fază, se folosesc medii de cultură adiţionate cu cărbune vegetal,

lipsite de hormoni sau cu concentraţii mai ridicate în auxine (Stănică şi colab. 2003).

O altă variantă constă din cultivarea pe un mediu cu concentraţie ridicată de auxine

o anumită perioadă urmată de cultivarea pe un mediu fără hormoni.

Din raţiuni economice, însă, tot mai multe laboratoare industriale optează pentru

realizarea înrădăcinării simultan cu aclima-tizarea (foto 5.8.).

Page 101: Microinmultirea plantelor

101

Foto 5.8. Înrădăcinarea in vivo a lăstarilor de smochin, simultan cu aclimatizarea

5.2.5. Aclimatizarea

Faza de aclimatizare este cea mai dificilă etapă în producerea materialului

microînmulţit. Lăstarii înrădăcinaţi sau cu primordii de rădăcini sunt trecuţi în amestecuri

de pământ (foto 5.9.) şi apoi menţinuţi într-un spaţiu caracterizat prin umiditate relativă

ridicată şi temperatură controlată (foto 5.10.).

Foto 5.9. Transferul plantelor obţinute

in vitro pentru înrădăcinare şi aclimatizare in vivo la firma Vitroplant,

Italia

Foto 5.10. Solar pentru aclimatizarea plantelor obţinute in vitro la firma

Vitroplant, Italia

Page 102: Microinmultirea plantelor

102

Înainte de a fi folosit pentru producţie materialul săditor de pomi şi viţă de vie

trebuie să fie plantat în câmp sau solar, pentru creştere şi fortificare (foto 5.11., 5.12.,

5.13.).

Foto 5.11. Plantă de smochin aclimatizată înaintea fortificării

Foto 5.12. Şcoală pentru fortificarea materialului săditor microînmulţit de actinidia

la firma Vitroplant Cesena, Italia

Page 103: Microinmultirea plantelor

103

Foto 5.13. Plante de măslin înmulţite in vitro la încheierea procesului de fortificare

în solar (Vitroplant, Cesena, Italia)

5.3. Cultura de meristeme şi apexuri

Plantele superioare deţin ţesuturi cu o mare capacitate de proliferare care au ca rol

creşterea în lungime a unor organe, îngroşarea altora şi chiar generarea de noi organe atât

la nivelul tulpinii cât şi al rădăcinii.

Aceste ţesuturi denumite meristeme de creştere, sau simplu, meristeme, sunt

alcătuite din celule bogate în citoplasmă, cu numeroase mitocondrii, cu nucleu mare şi cu

vacuole reduse ca dimensiuni. Pereţii celulari sunt subţiri, celulozici iar forma celulelor

variază de la poligonală la tabulară.

5.3.1. Clasificarea meristemelor

Meristemele se pot clasifica după mai multe criterii, astfel:

1. După tipul structurilor pe care le formează meristemele sunt clasificate în

meristeme organogene şi meristeme histogene. Din acest punct de vedere se cunosc

meristemele primare, meristemele secundare şi cele speciale.

Meristemele primare sunt de mai multe feluri:

- meristeme terminale (apicale) sunt situate în vârful ramificaţiilor tulpinii şi

rădăcinii asigurând creşterea acestora în lungime. Aceste meristeme se formează în

momentul în care ia naştere embrionul şi rămân active o perioadă îndelungată. În decursul

Page 104: Microinmultirea plantelor

104

anului există perioade de diviziune intensă a celulelor meristematice (perioada vegetativă)

şi perioada de repaus relativ (în timpul sezonului rece).

În perioadele de inactivitate relativă meristemele sunt protejate în structuri de tipul

mugurilor. Se cunoaşte procesul de inhibiţie corelativă pe care meristemele apicale îl

manifestă în raport cu cele axilare, fapt explicat prin conţinutul ridicat în auxine al celor

dintâi.

- meristeme axilare (laterale) - se formează la subsuoara frunzelor pe lăstarii în

creştere. Formarea lor este legată de evoluţia meristemului apical.

Prin diviziunea rapidă a celulelor meristematice existente la nivelul meristemului

terminal se formează spre exteriorul conului de creştere primordiile foliare iar la subsuoara

acestora, primordiile mugurilor laterali (axilari). Primordiile mugurilor axilari sunt

alcătuite la rândul lor, din celule de tip meristematic cu rol în dezvoltarea viitorilor muguri.

În acelaşi timp, spre baza conului de creştere în zona centrală, se formează vasele

conducătoare şi ţesut parenchimatic.

La plantele perene, formarea meristemelor laterale are loc deci, cu un an înaintea

pornirii lor în activitate.

- meristeme adventive - sunt în general meristeme profunde situate atât pe tulpină

cât şi pe rădăcină, în zona periciclului. Activarea acestor meristeme se face frecvent la

speciile care emit drajoni sau în situaţia în care planta pierde din diferite cauze, organe sau

părţi importante. În acest caz, meristemul adventiv va genera organe sau structuri similare

pentru compensarea pierderilor.

- meristemele intercalare se găsesc la monocotiledonate, fiind situate la baza

internodiilor.

- meristemele foliare sunt meristeme de tip adventiv care prezintă importanţă în

generarea unor organe noi, lăstari sau rădăcini, la speciile cu înmulţire vegetativă, prin

frunze sau fragmente de frunze. Aceste meristeme au un rol esenţial în regenerarea unor

structuri noi în cazul organogenezei directe şi a embriogenezei somatice.

Meristemele secundare se întâlnesc la speciile lemnoase, care prezintă creştere în

grosime la nivelul tulpinii sau rădăcinii. Dintre meristemele caulinare cambiul, generează

elemente conducătoare liberiene spre exterior şi vase lemnoase spre interior. În culturile in

vitro cambiul este folosit frecvent ca ţesut regenerativ.

Felogenul, denumit şi strat regenerator subero-felodermic, produce suber spre

exterior şi feloderm spre interiorul organului.

Page 105: Microinmultirea plantelor

105

Meristemele speciale (Hoza D., 1996) sunt caracteristice organelor şi ţesuturilor

cultivate in vitro. Ele au proprietăţi similare meristemelor primare şi dau naştere la

structuri noi de tipul lăstarilor, rădăcinilor sau embrionilor somatici.

Promeristemul apare la nivelul calusului sau a ţesuturilor care au suferit procese

de dediferenţiere. Fiind un ţesut meristematic în fază incipientă, evoluţia sa ulterioară este

influenţată de condiţiile de cultură.

Meristemoidul este folosit ca termen tot pentru a defini o structură asemănătoare

promeristemului şi care poate evolua diferit.

Unii autori (Margara 1982, citat de Cachiţă Cozma, 1984) consideră că

meristemoidul este diferenţiat deja funcţional fiind de tip proliferativ, când dă naştere la

calus, rizogen şi caulogen, când formează rădăcini respectiv lăstari.

Cu toate că se afirmă că meristemul radicular la angiosperme este diferit de cel

caulinar, cele două nefiind interconvertibile, cercetările proprii au dovedit contrariul

(Stănică, 1998).

Astfel, cultivate pe un mediu bogat în citochinine rădăcinile de kiwi au generat

lăstari, în timp ce limbul foliar cultivat pe un mediu cu conţinut ridicat de auxine (Stănică,

1994) a dat naştere la rădăcini (foto 5.14.).

Embrioidul este o structură evoluată care este capabil să genereze elemente

bipolare de tipul embrionilor somatici.

Foto 5.14. Formarea rădăcinilor direct din limbul foliar la kiwi

Page 106: Microinmultirea plantelor

106

Formarea embrioizilor are loc prin procese de diferenţiere în masa celulară a

calusului sau direct prin embriogeneză adventivă la nivelul altor organe (limb foliar,

cotiledoane, etc.).

Meristemului apical la angiosperme este alcătuit din două părţi principale: tunica şi

corpusul.

Tunica este formată din 1-3 straturi de celule care se divid anticlinal pe un plan

perpendicular pe suprafaţă. Ea asigură alungirea conului de creştere.

Corpus - corpul meristemului este format din celule care se divid în toate sensurile.

Aceste celule dau naştere primordiilor foliare şi primordiilor de muguri spre exterior iar

spre bază din zona axială iau naştere vasele conducătoare şi ţesuturile paranchimatice.

2. După zona în care se găsesc meristemele, acestea pot fi meristeme

radiculare sau meristeme caulinare.

Meristemele radiculare au o structură mai simplă şi funcţii limitate. În cadrul

meristemelor radiculare întâlnim:

- meristeme apicale - situate în vârful rădăcinilor sub piloriză (scufie), care au rolul

de a asigura creşterea în lungime a acestora;

- meristeme laterale - situate pe rădăcinile principale cu rol în formarea de noi

ramificaţii;

- meristeme adventive - situate în periciclu având rolul de a naştere la lăstari

(drajoni) sau alte rădăcini.

Meristemele caulinare sunt mult mai complexe din punct de vedere structural şi

funcţional.

La nivelul tulpinii se întâlnesc toate tipurile de meristeme a căror evoluţie este

diferită în funcţie de o serie de factori: nutriţionali, hormonali, de mediu, tehnologic, etc.

5.3.2. Cultura de meristeme

Meristemele caulinare sunt folosite în mod normal pentru a fi cultivate pe medii

aseptice in vitro.

Datorită totipotenţei de care dau dovadă meristemele caulinare, ele vor fi capabile

să genereze organe diferite, deci, în final, plante întregi.

În general, se folosesc pentru iniţierea de culturi meristematice terminale şi cele

axilare (laterale). Acestea sunt capabile să genereze in vitro plăntuţe, care sunt folosite apoi

pentru înmulţirea rapidă.

Page 107: Microinmultirea plantelor

107

Primele încercări de cultivare a meristemelor caulinare şi radiculare in vitro au fost

făcute în 1922 de câtre Kotte la mazăre şi de către Robbins la porumb. Abia în 1946, Ball a

reuşit să obţină plante din apexuri meristematice de Lupinus albus şi Tropaellum majus.

Ulterior, Wetmore şi Morel, citaţi de Cachiţă-Cozma (1984) au studiat comportarea

meristemelor provenite de la diferite specii, în diferite condiţii de cultură.

Epoca optimă pentru prelevarea meristemelor variază de la caz la caz. De regulă se

evită perioadele de latenţă a organelor când activitatea meristematică este redusă.

La garoafe, cel mai mare procent de supravieţuire 1-au avut meristemele recoltate

primăvara sau toamna devreme, în timp ce cele recoltate iarna au înrădăcinat mai uşor, iar

cele recoltate vara au prezentat cel mai ridicat grad de devirozare.

La cartof, meristemele recoltate primăvara şi vara formează plante care

înrădăcinează mai bine decât cele recoltate în a doua parte a anului.

Prelevarea meristemelor se face după sterilizarea prealabilă a materialului vegetal.

În cazul garoafelor, având în vedere că meristemele sunt bine protejate de primordiile

frunzelor se poate renunţa la sterilizare.

La speciile lemnoase care prezintă meristeme protejate de catafilele mugurilor,

sterilizarea poate să se facă la concentraţii mai ridicate ale agenţilor sterilizanţi.

Ulterior prelevarea meristemelor se face la hotă sub o lupă binocular. Se înlătură

treptat catafilele şi primordiile frunzelor cu ajutorul bisturiului şi a unor ace spatulate până

se ajunge la domul meristematic. Excizarea acestuia se face prin una sau două tăieturi

urmărind detaşarea unei cantităţi cât mai reduse din ţesutul aflat dedesubt.

Pentru uşurarea lucrului, la muguri vegetativi proveniţi de la speciile lemnoase

înainte de "dezvelirea" domului meristematic sub lupă, se poate recurge la eliminarea prin

patru tăieturi paralele cu marginile mugurilor a aproximativ 50% din volumul acestora.

Tăierea se va face antrenând şi scoarţa adiacentă de pe ramură şi înlăturând astfel şi

eventualele riscuri de infecţie.

Se ajunge astfel în vecinătatea meristemului şi se continuă operaţia sub lupa

binocular.

După detaşare, meristemul este aşezat uşor de pe lama bisturiului pe mediul de

cultură. Eventual cu ajutorul vârfului bisturiului se face o mică incizie în masa mediului în

care se va aşeza meristemul.

O altă variantă este aceea prin care se cultivă pe mediu meristemul însoţit de mai

multe primordii foliare. În acest caz, după dezinfecţia mugurilor se înlătură numai

Page 108: Microinmultirea plantelor

108

catafilele exterioare ale acestora. Mugurele „dezbrăcat” în acest fel este inoculat pe mediu

şi va porni în creştere în aproximativ două săptămâni. Metoda poate fi folosită pentru

iniţierea culturilor in vitro la speciile lemnoase (foto 5.15. a şi b)

a b

Foto 5.15. Iniţierea culturii cu meristeme şi primordii foliare a – Acer platanoides Drumondi, b – Carpinus betulus Fastigiata

Mediul de cultură folosit este de regulă mediul solid, putându-se însă folosi şi medii

lichide (foto 5.16), meristemele sau apexurile, aşezându-se în acest caz, pe punţi de hârtie.

Frecvent se recomandă reducerea conţinutului de macroelemente la 1/2 (Standardi,

1982). pH-ul mediului variază între 5,5-5,8.

Foto 5.16. Explante de kiwi (Actinidia deliciosa) provenite din apexuri

şi cultivate pe mediu lichid

Page 109: Microinmultirea plantelor

109

Concentraţiile de hormoni sunt reduse 0,1-,5 µm/1, auxinele şi citochininele fiind

indicate pentru stimularea diviziunii celulare, iar giberelinele (GA3) pentru stimularea

alungirii lăstarilor.

Intensitatea luminoasă variază de la caz la caz, în general recomandându-se 2400-

2600 lucşi, cu o perioadă de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. La unele specii, ţinerea

meristemelor la întuneric timp de 3-7 zile, are ca efect reducerea brunificărilor (Stănică şi

colab., 1992).

Există situaţii când intensitatea luminoasă trebuie să atingă valori de 3000-4000

lucşi sau chiar de 10000 lucşi la conifere. Uneori se recomandă suplimentarea luminii

fluorescente, cu lumină roşie.

Temperatura optimă este de 22-25°C. Sunt situaţii în care cultivarea meristemelor

la temperaturi mai ridicate are un efect mai drastic în eradicarea virusurilor (viţa de vie).

După începerea formării lăstarilor din meristeme se trece la înmulţirea acestora

folosind un procedeu adecvat.

Astfel, se poate realiza minibutăşirea lăstarului prin secţionarea lui în fragmente

uninodale sau stimularea lăstăririi axilare şi izolarea lăstarilor formaţi.

Avantajele folosirii meristemelor (după Cachiţă-Cozma, 1984) sunt multiple:

posibilitatea înmulţirii clonale a materialului biologic valoros; eliminarea bolilor şi

dăunătorilor periculoşi; obţinerea unui material juvenilizat cu capacitate mare de

multiplicare; conservarea prin frig a inoculilor valoroşi până în momentul folosirii;

realizarea băncilor de gene.

5.3.3. Cultura de apexuri

Pe lângă folosirea meristemelor, iniţierea culturilor in vitro se poate face şi prin

folosirea unor apexuri de lăstari. Vârful de creştere al lăstarului, însoţit de 1-2 frunze în

formare, este detaşat după o prealabilă sterilizare şi inoculat pe mediul de cultură. Cel mai

bun moment pentru inoculare este perioada de creştere intensă a lăstarilor.

Lăstarii pot proveni de la plante cultivate în câmp sau în seră. În acest caz însă,

gradul de infectare a materialului este ridicat.

O soluţie mult mai practică este obţinerea lăstarilor în laborator prin punerea la

forţare a unor ramuri anuale. În acest scop, ramurile se fasonează în butaşi de 10-15 cm, se

parafinează la vârf şi eventual se dezinfectează prin îmbăiere într-o soluţie de fungicide. Se

pun apoi în vase cu apă la temperatură ridicată (în camera de culturi) urmând ca în 10-14

Page 110: Microinmultirea plantelor

110

zile mugurii să se deschidă şi să se formeze lăstarii care vor fi folosiţi pentru prelevarea

apexurilor (foto 5.17., 5.18.).

Foto 5.17. Ramuri de kiwi (Actinidia arguta) puse la forţat

Foto 5.18. Coarde de viţă de vie puse la forţat în vederea prelevării apexurilor

Page 111: Microinmultirea plantelor

111

În tabelele următoare, sunt prezentate câteva din realizările obţinute prin cultura de

meristeme şi apexuri la plantele horticole: legume (5.3.1.), flori (5.3.2.), pomi şi arbuşti

fructiferi (5.3.3.), arbori şi arbuşti ornamentali (5.3.4.) şi viţă de vie (5.3.5.). Sunt indicate

mediile de cultură folosite, rezultatul cercetărilor şi bineînţeles, autorii.

Page 112: Microinmultirea plantelor

112

Tabelul 5.3.1.

Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la plantele legumicole

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Allium cepa Plantulă înrăd. Havel & Novak (1985) 5,6 30 8 (0,1)BAP+/- ANA Havel&Novak 1985

Apium graveolens Plantule via calus

Murashige&Skoog (1962)

- 30,8 agar (1)2,4-D+(1)BAP Rappaport et al. (1980)

Lăstari Doré (1975) CMI 5,6 20 6 (1) ANA Doré (1975) Calus Reuther (1984) 5,8 30 agar (1) ANA + (1) Kin Reuther (1984)

Lăstar unic Murashige & Skoog (1962)

5,8 20 6 (0,5) ANA Revière & Müller (1974)

Lăstari înrădăcinaţi

Tenedille & Lecerf (1974) KNO3

5,6 20 6 (1) ANA+(0,1) Kin+(0,1) GA3

Tenedille & Lecerf (1974)

Lăstari axilari si înrădăcinare

Murashige & Skoog (1962)

5,7 30 7 (0,1-0,3) ANA + (0,05-0,1) Kin

Yang & Clore (1973)

Plantule libere de virusuri

Murashige & Skoog (1962)

5,7 30 7 (0,1)ANA + (0,1) Kin Yang & Clore (1976)

Lăstari multipli Murashige & Skoog (1962)

5,7 30 7 (0,1)ANA + (0,1) Kin Yang (1976)

Asparagus officinalis

Creşterea lăstarilor

Yang (1977) 5,7 30 7 (0,05 - 0,1)ANA + (0,05) Kin

Yang (1977)

Brassica oleracea capitata

Regenerarea lăstarilor

Murashige & Skoog (1962)

- 30 agar (12,9) Kin Walkey et al (1980)

Cichorium intybus Regenerare lăstari Quoirin&Lepoivre (1977) 5,8 (0,1)GA3 + (0,05) BAP Pieron et al (1992) Cucumis sativus Lăstar unic,

înrădăcinat Handley&Chambliss

(1979) 30 agar (0,1)ANA+(0,1) Kin Handley&Chambliss

(1979) Dezvoltare pana

la 5 mm Tran Than Van (1973) 5,8 30 lichid (8)AIA+ (2,56)Kin Pink & Walkey

(1984) Cucurbita pepo

Proliferare lăstari

Tran Than Van (1973) 5,8 30 10 (1)BAP Pink & Walkey (1984)

Page 113: Microinmultirea plantelor

113

Tabelul 5.3.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

lăstari Elliot(1969)M-S 5,8 30 lichid (1)AIA Elliot(1969) calus Murashige & Skoog

(1962) 5,6-5,8 30 7 (0,1)2,4-D Jarret et al. (1984)

Lăstari multipli Kartha et al.(1974a) 5,7 30 6 (0,2-1)ANA sau AIA + [(0,2-1)BAP/Z/Kin]

Kartha (1982b)

Caulogeneză Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (1)BAP sau [(1)AIA+(1)Kin]

Litz&Conover(1978b)

Lăstar unic Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 agar BAP Moyer&Collins(1982)

Ipomoea batatas

Lăstar unic devirozat

Nielsen(1960) 30 10 - Nielsen(1960)

Dezvoltare lăstari

Kartha et al.(1974a) 5,8 30 8 (1)ANA+(0,5)BAP Bloksberg&Saltveit (1985)

Lactuca sativa

Lăstari cu rădăcini

Miller (1961a,1963) 5,8 30 10 (5)AIA+(0,5)Kin Koevary et al (1978)

Lycopersicon esculentum

Lăstari cu rădăcini

Gresshoff&Doy (1972a,b)DBM2

5,8 -6,4 20 8 (8)ANA+(0,1 ) Kin Gresshoff&Doy (1972b)

Phaseolus vulgaris

Lăstari multipli Kartha et al (1974 a) 5,7 30 6 (1,9) ANA + (1,1) BAP Kartha (1982 b)

Proliferare lăstari

Kartha et al (1974 a) 5,6 30 8 (0,02) ANA + (4,5) BAP

Griga et al (1986)

Regenerare plantă

Gamborg et al (1968) B 5

8 (0,11) BAP Haskins & Kartha (1980)

Pisum sativum

Dezvoltare lăstari

Gamborg et al (1968) B 5

5,7 20 6 (0,19) ANA + (0,1) BAP

Kartha et al (1974b; 1979)

Lăstar unic Murashige & Skoog (1962)

20 lichid (2) AIA + (2) Kin Dodds & Roberts (1982)

Alungire lăstari Goodwin (1966) 30 lichid (0,01) AIA + (1) Kin Goodwin (1966)

Solanum tuberosum

Plante devirozate

Morel & Martin (1955) 20 agar Morel & Martin (1955)

Page 114: Microinmultirea plantelor

114

Tabelul 5.3.2. Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la plantele floricole

Denumirea speciei Rezultat Mediu pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Anthurium

andraeanum Dezvoltare

lăstari Kunisaki (1975) 5,8 20 0 15% CM Kunisaki (1980)

Begonia rex Dezvoltare lăstari +

înrădăcinare

Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 6 Cassells & Morrish (1985)

Calus Lindemann et al (1970) 1

5,5 50 0 (0,1) ANA + (0,1) Kin + 15% CM

Lindemann et al (1970)

Protocorm Knudson (1946) C 5,2 20 Agar (1) AIA sau (1) ANA Morel (1965 b)

Cattleya sp,

Protocorm Reinert & Mohr (1967) 2

5 6 (1,75) ANA + (1,75 ) IBA + (1) Kin

Reinert & Mohr (1967)

Chrysanthemum sp,

Lăstari adventivi şi axilari

Linsmaier & Skoog (1965) 30 5 (0,02) ANA + (2) Kin Bush et al (1975)

Cultura de meristeme

Hollings (1965) 40 0 (1) ANA Hollings (1965)

Calus friabil Nitsch & Nitsch (1965) S

5,5 20 6 (2) ANA + (2-5) Kin Sangwan & Harada (1977)

Lăstar înrădăcinat

Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 10 (1) ANA + (0,001) Kin Smith & Murashige (1970)

Coleus blumei

Planta întreagă Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 10 (1) AIA + (0,003) Kin Smith & Murashige (1970)

Colocasia esculenta

Proliferare lăstari

Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 0 (0,15 – 1,5) AIA + (1) Kin

Jackson et al (1977)

Cordyline terminalis

Proliferare lăstari

Evaldsson & Welander (1985)

5,8 30 6 (0,1) ANA + (2) BAP Evaldsson & Welander (1985)

Page 115: Microinmultirea plantelor

115

Tabelul 5.3.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Propagare Morell (1965 a) 5,2 20 Agar Morell (1965 a) Protocorm Knudsom (1946) C 5,2 20 Agar Morell (1965 b)

Calus Reinert & Mohr (1967) 1 0 (1,75) ANA + (1,75) IBA

Reinert & Mohr (1967)

Protocorm Reinert & Mohr (1967) 2 6 (1,75) ANA + (1,75) IBA +(1) Kin

Reinert & Mohr (1967)

Cymbidium sp,

Organogeneză Vacin & Went (1949) 6 20 8-9 10 % CM Sagawa & Kunisaki (1982)

Protocorm Morell (1965a) 5,2 20 Agar Morell (1965 a) Dendrobium sp

Diferenţiere Vacin & Went (1949) 6 20 8-9 10 % CM Sagawa & Kunisaki (1982)

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

30 Agar (1) ANA Hackett & Anderson (1967)

Dianthus caryophyllus

Muguri axilari Hempel (1979) 5,8 20 0 (1,35) BAP Hemplel (1979) Freesia

superfreesia Rizogeneză Petru et al (1976)

meristem 30 Agar (2,5) Kin Petru et al (1976)

Gladiolus sp, Plantulă Murashige & Skoog(1962)

5,9 30 7 (0,1)ANA + (2-5)Kin +15% CM

Sutton (1978)

Iris spp, Cultură meristeme

Hollings (1965) 40 glucoză 0 (1)ANA Hollings (1965)

Lilium sp, Cultură meristeme

Hollings (1965) 40 glucoză 0 (1)ANA Hollings (1965)

Mammillaria carmenae

Lăstărire Vyskot & Bezdek (1984)1 sau 2

5,5 30 agar (1)ANA + (2)BAP Vyskot &Jara (1984)

Mammillaria prolifera

Lăstărire Vyskot & Bezdek (1984)1 sau 2

5,5 30 agar (0,5-1)ANA + (0,5-1)BAP

Vyskot &Jara (1984)

Oncidium lanceanum

Iniţiere Lim-Ho (1982) VW 0 0 15% CM Lim-Ho (1982)

Oncidium spp, Diferenţiere Vacin & Went (1949) 20 8-9 Thompson (1975) Pelargonium sp, Lăstar unic Murashige&Skoog(1962) 20 0 (2)AIA + (2)Kin Dodds&Roberts(1982)

Page 116: Microinmultirea plantelor

116

Tabelul 5.3.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Pelargonium spp, Cultură meristeme

Beauchesne et al (1977) I sau II

30 glucoză 6-7 (0,25)AIA + (0,1)2iP + (1)GA3 +/- (2)Ad

Beauchesne et al (1977)

Petunia hybrida Lăstari adventivi via calus

Sharma & Mitra (1976) C

20 7 (0,5)BAP Sharma & Mitra (1976)

Tulipa gesneriana Bulbili Riviere & Muller (1979)

5,5 50 glucoză 6 (0,1)ANA + (0,1)BAP Riviere & Muller (1979)

Tabelul 5.3.3. Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la plantele pomicole

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Lăstari axilari Murashige & Skoog

(1962) 30 0

(agar) (1,8)ANA+ (2)IBA

+(2)Kin Matheus & Rangan

(1979) Ananas comosus

Lăstar unic Murashige & Skoog (1962)

30 0 25% CM Zepeda & Sagawa (1981)

Lăstar unic Rodriguez (1982b) K(h)

5,5 30 6 (1)IBA Rodriguez (1982c)

Lăstari Rodriguez (1982b) K(h) 5,5 30 6 (0,01)IBA+(1)BAP Rodriguez (1982c)

Castanea sativa

Proliferare lăstari

Vieitez & Vieitez(1980b)

5,5 30 7 (0,1)BAP Vieitez & Vieitez(1980b)

Citrus sp, Lăstari axilari si adventivi

Bouzid (1975) A 5,8 30 8 (1)ANA + (1)Kin Bouzid (1975)

Cocos nucifera Rizogeneza D’Souza (1982) BM 68,4 agar (1-2)ANA+12%CM D’Souza (1982) Mullin et al, (1974)B 5,7-5,8 30 glucoză 0 (2,5)AIA + (0,1)Kin Mullin et al, (1974) White (1954)-saruri 20 7 10%CM Miller&Belkengren

(1963)

Fragaria Lăstari devirozati

Adams (1972) 5,2 30 0 (1)IBA+(0,1)BAP Adams (1972)

Page 117: Microinmultirea plantelor

117

Tabelul 5.3.3. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Proliferare lăstari

Boxus (1974a) 5,6 22 glucoză 7 (1)BAP Boxus et al, (1974) Fragaria

Lăstari Mullin et al (191974)A 4,5 30 glucoză 0 (1)AIA Mullin & Schlegel (1976)

Proliferare lăstari

Murashige & Skoog (1962)

5,3 20 7 (1,1)BAP Lane (1979) Malus x domestica

Proliferare lăstari

Jones et al (1977) 5,2 30 7 (1)IBA+(1)BAP+ (0,1)GA3

Snir & Erez (1980)

Musa cavendishii calus Murashige & Skoog (1962)

30 agar (0,3)AIA+(1)Kin sau [(2)BAP+20%CM]

Ma et al (1978)

Musa textilis Lăstari axilari si adventivi

Mante & Tepper (1983) I

5,7 30 5-8 (10)BAP+(80-160)AdS Mante & Tepper (1983)

Prunus cerasifera Proliferare lăstari axilari

Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 7 (0,5)BAP Norton & Norton(1986a)

Rubus idaeus Creştere lăstari Donnelly et al, (1980)2 5,7 30 0 Donnelly et al, (1980)

Rubus sp, Lăstari axilari Skirvin & Chu 1978a,b)0

5,8 30 10 (0,1)ANA+(2)BAP Skirvin et al (1981a)

Proliferare lăstari

Goldy & Lyrene (1984) 5,7 30 4 (10)2iP+(80)AdS Goldy & Lyrene (1984)

Vaccinium sp,

Lăstari axilari Smagula & Lyrene (1984) WPM

5,7 30 0 (5)2iP Smagula & Lyrene (1984)

Page 118: Microinmultirea plantelor

118

Tabelul 5.3.4. Câteva realizări privind cultura de meristeme şi apexuri la arborii şi arbuştii ornamentali

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Înrădăcinare (sub lumină puternică)

Hackett (1970) 5,8 20 (5-10)ANA sau (10)AIA+(5,5) catechol

Hackett (1970)

Înrădăcinare (sub lumină

slabă)

Hackett (1970) 5,8 20 (10)AIA+(5,5) catechol Hackett (1970)

Hedera helix

Lăstari Polito & Alliata (1981)

5,6 20 8 (0,5)ANA + (2)BAP Polito & Alliata (1981)

Lavandula augustifolia & sp,

Calus Kartha et al, (1974a) 5,5 20 7 (1)ANA + (4)BAP + 10%CM

Quazi (1980)

Pinus sylvestris Înmugurire Bornman & Janson (1980)

5,6-5,8 50,5 6-7 (1,1-2,2) BAP + (1-2) 2iP

Bornman & Janson (1980)

Syringa vulgaris Dezvoltare lăstari

Wetmore (1954) 2 20 10 15% CM Wetmore (1954)

Weigela florida 4 lăstari/expl, Murashige & Skoog (1962)

30 agar (2,25) BAP Calvert & Stephens (1986)

Page 119: Microinmultirea plantelor

119

Tabelul 5.3.5. Câteva realizări privind cultura de meristeme si apexuri la viţa de vie

Denumirea speciei Explant Rezultat Mediu pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l)

Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Vitis rupestris Apex lăstar Dezvoltare

lăstar unic Gazly (1964) 6,5 15 8 Gazly (1972)

Vitis rupestris Apex lăstar Lăstar înrădăcinat

Gazly (1964) 6,5 15 8 (0,02)ANA Gazly (1972)

Vitis vinifera Apexuri lăstari Alungire lăstari Webb & Street (1977)CI

30 agar (1,48)BAP Aldwinckle & Buturac (1981)

Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare lăstari

Webb & Street (1977)CI

30 agar (0,023)BAP Aldwinckle & Buturac (1981)

Vitis vinifera Apexuri lăstari Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 0 (2,2)BAP Barlass et al (1982)

Vitis vinifera Apexuri lăstari Lăstari înrădăcinaţi

White (1943a)A 5,8 30 0 (2,2)BAP Barlass et al (1982)

Vitis vinifera Meristeme Proliferare lăstari axilari

Jona & Webb (1979)BG

5,7-5,8 20 3-5,5 (2,25)BAP Jona & Webb (1979)

Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare Jona & Webb (1979)C

5,7-5,8 20 3-5,5 (0,23)BAP Jona & Webb (1979)

Vitis vinifera Meristeme Lăstar unic, înrădăcinat

Jona & Webb (1979)C

5,7-5,8 20 3-5,5 (0,023-0,23)BAP Jona & Webb (1979)

Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare Stevenson & Monette (1983)R

5 30 0 (0,1)AIA Stevenson & Monette (1983)

Page 120: Microinmultirea plantelor

120

5.4. Cultura de fragmente uninodale

Metoda constă în secţionarea lăstarilor crescuţi in vitro în porţiuni uninodale urmată

de cultivarea acestora pe un nou mediu de cultură.

Din mugurii axilari vor lua naştere noi lăstari care după o anumită perioadă de timp

vor fi secţionaţi din nou.

Primele experienţe privind cultura de fragmente uninodale, obţinerea de lăstari şi

înrădăcinarea acestora au fost efectuate de Galston 1947, 1948 şi Gorter 1965, la asparagus.

Pentru realizarea acestei tehnici se pot folosi ca explante iniţiale meristeme, vârfuri de

lăstari (apexuri), muguri aflaţi la subsuoara bracteelor la unele tipuri de inflorescenţe, precum

şi alte organe capabile să genereze lăstari in vitro.

Lăstari se pot obţine prin folosirea unor primordii de muguri florali care se transformă

apoi în structuri vegetative (conopidă - Crisp şi Walkey, 1974).

De regulă în mediul de cultură nu se adaugă citochinine care să anuleze efectul

dominanţei apicale. Se urmăreşte, în fapt alungirea lăstarilor pentru a obţine un număr cât mai

mare de noduri.

Iniţierea culturii este foarte importantă. În vederea stabilizării trebuie realizată

juvenilizarea materialului iniţial.

La speciile lemnoase un alt aspect important îl reprezintă necesitatea ruperii

dormansului mugurilor după inoculare. Acest lucru este posibil prin tratamente cu temperaturi

scăzute (0-5°C), mărirea duratei zilei (16 h) asociată cu temperaturi scăzute, urmate apoi de

creşterea temperaturii.

Uneori se recomandă creşterea concentraţiei de citochinine şi gibereline.

La speciile erbacee dormansul se poate întrerupe prin etiolarea materialului.

Rata multiplicării este direct proporţională cu viteza de creştere a lăstarilor, respectiv

cu numărul de frunze care se formează.

De regulă lăstarii formaţi din apexuri cresc şi se alungesc mai rapid decât cei formaţi

din muguri axilari. De aceea ei sunt trecuţi în vase de cultură separate.

Folosirea mediului de cultură în dublu strat, solid + lichid, a avut ca efect creşterea

vitezei de creştere a lăstarilor de gutui BA-29 (Stănică F. şi colab., 1996).

De asemenea, folosirea apei structurate şi a unor glico-steroizi naturali (Ecostim) a

determinat creşterea lăstarilor de măr (Săvulescu Anca şi Stănică F., 1996).

Folosirea apei π la prepararea mediului pentru faza de multiplicare la măr (foto 5.19.) şi la

smochin a avut ca efect o stimulare a creşterii explantelor şi sporirea proporţională a ratei de

multiplicare (Stănică F. şi colab. 2002, Gâlă R. şi colab. 2003).

Page 121: Microinmultirea plantelor

121

Foto 5.19. Efectul apei π asupra multiplicării in vitro la trei soiuri de măr

La liliac (Syringa vulgaris) stimularea creşterii lăstarilor este posibilă prin folosirea

zeatinei sau a 2ip (Pierik şi colab. 1986).

La Araucaria cunninghammii (Mott, 1981) la realizarea regenerării pot fi folosiţi

numai lăstari ortotropi. La cafea, în schimb (Pierik, 1987) are loc o transformare a lăstarilor

plagiotropi în ortotropi.

Metoda de faţă se foloseşte cu succes la foarte multe specii (cartof, manioc, pomi

fructiferi (foto 5.20.a), viţă de vie (foto 5.20.b), trandafir, iederă, clematită (foto 5.21), salcie

pletoasă etc.) (tabelele 5.4.1., 5.4.2., 5.4.3., 5.4.4., 5.4.5.) .

La tomate, castraveţi şi vinete (Pierik, 1987) a regenerat lăstari din seminţe, ca apoi

să-i folosească pentru cultura de fragmente uninodale.

După mai multe cicluri de multiplicare este necesară inducerea înrădăcinării lăstarilor

obţinuţi (foto 5.22.). Acest lucru este realizabil prin folosirea unor tratamente cu auxine

combinate sau nu cu tratamente cu întuneric.

