Prof. univ. dr. SORIN APOSTU

MICROBIOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

VOL. I SUPORT DE CURS IDD

CLUJ-NAPOCA 2009

2

PARTEA I MICROBIOLOGIE GENERAL

A. OBIECTUL DE STUDIU /5 B. BACTERII /5 GENERALITI /5 1. MORFOLOGIA I BIOLOGIA CELULEI BACTERIENE VEGETATIVE /6

CONSTANTELE MORFOLOGICE I FIZICE ALE CELULEI BACTERIENE /6

Forma /6 Dimensiunile /6 Modurile de grupare /7 Constantele fizice /7

STRUCTURA CELULEI BACTERIENE /7 nveliul /7 Coninutul /8

Materialul genetic /8 Citoplasma /8 Organitele celulei bacteriene /9

2. MORFOLOGIA I BIOLOGIA SPORULUI BACTERIAN /9 3. FIZIOLOGIA BACTERIILOR /10

COMPOZIIA CHIMIC A BACTERIILOR /10 METABOLISMUL BACTERIAN /10

Nutriia la bacterii /10 Catabolismul /11 Anabolismul /11 Respiraia (metabolismul energetic) /11

CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR /12 Creterea bacteriilor /12 Multiplicarea bacteriilor /12 Dinamica muliplicrii bacteriilor n (pe) mediile de cultur /13

4. TAXONOMIA BACTERIILOR /13 CRITERII DE CLASIFICARE A BACTERIILOR /14 UNITATEA TAXONOMIC /14

5. NOMENCLATURA BACTERIILOR /15 6. DESCRIEREA PRINCIPALELOR GRUPE DE BACTERII NTLNITE

N ALIMENTE /15 GRUPA BACTERIILOR AEROBE SAU MICROAEROFILE, MOBILE, GRAM NEGATIVE, CU FORM HELICOIDAL SAU VIBRIONIC /15

Genul Campylobacter /15 Genul Helicobacter /18

GRUPA BACTERIILOR CU FORM DE BACILI SAU DE COCI, AEROBE SAU MICROAEROFILE, GRAM NEGATIVE /19

Genul Pseudomonas /19 Genul Moraxella /22 Genul Acinetobacter /23 Genul Paracoccus /25 Genul Xanthomonas /25 Genul Gluconobacter (Acetomonas) /26 Genul Alcaligenes /26 Genul Brucella /26

GRUPA BACTERIILOR CU FORM DE BACILI, GRAM NEGATIVE, AEROBE I

3

FACULTATIV ANAEROBE /28 Subgrupa 1: Familia Enterobacteriaceae /28

Genul Escherichia /30 Genul Salmonella /34 Genul Shigella /35

Tribul Proteae /37 Genul Proteus /37

GRUPA BACTERIILOR CU FORM DE COC, GRAM POZITIVE, AEROBE I FACULTATIV ANAEROBE /38

Genul Staphylococcus /38 Genul Streptococcus /41 Genul Leuconostoc /44

GRUPA BACTERIILOR CU FORM DE BACILI, GRAM POZITIVE, AEROBE, FACULTATIV ANAEROBE SAU ANAEROBE, SPOROGENE /45

Genul Bacillus /45 Genul Clostridium /47

GRUPA BACTERIILOR CU FORM DE BACILI, GRAM POZITIVE, ASPOROGENE /50 Genul Lactobacillus /50

GENURI NENCADRATE N FAMILII /51 Genul Listeria /51

GRUPA BACTERIILOR CU FORM NEREGULAT DE BACILI, GRAM POZITIVE, ASPOROGENE (Actinomicete, Actinobacterii) /53

Bacterii corineforme /53 Genul Corynebacterium /53 Genul Brevibacterium /54

Bacterii propionice /54 Genul Propionibacterium /54

Micobacterii /54 Genul Mycobacterium /54

GRUPA RICKETTSIILOR /56 Genul Coxiella (Rickettsia) /56 Genul Chlamydia /57

C. CIUPERCI MICROSCOPICE /58 1. MUCEGAIURI /59

MORFOLOGIE /59 FIZIOLOGIE /59 GENURI I SPECII CU IMPLICAII N MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR /60 TAXONOMIE, IZOLARE I IDENTIFICARE /62

2. LEVURI (DROJDII) /63 MORFOLOGIE /63 FIZIOLOGIE /63 GENURI I SPECII CU IMPLICAII N MICROBIOLOGIA ALIMENTELOR /64 TAXONOMIE, IZOLARE, IDENTIFICARE /65

3. IMPLICAIILE CIUPERCILOR MICROSCOPICE N PATOLOGIA OMULUI /66 4. DETECTAREA MICOTOXINELOR DIN ALIMENTE I DIN PRODUSELE

PATOLOGICE /69

D. VIRUSURI /69 1. INTRODUCERE /69 2. DEFINIIE I CARACTERE GENERALE /70 3. MORFOLOGIA I COMPOZIIA CHIMIC /70

4

4. MULTIPLICAREA (REPLICAREA) VIRUSURILOR /71 5. CLASIFICAREA VIRUSURILOR /72 6. SURSELE DE CONTAMINARE A ALIMENTELOR CU VIRUSURI /73 7. POSIBILITATEA MBOLNVIRII OMULUI PRIN CONSUMUL

ALIMENTELOR CONTAMINATE CU VIRUSURI /73 8. INTERFERONII /74

E. BACTERIOFAGI /75 F. CIANOFAGI /75 G. MICOVIRUSURI /76 H. VIROIZI /76 I. PRIONI /76

PARTEA A II-A FACTORI CARE INFLUENEAZ MICROORGANISMELE DIN ALIMENTE

A. FACTORI INTRINSECI /77 1. COMPOZIIA CHIMIC A ALIMENTULUI /77 2. CONSTITUENII ANTIMICROBIENI NATURALI /79 3. STRUCTURA ALIMENTULUI /79 4. VALOAREA aw (factorul aw) /80 5. ACIDITATEA i PH-UL /80 6. POTENIALUL OXIDOREDUCTOR (POR) I OXIGENUL MOLECULAR /81

B. FACTORI DE PRELUCRARE /82 1. TRATAREA TERMIC /82 2. IRADIEREA /84

RADIAIILE ULTRAVIOLETE (UV) /84 RADIAIILE IONIZANTE (CORPUSCULARE) /84

3. SUBSTANELE DE CONSERVARE I PRELUCRARE /85 4. MODIFICRILE COMPOZIIEI FIZICO-CHIMICE A ALIMENTELOR

DETERMINATE DE PRELUCRARE /85 5. CONTAMINAREA ALIMENTELOR N TIMPUL PRELUCRRII /86

C. FACTORI EXTRINSECI /86 1. TEMPERATURA DE DEPOZITARE /86

REFRIGERAREA /87 CONGELAREA /87

2. PRESIUNEA VAPORILOR DE AP N SPAIILE DE DEPOZITARE /87 3. PRESIUNEA GAZELOR DIN SPAIUL DE DEPOZITARE /87

D. FACTORI IMPLICII /88 1. RATA SPECIFIC DE MULTIPLICARE /88 2. SIMBIOZA /88 3. ANTAGONISMUL /89 4. SUCCESIUNILE MICROBIENE /89

5

PARTEA I MICROBIOLOGIE GENERAL

A. OBIECTUL DE STUDIU

DEFINIIE. Microbiologia este tiina care se ocup cu studiul microorganismelor, organisme de dimensiuni foarte mici, vizibile numai cu aparate optice capabile de a mrii obiectele pe care le examineaz de zeci, sute, mii sau zeci i sute de mii de ori. Microorganismele au, de regul, organizare unicelular sau subcelular i o structur relativ simpl. Denumirea pe care o poart se datoreaz tocmai dimensiunilor lor foarte mici: micro = mic; bios = via; deci, vieuitoare mici. Pentru vizualizarea majoritii acestor vieuitoare se folosesc aparate optice speciale: lupa, microscopul optic, ultramicroscopul (microscopul electronic).

Microorganismele sunt reprezentate de alge, fungi, bacterii, virusuri, viroizi i prioni. Din datele de care dispunem n prezent, se apreciaz c microorganismele sunt cele mai vechi,

mai numeroase i mai diversificate forme de via de pe pmnt. Dac apariia vieii pe pmnt se pare c are o vechime de 3 4 miliarde de ani, studiile au demonstrat existena unor bacterii metanogene sau a unor clostridii n lava vulcanic pietrificat de cel puin 2 miliarde de ani.

Microbiologia a progresat continuu de la cunotine simple, empirice, pn la nivelul unei tiine moderne, de mare finee i precizie, cu aplicaii practice nebnuite, ceea ce a fcut posibil cunoaterea etiologiei, prevenirea i tratamentul bolilor omului, animalelor i plantelor, ca i punerea la punct a unor tehnologii eficiente pentru fabricarea i conservarea multor produse alimentare sau furajere. Progresele obinute n tehnologia ADN-ului n ultimii 30 de ani, bazat pe cunotinele de genetic molecular microbian, fac astzi posibil inserarea de material genetic provenit de la orice organism viu n bacterii selecionate i adaptate pentru a realiza efecte sau produse normale la celula donatoare, ca de exemplu, posibilitatea unor tulpini de Escherichia Coli modificate genetic de a sintetiza compui de tipul anticorpilor.

B. BACTERII

Generaliti. Lumea vie a fost mprit de Linne (1707 - 1778) n cele dou regnuri: vegetal i animal.

Unitatea structural a lumii vii s-a considerat a fi celula (Teoria celular a lui Schwan 1839). Cu ct aceste vieuitoare sunt mai mici i trec spre lumea invizibil a microorganismelor, cu att asemnrile dintre ele sunt mai mari. Totui i n cadrul microorganismelor exist suficiente deosebiri de structur i fiziologie, ceea ce au permis s fie mprite n mai multe diviziuni:

- protozoare, microorganisme din regnul animal, unicelulare cu organizare eucariot, - fungi sau micei, microorganisme din regnul vegetal, unicelulare cu organizare

eucariot, - bacterii, mai mici i mai rudimentare ca organizare dect primele dou diviziuni cu

nucleu procariot. Ele au un perete celular ceea ce le difereniaz de protozoare i o

6

structur chimic special a peretelui celular, diferit de aceea a peretelui vegetal al miceilor. Aceste deosebiri au determinat pe specialiti s ncadreze bacteriiile ntr-un al 3-lea regn al lumii vii, regnul Procaryota,

- virusuri, microorganisme subcelulare, care formeaz o a 4-a categorie de microorganisme, reprezentate de nite corpusculi submicroscopici cu o structur i mai rudimentar, lipsit de perete i alte componente citoplasmatice caracteristice bacteriilor, formate dintr-un element genetic, ARN sau ADN, cu o fiziologie total diferit, lipsite de sisteme enzimatice, parazite obligatorii pe alte celule vegetale, animale sau pe bacterii i care formeaz un al 4-lea regn al lumii vii numit Vira.

Reproducerea lor se face, n general, prin diviziune simpl i mai rar prin nmugurire sau pe cale sexuat. n natur pot exista sub dou forme biologice: ca celul vegetativ, identic cu celula bacterian complet, caracteristic, dotat cu toate caracteristicile speciei i ca spor, care este o form de rezisten fa de unii factori de mediu, dar care nu se multiplic i care are celelalte funcii vitale n stare dormant.

1. MORFOLOGIA I BIOLOGIA CELULEI BACTERIENE VEGETATIVE Bacteriile sunt organisme unicelulare asexuate, celula somatic fiind i celula

reproductoare, procariote (cu nucleu fr membran alctuit dintr-un singur cromozom), haploide (cu un singur set de gene), cu dviziune direct.

La o celul bacterian se disting: - structuri eseniale fiecrei celule: nucleu, citoplasm, membran citoplasmatic, ceea

ce formeaz protoplastul i reprezint cea mai rudimentar form de existen a bacteriilor, perete bacterian rigid ntlnit la toate bacteriile tipice i care protejeaz protoplastul;

- structuri neeseniale pentru existena bacteriilor i prezente numai la unele specii: capsula sau cel de-al 3-lea nveli, cilii sau flagelii i fimbriile sau pilii.

Sporul reprezint o a doua form de existen ntlnit numai la unele specii i este forma de rezisten care apare cnd bacteria ntlnete condiii nefavorabile multiplicrii.