În faza de alungire a rădăcinilor, concentraţia de auxine trebuie redusă.

Page 122: Microinmultirea plantelor

122

a b

Foto 5.20. Cultura de fragmente uninodale la măslin (a) şi la portaltoiul de viţă de vie Richter 110 (b) – Vitroplant

Foto 5.21. Multiplicarea la Clematis sp.

prin stimularea alungirii lăstarilor Foto 5.22. Formarea rădăcinilor la încheierea

ciclului de multiplicare la Sequoia sempervirens

Page 123: Microinmultirea plantelor

123

Tabelul 5.4.1. Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la plantele legumicole

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Lăstari în 4 săptămâni

Murashige & Skoog (1962)

5,7 30 7 (0,09) ANA + (0,11)Kin

Chin (1982) Asparagus officinalis

Lăstari axilari Pelletier et al, (1972) Tosaruri

- 20 5 Doré (1974)

Brassica oleracea botrytis

Lăstari via calus De Fossard et al (1974 a) HMHH

5,5 41,1 8 6 auxine + 2 citochinine Trimboli et al (1977)

Capsicum annuum Muguri adventivi

Phillips & Hubstenb’ (1984, 1985)

5,8 30 glucoză

8 (0,05) AIA + (50 ) BAP Phillips&Hubstenb (1984, 1985)

Plăntuţe înrădăcinate

Murashige şi Skoog (1962)

5,8 GA, BA, ANA Grazia şi co (1985) Cichorium intybus

Calus, muguri, flori

Linsmaier şi Skoog(1965)

5,8 - Harada (1966)

Cucumis sativus Lăstar unic Murashige&Skoog (1962)

5,8 30 agar (0,023)BAP Aziz&McCown(1985)

Lăstar unic Hussey & Stacey (1981)

5,9 30 7 Hussey & Stacey (1981)

Lăstar unic cu rădăcini

Hussey & Stacey (1981)

5,9 30 lichid Hussey & Stacey (1981)

Lăstari Murashige & Skoog (19620

5,8 30 12 Levy (1985)

Lăstari via calus Murashige & Skoog (1962)

5,7 20 7 (1) BAP + (1) GA3 Marani & Pisi (1977)

Solanum tuberosum

Lăstari în 3-5 săptămâni

Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 6 (0,5) BAP Thomas (1981)

Page 124: Microinmultirea plantelor

124

Tabelul 5.4.2. Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la plantele floricole

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Anthurium

andraeanum Lăstari multipli Kunisaki (1975) 5,8 20 8 (0,2 – 1) BAP Kunisaki (1980)

Camellia japonica Iniţiere caulogeneză

Carlisi & Torres (1985; 1986)

5 30 8 (0,5-1) BAP Carlisi & Torres (1985; 1986)

Dendrobium sp, Muguri axilari Ball & Arditti (1976) S 20 13 (2) BAP Ball & Arditti (1976)

Dianthus caryophyllus

Lăstari axilari si adventivi

Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (0,1) AIA + (1) BAP Roest & Bokelmann (1981)

Dracaena deremensis

Lăstari Debergh (1975) 5,8 20 6 Debergh (1975); 1976)

Protocormi Koch (1974) A 20 5 (0,5-3)ANA + (2)BAP Koch (1974) Phalenopsis sp, 55% Lăstari Reisinger et al (1976) 5-5,5 20 13 (2)BAP Reisinger et al

(1976)

Page 125: Microinmultirea plantelor

125

Tabelul 5.4.3. Câteva realizări privind cultura de fragmente uninodale la plantele pomicole

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Actinidia delicosa Lăstari

înrădăcinaţi Harada (1975) 5,5 20 7 (0,1)ANA+ (40) Ad Harada (1975)

Armeniaca vulgaris

70% lăstari Lloyd&McCOWN (1981) WPM

5,2 20 6 (2)2iP Snir (1984)

Castanea mollissima

Proliferare lăstari axilari

Yang et al,(1986) 5,5 20 6,5 (0,1)BAP Yang et al,(1986)

Proliferare lăstari axilari

San Jose et al, (1984) L sau Ha

30 6 (0,1)BAP San Jose et al, (1984)

Castanea sativa

Proliferare lăstari Heinz & Mee (1969) 5,5 30 6 (1)BAP Vieitez&Vieitez(1980b)

Citrus sp, Proliferare lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,7 30 10 (1)BAP+(100)AdS Navarro et al (1975) Corylus avellana Embriogeneză

directă 0,5xCheng (1975)Basal 5,5 30 8 (0,1-1)IBA Pérez et al (1986)

Juglans hindisii x J. regia

Multiplicare lăstari

Driver & Kuniykuhi (1984)DKW

5,5 30 2 gelrite

(0,001)IBA+(1)BAP Driver & Kuniykuhi (1984)

Juglans regia Lăstari Chalupa (1981a)A 30 6 (0,15)ANA+(0,1)BAP +(20)AdS

Chalupa (1981a)

Olea europaea Proliferare lăstari

Rugini&Fontanazza (1981)Shoot

5,8 30 6 (0,5)IBA+(0,5)GA3+ (10)Zr

Rugini&Fontanazza (1981)

Pyrus communis Lăstar unic Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 8 (0,45)BAP Shen&Mullins(1984) Rubus idaeus Lăstar unic Snir (1981)B 5 20 agar (0,22)2,4-D

+(1)BAP+(0,1)GA3 Snir (1981)

Theobroma cacao Proliferare lăstari axilari

Passey & Jones (1983) 5,2 30 7 (0,2)BAP Passey & Jones (1983)

Page 126: Microinmultirea plantelor

126

Tabelul 5.4.3. continuare

1 2 3 4 5 6 7 8 Lăstari axilari Cohen & Elliot(1979) 5,7 30 6 (5)2iP Cohen&Elliot(1979) Vaccinium

corymbosum 1-2 lăstari/expl, Lloyd & McCown (1981) WPM

5,2 30 6 (5)2iP Wolfe et al (1983;1986)

Vaccinium sp Lăstari axilari Smagula & Lyrene (1984)WPM

5,7 30 4 (5)2iP Smagula & Lyrene (1984)

Tabelul 5.4.4. Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la arborii şi arbuştii ornamentali

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Acer negundo Calus Murashige&Skoog(1962) 20 6 (3)ANA + 15%CM Radojevic et al(1980)

Betula verrucosa Calus Chalupa (1981b) 1 30 6 (0,05)IBA+ (0,6)BAP + (20)AdS

Chalupa (1981b)

Paulownia tomentosa

Muguri axilari Ben-Jaacov & Dax (1981)

5,6 30 agar (0,1)ANA + (1)BAP Burger et al (1985)

Ouercus robur Lăstari Chalupa (1984 a,b) BTM sau WPM

20 6 (0,2-1) BAP Chalupa (1984a)

Lăstari Morel & Martin (1955) 15 glucoză 8 Daguin&Letouze(1986)

Salix babylonica

Lăstari Daguin&Letouze(1986)B 15 glucoză 8 Daguin&Letouze(1986)

Salix madsudana Lăstari adventivi şi axilari

Whitehed & Giles (1976)

5,8 20 agar (0,01) ANA + (0,05) BAP + (20) AdSs

Bhojwani (1980)

Tilia cordata Lăstari axilari Chalupa (1984 a,b)WPM

20 6 (0,2-1) BAP + [(0-0,1) ANA sau IBA]

Chalupa (1984 a,b)

Vinca minor Proliferare lăstari Stapfer & Heuser (1985) 5,6-5,8 30 7 (0,018-0,18) ANA + (14,4) BAP

Stapfer & Heuser (1985)

Page 127: Microinmultirea plantelor

127

Tabelul 5.4.5. Cercetări privind cultura de fragmente uninodale la viţa de vie

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Vitis berlandieri x

V. cardinalis Proliferare

lăstari axilari Murashige & Skoog

(1962) 5,8 30 8 (2,25)BAP Novak&Jujova

(1983) Vitis berlandieri x

V. cardinalis Plantule

înrădăcinate 0,5 x Murashige &

Skoog (1962) 5,8 20 7 (0,02)IBA sau ANA Novak&Jujova

(1983) Vitis hybrid Baco Proliferare

lăstari Miller & Murashige

(1976)II 5 30 0 (2-4)BAP+(80)AdS Harris & Mason

(1983) Vitis rupestris Lăstar unic Gazly (1964) 6,5 15 8 Gazly (1964)

Vitis spp. Lăstari multipli Chee & Pool (1982a) 5,8 30 8 (0,09)ANA + (1,1)BAP Chee&Pool (1982a,b)

Vitis spp. Lăstari înrădăcinaţi

Chee & Pool (1982a) 5,8 30 8 (0,02)ANA Chee&Pool (1982a,b)

Vitis vinifera Proliferare lăstari axilari

Webb & Street (1977)CI

30 agar (2,25)BAP Aldwinckle & Buturac (1981)

Vitis vinifera Calus Jona & Webb (1979)C 5,7-5,8

20 3-5,5 (1)ANA+(0,2)Kin Jona & Webb (1979

Vitis vinifera Proliferare lăstari axilari

Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (2,25)BAP Novak&Jujova (1983)

Vitis vinifera Proliferare lăstari

Murashige (1974) 5 30 0 (0,03) IBA+(2)BAP+ (80)AdS

Stevenson & Monette (1983)&

Page 128: Microinmultirea plantelor

128

5.5. Cultura de lăstari axilari

Această metodă presupune, spre deosebire de cultura de fragmente uninodale,

stimularea creşterii lăstarilor axilari prin creşterea concentraţiei de citochinine, fără

stimularea alungirii lăstarului mamă.

Creşterea concentraţiei de citochinine are ca efect eliminarea dominanţei apicale a

mugurelui. Acest lucru este posibil şi prin eliminarea apexului lăstarului iniţial.

Principiile acestei metode sunt cunoscute încă din 1925. Ea a fost aplicată pentru

prima dată de către Hackett şi Anderson (1967) la garoafe, de către Adams (1972) şi Boxus

(1973; 1974) la căpşun şi de Pierik (1973; 1974; 1975a) şi Murashige (1974) la gerbera.

După descoperirea kinetinei, eliminarea dominanţei apicale a fost posibilă prin folosirea

acesteia şi apoi a altor citochinine.

Frecvent această metodă de microînmulţire este folosită în tandem cu cultura de

fragmente uninodale. Astfel, în prima etapă dintr-un explant uninodal se obţine un lăstar,

apoi acest lăstar este trecut pe un mediu cu un conţinut ridicat în citochinine şi este

stimulată formarea lăstarilor axilari.

Cultura de lăstari axilari are o serie de avantaje:

- este simplă;

- rata de multiplicare este relativ ridicată;

- stabilitatea genetică este asigurată;

- este unica metodă de multiplicare eficientă la plantele care cresc în rozetă: căpşun,

gerbera, bromelia etc.).

Necesarul de citochinine este variabil cu specia. Astfel, plantele de Bromelia

obţinute din seminţe au generat lăstari axilari fără citochinine. La multe specii s-a observat

scăderea necesarului de citochinine odată cu creşterea numărului de subculturi datorită

acumulării acestora dar, mai ales datorită juvenilizării lăstarilor.

Concentraţia citochininelor trebuie corelată şi cu stadiul de dezvoltare al

materialului biologic. Astfel, materialul juvenil necesită o cantitate mai redusă de

citochinine decât cel provenit de la plante adulte (Sequoia sempervirens, David, 1982).

Frecvent se recomandă să se folosească medii cu concentraţii scăzute de auxine şi

concentraţii ridicate de citochinine. Raportul citochinine: auxine cel mai recomandat este

de 10:1.

Page 129: Microinmultirea plantelor

129

Felul citochininelor folosite este şi el important. Cele mai multe specii reacţionează

bine la folosirea BAP şi mai puţin bine la kinetină sau 2-iP. Pentru Rhododendron însă, se

recomandă folosirea 2-iP.

Tidiazuronul şi compuşii de substituţie ai piridilfenilureei stimulează uneori mai

mult lăstărirea axilară decât citochininele (Read şi colab. 1986).

În multe situaţii se recomandă distrugerea mugurelui apical şi asocierea acestei

măsuri cu aplicarea citochininelor. Pentru creşterea eficienţei metodei, citochininele

trebuie aplicate după ce lăstarul s-a alungit.

Creşterea concentraţiei de citochinine aduce uneori după sine formarea calusului.

Acest lucru trebuie evitat pentru reducerea riscului apariţiei unor mutaţii.

Uneori formarea lăstarilor axilari este stimulată de folosirea mediului de cultură

lichid (Bromeliaceae).

De regulă, capacitatea de proliferare scade odată cu creşterea numărului de

subculturi, acest fenomen fiind frecvent însoţit şi de formarea calusului.

La căpşun, de exemplu, depăşirea unui număr de 12 subculturi a avut ca efect

apariţia unor modificări fiziologice majore.

Metoda lăstăririi axilare poate fi folosită atât pentru plantele care cresc în rozete

(foto 5.23. a şi b şi 5.24. a şi b), cât şi pentru plantele care formează lăstari obişnuiţi.

Foto 5.23. Rozetă de Drossera sp. înainte de multiplicare (a) şi după (b)

Page 130: Microinmultirea plantelor

130

a b

Foto 5.24. Cultură de lăstari axilari al Cichorium intybus (a) şi Drosera sp. (b)

Uneori stimularea lăstăririi axilare prin mărirea concentraţiei de citochinine are ca

efect apariţia fenomenului de "tufă". Astfel şi după trecerea explantelor pe medii lipsite de

citochinine, pentru alungire sau înrădăcinare acestea continuă să formeze lăstari axilari

numeroşi (foto 5.25.).

Foto 5.25. Lăstărire axilară puternică la explantele de Sequoia sempervirens

În câmp fenomenul se manifestă prin formarea unui număr mare de flori/fructe de

dimensiuni reduse (căpşun).

Page 131: Microinmultirea plantelor

131

Alte efecte negative ale concentraţiei ridicate de citochinine ar fi apariţia unor

frunze de formă anormală, apariţia calusului (foto 5.26.) sau formarea lăstarilor adventivi

susceptibili la mutaţii.

Foto 5.26. Formarea calusului în exces la concentraţii ridicate de citochinine

la dafin (Laurus nobilis) în faza de multiplicare

În prezent metoda este mult folosită la microînmulţirea materialului săditor pomicol

în multe ţări fiind generalizată: Italia, Franţa, Anglia, etc.

Foto 5.27. Cultură de lăstari axilari la smochin (Ficus carica)

În tabelele 5.5.1., 5.5.2., 5.5.3, sunt prezentate câteva cercetări privind cultura de

lăstari axilari la plantele horticole.

Page 132: Microinmultirea plantelor

132

Tabelul 5.5.1. Cercetări privind cultura de lăstari axilari la plantele legumicole

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Lăstari

înrădăcinaţi Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,5)IBA+(0,12)BAP Hussey&Falavigna

(1980) Proliferare lăstari

adv, şi axil, Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,5-4)BAP Hussey (1978a)&

Allium cepa

Proliferare si creştere lăstari

Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,12)ANA+ (2)BAP Hussey (1978a)&

Creştere lăstari şi înrădăcinare

Gorter (1965) - 40 20 Gorter (1965) Asparagus officinalis

Creştere lăstari şi înrădăcinare

Reuther (1984) 5,8 30 agar (0,5) AIA Reuther (1984)

Brassica oleracea botrytis

Lăstari axilari si adventivi

Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 lichid (8) AIA + (2,6) Kin Walkey & Woolfitt (1970)

Regenerare lăstari Qoirin&Lepoivre (1977) 5,8 20 5 (0,1)GA3 + (0,05) BAP Pieron et al (1992) Cichorium intybus Regenerare lăstari Murashige&Skoog(1962) (0,1) AIA + (2) BAP Park & Lim (1999)

Cucumis melo Lăstari axilari şi adventivi

Moreno et al,(1984)MEL

5,8 40 8 (2,5)ANA+(1)BAP Moreno et al, (1984)

Proliferare lăstari Linsmaier&Skoog(1965) 30 agar (4)AIA+(4)kin Herman&Haas(1978) Proliferare lăstari Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 7 (5) BAP Schnap&Preece-1986 Creştere lăstari Shahin (1985) TM –1 5,8 30 6 Shahin (1985)

Lycopersicon esculentum

Plantule înrădăcinate

Shahin (1985) TM –5 5,8 30 6 (0,1) IBA Shahin (1985)

Phaseolus vulgaris Lăstari înrădăcinaţi

Kartha et al (1974a) 5,7 30 6 (0,19) ANA Kartha (1982 b)

Lăstari înrădăcinaţi

Kartha et al (1974 a) 5,6 30 8 (0,93) ANA Griga et al (1986) Pisum sativum

Lăstari înrădăcinaţi

0,5 x Gamborg et al (1968) B 5

5,7 10 6 (0,19) ANA Kartha et al (1974 b; 1979)

Page 133: Microinmultirea plantelor

133

Tabelul 5.5.1. continuare

1 2 3 4 5 6 7 8 Plantule

înrădăcinate Murashige&Skoog

(1962) 30 agar Gleddie et al (1982)

Lăstari înrădăcinaţi

Pelletier et al (1972) Tosaruri

5,8 20 7,5 Isouard et al (1979)

Solanum melongena

Dezvoltare lăstari

White (1954) 20 agar (2) GA3 Yamada et al (1967)

Lăstari înrădăcinaţi

0,5 x Murashige & Skoog (1962)

5,8 15 7 (0,1) AIA + (0,01) Kin Austin & Cassells (1983)

Multiplicare lăstari

Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 lichid (0,1) GA3 + (0,5) Kin Goodwin et al (1980a)

Solanum tuberosum

20% lăstari în 1 luna

Murashige & Skoog (1962)

5,8 10 4 (0,5)Z Thomas (1981)

Tabelul 5.5.2. Câteva realizări privind cultura de lăstari axilari la plantele pomicole

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Actinidia delicosa Lăstari

înrădăcinaţi Harada (1975) 5,5 20 7 (0,1)ANA+ (40) Ad Harada (1975)

Plantule Lakshmi Sita et al (1974)

5,8-6 20 9 (1)ANA Lakshmi Sita et al (1974)

Plantule Murashige&Skoog (1962)

30 agar Mapes (1973)

Ananas comosus

Lăstari multipli Murashige & Skoog (1962)

30 0 (agar)

(1,8)ANA+ (2)IBA +(2)Kin

Matheus & Rangan (1979)

Ananas comosus Creştere lăstari 0,5 xMurashige&Skoog (1962)

30 0 25% CM Zepeda & Sagawa (1981)

Page 134: Microinmultirea plantelor

134

Tabelul 5.5.2. continuare

1 2 3 4 5 6 7 8 Castanea sativa Proliferare

lăstari Vieitez &

Vieitez(1980a) 2 5,5 30 6 (1-2)BAP Vieitez &

Vieitez(1980a) Lăstar unic Murashige & Skoog

(1962) 5,8 30 8 (0,18)ANA+(0,1)BAP

+(0,03) GA3 Muriithi et al,

(1982) Ficus carica

Proliferare lăstari

Linsmaier & Skoog (1965)

5,2 30 7 (0,5)BAP+(0,1)IBA+(0,1)GA3+(89)PG

Pontikis & Melas (1986)

Creştere lăstari si rădăcini

Jones & Vine (1968)B 5,6-5,8 40 glucoza 0 Jones & Vine (1968)

Glossularia redinata

Dezvoltare lăstari

Jones & Vine (1968)B 5,6-5,8 40 glucoza 0 (1)IBA+(0,2)BAP +(1)GA3

Jones & Vine (1968)

Malus x domestica 8 lăstari/ explant

Linsmaier & Skoog (1965)

5,2 29,9 7 (0,1)IBA+(0,99)BAP +(0,48)GA3

Van Nieuwkirk et al (1986)

Musa spp. Lăstari unic Heinz & Mee (1979) 5,8 40 7 (5)BAP Cronauer & Krikorian (1984)

Rubus idaeus Proliferare lăstari

Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (0,1)IBA+(4)BAP Anderson (1979)

Page 135: Microinmultirea plantelor

135

Tabelul 5.5.3. Cercetări privind cultura de lăstari axilari la arborii şi arbuştii ornamentali

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Clematis sp. Lăstari multipli Linsmaier & Skoog

(1965) 30 6 (10)BAP Kratz &

Langhans(1978) Cotoneaster

dammeri Lăstari multipli Linsmaier & Skoog

(1965) 5,8 30 7 (1)BAP Norton & Boe

(1982) Crataegus

rachyacantha Lăstari multipli Linsmaier & Skoog

(1965) 5,8 30 7 (1)BAP Norton & Boe

(1982) Fraxinus

americana Lăstari multipli Lloyd & McCown

(1981) WPM 5,2 20 lichid (5-10)BAP Heiman & Preece

(1983) 6 lăstari/ explant Gamborg et al,

(1968)B5 5,5 20 2

gelrite(1,8)BAP Bailey et al, (1986) Hydrangea

macrophylla Proliferare

lăstari Miller & Murashige

(1976) II 5,7-5,8 20 7 (1)BAP Stoltz (1984)

Lavandula augustifolia & sp.

Plantule Kartha et al, (1974a) 5,5 20 7 (2) 2,4-D+ (4)BAP + 10%CM

Quazi (1980)

Picea glauca Proliferare lăstari

Rumary & Thorpe (1984)

5,9 30 8 Rumary & Thorpe (1984)

Page 136: Microinmultirea plantelor

136

Capitolul 6

Devirozarea plantelor horticole prin culturi in vitro

6.1. Devirozarea prin culturi de meristeme

Un alt scop al înmulţirii prin meristeme este acela de a obţine plante sănătoase,

libere de virusuri, micoplasme şi chiar alţi agenţi patogeni. Înmulţirea vegetativă aduce

după sine şi transmiterea agenţilor patogeni menţionaţi în descendenţa clonală.

Înmulţirea generativă, prin seminţe înlătură în parte transmiterea virusurilor. Ea nu

poate fi folosită însă la toate speciile deoarece:

- nu toate speciile formează seminţe, sau numărul seminţelor este insuficient;

- descendenţa obţinută prin seminţe la plantele alogame este neuniformă;

- înflorirea sau fructificarea descendenţilor obţinuţi din sămânţă sunt întârziate

datorită perioadei juvenile lungi;

- o serie de viroze se transmit prin polen sau prin sămânţă (prin polen la pomii

fructiferi şi prin sămânţă la leguminoase: mazăre, fasole, soia etc.).

Având în vedere că o serie de genotipuri se înmulţesc numai vegetativ apare riscul

degenerării acestora sub influenţa atacului de virusuri.

În perioada anilor (1949-1950) Limasset şi Cornuet (citaţi de Martin, 1977) au

constatat că intensitatea virozării organelor vegetative creşte proporţional cu distanţa

zonei analizate faţă de apex. Astfel, cei doi au aşezat ţesut meristemal apical (calota +

câteva primordii foliare) pe rana existentă pe o frunză de tutun. După un timp s-a

constatat virozarea frunzelor de tutun în proporţie de 60%. Atunci când s-au folosit ca

inoculi zone mai depărtate de meristem, infectarea s-a produs în proporţie de 100%.

Plecând de la aceste observaţii, Morel (1952) reuşeşte să obţină plante sănătoase,

devirozate, prin cultivarea unor apexuri meristematice de dimensiuni reduse (75-100 µm

lăţime şi 150-200 µm înălţime) cu 1-2 primordii foliare, provenite de la plante bolnave.

Morel şi Martin au obţinut primele rezultate prin devirozarea daliilor şi în

continuare au extins metoda la cartof şi orhidee.

Quak (1957) a aplicat devirozarea prin culturi de meristeme la garoafe.

Din acest moment s-au pus bazele tehnologiilor industriale de devirozare a

materialului biologic vegetal. Plantele devirozate obţinute sunt în continuare înmulţite in

vitro pentru a obţine o descendenţă suficient de numeroasă.

Page 137: Microinmultirea plantelor

137

Ulterior ele se păstrează în izolatoare speciale (depozitare) şi constituie capetele de

clonă furnizând materialul iniţial pentru înmulţirea în condiţii de câmp.

Folosirea culturilor de meristeme pentru devirozarea materialului biologic a făcut

posibilă eradicarea şi a altor boli produse de ciuperci sau bacterii.

Astfel, la garoafe s-a înlăturat infecţia de Fusarium roseum şi F. oxysporum f.

dianthi, în timp ce la Dieffenbachia s-au eliminat bacteriozele sistemice (Pseudomonas

caryophylli şi Pectobacterium parthemi).

În ceea ce priveşte motivaţia faptului că celulele meristematice sunt libere de

virusuri există o serie de ipoteze:

- s-ar părea că datorită diviziunii intense a celulelor în meristem, există o competiţie

între acestea şi particula virală, pentru folosirea acizilor nucleici sintetizaţi. Acizii nucleici

se pare că sunt puşi la dispoziţia diviziunii celulare în detrimentul multiplicării virale

(Quak, 1966);

- o altă ipoteză se referă la faptul că absenţa plasmodesmei şi a structurilor

vasculare în meristem împiedică răspândirea virusului;

- alte explicaţii precizează că datorită concentraţiilor ridicate de auxine şi

citochinine din apexurile meristematice penetrarea particulelor virale este oprită sau chiar,

are loc inactivarea acestora (Quak, 1977);

- alţi autori afirmă că dezvoltarea virusurilor este împiedicată în apexurile

meristematice datorită lipsei unor enzime specifice de care acestea au nevoie pentru

multiplicare sau, datorită prezenţei unor substanţe inhibitoare;

- o explicaţie plauzibilă este şi aceea că ritmul diviziunilor celulare în meristeme

este mult mai mare decât ritmul replicării virusului. Acest lucru este evident în special

atunci când plantele bolnave sunt crescute în condiţii foarte favorabile fapt ce duce la

alungirea rapidă a lăstarilor.

- o altă explicaţie ar fi faptul că meristemul excizat suferă un traumatism puternic

(cu atât mai mare cu cât el este de dimensiuni mai mici) prin secţionare, fapt care duce la

eliminarea virusurilor. Acest lucru a fost remarcat de Hollings şi Stone (1964) la garoafa şi

de Walkey şi colab. La cireş (1969).

Din păcate nu toate virozele pot fi înlăturate prin cultura de meristeme. La cartof

virusul X a putut fi înlăturat doar în proporţie de 1%.

În acest caz se recomandă combinarea microînmulţirii prin culturi de meristeme cu

termoterapia.

Page 138: Microinmultirea plantelor

138

Această metodă constă din cultivarea plantelor supuse devirozării timp de 5-10

săptămâni la temperatura de 35-39°C, fapt care determină o inactivare a virusului. Acest

efect se obţine prin păstrarea organelor furnizoare de meristeme la temperaturi ridicate (ex.

tuberculii de cartof la 37-38°C).

Urmează apoi excizarea meristemelor şi inocularea lor pe mediu (foto 6.1.).

Foto 6.1. Excizarea apexului meristematic la viţa de vie după încheierea

tratamentului de termoterapie (Vitroplant, Cesena)

În acest sens se face sterilizarea vârfurilor de lăstari în alcool 70% urmată de

imersia în hipoclorit de sodiu sau calciu. Se înlătură apoi frunzele inclusiv cele tinere din

vârf şi se repetă sterilizarea cu alcool (70%) fără să se mai facă clătirea cu apă, deoarece

picăturile de apă îngreunează detaşarea meristemelor.

Meristemul izolat este apoi detaşat şi inoculat pe mediul de cultură. Dimensiunile

explantului trebuie să fie reduse (0,1 mm diametru şi 0,2-0,4 mm înălţime).

Creşterea numărului de primordii foliare cu care se detaşează meristemul determină

scăderea ratei de devirozare. În sens contrar, în multe situaţii detaşarea meristemului fără

cele 2 primordii foliare duce la moartea acestuia.

Pentru cultivarea meristemelor se foloseşte apoi, tehnica descrisă în subcapitolul

5.3., având ca scop final, multiplicarea rapidă a materialului devirozat.

Page 139: Microinmultirea plantelor

139

Înainte de începerea multiplicării propriu-zise este esenţial să se facă testarea

gradului de devirozare a materialului biologic apelând la tehnici serologice de tipul testului

ELISA.

În anumite situaţii lăstarii obţinuţi nu înrădăcinează. În acest caz se recomandă

altoirea in vitro a lăstarului devirozat pe un portaltoi obţinut din seminţe in vitro (Morel,

1964 - la dalia). Tehnica poartă denumirea de microaltoire şi va fi prezentată în continuare.

6.2. Microaltoirea

Obţinerea plantelor libere de virusuri se poate realiza prin diferite metode

microaltoire.

Microaltoirea plantelor horticole poate fi definită ca un ansamblu de tehnici

moderne, prin care se realizează îmbinarea între un explant de dimensiuni mici (crescut şi

multiplicat in vitro) şi un portaltoi adecvat, micropropagat sau obţinut prin metode

tradiţionale.

Gândită pentru prima dată de Morel şi Martin (1952) ca metodă pentru devirozarea

daliei, microaltoirea a fost folosită cu succes de către Murashige şi colab. (1972) şi apoi de

către Navarro şi colab. (1975).

Datorită faptului că în urma termoterapiei meristemul izolat are o capacitate redusă

de creştere, sau că, uneori lăstarii regeneraţi din meristeme nu formează rădăcini, se

recurge la altoirea acestora pe portaltoi stabilizaţi, proveniţi de la plante sănătoase.

De la caz la caz, microaltoirea se realizează în condiţii aseptice, concreşterea

partenerilor urmând a fi făcută în prima fază in vitro, sau în condiţii septice, "la masă",

când prinderea are loc în seră.

Microaltoirea oferă cercetătorului şi pepinieristului un câmp larg de posibilităţi

pentru rezolvarea unor probleme existenţiale la culturile in vitro şi pentru înlăturarea unor

neajunsuri ale înmulţirii clasice prin altoire.

Principalele câştiguri pe care le aduce microaltoirea sunt:

- se rezolvă problema producerii unei mari cantităţi de plante altoite într-un timp relativ

scurt;

- se foloseşte pentru devirozarea materialului genetic virozat în următoarele cazuri:

când acesta nu suportă tratamentele de termoterapie; când există pericolul apariţiei unor

mutaţii în urma termoterapiei; la specii care se înmulţesc greu in vitro;

Page 140: Microinmultirea plantelor

140

- se poate folosi pentru specii care, deşi se multiplică foarte bine in vitro, nu

înrădăcinează;

- este un instrument util pentru studiul afinităţii la altoire a noilor soiuri şi portaltoi

obţinuţi în lucrările de ameliorare. Se pot studia mecanismele de declanşare a lipsei de

afinitate;

- are avantajul că altoiul nu vine în contact cu mediul de cultură şi astfel nu este supus

riscului mutaţiilor sau influenţei directe a hormonilor;

- există posibilitatea juvenilizării materialului îmbătrânit prin microaltoire repetată pe

portaltoi juvenili;

- condiţiile de cultură şi de mediu sunt mai bine controlate.

6.2.1. Microaltoirea in vitro

Constă în altoirea în condiţii aseptice in vitro a unui apex meristematic pe un

portaltoi obţinut din seminţe sau din minibutaşi.

Portaltoii folosiţi trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

- să aibă seminţe cu bună germinabilitate şi creştere pe mediile artificiale de

cultură;

- minibutaşul să aibă ţesuturi elastice şi turgescente;

- minipuietul să aibă cambiu activ uşor depistabil;

- să aibă ţesuturi rezistente la oxidare şi care se înverzesc după trecerea la

lumină;

- să aibă un aparat radicular bine format, capabil să crească şi să trăiască în

mediu lichid de cultură.

În cazul folosirii înmulţirii vegetative a portaltoiului (minibutăşire), în plus, aceasta

trebuie să aibă o rată de multiplicare ridicată, să înrădăcineze uşor şi să nu aibă probleme

de aclimatizare.

1. Obţinerea portaltoiului se poate face din seminţe. În acest sens, pentru început, seminţele

sunt scoase din starea de dormans prin una din metodele cunoscute: stratificare; tratamente

cu citochinine şi gibereline (benzil-aminopurinâ 20 mg/1, respectiv acid giberelic GA3 100

mg/1); tratamente cu frig (4°C), etc.

Se înlătură apoi endocarpul păstrând tegumentele seminale.

Page 141: Microinmultirea plantelor

141

În continuare, se face verificarea viabilităţii seminţelor prin scufundarea timp de 20

de ore a unor probe într-o soluţie 1% de clorură de 2,3,5 trifeniltetrazoliu. Seminţele cu

ţesuturi colorate roşu-intens sunt viabile.

Materialul este supus apoi, la 1-2 sterilizări cu etanol 70%, 1 min., hipoclorit de

sodiu (0,7% clor activ) + Tween 20 0,3% timp de 20 minute, după care se fac spălări

repetate cu apă distilată sterilă. După caz, se face o a doua sterilizare.

Seminţele sterilizate se pun la germinat pe mediu Murashige&Skoog + 10 g/1 agar,

în termostat la 20°C, la întuneric. După 10-20 de zile seminţele germinează şi puieţii se

alungesc.

Portaltoii se pot obţine şi din minibutaşi. Minibutaşii (fragmente uninodale) se

prelevează de la plante libere de viruşi. Se sterilizează apoi cu hipoclorit de calciu (0,7%

clor activ) + Tween 20 (0,3%) şi se trec pe mediu adecvat.

Pentru obţinerea portaltoilor se pot folosi şi meristeme apicale sau laterale. După

mai multe multiplicări, lăstarii se trec pe un mediu de înrădăcinare, de exemplu, la

sâmburoase cu 1 mg/1 IBA.

2. Pregătirea altoiului. Altoiul constă dintr-un apex meristematic provenit fie de la lăstari

crescuţi in vitro, fie de la lăstari sau ramuri in vivo. În al doilea caz înainte de prelevare se

execută un protocol pentru sterilizarea explantelor.

3. Altoirea propriu-zisă se face prin înlăturarea cotiledoanelor de la portaltoii obţinuţi din

seminţe care apoi sunt secţionaţi transversal. Se secţionează de asemenea transversal

portaltoii vegetativi.

Apexul meristematic de dimensiuni foarte reduse (0,3 mm) se detaşează şi se

aşează pe zona cambială a portaltoiului secţionat.

Planta altoită se trece apoi într-o eprubetă sterilă pe mediu de cultură lichid pentru a

se asigura o atmosferă saturată în umiditate, necesară prinderii.

4. Aclimatizarea se realizează când mini-altoiul atinge 1,5-2 cm lungime prin

transplantarea plantei altoite într-un vas in vivo. Se trece apoi gradat la realizarea

aclimatizării în condiţii "blânde" cu umiditatea relativă a aerului, ridicată.

Dezavantajele acestei metode ar consta în folosirea unui personal calificat şi în

tehnica de lucru pretenţioasă.

Page 142: Microinmultirea plantelor

142

6.2.2. Microaltoirea in vivo

Microaltoirea in vivo se execută în condiţii normale folosind ca altoi un meristem

apical crescut in vitro iar ca portaltoi, un puiet sau un butaş înrădăcinat de dimensiuni

reduse.

1. Pregătirea altoiului se face prin prelevarea apexului meristematic (0,5 mm) după

sterilizarea materialului şi creşterea pe mediu pentru a-şi mări dimensiunile. Se recomandă

ca acesta să nu fie în contact direct cu mediul ci să fie aşezat pe o bucată de hârtie de filtru

(punte).

Când apexul atinge 0,5-1 cm lungime se fasonează în formă de pană dublă

punându-se pe secţiuni câte o picătură de DIECA (antioxidant).

2. Pentru altoirea propriu-zisă se folosesc portaltoi obţinuţi prin metode tradiţionale, aflaţi

în ghivece. Aceştia trebuie să aibă dimensiuni reduse (pentru puieţi 40-160 zile de viaţă).

În momentul altoirii, portaltoiul se retează şi apoi se execută o incizie diametrală.

Pentru prevenirea brunificărilor pe suprafeţele secţionate se aplică un antioxidant: dietil

diticarbonat de sodiu 2 g/1 (DIECA). Pot fi folosiţi alţi oxidanţi cum ar fi: acidul ascorbic,

polivinil pirolidona (PVP), tiourea, cisteina. Pentru stimularea creşterii altoiului se adaugă

o citochinină.

Altoiul se introduce în incizia de pe portaltoi şi apoi se leagă strâns (foto 6.2.)

Foto 6.2. Microaltoirea la piersic folosind altoi şi portaltoi obţinuţi in vitro

Page 143: Microinmultirea plantelor

143

3. Aclimatizarea se execută în sere în condiţii de umiditate relativă ridicată pentru a se

realiza sudura punctului de altoire.

6.2.3. Microaltoirea ex vitro

Este o tehnică care permite folosirea ca altoi a lăstarilor produşi in vitro, aceştia

altoindu-se pe portaltoi obţinuţi prin metode tradiţionale, sau in vitro.

Altoirea se face la masă în condiţii normale. Se îmbină astfel avantajele

multiplicării in vitro cu simplitatea metodei tradiţionale de altoire.

1. Obţinerea portaltoilor se face fie plecând de la seminţe şi sâmburi, fie prin butăşire în

uscat sau verde. Materialul înrădăcinat este trecut apoi la ghivece. Portaltoii pot fi obţinuţi

şi in vitro, aclimatizaţi şi fortificaţi (foto 6.3.).

Foto 6.3. Portaltoi de viţă de vie fortificaţi, pregătiţi pentru altoirea ex vitro

(Vitroplant)

2. Obţinerea altoilor este relativ simplă, pornindu-se fie de la meristeme, fie de la

fragmente uninodale sau chiar de la alte organe (frunze etc.). După mai multe multiplicări,

lăstarii având o lungime de 3-5 cm se folosesc 1a altoire.

Page 144: Microinmultirea plantelor

144

3. Altoirea propriu-zisă constă în retezarea portaltoiului transversal şi despicarea

longitudinal pe 1-2 cm lungime.

Lăstarul altoit, preluat din cultura in vitro se fasonează sub formă de pană dublă şi

se introduce în incizia de pe portaltoi. Punctul de altoire se leagă apoi strâns cu folie de

aluminiu, o bandă de cauciuc (foto 6.4.), sau se protejează cu un dispozitiv cu arc (tip

cârlig de rufe).

Foto 6.4. Plantă de viţă de vie microaltoită ex vitro (Vitroplant)

4. Aclimatizarea se face în spaţii protejate, cu umiditatea relativă ridicată în prima fază,

urmată apoi de o călire treptată (foto 6.5.). Plantele sunt trecute apoi în câmp, în pepinieră,

unde, după un sezon de vegetaţie, ating dimensiunile optime pentru plantare.

Altoirea ex vitro este o metodă economică, cu aplicabilitate largă, fiind uşor de

efectuat şi pe cale industrială în complexele de microînmulţire.

Page 145: Microinmultirea plantelor

145

Foto 6.5. Viţă de vie microaltoită, pregătită pentru livrare şi plantare (Vitroplant)

6.3. Producerea plantelor devirozate prin alte tehnici in vitro

Pe lângă cultura de meristeme, însoţită sau nu de termoterapie, s-au studiat şi alte

posibilităţi pentru eliminarea virusurilor sau micoplasmelor din plantele de cultură.

Una din tehnicile folosite este obţinerea de bulbili adventivi sănătoşi pe solzi de

Lilium longiflorum cultivaţi in vitro (Brierley, 1962). Rezultate similare au fost obţinute de

Hildebrandt (1971) la gladiole.

Button şi Bornman (1971), au regenerat plante libere de virusuri la Citrus folosind

embrionii somatici obţinuţi din ţesut nucelar.

La conopidă, devirozarea se poate realiza prin cultivarea meristemelor provenite de

la mugurii floriferi din inflorescenţă (Walkey şi colab., 1974).

Mai multe cercetări experimentale au demonstrat posibilitatea devirozării

materialului biologic prin regenerarea in vitro a unor lăstari adventivi pe frunze, solzi

(tunici) de bulbi sau alte organe infectate.

Astfel, Mori şi colab. (1982) au obţinut lăstari adventivi sănătoşi prin organogeneză

directă din frunze de tutun infectate cu VMT. Acelaşi lucru a fost reuşit şi la viţa de vie.

La crin şi zambilă s-a reuşit regenerarea de lăstari devirozaţi din tunici de bulbi

infectaţi (Allen, 1974; Asjes şi colab., 1974). După diferenţierea meristemelor pe

fragmentele de tunici cultivate in vitro, acestea au fost detaşate şi inoculate pe un alt mediu

pentru alungire şi formarea lăstarilor.

Page 146: Microinmultirea plantelor

146

Combinând cultura de meristeme cu obţinerea de lăstari adventivi Hakkaart şi

colab. (1983) au reuşit să devirozeze soiul de Kalanchoe “Yucatan”.

Bazându-se pe faptul că la o serie de specii (petunia, tutun, varză) frunzele prezintă

zone cu o densitate redusă a virusurilor sau lipsite de virusuri, în timp ce celelalte părţi ale

plantei sunt puternic infectate, regenerarea lăstarilor adventivi prin organogeneză directă

din limb a fost principala metodă de devirozare.

La plantele cu frunze variegate (himere) această metodă duce la pierderea

caracterului variegat, datorită faptului că fiecare lăstar regenerat se formează dintr-o

singură celulă (Cassells şi colab., 1980; Pelargonium).

Cultura de calus poate să fie folosită de asemenea pentru realizarea devirozării. S-a

observat că prin subcultivarea repetată a calusului de tutun infectat cu VMT acesta devine

liber de virusuri. Eliminarea virusului s-ar datora prezenţei celulelor meristematice tinere

dotate cu o mare capacitate de multiplicare. Aceste celule sunt mult mai rezistente la

pătrunderea şi multiplicarea virusului (Cooper, 1962, citat de Hildebrandt, 1977).

Ţinându-se cont de aceste observaţii, s-a reuşit regenerarea de plante sănătoase din

calus de cartof infectat cu virusul X.

Supunând calusul de Nicotiana rustica unui tratament termic, Walkey (1978) a

reuşit devirozarea completă a acestuia.

Mori şi colab. (1982) au obţinut plante libere de virusuri din protoplaşti izolaţi din

frunze infectate cu virusul mozaicului tutunului.

Page 147: Microinmultirea plantelor

147

Capitolul 7

Organogeneza in vitro

Organele şi ţesuturile cultivate in vitro în anumite condiţii au capacitatea de a

diferenţia centri meristematici (foto 7.1.) care ulterior dau naştere la lăstari sau rădăcini, iar

uneori la structuri de tip embrioid.

Foto 7.1. Centri meristematici formaţi pe limbul foliar de kiwi (Actinidia deliciosa)

Formarea adventivă a lăstarilor şi rădăcinilor poartă denumirea de organogeneză.

Aceasta poate fi de două feluri: directă sau indirectă, după cum organele respective se

formează, direct sau se trece printr-o fază intermediară de calus.

7.1. Organogeneza directă

7.1.1. Organogeneza adventivă de lăstari

Organogeneza adventivă de lăstari constă în regenerarea directă a unor lăstari

adventivi pornind de la diferite tipuri de organe şi ţesuturi. Metoda este folosită pe scară

largă la specii care regenerează uşor: Saintpaulia, Begonia, Achimenes Streptocarpus,

Lilium, Hyacinthus, Nerine etc.

Page 148: Microinmultirea plantelor

148

Factorii care influenţează pozitiv organogeneza şi formarea lăstarilor adventivi sunt

numeroşi:

- plantele juvenile au o capacitate organogenetică ridicată; la gimnosperme

regenerarea de lăstari adventivi este posibilă doar folosind embrioni, puieţi tineri sau părţi

ale acestora (David, 1982).

- zaharurile stimulează organogeneza directă cu formarea de lăstari;

- giberelinele şi acidul abscisic inhibă organogeneza;

- lumina stimulează în general procesul de organogeneză.

Există însă o serie de plante care necesită o perioadă de întuneric: muguri floriferi

de Freesia (Pierik şi Steegmans, 1975b) pedunculi de Nerine bowdenii (Pierik şi

Steegmans, 1986a). Rezultatele obţinute de Standardi A, Ferradini Nicoleta, Stănică F, au

dovedit importanţa întunericului în faza de inducţie pentru stimularea organogenezei

adventive din limb foliar la portaltoiul de măr M-27 (1996).

- culoarea roşie are efect stimulativ la regenerarea lăstarilor adventivi de Petunia

hybrida (Economou şi Read, 1986).

- temperatura ridicată stimulează formarea de lăstari adventivi la marea majoritate a

speciilor horticole. Face excepţie Begonia (Heide, 1965) Streptocarpus (Appelgren şi

Heide, 1972).

- poziţia explantului, importantă. În cazul limbului foliar la majoritatea speciilor,

acesta trebuie aşezat cu pagina inferioară pe mediu. Uneori se recomandă crestarea

nervurilor frunzei înainte de inoculare.

Cercetările lui Pierik, 1987 au demonstrat creşterea numărului de lăstari inoculaţi

la Kalanchoe forinacea prin aşezarea explantelor în poziţie verticală.

- hormonii de creştere influenţează organozeneza în mod diferit; există specii care

nu necesită aport suplimentar de auxine sau citochinine pentru declanşarea organogenezei

chiar dacă aceste substanţe stimulează apoi procesul respectiv: honesty (Pierik, 1967),

cicoarea (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren şi Heide, 1972).

- marea majoritate a speciilor formează lăstari adventivi în prezenţa citochininelor

în timp ce auxinele inhibă procesul. Uneori acest lucru este posibil şi atunci când este

vorba de explante de tipul peţiolului, rădăcinilor sau internodurilor (Stănică, F., 1995).

- puţine specii au nevoie de auxine: crinul (van Aartrijk, 1984), zambila (Pierik şi

Steegmans, 1975d)

Page 149: Microinmultirea plantelor

149

- raportul citochinine:auxine trebuie să încline în favoarea primelor, fapt

demonstrat la Begonia (Heide, 1965), hrean (Wurm, 1960), conopidă (Margara, 1969),

cicoare (Diaconescu, 2002).

Cicoarea witloof (Cichorium intybus L.) are capacitatea de a forma in vitro noduli

meristematici pe explantele foliare aşezate cu partea superioară în contact cu mediul de

cultură (foto 7.2.). Cea mai mare rată de regenerare s-a observat la o balanţă hormonală

alcătuită din 0,1 mg/l AIB şi 1,0 mg/l BAP.

Foto 7.2. Regenerare de noduli meristematici din limb foliar la Cichorium intybus L.

- cea mai folosită citochinină este BAP iar pentru gimnosperme este singura

recomandată. Celelalte citochinine sunt mai puţin folosite.

- concentraţii ridicate de citochinine (BAP) pot determina dereglarea procesului de

organogeneză. Se recomandă în această situaţie alternarea culturii pe două medii cu

concentraţii diferite de BAP.

- zeatina a avut un rol important în procesele de organogeneză la kiwi folosind

diferite tipuri de explante (Stănică, F. şi colab. 1995, 1998) (foto 7.3. a, b şi c).

- tidiazuronul (TDZ) şi 2 izopentiladenina (2iP) au determinat efecte spectaculoase

de stimulare a lăstăririi adventive. Din acest motiv cele trei substanţe sunt mult folosite în

lucrările de cercetare în ultimii ani în ciuda preţurilor de cost ridicate.

- adenina sulfat poate stimula organogeneza adventivă la Begonia (Ringe şi Hitsch,

1968), tutun (Skoog şi Tsui, 1948), ulm (Jacquiot, 1951). În combinaţie cu citochininele,

adenina sulfat a stimulat formarea lăstarilor adventivi (Skoog şi Miller, 1957; Nitsch şi

colab. 1969a).

Page 150: Microinmultirea plantelor

150

a b

c

Foto 7.3. Organogeneză directă de lăstari din rădăcini (a), peţiol (b) şi limb foliar (c) la kiwi (Actinidia sp.)

- acidul abscisic inhibă formarea lăstarilor adventivi la marea majoritate a speciilor,

excepţie făcând batatul (Yamanguchi şi Nakajima, 1974)

- etilena are şi ea un rol important în formarea bulbilor adeventivi la arin (van

Aartrijk, 1984).

- substanţele antiauxinice, cele care inhibă transportul auxinelor (TIBA) au ca efect

stimularea organogenezei adventive.

- vitaminele stimulează formarea lăstarilor adventivi la ciclamen (Mayer 1956),

ulm (Jacquiot, 1951), hrean (Wurm, 1960).

- infectarea materialului iniţial cu A. tumefaciens rasa C58, stimulează

organogeneza adventivă la cartof, plop, tutun (Ooms şi colab., 1983, Steffen şi colab.

1986). Efectul s-ar datora şi juvenilizării materialului iniţial datorită acţiunii bacteriei.

Datorită multiplelor aplicabilităţi ale acestei tehnici, dintre care amintim în primul

rând folosirea în transformarea genetică, numărul lucrărilor de cercetare privind

organogeneza directă de lăstari la speciile horticole este mare.

În tabelele 7.1.1, 7.1.2., 7.1.3., 7.1.4. sunt prezentate câteva din rezultatele

cercetării în acest domeniu.

Page 151: Microinmultirea plantelor

151

Tabelul 7.1.1. Cercetări privind organogeneza de lăstari la plantele legumicole

Denumirea speciei Explant iniţial Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Allium cepa Lăstari Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0-2)ANA+(4) BAP Hussey&Falavigna

1980 Calus Nitsch et al, (1969a) 30 6 (0,09-

0,43)AIA+(0,9)BAP Bui Dang Ha et al,

(1975) Calus Pelletier et al, (1972) To - 20 5 Doré (1974) Calus Pelletier et al, (1972) To - 20 5 (0,2)BAP (µg/l) Pelletier et al (1972) Calus Murashige & Skoog

(1962) - 30 - Steward & Mapes (1971

b) Calus Linsmaier & Skoog

(1965) 5,8 30 8 Wilmar & Hellendoorn

(1968)

Asparagus officinalis

Lăstar cu un mugure

Yang (1977) 5,7 30 7 (0,1)ANA + (0,1) Kin Yang (1977)

Brassica oleracea botrytis

Calus Gamborg et al, (1968) B5 5,5 20 8 (0,5)BAP Bagga et al (1982)

Brassica oleracea capitata

Calus Shahin (1985) TM-4 5,8 10 7 (0,99) BAP +(0,1) GA3 Lillo & Shahin (1986)

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,7 30 7 (2)AIA + (0,043) Kin + 15% CM

Dietert et al (1982) Brassica oleracea gemmifera

Lăstari Gamborg et al (1968) B5 - 20 8 (0,3) 2iP Ockendon (1984, 1985)

Capsicum annuum Cotiledon + hipocotil

Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 6,8 (1)AIA + (1) BAP sau (1) PBA

Gunay & Rao (1978)

Cichorium intybus Fragmente de, frunze etiolate (16 mm Ø) Knop Kin, AIA Vasseur (1978a)

Page 152: Microinmultirea plantelor

152

Tabelul 7.1.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Fragmente de frunze, cotiledon sau frunze

cotiledonare

Reynolds et al, (1980) 5,7 40 glucoză 8 (0,1)NOA+(20) 2iP+(0,1)CCC

Blackmon& Reynolds (1982)

calus Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 (0,1)BAP Moreno et al,(1984)

Cucumis melo

Calus si lăstari Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 (0,1)AIA Moreno et al,(1984) Cucumis sativus Calus din

cotiledon Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (1)ANA+(1)BAP Wehner&Locy

(1981) Daucus carota Lăstari Thorpe&Murashige(1968;

1970)Sf 5,8 30 10 (2)AIA+(2)Kin+(160)A

dS Smith&Murashige

(1970) Ipomoea batatas Fragmente de

rădăcini Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 (1)ANA+( 0,1)BAP Carswell&Locy(198

4) Cotiledon Doerschung & Miller

(1967) 30 10 (5)AIA+(0,5)Kin Doerschung & Miller

(1967) Calus Engler & Grogan

(1983)DM 5,8 17,1 15 (0,01) 2,4-D+(0,2)Z Engler & Grogan

(1983)

Lactuca sativa

Calus Murashige&Skoog (1962) 5,7-5,9 20 6 (10)AIA+(0,04)Kin Vasil & Hildebrandt (1966c)

Cotiledon Yang&Chang(1979) 5,7 30 2 gelrite (0,5)AIA+(2)BAP Ammati et al,(1984) Calus Murashige&Skoog (1962) 30 8 [(7)ANA+(2)Z] sau

[(1)ANA+(2)BAP] Behki & Lesley

(1980) Hipocotil Nitsch et al,(1967)S 5,5 30 8 (0-3,5)AIA + (0,2-2)2iP Bigot et al,(1977)

Ţesut medular Murashige&Skoog (1962) 5,8 3 6 (2)Z+(0,01)TIBA Cassells (1979) Hipocotil Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (0,5)AIA+(2)BAP Gunay&Rao (1980)

Fragmente de frunze

Pence & Caruso (1984) - 30 8 (1,75) AIA + (2) BAP Pence & Caruso (1984)

Lycopersicon esculentum

Calus Shahin (1985) TM –4 5,8 30 6 (0,2) GA3 + (1) Zr Shahin (1985) Petroselinum

hortense Calus Murashige&Skoog (1962) 5,7-5,9 30 10 (10) AIA + (0,04) Kin Vasil & Hildebrandt (1966

b,c)

Page 153: Microinmultirea plantelor

153

Tabelul 7.1.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Fragmente frunze

Murashige&Skoog (1962)

30 agar (0,5 – 10) Kin Gleddie et al (1982)

Calus Pelletier et al (1972) To 5,8 20 7,5 (0,2) BAP Isouard et al (1979) Fragmente hipocotil

Matsuoka& Hinata (1979)

5,5 20 8 (0,0225) BAP + (10) AdS

Matsuoka& Hinata (1979)

Calus White (1954) 20 agar (2-4) AIA + (4-) Kin Yamada et al (1967)

Solanum melongena

3 cm rădăcină Murashige&Skoog (1962) 30 0 (agar) Zelcer et al (1983) Calus Shepard & Totten

(1977) D 5,7 3 10 (0,1 ) AIA + (0,5) Z Austin & Cassells

(1983) Calus Murashige & Skoog

(1962) 5,8 10 7 (1)AIA + (1) BAP +

(10) GA3 Austin & Cassells

(1983) Fragmente tuberculi

Ratnamba & Chopra (1974)

5,8 30 agar (0,4) AIA + (0,8) Kin + (0,4) BAP

Bragdo – Aas (1977)

Calus Ratnamba & Chopra (1974)

5,8 30 agar (0,4) AIA + (0,8) Kin + (0,4) BAP

Bragdo – Aas (1977)

Fragmente tuberculi

Jarret et al (1980 a, b) 5,7 30 9 (0,03) ANA + (0,3-1) BAP

Jarret et al (1980 a, b)

Fragmente tuberculi

Lam (1975) 20 9 (0,4) AIA + (0,8) Kin + (0,4) GA3 + (0,4) BAP

Lam (1975)

Fragmente lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,7 20 7 (1) BAP Marani & Pisi (1977)

Fragmente lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,7 30 agar (0,01) ANA + (1) BAP + (0,1) GA3

Resende & Paiva (1985)

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,7 30 agar (0,01) ANA + (1) Kin + (0,1) GA3

Resende & Paiva (1985)

Solanum tuberosum

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 agar (3,63) Zr Sopory & Tan (1979)

Page 154: Microinmultirea plantelor

154

Tabelul 7.1.2. Cercetări privind organogeneza de lăstari la plantele floricole

Denumirea speciei Explant iniţial Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Calus Linsmaier & Skoog

(1965) 5,8 30 8 (0,2) 2,4-D+(1)Kin Groenewald et al,

(1977) Agave sp,

Calus Groenewald et al, (1975)

5,8 30 8 (0,2) 2,4-D+(1)Kin Groenewald et al, (1977)

Amaryllis sp, Calus Bapat & Narayanaswamy (1976)

5,8 20 8 (0,5) 2,4-D + (1) Kin + 10% CM

Bapat & Narayanaswamy

(1976) Anemone coronaria

Fragmente Lăstari

0,5 x Linsmayer & Skoog (1965)

(0,2) AIA + (2) BAP Sutter & Langhans (1978 a,b)

Anthurium scherzerianum

Calus Pierik et al (1974) 40 agar (0,23) BAP Fersing & Lutz (1977)

Antirrhinum majus Lăstari Sangwan & Harada (1975)

5,5 20 6 (0,25) NOA +10 % CM Pfister & Widholm (1984)

Petiol Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 6 (00,1) ANA + (0,1) BAP

Cassells & Morrish (1985)

Begonia rex

Fragmente frunze

Schott & Scraudolf (1967)

20 agar Schott & Scraudolf (1967)

Frunze sau petiol Ranga Swamy (1961) I 5,8 20 8 (10-20) Ad Sehgal (1975) Begonia semperflorens Frunze Bourgin & Nitsch

(1967) H 5,8 20 7 (0,23) BAP sau (0,31 –

3,1) PBA Thakur (1973)

Begonia spp, Frunze si petioli Ringe & Nitsch (1968) 5 20 8 (1)AIA + (2,3)BAP Ringe & Nitsch (1968)

Begonia tuberhybrida

Fragmente frunze

Peck & Cumming (1984 a) 1

5,8 30 6,5 (1) ANA + (5) BAP + (125) Ad

Peck & Cumming (1984 a)

Page 155: Microinmultirea plantelor

155

Tabelul 7.1.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Camellia japonica Lăstari Samartin et al ( 1984) 1 5,5-5,6

30 6 (1) BAP + (0,1) ANA + (20) AdS

Samartin et al (1984)

Calus Hill (1967) B2 5,6 20 10 (1) Kin Hill (1968) Fragmente lăstar Kaul & Staba (1968) 6 30 10 (9) AIA + (2,25) BAP Grewald & Sharma

(1978) Lăstari Murashige & Skoog

(1962) 5,8 30 10 (20) BAP Staba et al (1984)

Fragmente lăstari

Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 10 (0,203) BAP Wambugu & Rangan (1981)

Chrysanthemum sp.

Calus Linsmaier & Skoog (1965)

30 5 (0,2) ANA + (2) Kin + (10) GA3

Bush et al (1975)

Calus Nitsch & Nitsch (1965) S

5,5 20 6 (1) 2,4 -D Sangwan & Harada (1977)

Fragmente frunze

Robbins & Hervey (1969) BRVS 2

4,5 20 0 (0,01) ANA + (0,05) BAP

Hervey & Robbins (1978)

Lăstari Robbins & Hervey (1969) BRVS 2

4,5 20 0 (0,005) ANA + (0,0025) BAP

Hervey & Robbins (1978)

Coleus blumei

Ţesut medular Thorpe & Murashige (1968; 1970) Sf

5,8 30 10 (2) AIA + (2) Kin + (160) AdS

Smith & Murashige (1970)

Calus Abo El – Nil & Zettler (1976) A Z

5,8 20 6 (2) Kin + (0,09-0,93) ANA

Abo El – Nil & Zettler (1976)

Colocasia esculenta

Calus Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 0 (1) Kin Jackson et al (1977) a

Ţesut medular Kunisaki (1975) 5,8 30 9 (0,5) BAP Kunisaki (1975) Calus Heinz & Mee (1969) 5,6 20 9 10% CM Mee (1978)

Cordyline terminalis

Fragmente lăstari

Miller & Murashige (1976)

5 30 8 (1) AIA + (3) Kin + (80)AdS

Miller & Murashige (1976)

Page 156: Microinmultirea plantelor

156

Tabelul 7.1.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Fragmente lăstari

Davis et al (1977)MS-3X

5 50 6 (0,19)ANA + (2,15)Kin Davis et al (1977)

Fragmente lăstari

Davis et al (1977)MS-3X

5 50 6 (0,05)ANA + (0,54)Kin Davis et al (1977)

Fragmente lăstari

Linsmaier & Skoog (1965)

5,7 30 6 (0,1)ANA+(0,5)Kin Earle & Langhans (1975)

Fragmente lăstari Murashige&Skoog(1962) 30 0 (1) Kin Gukasyan et al(1977)

Dianthus caryophyllus

Calus Hackett & Anderson (1967)

30 agar (1) ANA Hackett & Anderson (1967)

Dracaena deremensis

Ţesut medular Debergh (1975) 5,8 20 6 (0,1) ANA + (5) Kin Debergh (1975); 1976)

Dracaena gosetfiana

Fragmente lăstari

Miller & Murahige (1976) II

5 30 0 (1) AIA + (3) Kin + (120) AdS

Miller & Murashige (1976)

Dracaena marginata

Calus Murahige & Skoog (1962)

30 8 (1) Kin + 15% CM Choa et al (1981)

Ficus benjamina Fragmente lăstari

Miller & Murahige (1976) II

5,8 30 agar (0,3) AIA + (30) 2iP + (80) AdSh

Makino et al (1977)

Ficus lyrata Frunze Debelgh & De Waiel (1977) Shoots

5,8 20 6 (2,5) IBA + (5) BAP Debelgh & De Waiel (1977)

Freesia sp, Calus Bajaj & Pierik (1974) 5,8 30 8 (5) Kin Bajaj & Pierik (1974)

Freesia hybrida Calus Linsmaier & Skoog (1965)

5,6 30 6 (5) Kin Stimart & Ascher (1978 b, 1982)

Fragmente lăstari

Miller & Murashige (1976) II

5 30 7 (2-4)BAP+(80)AdS Harris&Mason (1983)

Fuchsia hybrida

Fragmente lăstari

Gamborg et al, (1968) B5

5 30 0 (3)BAP Stevenson&Harris (1980)

Gardenia jasminoides

Fragmente lăstari

Economou & Read (1984)

5 20 6 (5-10)2iP Economou & Spanoudaki (1985)

Page 157: Microinmultirea plantelor

157

Tabelul 7.1.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Fragmente frunze

Hedtrich (1979)A 10 8 (0,1)AIA +(10)BAP Hedtrich (1979)

Fragmente Lăstari

Hedtrich (1979)A 10 8 (1)BAP+(0,1)GA3 Hedtrich (1979)

Calus Meynet & Sibi (1984) 1 5,8 20 8 (0,25)AIA + (1)BAP Meynet & Sibi (1984)

Fragmente Lăstari

Murashige et al (1974) 5,7 45 10 (0,5)AIA + (10)Kin + (80) AdS

Murashige et al (1974)

Gerbera jamesonii

Calus Sitbon (1981)1 5,7 45 8 (0,5)AIA + (2)BAP + (2)Kin

Sitbon (1981)

Gladiolus grandiflorus

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 agar (0,1)ANA + (2)Kin Bajaj et al (1983)

Lilium sp, Calus Simmonds & Cumming (1976)

5,7 30 6 (1,1)2,4-D sau BAP Simmonds & Cumming (1976)

Mammillaria elongata

Tuberculi Johnson & Emino (1979)

5,6 45 10 (1)IBA+(10)2iP Johnson & Emino (1979)

Mammillaria voodsi

Ţesut medular Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (2)AIA + (2)Kin Kolar et al (1976)

Monstera deliciosa

Fragmente Lăstari

Linsmaier & Skoog (1965)

5,7 30 8 (2)AiA + (10)PBA Fonnesbech & Fonnesbech (1980)

Bulbili sau plantule

Heinz & Mee (1969) 20 7 (0,03-5)ANA + (2-8)BAP

Hussey (1976c;1977a)

Lăstari Heinz & Mee (1969) 20 7 (0,03-5)ANA + (1-2)BAP

Hussey (1976c;1977a)

Narcissus sp,

Fragmente frunze

Hussey (1977a)1 sau 2 sau (1982)

20-30 7 (0,25-4)ANA + (2-16)BAP + (150)AdS

Hussey (1982)

Nephrolepsis falcata

Fragmente Lăstari

Miller & Murashige (1976)III

30 8 (1,1-11)Kin +/- (0,93)ANA

Beck & Caponetti (1983)

Page 158: Microinmultirea plantelor

158

Tabelul 7.1.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Stoloni 0,5x Murashige & Skoog (1962)

5,6 30 8 Henson (1979) Nephrolepsis spp

Rizom Miller & Murashige (1976)III

5,8 30 8 (2)AIA+(0,04)Kin+ (1,13) BAP

Beck & Caponetti (1983)

Pelargonium peltatum

Fragmente Lăstari

Theiler (1977) 5,6-5,8

30 0 (1)IBA + (0,2)Z Theiler (1977)

Pelargonium spp, Lăstari Beauchesne et al (1977) III sau IV

10 glucoză 6-7 (0,25)AIA + (0,1)2iP + (1)GA3 +/- (2)Ad

Beauchesne et al (1977)

Fragmente frunze

Linsmaier & Skoog (1965)

5,7-5,8

30 5 (0,2)BAP Daykin et al (1976) Petunia hybrida

Calus Sangwan & Norreel (1975)

5,6 20 agar (0,1)ANA + (1)BAP Sangwan & Norreel (1975)

Phalenopsis sp, Muguri adventivi

Knudson (1946)C 30 agar (2)ANA Hackett et al (1972)

Phalenopsis sp, Muguri dorminzi Koch (1974) A 20 5 (0,3)ANA Pipper & Zimmer (1976)

Peţiol Murashige & Skoog (1962)

5,8 25 8 (0,1)ANA + (0,01-0,5)BAP

Bilkey et al (1978)

Frunze tinere Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 6 (1)ANA + (1)BAP Cassells & Plunkett (1984)

Fragmente frunze Cooke (1977) 5,7 30 9 (2)AIA + (0,08)BAP Cooke (1977) Peţiol Grunewaldt (1976) 5,8 30 8 (0,2)AIA+(0,1)2,4-D

+(0,4) BAP + 19 % CM Grunewaldt (1976)

Peţiol Grunewaldt (1977) 5,8 30 8 (0,8)AIA+(0,5)Kin Grunewaldt (1977) Peţiol Harney & Knap (1979) 30 6 (0,5)ANA + (0,5)Kin Harney&Knap (1979)

Saintpaulia ionantha

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (1)ANA+(0,5)BAP Weatherhead et al(1982)

Sansevieria trifasciata

Meristemoizi Murashige & Skoog (1962)

6,3 20 8 (0,3) Kin Blazich & Novitzky (1984)

Page 159: Microinmultirea plantelor

159

Tabelul 7.1.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Muguri Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (1)AIA + (3)BAP Kothari & Chandra (1984a)

Fragmente Lăstari

Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (5)AIA + (3)BAP+ (0,5)GA3

Kothari & Chandra (1984b)

Tagetes erecta

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (5)AIA + (7)BAP Kothari&Chandra (1984b)

Tulipa gesneriana Bulbili Riviere & Muller (1979)

5,5 50 glucoză 6 Riviere & Muller (1979)

Tabelul 7.1.3.

Cercetări privind organogeneza de lăstari la plantele pomicole Denumirea

speciei Explant iniţial Mediul de cultură pH Zaharoză (g/l)

Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Fragmente

rădăcini Harada (1975) 5,5 20 7 (1) Z + (40) Ad Harada (1975)

Fragmente lăstari Murashige&Skoog(1962) 30 Agar (1) Z Kwei et al (1980)

Actinidia deliciosa

Fragmente lăstari

Monette (1986 a) I 5,7 22,5 0,7 (0,023) IBA + (2) BAP + (60) AdS

Monette (1986 a)

Lăstari Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,0225) BAP Hisajima (1982 a) Lăstari Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,0225)BAP+(0,005)

IBA Hisajima (1982 a)

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 9 (0,1) ANA + (0,7) BAP Ruginii & Verma (1982;1983)

Amygdalus communis

Calus Matheus&Rangan (1981) 30 agar 5%CM Matheus&Rangan(1981) Ananas comosus Lăstari 0,5xMurashige &

Skoog (1962) 30 0 (0,5-1)IBA Zepeda & Sagawa

(1981)

Page 160: Microinmultirea plantelor

160

Tabelul 7.1.3. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Armeniaca vulgaris

Fragmente lăstari

Skirvin et al,(1980) 5,7 20 agar Nu sunt mentionate Skirvin et al,(1980)

Castanea sativa Epicotil San Jose et al, (1984) L sau Ha

30 6 [(0,1)NAN sau IBA] +(2)BAP

San Jose et al, (1984)

Cerasus avium Fragmente lăstari

Jones et al (1977) 5,2 30 7 (0,1)IBA+(1)BAP+ (0,1)GA3

Seirlis et al, (1979)

Fragmente lăstari

Skirvin et al (1980) 5,7 20 agar Skirvin et al (1980) Cerasus vulgaris

Lăstari Skirvin & Chu(1978a,b)

5,7 30 agar (0,1)ANA+(2)BAP Skirvin et al,(1981b)

Fragmente rădăcini

Hoagland&Snyder (1933)

0 0 Murashige et al (1972a)

Citrus sp,

Fragmente lăstari (5mm)

Kitto& Young (1981)S 5,6-5,8

30-40 10 (5)BAP+(80)AdS Kitto& Young (1981)

Calus Radojevic et al,(1975) 20 8-10 (1)Kin+(2)Ad Radojevic et al,(1975)

Corylus avellana

Calus Radojevic et al,(1975) 20 8-10 (1)Kin+(2)Ad+(1)GA3 Radojevic et al,(1975)

Diospyros kaki calus Yokoyama&Takeuchi (1976)

5,6-5,8

30 7 (1)ANA + (0,1-1)Kin Yokoyama&Takeuchi (1976)

Fragaria Fragmente lăstari

Murashige & Skoog (1962)

5,6 30 7 (0,2-1)IBA + (1,1)BAP + (1)GA3 sau (0,02-0,2)IBA+(1,1)BAP

Anderson et al, (1982)

Glossularia redinata

Fragmente lăstari

Murashige & Skoog (1962)

5,5 30 6 (0,1)IBA + (0,49)BAP Welander (1985a)

Juglans hindisii x J, regia

Lăstari Extra vitrum Driver & Kuniykuhi (1984)

Page 161: Microinmultirea plantelor

161

Tabelul 7.1.3. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Lăstari Chalupa (1981a)A 30 6 (0,1-0,3)ANA+(0,1-0,6)BAP +(20)AdS

Chalupa (1981a) Juglans regia

Seminţe 0,5 x Rodriguez (1982b)K(h)

5,5 30 6 (9)BAP Rodriguez (1982b)

Juglans regia Lăstari Rodriguez (1982b)K(h) 5,5 30 6 (0,4)IBA+(0,4)BAP Rodriguez (1982b) Fragmente

lăstari Jones et al (1977) 5,2 30 7 (0,1)IBA+(1)BAP

+(0,1)GA3+(162)PG Jones et al (1979)

Cotiledon Kartha et al, (1974 a) 5,8 30 8 (1)ANA+(0,3)BAP Liu et al (1983a) Calus Kartha et al, (1974 a) 5,8 30 8 (1)BAP Liu et al (1983a)

Calus din cotiled., sau tesut med.