1.1. CONSTANTELE MORFOLOGICE I FIZICE ALE CELULEI BACTERIENE 1.1.1. Forma Bacteriile pot avea urmtoarele forme: - principale: coc sferic sau oval; bacil bastona drept; vibion baston ncurbat i cu

capetele ascuite; spirochet un fir spiralat; - forme intermediare: cocoid coc uor alungit; cocobacil bacil scurt cu capetele

rotunjite; - forme asimetrice: forma bombat la una sau la ambele extremiti, cu aspect de mciuc

respectiv de haltere; forma lanceolat, forma reniform.

1.1.2. Dimensiunile Bacteriile tipice au o lungime de 1-8 micrometri (m) sau microni () i o grosime de 0,1-

0,2 micrometri. Unele bacterii pot avea lungimi de pn la 15 m. Cele mai mici bacterii sunt micoplasmele i rickettsiile. n general exist o corelaie direct ntre lungime i grosime. Astfel, speciile de Bacillus i Clostridium care sunt cele mai lungi sunt i cele mai groase.

7

1.1.3. Modurile de grupare Pe lng numeroase specii de bacterii care nu au un mod caracteristic de grupare, exist

unele specii care au n mod constant un anumit mod de grupare care, uneori, reprezint un criteriu foarte util pentru identificarea lor. Modul de grupare este determinat, de regul, de nedeslipirea (nesepararea) celulelor dup multiplicarea lor prin diviziune direct. Principalele moduri de grupare ntlnite la bacterii sunt:

- gruparea diplo, n care celulele sunt aezate cte dou: diplococ (2 coci), diplobacil (2 bacili). Diplobacilii pot fi aezai unul n prelungirea celuilalt n linie dreapt sau la unele specii sunt aezai n unghi, cu aspect de litera V (bacilul rujetului);

- grupara strepto celulele bacteriene sunt aezate n lan: streptococ (lan format din coci), streptobacil (lan format din bacili);

- tetrada: 4 coci aezai sub forma a doi diplococi alturai; - sarcina: 8 coci aezai ca dou tetrade suprapuse; - stafilococ: grmezi de coci aezai ca boabele unui ciorchine de struguri; - gruparea n palisad ca un grilaj: mai muli bacili aezai paralel ca dinii unui pieptene; - gruparea n litere chinezeti: grup de civa bacili aezai neregulat, alturat sau

suprapui, unii ncrucindu-se; - filamentul reprezint un plasmodiu, multiplicarea citoplasmei i a materialului nuclear nefiind

urmat de constituirea pereilor celulari i a membranelor citoplasmatice separatoare ntre celule; - formele ramificate. Apar foarte rar la bacterii i reprezint plasmodii, caracteristice

actinomicetelor. De reinut c formele, dimensiunile i modurile de grupare a bacteriilor menionate mai sus

nu sunt fixe, exclusiviste, polimorfismul trebuind acceptat cu diferite grade de intensitate la multe specii bacteriene puse n condiii diferite de mediu.

1.1.4. Constantele fizice Aceste constante sunt suprafaa, volumul i greutatea specific. Ele difer de la specie la

specie, dar la fiecare specie ele au n general aceleai valori, ceea ce le deosebete pe unele de altele. Raportul dintre suprafa i greutate, precum i cel dintre suprafa i volum are la bacterii valori mult mai mari dect n cazul celulelor organismului animalelor superioare. Densitatea bacteriilor umede este apropiat de aceea a apei (1,07 1,82). Ea scade n cazul unui coninut mare n lipide i crete n cazul unui coninut mare de protide i sruri.

1.2. STRUCTURA CELULEI BACTERIENE Dei bacteriile sunt organisme foarte mici, au o structur complex care a putut fi pus n

eviden prin mijloacele moderne de investigaie. Celula bacterian este constituit, n mare, dintr-un nveli i un coninut, iar la unele specii, pot exista i organite.

1.2.1. nveliul nveliul este format din urmtoarele componente: - membrana citoplasmatic, - peretele celular, - capsula, prezent numai la unele specii. Membrana citoplasmatic Este o membran fin, groas de 7,5 10 nanometrii, elastic, lipsit de rezisten

mecanic, de structur lipoproteic (40% lipide, 60% proteine), cu cantiti foarte mici de hidrai

8

de carbon. Are o structur trilamelar. Scheletul ei biochimic este format dintr-un strat dublu de fosfolipide amfipatice cu orientare polar a regiunilor hidrofile, unul ctre exterior, cellalt ctre interior i a celor hidrofobe aezate fa n fa. Acest strat fosfolipidic bimolecular confer membranei rolul de barier osmotic i reprezint, n acelai timp, sediu pentru proteinele enzimatice care se pot deplasa ctre interiorul i exteriorul celulei

Membrana citoplasmatic a bacteriilor, cu excepia acelei a micoplasmelor nu conine steroli, iar glucidele sunt prezente n cantiti foarte mici.

Membrana citoplasmatic ndeplinete urmtoarele roluri i funcii: - separ coninutul celulei de mediul n care se gsete, - este sediul majoritii sistemelor enzimatice selective prin care se realizeaz respiraia i

unele procese de sintez celular, - are rol de filtru selectiv permind accesul n celul a unor substane nutritive i

eliminarea metaboliilor, procese reglate enzimatic prin permeaze i sisteme de transport, Peretele celular Peretele celular este o a doua component a nveliului celular i ader de membrana

citoplasmatic prin stratul su bazal. El este situat la exteriorul membranei citoplasmatice, este mai gros dect aceasta (15 35 i chiar 80 nanometri). Spre deosebire de peretele celulelor vegetale, peretele celulei bacteriene nu conine celuloz, avnd ns unii compui chimici specifici, abseni la peretele celulelor altor vieuitoare. Structura sa morfochimic i determin grosimea, rigiditatea i afinitatea tinctorial. Peretele bacteriilor Gram pozitive este mai gros i mai rigid dect cel al bacteriilor Gram negative, care este mai subire i mai elastic.

Capsula Capsula este o component a nveliului bacterian prezent numai n anumite condiii i numai

la unele specii. Astfel speciile patogene capsuleaz numai n organism sau n cazul cultivrii lor pe medii de cultur care conin anumite substane organice ca serul, lichidul ascitic sau plasma. Ea se formeaz n jurul celulelor bacteriene sub forma unor matrice fibroase, numite glicocalix.

Rolurile principale ale capsulei sunt: - reprezint factor de virulen, mpiedicnd fagocitarea bacteriilor i favoriznd, astfel,

invazivitatea. Este deci i un factor de agresivitate, - rol de adezin, permind aderarea unor bacterii de celulele indivizilor infectai, - barier fa de bacteriofagi i protozoare, - este sediul unor substane cu specificitate antigenic. Exemple: B. Anthracis, S. Pneumoniae.

1.2.2. Coninutul Coninutul celulei bacteriene este constituit din citoplasm, n care, pe lng alte structuri,

este inclus i materialul genetic sau materialul nuclear. 1.2.2.1. Materialul genetic Materialul genetic este format din genom sau material genetic nuclear, situat n centrul

citoplasmei i din plasmide. 1.2.2.2. Citoplasma Citoplasma bacterian este un sistem coloidal complex, amorf, fin granular, de consistena

unui gel, format din proteine, glucide, lipide, ap i substane minerale; nu prezint cureni i nici deplasri evidente ale elementelor componente. Ea nu are o organizare bine definit, ca aceea a celulelor eucariote, i n interiorul lor se gsesc materialul genetic i mai multe structuri cu form de granule, incluzii i vacuole. Nu conine mitocondrii i nici reticul citoplasmatic propriu zis. La

9

celulele mbtrnite, citoplasma se retract, cantitatea de ADN se reduce i i pierde treptat afinitile tinctoriale, transformndu-se n structuri granulare cu vacuole.

1.2.3. Organitele celulei bacteriene Unele specii bacteriene au la suprafaa lor nite formaiuni numite numite organite

celulare: cili i pili. Cilii sau flagelii sunt nite filamente cilindrice, de cteva ori mai lungi dect celula

bacterian pe care se afl, foarte subiri (0,01 0,02 micrometri), ondulate regulat i flexibile. Toate bacteriile ciliate sunt mobile. Din cauza grosimii lor foarte mici, ei nu se vd dect la microscopul electronic. Se coloreaz numai prin metode speciale. n practica curent bacteriile cu cili (mobile) se evideniaz prin examinarea microscopic simpl a preparatelor proaspete (o pictur de cultur n mediu lichid pus ntre lam i lamel) sau prin cultivarea n medii semisolide sau pe suprafaa mediilor solide proaspete, pe care formeaz colonii difuzibile sau cultura se dezvolt ca un film continuu (roire).

Pilii sau fimbriile Pilii sunt organite prezente numai la unele specii bacteriene i reprezint nite apendici

filamentoi, foarte subiri, diferii de cili, fiind mult mai scuri, de origine intracelular (membrana citoplasmatic), aezai foarte des pe suprafaa celulei bacteriene. Din punct de vedere chimic sunt de natur proteic, dar diferit antigenic de cea a cililor. Se ntlnesc mai des la bacteriile Gram negative, dar i la unele specii Gram pozitive (Streptococcus, Corynebacterium).

1. Ce sunt bacteriile? 2. Precizai care sunt constantele morfologice i fiziologice ale celulei bacteriene 3. Cine face parte din structura celulei bacteriene?

2. MORFOLOGIA I BIOLOGIA SPORULUI BACTERIAN Sporul bacterian este o form de rezisten ntlnit numai la unele specii de bacterii cum

sunt cele din genurile Bacillus, Clostridium i specia de coc Sporosarcina ureae. Sub aceast form bacteriile pot supravieui ani i zeci de ani n condiii nefavorabile dezvoltrii. Sporul se formeaz n interiorul celulei vegetative, de unde i denumirea de endospor. De regul dintr-o celul vegetativ ia natere un singur spor; foarte rar se pot forma doi spori ntr-o celul vegetativ (bacterii bisporulate). Sporul bacterian nu este i form de nmulire. Fac excepie actinomicetele, care de curnd au fost incluse n cadrul bacteriilor, i la care sporul reprezint o form de multiplicare ca la ciuperci.

Sporogeneza este procesul prin care o celul vegetativ se transform n spor, parcurgnd mai multe etape:

a. pregtirea celulei pentru sporogenez i care cuprinde contopirea materialului genetic nuclear i segmentarea i reorganizarea acestuia n doi cromozomi separai,

b. formarea presporului care ncepe prin formarea unui sept transversal urmare a invaginrii membranei citoplasmatice, care separ cei 2 cromozomi,

c. evoluia celor dou segmente celulare, una transformndu-se n prespor, alta n sporagiu. Menionm cteva tipuri de rezisten a sporilor bacterieni: - termorezistena: cteva zeci de minute sau chiar ore la 120C, cldur umed, sau la

180C, cldur uscat, n timp ce celulele vegetative sunt omorte, de regul, la 60C, cldur umed. Gradul de rezisten la cldur variaz ntre specii, la aceasta contribuind unii factori, ca:

10

specia bacterian, biotipul unor specii, condiiile de mediu n care a avut loc sporogeneze. La unele specii bacteriene s-a demonstrat, de exemplu, c sporii formai n medii bogate n ioni de calciu sunt mai rezisteni dect cei formai n medii lipsite de asemenea ioni;

- rezistena la uscciune; - rezistena fa de unii factori chimici: alcoolul, cloroformul, glicerina (glicerina asigur

conservarea lor). Menionm c la unele specii bacteriene toxinogeneza sau antibioticogeneza sunt strns

legate de capacitatea lor de a sporula (C. histolyticum respectiv B. subtilis).

3. FIZIOLOGIA BACTERIILOR 3.1. COMPOZIIA CHIMIC A BACTERIILOR Celula bacterian este constituit din elemente i compui chimici anorganici cu molecula mic, ce

se ntlnesc n toate organismele vii i n compuii organici moleculari cu diverse grade de complexitate structural, specifici bacteriilor i, deci, diferii de cei ai organismelor vegetale i animale. Ea conine 3000 6000 tipuri de molecule diferite, din care cca. jumtate aparin compuilor anorganici cu mas molecular mic, restul reprezentnd compui anorganici.