White (1943a)A 20 agar (4)ANA+(2)Kin +(1)GA3 + 15% CM

Mehra & Sachdeva (1979)

Calus din embr. sau lăstari

White (1943a)A 20 agar (2)ANA+(2)BAP + 15% CM

Mehra & Sachdeva (1979)

Lăstari Jones et al (1977) 5,2 30 7 (1)IBA+(1)BAP+ (0,1)GA3

Snir & Erez (1980)

Lăstari Linsmaier & Skoog (1965)

5,2 29,9 7 (0,1)IBA+(0,48)GA3 Van Nieuwkirk et al (1986)

Malus x domestica

Muguri dorminzi / lăstari

Zimmerman (1984a)Lep

20 7 (0,01)IBA + (0,09 BAp)

Zimmerman (1984a)

Fragmente lăstari

Lakshmi-Sita et al (1976)

5,6 30 8 (1)BAP Oka & Ohyama (1981)

Fragmente lăstari

Lakshmi-Sita et al (1976)

5,6 30 8 (10)BAP Oka & Ohyama (1981)

Morus alba

Muguri Murashige&Skoog(1962) 5,6 30 8 (10)BAP Oka&Ohyama(1981) Lăstari Krikorian & Cronauer

(1984) 5,8 41 0 (4,95)BAP+10%CM Cronauer &

Krikorian (1985a) Lăstari Heinz & Mee (1969) 5,8 40 7 (5)BAP + 10% CM Cronauer &

Krikorian (1985b)

Musa acuminata

Fragmente lăstari Murashige&Skoog(1962) 5,8 20 8 (10)BAP+15%CM Dore Swamy & al (1983)

Page 162: Microinmultirea plantelor

162

Tabelul 7.1.3. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Musa cavendishii Calus Murashige & Skoog (1962)

30 agar (0,3)AIA+(1)Kin sau [(2)BAP+20%CM]

Ma et al (1978)

Musa spp, Lăstari Heinz & Mee (1979) 5,8 40 7 (5)BAP Cronauer & Krikorian (1984)

Musa textilis Lăstari Mante & Tepper (1983) I

5,7 30 5-8 (0,1)IBA+(3-5)BAP +(160)AdS

Mante & Tepper (1983)

Lăstari Miller et al (1982)A 20 8 (0,1)ANA+(2)BAP Miller et al (1982) Persica vulgaris Lăstari Skirvin &Chu

(1978a,b) 5,7 30 agar (0,1)ANA+(2)BAP Skirvin &Chu

(1978a,b) Fragmente

lăstari Linsmaier&Skoog

(1965) 5,7 30 8 [(0-1)2,4-D sau

ANA]+(3)2iP +(40)AdSTisserat et al (1979)

Calus Thompson & Gordon (1977)

5,6-5,8

30 8 Tisserat (1982)

Phoenix dactylifera

Fragmente lăstari Tisserat (1984a) 5,6-5,8 30 8 (10)2,4-D Tisserat (1984a) Seminţe 0,5xMurashige &

Skoog (1962) 5,8 0 0 Barghchi&Alderso

n (1983) Lăstari Murashige & Skoog

(1962) 5,8 0 7 (4)BAP Barghchi&Alderso

n (1983)

Pistacia vera

5-8 mm lăstari Murashige & Skoog (1962)

30 7 (4)BAP Barghchi&Alderson (1985)

Fragmente lăstari

Miller&Murashige (1976)II

5,6 30 7 (10)2iP+(162) PG Garland&Stoltz (1981)

Fragmente lăstari

Kim et al, (1981) 5,8 20 0 (0,01)IBA+(1)BAP Hammerschlag (1982b)

Prunus cerasifera

Fragmente lăstari

Linsmaier&Skoog (1965)

5,8 30 7 (0,5)BAP Norton & Boe (1982)

Fragmente lăstari (5-15mm)

Pietropaolo & Reisch (1984)

5,8 30 7 (1,1)BAP Pietropaolo & Reisch (1984)

Prunus domestica

Fragmente lăstari Skirvin et al (1980) 5,7 20 agar Nu sunt menţionate Skirvin et al (1980)

Page 163: Microinmultirea plantelor

163

Tabelul 7.1.3. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Prunus insititia Fragmente lăstari

Jones et al, (1977) 5,2 30 7 (0,1)IBA+(1)BAP+ (0,1)GA3 +(162)PG

Jones & Hopgood (19790

Fragmente lăstari

Lane (1979b) 5,2 30 7 (1,13)BAP Lane (1979b)

Fragmente lăstari

Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (1,36-2,25)BAP+(1,1)Z +(1,02)2iP

Shen&Mullins (1984)

Pyrus communis

Fragmente lăstari

Linsmaier & Skoog (1965)

5,7-5,8

30 6 (2)BAP Singha (1982a,c)

Fragmente lăstari

Murashige & Skoog (1962)

5,7 20 6 (1,35)BAP Flegmann& Wainwright(1981)

Ribes nigrum

Fragmente lăstari

Jones &Vine (1968)B 5,6-5,8

40 glucoză 0 Jones &Vine (1968)

Lăstari Donnelly et al, (1980)2 5,7 30 agar (0,1)IBA+(1)BAP Donnelly et al, (1980)

Lăstari Snir (1981)a 5 20 agar (0,22)2,4-D +(1)BAP+(0,1)GA3

Snir (1981)

Rubus idaeus

Lăstari cu noduri Welander (1985c) 5,2 30 6 (1)BAP Welander (1985c0 Fragmente

lăstari Linsmaier & Skoog

(1965) 5,6-5,8

30 7 (1)IBA+(1)BAP +(0,1)GA3

Broome & Zimmerman (1978)

Rubus sp,

Fragmente lăstari

Linsmaier & Skoog (1965)

5,6-5,8

30 0 (0,1)IBA+(1)BAP Donnely et al (1986)

Vaccinium sp, Fragmente lăstari

Zimmerman & B’ (1980)Z-2

30 5,5 (4)AIA+(15)2iP +(80)AdSh

Zimmerman & Broome (1980)

Page 164: Microinmultirea plantelor

164

Tabelul 7.1.4. Cercetări privind organogeneza de lăstari la arborii şi arbuştii ornamentali

Denumirea speciei Explant Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Acer rubrum x

Acer saccharum Fragmente

lăstari Murashige&Skoog

(1962) 5,7 30 10 (0,1-0,5)Thidiazuron Kerns & Meyer

(1985) Calus Simola (1985)N7 5,6 20 6 [(5/10)Z/Zr] +

[(0,1/0,2)ANA/NOA] Simola (1985)

Calus Srivastava&Steinhauer (1981a)2

5,8 40 6 (2)AIA + (6)Kin + (40)Ad

Srivastava&Steinhauer (1981a)

Frunze Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (2)AIA + (5)Z + (2)GA3

Srivastava et al (1985)

Betula pendula

Fragmente rădăcini

Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (0,5)ANA + (5)2iP + (30)Ad

Srivastava et al (1985)

Betula verrucosa Calus Chalupa (1981b) 1 30 6 (0,05)IBA+ (0,2-0,3)BAP + (20)AdS

Chalupa (1981b)

Biota orientalis (thuja)

Hipocotil Thomas & Tranvan (1982)

5,4 30 8 (0,1) IBA + (1,1)BAP Thomas & Tranvan (1982)

Chaenomeles japonica

Fragmente lăstari

Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 7 (2,5)BAP Norton & Boe (1982)

Crataegus rachyacantha

Fragmente lăstari

Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 7 (0,1-10)BAP Norton & Norton (1986b)

Crataegus cv, TOBA

Fragmente lăstari

Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 7 (1)BAP Norton & Boe (1982)

Fraxinus americana

Fragmente lăstari

Lloyd & McCown (1981) WPM

5,2 20 6 (0,5-1)BAP Heiman & Preece (1983)

Fraxinus pennsylvanica

Fragmente lăstari

Lloyd & McCown (1981) WPM

5,2 20 6 (0,5-1)BAP Heiman & Preece (1983)

Page 165: Microinmultirea plantelor

165

Tabelul 7.1.4. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Hedera helix Cotiledon/ hipocotil

Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (0,5)ANA + (0,5)BAP Banks et al, (1979)

Calus Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (0,5)ANA + (0,5)BAP Banks et al, (1979) Hedera helix Ţesut medular Banks(1979) 1, 5,7 30 5 (2)ANA + (0,5)BAP Banks (1979)

Hydrangea macrophylla

Fragmente lăstari

Gamborg et al, (1968)B5

5,5 20 6 (1,8)BAP Bailey et al, (1985)

Larix decidua Fragmente frunze

Bonga (1984) LM 5,6 30 8 (2,25)BAP Bonga (1984)

Hipocotil Murashige & Skoog (1962)

30 8 (3)AIA + (3)Kin Marcortriginiano & Stimart (1983)

Paulownia tomentosa

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

30 8 (0,1)IBA + (1)BAP + (0,1)GA3

Marcortriginiano & Stimart (1983)

Frunze cotiledonare

Murashige & Skoog (1962) a:DIT

5,8 30 agar (1,3) BAP Bornman & Vogelmann (1984)

Frunze cotiledonare

Bornman (1981) MCMa:B

5,5 30,8 7 (1,1) BAP Bornman (1983)

Ace Bornman (1981) MCMa:B

5,5 30,8 7 Bornman (1983)

Hipocotil Chalupa (1974) WS 5,6 30 7 (0,01) AIA + (2) BAP Chalupa (1977)

Picea abies

Muguri Chalupa (1974) WS 5,6 30 7 Chalupa (1977) Hipocotil Campbell & Durzam

(1975) 30 7 (2,25) BAP Campbell &

Durzam (1975) Picea glauca

Epicotil Rumary & Thorpe (1984)

5,9 30 8 (1,13) BAP + (1,02) 2iP Rumary & Thorpe (1984)

Picea pungens Muguri dorminzi Von Arnold & Eriksson (1977) LP

5,8 34 8 (2,2) BAP Misson et al (1982)

Picea mugo Muguri Champbell&Durzan(1975) 30 7 (0,19)ANA + (2,25) BAP Stiff et al (1985) Pinus sylvestris Ace Bornman & Janson

(1980) 5,6-5,8

50,5 6-7 (4,5) BAP Bornman & Janson (1980)

Page 166: Microinmultirea plantelor

166

Tabelul 7.1.4. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Muguri Linsmaier & Skoog (1965)

5,6 30 7 Chalupa (1977)

Cotiledon Cheng (1977; 1978) 5,5 30 6 (0,001) ANA + (1,125) BAP

Cheah & Cheng (1978)

Pseudotsuga menziesii

Lăstari Thompson (1981) 30 agar (22,5) BAP +/- (0,019) ANA

Thompson (1981)

Pyracantha coccinea

Lăstari Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 7 (2,5) BAP Norton & Boe (1982)

Quercus robur Fragmente lăstari

Vieitez et al (1985) H + SO4

30 6 (0,1) BAP Vieitez et al (1985)

Lăstari Ma & Wang (1977) 2 5,7 20 7 (5) Kin Ma & Wang (1977) Lăstari Economou & Read

(1984) 5 20 6 (5-20) 2 iP Economou & Read

(1984)

Rhododendron sp,

Fragmente tulpină

Lloyd & McCown (1981) WPM

5,8 lichid (1,6) 2 iP McCown & Lloyd (1981)

Fragmente lăstari

Hasegawa (1979) 5,7 30 8 (0,3) AIA + (3) BAP Bressan et al (1982) Rosa hybrida

Fragmente lăstari

Skirvin & Chu (1979 a) 5,7 30 10 (0,1) ANA + (2) BAP Skirvin & Chu (1979 a)

Rosa sp, Lăstari Murashige & Skoog (1962)

40 agar (0,004) ANA + (2) BAP + (0,1) GA3

Davies (1980)

Salix madsudana Lăstari Whitehed & Giles (1976) 5,8 20 agar (0,2) ANA + (0,1) BAP Bhojwani (1980) Syringa vulgaris Lăstari Start & Cumming

(1976)S 4,5 30 7 (0,25) AIA + (0,1)

ANA Hildebrandt & Harney (1983)

Cotiledon Coleman & Thorpe (1977) S

5,2 30 agar (0,02) ANA + (0,2) BAP

Coleman & Thorpe (1977)

Thuja plicata

Fragmente lăstari

Coleman & Thorpe (1977) S

5,2 30 agar (0,02) ANA + (1,1) BAP

Coleman & Thorpe (1977)

Page 167: Microinmultirea plantelor

167

7.1.2. Organogeneza adventivă de rădăcini

Formarea adventivă a rădăcinilor in vitro este determinată de un număr mare de

factori care influenţează intensitatea şi desfăşurarea procesului:

- vârsta şi stadiul de dezvoltare al explantului. În general, explantele tinere, baza

lăstarilor, cotiledoanele au capacitate mărită de a diferenţia rădăcini la marea majoritate a

speciilor. Fac excepţie de la această regulă Freesia, Lunaria, Nicotiana, Phoenix, Musa şi

altele.

- poziţia pe plantă a explantului regenerator, în principiu, nu influenţează hotărâtor

formarea şi creşterea rădăcinilor adventive. Totuşi se ştie că explantele bazale şi solzii de

bulbi au randamente mai mari în acest sens. La pomi şi arbuşti fructiferi şi în general la

speciile lemnoase, este importantă atât poziţia pe plantă a explantului cât şi poziţia faţă de

soare.

- specia şi soiul au rol hotărâtor. Se ştie că plantele erbacee au o capacitate mai

mare de a emite rădăcini, acest lucru fiind influenţat şi de prezenţa sau absenţa unor bariere

anatomice.

- sexul plantei de la care se recoltează materialul biologic este şi el important. S-a

observat că la speciile dioice (actinidia, plop, etc.), plantele mascule au o vigoare de

creştere superioară şi o capacitate rizogenetică pe măsură.

- influenţa mărimii explantului este contradictorie. Cu toate că aparent, explantele

de dimensiuni mari ar avea o capacitate mai mare de a forma rădăcini (foto 7.4.), s-a

observat că cele de dimensiuni mai mici au format un număr comparabil de rădăcini,

datorită, se pare, suprafeţei mai mari de contact cu mediul (foto 7.5.).

- orientarea explantelor este esenţială. În mod paradoxal cele mai multe rădăcini s-

au obţinut la cultivarea lăstarilor (explantelor) cu vârful în jos. Fenomenul se explică prin

mai buna oxigenare a ţesuturilor care se află în afara mediului.

- numărul de subculturi influenţează diferit formarea rădăcinilor adventive. Efectul

este diferit însă, în funcţie de specie şi citochinina folosită. Astfel la Rosaceae în general,

numărul de rădăcini scade cu creşterea numărului de subculturi (ex. Chaenomeles). Face

excepţie soiul Jonathan la care se petrece fenomenul invers, datorită probabil, creşterii

gradului de juvenilizare în timp.

Page 168: Microinmultirea plantelor

168

Foto 7.4. Volum mare de rădăcini la un explant mare de Hakonechloa aureola

Foto 7.5. Rădăcini lungi la un explant de dimensiuni reduse

de curmal chinezesc Ziziphus jujuba

În prezenţa 2iP procesul de reducere a capacităţii rizogenetice evoluează rapid, în

timp ce BAP-ul atenuează acest fenomen.

- prezenţa oxigenului determină formarea rapidă a explantelor după trecerea in vivo.

De asemenea, pe mediile lichide trebuie luate obligatoriu măsuri de aerare prin barbotare

sau alte mijloace. O variantă bună este şi folosirea mediului de cultură în dublu strat.

- lumina influenţează în mod diferit formarea rădăcinilor adventive. Pentru

reducerea acestui fenomen se recomandă folosirea cărbunelui activ în mediile de

înrădăcinare. La majoritatea speciilor şi în special la Prunus cersifera, efectul negativ este

Page 169: Microinmultirea plantelor

169

evident. Totuşi, la Helianthus tubeosus şi la crin lumina stimulează formarea rădăcinilor.

Acelaşi efect se constată la Petunia când explantele sunt expuse la lumina roşie.

- temperatura ridicată influenţează pozitiv procesele de rizogeneză. Fac excepţie

Lunaria annuna şi speciile lemnoase care reacţionează mai bine la temperaturi scăzute.

- agarul în concentraţie mai scăzută stimulează formarea rădăcinilor.

- creşterea conţinutului mediului de cultură în zaharoză, stimulează formarea

rădăcinilor la speciile lemnoase. Face excepţie Pseudotsuga menziesii, la care se petrece

fenomenul invers.

În tabelele 7.2.1, 7.2.2., 7.2.3., 7.2.4., 7.2.5. sunt prezentate câteva rezultate ale

cercetărilor privind organogeneza de rădăcini la plantele horticole.

7.2. Organogeneza indirectă

Regenerarea unor organe in vitro (lăstari, rădăcini, bulbili, etc.) trecând printr-o

fază intermediară de calus, poartă denumirea de organogeneză indirectă.

Foto 7.6. Formarea lăstarilor prin organogeneză indirectă din calus

de frunză de kiwi (Actinidia deliciosa)

În mod normal calusul formează mai uşor rădăcini decât lăstari (Thomas şi Dovey,

1975). Acest lucru este mai evident pe medii cu conţinut ridicat de auxine şi mai coborât

de citochinine.

Page 170: Microinmultirea plantelor

170

Ca şi în cazul organogenezei directe auxinele sunt necesare în concentraţie mai

ridicată în faza de inducţie.

În acelaşi timp pe calus se pot forma independent rădăcini sau lăstari.

La concentraţii ridicate de citochinine şi scăzute de auxine are loc formarea

lăstarilor adventivi. Ctochinina cea mai folosită este benzilaminopurina (BAP).

Uneori la baza lăstarilor formaţi se formează simultan şi rădăcini.

Formarea lăstarilor din calus este condiţionată de un număr mare de factori:

- concentraţia de săruri ridicată (care reduce creşterea) stimulează organogeneza

indirectă de lăstari. În acest sens, creşterea concentraţiei de NH4NO3 în cultura de calus

stimulează formarea lăstarilor adventivi. (Pierik şi colab., 1976) a demonstrat însă

contrariul la Anthurium andreanum, la care, reducerea concentraţiei de NH4NO3 determină

creşterea numărului de lăstari adventivi formaţi din calus.

- curentul electric 1-2 µA stimulează organogeneza din calus la Nicotiana tabacum.

Page 171: Microinmultirea plantelor

171

Tabelul 7.2.1. Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la plantele legumicole

Denumirea speciei Explant iniţial Mediu pH Zaharoză (g/l)

Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Lăstari Hussey (1978a) 5,9 30 7 (0,5)IBA+(0,12)BAP Hussey&Falavigna

1980 Calus Dunstan&Short

(1977a)BDS 5,5 30 8 (0,05-2)ANA+(2-8)2iP Dunstan&Short

1977b

Allium cepa

Fragmente rădăcini

White (1937a) - 20 lichid White (1938a)

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,7 30 7 (0,09) ANA + (0,11)Kin Chin (1982)

Lăstari Gorter (1965) - 40 20 Gorter (1965) Lăstari Murashige et al (1972 b) 5,7 25 6 (0,3) ANA + (0,1) Kin +

(40) AdS Murashige et

al.(1972b) Lăstari Pelletier et al. (1972) To - 20 5 Pelletier et al (1972) Lăstari Murashige & Skoog

(1962) - 30 agar (0,1) AIA Steward&Mapes(19

71b) Lăstari Murashige & Skoog

(1962) 5,7 30 7 (0,05-0,1)ANA+(0-

0,05)Kin Yang & Clore

(1973) Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,7 30 7 (0,01-0,1) ANA Yang&Clore(1974a,b)

Asparagus officinalis

Lăstari Yang (1977) 5,7 30 7 (0,1)ANA Yang (1977) Brassica alba Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar AIA Leelavahti et al(1984)

Calus sub lumină roşie

Gamborg et al (1968) B5 5,5 20 agar (2) ANA + (0,5)BAP Tejovathi & Anwar (1984)

Lăstari De Fossard et al (1974a) H-ZH

5,5 41,1 8 Concentraţie ridicată de IBA

Trimboli et al (1977)

Brassica oleracea botrytis

Lăstari Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 lichid (8) AIA + (0-0,25) Kin Walkey & Woolfitt (1970)

Page 172: Microinmultirea plantelor

172

Tabelul 7.2.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Brassica oleracea capitata

Lăstari Shahin (1985) TM-4 5,8 10 7 Lillo & Shahin (1986)

Brassica oleracea gemmifera

Lăstari Gamborg et al (1968) B5 - 20 8 Ockendon (1984, 1985)

Capsicum annuum Muguri Phillips & Hubstenb’ (1984, 1985)

5,8 30 glucoză 8 (0,05) AIA + (0,05) BAP Phillips & Hubstenb (1984, 1985)

Cichorium intybus Fragmente rădăcini cilindrice (6/2mm) Heller ANA, kin, GA Vasseur şi co.

(1986) Cucumis melo Lăstari Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 +/-(0,01-0,1)AIA sau ANA Moreno et al.(1984)

Hipocotil Jelaska et al. (1985) 30 9 (1-32) AIA Jelaska et al. (1985) Cucurbita pepo Lăstari Tran Than Van (1973) 5,8 30 10 (8)AIA Pink & Walkey

(1984) Fragmente

rădăcini Bonner (1940b)C 20/40 lichid Bonner (1940b)

Calus Halperin (1966)B 5,6 20 lichid Halperin (1966)

Daucus carota

Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 10 (0,1)AIA Smith&Murashige(1970) Lăstari Elliot(1969)M-S 5,8 30 agar (1)ANA Elliot(1969) Lăstari Murashige & Skoog

(1962) 5,8 30 8 (1)BAP sau

[(1)AIA+(1)Kin] Litz&Conover(1978

b) Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 (1)ANA+(0,1)BAP Carswell&Locy(1984)

Ipomoea batatas

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (1)ANA+(0,1)BAP Carswell&Locy (1984)

Lăstari Kartha et al.(1974a) 5,8 30 8 Bloksberg&Saltveit (1985)

Lăstari adventivi Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 Brown et al (1986) Lăstari Shepard (1982)T 5,6 58,2 5 (40)AdS Engler & Grogan

(1983)

Lactuca sativa

Lăstari Miller (1961a,1963) 5,8 30 10 (1)IBA Koevary et al (1978)

Page 173: Microinmultirea plantelor

173

Tabelul 7.2.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Lăstari Yang&Chang(1979) 5,7 30 2 gelrite Ammati et al.(1984) Fragmente

rădăcini Boll&Street(1951) 20 lichid Boll&Street(1951)

Fragmente rădăcini

Bonner&Devirian (1939) C

20 lichid Bonner&Devirian (1939)

Lăstari 0.5xMurashige&Skoog (1962)

5,8 3 vermiculit (0,01)ANA Cassells (1979)

Fragmente rădăcini

Sheat et al. (1959)B 30 7,5 Chin et al. (1981)

Hipocotil Murashige&Skoog (1962)

5,8 30 agar (2)Kin Gunay&Rao (1980)

Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (0,5)AIA Gunay&Rao (1980) Fragmente de

frunze Pence & Caruso (1984) - 30 8 (17,5) AIA/ (25) IA, Ala/

(23,4) IA, Gly Pence & Caruso

(1984)

Lycopersicon esculentum

Fragmente de rădăcini

White (1937 a) - 20 lichid White (1937)

Fragmente de rădăcini

Bonner & Addicott (1937) 1 sau 2

- 40 lichid Bonner & Addicott (1937)

Fragmente de rădăcini

Bonner & Devirian (1939) A

- 40 lichid Bonner & Devirian (1939)

Fragmente de rădăcini

Robbins (1922 a) - 20 glucoză lichid Robbins (1922 a)

Pisum sativum

Fragm. rădăcini Torrey (1956) 6-6,4 40 lichid (1,75) AIA + (42) Ad Torrey (1956) Fragmente de

rădăcini Bonner & Devirian

(1939) A - 40 lichid Bonner & Devirian

(1939) Fragmente de

rădăcini White (1937 a) - 20 lichid - White (1938 a)

Raphanus sativus

Fragmente de rădăcini

White (1943 a) B - 20 lichid - White (1943 a)

Page 174: Microinmultirea plantelor

174

Tabelul 7.2.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Solanum melongena

Fragmente de hipocotil

Matsuoka& Hinata (1979)

5,5 20 8 (0,016)ANA + (10)AdS Matsuoka& Hinata (1979)

Lăstari Ratnamba & Chopra (1974)

5,8 30 agar Bragdo – Aas (1977)

Lăstari Murashige & Skoog (1962) Supl

5,8 10 lichid (0,1) AIA Goodwin et al (1980 b)

Solanum tuberosum

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,7 20 7 (1) IBA Marani & Pisi (1977)

Tabelul 7.2.2. Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la plantele floricole

Denumirea speciei Explant iniţial Mediu pH Zaharoză (g/l)

Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Amaryllis sp, Lăstari White (1943 a) A 10 agar Bapat &

Narayanaswamy (1976)

Anthurium andraeanum

Calus Pierik et al (1974) 40 agar (0,23) BAP Fersing & Lutz (1977)

Lăstari Pierik et al (1974) 10 agar (0,002 – 0,02) 2,4-D Fersing & Lutz (1977)

Anthurium scherzerianum

Lăstari Pierik et al (1974) 30 7 (0,1) AIA Pierik & Steegmas (1976 a)

Antirrhinum majus Lăstari Bourgin & Nitsch (1967) 5,5 10 8 Pfister & Widholm (1984)

Begonia semperflorens

Frunze Bourgin & Nitsch (1967) H

5,8 20 7 (0,18)AIA sau (0,2) IBA sau (0,19) ANA

Thakur (1973)

Page 175: Microinmultirea plantelor

175

Tabelul 7.2.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Caladium bicolor Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (1) ANA +(1) BAP Sahavacharin (1982) Camellia japonica Lăstari Samartin et al ( 1984) 2 5,5 30 6 Samartin et al (1984)

Cattleya sp, Protocorm Knudson (1946) C 20 agar Lindemann et al (1970)

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 10 (0,205) ANA Wambugu & Rangan (1981)

Chrysanthemum sp,

Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 30 5 (0,02) ANA Bush et al (1975) Coleus blumei Lăstari Linsmaier & Skoog

(1965) 5,8 30 10 (0,1)AIA Smith & Murashige

(1970) Colocasia esculenta

Lăstari Abo El – Nil & Zettler (1976) A Z

5,8 20 6 (1,9) ANA + (0,09) 2iP Abo El – Nil & Zettler (1976)

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 6 Evaldsson & Welander (1985)

Cordyline terminalis

Lăstari Kunisaki (1975) 5,8 30 9 Kunisaki (1975) Lăstari Ball & Arditti (1976) S 5,8 30 13 (0,1) AIA Ball&Arditti (1976) Dendrobium sp,

Protocorm Morell (1974)B 5,5 20 8 (1) ANA Morell (1974) Lăstari Linsmaier & Skoog

(1965) 5,7 30 6 Earle & Langhans

(1975) Calus Engvild (1972) 30 10 Engvild (1972) Lăstari Gukasyan et al (1977) 0,2 7 (1)ANA Gukasyan et al (1977) Lăstari Vieitez&Vieitez (1980 b) 5,8 30 7 Leshem (1986) Lăstari Petru & Landa (1974) A 30 Petru&Landa (1974) A Lăstari Petru & Landa (1974) A 20 (0,4) AIA + (5) Ad Petru & Landa (1974) A

Dianthus caryophyllus

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (0,1) AIA Roest & Bokelmann (1981)

Dracaena fragrans Internod Linsmaier&Skoo(1965) 30 6 (1) 2,4-D + (0,3) BAP Hunault (1976) Dracaena gosetfiana

Lăstari Miller & Murahige (1976) II

5 30 0 (10) AIA Miller & Murashige (1976)

Page 176: Microinmultirea plantelor

176

Tabelul 7.2.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Dracaena marginata

Lăstari Murahige & Skoog (1962)

6 30 8 (1) ANA + 15% CM Choa et al (1981)

Ficus benjamina Lăstari Miller & Murahige (1976) II

5,8 30 Agar Makino et al (1977)

Lăstari Debelgh & De Waiel (1977) Roots

5,8 20 6 Debelgh & De Waiel (1977)

Ficus lyrata

Lăstari Gamborg et al, (1968) B5

5 30 0 Stevenson&Harris (1980)

Lăstari Extra Vitrum Economou & Spanoudaki (1985)

Gardenia jasminoides

Lăstari 0,25xMurashige & Skoog (19620

5,8 20 8 Beyl & Sharma (1983)

Lăstari Murashige et al (1974) 5,7 45 10 (10)AIA Murashige&al (1974) Lăstari Pierik & Woets (1971)A 30 6 (1)AIA Pierik et al (1973) Lăstari Pierik et al (1975) 30 6 (10)AIA Pierik et al (1975)

Gerbera jamesonii

Lăstari Sitbon (1981)1 5,7 45 8 (1)IBA Sitbon (1981) Hyacinthus orientalis

Bulbili Kim et al (1981) 5,7 30 8 (0,1)ANA Kim et al (1981)

Iris sp, Calus Meyer et al (1975) 5,8 30 6 Meyer et al (1975) Mammillaria

carmenae Lăstari Vyskot & Bezdek

(1984)1 sau 2 5,5 30 agar (1)ANA Vyskot &Jara (1984)

Mammillaria elongata

Tuberculi Johnson & Emino (1979) 5,6 45 10 (60)[ANA sai IBA] + (1-2) (Kin sau 2iP)

Johnson & Emino (1979)

Mammillaria prolifera

Lăstari Vyskot & Bezdek (1984)1 sau 2

5,5 30 agar (1)AIA Vyskot &Jara (1984)

Monstera deliciosa Lăstari Linsmaier & Skoog (1965)

5,7 30 8 (2)AiA Fonnesbech & Fonnesbech (1980)

Page 177: Microinmultirea plantelor

177

Tabelul 7.2.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Narcissus sp, Lăstari 0,5xMurashige & Skoog (1962)

5,4-5,6 15 6 Seabrook et al (1976)

Nephrolepsis cordifolia

Calus Steeves et al (1955)2 20 agar Sulklyan & Mehra (1977)

Nephrolepsis falcata Lăstari Miller & Murashige (1976)III

30 8 Beck & Caponetti (1983)

Oncidium lanceanum Protocorm Lim-Ho (1982) VW 20 10 7,5% CM Lim-Ho (1982) Oncidium varicosum Lăstari Dalla Rosa & Laneri

(1977) KO7 5,5 20 8 Kerbauy (1984b)

Lăstari Linsmaier& Skoog (1965) 5,7-5,8 30 5 Daykin et al (1976) Lăstari Sangwan & Norreel (1975) 5,6 20 agar (0,1)ANA Sangwan & Norreel

(1975)

Petunia hybrida

Lăstari Sharma & Mitra (1976) R 10 agar (0,5-1)AIA Sharma Mitra (1976) Lăstari Murashige & Skoog

(1962) 5,8 30 6 Cassells & Plunkett

(1984) Lăstari Cooke (1977) 5,7 30 9 Cooke (1977) Lăstari Grunewaldt (1976) 5,8 30 8 (2)AIA Grunewaldt (1976) Lăstari Harney & Knap (1979) 15 6 Harney&Knap (1979)

Saintpaulia ionantha

Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 Weatherhead et al (1982) Sansevieria trifasciata

Lăstari Murashige&Skoog (1962) 6,3 20 8 (1)IBA Blazich & Novitzky (1984)

Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 8 (0,5)IBA +(0,5)GA3 Kothari & Chandra (1984a) Fragmente frunze Murashige & Skoog

(1962) 5,8 30 8 (1)AIA + (1)Kin Kothari & Chandra

(1984a)

Tagetes erecta

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 0 (0,5)IBA + (0,5)GA3 Kothari & Chandra (1984b)

Page 178: Microinmultirea plantelor

178

Tabelul 7.2.3. Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la plantele pomicole

Denumirea speciei Explant Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere(mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Fragmente lăstari 0,5 x Murashige &

Skoog (1962) 10 agar Kwei et al (1980) Actinidia deliciosa

Lăstari Extra vitrum Monette (1986 a) Lăstari 0,25 x Hisajima (1982

a) 5,5 30 6 (1) IBA Hisajima (1982 a) Amygdalus

communis lăstari Ruginii & Verma

(1982) R 5,8 30 Verm (0,1) ANA + (0,7) BAP Ruginii & Verma

(1982;1983) Lăstari Murashige & Skoog

(1962) 30 0

(agar) (0,18)ANA+ (0,4)IBA Matheus & Rangan

(1979) Lăstari Ranga Swamy (1961)I 30 agar (0,05)ANA+(0,4)IBA+(

2)Kin Matheus & Rangan

(1981)

Ananas comosus

Lăstari 0,5xMurashige & Skoog (1962)

30 agar Zepeda & Sagawa (1981)

Lăstari 0,13 x Murashige&Skoog(196

2)

5,7 3, 5-6 (0,1-2)ANA Skirvin et al,(1980) Armeniaca vulgaris

Lăstari Snir & Erez (1980)R 5,3 20 7 (0,5)ANA Snir (1984) Castanea

mollissima Lăstari Yang et al, (1986) 5,5 20 6,5 Yang et al,(1986)

Lăstari 0,5 x Rodriguez (1982b) K(h)

5,5 30 6 (1)IBA Rodriguez (1982c)

Lăstari Vieitez et al (!983)MS(N/2)/2

30 6 (0,5-1)BAP San Jose et al (1984)

Castanea sativa

Lăstari Vieitez & Vieitez(1980a) 2

5,5 30 6 (1)IBA Vieitez & Vieitez(1980a)

Page 179: Microinmultirea plantelor

179

Tabelul 7.2.3. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,3 30 0 (1)ANA+[(1)IBA sau (1)ABA]

Feucht & Dausend (1976)

Cerasus avium

Lăstari Jones et al (1977) 5,2 30 7 (1)IBA+(0,1)GA3 Seirlis et al, (1979) Lăstari 0,13xMurashige&Skoog

(1962) 5,7 30 5-6 (0,1-2ANA) Skirvin et al,(1980) Cerasus vulgaris

Lăstari Skirvin et al, (1981) MS-H2

5,7 20 6 (3)IBA+(1)ANA+ (0,04)Kin+(0,01)BAP+(

0,1)GA3

Skirvin et al, (1981b)

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (0,15)ANA+(0,5)IBA Muriithi et al, (1982)

Ficus carica

Lăstari Linsmaier & Skoog (1965)

5,2 30 7 (1)IBA+(0,1)GA3+ (89)PG

Pontikis & Melas (1986)

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,6 30 7 (0,4-1)IBA Anderson et al, (1982)

Fragaria

Lăstari Boxus (1974a) 5,6 22 glucoză 7 Boxus et al, (1974) Glossularia

redinata Lăstari Welander (1985a) 5,5 30 6 Welander (1985a)

Lăstari 0,5 x Chalupa (1981a)A 5-10 6 (0,3)ANA+(0,3)IBA Chalupa (1981a) Juglans regia Cotiledon 0,5xCheng (1975)Basal 5,5 30 8 (7,4)ANA+[(0,45)BAP

sau (0,43)Kin] Rodriguez (1982a)

Lăstari Jones et al (1977) 5,2 30 7 (03)IBA+(0,1)GA3+ (162)PG apoi (0,1)GA3

Jones et al (1979)

Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,3 20 7 (1,9)ANA Lane (1979) Lăstari Kartha et al, (1974 a) 5,8 30 8 (0,03-0,3)AIA+

(0,01)ANA Liu et al (1983a)

Calus din sămânţă, cotiledon sau frunză

White (1943a)A 20 agar (4)ANA+(2)Kin +(1)GA3 + 15% CM

Mehra & Sachdeva (1979)

Lăstari Snir & Erez (1980) 5,8 20 7 (1)IBA Snir & Erez (1980)

Malus x domestica

Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,2 15 0 (0,3)IBA Nieuwkirk&al(1986)

Page 180: Microinmultirea plantelor

180

Tabelul 7.2.3. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Mangifera indica Cotiledon Murashige & Skoog (1962)

40 agar (5)ANA+(2,5)Kin +15%CM

Rao et al, (1982)

Morus alba Frunze, peţiol, lăstari

Lakshmi-Sita et al (1976)

5,6 30 8 (0,1)ANA Oka & Ohyama (1981)

Lăstari Krikorian & Cronauer (1984)

5,8 41 0 (1)ANA+10%CM Cronauer & Krikorian (1985a)

Lăstari Heinz & Mee (1969) 5,8 40 7 (1)ANA + 10% CM Cronauer & Krikorian (1985b)

Musa acuminata

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,8 20 8 (5)IBA Dore Swamy et al (1983)

Lăstari Heinz & Mee (1979) 5,8 40 7 (1)ANA, AIA sau IBA Cronauer & Krikorian (1984)

Calus Linsmaier & Skoog (1965)

5,6 30 3 Jarret et al (1985b)

Musa spp,

Lăstari Wong (1986) 5,7 20 7 (5)BAP Wong (1986) Musa textilis Lăstari Mante & Tepper (1983)

I 5,7 30 5-8 (0,1-1)ANA sau

(2-10)IBA Mante & Tepper

(1983) Olea europaea Lăstari Colomas (1971) 5,8 30 6 (2-4)ANA Rugini&Fontanazza

(1981) Lăstari Miller et al (1982)A 20 8 (0,1)ANA Miller et al (1982) Lăstari 0,13xMurashige &

Skoog (1962) 5,7 30 5-6 (0,1-2)ANA Skirvin et al (1980)

Persica vulgaris

Lăstari Skirvin et al (1981) MS-H

5,7 20 6 (3)IBA+(1)ANA+ (0,1)GA3+(0,04)Kin

1+(0,01)BAP

Skirvin et al (1981)

Plantule Thompson & Gordon (1977)

5,6-5,8 30 8 (0,1)ANA Tisserat (1982) Phoenix dactylifera

Lăstari Tisserat (1984a) 5,6-5,8 30 8 (0,1)ANA Tisserat (1984a)

Page 181: Microinmultirea plantelor

181

Tabelul 7.2.3. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,8 0 7 Barghchi&Alderson (1983)

Pistacia vera

Lăstari Pierik et al (1974) 30 7 (2,5)IBA Barghchi&Alderson (1985)

Lăstari 0,5 x Murashige & Skoog (1962)

5,7-5,8

30 7 (2)IBA Garland&Stoltz (1981)

Lăstari 0,5 x Kim et al, (1981) 5,8 20 agar [(2,5)AIA+(0,1)GA3] sau (5)AIA

Hammerschlag (1982b)

Prunus cerasifera

Lăstari Linsmaier&Skoog (1965)

5,8 30 7 (0,5-2,5)IBA Norton & Boe (1982)

Fragmente lăstari (7-12 mm)

Pietropaolo & Reisch (1984)

5,8 30 7 (0,5-2,5)IBA/5 săpt sau

(2-6,1)IBA/3 săpt

Pietropaolo & Reisch (1984)

Prunus domestica

Lăstari 0,13 x Murashige&Skoog

(1962)

5,7 30 5,6 (0,1-2)ANA Skirvin et al (1980)

Prunus insititia Lăstari Jones et al, (1977) 5,2 30 7 (3)IBA+(0,1)GA3 +(162)PG

Jones & Hopgood (1979)

Pyrus communis Lăstari Lane (1979b) 5,2 30 7 Auxina Lane (1979b) Fragmente lăstari Jones &Vine (1968)B 5,6-

5,8 40 glucoza 0 (1)IBA+(0,2)BAP

+(1)GA3 Jones &Vine (1968) Ribes nigrum

Calus Harvey (1967)Basal 6 30 10 (1)AIA+(1)Kin Harvey&Grasham (1977) Lăstari Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (0,1)IBA Anderson (1979) Lăstari Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (1)IBA Borgman & Mudge

(1986) Fragmente

rădăcini Anderson (1978;1980) 5,7 30 6 (0,5)IBA+(80)AdS Borgman & Mudge

(1986) Lăstari Donnelly et al, (1980)2 5,7 30 0 (0,5)BAP Donnelly et al, (1980)

Rubus idaeus

Lăstari Hedtrich(1979)B 5,7 20 0 (0,5)AIA Gebhardt(1985)

Page 182: Microinmultirea plantelor

182

Tabelul 7.2.3. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Lăstari (7-15 mm)

Linsmaier & Skoog (1965)

5,6-5,8

30 7 (1)IBA Broome & Zimmerman (1978)

Rubus sp,

Lăstari Linsmaier & Skoog (1965)

5,6-5,8

30 0 (0,5)IBA Donnely et al (1986)

Fragmente frunze

Hall & Collin (1975) 5,7 30 10 (2)AIA+(0,1)Kin +10%CM

Pence&Janick (1978)

Theobroma cacao

Lăstari Passey & Jones (1983) 5,2 30 7 (0,5)IBA+(0,5)ANA +(162)PG

Passey & Jones (1983)

Lăstari Extra vitrum Cohen & Elliot(1979)

Vaccinium corymbosum

Lăstari Extra vitrum Wolfe et al (1983;1986)

Lăstari Extra vitrum Zimmerman&Broome (1980)

Vaccinium sp,

Lăstari Extra vitrum Smagula & Lyrene (1984)

Page 183: Microinmultirea plantelor

183

Tabelul 7.2.4. Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la arborii şi arbuştii ornamentali

Denumirea speciei Rezultatul Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere(mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Lăstari Simola (1985)N7 5,6 20 6 Simola (1985) Lăstari Srivastava&Steinhauer

(1981b)MMS 5,8 40 6 (2)AIA + (6)Kin +

(40)Ad Srivastava&Steinha

uer (1981b)

Betula pendula

Calus+ lăstari Srivastava et al (1985) 5,8 30 6,5 (1)ANA Srivastava&al (1985) Lăstari Chalupa (1981b) 2 15 6 (0,1)IBA sau (0,1)ANA Chalupa (1981b) Betula verrucosa Calus Jacquiot (1955) 30 agar (1)ANA Jacquiot (1955)

Biota orientalis (thuja)

Lăstari Thomas & Tranvan (1982)

5,4 30 8 (0,1) IBA + (1,1)BAP Thomas & Tranvan (1982)

Chaenomeles japonica

Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (10-20)IBA Norton & Boe (1982)

Cotoneaster dammeri

Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (1-5)IBA Norton & Boe (1982)

Crataegus rachyacantha

Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (0,5-5)IBA Norton & Boe (1982)

Crataegus cv, TOBA Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,8 30 7 (5-10)IBA Norton & Boe (1982) Fraxinus

americana Lăstari Lloyd & McCown

(1981) WPM 5,2 20 6 nespecificat Heiman & Preece

(1983) Fraxinus

pennsylvanica Lăstari Lloyd & McCown

(1981) WPM 5,2 20 6 nespecificat Heiman & Preece

(1983) Lăstari Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (1)ANA Banks et al, (1979) Hedera helix Lăstari Banks(1979) 1, 5,7 30 5 (1)ANA Banks (1979)

Hydrangea macrophylla

Lăstari 2-3cm

0,5 x Murashige&Skoog (1962)

5,7-5,8

20 7

Stoltz (1984)

Page 184: Microinmultirea plantelor

184

Tabelul 7.2.4. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Lavandula augustifolia & sp,

Lăstari Kartha et al, (1974a) 5,5 20 lichid (5)AIA + (0,5)BAP + (5)GA3

Quazi (1980)

Lăstari Ben-Jaacov & Dax (1981) 5,6 30 agar (0,5-1)IBA Burger et al (1985) Paulownia tomentosa Lăstari Murashige & Skoog

(1962) 30 8 (1)IBA Marcortriginiano &

Stimart (1983) Picea abies Lăstari 0,5 x Linsmaier &

Skoog (1965) 5,6 5 7 (0,02) ANA Chalupa (1977)

Pinus sylvestris Lăstari Bornman & Janson (1980)

5,6-5,8

50,5 6-7 (1,46) Cumarina Bornman & Janson (1980)

Pseudiotsuga menziesii

Lăstari 0,5 x Linsmaier & Skoog (1965)

5,6 5 7 (0,02) ANA Chalupa (1977)

Pyracantha coccinea

Lăstari Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 7 (5-10) IBA Norton & Boe (1982)

Lăstari Chalupa (1984 a,b) WPMR

10 6 (0,1) ANA + (0,3) IBA Chalupa (1984a) Quercus robur

Fragmente lăstari Vieitez et al (1985) H + SO4

30 6 Vieitez et al (1985)

Lăstari Extra Vitrum Economou & Read (1984)

Rhododendron spp

Lăstari Kyte & Briggs (1979) R 30 6 Kyte & Briggs (1979)

Lăstari Hasegawa (1979) 5,7 60 6 (1) AIA Bressan et al (1982) Lăstari Hyndman et al (1982a, b) 5,7 70 8 Hyndman et al (1982 a, b)

Rosa hybrida

Lăstari 0,25 x Skirvin & Chu (1979 a)

5,7 30 10 Skirvin & Chu (1979 a)

Rosa sp, Lăstari Murashige & Skoog (1962)

40 6 +/- (0,05-0,1) ANA Davies (1980)

Salix madsudana Lăstari Whitehed & Giles (1976)

5,8 20 agar (0,2) ANA Bhojwani (1980)

Page 185: Microinmultirea plantelor

185

Tabelul 7.2.4. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Thuja plicata Lăstari Coleman & Thorpe (1977) S

5,2 30 agar (10) IBA Coleman & Thorpe (1977)

Tilia cordata Lăstari Chalupa (1984 a,b) BTMRsau WPMR

10 6 (0,1) ANA + (0,3) IBA Chalupa (1984 a, b)

Weigela florida Lăstari Murashige&Skoog(1962) 30 agar (0,88) AIA Calvert&Stephens(1986) ]

Tabelul 7.2.5. Cercetări privind organogeneza adventivă de rădăcini la viţa de vie

Denumirea speciei Explant Rezultat Mediu pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l)

Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Vitis berlandieri x V. cardinalis

Fragmente lăstari

Plantule înrădăcinate

0.5 x Murashige & Skoog (1962)

5,8 20 7 (0.02)IBA sau ANA Novak&Jujova (1983)

Vitis riparia x V. rupestris

Rădăcini adventive

Favre (1977) P7 5,8 20 (20)AIA +(0.1)BAP

Favre (1977)

Vitis rupestris

Internod, frunze, petiol

Lăstar Lăstar înrădăcinat Gazly (1964) 6,5 15 8 (0.02)ANA Gazly (1972) Vitis spp Fragmente lăstari Lăstari înrădăcinaţi Chee & Pool (1982a) 5,8 30 8 (0.02)ANA Chee&Pool (1982a,b)

Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare lăstari

Webb & Street (1977)CI

30 agar (0.023)BAP Aldwinckle & Buturac (1981)

Vitis vinifera Apexuri lăstari Lăstari înrădăcinaţi White (1943a)A 5,8 30 0 (2.2)BAP Barlass et al (1982) Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare Jona & Webb (1979)C 5,7-5,8 20 3-5,5 (0.23)BAP Jona & Webb (1979) Vitis vinifera Meristeme Lăstar unic,

înrădăcinat Jona & Webb (1979)C 5,7-5,8 20 3-5,5 (0.023-0.23)BAP Jona & Webb (1979)

Vitis vinifera Apexuri lăstari Înrădăcinare Stevenson & Monette (1983)R

5 30 0 (0.1)AIA Stevenson & Monette (1983)

Page 186: Microinmultirea plantelor

186

Capitolul 8

Embriogeneza somatică

8.1. Formarea embrionilor somatici

Embriogeneza somatică a fost realizată pentru prima dată în 1958 de Reinert şi

Steward la morcov, din calus şi suspensie de celule. Tot ei au realizat o paralelă între

formarea embrionilor zigotici şi a celor somatici fapt uşurat de folosirea laptelui de cocos

în mediul de cultură.

Şi alţi reprezentanţi din Fam. Umbeliferae produc uşor embrioni somatici (Thomas

şi colab. 1979, ţelină). Formarea embrionilor somatici parcurge mai multe etape:

- dediferenţierea celulelor diferenţiate şi începerea diviziunii;

- formarea celulelor parenchimatice, începerea diviziunii şi creşterea conţinutului

de citoplasmă sub influenţa auxinelor. În urma acestor procese, celulele parenchimatice se

transformă în celule embriogenice. Acestea sunt mici, cu conţinut citoplasmatic dens,

vacuolă mică, nuclei mari cu nucleoli mari, conţinut mare de grăunciori de amidon. Au

activitate metabolică intensă şi o sinteză intensă de ARN;

- formarea embrionilor din celule embriogenice în absenţa auxinelor din mediu.

Formarea embrionilor somatici se poate face în interiorul calusului, (endogen) sau

la exteriorul acestuia (exogen). Embrionii somatici se mai pot forma în ţesutul nucelar şi

hipocotil, sau pe organe florale, antere, grăunciori de polen, enndosperm, embrioni

zigotici.

Embrionii somatică se formează dintr-o singură celulă care se divide şi formează o

structură embrioidă.

Embriogeneza somatică a fost realizată la 132 de specii din 81 de genuri din

familiile: Ranunculaceae, Rutaceae, Solanaceae, Umbeliferae. Graminae etc. (Tisserat,

colab., 1979, citaţi de Pierik, 1987).

Page 187: Microinmultirea plantelor

187

8.2. Embriogeneza somatică directă

Embriogeneza directă reprezintă formarea embrionilor somatici sau a ţesuturilor

embrionare direct din explantul iniţial. Embrionii somatici se pot forma din celule

somatice, din celule nucelare la Citrus, din celule epidermice, din hipocotil de morcov,

Ranunculus, Brassica napus.

Pentru inducerea şi studierea embriogenezei somatice, cel mai adesea se recurge la

culturi de embrioni zigotici imaturi. Ţesutul acestora are un pronunţat caracter

embriogenic. Momentul oprim pentru izolarea embrionilor şi inocularea lor in vitro este la

aproximativ 14 zile după polenizare.

Mediile de cultură folosite conţin cantităţi variabile de auxine, în special 2,4 C şi

ANA.

După sterilizarea de suprafaţă se face excizarea embrionului imatur şi inocularea lui

pe mediu. După aproximativ o săptămână, la o parte dintre explante încep să se

diferenţieze embrioni somatici în diferite stadii de dezvoltare. Fazele de evoluţie ale

embrionilor somatici sunt: globulară, cordiformă, de torpilă şi cotiledonară (forma de

ţăruş). De remarcat dezvoltarea asincronă a embrionilor, fapt care determină suprapunerea

diferitelor faze de evoluţie. Acest lucru îngreunează mult orice tentativă de automatizare a

culturilor şi sporeşte cheltuielile cu manopera.

8.3. Embriogeneza somatică indirectă

Regenerarea unor embrioni somatici din calus poartă denumirea de embriogeneză

indirectă. După obţinerea şi multiplicarea calusului (subcapitolul 11.1.) acesta este trecut

pe un mediu pe care se realizează inducţia şi formarea embrionilor somatici. După

realizarea inducţiei are loc formarea celulelor embriogenice care vor da naştere

embrionilor somatici.

Capacitatea de regenerare depinde de specie, felul explantului iniţial (floem

secundar la morcov, fragmente de frunze la cafea, kiwi, Petunia, Asparagus, cotiledoane,

embrioni zigotici la conifere, citrice), vârsta explantului iniţial (gradul de juvenilizare),

numărul de subculturi, etc. Unele specii regenerează numai organe şi embrioni somatici.

Inducţia embrionilor somatici este condiţionată de un număr însemnat de factori:

- concentraţia ridicată de auxine şi în special 2,4 D, determină inducţia embrionilor

somatici;

Page 188: Microinmultirea plantelor

188

- acidul abscisic stimulează formarea embrionilor somatici în culturile de calus şi

suspensii celulare;

- giberelinele şi etilena inhibă procesele de inducţie;

- şansa formării embrionilor somatici creşte la ţesuturile juvenile. La speciile

aparţinând genului Citrus, aceştia se formează numai în nucelă;

- azotul redus sub formă de ioni de amoniu, potasiul şi concentraţia ridicată de

săruri stimulează formarea celulelor embriogenice în masa calusului; în acelaşi timp, ionii

de calciu influenţează negativ acest proces;

- lumina este un factor stimulator al embriogenezei somatice cu toate că, anumite

specii reacţionează mai bine la întuneric;

- temperatura ridicată stimulează formarea embrionilor somatici. Atunci când

materialul iniţial este reprezentat de antere, acesta necesită la început un şoc cu temperaturi

scăzute.

- concentraţia de zaharoză de 2-3% şi prezenţa laptelui de cocos au un efect pozitiv

asupra inducţiei procesului de embriogeneză somatică.

Embriogeneza somatică indirectă rămâne o tehnică mai puţin folosită în practică

datorită unor neajunsuri pe care le prezintă:

- materialul genetic este relativ instabil în timpul proceselor de embriogeneză, iar

riscul apariţiei mutaţiilor face ca metoda să nu fie recomandată la înmulţirea materialului

clonal;

- este o metodă dificilă pentru că multe specii nu formează embrioni somatici;

- prin culturi repetate scade capacitatea de regenerare a calusului;

- frecvent formarea embrionilor somatici este asociată cu apariţia fenomenului de

dormans care face dificilă sau imposibilă pornirea acestora în “vegetaţie” şi regenerarea

unor plante întregi;

- formarea scalară a embrionilor face ca procesul să fie destul de greu de gestionat.

În tabelele 8.1., 8.2., 8.3. şi 8.4. sunt prezentate principalele realizări în domeniul

embriogenezei somatice la plantele horticole.

Page 189: Microinmultirea plantelor

189

Tabelul 8.1. Cercetări privind embriogeneza somatică la plantele legumicole

Denumirea speciei Explant iniţial Mediu pH Zaharoză (g/l)

Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Calus Murashige&Skoog

(1962) - 30 lichid Al-Abta&Collin

(1978) Calus Murashige&Skoog

(1962) 5,6 30 10 (0,1)ANA+(3)Kin Chen (1976)

Peţiol Murashige&Skoog (1962)

- 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Williams&Collin (1976)&

Apium graveolens

Calus Murashige&Skoog (1962)

- 30 lichid (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Williams&Collin (1976)&

Calus Nitsch et al. (1969a) - 30 6 Bui Dang Ha et al. (1975)

Calus Murashige & Skoog (1962)

- 30 lichid (5) ANA Steward & Mapes (1971 b)

Asparagus officinalis

Celule din cultura în suspensie

Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 8 (0,01) 2,4-D + (0,1) Kin Wilmar & Hellendoorn (1968)

Brassica alba Calus Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 agar (0,1)ANA+(0,1) 2,4-D Leelavahti et al (1984)

Frunze tinere Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 agar (1) AIA + (0,5)Kin Pareek & Chandra (1978 a)

Brassica oleracea botrytis

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 agar (0,01-0,1)AIA +(0,5)Kin Pareek & Chandra (1978 a)

Segmente de nervură foliară (2

mm gros)

Murashige&Skoog (1962)Gamborg & co. (1968) Kin, BA, AIA, ANA,

2,4-D, picloram Mix (1985) Cichorium intybus

Fragmente rădăcini 5x5x5 mm

Murashige şi Skoog (1962) BA, 2,4-D, 2,4,5-T Van Dick (1986)

Page 190: Microinmultirea plantelor

190

Tabelul 8.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Cucumis melo Hipocotil Reynolds et al (1980) 5,7 40 glucoza 8 (0,5)2,4-D+(0,5)2,4,5-T+(0,5)NOA+(0,5)IBA+

(0,5)2,4,5-TP+ (0,5)CPA+(0,5)pic+

(0,5)MCPP+(0,1)CCC+ (30)Ad

Blackmon et al.(1981b)

Cucumis sativus Calus Lazarte&Sasser (1982)L 0 agar +/-(1)Kin Lazarte&Sasser(1982) Cucurbita pepo Fragmente

hipocotil Murashige & Skoog

(1962) 30 glucoza 9 (10)IBA apoi (1)IBA in

urmatoarele subculturi Jaleska (1974)

Suspensie Eriksson(1965)1. 5,8 40 lichid (0,9)ANA+(0,02 )Kin Fridborg et al.(1978) Calus Halperin&Wetherell

(1965)B 20 agar (0,0005)2,4-D

+(0,001)Kin Halperin&Wetherell

(1965) Segmente peţiol Halperin (1964) 6 20 agar (0,1)2,4-D+(2)Ad Halperin (1964)

Daucus carota

calus Gamborg et al.(1968)B5 lichid Hari (1980) Fragmente rădăcină

Skirvin&Chu(1979a) 5,8 30 10 (0,1)ANA+(2)BAP Hwang et al.(1980) Ipomoea batatus

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,6-5,8

30 7 (0,1-3)2,4-D-depinzand de genotip

Jarret et al. (1984)

Lycopersicon esculentum

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,8 20 8 (0,5) AIA + (0,25) Z Zamir et all (1980; 1981)

Petroselinum hortense

Calus Murashige&Skoog (1962)

- 30 10 (10) AIA + (0,04) Kin + (15-20) AdS

Vasil & Hildebrandt (1966 b,c)

Pisum sativum Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 lichid (0,06) pic + (0,1) BAP Jacobsen & Kysely (1984) Fragmente frunze Murashige&Skoog (1962) 30 agar (10) ANA Gleddie et al (1982)

Calus Murashige&Skoog (1962) 30 lichid (10) ANA Gleddie et al (1982) Solanum

melongena Fragmente hipocotil

Matsuoka& Hinata (1979)

5,5 20 8 (8)ANA + (10) AdS Matsuoka& Hinata (1979)

Solanum tuberosum

Fragmente tuberculi

Lam (1975) 20 9 (0,4) AIA + (0,8) Kin + (0,4) GA3

Lam (1975)

Page 191: Microinmultirea plantelor

191

Tabelul 8.2. Cercetări privind embriogeneza somatică la plantele pomicole

Denumirea speciei Explant Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Actinidia deliciosa Fragmente de

rădăcini Harada (1975) 5,5 20 7 [(0,1-1)2,4-D sau

NOA] + (40) Ad Harada (1975)

Seminţe imature Litz et al (1984) 5,7 30 0 Litzet al, (1984b) Mangifera indica Fructe imature Litz (1984a) 5,7 60 8 (1)2,4-D Litz(1984b)

Fragmente lăstari

Linsmaier&Skoog (1965)

5,7 30 8 (10-100)2,4-D+(3)2iP +(40)AdS

Tisserat et al (1979)

Muguri laterali Thompson & Gordon (1977)

5,6-5,8

30 8 (100)2,4-D+(3)2iP Tisserat (1982)

Phoenix dactylifera

Calus Tisserat (1984a) 5,6-5,8

30 8 Tisserat (1984a)

Tabelul 8.3.

Cercetări privind cultura embriogeneza somatică la arborii şi arbuştii ornamentali Denumirea

speciei Explant iniţial Mediul de cultură pH Zaharoză (g/l)

Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Hedera helix Calus Banks(1979) 2, 5,7 30 5 (1)ANA + (0,5)BAP Banks (1979)

Ilex aquifolium Embrioni Linsmaier&Skoog (1965) 5,6 40 10 Hu & Sussex (1972) Larix decidua Calus Nagmani&Bonga (1985) 5,8 20 8 (2)BAP Nagmani&Bonga(1985)

Calus Von Arnold & Erikson (1981) LPm

5,8 34,2 5 (2,2) 2,4-D + (1,1) BAP Hakman et al (1985)

Picea abies

Embrioni maturi Von Arnold & Erikson (1981) LPm

10 3 gelrite

(2,21) 2,4-D + (1,13) BAP

Von Arnold & Hakman (1986)

Quercus rubra Internod Murashige&Skoog(1962) 30 agar (5) ANA + (0,1) BAP Seckinger&al(1979)

Page 192: Microinmultirea plantelor

192

Tabelul 8.4. Cercetări privind embriogeneza somatică la viţa de vie

Denumirea speciei Explant Rezultatul Mediu pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l)

Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Vitis vinifera Calus Calus

embriogen Mullins&Srinivasan

(1976)N 5.6 20 0 (1)NOA+(1.1)BAP Mullins &

Srinivasan (1976) Vitis vinifera Embrioizi Dezvoltare

embrioni Mullins&Srinivasan

(1976)N 5.6 20 agar (1)2iP+(0.35)GA3 Mullins &

Srinivasan (1976) Vitis vinifera Embrioizi Plantulă White (1954) 5.6 20 agar Mullins &

Srinivasan (1976) Vitis vinifera x Vitis rupestris

Calus 2500 embrioizi/flacon

Bourgin & Nitsch (18670 H

20 0 Rajakeran & Mullins (1979)

Vitis vinifera x Vitis rupestris

Embrioizi 83% plante haploide

Bourgin & Nitsch (18670 H

20 agar (1.11)2,4-D + (0.225)BAP

Rajakeran & Mullins (1979)

Page 193: Microinmultirea plantelor

193

8.4. Poliembrionia nucelară

O serie de specii din genul Citrus formează în mod natural, în aceeaşi sămânţă, pe

lângă embrionul zigotic şi unul sau mai mulţi embrioni somatici. Aceşti embrioni iau

naştere din celule somatice (diploide ale ţesutului nucelar). Ţesutul nucelar este un ţesut

juvenil caracterizat printr-o mare capacitate de regenerare.

Prin cultivarea ţesutului nucelar in vitro şi inducerea formării calusului s-au obţinut

un mare număr de embrioni somatici la genul Citrus (Rangaswamy, 1981).

Formarea embrionilor somatici prin embriogeneză directă sau indirectă a fost

posibilă prin cultivarea in vitro a unor ovule fecundate sau nefecundate de Citrus (Litz şi

colab. 1985).

ANA, citochinina şi compuşii complecşi (lapte de cocos, extractul de drojdie de

malţ) stimulează formarea embrionilor somatici.

Embriogeneza somatică din ţesut nucelar este prezentă la mango (Mangifera

indica) şi la alte specii pomicole tropicale. La fel ca în cazul genului Citrus, la speciile cu

tendinţă de poliembrionie in vivo capacitatea o de regenerare a embrionilor somatici in

vitro este mai ridicată decât la plantele monoembrionare.

Utilizarea poliembrioniei nucelare prezintă o serie de avantaje: permite înmulţirea

“în masă” rapidă a speciilor monoembrionare; procesele de embriogeneză somatică sunt

însoţite şi de devirozarea materialului vegetal obţinut; în paralel, se pot induce mutaţii şi se

pot selecţiona mutantele utile; se realizează juvenilizarea materialului obţinut.

În toate cazurile, folosirea pentru înmulţire a embrionilor somatici care conservă

caracteristicile genetice ale plantelor mamă, deschide mari perspective în domeniul

seminţelor sintetice (Standardi, 1997).

8.5. Încapsularea materialului vegetal in vitro

8.5.1. Sămânţa sintetică

Pentru utilizarea în producţie a embrionilor somatici s-a imaginat şi realizat

sămânţa sintetică prin crearea unui endosperm artificial, care să protejeze şi eventual să

hrănească embrionul.

Folosirea embrionilor somatici presupune apelarea la două sisteme pentru

menţinerea viabilităţii acestora:

- încapsularea în substanţe speciale de tipul gelurilor care conţin substanţe nutritive,

regulatori osmotici şi eventual pesticide;

Page 194: Microinmultirea plantelor

194

- semănatul embrionilor în flux lichid (fluid drilling) folosind sistemele puse la

punct pentru semănatul seminţelor preîncolţite de legume sau flori.

Avantajele folosirii seminţelor artificiale sunt multiple:

- permite obţinerea şi folosirea seminţelor la specii care în mod normal nu produc

seminţe;

- elimină procedurile greoaie şi costisitoare de obţinere a seminţelor hibride cu

toate avantajele care decurg de aici:

- se înlătură liniile parentale menţinute pentru hibridări;

- se elimină cercetările pentru obţinerea liniilor androsterile;

- se elimină polenizarea artificială an de an, hibrizii fiind menţinuţi prin

înmulţire vegetativă in vitro.

- permite obţinerea de sporuri substanţiale de recoltă prin folosirea unor super-

genotipuri;

- aduce mari avantaje lucrărilor de ameliorare.

Folosirea pe scară largă a seminţelor artificiale este limitată datorită unor greutăţi

care apar:

- seminţele artificiale trebuie protejate împotriva deshidratării prin folosirea unor

învelişuri care să reziste pe timpul păstrării, transportului şi semănatului;

- păstrarea seminţelor artificiale presupune folosirea unor substanţe chimice sau

agenţi fizici care să menţină embrionul în stare de repaus;

- în momentul semănatului trebuie găsite soluţii pentru scoaterea embrionului din

repaus şi începerea dezvoltării acestuia;

- procentul de plante viabile obţinute este relativ redus datorită unor cauze multiple:

- embrionii au grade de dezvoltare diferită;

- păstrarea viabilităţii embrionilor este diferită;

- crearea condiţiilor optime pentru dezvoltarea embrionilor după semănat

este greu de realizat.

- embrionul necesită şi o protecţie antipatogenă realizabilă prin înglobarea unor

substanţe pesticide. Efectul acesta trebuie să fie de scurtă durată, pentru a nu împiedica

ulterior procesele de micorizare.

Cea mai răspândită metodă pentru încapsularea embrionilor prin schimb ionic este

cea în care se foloseşte alginatul de sodiu.

Page 195: Microinmultirea plantelor

195

Embrionii sunt scufundaţi în alginat de sodiu 2-4% apoi sunt trecuţi individual în

soluţie de clorură de calciu 50 µM, la pH 7. După 20-30 de minute, capsulele de alginat se

întăresc (0,5 - 2 kg/cm2) şi pot fi manipulate.

Păstrarea se poate face în vase închise ermetic la frigider la (3-6°C) în condiţii

aseptice.

Alginatul de calciu are avantajul că este ieftin, se gelifică uşor şi nu este toxic.

Are însă şi dezavantaje (Hoza, 1996).

- permeabilitate mare pentru elementele solubile;

- creşterea rădăcinilor lăstarilor este mai lentă;

- capsulele sunt lipicioase şi se îngreunează manipularea şi semănatul.

8.5.2. Încapsularea unor organe şi ţesuturi in vitro

Ca o extindere a folosirii capsulelor de alginat s-a recurs la încapsularea altor

organe, în afara de embrionii somatici.

Astfel, multiplele cercetări efectuate de Standardi, A., şi colab., (1994-1998), au

dovedit că pot fi încapsulaţi bulbili, obţinuţi in vitro precum şi minibutaşi sau rozete de

diferite dimensiuni provenite de la un mare număr de specii: crin, măr, zmeur, kiwi etc.

După înglobarea explantelor respective în alginat, acestea au fost păstrate în

frigidere la 3-4°C timp îndelungat 6-12 luni, după care s-au trecut din nou pe un mediu de

creştere şi multiplicare.

Metoda vine să simplifice tehnologia conservării materialului genetic in vitro şi

aduce o serie de avantaje:

- se reduc substanţial cheltuielile pentru păstrarea materialului vegetal in vitro;

- se face economie de spaţiu şi de mediu de cultură;

- se realizează economie de forţă de muncă, energie etc.

Page 196: Microinmultirea plantelor

196

Capitolul 9

Embriocultura in vitro la plantele horticole

Cultura embrionilor zigotici a apărut ca necesitate pentru rezolvarea unor probleme

apărute în procesul ameliorării plantelor horticole.

În pomicultură, apare posibilă cultivarea pe medii aseptice a unor embrioni imaturi

care provin prin încrucişări de la soiuri extratimpurii şi timpurii de sâmburoase.

În mod natural, aceşti embrioni nu ajung la maturitate datorită unor dereglări

fiziologice care apar în procesul de creştere al seminţei şi fructului (foto 9.1.).

În mod similar, în cazul unor hibridări interspecifice are loc avortarea embrionilor

înaintea ajungerii lor la maturitate (Ion L. şi colab., 1997).

La viţa de vie nu este posibilă obţinerea unor descendenţi hibrizi atunci când se

foloseşte ca genitor matern un soi apiren, în acest caz, embrionul avortând timpuriu.

Situaţii oarecum similare se întâlnesc şi la realizarea unor combinaţii hibride sau

încrucişări între soiuri, specii sau genuri incompatibile la majoritatea speciilor horticole.

Prin extragerea embrionului abia format cu o porţiune de ţesut nucelar, sau prin

cultivarea ovulului fecundat, se reuşeşte depăşirea barierelor incompatibilităţii.

Un alt caz particular este reprezentat de cultivarea embrionilor maturi. Metoda se

foloseşte pentru scurtarea procesului de ameliorare prin eliminarea perioadelor de repaus

relativ al seminţelor.

Un avantaj important al embrioculturii este acela al înmulţirii clonale pornind de la

seminţele hibride ale unor plante anuale, legume şi flori. Plecând de la ideea că indivizii

regeneraţi ulterior vor păstra efectul heterozis al hibrizilor valoroşi, se poate realiza apoi

înmulţirea clonală in vitro. La Cichorium intybus L. s-a reuşit iniţierea unei culturi in vitro

cu un procent de 100% explante sănătoase prin germinarea seminţelor hibride (Diaconescu

O., 2002) (foto 9.2.).

De asemenea, în cazul unor combinaţii hibride valoroase, se face înmulţirea

materialului genetic înainte de realizarea selecţiei, sau materialul hibrid este supus unor

procese de stres selecţie in vitro înainte de a fi aclimatizat şi trecut în câmp.

Page 197: Microinmultirea plantelor

197

a b

c

d e

Foto 9.1. Fazele embrioculturii la hibrizii extratimpurii de nectarin: a – extragerea embrionilor din sâmburi, b – cultivarea embrionilor imaturi in vitro, c – puieţii hibrizi obţinuţi prin germinare in vitro, d – plantarea hibrizilor pentru

fortificare, e – hibrizi de nectarin fortificaţi

Page 198: Microinmultirea plantelor

198

Foto 9.2. Plantă hibridă de cicoare (Cichorium intybus L.)

obţinută prin germinare in vitro

Momentul începerii culturii variază de la specie la specie, în funcţie de scopul

urmărit. Astfel, la cireş, inocularea se face la 28-35 de zile de la înflorire, la vişin, la 29-41

zile şi piersic, la 81-97 zile.

Un alt indiciu folosit este reprezentat de mărimea cotiledoanelor. La piersic

momentul optim fiind atunci când acestea ating 4-5 mm în diametru.

La cireş, se mai recomandă iniţierea culturii în momentul întăririi sâmburelui, după

aceea viabilitatea embrionilor scade până la momentul intrării în pârgă.

Stabilizarea culturilor de embrioni este relativ uşoară datorită faptului că sâmburii

sau seminţele protejate de endocarp sau tegumente, pot fi sterilizate la concentraţii ridicate.

Compoziţia mediului de cultură este cu atât mai complexă cu cât embrionii se află

într-un stadiu de dezvoltare mai incipient.

După inoculare, embrionii se lasă la întuneric timp de 30-60 de zile la temperatura

camerei pentru germinare după care sunt trecuţi la lumină.

În tabelele 9.1., 9.2. şi 9.3. sunt prezentate câteva din cercetările privind folosirea

embrionilor zigotici imaturi la plantele horticole.

Page 199: Microinmultirea plantelor

199

Tabelul 9.1. Cercetări privind cultura de embrioni imaturi la plantele legumicole

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză (g/l)

Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Allium cepa Cultură embrioni Guha&Johri (1966) 5,8 50 7 (0,5)AIA-pentru formare

bulbili Guha&Johri (1966)

Plantule Murashige&Skoog (1962) 5,6 30 10 Chen (1976) Plantule Murashige&Skoog (1962) 30 agar Williams&Collin

(1976)& Dezvoltare embrioni

Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 lichid (0,6)Kin Zee&Wu(1979)

Apium graveolens

Plantule Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar Zee&Wu (1980) Plante diploide Nitsch et al. (1969a) - 30 6 AIA + Z (nespecificat) Bui Dang HA et al

(1975) Creşterea

embrionilor Linsmaier & Skoog

(1965) 5,8 30 8 (1) 2,4-D + (0,315) Kin Wilmar &

Hellendoorn (1968)

Asparagus officinalis

Creşterea plantelor

Knudson (1946) C - 30 8 Wilmar & Hellendoorn (1968)

Brassica alba Lăstari Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar Leelavahti et al (1984) Plantule Gamborg et al. (1968) B5 5,5 20 8 (0,5)BAP Bagga et al (1982) Brassica oleracea

botrytis Plantule Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 agar Pareek & Chandra (1978 a)

Capsicum annuum Plantule haploide şi diploide

Dumas De Vaulx et al (1981) R

5,9 30 8 (2) Kin Dumas De Vaulx et al (1981)

Page 200: Microinmultirea plantelor

200

Tabelul 9.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Germinarea embrionilor şi plantule

Murashige&Skoog (1962)

5,8 30 8 Norton (1981) Cucumis melo

Lăstari şi rădăcini adventive

Murashige&Skoog (1962)

40 agar (5)ANA+(2,5)Kin+ 15%CM

Rao et al. (1982)

Germinare Randolph&Cox(1943) 20 lichid Aalders (1958) Cucumis sativus Lăstari Lazarte&Sasser (1982)L 0 agar - Lazarte&Sasser

(1982) Cucurbita pepo Plantule cu rădăcini Murashige&Skoog

(1962) 30

glucoză 9 (0,3)2,4-D Jelaska (1972)

Hildebrandt et al (1946)Tob

20 5 Zenkteler et al (1961)

White (1942) 20 5 Zenkteler et al (1961)

Zenkteler et al. (1961)D1.