Compuii anorganici cu molecul mic sunt: a. Apa care reprezint 75 85% din greutatea umed a celulei bacteriene. Ea se

gsete n stare liber sau activ sau legat de diferii compui chimici.. b. Substanele minerale reprezint 2 30% din greutatea uscat a bacteriilor,

proporia lor putnd varia uor de la specie la specie, n funcie de vrsta culturii i compoziia chimic a mediului n care se dezvolt.

Ele ndeplinesc numeroase funcii i anume: - favorizeaz schimburile cu mediul, - asigur presiunea osmotic la nivelul membranei citoplasmatice, - activeaz unele sisteme enzimatice, - contribuie la reglarea pH-ului i a potenialului oxido-reductor, - intr n structura multor constitueni celulari.

3.2. METABOLISMUL BACTERIAN 3.2.1. Nutriia la bacterii Nutriia la bacterii reprezint totalitatea proceselor metabolice prin care bacteriile i asigur

necesitile energetice i plastice, de sintez a constituienilor celulari, de activare a enzimelor i a sistemelor de transport. Nutrienii sunt substane ale cror soluii pot traversa membrana citoplasmatic pentru a fi folosite n mecanismele metabolice n vederea creterii i multiplicrii celulare.

n funcie de sursele energetice i plastice pe care le pot folosi pentru nutriie, bacteriile se mpart n dou mari grupe sau tipuri nutritive:

- bacterii fototrofe (fotobacterii) care folosesc energia luminoas i triesc la lumin. Ele conin cloroplaste cu pigmeni de tip clorofile, adevrate organite de fotosintez, similare celor ale plantelor;

- bacterii chimiotrofe (chimiosintetizante) care i procur energia prin procese de oxidoreducere, catalizate enzimatic, i care triesc n ntuneric (scotobacterii). Ele sunt lipsite de pigmeni fotosintetizani.

Totalitatea proceselor prin care celula bacterian preia prin mediul ambiant diferitele substane i le folosete pentru biosintez i cretere, procurndu-i energia indispensabil

11

acestora, constituie metabolismul bacterian. Pe baza reaciilor metabolice se asigur nutriia i multiplicarea bacteriilor.

Metabolismul bacterian se realizeaz printr-un lan de reacii biochimice interdependente, care decurg ntr-o succesiune strict urmnd dou ci: calea reaciilor catabolice i calea anabolic. La acestea s-ar putea aduga o a treia cale, cea a reaciilor amfibiotice, care servesc n funcie de nevoi, ambele ci ale metabolismului.

3.2.2. Catabolismul Reaciile catabolice necesare producerii energiei constau ntr-o prim etap n degradarea

enzimatic a unor substane din mediul n care se gsesc bacteriile. Din aceast degradare rezult cantiti importante de energie i hidrogenSursele energetice principale le formeaz proteinele, n principal polipeptidele, glucidele i lipidele. Ele sunt descompuse de bacterii pe cale enzimatic prin reacii de oxidoreducere biologic care, n general, au loc n 3 faze principale:

Faza 1 n care macromoleculele sunt descompuse n unitile lor de construcie, astfel: proteinele n aminoacizi, polizaharidele n monozaharide, iar lipidele n acizi grai. Cantitatea de energie eliberat n aceast faz este foarte mic

Faza 2 n care are loc o degradare incomplet a aminoacizilor, monozaharidelor i a acizilor grai, rezultnd produi intermediari.

Faza 3 n care produii intermediari sunt simplificai n CO2 i H2O pe calea ciclului acizilor tricarboxilici. n aceast faz rezult cantitatea cea mai mare de energie.

3.2.3. Anabolismul Reaciile anabolice sunt reaciile biochimice necesare biosintezei constituenilor celulari

care asigur creterea i reproducerea bacteriilor. Pentru aceasta, unele substane din mediu i unii compui din activitatea catabolic sunt luai sub form de precursori i intr n reaciile anabolice activate de enzimele biosintetizante. Din aceste reacii rezult constituenii celulari conform codificrilor nscrise n genomul celular. Prin reaciile anabolice se reconstituie compuii descompui prin reaciile catabolice, dar dup alt cod genetic caracteristic fiecrei specii bacteriene.

3.2.4. Respiraia (metabolismul energetic) Respiraia la bacterii reprezint a doua cale de procurare a energiei necesare activitii

biosintetice a celulei bacteriene, prima fiind catabolismul. Ea reprezint suma reaciilor biochimice aerobe sau anaerobe productoare de energie.

n funcie de natura acceptorului final, respiraia este, n mare, aerob sau anaerob. Respiraia aerob sau oxibiotic are ca acceptor final de H2 sau electroni, oxigenul sau alte

substane. Ea necesit existena membranei celulare. Respiraia anaerob sau anoxibiotic are ca acceptor final de hidrogen sau electroni orice

substan anorganic diferit de oxigen sau orice substan organic. Un exemplu de asemenea tip de respiraie l reprezint fermentaia.

n funcie de acceptorii posibili ai hidrogenului (electronilor), de modul i etapele transferului, la bacterii se disting mai multe tipuri i subtipuri respiratorii.

a. Tipul aerob determinat de posibilitatea folosirii oxigenului ca acceptor de hidrogen. n etapele intermediare intervin citocromii i citocromoxidazele, iar la unele bacterii i diferite coenzime i flavoproteine. n final rezult H2O sau H2O2.

12

n prezena catalazelor i peroxidazelor, H2O2 se descompune n ap i oxigen cu producere de energie.

Subtipul strict aerob se ntlnete la bacteriile care nu se pot dezvolta dect n prezena oxigenului, cum sunt B.subtilis i M.tuberculosis.

b. Tipul anaerob este prezent la bacteriile care folosesc alt acceptor de hidrogen dect oxigenul. Acceptor pentru asemenea tip respirator pot fi: un compus organic sau anorganic (ex. NO3- SO42+, CO2). Bacteriile cu asemenea tip respirator sunt lipsite de enzime fixatoare i activatoare ale oxigenului (citocromi, oxidaze) sau de enzime capabile s descompun H2O2 (peroxidaze, catalaze).

Subtipul strict anaerob se ntlnete la bacteriile pentru care oxigenul este toxic, sum sunt C.tetani, C.botulinum, Fusobacterium necrophorum, Veillonella.

Subtipul microaerofil se ntlnete la bacteriile care tolereaz cantitile mici de oxigen sau chiar au nevoie de cantiti mici de oxigen. Ex. Campylobacter.

c. Tipul aerob i facultativ anaerob este caracteristic pentru bacteriile care se dezvolt mai bine n prezena oxigenului, dar nu pot s se dezvolte i n condiii anaerobe. Deci, este vorba de bacterii care pot prezenta ambele tipuri respiratorii (E.coli, S.aureus).

3.3. CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR 3.3.1. Creterea bacteriilor Creterea este un proces biologic care determin mrirea volumului organismelor i este

rezultatul metabolismului de sintez ce face posibil adugarea la celul de substan nou. Creterea se poate face uni sau multidimensional. n funcie de locul i modul de depunere a substanei noi n celul, ea poate fi:

- creterea la o singur extremitate a celulei, - creterea la ambele extremiti, - creterea n vecintatea viitorului sept de diviziune, - creterea prin depunerea substanei noi, diseminat i intercalat printre constituenii

preexisteni (intususcepiune). Creterea la bacterii are dou nelesuri: mrirea volumului celular sau creterea propriu

zis i sporirea numrului de indivizi dintr-o populaie dat sau multiplicarea. Nu orice cretere n volum este consecina creterii. Creterea n volum a unor celule bacteriene poate fi consecina acumulrii de substane de rezerv sau a mririi coninutului n ap.

3.3.2. Multiplicarea bacteriilor Bacteriile se multiplic pe mai multe ci:

a. Multiplicarea prin diviziune direct, simpl sau sciziparitate, este calea cea mai frecvent i const n scindarea celulei mame n dou celule fiice identice diviziune izomorf sau inegale diviziune heteromorf -. n cazul bacteriilor alungite bacili, spirili diviziunea se face perpendicular pe axul longitudinal al celulei, iar la coci se face n 1, 2 sau 3 planuri perpendiculare ntre ele, n mod succesiv, ceea ce determin i modul caracteristic de grupare a celulelor fiice: diplo, tetrad respectiv sarcin, n cazul c diviziunea nu este urmat de desprinderea celulelor rezultate.

13

b. Multiplicarea prin corpi elementari se ntlnete la micoplasme (chlamidii) ca o a doua form de multiplicare, prima fiind, de asemenea, diviziunea direct, i ar presupune existena unui ciclu vital.

c. Multiplicarea prin nmugurire sau ramificare se ntlnete rar la bacterii, este caracteristic pentru actinomicete

d. Multiplicarea prin fragmentare se observ la cele mai multe actinomicete filamentoase cu ramificaii adevrate.

e. Multiplicarea prin spori este ntlnit numai la unele actinomicete care formeaz exospori sau spori de dispersare de tip asexuat, dispui pe hifele aeriene, n lanuri sau n vezicule sporale speciale (sporofori).

3.3.3. Dinamica multiplicrii bacteriilor n/pe mediile de cultur Multiplicarea bacteriilor n mediile de cultur este nlocuit deseori cu termenii de cretere

sau dezvoltare, ceea ce nu este corect. Prin multiplicarea bacteriilor n mediile de cultur se obine o cultur bacterian. Populaia de bacterii care se dezvolt n mediile de cultur, ca urmare a diviziunii celulare, crete n progresie geometric cu raia 2. Timpul necesar pentru dublarea unei populaii bacteriene se numete timp de (pe) generaie sau timp de dublare. Acesta poate fi mai scurt sau mai lung n funcie de specia bacterian i de condiiile de cultivare i el este determinat genetic. La majoritatea speciilor bacteriene, n condiii optime de dezvoltare, timpul pe generaie este de aproximativ 20 minute. Pentru unele specii bacteriene acest timp este mult mai mare (ex. 12 27 ore pentru Mycobacterium tuberculosis).

1. Ce este sporul bacterian i care este morfologia i biologia acestuia? 2. Cum are loc creterea i multiplicarea bacteriilor? 3. Care este compoziia chimic a bacteriilor?

4. TAXONOMIA BACTERIILOR Taxonomia sau sistematic are urmtoarele obiective de studiu:

- stabilirea criteriilor taxonomice, a conduitei de identificare a categoriilor taxonomice cunoscute i a metodologiei de identificare i omologare a unitilor necunoscute,

- clasificarea organismelor vii n grupe i uniti taxonomice pe baza asemnrilor i interrelaiilor lor naturale,

n prezent, cunotinele dobndite n domeniul biologiei celulare i moleculare au determinat diferenierea organismelor vii, pe baza structurii i funciilor celulare, n organisme procariote i eucariote.

Procariotele: - cuprind bacteriile i cianobacteriile, - celulele sunt mari de 1 10 microni, - sunt aerobe i anaerobe,

Eucariotele: - cuprind organisme unicelulare sau pluricelulare cu nucleu delimitat de membran

proprie, - celulele au 10 100 microni lungime, - sunt aerobe,

14

Organismele celulare cu structur procariot constituie regnul Procaryotae, ai crui membrii pot constitui obiectul unei clasificri cu urmtoarele categorii i grade taxonomice, de exemplu, pentru specia Escherichia Coli:

4.1. CRITERIILE DE CLASIFICARE A BACTERIILOR Treptat, caracterele anatomice sau fiziologice, puse n eviden prin teste simple i practice

au concurat i concur la clasificarea noilor izolate. Aceste caractere au devenit cu timpul tot mai numeroase i mai specifice, asigurnd i n zilele noastre repartizarea noilor izolate n grupele taxonomice cele mai reale. Dintre aceste caractere, menionm:

- aspectele morfologice: forma, dimensiunile, cilii, capsula, sporii, - aspectele tinctoriale: coloraia Gram, Ziehl-Nielsen, impregnare argentic, - tipurile trofice: fototrofe, chimiotrofe, litotrofe, autotrofe s.a., - tipurile respiratorii: aerob, anaerob, microaerofil s.a., - metabolizarea diferitelor substane: glucide, proteine, lipide, aminoacizi s.a., - sensibilitatea sau rezistena fa de diferii ageni antimicrobieni, - patogenitatea fa de animalele de laborator, - antigenitatea.