20 5 (6)2,4-D+(0,1)ANA+15%CM Zenkteler et al (1961)

Zenkteler et al. (1961)D2.

20 5 (6)2,4-D+(0,1)ANA+15%CM Zenkteler et al (1961)

Daucus carota Dezvoltarea embrionilor

Zenkteler et al. (1961)D3.

10 glucoză

5 (0,2)Ad+15%CM Zenkteler et al (1961)

Germinarea embrionilor

Murashige & Skoog (1962)

5,6-5,8

30 7 Jarret et al. (1984) Ipomoes batatus

Lăstari Linsmaier&Skoog (1965) 5,7 16 agar (0,19-0,38)ANA Schultheis et al. (1986)

Dezvoltare embrioni Bonner & Axtman (1937) - 40 Agar Bonner & Axtman (1937)

Creşterea lăstarilor Bonner & Bonner (1938) - 40 10 Vitamina C Bonner & Bonner (1938) 2 rădăcini Murashige&Skoog (1962) 5,8 15 10 Jacobsen&Kysely(1984)

Pisum sativum

Dezvoltare embrioni Stafford & Davies (1979) 5,8 10 Lichid Stafford & Davies (1979)

Page 201: Microinmultirea plantelor

201

Tabelul 9.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 Agar (0,005) ANA + (1-2) Kin Anon (1981 b)

Dezvoltare plantule

Murashige&Skoog (1962)

30 Agar Gleddie et al (1982)

Calus White (1954) 20 Agar (1) ANA Yamada et al (1967) Calus şi

embriogeneză White (1954) 20 Agar Auxina Yamada et al (1967)

Solanum melongena

Plantule White (1954) 20 Agar Yamada et al (1967)

Tabelul 9.2. Cercetări privind cultura de embrioni imaturi la plantele pomicole

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză (g/l)

Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Amygdalus communis

Lăstari Hisajima (1982 a) 5,5 30 6 (0,56) BAP Hisajima (1982 b)

Armeniaca vulgaris Dezvoltare şi germinare

Tukey (1933)I 5,5 5 glucoză 6,5 Tukey (1938)

Lăstari axilari San Jose et al, (1984 L sau H)

30 6 (2-5) BAP San Jose et al, (1984)

Castanea sativa

Lăstari axilari Vieitez & Vieitez(1980a) 1 5,5 30 6 (1-2) BAP Vieitez & Vieitez(1980a)

Cerasus vulgaris Dezvoltare germinare

Tukey (1933)I 5,5 5 glucoză 6,5 Tukey (1938)

Germinare Van Overbeek et al (1941) 10 7 (0,2) AdS+33%CM Ozsan&Cameron (1963)

Plantule Dubey&Rishi (1976) 5,7 20 7 Dubey&Rishi (1976)

Citrus sp,

Plantule Murashige&Tucker (1969) 5,7 30 8 (1) GA3 Gmitter&Moore (1986)

Page 202: Microinmultirea plantelor

202

Tabelul 9.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Creştere embrioni Cutter&Wilson (1954) 5 20 agar Cutter&Wilson(1954) Calus Eeuwens (1976) Y3 6 45 8 (50)2,4-D+(2)Kin Kumar et al (1985)

Cocos nucifera

Creştere embrioni Murashige&Skoog(1962) 40 glucoză

8 (10)AIA Nurita-Toruan (1978)

Proliferare embrioizi 0,5xCheng (1975)Basal 5,5 30 8 +/-(0,11)BAP Pérez et al (1986) Corylus avellana Calus şi

embriogeneză Radojevic et al,(1975) 20 8-10 (1)2,4-

D+(1)Kin+(2)Ad Radojevic et al,(1975)

Ţesut embriogen Wang D, et al, (1984) 5,8 50 8 (5)2,4-D + (0,5)BAP Wang D, et al, (1984) Fragaria Regenerare plantule Wang D, et al, (1984) 5,8 50 8 (1)GA3 sau

[(0,5)BAP+ (0,1)ANAWang D, et al, (1984)

Juglans regia Lăstari Cassio&Minotta (1983)1,2&3

5,7 30 10 (0,2)ANA Cassio&Minotta (1983)

Malus x domestica

Proliferare embrioizi Murashige & Skoog (1962)

5,6-5,8 30 8 Eichholtz et al (1979)

Proliferare embrioni Litz et al (1984) 5,7 30 8 (1-2)BAP Litz et al, (1984b) Mangifera indica Germinare limitată Litz (1984a 5,7 60 0 Litz (1984b)

Germinare Brooks & Hough (1958) 20 6,8 Brooks & Hough (1958)

Persica vulgaris

Dezvoltare embrioni Monet (1968) 5,8 20 8 2-3 ml CM pe suprafata agarului

Monet (1968)

Phoenix dactylifera

Calus, embriogeneză Linsmaier&Skoog (1965) 5,7 30 8 (10-100)2,4-D+(3)2iP +(40)AdS

Tisserat et al (1979)

Maturare Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 Kononowikz & Janik (1984b)

Embriogeneză Murashige & Skoog (1962)

30 10 (1,5)ANA+10%CM Pence et al (1979;1980)

Dezvoltare embrioni şi germinare

Murashige & Skoog (1962)

30 0 (1,5)ANA+10%CM Pence et al (1979;1980)

Theobroma cacao

Germinare precoce Ben-Jaacov & Dax (1981) 5,7 30 0 Pasare la 10 zile Wang & Janich (1984)

Page 203: Microinmultirea plantelor

203

Tabelul 9.3. Cercetări privind cultura de embrioni imaturi la arborii şi arbuştii ornamentali

Denumirea speciei Rezultat Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Fraxinus

americana Dezvoltare embrioni

Bulard & Monin (1960) 5 30 glucoză 8 +/- (1)GA3 Bulard & Monin (1963)

Calus Linsmaier&Skoog(1965) 20 8 Arias et al (1982) Lăstar Tukey (1933) I 20 10 Ball (1956a,b)

Gingko biloba

Lăstar Ball (1959)A sau B 40 glucoză 10 30% CM Ball (1959) Hedera helix Calus Banks et al, (1979) 5,7 30 6 (2)ANA + (0,5)BAP Banks et al, (1979)

Ilex aquifolium Germinare şi creştere

Linsmaier & Skoog (1965)

5,6 40 10 Hu & Sussex (1972)

Magnolia grandiflora

Germinare Heller (1953;1955) 20 8 Le Page-Degivry (1970)

Magnolia soulangeana

Germinare Heller (1953;1955) 20 8 Le Page-Degivry (1970)

Calus şi embriogeneză

Von Arnold & Eriksson (1981) LPm

5,8 34,2 5 (2,2) 2,4-D + (1,1) BAP Hakman et al (1985)

Lăstari adventivi 0,5 x Schenk & Hildebrandt (1972)

15 5 (1) Kin + (1,1) BAP Von Arnold & Eriksson (1984)

Picea abies

Lăstari adventivi Von Arnold (1982) 17,1 (2,1) Kin Von Arnold (1982) Calus Murashige & Skoog

(1962) 5,8 30 8 [(0,01-2) ANA, 2,4-D

sau IBA] + (0,1-5) Z, BAP sau 2iP

Minocha (1980) Pinus strobus

Lăstari Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 8 (1-5) IBA + (0,1-1)Z Minocha (1980) Pseudiotsuga

menziesii Calus şi muguri Linsmaier & Skoog

(1965) 5,6 30 7 (1-2) ANA + (1) BAP Chalupa (1977)

Ouercus robur Lăstari Vieitez & Vieitez (1983) QL

30 6 (1) BAP Vieitez et al (1985)

Page 204: Microinmultirea plantelor

204

Capitolul 10

Producerea haploizilor

10.1. Generalităţi

În urma diviziunilor celulare care se încheie cu formarea gameţilor se obţin celule

haploide cu număr simplu de cromozomi (n).

Plecând de la aceste celule se pot regenera prin diferite metode plante haploide sau

prin diploidizare, plante homozigote care prezintă o importanţă practică deosebită pentru

activitatea de ameliorare.

In vivo, plantele haploide se pot obţine relativ uşor cunoscându-se peste 100 de

specii la care s-au obţinut haploizi pe cale spontană.

Cea mai comună metodă în acest sens este obţinerea de plante din seminţe cu doi

embrioni (duble). Acestea pot avea 2 embrioni n-n sau 2 embrioni 2n-n.

Avantajele folosirii haploizilor:

- prin dublarea cromozomilor se obţin rapid plante homozigote - procesul are mare

importanţă la speciile la care acestea nu pot fi obţinute in vivo (ex. plante dioice şi

autoincompatibile). Se reduce durata procesului de obţinere a liniilor homozigote care

presupune autopolenizări timp de 5-7 generaţii;

- obţinerea plantelor homozigote la speciile cu perioada juvenilă lungă este dificilă

şi îndelungată;

- producerea de hibrizi F1 este uşurată;

- la speciile poliploide prin obţinerea de haploizi se poate lucra mai uşor cu niveluri

de ploidie inferioare;

- mutantele recesive sunt rapid puse în evidenţă la plantele haploide;

- folosirea plantelor haploide permite obţinerea de plante mascule normale prin

dublarea garniturii cromozomale. Acestea sunt deosebit de utile pentru Asparagus

officinalis la care producţia este mai ridicată şi mai timpurie decât la cele femele;

X X x Y Y (super mascul)

↓ X Y

Page 205: Microinmultirea plantelor

205

- in vitro haploizii îşi dublează spontan garnitura cromozomală sau necesită

cantităţi mici de colchicină. Aceasta determină apariţia de probleme secundare atunci când

este folosită în mod normal in vivo;

- fuziunea protoplaştilor haploizi este mai indicată pentru că se realizează mai uşor

şi hibridul somatic va fi diploid, decât în cazul protoplaştilor diplozi care formează hibrizi

somatici tetraploizi.

Producerea haplozilor in vitro presupune două procese:

- cultivarea unor gameţi femeli (ovule) sau sinergide-ginogeneza;

- cultivarea unor gameţi masculi (grăuncior de polen) – androgeneza.

10.2. Androgeneza in vitro

Cel mai mult s-au studiat produsele de androgeneză in vitro cu rezultate pozitive la

speciile din fam. Solanaceae, Cruciferae, Gramineae şi Ranunculaceae.

Peste 247 de specii şi hibrizi de 88 de genuri şi 34 de familii au produs haploizi in

vitro (Maheshwari şi coalb. 1983).

Rezultate mai puţin promiţătoare s-au obţinut la arbori şi arbuşti.

Primele cercetări în urma cărora s-au obţinut haploizi din antere de Datura innoxia

au fost realizate de Guba şi Maheshwari (1964 şi 1966). În 1967 Borgin şi Nitsch au

obţinut acelaşi lucru din antere de Nicotiana.

Materialul iniţial pentru obţinerea haploizilor:

- anterele sunt cele mai folosite fiind cultivate pe mediu lichid sau solid.

Izolarea se face folosind antere provenite din mugurii închişi sau flori deschise.

- grăunciori de polen se folosesc mai puţin;

- inflorescenţe care cresc uşor pe mediu lichid (la specii de ierburi care au

flori de dimensiuni reduse).

- embriocultură - cultivarea unor embrioni rezultaţi din încrucişări

interspecifice sau intergenerice la care unul din genitori este eliminat. Ex. Hordeum

vulgare x H. bulbosum, acesta din urmă este eliminat, idem T. aestivum x H. bulbosum.

- pseudofecundare - Hess şi Wagner (1974) au polenizat Mimulus luteus cu

polen de Torenia fournieri in vitro. Gameţii femeli de Mimulus au generat plante haploide.

- ovule nefecundate - avantaj majoritatea plantelor regenerate sunt verzi, la

cereale la orz celulele sacului embrionar haploide, la grâu, orez şi porumb ovule. La

Page 206: Microinmultirea plantelor

206

gerbera prin cultură de capitul, s-au obţinut plante haploide clorofilo-deficitare, galbene

(Preil şi colab, 1977); ovule + placentă la Petunia axillaris (Keller 1986).

Producerea haploizilor din antere se poate realiza pe două căi:

- direct - embrionul haploid se formează direct din grăunciorul de polen;

- indirect - pentru început din grăunciorul de polen se obţine calus dar apoi se

formează un embrion sau un lăstar adventiv. Prezintă dezavantaje datorită existenţei în

masa calusului a unor celule diploide şi haploide.

Momentul izolării anterelor este esenţial: mulţi autori (Debergh 1978; Reinert şi

Bajaj, 1977a etc.) optează pentru momentul de dinaintea primei diviziuni a grăunciorilor de

polen.

Dunwell (1985) precizează că momentul optim este între diviziunea microsporilor

din tetradă şi prima mitoză.

La tutun se folosesc mugurii florali la care petalele sunt abia vizibile.

Prin cultura de antere se formează frecvent un număr mare de haploizi, himere şi

plante cu diferite niveluri de ploidie.

Factori care influenţează producerea haploizilor din antere:

- pretratamente la plantele mamă: temperatura scăzută, centrifugarea anterelor, incizia

vârfului inflorescenţelor, tăierea peretelui anterei;

- tipul de material iniţial: - plante sănătoase, viguroase;

- vârsta plantei, vârsta florii;

- poziţia explantului - la cereale se izolează flori din vârful spicului;

- compoziţia mediului, MS ori Nitsch, se modifică în fiecare de fază;

- pH-ul mediului recomandat este 5,8, conţinutul în zaharoză de 2-4%;

- prezenţa agarului nu este obligatorie. Se poate folosi un mediu lichid în care anterele

plutesc, sau un mediu cu dublu strat;

- cărbunele activ absoarbe metaboliţii din mediul de cultură şi are efect pozitiv.

Androgeneza in vitro se confruntă cu o serie de probleme:

- uneori creştere dificilă - avortarea embrionilor;

- se formează simultan diploizi sau tetraploizi; diviziunea celulară trebuie să se

realizeze în haploid şi nu în celule diploide adiacente;

- se formează frecvent plante albinotice care nu trăiesc;

- costuri ridicate, uneori se recurge la obţinerea de haploizi in vivo, care este mai

ieftină (Solanum tuberosum x S. phureja);

Page 207: Microinmultirea plantelor

207

- formarea calusului este nedorită;

- este greu să se izoleze haploizi dintr-un amestec în care există şi celule cu diferite

grade de ploidie, deoarece acestea cresc mai puternic.

- selecţia plantelor diploide este dificilă şi de lungă durată prin metoda citogenetică

şi presupune folosirea metodelor cu marcatori genetici.

- nu întotdeauna dublarea garniturii cromozonale are ca efect producţia de plante

homozigote, întrucât în descendenţă poate apărea segregarea.

10.3. Fecundarea in vitro

În anumite situaţii, realizarea hibridării sexuate este imposibilă datorită mai multor

factori cu influenţă negativă :

- polenul nu germinează pe stigmat;

- creşterea tubului polinic este parţială;

- fecundarea nu se produce;

- zigotul nu se dezvoltă;

- ovarul îmbătrâneşte prematur, etc.

După 1962 s-a pus problema rezolvării cazurilor de incompatibilitate prin realizarea

polenizării şi fecundării in vitro.

Tipuri de polenizare şi fecundare:

a) polenizarea stigmatului - se realizează castrarea (emascularea) florii provenite

de la genitorul matern, sterilizarea acesteia şi inocularea pe un mediu in vitro.

Polenul provenit de la antere mature este sterilizat şi el şi amplasat pe stigmat.

Metoda a fost folosită cu succes la Nicotiana rustica, N. tabacum, Petunia violacea,

Antirhinum majus, Pisum sativum, Lathyrus odoratus, Zea mays (Pierik,. 1979; Zenkteler,

1980) şi Glycine sp. (Silvoy şi alţii, 1984).

b) polenizarea placentei - după sterilizarea florii femele se extrage sub lupă

binocular placenta cu ovulele proprii şi se inoculează pe un mediu nutritiv. În acelaşi timp,

anterele ajunse aproape de maturitate, se sterilizează şi se deschid sub hotă, depunând apoi

grăunciorii de polen pe ovule. Grăunciorii de polen germinează, străpung sacul embrionar

şi se realizează fecundarea.

Rezultate bune s-au obţinut la specii din familia Caryophyllaceae, Gossypium

precum şi la Zea mays.

Page 208: Microinmultirea plantelor

208

c) polenizarea ovulelor izolate - după izolarea ovulelor fără placentă se face

polenizarea ca în metodele precedente, şi are loc fecundarea.

Metoda este mai puţin folosită deoarece embrionul se dezvoltă greu în acest caz.

Totuşi polenizarea in vitro se poate folosi:

- în cazuri de incompatibilitate in vivo ex. Petunia axilaris (Rangaswarny şi

Shivanna, 1967) şi hibrizii de Petunia (Numi, 1970).

- în cazuri de incompatibilitate la realizarea polenizării încrucişate interspecifice

sau intergenerice. Ex. :

- Nicotiana alata x Nicotiana tabacum;

- la genuri din Familia Caryophyllaceae – se foloseşte metoda polenizării

placentei;

- producerea de haploizi prin partenogeneză. Hess şi Wagner (1974) au obţinut un

haploid de Mimulus luteus prin polenizarea cu polen de Torenia fournieri.

- când are loc căderea prematură a florii sau ovulului se poate recurge la

polenizarea stigmatului in vitro

- realizarea studiilor de fiziologia fecundării şi a studiilor fenomenului de

incompatibilitate.

Pentru reuşita fecundării in vitro trebuie îndeplinite mai multe condiţii:

- gameţii să fie în faza optimă de dezvoltare pentru realizarea fecundării;

- mediul de cultură să asigure condiţii optime pentru fecundare, creşterea

embrionului şi obţinerea de noi plante. Se folosesc de regulă soluţii foarte complexe;

- operaţiile de stabilizare a materialului vegetal trebuie să fie executate rapid

pentru a nu determina spălarea lichidului de pe stigmat sau crăparea anterelor;

- când se recurge la metoda polenizării stigmatelor nu se înlătură sepalele,

deoarece acestea stimulează creşterea şi dezvoltarea ovarului.

- temperatura influenţează direct procesul de fecundare. Speciile din genul

Narcissus necesită temperaturi mai scăzute, inferioare temperaturii de 25°C (Balatkova şi

colab. 1977), în timp ce Papaver somniferum are nevoie de temperaturi ridicate.

Tabelele 10.1., 10.2., 10.3. şi 10.4. prezintă rezultatele unor lucrări de cercetare

privind androgeneza şi ginogeneza in vitro la plantele horticole.

Page 209: Microinmultirea plantelor

209

Tabelul 10.1. Cercetări privind androgeneza şi ginogeneza la plantele legumicole

Denumirea speciei Explant iniţial Rezultat Mediu pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l)

Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Primordii

florale Lăstari multipli Dunstan&Short

(1977a)BDS 5.5 30 8 (1) BAP Dunstan&Short

(1979a) Flori fertilizate Cultura de

ovare/fruct Nitsch (1951)1 5.8 50 7 (0.5)AIA+(0.5-1) Kin

+(4)GA3 Guha&Johri (1966)

Allium cepa

Ovule fertilizate

Răsad Johri&Guha (1963) - 50 7 (1)AIA+(0.5) Kin+(4)GA3

Johri&Guha (1963)

Antere Calus Pelletier et al. (1972) Tosauri

- 20 5 (0,1) ANA +(0,5) 2,4-D +(0,5) BAP

Doré (1974) Asparagus officinalis

Antere Calus Pelletier et al. (1972) Tosauri

- 20 5 (0,1) ANA +(1) 2,4-D +(0,2) BAP

Pelletier et al (1972 b)

Brassica alba Antere Calus Leelavahti et al (1984)

5.6 20 agar (2) 2,4-D Leelavahti et al (1984)

Antere uninucleate

Calus Bagga et al (1982) 1 5.5 20 8 (0.22)2,4-D + (0.22) Kin

Bagga et al (1982)

Antere uninucleate

42% calus 8% embrioizi

Gamborg et al. (1968) B5

5.5 20 8 (0.5)BAP Bagga et al (1982)

Fragmente petale

Lăstari Linsmaier & Skoog (1965)

- 30 lichid (8) AIA + (2,56) Kin Crisp & Walkey (1974)

Fragmente pedunculi

florali

Lăstari Margara (1969a,b) C - 45 8 (2.3) BAP Margara (1969 a,b)

Brassica oleracea botrytis

Fragm. pedunc. florali

Lăstari Margara (1977; 1978) N 30 NH4

- 30 8 (1) IBA + (0,93) ANA Margara (1978)

Brassica oleracea gemmifera

Antere Embriogeneză Keller et al (1975) - 100 8 (0.1) 2,4-D + (0,1) ANA

Ockendon (1984, 1985)

Page 210: Microinmultirea plantelor

210

Tabelul 10.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Antere Embriogeneză Dumas De Vaulx et al (1981) R

5.9 30 8 (0.1) Kin Dumas De Vaulx et al (1981)

Antere Plante haploide George & Narayanaswamy

(1973)

5.8 20 8 (0.5)AIA George & Narayanaswamy

(1973) Antere (48h, 4°C) Embrioizi Sibi et al (1979) Cm 5.9 30 8 (2) 2,4 – D + (2) Kin Sibi et al (1979)

Capsicum annuum

Antere Embrioizi şi plantule

Sibi et al (1979) Cm 5.9 30 8 (0.1) Kin Sibi et al (1979)

Antere Calus Murashige & Skoog (1962) BA, AIA, ANA, 2,4-D Smets (1983) Cichorium

intybus Seminţe, muguri

florali, flori, fragm. foliare

(0,1-1cm2)

Calus, muguri, lăstari, rădăcini

Murashige & Skoog (1962) BA, AIA Dabin (1985)

Cucumis sativus antere calus Lazarte&Sasser (1982)L

0 agar - Lazarte&Sasser (1982)

Lactuca sativa polen 40% germinare Eenik (1983) 40 lichid - Eenik (1983) Polen/antere torpedo Bourgin & Nitsch

(1967)H 5.5 20 lichid (0.1)ANA+(0.1)BAP Debergh&Nitsch

(1973) Antere Calus haploid Gresshoff&Doy

(1972a,b)DBM1 5.8-6.4

20 8 (2)ANA+(1.5 )Kin Gresshoff&Doy (1972b)

Antere Calus Gresshoff&Doy (1972a,b)DBM2

5.8 20 8 (2)ANA+(1)Kin Gulshan&Sharma (1981)

Ovare 8-10 zile Seminţe viabile Uralets (1980) 1 5.8 20 agar Uralets (1980)

Lycopersicon esculentum

Antere Calus Murashige & Skoog (1962)

5.8 20 8 (0.5) AIA + (0.25) Z Zamir et all (1980; 1981)

Phaseolus vulgaris

Antere Calus haploid şi diploid

Veliky & Martin (1970) 67-V

20 8 (1) 2,4-D Peters et al (1977)

Page 211: Microinmultirea plantelor

211

Tabelul 10.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Muguri florali Calus şi embriogeneză

Konar et al (1972 a) - 0 7 (1) AIA + 10% CM Konar et al (1972 a)

Raphanus sativus

Sepale, petale, antere

Calus şi embriogeneză

Ranga Swamy (1962) I

5.8 20 7 (1) 2,4 –D + 10 % CM

Nataraja & Konar (1970)

Antere Calus şi embriogeneză

Murashige & Skoog (1962)

5.8 30 agar (0.25 - 2) 2,4-D + (0.25-1)Kin + (0.2)

Rac

Anon (1981 b) Solanum melongena

Antere Calus şi embriogeneză

Pelletier et al (1972) Tosauri

5.8 20 7.5 (0.1) ANA + (0.2) BAP

Isouard et al (1979)

Antere Embrioizi Bourgin & Nitsch (1967) H

5.5 20 8 (0.22) Kin Kohlenbach & Geier (1972)

Antere Calus Murashige & Skoog (1962)

5.8 30 agar (1.9) ANA + (0.39) Kin

Sopory & Tan (1979)

Antere Calus Murashige & Skoog (1962)

5.8 30 agar (1.86) ANA + (0.23) BAP

Sopory & Tan (1979)

Antere Embrioizi Bourgin & Nitsch (1967) H

5.8 20 8 (0.23) BAP + (1.86) ANA

Sopory (1977a )

Antere Embriogeneză directă

Murashige & Skoog (1962)

5.8 60 agar (1.1)AIA + (0.9) BAP Sopory et al (1978)&

Solanum tuberosum

Polen Embrioizi globulari

Murashige & Skoog (1962)

5.8 30 lichid (1.4) 2,4-D + (0.4) Kin

Sopory (1977)

Page 212: Microinmultirea plantelor

212

Tabelul 10.2. Cercetări privind androgeneza şi ginogeneza la plantele pomicole

Denumirea speciei Explant Rezultat Mediu pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l)

Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Armeniaca

vulgaris Antere Calus Murashige & Skoog

(19620 30 agar (2)ANA+(2)Kin Harn & Kim

(1972) Cerasus avium Antere Calus Seirlis et al, (1979)A 30 9 (0,5)2,4-D+(0,5-

1)BAP Seirlis et al, (1979)

Antere Calus Murashige & Tucker (1969)

50 agar (3)2,4-D+(1)Kin Murashige&Tucker

(1969) Ovule

nedezvoltate Formarea şi

creşterea embrionilor

Murashige & Tucker (1969)

5,7 30 8 (0,01)2,4-D+(0,1)daminozide

Gmitter & Moore (1986)

Kochba et al, (1972) 5,7 30 8 Gmitter & Moore (1986)

Citrus sp,

Inflorescenţe Rizogeneză Eeuwens&Blake(1977) 5,5-5,8 68,5 3,9 (0,022)2,4-D+(1,13)BAP Eeuwens (1978) Cocos nucifera Antere Torpedo Thanh-Tuyen&De

Gz,(1983)1 5,8 60 7 (2)ANA+/-(0,25)2,4-

D+15%CM Thanh-Tuyen&De

Gz,(1983)1 Juglans regia Polen 80%

germinaţie Luza & Polito (1985) 20 6,5 Luza & Polito

(1985) Muguri florali Lăstari Krikorian & Cronauer

(1984) 5,8 41 0 (4,95)BAP+10%CM Cronauer &

Krikorian (1985a) Musa acuminata

Muguri florali Lăstari Heinz & Mee (1969) 5,8 40 0 (5)Bap + 10% CM Cronauer & Krikorian (1985b)

Page 213: Microinmultirea plantelor

213

Tabelul 10.3. Cercetări privind cultura embriogeneza somatică la arborii şi arbuştii ornamentali

Denumirea speciei Explant Rezultat Mediu pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere(mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Antere Calus Ranga Swamy (1961)I 5,8 20 7 (1)AIA + 10%CM Nataraja (1971) Clematis gourianaAntere Embriogeneză Nitsch & Nitsch (1969) 5,8 20 lichid Johansson et al

(1982) Polen Calus Lamport (1964) 20 7,5 (0,6-6)2,4-D +10-

40%CM Lamport (1964)

Polen Calus Tulecke (1960) A 6 20 10 (0,1)ANA + 20% CM Tulecke (1960)

Ginkgo biloba

Gametofit Calus haploid White (1943a) A 20 agar (6)2,4-D + 18%CM Tulecke (1964) Larix decidua Gametofit Calus Nagmani & Bonga

(1985) 5,8 20 8 (2)BAP Nagmani & Bonga

(1985) Paulownia tomentosa

Ovule Plantule via calus

Radojevic et al, (1975) 20 7 (1)2,4-D + (1)Kin + (2)Ad

Radojevic (1979)

Megagametofit Calus haploid & lăstari adventivi

Huhtinen (1976) 30 (1-10) 2,4-D + (0,1-1) Kin

Huhtinen (1976) Picea abies

Megagametofit Calus Simola & Honkanen (1983)

5,6 20 6 (2) 2-4-D +(0,5) Kin Simola & Honkanen (1983)

Pinus mugo Polen Germinare polen Nygaard (1970) B, Nf sau C

5,2 3,4 lichid Nygaard (1970)

Pinus mugo mughus

Megagametofit Calus haploid Brown & Lawrence (1968)

5,6-5,8

20 8 (5) 2,4-D Bonga (1974)

Pinus nigra austriaca

Megagametofit Calus haploid Brown & Lawrence (1968)

5,6-5,8

20 8 (5) 2,4-D Bonga (1974)

Embrioni zigotici

Dezvoltare embrioni

Mapes & Zaerr (1981) 5,8 30 agar Mapes & Zaerr (1981)

Pseudotsuga menziesii

Polen Germinare polen Muren et al (1979) 5,2 lichid Muren et al (1979) Rosa hybrida Antere Calus haploid Murashige & Skoog

(1962) 5,8 30 agar (7,5) AIA +(0,8) Kin Tabaeezadeh &

Khosh –K, (1981)

Page 214: Microinmultirea plantelor

214

Tabelul 10.4.

Cercetări privind androgeneza şi ginogeneza la viţa de vie

Denumirea speciei Explant iniţial Rezultat Mediu pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l)

Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Vitis thunbergii Antere Lăstari Nitsch (1971)1 5.5 20 8 (1.86) ANA+(0.225)

BAP Hirabayashi et al

(19760 Vitis vinifera Antere Calus Gresshoff & Doy

(1974)1 5.8 20 8 (2) ANA+(2) AIA+(1.5)

Kin

Vitis vinifera Lăstari Dezvoltare Favre & Grenan (1979)S

20 glucoză

agar Favre & Grenan (1979)

Vitis vinifera Ovule Calus Mullins & Srinivasan (1976) HDVM

5.6 20 0 (2.8)CPA + 10-15% CM

Mullins & Srinivasan (1976)

Vitis vinifera Ovule Calus Mullins&Srinivasan(1976)N

5.6 20 0 (1.1) BAP Mullins & Srinivasan (1976)

Vitis vinifera x Vitis rupestris

Antere Calus Bourgin & Nitsch (18670 H

20 0 (1.11) 2,4-D + (0.225) BAP

Rajakeran & Mullins (1979)

Page 215: Microinmultirea plantelor

215

Capitolul 11

Cultura de calus in vitro

11.1. Cultura de calus

Calusul reprezintă o aglomerare de celule mai mult sau mai puţin diferenţiate care au o

capacitate diferită de multiplicare.

Formarea calusului are loc pe diferite tipuri de explante cultivate in vitro pe zonele

rănite, sub influenţa unor substanţe specifice.

Cultura calusului presupune trei etape:

- inducerea formării calusului;

- înmulţirea calusului;

- regenerarea de organe adventive de calus.

Inducerea calusului

Pentru iniţierea unei culturi de calus pot fi folosite diferite tipuri de organe: rădăcini,

tulpini, frunze, flori şi ţesuturi. Când este nevoie de material juvenil, de regulă se apelează la

cotiledoane, embrioni imaturi, puieţi etc.

Stimularea formării calusului pe explantele iniţiale se face prin folosirea unor hormoni

specifici. Pentru monocotiledonate sunt recomandate auxinele. Unele specii necesită

citochinine în timp ce altele au nevoie atât de citochinine cât şi de auxine.

La început, la explantele de morcov se folosea 2,4 D şi lapte de cocos pentru obţinerea

calusului. Ulterior s-a demonstrat că laptele de cocos are un conţinut ridicat de citochinine

care stimulează procesul de calogeneză.

Alţi factori care intervin în formarea calusului sunt: genotipul, compoziţia mediului de

cultură, pH-ul, factorii fizici de creştere.

Pe lângă mediul de cultură MS, în reţeta de bază se mai foloseşte zaharoza în

concentraţie de 2-4% şi alte substanţe auxiliare cum ar fi: caseina hidrolizată, extractul de

malţ, de drojdie, laptele de cocos.

pH-ul ridicat (7) a stimulat formarea şi creşterea producţiei de calus la actinidia

(Stănică şi colab., 1995).

Page 216: Microinmultirea plantelor

216

a) b) Foto 11.1. Formare calusului la kiwi (Actinidia deliciosa) din peţiol (a) şi lim foliar (b)

Temperatura ridicată (22-28°C) stimulează procesul de calogeneză în timp ce lumina

are efect diferit.

Sub influenţa factorilor amintiţi, celulele ţesuturilor diferenţiate suferă un proces de

dediferenţiere. În timpul acestuia celulele parenchimatice se convertesc în celule juvenile cu

capacitate mare de diviziune.

Ţesuturile meristematice nu au nevoie de procese de dediferenţiere, ele fiind capabile

de diviziune rapidă şi formare de calus. În masa de calus pot să coexiste celule cu grade

diferite de diferenţiere.

Cultura de calus

După obţinerea calusului, acesta este cultivat pe un alt mediu, de regulă solid în prima

fază de cultură şi lichid după aceea.

Compoziţia mediilor este similară cu cea din faza de inducţie cu excepţia concentraţiei

auxinelor şi citochininelor care este mai redusă. Dacă creşterea calusului este mai redusă

atunci se recomandă şi păstrarea unei porţiuni din explantul iniţial în timpul primei subculturi.

Calusul format are culori, grade de compactare şi consistenţă (duritate) diferite în

funcţie de specie, tipul de explant din care provine şi condiţiile de cultură (Stănică, 1995,

1998). La kiwi, calusul cel mai consistent a fost produs de către limbul foliar, indiferent de

mediul de cultură folosit. De asemenea, pH-ul 7, a avut ca efect producerea unui calus mai

dens şi de culoare verde intensă, faţă de cel obţinut pe un mediu cu pH- ul de 5.5.

Trebuie remarcat calusul cu aspect sticlos deosebit de consistent, de culoare verde, cu

infiltraţii roz care a avut şi o mare capacitate organogenetică. Odată cu scăderea consistenţei,

culoarea calusului trece de la verde închis strălucitor la verde deschis, verde albicios, brun şi

alb gălbui.

Page 217: Microinmultirea plantelor

217

În acelaşi timp, culoarea şi duritatea calusului, numărul de subculturi şi pH-ul

mediului de cultură, s-a dovedit că influenţează radical viteza acestuia de creştere şi

capacitatea organogenetică (Stănică F. şi Armeanu I. 2004).

S-a observat de asemenea, o corelaţie inversă între cantitatea de calus produs şi

procentul de organogeneză indirectă, respectiv între cantitatea de calus produs şi numărul de

lăstari formaţi din calus. După o subcultură cu o creştere importantă a calusului, urmează o

subcultură cu formarea unui număr mare de lăstari pe calusul respectiv.

În funcţie de specie, provenienţă şi compoziţia mediului de cultură, calusul va

continua să crească sau va începe să diferenţieze centri meristematici din care se vor forma

apoi diferite organe prin organogeneză indirectă (foto 11.2.).

Foto 11.2. Calus cu capacitatea organogenetică ridicată obţinut din frunză de cicoare

În trecut, se practica cultura calusului pe mediu solid, însă viteza de creştere a acestuia

era mai redusă deoarece: suprafaţa de contact cu mediul era mai redusă, fapt care influenţa

negativ absorbţia substanţelor nutritive; cantitatea de oxigen era limitată; o serie de factori

prezenţi în mediul solid stimulau diferenţierea şi regenerarea unor organe şi reduceau

creşterea calusului.

Cultura calusului pe mediul lichid se realizează pe agitatoare în vase Erlenmeyer. În

această situaţie, se folosesc agitatoare rotative cu o frecvenţă de rotire de 80-100 rotaţii/minut.

Cantitatea de mediu trebuie să reprezinte 20-30% din volumul vasului.

În funcţie de specie calusul rămâne agregat (Anthurium andreanum) sau se separă în

celule formând o suspensie celulară (la morcov).

Tabelele 11.1., 11.2., 11.3., şi 11.4. prezintă câteva rezultate ale lucrărilor de cercetare

privind cultura de calus la speciile horticole.

Page 218: Microinmultirea plantelor

218

Tabelul 11.1.