4.2. UNITATEA TAXONOMIC (SPECIA) Taxonii de rang superior speciei sunt: regnul, ncrengtura, clasa, ordinul, familia, tribul i

genul. n practic nu se opereaz cu toi aceti taxoni. Ordinul i tribul n cazul bacteriilor, sunt foarte rar folosite, cele mai multe grupe de bacterii nefiind ncadrate n asemenea taxoni. Familia este un taxon folosit mai des, dar pn n prezent numeroase genuri de bacterii nu au fost nc ncadrate n familii. Taxonul cel mai frecvent folosit este genul, iar de multe ori ncadrarea bacteriilor n gen se consider suficient pentru precizarea unui diagnostic bacteriologic.

Subdiviziunile speciei bacteriene au aprut din cauza existenei, n cadrul speciei, ntre diverse tulpini, a unor diferene individuale. Aceste subdiviziuni sunt: subspecia i varianta sau tipul.

Subspecia implic diferene care privesc caractere mai importante, fr a se depi limitele admise pentru specie.

Varianta sau tipul reprezint tulpini care se abat de la genotipul speciei pe baza unui singur caracter diferenial sau al unui numr restrns de caractere. Ea poate fi considerat un taxon infrasubspecific cu care se opereaz cel mai frecvent n activitatea practic. Din cauza folosirii frecvente, acest taxon a fost divizat de Staley i Krieg (1984) n mai multe subvariante sau subtipuri:

- biovar sau biotip are proprieti biochimice sau fiziologice speciale fa de specia tip, - serovar sau serotip are particulariti antigenice, - pathovar sau pathotip are particulariti de patogenitate, - fagovar sau fagotip are diferene de sensibilitate fa de anumii bacteriofagi, - morfovar sau morfotip are unele caractere morfologice deosebite.

Regnul: Diviziunea: Clasa: Ordinul: Familia: Genul: Specia:

Procaryotae Gracilicutes Scotobacteria Nu este utilizat Enterobacteriaceae Escherichia Escherichia coli

15

Tulpina, sua sau clona bacterian este o populaie format dintr-o cultur pur aparinnd unei singure specii, provenit dintr-o singur izolare i dintr-un mediu natural. Prin comparare cu organismele superioare ea are valoarea unui individ, pentru c n bacteriologie se lucreaz cu tulpini (populaii) i nu cu celule bacteriene, din cauza mrimii lor reduse i dificultilor de manipulare a celulelor izolate.Cultura bacterian reprezint totalitatea bacteriilor crescute ntr-un mediu de cultur artificial.Cultura pur bacterian este o cultur bacterian n care toi indivizii care o alctuiesc au aceiai structur i puritate genetic.

5. NOMENCLATURA BACTERIILOR Bacteriile au denumiri tiinifice n limba latin. ncrengtura i clasa au denumiri constituite dintr-un nume generic i sufixe care pot varia.

n ultimul timp se opereaz rar cu aceste categorii taxonomice. Exemple: ncrengturi: Gracilicutes, Firmicutes, Mendosicutes Clase : Scotobacteria, Firmibacteria, Archaeobacteria. Ordinul este denumit, de regul, cu numele genului celui mai reprezentativ la care se

adaug sufixul ales. Exemple: Spirochetales, Actinomicetales, Rickettsiales. Familia, de asemenea, este denumit cu numele genului celui mai reprezentativ pentru

gruparea taxonomic respectiv, la care se adaug sufixul aceae. Exemple: Spirochetaceae, Actinomicetaceae, Rickettsiaceae.

Genul este denumit cu un substantiv la cazul nominativ, provenit de la un caracter morfologic al bacteriei (Bacillus, Vibrio, Streptococcus); alte caractere ale bacteriei (Citrobacter, Lactobacillus); numele bacteriologului care a izolat primul bacteria respectiv sau a studiat-o aprofundat (Pasteurella, Nocardia, Neisseria). Cnd numele genului precede pe cel al speciei se poate scrie ntreg sau numai cu iniiala urmat de un punct.

Specia este denumit prin dou cuvinte: numele genului la cazul nominativ i un al doilea, format dintr-un adjectiv acordat cu genul (Staphilococcus aureus, Staphilococcus intermedius, Pasteurella multocida) sau de un substantiv la cazul genitiv (Escherichia coli, Bacillus anthracis, Spirochaeta gallinarum, Streptococcus bovis) sau de un cuvnt care arat un caracter cultural sau biochimic (Lactobacillus acidophilus, Bacillus cereus, Clostridium rubrum

Tulpinile bacteriene la care s-a identificat genul dar nu i specia, se noteaz cu numele genului urmat de prescurtarea sp pentru singular sau spp pentru plural (ex. Bacillus sp.).

Subspeciile sau variantele se denumesc adugnd dup numele speciei cuvntul subspecies (subsp) respectiv varietas (var) urmat de numele subspeciei sau variantei (ex. Campylobacter fetus, subspecies jejuni, Bacillus cereus varietas mycoides).

Tulpinile se noteaz prin numere sau simboluri. Numerele reprezint, de regul, numrul sub care s-au nregistrat probele din care s-au izolat tulpinile. Simbolurile reprezint nume de localiti sau de indivizi de la care s-au izolat tulpinile.

6. DESCRIEREA PRINCIPALELOR GRUPE DE BACTERII NTLNITE N ALIMENTE

6.1. GRUPA BACTERIILOR AEROBE SAU MICROAEROFILE, MOBILE, GRAM NEGATIVE, CU FORM HELICOIDAL SAU VIBRIONIC

6.1.1. Genul Campylobacter

16

Taxonomia genului Campylobacter a fost mult discutat i revizuit n ultima vreme i putem afirma c ea va suporta modificri i n urmtorii ani. De la 2-3 specii care-l formau, pn nu demult, genul Campylobacter cuprinde n prezent mai mult de 20 specii. Genurile Campylobacter, Arcobacter i Helicobacter sunt incluse n familia Campylobacteriaceae i superfamilia VI ARNr mprit n 3 grupe de omologie ARNr, n care:

Grupa I cuprinde 20 specii care formeaz genul Campylobacter din care fac parte speciile cu semnificaie patogen major pentru om i/sau animale: C.jejuni, C.coli, C.fetus s.fetus (intestinalis), C.fetus s.venerealis, C.lari, C.ureolyticus.

Grupa II cuprinde 4 specii din genul Arcobacter fr importan pentru patologia uman i animal.

Grupa III cuprinde 19 specii din genurile Helicobacter, Walinella, Gastrospirillum. Din aceste 19 specii, H. pylori (piloridis) are semnificaie pentru patologia omului.

n Bergeys Manual, Determinative Bacteriology, ediia 9-a, 1994, speciile din grupele i genurile menionate sunt introduse n grupa 2 de microorganisme: Bacterii aerobe sau microaerofile, mobile, Gram negative, de form helicoidal sau vibrionic.

Genul Campylobacter cuprinde bacterii Gram-negative, cu form de bastonae subiri, curbate, n spiral sau n S, groase de 0,2-0,5 microni i lungi de 0,5-5 microni, microaerofile, mobile datorit unui flagel polar care determin micri n vril (nainte prin nurubare) caracteristice. n culturile vechi i aerobioz bacteriile devin cocoide, imobile i necultivabile. Nu fermenteaz i nu oxideaz hidraii de carbon i au ADN-ul cu un coninut de G+C de 29-36 moli%. Sunt oxidaz pozitive, reduc nitraii, nu hidrolizeaz gelatina i ureea i dau reacia VP i RM negativ. Se pot dezvolta la 250450.

Prezena sau absena catalazei mparte principalele specii de Campylobacter n: a. Specii catalaz pozitive: Campylobacter fetus s.fetus (intestinalis) considerat taxonul tip al genului i purtat la

nivelul intestinului rumegtoarelor la care produce avortul sporadic, iar la om infecii sistemice cu septicemii, artrite, meningite, meningoencefalite, avorturi n special la persoanele imunodeficitare sau cu antecedente de alcoolism, cu ciroz, diabet sau cardiopatii.

Campylobacter fetus s.venerealis cu habitatul natural n mucoasa genital a bovinelor i care este agentul major al sterilitii i al avortului la bovine.

Campylobacter jejuni, specia dominant a genului prin semnificaia sa sanitar pentru om, fiind responsabil de 85-90% din cazurile de gastroenterit acut campilobacterian la om, cu caracter epidemiologic de toxiinfecie alimentar, iar uneori implicat i n infeciile urinare. Este larg rspndit la psri i mamifere, cele mai multe cu rol de purttor intestinal.

Campylobacter coli, considerat mult timp o variant biochimic a C.jejuni, a fost separat ca specie distinct, pe baza hibridizrii ADN. Este implicat n 5-15% din cazurile de enterit campilobacterian la om. Ea este gzduit n intestinul diferitelor animale, gazda ei obinuit fiind porcul. Se dezvolt mai uor pe mediile de cultur dect alte specii i trece mai lent n forme cocoide. Se deosebete de C.jejuni pe baza incapacitii sale de a hidroliza hipuratul.

Campylobacter lari (laridis) se gsete frecvent pe carcasele, pipotele i ficaii de pasre. Produce enterite la om i psri. Ca i C.coli se poate dezvolta la 3005 C i nu hidrolizeaz hipuratul.

b. Specii catalaz negative: Campylobacter sputorum cu 3 subspecii (sputorum, bubulus i mucosalis), cu toleran

mare fa de oxigen, capabile s reduc nitraii i s produc H2S. Campylobacter concisus care produce gingivite i periodontite la om.

17

Campilobacteriile catalaz pozitive se mpart n dou grupe n funcie de comportarea lor fa de temperatur:

- specii care se dezvolt la 250C, dar nu i la 420C. Ex.: C.fetus. - specii care se dezvolt la 420C, dar nu i la 250C, numite campilobacterii termotolerante i

care sunt principalii ageni ai gastroenteritelor umane. Ele sunt reprezentate de mai multe specii dintre care cele mai importante sunt: C.jejuni, C.coli, C.lari, C.upsaliensis, C.lyoilei, C.hyointestinalis i C.showae. Pentru igiena alimentar primele dou specii sunt cele mai importante.

Diferenierea speciilor de campilobacterii cu semnificaie mai mare pentru patologia omului se poate face pe baza criteriilor consemnate n tabelul urmtor.

Criterii de difereniere a speciilor de campilobacterii (Campylobacter, Arcobacter i Helicobacter) patogene pentru om

Criterii

C.jej

uni

C.co

li

C.la

ri

C.u

psal

ien

sis

C.fe

tus

s.fe

tus

C.hy

oin

test

inal

is s.

hyo

inte

stin

alis

C.jej

uni s

.do

ylei

C.co

nci

cus

C.re

ctus

A.cr

yaer

oph

ilus

A.bu

tzle

ri

H.py

lori

Oxidaza + + + + + + + + + + + Catalaza + + +

-(m) + m + m + m + Ureaza

+ Hemolizina alfa + m + + m + + Hidroliza hipuratului + + Creterea la 25oC

+ +

Glucoza ( TSI )

Lactoza

Zaharoza

Gaze

H2S Acid nalidixic S S R S R R S (R) R S S (R) Cefalotina R R R S S S S S S R R S Cafapetazona R R R S S S S S S R R S Carbecilina R S R/S S S S S S S R R S

+ = > 99% pozitive, = > 99% negative, = > 50% pozitive, m = > 50% negative, R = rezistent, S = sensibil, (R) = de regul rezistent, R/S = 50% rezistent i 50% sensibil

Datele descrise n cele de mai jos se refer aproape exclusiv la C.jejuni, specie cu implicaiile cele mai mari n patologia uman i principalul agent al toxiinfeciilor alimentare campilobacteriene.

O alt structur de suprafa a C.jejuni care poate juca un rol n patogeneza bacteriei este flagelul. Determinani de virulen ai bacteriei pot fi codificai pe baza informaiei genetice prezente pe plasmide, dintre care dou s-au dovedit a fi caracteristice: una care induce rezistena fa de tetraciclin i alta care induce producerea de enterotoxin.

Capacitatea patogen a C.jejuni variaz dup tulpin i este legat de mai muli factori:

18

a. Producerea de toxine: enterotoxina, citotoxina, endotoxina. Enterotoxina C.jejuni este asemntoare cu enterotoxina holeric. Aproximativ 75% din tulpinile izolate din materiale clinice produc aceast toxin, n timp ce cele izolate de la purttori nu o produc sau o produc foarte rar.

b. Structura suprafeei celulare format, n principal, de LPS i OMP contribuie la patogenitatea bacteriei, ajutnd bacteria s nving mecanismele de aprare ale celulei gazd i asigurnd aderena i invazia bacteriei n celula gazd.

c. Rspunsul fagocitar al macrofagelor fa de C.jejuni constituie un alt factor implicat n patogeneza bacteriei. Supravieuirea n monocitele din sngele periferic timp de 6-7 zile, socotit ca o evaziune fagocitar, contribuie la virulena bacteriei.

d. Folosirea fierului de ctre C.jejuni este de asemenea un factor de virulen. Producerea de toxine de ctre C.jejuni este mrit n medii cu exces de fier.

C.jejuni i manifest patogenitatea prin dou mecanisme principale: colonizarea i procesul invaziv. Colonizarea const n aderarea i multiplicarea bacteriei pe suprafaa mucoasei intestinale i elaborarea toxinelor, n special a enterotoxinei care determin un aflux de lichid i de electrolii, urmat de apariia diareei apoase.

C.jejuni, n mod natural, produce toxiinfecii alimentare la om manifestate clinic i anatomopatologic ca enterit, enterocolit sau gastroenterocolit acut.

Habitatul su obinuit l formeaz intestinul numeroaselor specii de animale i psri (60% la purcei, 14-91% la puii de gin, 35% la raele slbatice). Bacteria contamineaz, odat cu fecalele, suprafaa carcaselor care devin surs de infecie pentru om (20, 21, 181, 197).

Condiii de cultivare i de izolare din materiale patologice i alimente. C.jejuni este o bacterie microaerofil i se dezvolt optim ntr-o atmosfer care conine 5% oxigen, 10 % CO2 i 85% azot. Pe mediile lichide produce o turbiditate discret observabil la civa mm sub faa superioar a coloanei de mediu. Pe mediile solide dezvolt colonii care pot avea dou aspecte principale: a) colonii foarte mici, aplatizate, gri-cenuii, fin granulate i translucide, cu marginile neregulate, asemntoare picturilor mici de miere i b) colonii rotunde, cu marginile translucide. Uneori formeaz colonii de tip R sau colonii cu aspect mucos. Mediile cu snge sunt favorabile dezvoltrii campilobacteriilor, dei majoritatea speciilor nu produc hemoliz beta sau produc slab numai o hemoliz alfa.

Metodele clasice de evideniere a C.jejuni n alimente i diferite materiale patologice, pe lng dificultile tehnice pe care le presupun, necesit mult timp pn la cunoaterea rezultatelor, ceea ce reprezint un mare inconvenient. Pentru scurtarea timpului de izolare-identificare-confirmare, care n metodele clasice dureaz 4-5 zile, n ultimii ani s-au pus la punct metode i tehnici rapide, cum sunt:

- testele imunoenzimatice de tip ELISA; - reacia de polimerizare n lan (PCR), cu o sensibilitate de 10-25 ufc/g i un timp mediu

de analiz de 48 ore, dar care are inconvenientul c nu discerne celulele bacteriene vii de cele moarte prezente n materialul de examinat;

- amplificarea ARN-ului celular care dispare rapid dup moartea celulelor. Aceast amplificare se poate face prin RT-PCR (Reverse-Transcriptare PCR) i nltur inconvenientul PCR simple.

6.1.2. Genul Helicobacter Genul Helicobacter face parte din familia Campylobacteriaceae, superfamilia VI ARNr

subgrupa 3 i cuprinde bacterii cu form de bacili Gram-negativi, curbai sau n form de S, helicoidali, groi de 0,3-1 i lungi de 1,5-7,5 microni, mobili, datorit unuia sau mai multor

19

flageli unipolari, bipolari sau laterali. Expui la aer devin cocoizi. Sunt microaerofili cu metabolism respirator, nesporogeni. Hidrogenul le stimuleaz dezvoltarea, iar pentru unele specii este indispensabil. Sunt catalaz i oxidaz pozitivi, cu excepia speciei H.canis care este catalaz negativ. Nu se dezvolt la 250C.

Speciile acestui gen se mpart n dou grupe: o grup format din specii care colonizeaz mucoasa gastric a omului i animalelor i alt grup cu specii care colonizeaz mucoasa intestinal. H.pylori este specia de tip a genului i cu semnificaia patogen pentru om cea mai mare, fiind implicat n patogeneza ulcerului i cancerului gastric. Dei aceast specie se izoleaz n mod obinuit din mucoasa gastric a omului, ea a fost gsit i n sucul gastric, saliva, leziunile dentare, bila, fecalele omului i ale unor specii de animale, n special pisica domestic, ceea ce ridic problema rolului pisicii n transmiterea infeciei la om. Este semnalat prezena bacteriei i n mediul nconjurtor, ca i n unele produse alimentare de origine animal prin intermediul crora se poate infecta omul.

Incidena bacteriei n mucoasa gastric a oamenilor sntoi (purttor ) crete odat cu vrsta acestora: 20% la persoanele tinere i 50 % la cele mai vrstnice de 50 ani (83,156).

Este o bacterie strict microaerofil, pentru dezvoltare avnd nevoie de 5-20% CO2 , de mult umiditate i de suplimente similare celor menionate la genul Campylobacter, cu deosebirea c este inhibat de bisulfitul care intr n suplimentul FBP folosit pentru aerotoleran. Toate tulpinile se dezvolt bine la 370C, slab la 300C i 420C i deloc la 250C, sunt inactive la majoritatea testelor biochimice convenionale, cu excepia producerii de catalaz, oxidaz, ureaz i hemoliz alfa (156).

6.2. GRUPA BACTERIILOR CU FORM DE BACILI SAU DE COCI, AEROBE SAU MICROAEROFILE, GRAM NEGATIVE

Bacteriile din aceast grup sunt larg rspndite n natur ca saprofite, unde, prin funcia lor de mineralizare a materiei organice animale i vegetale, particip la circuitul azotului. Ele constituie flora banal care contamineaz produsele de origine animal, fiind principalii ageni ai descompunerii acestora. n aceast grup de bacterii sunt incluse n principal cele din familia Pseudomonadaceae i din familiile i genurile apropiate, constituite din cocobacili sau bacili Gram negativi aerobi, precum i din familii i genuri mai ndeprtate, constituite de asemenea din bacili sau cocobacili Gram negativi, dar facultativ anaerobi, care sunt mai apropiai de familia Enterobacteriaceae.

Constituirea acestei grupe mari de bacterii are deci la baz n primul rnd efectul lor asupra produselor organice, ecologia lor asemntoare i n mai mic msur, criteriile taxonomice. Ea cuprinde urmtoarele genuri de bacterii: Pseudomonas, Xanthomonas, Moraxella, Acinetobacter, Alcaligenes, Agrobacterium, Halobacterium, Gluconobacter (Acetomonas), Paracoccus, Brucella, Legionella. Majoritatea acestor genuri nu cuprind bacterii patogene pentru om i animale, cu unele mici excepii care vor fi menionate la descrierea fiecrui gen.

Caracterele generale ale bacteriilor ce formeaz aceast grup sunt: - forma de bacili sau cocobacili Gram negativi, - asporogene, acapsulogene, majoritatea mobile, - oxidaz pozitive sau negative, dar ntotdeauna fermentativ negative, spre deosebire de

enterobacterii care sunt oxidaz negative, dar fermentativ pozitive, - multiplicarea pe medii simple, - mezofile sau psihrotrofe, prefernd pentru dezvoltare temperatura de 30oC sau 20-220C;

unele se pot dezvolta i la temperaturi mult mai joase, - numeroase specii sau tulpini sunt pigmentogene,

20

- habitatul lor obinuit l formeaz solul, apa, aerul, produsele vegetale i sunt ntlnite frecvent n produsele alimentare.

6.2.1. Genul Pseudomonas Cuprinde numeroase specii de bacterii cu forma de bastonae drepte sau curbe, lungi de 0,5-4

microni, mobile datorit flagelilor polari, Gram negative, cu metabolism ntotdeauna respirator, niciodat fermentative, de obicei chemoorganotrofe, dar unele sunt chemolitotrofe, capabile s foloseasc hidrogenul molecular sau dioxidul de carbon ca surs de energie. Oxigenul molecular este acceptorul universal. Unele tulpini sunt denitrifiante, folosind nitratul ca acceptor de hidrogen. Sunt strict aerobe, cu excepia speciilor care pot folosi denitrificarea ca un mijloc de respiraie anaerob. Catalaz i oxideaz pozitive. Habitatul lor obinuit este solul, apa dulce, apa de rm a mrilor unde desfoar o intens activitate de mineralizare a materiilor organice. Majoritatea speciilor sunt saprofite i numai cteva sunt patogene pentru plante, animale i om.

Unele specii produc pe cale oxidativ acizi din alcooli i zaharuri, multe acumuleaz n celul poli-beta-hidroxibutirat sau polizaharide ca rezerve de carbon. Anumite specii produc pigmeni fluoresceni difuzibili, n special pe mediile fr fier, iar altele, pigmeni fenazinici difuzibili sau insolubili, de diferite culori (albastr, roie, galben, verde).

Pseudomonadele sunt insensibile la concentraii de 2,5 U sau mai mici de penicilin, ca i fa de eritromicin, lactobionat de eritromicin i cloramfenicol. De aceea, aceste antibiotice se includ n unele medii selective folosite la izolarea lor.

Noskova mparte bacteriile din genul Pseudomonas n 4 subgrupe lund ca criterii capacitatea de a produce pigment difuzibil i de a forma acizi din glucoz:

- subgrupa I: - produc pigment difuzibil n mediul de cultur, - produc acizi din glucoz.

Speciile din aceast subgrup sunt psihrotrofe i sunt implicate deseori n alterarea crnii refrigerate. Ex. P.fluorescens, P.putida, P.geniculata.

- subgrupa II: - nu produc pigment difuzibil n mediul de cultur, - produc acizi din glucoz. Ex. P.putrefacies, P.fragi.

Speciile din aceast subgrup sunt psihrotrofe i sunt implicate deseori n alterarea crnii refrigerate. Ex. P.fluorescens, P.putida, P.geniculata.

- subgrupa III: - nu produc acizi din glucoz, - alcalinizeaz mediul Hugh-Leifson.

- subgrupa IV: - nu produc acizi din glucoz, - nu alcalinizeaz mediul Hugh-Leifson.

Sensibilitatea fa de antibioticele din grupa tetraciclinelor este diferit i este corelat cu capacitatea lor de a colora mediul. Tulpinile care coloreaz mediul de cultur nu sunt sau sunt mai puin sensibile la oxi i clortetraciclin. Cele care nu coloreaz mediul sunt rezistente la oxitetraciclin i sensibile la clortetraciclin.

Pe suprafaa carcaselor de pasre tratate cu clortetraciclin, numrul de pseudomonade care nu coloreaz mediul (sensibile la acest antibiotic) ajunge n momentul apariiei mirosului incipient de alterat, numai la 5% fa de 60% ct reprezint proporia lor pe carcasele netratate cu clortetraciclin.

Pseudomonadele au o intens activitate inhibant asupra dezvoltrii florei cu care sunt asociate pe suprafaa alimentelor. De subliniat aciunea lor inhibant asupra S.aureus i a unor specii de enterobacterii.

Se dezvolt aproape n mod obinuit la temperaturi de 40 la 430C, cea mai convenabil tem-peratur pentru cele mai multe specii fiind 250 300C. Unele specii se pot dezvolta i la 30 50C i chiar la 90C. Durata de timp per generaie crete pe msur ce temperatura de cultivare scade. Astfel, P.fluorescens are o durat per generaie de 25,5 ore la 201, de 12,8 ore la 202 i de 4,8 ore la 807.

21

Sub temperatura minim de dezvoltare, bacteriile din genul Pseudomonas mor ncet, ca i celelalte bacterii, dar mult mai repede dect alte bacterii asporogene (micrococi, stafilococi, streptococi). n substraturile congelate mor mai repede la 2 pn la 100C dect la temperaturi mai joase. Cnd temperatura maxim de nmulire este depit, ele mor foarte repede. Multe tulpini psihrotrofe mor deja la 370C.