Cercetări privind cultura de calus la plantele legumicole

Denumirea speciei Explant iniţial Mediu pH Zaharoză (g/l)

Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Ţesut medular Dunstan&Short (1977a)

BDS 5,5 30 8 (0,28)2,4-D Dunstan&Short

(1977a) Radicele Dunstan&Short 1977a

BDS 5,5 30 8 (0,138) 2,4-

D+(0,05)ANA Dunstan&Short

(1977b) Fragmente rădăcini Mullin (1970) 5,5-6,0 20 6 (6)2,4-D+15%CM Mullin 1970

Allium cepa

Radicele Mullin 1970 5,5-6,0 40 6 (0,6)2,4-D+15%CM Mullin 1970 Peţiol Murashige&Skoog(1962) - 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Al-Abta & Collin (1978) Calus Murashige&Skoog(1962) - 30 agar (5)2,4-D Al-Abta & Collin (1978)

Peţiol tânăr sau frunze

Murashige&Skoog(1962) - 30 9 (0,5)2,4-D+(0,6)Kin Browers&Orton (1982)

Peţiol 3-5cm Murashige&Skoog(1962) 5,6 30 10 (1)ANA+(0,1)Kin Chen (1976)

Apium graveolens

Fragmente de frunză

Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 agar (0,5)2,4-D+(0,6) Kin Zee&Wu (1980)

Internod Linsmaier&Skoog(1965) - 30 6 Hunault (1976) Calus Reuther (1984) 5,8 30 agar (1) AIA + [(0,1) BAP

sau (0,5) 2iP] Reuther (1984)

Ţesut medular White (1943 a)A - 30 agar (5) ANA + 10% CM Steward & Mapes (1971 b)

Calus Murashige & Skoog (1962)

- 30 lichid (5) 2,4 -D +10% CM Steward & Mapes (1971 b)

Asparagus officinalis

Fragmente de hipocotil

Linsmaier & Skoog (1965)

5,8 30 8 (1) 2,4-D + (0,315) Kin Wilmar & Hellendoorn (1968)

Page 219: Microinmultirea plantelor

219

Tabelul 11.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Fragmente de frunze

Bagga et al. (1982) 1 5,5 20 8 (0,22)2,4-D +(0,22) Kin Bagga et al (1982)

Ţesut medular Gamborg et al. (1968) B5

5,5 20 8 (2) ANA + (0,5)BAP Bagga et al (1982)

Hipocotil Murashige&Skoog (1962)

5,8 30 8 (1,1)2,4-D+(0,11) Kin +10% CM

Dietert et al (1982)

Brassica oleracea botrytis

Calus Murashige&Skoog (1962)

5,8 30 8 (8) IBA + (0,04) Kin +15% CM

Dietert et al (1982)

Brassica oleracea capitata

Minicalus Lillo & Shahin (1986) 5,6 30 7 (1) 2,4-D + (0,5) BAP + (0,1) ANA + (40) AdS

Lillo & Shahin (1986)

Brassica oleracea gemmifera

Fragmente de peţiol

Clare & Collin (1973) 5,7 30 7 (1) IBA + (2) AIA + (0,05) Kin

Clare & Collin (1974)

Cichorium intybus Fragm. foliare obţinute in vitro

Murashige & Skoog (1962) ANA, BA Saksi şi co. (1986)

Fragmente de frunză sau cotiledon

Bourgin&Nitsch (1967)H

5,7 40 glucoză 8 - Blachmon & Reymonds (1982)

Cucumis melo

Cotiledon Heinz&Mee(1969) 5,7 30 8 (6)Kin+(1,5)AIA Moreno et al.(1984) Internod Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (0,19)ANA+(0,023)BAP Aziz&McCown(1985)

Calus Murashige&Skoog (1962) 5,8 30 agar (6,75)BAP Aziz&McCown(1985) Calus Lazarte&Sasser

(1982)MS 20 8 (0,1)IBA+(1)BAP+

(0,1)GA3 + (162)PG Lazarte&Sasser

(1982) Fragmente de hipocotil

sau cotiledon Murashige&Skoog

(1962) 30 agar (0,37)ANA+(0,23)BAP Sekioka&Tanaka

(1981)

Cucumis sativus

Cotiledon sau hipocotil

Murashige&Skoog (1962)

5,8 30 agar (1)ANA+(1)BAP Wehner&Locy (1981)

Page 220: Microinmultirea plantelor

220

Tabelul 11.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Fragmente rădăcini

Abou-Mandour (1977a) 5,6 30 10 (2)AIA+(6)2,4-D+ (0,3)Kin+(4)AdS

Abou-Mandour (1977a)

Calus Gamborg et al.(1968) 20 lichid (1,1)2,4-D+(0,1)Kin Baldwin&Gresshoff (1978)

Cambiu-rădăcină Butcher&Ingram (1976)C

5,5 20 7 (0,15)2,4-D+(0,15)Kin Butcher&Ingram (1976)

Fragmente rădăcină

Caplin&Steward(1948) 5,6 20 8 (0,1)ANA+15%CM Caplin&Steward(1948)

Fragmente rădăcină

Murashige & Skoog (1962)

5,7-5,8 30 8 (10) 2,4-D+[(2)BAP sau 10%CM]

Dodds&Roberts (1982)

Peţiol Halperin (1966)A 5,6 20 agar (0,1-1)2,4-D Halperin (1964)

Daucus carota

Rădăcini Lamport 1964 20 lichid (0,6-6)2,4-D+10-40%CM Lamport (1964) Fragmente rădăcină

Murashige & Skoog (1962)

5,7-5,8 30 8 (10) 2,4-D+[(2)BAP sau 10%CM]

Dodds& Roberts(1982)

Fragmente rădăcină

Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (0,25) 2,4-D Handley&Locy (1984)

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,8 30 8 (0,5) 2,4-D+(3)Kin Handley&Locy (1984)

Fragmente tuberculi

Henderson et al.(1984)1. 20 8 (3)2,4-D Henderson et al.(1984)

Ipomoea batatas

Calus Henderson et al.(1984)2. 20 8 (1)2,4D+(1)ANA+(0,25)2iP+ (2)ABA

Henderson et al.(1984)

Cotiledon sau frunze cotiledonare

Murashige&Skoog (1962)

5,8 30 8 (0,05)ANA+(0,5)BAP Brown et al (1986)

Peţiol Vasil&Hildebrand (1966c) C

5,7-5,9 20 6 (0,1)ANA+15%CM Fukami&Hildebrandt(1967)

Calus Fukamil&Hildebrand (1966c) THS

5,7-5,9 0 6 (0,1)ANA+15%CM Fukami&Hildebrandt (1967)

Lactuca sativa

Fragmente de frunză

Miller (1961a,1963) 5,8 30 10 (5)AIA+(0,5)Kin Koevary et al (1978)

Page 221: Microinmultirea plantelor

221

Tabelul 11.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Fragmente de frunză

Vasil&Hildebrand (1966c)C

5,7-5,9 20 6 (6)2,4-D+ (0,1)ANA+15%CM

Vasil & Hildebrandt (1966c)

Lactuca sativa

Calus Vasil&Hildebrand (1966c)C

5,7-5,9 20 6 (0,1)ANA+15%CM Vasil & Hildebrandt (1966c)

Frunze Murashige&Skoog (1962)

30 8 (0,5)2,4-D+(1)BAP Behki&Lesley (1980)

Ţesut medular Murashige&Skoog (1962)

5,8 3 6 (2)Z Cassells (1979)

Calus Murashige&Skoog (1962)

5,8 3 6 (2)Z Cassells (1979)

Calus Gresshoff&Doy (1972a,b)DBM3

5,8-6,4 20 8 (5)ANA+(0,01 )Kin Gresshoff&Doy (1972b)

Hipocotil Murashige&Skoog (1962)

5,8 30 agar (2)BAP Gunay&Rao (1980)

Fragmente frunze Linsmaier&Skoog (1965)

30 agar (0,4)AIA+(4)Kin Herman&Haas(1978)

Fragmente frunze Kartha et al. (1974a) 5,8 30 8 [(1,1-2,3)BAP+/-(0,02-1,8)AIA] sau [(0,22-

1,1)+/-(0,18-1,8)AIA]

Kartha et al. (1976)

Lycopersicon esculentum

Fragmente de frunze

Pence & Caruso (1984) - 30 8 [(2,5) IA, Ala/ (2-3) IA, Gly] + (0,2) BAP

Pence & Caruso (1984)

Pastinaca sativa Fragmente de frunze

Abou-Mandour (1977a) 5,6 30 10 (2) AIA + (6) 2,4-D +(0,3) Kin + (4)AdS

Abou-Mandour (1977a)

Petroselinum hortense

Peţiol Vasil & Hildebrandt (1966c)C

5,7-5,9 20 6 (6) 2,4-D +(0,1) ANA + 15% CM

Vasil & Hildebrandt (1966 b,c)

Fragmente de frunza/ rădăcini

Abou-Mandour (1977a) 5,6 30 10 (2) AIA + (6) 2,4-D +(0,3) Kin + (4)AdS

Abou-Mandour (1977a)

Phaseolus vulgaris

Fragmente de frunze

Veliky & Martin (1970) 67-V

4,5 20 10 (1) AIA + (10) Kin Crocomo et al (1976)

Pisum sativum Fragmente de frunze

Murashige&Skoog (1962)

5,8 30 10 (0,06) pic + (1) Kin Jacobsen & Kysely (1984)

Page 222: Microinmultirea plantelor

222

Tabelul 11.1. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Solanum melongena

Fragmente hipocotil

Matsuoka& Hinata (1979)

5,5 20 8 (0,8)ANA + (0,225) BAP + (10) AdS

Matsuoka& Hinata (1979)

Fragmente lăstari Murashige&Skoog (1962)

5,8 30 7 (5)ANA Austin & Cassells (1983)

Calus Austin & Cassells (1983)4

5,7 10 10 (0,2)ANA + (0,1) AIA + (0,5) BAP + (0,1) Kin +

(0,2) GA3

Austin & Cassells (1983)

Fragmente tuberculi

Engvild (1973) MSN 5,8 30 agar (8) ANA + (0,5) Kin Bragdo – Aas (1977)

Fragmente tuberculi

Gamborg (1966) PRL – 4 – C

5,8 20 agar (2) 2,4 -D Gamborg (1966)

Solanum tuberosum

Fragmente frunze Ratnamba & Chopra (1974)

5,8 20 7 (3) 2,4-D + (0,3)Kin + (0,4) GA3 + (40 ) AdS

Gavinlertvatana & Li (1980)

Calus din peţiol Vasil& Hildebrandt (1966 c)C

5,7-5,9 20 6 (0,1) ANA + 15% CM Fukami & Hildebrandt (1967)

Spinacia oleracea

Calus Fukami & Hildebrandt (1967) THS

5,7-5,9 0 6 (0,05) Kin + 15% CM Fukami & Hildebrandt (1967)

Page 223: Microinmultirea plantelor

223

Tabelul 11.2. Cercetări privind cultura de calus la plantele pomicole

Denumirea speciei Explant iniţial Mediul de cultură pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Amygdalus communis

Fragmente lăstari

Wu & Kuniyuki (1985) CS

5 0 8 (0,1)ANA +(0,45) BAP Wu & Kuniyuki (1985)

Fragmente lăstari

Murashige&Skoog (1962)

30 0 (20)Ad sau (30)adenosine

Mapes (1973)

Lăstari Murashige & Skoog (1962)

30 0 (agar)

(5,4)ANA+ (5,2)AIA +(2,1)Kin

Matheus & Rangan (1981)

Ananas comosus

Calus Matheus & Rangan (1981)

30 0 (agar)

(10)ANA+ 15%CM Matheus & Rangan (1981)

internod Murashige&Skoog(1962) 5,3 30 0 (10)IBA+(1)ABA Feucht&Dausend(1976) Cerasus avium Fragmente

frunze Pierik et al (1974) 20 0 (1)ANA+(1)BAP Hedtrich (1977)

internod Murashige & Skoog (1962)

5,6-5,8 30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976) Cerasus mahaleb

Fragmente frunze

Pierik et al (1974) 20 0 (4)ANA+(1)BAP Hedtrich (1977)

Cerasus vulgaris Internod Murashige & Skoog (1962)

5,6-5,8 30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976)

Cocos nucifera Ţesut medular Eeuwens(1976) Y3 5,5 45 agar (0,022)ANA+(0,05)Kin +(0,22)GA3

Eeuwens (1976)

Hipocotil din embrioni imaturi

Yokoyama&Takeuchi (1976)

5,6-5,8 30 7 (3)ANA+(0,1)Kin Yokoyama&Takeuchi (1976)

Diospyrus kaki

Ţesut medular Fujii & Nito (1972) 20 agar (5)Ad Fujii & Nito (1972)

Page 224: Microinmultirea plantelor

224

Tabelul 11.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,6-5,8

0 5,5 (2)ANA+(0,2)Kin Chong & Taper (1974)

Internod Murashige & Skoog (1962)

5,6-5,8

0 5,5 (0,25)2,4-d+(0,2)Kin Coffin et al (1976)

Fragmente frunze tinere

Hurwitz & Agrios (1984)CS

5,7 30 8 (1)2,4-D+(2)ANA +(0,2)Kin

Hurwitz & Agrios (1984)

Frunze cotiledonare

Schenk & Hildebrandt(1972)

5,8 30 8 (0,5)2,4-D+(2)CPA +(0,1)Kin

Liu et al (1983a)

Malus x domestica

Diferite surse White (1943a)A 20 agar (4)ANA+(2)Kin +(1)GA3 + 15% CM

Mehra & Sachdeva (1979)

Mangifera indica Seminţe imature Litz et al (1984) 5,7 30 8 (2)2,4-D Litz et al, (1984b) Musa cavendishii Calus Murashige & Skoog

(1962) 30 0 (5)IBA Ma et al (1978)

Musa spp, Fragmente frunze

Linsmaier & Skoog (1965)

5,6 30 3 (20)Dicamba Jarret et al (1985b)

Olea europaea Calus Lavee (1963)21-MW 6,6 20 10 (2)AIA+suc de piersici Lavee (1963) Mezocarp Bradley & Dahmen

(1972) 6,5 20 8 Bradley&Dahmen

(1972) Persica vulgaris

Internod Murashige & Skoog (1962)

5,6-5,8

30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976)

Phoenix dactylifera

Calus Linsmaier&Skoog (1965)

5,7 30 8 (3)2iP +(40)AdS Tisserat et al (1979)

Prunus domestica Internod Murashige & Skoog (1962)

5,6-5,8

30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976)

Internod Murashige & Skoog (1962)

5,6-5,8

30 5,5 (0,25)2,4-D+(0,2)Kin Coffin et al (1976) Pyrus communis

Seminţe Schenk & Hildebrandt (1972)

5,9 30 6 (0,5)2,4-D+(2)CPA +(0,1)Kin

Schenk & Hildebrandt (1972)

Phoenix dactylifera

Ţesut medular Eeuwens (1976)Y3 5,5 45 agar (0,022)2,4-D+(0,05)Kin +(0,22)GA3

Eeuwens (1976)

Ribes nigrum Ţesut medular Harvey (1967)Basal 6 30 10 (0,15)2,4-D+(1)Kin Harvey&Grasham (1977)

Page 225: Microinmultirea plantelor

225

Tabelul 11.2. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Pericarp Dublin (1984) 30 agar (0,5-1)2,4-D+[(1)BAP sau Z]

Dublin (1984)

Hipocotil Hall & Collin (1975) 5,7 30 10 (2)AIA+(2)IBA+(0,1)Kin +10%CM

Hall & Collin (1975)

Hipocotil Jalal & Collin (1979) 5,7 30 10 (1)IBA+(0,05)Z Jalal & Collin (1979)

Fragmente frunze

Maraffa & Sharp (1979)

5,5 30 10 2,4-D Maraffa & Sharp (1979)

Cotiledon Gamborg et al (1968) B5 a:G

5,5 20 7 (1)2,4-D+(0,2)Kin Tsai & Kinsella (1981)

Theobroma cacao

Calus Murashige & Skoog (1962)

5,7 30 7 (1)2,4-D+10%CM Tsai & Kinsella (1981)

Tabelul 11.3.

Cercetări privind cultura de calus la arborii şi arbuştii ornamentali Denumirea

speciei Explant Mediul de cultură pH Zaharoză (g/l)

Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l) Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 Acer negundo Calus Radojevic et al (1980) 20 6 (3)ANA + (1)Kin +

(2)Ad Radojevic et al

(1980) Ţesut cambial Lamport (1964) 20 7,5 (0,6-6)2,4-D+10-40%CM Lamport (1964)

Cambiu Sunderland (1966) 5,4 20 agar (0,1)ANA+10%CM Sunderland (1966) Acer

pseudoplatanus Calus Sunderland (1966) 5,4 20 agar [(1)2,4-D sau

(10)ANA] +10%CM Sunderland (1966)

Acer rubrum Cambium 0,5 x Linsmaier&Skoog (1965) 5,6 20 Agar (5)AIA + (0,2)Kin Mathes et al (1973) Fragmente

frunză Simola (1985)N7 Supl 5,6 20 6 [(2)2,4-D+(0,5)Kin] sau

[(5)2,4-D+(1)Kin] Simola (1985) Betula pendula

Calus Simola (1985)N7 5,6 20 6 [(2)2,4-D / ANA] + (0,5)Kin

Simola (1985)

Page 226: Microinmultirea plantelor

226

Tabelul 11.3. continuare 1 2 3 4 5 6 7 8

Betula verrucosa Cambiu Jacquiot (1955) 30 agar (1)ANA Jacquiot (1955) Crataegus x mordensis

Internod Murashige&Skoog (1962) 5,6-5,8 30 5,5 (0,25)2,4-D + (0,2)Kin Coffin et al (1976)

Ţesut medular Reinert & White (1956) 5,6-5,8 30 10 (0,05)2,4-D + (1)Kin Wolter&Skoog(1966) Fraxinus pennsylvanica Calus Wolter & Skoog (1966)

Standard 5,6-5,8

30 10 (0,04)2,4-D + (1)Kin Wolter & Skoog (1966)

Gingko biloba Calus Tulecke (1964) 5,5 20 10 (1)ANA + (0,5)Kin + (10)AdS

Tulecke (1964)

Ţesut medular Murashige&Skoog(1962) 5,7 30 5 (2)ANA + (0,5)BAP Banks (1979) Hedera helix Ţesut medular Stoutemyer & Britt

(1965) 5,6 20 8 (1)ANA + 10%CM Stoutemyer & Britt

(1965) Picea abies Ţesut medular Harvey & Grasham

(1969) 1 10 glucoza 8 (0,5) AIA + (0,5) Kin Harvey & Grasham

(1969) Ţesut De Torok & Thimann

(1961) 5,6 20 agar De Torok &

Thimann (1961) Picea glauca

Hipocotil Durzan et al (1973) 35 5 (2,5) ANA + (1) Kin Durzan et al (1973) Picea pungens Ţesut medular Harvey & Grasham

(1969) 1 10 glucoza 8 (0,5) AIA + (0,5) Kin Harvey & Grasham

(1969) Pinus nigra Ţesut medular Harvey & Grasham

(1969) 1 10 glucoza 8 (1) ANA + (0,5) Kin Harvey & Grasham

(1969) Lăstari Kasperbauer & Reinert

(1967) 6 20 6 (0,2) ANA + (2) BAP Kaul (1986) Pinus strobus

Calus Murashige&Skoog(1962) 5,8 30 8 (0,1) 2,4 –D + (0,1) Z Minocha (1980) Pseudotsuga

menziesii Cotiledoane Cheng (1977; 1978) 5,5 30 6 (0,9) ANA + (1,13) BAP Cheah & Cheng

(1978) Rosa sp. Ţesut medular Lamport (1964) 20 7,5 (0,6-6) 2,4-D + 10-40%

CM Lamport (1964)

Syringa vulgaris Cambiu Wetmore&Sorokin(1955) 5,5 40 8 (1) 2,4-D + 15% CM Wetmore&Rier(1963)

Page 227: Microinmultirea plantelor

227

Tabelul 11.3. continuare

1 2 3 4 5 6 7 8 Thuja plicata Ţesut medular Harvey & Grasham

(1969)3 25 glucoza 8 (1) ANA Harvey & Grasham

(1969) Vinca rosea Ţesut din

sămânţă Schenk & Hildebrandt

(1972) 5,9 30 6 (0,5) 2,4-D + (2) CPA

+ (0,1) Kin Schenk &

Hildebrandt (1972)

Tabelul 11.4. Cercetări privind cultura de calus la viţa de vie

Denumirea speciei Explant iniţial Rezultatul Mediu pH Zaharoză

(g/l) Agar (g/l)

Regulatori de creştere (mg/l)

Autori

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Vitis vinifera Antere Calus Gresshoff & Doy

(1974)1 5,8 20 8 (2)ANA+(2)AIA+

(1,5)Kin

Vitis vinifera Lăstari tineri sau peţiol

Calus Jona & Webb (1979)C

5,7-5,8

20 3-5,5 (1)ANA+(0,2)Kin Jona & Webb (1979

Vitis vinifera Frunze Calus Gamborg (1966) PRL-4-C

5,5 20 agar (0,1)ANA+(0,2)Kin+15%CM

Lai & Yye (1980)

Vitis vinifera Calus Lăstărire Gamborg (1966) PRL-4-C

5,5 20 agar (0,1)ANA+(0,2)Kin+15%CM

Lai & Yye (1980)

Vitis vinifera Ovule Calus Mullins & Srinivasan (1976) HDVM

5,6 20 0 (2,8)CPA + 10-15% CM

Mullins & Srinivasan (1976)

Vitis vinifera Ovule Calus Mullins&Srinivasan(1976)N

5,6 20 0 (1,1)BAP Mullins & Srinivasan (1976)

Vitis vinifera Calus Calus embriogen

Mullins&Srinivasan (1976)N

5,6 20 0 (1)NOA+(1,1)BAP Mullins & Srinivasan (1976)

Vitis vinifera x Vitis rupestris

Antere Calus Bourgin & Nitsch (18670 H

20 0 (1,11)2,4-D + (0,225)BAP

Rajakeran & Mullins (1979)

Page 228: Microinmultirea plantelor

228

11.2. Cultura de protoplaşti şi hibridarea somatică

Protoplaştii sunt celule lipsite de peretele celular, care au capacitatea de a fuziona, de a

se divide în continuare şi de a da naştere la plante noi.

Hibridarea somatică, cunoscută sub numele de hibridare parasexuată, constă din

fuzionarea (contopirea) a doi protoplaşti realizată prin contopirea nucleilor şi citoplasmei

acestora.

Celula obţinută este un hibrid somatic şi ea poate da naştere unei plante întregi.

În anumite situaţii, schimbul de material genetic este parţial. Se poate întâmpla ca în

urma fuziunii protoplaştilor nucleii să nu fuzioneze şi să se realizeze numai o hibridare a

citoplasmei. În acest caz vorbim de hibridare citoplasmatică, plantele obţinute fiind numite

hibrizi citoplasmatici sau cibrizi.

Realizarea unor astfel de hibrizi este importantă pentru transmiterea unor caractere

controlate de ereditate citoplasmatică. Este cazul transmiterii sterilităţii mascule care este

controlată de gene existente în mitocondrii.

Etapele hibridării somatice (Pierik, 1987):

1- Alegerea şi creşterea materialului iniţial.

Alegerea genotipurilor este esenţială întrucât nu toate se comportă la fel. Astfel la

tomate, Evans şi Bravon,1983 a, au obţinut rezultate pozitive cu un singur genotip din cele 14

încercate.

Condiţiile de creştere a materialului vegetal sunt şi ele importante. Se recomandă ca

ultimele faze de creştere să se desfăşoare în condiţii controlate (seră, fitotron, etc.) pentru a

oferi plantelor condiţii optime (Evans şi Bravon 1983 a).

Se preferă folosirea materialului vegetal cultivat in vitro care, pe lângă juvenilitate,

prezintă avantajul că nu trebuie sterilizat.

Cel mai frecvent, pentru obţinerea protoplaştilor se foloseşte mezofilul frunzei.

Alte organe folosite pentru izolarea protoplaştilor sunt vârfurile de lăstari (Binding şi

colab., 1981), puieţii în primele faze de creştere, cotiledoanele şi hipocotile (Potrykus şi

colab., 1983).

Datorită instabilităţii genetice, calusul sau suspensiile celulare sunt mai puţin folosite.

2. Dezinfectarea materialului vegetal se face urmărind tehnica şi metodologia folosită

la iniţierea culturilor in vitro.

Datorită faptului că ţesuturile folosite sunt juvenile, trebuie acordată o atenţie

deosebită timpilor şi concentraţiilor folosite pentru a nu afecta viabilitatea celulelor.

Page 229: Microinmultirea plantelor

229

Din acest punct de vedere, tratamentele aplicate mezofilului trebuie să fie cât se poate

de "blânde".

3. Izolarea protoplaştilor se face prin macerarea enzimatică a peretelui celular.

De regulă, se foloseşte un amestec de enzime ca celuloza, pectinoza şi uneori

hemiceluloza. Aceste enzime dizolvă celuloza, pectina (lamela mediană) şi stratul de

hemiceluloză. În urma procesului de macerare celula rămâne doar cu plasmalema intactă.

În timpul tratamentului enzimatic trebuie asigurată în soluţie o presiune osmotică

superioară pentru a preveni plasmoliza celulelor. Acest lucru este realizat prin adăugarea de

glucoză, manitol şi sorbitol.

Datorită efectului negativ al agenţilor osmotici asupra protoplaştilor, durata

tratamentului enzimatic trebuie redusă la minimum posibil.

Macerarea enzimatică a celulelor se efectuează de regulă la întuneric, fiind importante

şi celelalte condiţii de lucru: temperatură, pH, viteza de agitare etc.

După obţinerea protoplaştilor aceştia se purifică prin filtrare prin site metalice sau de

nylon pentru înlăturarea impurităţilor de tipul pereţilor celulari etc.

Urmează apoi o centrifugare la turaţie redusă într-o soluţie cu zaharoză (15-20%)

pentru a separa protoplaştii.

4. Fuziunea protoplaştilor se realizează prin inoculare într-o soluţie concentrată de

polietilenglicol (PEG), care are şi o mare concentraţie de ioni de Ca2+ şi un pH ridicat

(Menczel, 1983).

Acest tratament are ca scop înlăturarea sarcinii negative a protoplaştilor. După

realizarea fuziunii polietilenglicolul şi ioni de Ca2+ sunt spălaţi.

Zimmermann (1982) a propus şi realizat electrofuziunea protoplaştilor (fuziunea într-

un câmp electric), această tehnică determinând creşterea viabilităţii lor.

Kameya (1984) a realizat, în schimb, fuziunea protoplaştilor prin folosirea dextranului

şi a stimulării electrice.

După fuzionarea protoplaştilor are loc fuzionarea nucleilor.

Atunci când se urmăreşte fuzionarea protoplaştilor proveniţi de la două genotipuri

diverse A şi B, apare problema selecţiei hibrizilor somatici din suspensia celulară.

În populaţia de celule vor fi întâlniţi protoplaşti nefuzionaţi A, B, celule AA, BB

(monocarion) şi hibrizi somatici AB (heterocarion) care trebuie selectaţi.

Hibridarea somatică s-a realizat cu succes la plante din familia Solanaceae.

Un aspect interesant îl reprezintă hibridarea somatică interspecifică şi mai ales,

intergenerică.

Page 230: Microinmultirea plantelor

230

Au fost astfel realizaţi hibrizi între Solanum tuberosum şi Lycospersicon esculentum,

sau între Brassica şi Arabidopsis, între Daucus şi Aegopodium podagraria (Vasil 1978,

Thomas şi colab. 1979)

Frecvent însă hibrizii realizaţi sunt inutilizabili, fiind sterili.

Cercetările continuă pentru obţinerea unor hibrizi utili din punct de vedere agronomic

la un număr de specii, vărzoase, lucernă, tomate, cartof, trifoi, morcov, tutun, petunii etc.

5. Cultura protoplaştilor, regenerarea peretelui celular, diviziunea celulară

Cultura de protoplaşti presupune asigurarea unor condiţii deosebite.

Astfel, în timpul regenerării peretelui celular potenţialul osmotic al mediului de

cultură trebuie să fie redus şi concentraţia ionilor de Ca2+ ridicată. După regenerarea peretelui

celular (câteva zile) potenţialul osmotic trebuie să crească treptat (Burgess, 1983).

După 2-7 zile de la izolarea protoplaştilor, are loc prima diviziune celulară.

Cultura de protoplaşti se poate realiza în diferite moduri:

- într-un strat subţire de mediu lichid, în vase Petri;

- pe mediu solid după tehnica Bergmann (1960);

- în microcamere de sticlă;

- în picături de mediu lichid (metoda micropicăturii) în vase Petri;

- cultura în “creşă” (“nurse culture) - protoplaştii sunt crescuţi pe o punte de hârtie

de filtru sau celofan aşezate pe un strat de celule “mamă”.

- cultura în dublu strat lichid + solid

- cultura pe pat de agar şi discuri de agar (Shillito şi colab., 1983; Dons şi Bouwer,

1986).

După formarea peretelui celular condiţiile de creştere sunt similare celor folosite la

cultura de celule izolate, atât în ceea ce priveşte compoziţia mediului de cultură cât şi factorii

de creştere.

Cele mai bune condiţii de creştere a protoplaştilor se realizează la întuneric sau lumină

de slabă intensitate.

După formarea aglomerărilor de celule (microcalus) se trece la faza următoare, de

regenerare a noilor plante.

6. Regenerarea de noi plante

Posibilitatea regenerării de noi plante este încă redusă (Evans şi Bravo, 1983; Binding

şi colab., 1982).

Acest lucru a fost posibil până în 1983 la 66 de specii din care 38, sunt din Familia

Solanaceae.

Page 231: Microinmultirea plantelor

231

Factorii de care depinde regenerarea sunt:

- familia, specia şi genotipul;

- nivelul de diferenţiere a materialului iniţial;

- condiţiile de creştere a materialului iniţial;

- folosirea mediilor de cultură bogate: Kao şi Michayluk pentru calus (1975), B5,

suplimentat cu 5-10% lapte de cocos, pentru embrioni şi organe (Gamborg şi colab., 1982) şi

MS (Murashige & Skoog, 1962).

Avantajele hibridării somatice sunt multiple:

- realizarea tetraploizilor, a amfidiploizilor şi fuzionarea protoplaştilor haploizi;

- hibrizi la plante cu probleme sexuale: organe incomplet/ insuficient dezvoltate,

sterilitate masculină etc.

- hibridare între plante juvenile înainte de primul înflorit;

- hibridare parţială pentru obţinerea hibrizilor asimetrici la care nu toţi cromozomii

se combină după fuziunea nucleară.

- realizarea transmiterii caracterelor citoplasmatice de la partenerul mascul –

ereditatea citoplasmatică – hibrizi citoplasmatici – sterilitate masculină, rezistenţă la boli şi

erbicide etc.

Problemele şi dezavantajele hibridării somatice sunt redate în continuare:

- lipsa unei metode eficiente de selecţie a hibrizilor somatici;

- produşii obţinuţi sunt frecvent necorespunzători, neviabili, sterili, instabili etc.

- poate apărea formarea unui calus himeric în locul plantelor;

- apar amfidiploizi, care de regulă sunt nedoriţi (4n);

- produşii obţinuţi au o variabilitate accentuată;

- nu se poate asigura transmiterea unui caracter dorit, datorită stabilităţii genetice reduse;

- frecvent, la combinaţii necompatibile, apare eliminarea cromozomilor străini;

- producţia de cibrizi este încă slab dezvoltată;

Page 232: Microinmultirea plantelor

232

11.3. Regenerarea plantelor dintr-o singură celulă

După izolarea unor celule, s-a pus problema stimulării fiecăreia dintre ele de a se

divide şi eventual de a da naştere unor lăstari sau plante întregi.

Primele rezultate pozitive au fost obţinute de Muir şi colab. (1954, 1958) care au

cultivat o celulă pe o punte din hârtie de filtru, care a fost aşezată apoi pe o bucată de calus

din care celula respectivă a provenit.

Extrăgând substanţele hormonale şi nutritive formate de calus prin puntea de filtru,

celula a început să crească şi să se dividă.

Bergmann (1960), după ce a filtrat o suspensie de celule de tutun şi mazăre, le-a

amestecat într-un mediu de cultură cu agar care era pe cale să se solidifice.

După dispersarea celulelor şi întărirea mediului de cultură, acestea au început

diviziunea şi formarea calusului. Pentru stimularea proliferării la acea dată se folosea 2,4 D şi

laptele de cocos.

Alte încercări reuşite de inducere şi de realizare a diviziunii unor celule izolate au

constat în cultivarea unor celule în micro-camere pe agar în vecinătatea unor "celule-mamă"

de calus (Strat, 1973).

Pentru obţinerea celulelor izolate există mai multe metode:

- filtrarea suspensiilor celulare prin site din diferite materiale;

- dezintegrarea calusului pe cale mecanică sau chimică prin adăugarea de pectinoză;

- macerarea peretelui celular cu ajutorul unor enzime, urmată de separarea protoplaştilor.

Ulterior aceştia îşi refac membrana celulară şi încep diviziunea;

- folosirea grăunciorilor de polen pentru obţinerea unor celule izolate;

- centrifugarea suspensiilor de celule şi separarea acestora pe baza diferenţelor de masă etc.

Obţinerea unei culturi monocelulare este dependentă de: genotip, densitatea celulară,

rata diviziunii celulare în material iniţial, vârsta materialului iniţial, prezenţa calusului iniţial,

compoziţia mediului de cultură (Pierik, 1987).

După separarea celulelor, fiecare dintre ele se divid formând calus din care vor lua

naştere apoi lăstarii sau embrionii somatici.

Culturile monocelulare au fost realizate cu succes la Nicotiana tabacum, Daucus

carota, Cichorium endivia, Asparagus officinalis, Brassica napus, Citrus sinensis, etc.

Page 233: Microinmultirea plantelor

233

Capitolul 12

Baby plant

12.1. Consideraţii generale

O aplicaţie comercială a culturilor in vitro, destul de răspândită după anii 80’, este

baby plant. Acest nou produs se obţine prin cultivarea unor specii horticole pe medii

colorate în vase din sticlă decorative. Astfel realizat, este destinat valorificării ca obiect

decorativ care poate „trăi” 6- 12 luni sau chiar mai mult.

În momentul în care explantele au ocupat volumul interior al vasului în care au

crescut şi mediul de cultură s-a epuizat, acestea se pot scoate în condiţii in vivo, se pot

aclimatiza şi trece la ghivece.

Crearea de baby plants a fost posibilă prin îmbinarea tehnicilor de microînmulţire,

cu diverse modele de sticlărie şi medii colorate. La baza acestor combinaţii stă bunul gust,

imaginaţia şi plăcerea de a crea frumosul.

Produsele Baby plant pot înfrumuseţa orice spaţiu interior, conferind prospeţime şi

culoare. Ele pot fi aşezate pe mobila din sufragerie, pe consola din baie, pe noptiera din

dormitor, pe birou sau în apropierea unei ferestre.

Când sticluţele cu baby plant sunt comercializate, ele sunt întotdeauna însoţite de

câteva sfaturi practice de întreţinere:

- niciodată să nu se îndepărteze dopul;

- sticluţele nu se expun direct la soare;

- se evită răsturnarea sau agitarea recipientului;

- se ţin la distanţă de orice sursă de căldură.

Pentru realizarea produselor baby plant se folosesc plante care în principiu, trebuie

să răspundă la următoarele cerinţe:

- să fie decorative;

- să aibă creştere redusă în timp pentru a nu ocupa rapid vasul de prezentare;

- să aibă talii asemănătoare;

- să aibă cerinţe asemănătoare faţă de mediul de cultură şi, în general să nu fie mari

consumatoare de substanţe nutritive;

- să nu-şi modifice aspectul la cultivarea pe medii colorate;

Page 234: Microinmultirea plantelor

234

- să nu aibă cerinţe deosebite faţă de factorii de mediu şi să crească bine la

temperatura camerei;

- să se aclimatizeze uşor;

Dintre speciile cele mai folosite pentru realizarea de produse baby plant amintim:

Syngonium, Phylodendron, Vriestea, Spathiphylium, Aechemea, Cordyline, cactuşi şi alte

specii de suculente etc.