Toate speciile se dezvolt la pH 7-8,5, majoritatea fiind incapabile s se multiplice la pH6,0. Valoarea minim a umiditii atmosferice la care pseudomonadele se pot dezvolta pe suprafaa crnii depozitate la 10C, este de 98-98,5% (aw = 0,98-0,985).

Pentru izolarea i numrarea pseudomonadelor din produsele alimentare se folosesc urmtoarele medii selective: agar cu glutamat-amidon-fenol (GSP), cetrimid-furadoin-sefalosporin (CFC), Pseudomonas agar P, Pseudomonas agar F i cetrimid-agar (acesta exclusiv pentru P.aeruginosa).

Bacteriile din genul Pseudomonas, datorit caracterului lor psihrotrof, sunt ageni principali ai alterrii crnii refrigerate depozitate n condiii aerobe mai mult dect timpul permis. n condiii de depozitare aerob bacteriile se nmulesc activ pe carnea refrigerat i inhib toate celelalte categorii de bacterii, inclusiv levurile i mucegaiurile.

Cteva specii din genul Pseudomonas sunt patogene sau patogene ocazional pentru animale i om i pot interesa controlul microbiologic al crnii, n anumite situaii speciale, de aceea vom prezenta cteva date despre fiecare.

P.aeruginosa (P.pycyanea, bacilul piocianic, bacilul puroiului albastru). Este o bacterie de putrefacie, prezent n apele naturale, n deosebi stttoare, ape de canal, unele surse de ap potabil de suprafa, pe vegetale, pe diferite produse alimentare, de unde ajunge pe piele, mucoase i n colonul omului i al animalelor la care poate provoca infecii purulente cu diferite localizri: mamite la bovine, conjunctivite i metrite la cine, septicemii la psri, suine la om, infecii ale tractusului urinar, otite, bronhopneumonii i pleurite la om. Puroiul n infeciile cu P.aeruginosa are culoarea albastr, cu miros fad.

Aceast specie poate elabora 4 pigmeni: piocianina (caracteristic speciei), fluoresceina (pioverdina), pigmentul eritrogen (rou) i melanic (negru). Ultimii doi pigmeni se ntlnesc la un numr mic de tulpini. Produce o exotoxin nociv pentru oareci, maimu i om.

Pentru a evita contaminarea omului prin produsele de origine animal, se recomand nlturarea de la tiere a psrilor i animalelor cu septicemii sau cu focare purulente ntinse date de aceast bacterie, nlturarea focarelor delimitate i tratarea termic a crnii obinute.

P.mallei (Malleomyces mallei, Actinobacillus mallei, Corynebacterium mallei, bacilul morvei). Este agentul morvei, boal a calului i a altor solipede, transmisibil la om, cine i alte carnivore, oaie, capr. n prezent boala este eradicat n ara noastr, dar mai exist sporadic n unele ri din Orientul Apropiat i Mijlociu. Pn la apariia sulfamidelor i antibioticelor, era o boal incurabil.

La animale produce inflamaie i edem al mucoaselor, limfadenit-granulomatoas ulcerativ cu evoluie cronic i leziuni grave granulomatoase la nivelul pulmonului.

La om, boala poate evolua acut sau cronic i se manifest prin granuloame i ulcere cutanate i abcese pulmonare.

P.mallei este un bacil polimorf (1,5 4/0,5 microni), imobil, acapsulogen, asporogen Gram negativ. Spre deosebire de cele mai multe specii din genul Pseudomonas, P.mallei nu se dezvolt pe mediile obinuite, preferndu-le pe cele glicerinate. n bulionul glicerinat produce turbiditate moderat i depozit mucos, aglutinat. Pe suprafaa agarului glicerinat formeaz colonii mijlocii-

22

mari, mucoase, uor convexe, rotunde, opace, nepigmentate. Pe cartoful glicerinat coloniile seamn cu picturile de miere, care cu timpul se coloreaz n brun.

Este o bacterie cu slabe proprieti zaharolitice, nu produce indol i nu lichefiaz gelatina. Nu rezist la aciunea factorilor fizici i chimici, fiind omort n 10 minute la 550C i aproape instantaneu la 1000C.

Carnea provenit de la animalele bolnave nu se valorific n consum uman. Pentru a se evita contaminarea oamenilor n timpul operaiunilor de tiere, animalele bolnave se omoar printr-un procedeu nesngeros (mpucare, electrocutare), iar cadavrele se ngroap, se ard sau se transform n fin proteic, manipularea lor fcndu-se cu cea mai mare atenie.

P.pseudomallei (bacilul lui Whitemore) este agentul melioidozei, o zoonoz foarte grav. Este nrudit antigenic cu P.mallei, de care se deosebete prin mobilitate i capacitate enzimatic zaharolitic i proteolitic intens. Se coloreaz adesea bipolar. Se cultiv uor pe agar-snge-gli-cerin, dnd colonii glbui-portocalii, opace. Se gsete ca saprofit n mediul extern, n principal n sol.

Produce infecia la om i multe specii de animale din zonele tropicale i subtropicale ale Asiei de Sud-Est. Rezervorul natural l formeaz roztoarele slbatice (oarecele, obolan). De la acestea, prin plgi, pe cale digestiv sau pulmonar, infecia se transmite la unele specii de animale domestice (solipede, suine, carnivore) sau slbatice (cerbi, antilope, canguri .a.). Omul se infecteaz prin contact cu animalele bolnave sau produse provenite de la acestea. Att la animale ct i la om infecia se manifest prin apariia a numeroi noduli cazeo-puruleni n diferite esuturi i organe, leziuni asemntoare cu cele din unele micoze i din tuberculoz. Poate da septicemii cu evoluie rapid i mortale, abcese n esuturile moi sau osteomielite.

Evitarea infectrii omului se bazeaz pe diagnosticarea din timp a animalelor bolnave, evitarea contactului cu acestea i interzicerea introducerii lor la tiere.

P.cocovenenans este o specie creia n ultimele dou decenii i s-a acordat mare atenie, odat cu descrierea unor cazuri grave de intoxicaie alimentar din insula Jawa, aprute n urma consumului preparatului local bongkrek klappa, un produs de nuc de cocos fermentat cu ajutorul mucegaiurilor. S-a stabilit c toxicitatea produsului se datora multiplicrii bacteriei P.cocovenenans care produce dou toxine active pe cale oal: toxoflavina i acidul bonkrekic. Toxoflavina este un derivat azopteridin i toxicitatea ei rezult din producerea intracelular a peroxidului de hidrogen. Acidul bongkrekic este un acid nesaturat, pentaciclic, tricarboxilic. El este mai toxic pe cale oral dect toxoflavina, interfernd metabolismul hidrailor de carbon.

6.2.2. Genul Moraxella Genul Moraxella face parte din familia Moraxellaceae, cuprinde specii care particip la

alterarea a unor produse alimentare, fiind inclus n asociaia microbian Pseudomonas-Moraxella-Acinetobacter.

Genul Moraxella se difereniaz de unele genuri asemntoare pe baza criteriilor din tabelul de mai jos.

Caracterele difereniale ale genului Moraxella de unele genuri asemntoare Neisseria Branhamella Moraxella Acinetobacter

Forma celulelor cocoid cocoid Bastonae umflate

n perechi sau lanuri scurte

Bastonae n faza exponenial i

coci n faza staionar

Diviziune n: Dou planuri Dou planuri Un plan Un plan

Dezvoltare pe V - V +

23

medii simple

Sensibilitate la penicilin

+ - + -

Oxidaza + - + -

Nitrat-reductaza - sau V + V -

G + C% 47-52 40-45 40-46 39-47

Bacteriile din genul Moraxella au form de bastonae foarte scurte i umflate cu dimensiuni de 1,0 2,5 microni, deseori semnnd cu cocii, obinuit aezate n perechi sau lanuri scurte. n unele culturi, forma celulelor este foarte uniform, n altele, pleomorf, cu variaii de mrime i aspect i cu apariia de filamente sau de lanuri lungi. Pleomorfismul este favorizat de lipsa de oxigen i de temperaturile mai mari dect cea optim. Unele specii sau tulpini formeaz capsul, altele nu, sunt Gram negative, imobile, asporogene, i nu necesit cerine speciale pentru dezvoltare. Nu produc indol, AMC i H2S. Nu folosesc hidraii de carbon. Pot folosi ca surs de energie un numr limitat de acizi organici, alcoolici i aminoacizi. Sunt foarte sensibile la penicilin. Temperatura optim de dezvoltare este de 32 350C, iar pH-ul optim 7 - 7,5. Cele mai multe specii se dezvolt bine pe agarul cu snge, pe care formeaz colonii foarte mici (

24

Genul Acinetobacter se difereniaz de genurile asemntoare pe baza caracteristicilor fenotipice consemnate n vol. 1 din Microbiologia produselor alimentare (Sorin Apostu, 2006), iar speciile din cadrul genului, dup testele menionate n aceeai lucrare. Specia tip a genului este A.calcoaceticus (28, 213b).

Genul Acinetobacter este format din bacterii cu form de bacili scuri, drepi, (1-1,5/1,5-2,5 microni) n faza de cretere exponenial i cu forma cocoid (0,60,8/11,5 microni) n faza staionar, cnd apar ca nite diplococi colorai bipolar. n culturile dezvoltate n bulion nutritiv n faza exponeniala formeaz lanuri scurte de celule. Bacteriile snt imobile, neflagelate, frecvent capsulate i fimbriate, strict aerobe, catalaz pozitive, oxidaz negative pentru c le lipsesc citocromul c i au un coninut G+C al ADN de 39-47 mol %.

Se dezvolt bine pe majoritatea mediilor uzuale, pe cele solide formnd colonii mici (1 2 mm diametru) de culoare pal-glbui sau grialbicioase, iar n bulionul nutritive dau o turbiditate uniform evident i depozit pulverulent, granular sau vscos, n cantiti variabile. Majoritatea tulpinilor izolate din probele clinice se dezvolt pe agarul Mac Conkey i numai unele din cele provenite din probele de mediu. Pe acest agar, tulpinile zaharolitice formeaz colonii rare. Rare specii produc hemoliza pe agarul nutritiv cu snge, iar unele lichefiaz lent gelatina. O parte din tulpinile izolate din probele de mediu produc un pigment brun difuzibil. Dezvoltarea speciilor de Acinobacter se face bine la temperatura de 200 300C, fr a avea nevoie de factori de cretere. Majoritatea tulpinilor clinice se dezvolt bine la 370C, iar unele i la 410 420C i chiar la 440C, pe cnd cele izolate din mediul ambiant, numai la temperaturi joase, fiind psihrotrofe i explicnd dezvoltarea lor pe suprafaa crnurilor i altor produse refrigerate, la care produce putrefacia superficial n condiii aerobe i cu umiditate mare, mpreun cu specii de Pseudomonas i Moraxella.

Speciile de Acinobacter au un numr de proprieti distinctive care motiveaz existena genului. Ele seamn cu pseudomonadele saprofite, fiind capabile s foloseasc anumite substane ca unice surse de carbon i energie, n prezena unei surse de azot, n mediile minerale. Dei folosirea carbohidranilor este oarecum neobinuit, o trstur major a genului este c multe tulpini pot metaboliza o serie de compui ca alcoolii alifatici, unii aminoacizi, acizi carboxilici i grai , hidrocarburi neramificate, zaharuri i muli compui aromatici ca benzoatul, mandelatul, s.a. Majoritatea tulpinilor sunt incapabile s foloseasc glucoza ca surs de carbon, dar capabile s acidifice mediile care conin zaharuri ca glucoza, arabinoza, celobioza, galactoza, lactoza, maltoza, manoza, riboza i xiloza. Dei majoritatea tulpinilor sunt incapabile s reduc nitraii n nitrii prin teste convenionale, unele dintre ele pot folosi nitratul i nitritul ca surs de azot, datorit unei nitrat-reductaze pe care o produc.

Studii recente asupra genului au artat c toate tulpinile izolate din probele de mediu sunt rezistente la penicilin, cefalosporine de prim generaie i cloramfenicol i sensibile la carbenicilin, tetracicline i aminoglicoside. Sensibilitatea fa de ultimele trei categorii de antibiotice nu este valabil ns, i pentru izolatele clinice la care s-a constatat dezvoltarea antibiorezistenei extrem de rapide. De asemenea la aceste isolate s-a constatat rezistena i fa de cefalosporine de ultim generaie, 4-fluoroquinolone i carbapeneme.

Habitatul acinetobacteriilor este ubicvitar, ele gsindu-se ca saprofii ai solului, apei, alimentelor, dar i ai mediului spitalicesc. Ele se pot ntlni pe suprafeele de lucru din ntreprinderile de industrie alimentar i din unitile de comer alimentar, ca i comensali pe pielea omului i animalelor. Incidena ubicvitar a acestor bacterii a determinat pe unii cercettori s considere, n mod eronat, izolatele din probele clinice ca simpli contaminai.

25

Acinetobacteriile sunt de obicei saprofite i ocazional patogene pentru om i animale. Specia principal capabil s produc infecii mai ales nosocomiale la om este A.baumannii i ntr-o msur mai mic alte specii ca Acinobacter spp3, A.johnsonii i A.lwoffii. n cazul infeciilor la om, deseori se izoleaz din aspiratele traheale, snge, lichid cerebrospinal i puroi.

Patogenitatea acinetobacteriilor s-ar datora mai multor factori de virulen, i anume: - prezena capsulei polizaharidice, - capacitatea de a adera de celulele epiteliale umane datorit capsulei i fimbriilor, - producerea de enzime care pot ataca lipidele tisulare, - componenta lipopolizaharidic (LPS) a peretelui celular i prezena lipidei A, - capacitatea de a folosi fierul din organismul omului, necesar dezvoltrii. Izolarea acinetobacteriilor din probele clinice (snge, lichid cefalorahidian) necontaminate cu

alt microflor se face uor, folosind mediile de cultur uzuale. Dac este vorba de probe de mediu sau de materiale clinice contaminate cu microflor de asociaie, izolarea acinetobacteriilor se face folosind un mediu mineral de mbogire i selective cu pH 5,5-6,0, care conine o singur surs de carbon i energie i o sare de amoniu sau nitrat, ca surs de azot. Acest mediu inoculat cu materialul de cercetat se incubeaz la 200C 300C, cu agitare viguroas i continu pentru ca acinetobacteriile s se dezvolte cu prioritate fa de pseudomonade cu care se gsesc de obicei n competiie.

6.2.4. Genul Paracoccus Bacteriile din acest gen au form de coci (de unde i numele), cu diametrul de 0,5-1,1

microni, aezai izolat, n perechi sau n grmezi, imobile, asporogene, acapsulogene, catalaz i oxidaz pozitive, Gram negative. Acumuleaz intracelular granule de poli-beta-hidroxibutirat ca rezerv de carbon, n special n mediile deficitare n azot. Au numai metabolism respirator. Sunt aerobe, iar n mediile cu nitrat pot fi i anaerobe, putnd folosi alternativ ca acceptori de electroni, oxigenul sau nitratul. n condiii anaerobe reduc nitratul n oxid de azot i n azot molecular. Una din cele dou specii care formeaz genul este chemolitotrof, capabil s foloseasc oxidarea H2 ca surs de energie pentru creterea autotrof (P.denitrificans).

n multe privine specia P.denitrificans seamn cu unele specii facultative chemolitotrofe din genurile Alcaligenes i Pseudomonas, de care difer n principal prin forma sa cocoid din faza logaritmic de multiplicare i prin lipsa mobilitii.

Cele dou specii ale genului Paracoccus se deosebesc prin urmtoarele caractere: P.denitrificans este facultativ chemolitotrof, nu este halofil, nu are cerine speciale de

cretere i nu hidrolizeaz gelatina. Se gsete obinuit n sol, n special n cel suplimentat cu ngrminte pentru bacterii denitrifiante sau pentru bacteriile autotrofice capabile de a folosi hidrogenul atmosferic.

P.halodenitrificans nu este chemolitotrof, este halofil (nu se dezvolt n medii cu mai puin de 0,4 M (1,5%) NaCl, se dezvolt bine n cele cu 0,8-1,6 M NaCl i slab n cele cu 4 M (23%) NaCl, are nevoie de medii complexe pentru dezvoltare i hidrolizeaz gelatina. Se gsete obinuit pe crnurile conservate prin sare sau saramur. Se presupune c este larg rspndit n natur, n apele srate.

6.2.5. Genul Xanthomonas Cuprinde bacterii cu form de bastonae drepte, aezate izolat, relativ mici (0,2-0,8 pn la

0,6-2,0 microni), mobile, Gram negative, cu metabolism respirator, niciodat fermentativ, catalaz pozitive, oxidaz negative sau slab pozitive. Pe suprafaa mediilor cu agar formeaz

26

colonii galbene. Produce cantiti mici de acizi din muli carbohidrai, dar nu i din ramnoz, insulin, adonit, ducit, inozit sau salicin. Nu produc acetoin, indol i acidifierea laptelui. Majoritatea speciilor hidrolizeaz amidonul i tweenul 80. Nu reduc nitraii, nu folosesc arginina ca singura surs de carbon i azot. Dezvoltarea lor pe agarul nutritiv este inhibat de concentraii de 0,1-0,02 % clorur de tetrazolium. Strict aerobe. Temperatura optim de dezvoltare este de 25-270C; nu se multiplic la 50C i nici la 400C. Unele se pot multiplica la 70 sau 90C. Majoritatea speciilor aparinnd acestui gen sunt patogene pentru plante i se gsesc de regul pe plante sau pri i produse rezultate din acestea. Ele pot contamina i alimentele, fr ns a avea o semnificaie deosebit pentru alterarea i salubritatea alimentelor de origine animal.

6.2.6. Genul Gluconobacter (Acetomonas) Bacteriile din acest gen mpreun cu cele din genul Acetobacter (nencadrat) formeaz

grupa bacteriilor acetice. Ele prezint interes pentru industria vinului, berii i alcoolului. Contamineaz produsele alcoolizate i sunt folosite pentru fabricarea oetului i a acidului

gluconic. Pot fi confundate cu unele grupe de bacterii ntlnite pe produsele alimentare de origine animal.

6.2.7. Genul Alcaligenes Genul Alcaligenes nu este ncadrat ntr-o anumit familie. El cuprinde bacterii cu form de

bastonae sau de coci cu dimensiuni de 0,5 1,2 pn la 0,5 2,6 microni, aezate de obicei izolat, mobile, cu 1 4 flageli, Gram negative, strict aerobe, cu metabolism respirator, niciodat fermentativ, oxidaz pozitive. Unele tulpini pot avea respiraie anaerob n prezena nitratului sau nitritului. Majoritatea tulpinilor pot folosi ca surs unic de azot srurile de amoniu sau de nitrat. Aceste tulpini produc o turbiditate intens a mediilor lichide simple, n care nu exist dect sruri de amoniu sau azotai ca surs de azot. Unele tulpini au nevoie pentru dezvoltare de compui azotai organici.

Nu au activitate proteolitic asupra caseinei i gelatinei i nu hidrolizeaz celuloza i chitina. Temperatura optim de dezvoltare este cuprins ntre 200C i 370C, existnd mici diferene ntre

specii. Genul cuprinde mai multe specii, din care numai 4 sunt bine studiate i ncadrate. Bacteriile din acest gen sunt de obicei saprofite, gsindu-se frecvent n sol, apa dulce i marin,

ca participani la procesele de descompunere i mineralizare. Se ntlnesc frecvent n coninutul intestinal la om i animale. Contamineaz alimentele producndu-le descompunerea, n asociaie cu alte microorganisme. Sunt implicate n alterarea oulor. Nu sunt patogene pentru om i animale.

Bacteriile din genul Alcaligenes sunt incluse n unele asociaii speciale de bacterii care contribuie la alterarea produselor alimentare, ca Pseudomonas-Moraxella-Acinetobacter. Din cauza asemnrilor mari dintre descrierile fcute anterior pentru bacteriile din genul Achromobacter i cele din genul Alcaligenes, n ultimul timp s-a abandonat numele de Achromobacter. De altfel acest gen era constituit din multe specii diferite mult n privina caracterelor, ceea ce nu explica gruparea lor n aceeai unitate taxonomic. Din aceast cauz genul Achromobacter a disprut din determinatoarele mai recente, iar speciile din care era format au fost ncadrate, n raport de caractere, n alte genuri: Acinetobacter (Achr. anitratum, Achr. conjunctivae, Achr. haemolyticus var. alcaligenes, Achr. metalcaligenes), Alcaligenes (Achr. alcaligenes, Achr. arsenoxydanstres, Achr. aqua marinus), Vibrio (Achr. ichthyodermis, Achr. fischeri), Arthrobacter (Achr. globiformis), Brevibacterium (Achr. stationis), Pseudomonas (Achr. stutzeri), Lucibacterium (Achr. harvayi).

27

Caracterele morfologice generale ale genului exclud bacteriile imobile care au fost incluse n grupa Acinetobacter-Moraxella. Incapacitatea bateriilor din genul Alcaligenes de a se dezvolta la pH-4,5 le deosebete de cele din genul Acetobacter.

6.2.8. Genul Brucella Genul Brucella este constituit din ase specii, toate patogene pentru animale, iar unele, i

pentru om. Prin aplicarea MLEE (Multilocus enzyme electrophoresis) la tulpini din toate speciile, s-a constatat o diversitate genetic foarte mic, ceea ce arat monospecificitatea genului (77). Brucelele au form de bacili scuri sau de cocobacili mici (0,6-1,5/0,5-0,7 microni), Gram negativi, care nu se coloreaz bipolar, asporogeni, acapsulogeni, imobili, strict aerobi, catalaz pozitivi, oxidaz, n general, pozitivi. Temperatura optim de dezvoltare este 370C, iar pH-ul optim 6,6-7,4.

Pentru cultivare au nevoie de condiii speciale, de factorii X (hemina) i V (coenzima 1), de tiamin, niacin i biotin. Pantotenatul de calciu stimuleaz creterea, iar nichelul activitatea ureazic a Br.suis, ceea ce permite supravieuirea bacteriei n condiiile ntlnite n corpul gazdei (222). La izolare, unele specii (B.abortus, B.ovis) au nevoie de o atmosfer cu 5 1 % dioxid de carbon. Se cultiv bine pe bulion, agar nutritiv, cartof, la care se adaug glucoz 1%, ser 1 5% sau glicerin 2%. Pentru izolarea lor din materialele patologice n care sunt i alte bacterii contaminate, se recomand tratarea prealabil a materialelor timp de 30 minute cu o soluie de 2,5% hidroxid de potasiu.

Se dezvolt ncet n mediile de cultur, de cele mai multe ori fiind necesare mai multe zile pentru a aprea semne evidente de dezvoltare. n mediile lichide produc turbiditate moderat, depozit cenuiu i alcalinizare (pH 8,0). Pe suprafaa agarului cu glicerin i glucoz se dezvolt colonii mici, rotunde, opace, cu suprafaa lucioas. Pe suprafaa cartofului glicerinat coloniile sunt glbui i devin brune prin nvechire. n prezent exist kituri comerciale pentru izolarea brucelelor cum este BACTEC 9240 blood cultural system pentru detectarea Br.melitensis din lichidul sinovial (234). La unele specii de Brucella s-au descris mai multe biotipuri. Criteriile de difereniere a speciilor i biotipurilor sunt redate n vol. 1 din cartea Microbiologia produselor alimentare (Sorin Apostu, 2006).

Brucelele sunt obligatoriu parazite, multiplicndu-se numai n organismele vii i pe medii speciale. Ajunse n mediul extern, odat cu placenta, lichidele fetale, secreiile urinare, laptele, urina, carnea animalelor bolnave sau prin avorturi, pot rezista timp ndelungat. n condiii favorabile, ele pot rezista n afara organismelor vii pn la 200 zile. Sunt distruse n 5 15 minute la 60 650C i instantaneu la 1000C. Brucelele sunt mai puin termorezistente dect bacilul tuberculozei, tratamentele termice care inactiveaz fosfataza, omorndu-le.