12.2. Tipuri de produse şi materiale folosite la producerea de baby plant

12.2.1. Vase din sticlă

Varietatea gamei de modele şi dimensiuni de vase în care se pot realiza baby plants

este impresionantă. În această situaţie, cel mai important rol îl joacă imaginaţia fiecăruia.

Se pot folosi vase de laborator de tip Erlenmeyer (100 ml), sticlărie destinată ambalării

produselor alimentare (50ml,150ml, 250ml, 400ml), sticluţe de parfum, vase pentru

servirea vinului, bomboniere, vase din cristal, etc.

Detaliind departamentul formelor recipientelor, putem vorbi despre vase cilindrice,

conice, tronconice, rotunde, pătrate, piramidale, prismatice, hexagonale, octogonale, de tip

pară, turtite, bombate, cu sau fără mâner, cu gât lung sau scurt, cu deschidere mai mult sau

mai puţin largă, etc. Recipiente aparent banale, pot căpăta o imagine deosebită folosindu-le

pentru baby plant.

În funcţie de ocazia cu care sunt oferite produsele baby plants se pot alege forme

adecvate ale vaselor. De exemplu, pentru perioada Crăciunului există recipiente cu forma

unui brad sau a unui sfeşnic.

Este foarte important ca sticla să fie albă şi perfect transpsrentă pentru a nu

împiedica în nici un fel captarea luminii şi pentru a nu îngreuna vizibilitatea către

interiorul vasului.

Dimensiunea recipientului se corelează cu specia pentru a asigura acesteia spaţiul

necesar dezvoltării timp de mai multe luni.

12.2.2. Alte materiale

Deoarece produsele baby plant se realizează în condiţii aseptice, trebuie alese

materiale cu care putem realiza acest lucru. Se pot utiliza dopuri de plastic, sticlă, cauciuc

sau plută, capace metalice sau de plastic, iar pentru izolare silicon transparent, folie pentru

alimente, chip band sau bandă izolatoare.

Page 235: Microinmultirea plantelor

235

Pentru a conferii produselor o valoare estetică deosebită se folosesc accesorii

adecvate fiecărei ocazii, de exemplu: panglici şi şnururi de diferite culori, dimensiuni şi

combinaţii, hârtie creponată sau pânză, ciucuri, flori artificiale şi multe altele în funcţie de

imaginaţia fiecăruia.

12.3. Folosirea mediilor de cultură colorate

Pentru colorarea mediilor de cultură, se pot folosi mai multe tipuri de substanţe care

trebuie să răspundă la următoarele cerinţe:

- să nu fie toxice pentru plante;

- să nu determine colorarea ţesuturilor plantelor;

- să nu formeze compuşi toxici, prin descompunere sau prin reacţie cu celelalte

componente ale mediului;

- să fi stabile şi să nu se decoloreze prin autoclavare;

- să-şi păstreze culoarea în timp, în condiţii de iluminare naturală şi artificială.

În general este recomandat să se folosească coloranţi alimentari. În acelaşi timp, se

pot folosi coloranţi naturali, dar trebuie testată în prealabil persistenţa culorii în timp şi

influenţa asupra explantelor (Groza I., 2004).

În tabelul 12.1. şi graficul aferent, este ilustrată influenţa tipului de colorant asupra

ratei de multiplicare şi creşterii lăstarilor de Sequoia sempervirens, după o lună de cultură

pe mediu colorat.

Page 236: Microinmultirea plantelor

236

Tabelul 12.1.

Comportarea explantelor de Sequoia sempervirens

pe medii de cultură colorate

Culoarea mediului Colorantul

Cantitate/ 100 ml mediu

Rata de multiplicare

Lungimea lăstarilor (cm)

albastră colorant alimentar praf 0,02 g 11,00 2,95

galbenă colorant alimentar lichid 1 ml 16,00 5,91

violetă amestec colorant albastru şi roşu 0,01 g+0,01 g 15,20 5,47

verde amestec colorant albastru şi galben 0,01 g+0,01 g 8,00 6,46

roşie colorant alimentar praf 0,02 g 7,80 3,35

]

S-a observat că pe mediile de cultură colorate mai închis este stimulată formarea şi

creşterea rădăcinilor.

Page 237: Microinmultirea plantelor

237

a b

c

Foto 12.1. Testarea culorilor şi unor specii de plante: a – Gasteria sp. b - Sequoia sempervirens, c - Drosera rotundifolia

Page 238: Microinmultirea plantelor

238

a

b

Foto 12.2. Produse baby plant pregătite pentru livrare

Page 239: Microinmultirea plantelor

239

Bibliografie selectivă

Al-Abta S. & Collin H.A. – Control of embryoid development in tissue culture of celery.

Plant Sci. Lett. 16. 773-782, 1978

Austin S. & Cassells A.C. – Variation between plants regenerated from individual calli

produced from separated potato stem callus cells. Plant Sci. Lett. 31, 107-114, 1983.

Aziz H.A. & Mccown B.H. – Hormonal response curves of shoot and callus culture of

cucumber (Cucumis sativus L.). Hortscience 20, 540, 1985

Bagga S., Bhalla-Sarin N., Sopory S.K. & Guha-Mukhrenjee S. – Comparison of in vitro

plant formation from somatic tissue and pollen grains in Brassica olearacea var.

botrytis. Phytomorph. 32, 152-156, 1982

Barba, M., Cupidi, A. - Il microinnesto del ciliegio e del pesco in vitro studio sull' idoneità dei

portinnesti. Frutticoltura 5, p: 37-41, 1989.

Barba, M., Cupidi, A., Ammirabile A. -Uso del microinnesto in vitro per il risanamento del

mandorlo. Frutticoltura 3, p:73-75, 1990.

Behki C., R.M. &Lesley S.M. – Shoot regeneration from leaf callus of Lycopersicon

esculentum. Pflanzenphysiol. 90,83-87, 1980

Bigot C, Ohki S. & Mousseau J. – Experimental data for a strategy for the improvement of the

shoot forming capacity in vitro. Acta Hort. 78, 125-132, 1977

Blackmon W.J., Reynolds B.D. – In vitro shoot regeneration of Hibiscus acetosella,

muskmelon, watermenlon and winged bean. Horscience 17, 588-589, 1982

Blackmon W.J., Reynolds B.D. & Postek C.E. – Production of somatic embryo from callused

cantaloupe hypocotyl explants. Hortscience 16, 451,1981b

Bloksberg L.N. & Saltveit M.E. – Regenerating plants from axillary buds of field-grown

iceberg lettuce hearts. HortScience 20, 540, 1985

Bonner J. – On the growth factor requirements of isolated tomato roots. Bull. Torrey Bot.

Club 70 184-189, 1940B

Bonner J. & Axtman G. – The growth of plant embryos i vitro. Preliminary experiments on

the role of accessory substances. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 23, 453-457, 1937

Bonner J. & Bonner D. – Ascorbic acid and the growth of plant embryos. Proc. Nat. Acad.

Sci. USA. 24, 70-75, 1938

Bragdo – Aas M. – Regeneration of plants from, callus of potato tubers. Acta Hort. 78, 133-

137, 1977

Page 240: Microinmultirea plantelor

240

Brezeanu A., Roşu Ana, Mirancea D., Iordan M. (1983) - "Modificarea genetică a plantelor cu

ajutorul protoplaştilor-perspective şi limite". În: Lucr.celui de al II-lea Simp.Naţ. Cult.

Tes. Veg. Piteşti, p. 61-64.

Browers M.A. & Orton T.J. – A factorial study of chromosome variability in callus cultures

of celery (Apium graveolens). Plant Sci. Lett. 26, 65-73, 1982

Brown D.M. & Charlwood B.V. – The control of callus formation and differentiation in

scented pelargoniums. J. Plant Physiol. 123 409-417, 1986

Bui Dang Ha D., Norreel B. & Masset T.A. – Regeneration of Asparagus officinalis L.

through callus cultures derived from protoplasts. J. Exp. Bot. 26, 263-270, 1975

Butcher D.N. & Ingram D.S. – Plant Tissue Culture. Inst. of Biology, Studies in Biology no

65. Edward Arnold, 1976

Cachiţă-Cosma, Dorina - Metode in vitro la plantele de cultură - baze teoretice şi practice.

Editura Ceres, Bucureşti, 1987.

Cachiţă-Cosma, Dorina, Petrescu C. - Curs practic de culturi de ţesuturi in vitro cu aplicaţii în

legumicultură şi floricultură. I.A.N.B., Atelierul de multiplicat cursuri, Bucureşti,

1985.

Caplin S.M. & Steward F.C. – Effect of coconut milk on the growth of explants from carrot

root. Science 108, 688-657, 1948

Capuano G., Piccioni E., Standardi A. – Effect of different treatments on the conversion of

M.26 apple rootstock synthetic seeds obtained from encapsulated apical and axillary

micropropagated buds. Journal of Horticulture Science and Biotechnology, 73 (3),

299-305, 1998

Carswell G.K. & Locy R.D. – Root and shoot initiation by leaf, stem and storage root

explants of Sweet potato. Plant Cell Tiss. Organ Cult.3, 299-236, 1984

Cepoiu, N.; Stănică, FI.; Dumitraş, D.; Ioniţă-Mânzatu, Mirela; Mihăila, Mariana; Cornea,

Cornelia - Carbon Dioxide Laser, as work technique in fruit tree biotechnology -

poster. 2nd International Symposium Biotehnos, "Biotechnology now& tomorow"

Lucrări, Volumul II, SP III, 1 pag., 29-30 septembrie, Bucureşti 1994.

Chin C.K., Haas J.C. & Still C.C. – Growth and sugar uptake of excised root and callus of

tomato. Plant Sci. Lett. 21, 229-234, 1981

Crisp P. & Walkey D.G.A. – The use od aseptic meristem culture in cauliflower breeding.

Euphytica 23, 305-313, 1974

Page 241: Microinmultirea plantelor

241

Crocomoco O.J., Sharp W.R. & Peters J.E. – Plant morphogenesis and the control of callus

growth and root induction of Phaseolus vulgaris with the addition of bean seed

extract. Z. Pflanzenphysiol. 78, 456-460, 1976

Cupidi, A., Barba, M. - Produzione di materiale virus-essente esperienze di microinnesto in

vitro. Frutticoltura 5, p: 25-28, 1988.

Diaconescu Oana - Studiul influenţei factorilor ecologici şi a tehnologiei de cultură asupra

calităţii andivelor, Lucrare de dizertaţie, U.S.A.M.V.B., Facultatea de Horticultură,

2002

Diaconescu Oana, - The influence of culture medium on in vitro clonal regeneration on

witloof chicory (Cichorium intybus L.), Lucrări ştiinţifice U.S.A.M.V.B. Seria B, vol.

XLVI, 2003

Diaconescu Oana, Petrescu C. - Influenţa mediului de cultură asupra ratei de multiplicare in

vitro la cicoare (Cichorium intybus L.). Sesiunea ştiinţifică a Facultăţii de

Horticultură, Iaşi, 2003

Diaconescu Oana, Petrescu C. - Research regarding the in vitro germination of some chicory

hybrids (Cichorium intybus L.), Lucrări ştiinţifice U.S.A.M.V.B. Seria B, vol. XLV,

2002

Dietert M.F., Barron S.A. & Yoder O.C. – Effects of genotype on in vitro culture in the genus

Brassica. Plant Sci. Lett. 26, 233-240, 1982

Dodds J.H. & Roberts L.W. – Experiments in plant tissue culture. Cambridge University

Press, Cambridge, London, New York, 1982

Doerschung M.R. & Miller C.O. – Chemical control of adventious organ formation in

Lactuca sativa explants. Am. J. Bot. 54, 410-413, 1967

Doré C. – Production de plantes homoyigotes mâles et jemelles à partir d’anthère d’asperge,

cultivées in vitro (Asparagus officinalis). Compt. Rend. Acad. Sci. Paris 278D, 2135-

2138, 1974

Dumas De Vaulx R., Chambonnet D. & Pochard E. – Culture in vitro d’anthère de piment

(Capsicum annuum L.) : amélioration des taux d’obtention de plantes chez différents

génotipes des traitments à +35°C. Agronomie 1, 859-864, 1981

Dumitraşcu, Monica; Stănică, Fl.; Ion, Ligia. - Cercetări privind stabilirea protocolului de

înmulţire in vitro a embrionilor imaturi la hibrizi interspecifici din genul Prunus.

Lucrările celui de-al VII-lea Simpozion Naţional de Culturi de Ţesuturi şi Celule

Vegetale, 58-62, Arad, 1997.

Page 242: Microinmultirea plantelor

242

Dunstan D.I. & Short K.C. – In vitro studies on organogenesis and growth in Allium cepa

tissue cultures. Acta Hort. 78, 139-148, 1977b

Eenik A.H. – Preliminary results of research on storage and in vitro germination of lettuce

pollen as an aid in lettuce breeding. Euphytica 32, 521-526, 1983

Elliot R.F. – Growth of excised meristem-tips of Rumara, Ipomoea batatas (Linn.) Poir in

axenic culture N.Z.J. Bot. 7, 158-166, 1969

Enescu, V., Ioniţă, Lucia, Palada-Nicolau, Magdalena - Înmulţirea vegetativă a arborilor

forestieri. Editura Ceres, Bucureşti, 1994.

Engler D.E. & Grogan R.G. – Isolation, culture and regeneration of lettuce leaf mesophyll

protoplasts. Plant Sci. Lett. 28, 223-229, 1983

Falcinelli M., Standardi A., Piccioni E. – Il seme sintetico nelle piante agrarie: stato attuale

della ricerca. Riv. Sementi elette, XLII, nr. 1, 1997

Famiani, F., Ferradini, N., Standardi, A., Hoza, D. and Stănică, Fl. - In vitro regeneration of

different Actinidia species Acta Horticulturae No. 444, ISBN 9066058099 pp 133-138,

1997

Famiani, F.; Ferradini, N.; Hoza, D.; Standardi, A.; Stănică, Fl. - In vitro regeneration of

different Actinidia species. Proceedings of the III-Rd International Symposium on

Kiwifruit, Tessaloniki, 19-22 September 1995.

Ferradini, Nicoletta; Famiani, F.; Proietti, P.; Stănică, Fl. - Influence of growth regulators and

light on in vitro regeneration in M.26 apple rootstock. Journal of Horticultural Science

71 (5), 859-865, 1996.

Fridborg G., Pedersen M., Landstrom M. & Eriksson T. – The effect of inhibiting

morphogenesis. Physiol. Plant. 43, 104-106, 1978

Fukami T. & Hildebrandt A.C. – Growth and chlorophyll formation in edible green plant

callus tissues in vitro on media with limitated sugar supplements. Bot. Mag.: Tokyo

80, 199-212, 1967

Gâlă Ruxandra, Stănică Fl., Diaconescu Oana - Cercetări privind iniţierea culturii in vitro de

Clematis vitalba, Lucrări ştiinţifice, Facultatea de Horticultură, UŞAMV Iaşi, 2003

Gâlă Ruxandra, Velcea M., Stănică Fl., Diaconescu Oana - Influenţa apei Pi asupra înmulţirii

in vitro a smochinului (Ficus carica L.), Simpozionul internaţional „Apa un miracol”

Ediţia a III a, Bucureşti 25-26 iunie, pp. 24-25, 2003

Gamborg O.L., Philips G.C. – Plant Cell, Tissue and Organ Culture – fundamental methods.

Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1995

Page 243: Microinmultirea plantelor

243

Gardi T., Piccioni E., Standardi A. - Effect of bead nutrient composition on regrowth of stored

vitro-derived encapsulated microcutting of diferent woody species, J.

Microencapsulation, vol. 16, nr. 1, 13-25, 1999;

Gavinlertvatana P. & Li P.H. – The influence of 2,4 D and kinetin on leaf callus formation in

different potato species. Potato Res. 23, 115-120

George E.F., Puttock D.J.M., George H.J – Plant Culture Media: Vol 1, Formulation and uses.

Exegetics Limited, Edington, 1987

George L. & Narayanaswamy S. – Haploid Capsicum through experimental androgenesis.

Protoplasma 78, 467-470, 1973

Gleddie S., Keller W. & Setterfield G. – In vitro morphogenesis from tissue, cells and

protoplasts of Solanum melongena L. Pp 139-140 in Fujiwara (ed), 1982

Goodwin P.B. – An improved medium for the rapid growth of isolated potato buds. J. Exp.

Bot 17, 590-595, 1966

Gresshoff P.M. & Doy C.H. – Development and differentiation of haploid Lycopersicon

esculentum (Tomato). Planta 107, 161-170, 1972b.

Griga M., Tejklova E., Novak F.J. & Kubalakova M. – In vitro clonal propagation of Pisum

sativum L. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 6, 95-104, 1986

Grigore, Ana; Stănică, Fl. - Stabilirea metodologiei de microînmulţire a unor specii şi hibrizi

din genul Actinidia. Simpozionul omagial dedicat semicentenarului Universităţii de

Ştiinţe Agricole a Banatului din Timişoara, 1-3 iunie 1995.

Groza, Ioana, Stănică, Fl. - In vitro propagation of BA 29 quince rootstock, Abstracts 4th

International Symposium Biotehnos, Biotechnology now&tomorow, Bucureşti, 26-27

Sept, SP 48/130, pp XLVIII-XLIX, 1996.

Groza Ioana Camelia, - Baby plant, o nouă modalitate de promovare a culturilor in vitro la

plantele horticole. Lucrare de diplomă, UŞAMV Bucureşti, Facultatea de Horticultură,

2004.

Guha S. & Johri B.M. – In vitro development of ovary and ovule of Allium cepa L.

Phytomorph. 16, 353-364, 1966

Gunay A.L. & Rao P.S. – In vitro plant regeneration from hypocotyls and cotyledon explants

of red pepper. Plant Sci. Lett. 11, 365-372, 1978

Gunay A.L. & Rao P.S. – In vitro propagation of hybrid tomato plants (Licopersicon

esculentum) using hypocotyls and cotyledon explants. Ann. Bot. 45, 205-207, 1980

Halperin W. – Alternative morphogenetic events in cell suspesions. Am.J. Bot. 53, 443-453,

1966

Page 244: Microinmultirea plantelor

244

Halperin W. & Wetherell D.F. – Ammonium requirement for embryogenesis in vitro. Nature

205, 519-520, 1965

Handley L.W. & Chambliss O.L. – In vitro propagation of Ciucumis sativus L. HortScience

14, 22-23, 1979

Hari V. – Effect of cell density changes and conditioned media on carrot cell embryogenesis.

Z. Pflanzenphysiol. 96, 227-231, 1980

Havel L. & Novak F.J. – Meristem tip culture of Allium cepa L. Scientia HOrt. 27, 209, 214,

1985

Herman E.B. & Haas G.J. – Clonal propagation of Coffea Arabica L. from callus culture.

HortScience 10, 588-589, 1978

Hoza, D. - Culturi in vitro cu aplicaţii în pomicultură. UŞAMV, Atelierul de multiplicat

cursuri, Bucureşti, 1996.

Hoza, D.; Standardi, A; Stănică,. Fl.; Tudor, T.A. - Date preliminare privind cultura in vitro a

nucului (Juglans regia). Lucrări ştiinţifice USAB, seria B, vol. XXXV, 51-56, 1992.

Hunault G. – Obtention de nouvelle souches de tissues à partir de diverse espèces de

Liliacées. Compt. Rend. Acad. Sci., Paris 283D, 1401-1404, 1976

Hussey G. & Stacey N.J. – In vitro propagation of potato (Solanum tuberosum L.) Ann. Bot.

48, 787-796, 1981

Ion, Ligia; Stănică, Fl.; Dumitraşcu, Monica; Peticilă, A. - Cercetări privind cultura in vitro a

unor embrioni imaturi din genul Prunus. Sesiunea ştiinţifică anuală a cadrelor

didactice şi studenţilor, Bucureşti, 11 decembrie 1997.

Iordan M., Roşu Ana, Enescu V., Brezeanu A., Grigorescu A., Coman I. (1983) -

"Regenerarea de plante prin cultura in vitro la Quercus". În:Lucr. II-lea Simp. Naţ.

Cult. Ţes. Veg.. Piteşti, p.10-26.

Isouard G., Raquin C. & Demarly Y. – Obtention de plantes haploids par culture in vitro

d’anthères d’Aubergine (Solanum melongena L.). Compt. Rend. Acad. Sci., Paris

288D, 987-989, 1979

Jarret R.L., Hasegawa P.M. & Erickson H.T. – Factors affecting shoot initiation from tuber

discs of potato (Solanum tuberosum). Physiol. Plant. 49, 177-184, 1980 B

Jelaska S. – Embroyd formation by fragments of cotyledons and hypocotyls in Cucurbita

pepo. Planta 103, 278-280, 1972

Johri B.M. & Guha S. - In vitro development of onion plants from flowers. Pp 215-223 in

Maheswari & Ranga Swamy (eds.), 1963

Kartha K.K. – Meristem culture. Pp 19-24 in Wetter and Costabel (eds.), 1982

Page 245: Microinmultirea plantelor

245

Kartha K.K., Gamborg O.L. & Constable F. – Regeneration of pea (Pisum sativum) plants

from shoot apical meristems. Z. Pflanzenphysiol. 72, 172-176, 1974b

Koevary K., Rappaport L. &Morris L.L. – Tissue culture propagation of head lettuce.

HortScience 13, 39-41, 1978

Lakon, G.- Tho topografical tetrasolium method for determined the germinating capacity of

seeds. Plant Phys., 24. p:389-994, 1949.

Lamport D.T.A. – Cell suspension cultures of higher plants: isolation and growth energetics.

Exp. Cell Res. 33, 195-206, 1964

Lazarte J.E. & Sasser C.C. – Asexual embryogenesis and plantlet development in anther

culture of Cucumis sativus HortScience 17, 88, 1982

Leelavahti S., Reddy V.S. & Sen S.K. – Somatic cell genetic studies in Brassica sp. I High

Frequency production of haploid plants in Brassica alba (L.) H.f. & T. Plant Cell Rep.

3, 102-105, 1984

Marani F. & Pisi A. – Meristem-tip culture and vegetative propagation in potato. Acta Hort.

78, 415-422, 1977

Morel G. & Martin C. – Curing potatoes infected with vitus. C.R. hebd. Séance. Acad. Agric.

Fr. 41, 472-473, 1955

Murashige, T. - A technique of shoot apex grafting and its utilization toward recovering virus

citrus clones. Hortic. Science 7, p:118-119, 1972

Neculae Luminiţa, Teodorescu A. – Rezultate privind microînmulţirea portaltoiului de măr

MM 106 în condiţii diferite de iluminare. Abstracts 3rd International Symposium

Biotehnos, “Biotechnology now & tomorrow” 19-20 octombrie, B 12, Bucureşti, 1995

Neri, D.- Tecniche da innesto con materiale proveniente da colture in vitro. Frutticoltura 3, p:

69-72, 1990.

Nielsen L.V. – In vitro bulbet formation from leaf segments of lilies, especially Lilium

rubellum. Scientia Hort. 11, 379-390, 1960

Pelletier G., Raquin C. & Simon G. – La culure in vitro d’anthères d’Asperge (Asparagus

officinalis). Compt. Rend. Acad. Sci., Paris 274D, 848-851, 1972

Pence V.C. & Caruso J.L. – Effects of IAA and four IAA conjugates on morphogenesis and

callus growth from tomato leaf discs. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 3, 101-110, 1984

Piccioni E., Standardi A., Ţuţuianu V.C. – Storage of M 26 apple rootstock encapsulates

microcuttings. Adv. HortScience, 10, 185-190, 1996

Pierik R.L.M. – In vitro culture of higher plants – Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht,

1987

Page 246: Microinmultirea plantelor

246

Pink D.A.C. & Walkey D.G.A. – Rapid propagation of Cucurbita pepo L. by culture of

meristem tips. Scientia Hort. 24, 107-114, 1984

Pliego-Alfaro, F., Murashighe, T.- Possible rejuvenation of adult avocado by greffage onto

juvenile roctstock in vitro. Hortscience, Vol.22 (6),p: 1321-1324, 1987.

Quoirin M., Lepoivre P. – Etudes de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus. Acta

Horticulturae, 78: 437-442. 1977

Raicu Petre, Badea, Elena Marcela - Cultura de celule şi biotehnologiile moderne. Editura

Ştiinţifică şi Enciclopedică, Bucureşti, 1986.

Raicu Petre şi colab. - Culturi de celule şi ţesuturi vegetale – aplicaţii în agricultură, Ed.

Ceres, Bucureşti, 1984;

Resende R.O. & Paiva M. – Eradication of potato viruses X and S by meristem-tip culture.

hortScience 20, 525, 1985

Reuther G. – Chapter 8 – Asparagus. Pp 211-242 in Sharp et al (eds.), 1984

Roşu Ana - An efficient method for rooting of in vitro propagated roses-XXV-th Annual

Meeting of ESNA, Piacenza, Italy, 1995

Roşu Ana - Elemente de biotehnologii vegetale – aplicaţii în ameliorare, Ed. Ametist 92,

Bucureşti, 1999

Roşu Ana, Brezeanu A., Iordan M. - Micropropagation in Vitis vinifera L. III: Studies

regarding in vitro stimulation of multiple axillary shoot development in some

grapevine cultivars for clonal multiplication. Rev. Roum. Biol., Biol. veg., 28 (2).,

1983

Roşu Ana, Grigorescu A. -Multiplicarea clonală prin tehnicile de culturi de ţesuturi la

Paulownia tomentosa. Studii Cerc.Biol., Biol. Veg., 1, 1984

Roşu Ana, Indreaş A., Sfetcu D. (1992) - A method of in vitro rescue of hybrid embryos from

crosses between seeded x seedless table varieties in grapevine (Vitis vinifera L.).

Abstract published in: Proceed. of NATO ASI Seminar Plant Morphogenesis-

Molecular Approaches, Heraclio, Crete., 1992

Roşu Ana, Iordan M., Brezeanu A., Volosciuc E. - Cercetări privind utilizarea calusului de

Daucus carota în scopul obţinerii de produşi secundari de importanţă farmaceutică.

Studii şi Cercetări de Biologie, Biol. Veget. 34 (1)., 1982

Roşu Ana, Skirvin R. M., Bein A., Norton M.A., Kushad M., Otterba Cher A.G. - The

development of putative adventitious shoots from a chimeral thornless rose (Rosa

multiflora) in vitro. Journal of Horticultural Science (1995) 70 (6), 1995

Page 247: Microinmultirea plantelor

247

Roşu Ana, Skirvin R.M. - In vitro culture of plant chimeras. Implications in horticulture -

Book of Abstract - XXIV.th Annual Meeting of ESNA, Varna, Bulgaria , 1994

Roşu, Ana – Elemente de biotehnologii vegetale-aplicaţii în ameliorare. Editura Ametist 92,

Bucureşti, 1999.

Săvulescu, Anca, Buliga, A., Stănică Fl. - Influence of X structured waters on in vitro

organogenesis of apple varieties and mother plant, Abstracts 4th International

Symposium Biotehnos, Biotechnology now&tomorow, Bucureşti 26-27 Sept., B2, 3/7,

pp XII, 1996

Smith R.H. & Murashige T. – In vitro development of the isolated shoot apical meristems of

angiosperms. Am.J.Bot. 57, 5623-568, 1970

Sopory S.K. & Tan B.H. – Regeneration and cytological studies and anther and pollen calli of

dihaploid of Solanum tuberosum. Z. Pflanzenzücht. 82, 31-35, 1979

Standardi A., Micheli M., Piccioni E. – Propagazione in vitro dell’olivo: acquisizioni e

prospettive. Riv. Frutticoltura Nr. 7/8, 1998

Standardi A., Piccioni E. - Recent perspectives on synthetic seed technology using

nonembryogenanic în vitro-derived explants, Int. J. Plant Sci. 159(6):968-978, 1998

Standardi A., Piccioni E. - Rooting induction în encapsulated buds of M.26 apple rootstock

for synthetic seed, biology of root formation and development, Plenum press, New

York, 1997;

Stănică Fl. – Microînmulţirea plantelor horticole şi alte tehnici de cultură in vitro. Editura

Grand, Bucureşti, 1999

Stănică Fl., Armeanu Ileana - Influence quantification of some factors implied in the kiwifruit

in vitro organogenesis Scientifical Papers UŞAMV Bucureşti, Serie B, Vol. XLVII,

ISBN 973-7753-04-6, Invel Multimedia, 2004

Stănică Fl., Dumitraşcu M., Davidescu V., Madjar R., Peticilă A. - Înmulţirea plantelor

horticole lemnoase, Format electronic, Editura Invel Multimedia, Bucureşti, ISBN

973-86341-4-8, 2003

Stănică Fl., Dumitraşcu M., Davidescu V., Madjar R., Peticilă A. - Înmulţirea plantelor

horticole lemnoase, Editura Ceres, Bucureşti, ISBN 973-40-0558-8, 431 pg., 2002

Stănică Fl., Gâlă Ruxandra, Diaconescu Oana - Cercetări privind înmulţirea in vitro a

smochinului (Ficus carica L.), Lucrări ştiinţifice, Facultatea de Horticultură, UŞAMV

Iaşi, 2003

Page 248: Microinmultirea plantelor

248

Stănică Fl., Gâlă Ruxandra, Velcea M., Diaconescu Oana - Rezultate preliminare privind

folosirea apei Pi la microînmulţirea in vitro a unor soiuri de măr - Simpozionul

Internaţional Apa un miracol Ediţia a II a, Bucureşti, 25-26.06, pp. 12 , 2002

Stănică Fl.; Hoza, D.; Lăzureanu, C. - The micro-grafting of fruit-growing plants

(Microaltoirea plantelor pomicole). Bioterra 1: 33-38, Bulletin of Scientific

Information, Athenaeum Academic University, Faculty of Horticultural. Sciences and

Bioengineering, Bucureşti, 1992.

Stănică, Fl. - Organogenesis via callus in kiwifruit hybrid plants (Actinidia deliciosa Chev. x

Actinidia arguta Sieb. e Zucch.). European Society for New Methods in Agricultural

Research (ESNA) XXVIII-th Annual Meeting, WG. 4, 151, Brno, 25-29 august, 1998.

Stănică, Fl. – Rezultate preliminare privind microînmulţirea in vitro a curmalului chinezesc

(Ziziphus jujuba Mill.). Lucrările Simpozionului "Horticultura Clujeană XX", Cluj-

Napoca, 236-238, 19-20 iunie 1997.

Stănică, Fl., Cepoiu N., Standardi A., Zuccherelli G.- Aspects of in vitro organogenesis in

Actinidia plants. 2nd International Symposium Biotehnos, "Biotechnology

now&tomorow", Lucrări, Volumul I, B10, 13 pag., 29-30 septembrie, Bucureşti 1994.

Stănică, Fl.; Cepoiu, N.; Dumitraşcu, Monica - Double layer and culture medium composition

on in vitro propagation of BA 29 and EM-C quince rootstocks. European Society for

New Methods in Agricultural Research (ESNA) XXVI-th Annual Meeting, 145, 12-16

septembrie, Buşteni, 1996.

Stănică, Fl.; Groza, Ioana; Cepoiu, N.; Standardi, A. - Influence of inductive factors on M.26

apple rootstocks organogenesis from leaf blade. Abstracts 3rd International

Symposium Biotehnos, "Biotechnology now & tomorow" 19-20 octombrie, B 11,

Bucureşti, 1995.

Stănică, Fl.; Hoza, D.; Cepoiu, N. - Organogeneza in vitro la plantele hibride de kiwi

(Actinidia deliciosa Chev. x Actinidia arguta Sieb. e Zuch.). Lucrările Simpozionului

omagial dedicat semicentenarului Universităţii de Ştiinţe Agricole a Banatului din

Timişoara, 1-3 iunie 1995.

Stănică, Fl.; Standardi, A; Hoza, D.; Tudor, T.A. - Cercetări privind microînmulţirea dafinului

(Laurus nobilis L.). Lucrări ştiinţifice USAB, seria B, vol. XXXV, 83-90, 1992.

Teodorescu A., Neculae Luminiţa – Cercetări pentru stabilirea biotehnologiilor de înmulţire a

unor specii pomicole şi dendrologice şi stadiul aplicării acestora în producţie. 2nd

International Symposium Biotehnos, “Biotechnology now & tomorrow”, Lucrări, Vol.

I, B10, 13 pag., 29-30 sept., Bucureşti, 1994

Page 249: Microinmultirea plantelor

249

Teodorescu A., Neculae Luminiţa – Rezultate privind înrădăcinarea în condiţii septice a

minibutaşilor unor specii horticole înmulţite in vitro. Abstracts 4th International

Symposium Biotehnos, Biotechnology now & tomorrow”, 26-27 sept., SP 50,

Bucureşti, 1996

Walkey D.G.A., Neeley H.A. & Crisp P. – Rapid propagation of whitw cabbage by tissue

culture. Scientia Hort. 12, 99-107, 1980

Yan R.L., G.R. Liu, L. Zhang, Z.X. Wang, E.Q. Yang, - Effect of exogenous plant hormones

on rapid multiplication of Ziziphus jujuba test-tube plants, Journal of Fruit Science, 7,

4, 231-233, 1990.

Yang H.J. & Clore W.J. – Obtaining virus-free plants from Asparagus officinalis L. by

culturing shoot tips and apical meristems. HortScience 11, 474-475, 1976.

Zucherelli G.- Metodologie nelle moltiplicazione, industriale in vitro dei portinnesti clonali

del pesco. Pescomandorlo GF 677, Susino GF 43, Damasco 1869, San Giuliene 655/2.

Atti Convegno “Tecniche di coltura in vitro per la propagazione su vasta scala delle

specie ortoflorofrutticole” p: 147-154, 1979.

Zucherelli G.- Moltiplicazione in vitro di cinque varieta di nocciolo e loro micorizazione con

Tuber melanosporum. L’Informatore Agrario, Verona, XLVI (41), 1990

Zucherelli G., Capaccio V. – Micorrizazione del castagno con simbionti a carpoforo edule.

Pianfei-Cuneo, 9 novembre 1990

Zucherelli G., Zucherelli S., Capaccio V. – Production in vitro of two hazelnut varieties and

results about inoculum of Tuber magnatum pico on a mass scale. Acta Horticulture

351

*** - Colecţia revistei Frutticoltura. Edagricole, Bologna, 1990-1995

*** - Colecţia revistei Plant Cell Tissue and Organ Culture, Martinus Nijhoff Publishers,

1990-1997

*** - Sigma Plant Culture Catalg, 1994

*** - Tehnici moderne de producere a materialului săditor pomicol. I.C.P.P. Mărăcineni,

Piteşti 1983

*** Abstracts VIIth International Congress on Plant Tissue and Cell Culture – Amsterdam,

June 24-29 1990.

Page 250: Microinmultirea plantelor

Editură de Carte Electronică

din cadrul SC MAVI SERPICO TRADE SRL

str. Belizarie nr 1, bl. 21/5, sc. 1, ap. 2, sector 1 - Bucureşti, PO Box 63-110 tel.: 0723.20.50.48; fax: 021/430.35.42; e-mail: [email protected]

Avem tehnologia ... dar şi uneltele, pentru a vă oferi:

♦carte electronică ♦CD personalizat ♦CD multimedia ♦paper to digital text ♦desen proiectiv digital 2D ♦CD film ♦DTP ♦consultanţă birotică/office/IT

OFERTĂ SPECIALĂ

GRATUIT în primul trimestru

al anului 2005 prelucrăm

teze de doctorat înformat electronic

ing. Florin STĂNICĂ

CoAcad. David DAVIDESCU

ordonator ştiinţific

TEZĂ DE DOCTORAT

Cercetări experimentale

privindfertilizarea

în livezi

1996

Evaluareamaşinilor şiechipamentelor

American Society of Appraisers

CD carte CD carte CD carte CD carte CD carte

SCIENTIFICALLY PAPERS

HORTICULTURE

MINISTRY OF EDUCATION AND RESEARCHUNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE BUCHAREST

SERIA B - XLV - 2002SERIA B - XLVI - 2003

CD curs universitar CD lucrări ştiinţifice CD colecţie reviste 2 CD carte + film 2 CD carte + film

CD film CD film CD film CD film CD film

Page 251: Microinmultirea plantelor

ISBN 973-7753-07-0