Experienele cercettorilor danezi Mller Madson Aage i col. care au tratat termic n aparatele cu plci lapte crud contaminat experimental cu B.abortus (de la 710 la 7500000 germeni ml/lapte) au demonstrat c brucelele se distrug n 12 secunde la 630C, n 3 secunde la 650C i ntr-o secund la 67,50C Acidifierea laptelui nu le omoar dect dup multe zile. Astfel, B.melitensis rmne viabil 15 zile n lapte acidifiat cu pH 4 - i 125 2000T, pstrat la 11-140C. n cums cu 120-1400T i cu 3,5 3,7% alcool rezist mai mult de 3 zile.

Laptele crud i smntna nepasteurizate, ca i untul i brnzeturile albe fcute din materie prim nepasteurizat i care nu sufer un proces de fermentare-maturare, joac un rol important n infectarea omului. n unele din aceste produse s-au gsit brucele viabile dup perioade lungi de timp: 180 zile n brnza Cheddar, 90 zile n brnza Pecorino.

28

Brucelele sunt sensibile fa de streptomicin, cloramfenicol, aureomicin i teramicin. Dei pot rezista n anumite condiii timp ndelungat n afara organismelor vii receptive, totui rezervorul principal de brucele n natur l constituie animalele bolnave. Ele pot infecta numeroase specii de animale domestice i slbatice de la care pot trece la om. Patogenitatea lor se bazeaz pe virulen, se multiplic de obicei intracelular i au tropism accentuat pentru organele genitale, n care se multiplic i determin avorturi la femelele gestante i orhiepididimite la masculi.

Fiecare specie de Brucella i chiar fiecare biotip din cadrul aceleiai specii infecteaz n mod obinuit o anumit specie de animal sau cteva asemenea specii. Astfel, B.melitensis: ovinele, caprinele i omul; B.abortus: taurinele i omul i rar cabalinele; B.suis: porcul, iar anumite biotipuri ovinele, taurinele, renii i omul; B.ovis: ovinele, n special masculii la care produce orhiepididimita; B.canis: cinele, foarte rar omul; B.neotomae: obolanul Neotoma lepida.

La om Brucella produce mbolnviri grave manifestate prin granuloame primare, septicemii cu febr ondulatorie, localizri cronice n diferite organe i esuturi (articulaii, oase, meninge, seroase, viscere, ganglioni limfatici), greu vindecabile, cu sensibilizri celulare accentuate.

6.3. GRUPA BACTERIILOR CU FORM DE BACILI, GRAM NEGATIVE I FACULTATIV ANAEROBE

6.3.1. Subgrupa 1: Familia Enterobacteriaceae Aceast familie prezint semnificaie deosebit pentru igiena alimentar. Ea conine 12

genuri, fiecare din acestea incluznd specii patogene sau condiionat patogene pentru om i animale. Bacteriile din aceast familie contamineaz frecvent produsele alimentare de origine animal, crora, de cele mai multe ori, le produc degradri importante sau le fac duntoare pentru consumatori. Alimentele contaminate cu enterobacterii stau de multe ori la originea multor infecii sau toxiinfecii alimentare ale omului.

Nia ecologic obinuit a bacteriilor din aceast familie o formeaz tubul digestiv al omului i animalelor, n special partea lor posterioar. Din aceast cauz prezena enterobacteriilor pe alimente se consider contaminare fecal

Enterobacteriile sunt bacterii cu form de bastonae mici bacili sau cocobacili, Gram negative, care fermenteaz glucoza, sunt oxidaz negative, catalaz pozitive (cu excepia Shigella dysenteriae serotip. 1 care este catalaz negativ), reduc nitraii n nitrii (cu excepia unor tulpini din genul Erwinia), asporogene, capsulogene sau nu, mobile sau nu, acidosensibile, aerobe i facultativ anaerobe. Au metabolism respirator i fermentativ i produc acid prin fermentarea glucozei i a altor hidrai de carbon i alcooli. Ele se nmulesc uor pe mediile de cultur obinuite cu pH n jur de 7,0 la o temperatur de 370C.Familia Enterobacteriaceae este divizat n 5 triburi, fiecare trib coninnd unul sau mai multe genuri, astfel:

Tribul I : Escherichieae:

1. Escherichia (o specie cu 71 serogrupe O i cu mii de serotipuri),

2. Erwardsiella (o specie cu 18 serotipuri, saprofit n tubul digestive al petilor, erpilor i rar al omului),

3. Citrobacter (dou specii cu 42 serogrupe O i numeroase serotipuri),

4. Salmonella (4 subgenuri cu peste 2400 serotipuri), 5. Shigella ( 4 specii cu 34 serotipuri ).

29

Tribul II: Klebsielleae: 1. Klebsiella (3 specii cu 23 biotipuri i peste 80 serotipuri), 2. Enterobacter (22 de specii cu mai mult de 80 serotipuri), 3. Hafnia (o specie cu 49 serotipuri, saprofit n mediul

extern i n colon), 4. Serratia (o specie cu 46 serotipuri, de regul saprofit n

mediul extern ). Tribul III: Proteeae: 1. Proteus ( 4 specii cu 200 serotipuri ),

2. Morganella (1 specie), 3. Providencia (5 specii).

Tribul IV: Yersinieae: 1. Yersinia (3 specii; la speciile Y.enterocolitica i Y.pseudotuberculosis exist multe serotipuri).

Tribul V: Erwinieae: 1. Erwinia (13 specii cu multe subspecii; saprofite i patogene ale plantelor).

Caractere difereniale ale celor 5 triburi de Enterobacteriaceae Caractere

Trib. I Escherichieae

Trib. II Klebsielleae

Trib. III Proteeae

Trib. IV Yersinieae

Trib. V Erwinieae

Model de fermentare amestec de acizi

2,3 butan-diol /

amestec de acizi

amestec de acizi i 2,3-butandiol

M.R. + V + + / V.P. V V V Fenilalanindesaminaz + V Nitrat-reductaz + + + + V Ureaz

V V V Dezvoltarea in KCN V + + V T0 optim de dezvoltare 370C 370C 370C 30 370C 27 300C

G + C% 50 - 53 52 - 59 39 - 42 45 - 47 50 - 58

V = caracter variabil; / = caracter ce nu se ia n consideraie; G = guanidin; C = citozin.

Structura antigenic la enterobacterii este foarte complex, fiecare specie sau serotip posednd toi sau o parte din urmtorii antigeni:

Antigenul fimbrial (piliar) este de natur proteic i s-a identificat la genurile Salmonella, Escherichia, Proteus, Klebsiella, Shigella, Serratia. Are rol n virulena bacteriilor ca factor de adezivitate specific pentru anumite epitelii.

Antigenul H (ciliar) este de natur proteic, termolabil (denaturat n 20 minute la 100oC), alcoolo-sensibil, rezistent la formol. Este foarte antigenic, variat ca structur i mparte grupele serologice O n numeroase serotipuri H. Poate exista i la variantele R lipsite de antigeni O, K sau Vi.

Antigenul K (capsular) prezent la specii capsulate din genurile Klebsiella i Escherichia. Este de natur polizaharidic. variat ca structur i mparte membrii genurilor n serotipuri K. Au rol n virulen.

Antigenul M (mucoid)este antigen capsular comun la toate enterobacteriile care formeaz colonii mucoide, deci lipsit de specificitate. Este de natur polizaharidic.

Antigenul Vi. Este antigenul cel mai superficial, termolabil, rezistent la alcool i formol. Fiind situat n exteriorul antigenului O l mascheaz pe acesta i mpiedic aglutinarea cu

30

seruri anti O. Se ntlnete la S.typhi, S.paratyphi C (hirschfeldii), S.dublin i la unele serotipuri de Citrobacter (O5 i O29). Este un polizaharid, identic la toate serotipurile la care s-a pus n eviden. Are rol n patogenitate fiind un factor de virulen prin proprietatea sa antifagocitar.

Antigenul O (somatic) este un complex glucido-lipido-polipeptidic, termostabil (nu e denaturat n 20 minute la 1000C), alcoolo-rezistent i sensibil la formol. Pe baza lui bacteriile din unele genuri de enterobacterii (Salmonella) se mpart n grupe serologice.

Clasificarea i identificarea enterobacteriilor sunt dificile din cauza numeroaselor posibiliti de variaie i selecie, determinate de habitatul lor intestinal.

Oricare din membrii familiei Enterobacteriaceae poate contamina produsele alimentare de origine animal putnd produce alterarea lor, iar multe din ele i mbolnviri ale consumatorilor. n raport de patogenitatea lor pentru om, enterobacteriile au fost clasificate n specii:

- nalt patogene (Y.pestis, S.typhi, Sh.dysenteriae 1), - patogene (toate celelalte serotipuri de Salmonella i celelalte specii de Shigella), - condiionat patogene (Escherichia, Klebsiella, Proteus, Y.enterocolitica i

Y.pseudotuberculosis), - accidental patogene (Citrobacter, Enterobacter, Serratia), - nepatogene (Edwardsiella, Hafnia, Erwinia). De subliniat c, n prezent, patologia infecioas la om i animale nu mai este dominat de

speciile cu patogenitate nalt, ci de cele condiionat patogene, ceea ce sporete enorm semnificaia enterobacteriilor ca ageni contaminani ai alimentelor. Dup cum s-a menionat i mai sus, oricare specie de enterobacterie poate contamina alimentele i n raport de gradul ei de patogenitate, de numr i de factorul individ, poate produce consumatorilor acestor alimente infecii manifestate prin septicemii sau localizri n diferite esuturi i organe, acute sau nu, de cele mai multe ori, cronice, cu urmri din cele mai grave, ca i toxiinfecii alimentare.

6.3.1.1. Genul Escherichia Pn nu demult se credea c genul Escherichia (E) conine o singur specie: E.coli. n

prezent este stabilit c acest gen cuprinde 5 specii: E.coli, E.blattae, E.fergusoni, E.hermani i E.vulneris. ntruct celelalte 4 specii sunt puin studiate i nu prezint semnificaie patogen demn de luat n seam, n cele ce urmeaz se va descrie numai E.coli care are numeroase implicaii n patologia omului i animalelor, ca i n igiena alimentelor.

ESCHERICHIA COLI (E.c.) reprezint specia tip a genului, ubicvitar, cu multiple faete i formeaz taxonul bacterian cel mai studiat i, probabil, organismul viu cel mai bine cunoscut. Aceast bacterie constituie de mult timp principalul microorganism folosit n cercetrile fundamentale de biochimie, genetic bacterian i de biologie molecular. n decursul timpului i s-a atribuit rol de agent patogen oportunist, cu circulaie mare n natur, prezent n tubul digestiv al animalelor cu snge cald i al omului, asociat sau nu cu entiti patologice specifice. Capacitatea sa de adaptare deosebit s-a atribuit dobndirii de noi genofori (plasmide), bacteriofagilor, elementelor transpozabile, caracterul su ubicvitar favoriznd apariia de tulpini i serotipuri noi.

E.c. a fost izolat i descris prima dat n 1885 de pediatrul german Theodor Escherich care a demonstrat existena ei ca musafir obinuit al intestinului copilului. Pentru a marca tropismul su pentru colon, autorul a numit aceast bacterie Bacterium coli commune. n 1919,

31

Castelani i Chalmers i dau numele definitiv de Escherichia coli, ca un omagiu adus lui Escherich.

E.c. este un bacil sau cocobacil Gram negativ, aerob i facultativ anaerob, polimorf, colorat bipolar, cu dimensiuni de 2-6/1,1-1,5 microni, nesporogen, acapsulogen, mobil datorit unui bogat aparat ciliar dispus peritrich sau uneori imobil. Tulpinile fimbriate sunt hemaglutinante. Tulpinile cu fimbrii de tip 1 sunt manoz sensibile i mai omogene antigenic, iar cele cu fimbrii de tip 2 sunt manoz rezistente i cu diversitate antigenic mai mare. Fimbriile manoz rezistente ndeplinesc rolul de factori de patogenitate. Multe tulpini au plasmide F, celulele lor fiind prevzute cu pil de sex, detectabil serologic sau cu ajutorul fagilor sexuali.

Se dezvolt bine n mediile uzuale la temperatura optim de 370C. n bulionul nutritiv produce turbiditate intens, uneori inel la suprafaa coloanei de mediu, iar n culturile mai vechi , depozit abundent, neaderent. Pe suprafaa agarului nutritiv formeaz colonii cu diametru de 2-6 mm, opace, nepigmentate, uor bombate, de tip S. Culturile degaj miros amoniacal-fecaloid.

Proprietile biochimice cele mai gener